JPH07503136A - κ−カゼインをコードするＤＮＡ，そのタンパク質を得る方法および用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 に−カゼインをコードするＤＮＡ、そのタンパク質を得る方法および用途 本発明は、人乳タンパク質に一カゼインまたはこのタンノくり質の類似体もしく は変異体をコードするＤＮＡ配列に関する。

特定の実施態様では、本発明のＤＮＡ配列は後記のＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：２に示 すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている。

このＤＮＡ配列は、原核もしくは真核の産生系によるか、またはより有利に、形 質転換（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）非ヒト哺乳動物例えばウシの種の雌ウシに産生 させることによって、組換えヒトに一カゼインまたはその類似体もしくは変異体 を製造する際に使用するのに有利である。組換えヒトに一カゼインの主な用途の 一つは、人乳の代替品として乳児に授乳するに用いる乳児用調合乳の成分として の用途である。組換えヒトに一カゼインは、乳児用調合乳の成分として用いられ ると、人乳に一層近い類似体が得られるという点で、調合乳の生物学的栄養価が 大きく改善されると考えられる。また組換えタンパク質類は、ヒトに一カゼイン が有利な特性をもっているので多数の他の実施態様で用いることか可能で例えば 医薬として用いることができると考えられる。

発明の背景 人乳の授乳は、乳児にとって、調合乳の授乳より優れているとみなされているこ とは公知である。人乳は栄養の充分に釣合いのとれた供給を行うのみならず乳児 は容易に消化する。したがって、乳児の体内で生理学的に機能をすることが分か っているいくつもの生理学的活性成分が、人乳の成分であるかまたはその消化中 に産生される。そして、これらの成分には、感染に対する防陣に関与する成分お よび人乳からの栄養素の摂取を容易にする成分か含まれている。

乳児用調合乳を製造するのに多くの努力か払われているのにもかかわらず、人乳 の有利なすべての特性をかなりな程度までもっている調合乳はまだ製造可能にな っていない。したがって乳児用調合乳は、牛乳に基づいて製造されることが多い か、一般に乳児による消化が不完全であり、かつ乳児の生理学的機能に作用する ことが知られている物質が欠除している。人乳に類似の栄養価を有する乳児用調 合乳を得るため、タンパク質類、タンパク質フラグメント類、ビタミン類、無機 質類などを含む多数の添加物か調合乳に含有されているが（これらのものは通常 、人乳を乳児が消化している間に生成するかまたは吸収される）、その結果、肝 臓および腎臓のような重要な臓器に対して緊張を起こす危険かありかつこのよう な臓器を長期間にわたって損傷する可能性かある。牛乳に基づいた調合乳の使用 に付随する他の欠点は、ウシタンパク質に対するアレルギーを乳児に誘発する危 険か増大することである。

牛乳に基づいた乳児用調合乳の代わりに、いわゆる母乳銀行から入手できる人乳 が用いられている。しかし、母乳銀行からの人乳を新生乳児に授乳することは近 年避ける傾向が増大している。というのは、その人乳中にＨＩＶおよびＣＭＶの ような感染因子が存在している恐れがあるからである。人乳中の感染因子を破壊 するために、使用する前に人乳を低温殺菌することが必要になった。しかし低温 殺菌によって、大乳成分の栄養価と生物学的効果は低下するかまたは消失する。

したがって人乳の使用は依然として少ない。

母乳の代わりに用いられるヒト乳児用調合乳で現在市販されているものは、主と して、牛乳のタンパク質成分に基づいている。これらの乳児用調合孔組成物は、 栄養バランス、栄養の生体内利用性およびヒト乳児の非ヒト／動物タンパク質に 対する感受性の点で難点がある。具体的に述へると、これらの乳児用調合乳に用 いられる非ヒト動物タンパク質に対してアレルギー反応かあるので、市販の調合 乳はタンパク質成分が変えられて大豆タンパク質に基ついた調合乳になったが、 牛乳に対してア【／ルギー性の多くの乳児は大豆による乳汁に対してもアレルギ ー性である（　Ａｍ、　Ａｃａｄ、　ｏｆ　Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ　Ｃｏｍｍ、 　ｏｎ　Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ。

Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、　７２巻、３５９〜３６３頁、１９８３年）。

その上に、牛乳タンパク質の使用による問題の多くは、ウシカゼインの含有量と 構造か原因で消化が困難であることに関連がある（　Ｌ、　Ｈａｍｂｒａｅｕｓ 、　Ｌ、Ａ、　ＨａｎｓｏｎおよびＨ，ＭｃＦａｒｌａｎｅ編集“Ｆｏｏｄ　ａ ｎｄ　１ｍｍｕｎｏ１ｏｇｙ″、１１６〜１２４頁、１９７７年、Ａｌｍｑｕｉ ｓｔａｎｄ　Ｗｉｋｓｅ１１社のり、　Ｈａｍｂｒａｅｕｓ、　Ｅ、　Ｆｏｒｓ ｕｍおよびＢ、　Ｌｏｎｎｅｒｄａｌの論文）。

このことから、乳清（ｗｈｅｙ）タンパク質を大比率で含有し〔乳清タンパク質 はヒト乳児が容易に消化するからであるＣＭ、　Ｊ、　ＮｅｗｐｏｒｔおよびＭ 、Ｊ、Ｈｅｎ５ｃｈｅｌ、　Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ　Ｒｅｓ、、　１８巻、６５８ 〜６６２頁、１９８４年）〕ウシカゼインをほとんど含有しないかもしくは全く 含有しない乳児用調合乳が生産されるようになっている。

しかし牛乳の乳清中の主要タンパク質はβ−ラクトグロブリンである。このタン パク質は人乳中に本来存在せず、乳児の牛乳アレルギーの主要原因の一つである ことが確認されている（［。

Ａｘｅｌｓｓｏｎ、１．Ｊａｋｏｂｓｓｏｎ、　Ｔ、　Ｌｉｎｄｂｅｒｇおよび Ｂ、　Ｂｅｎｅｄｉｋｔｓｓｏｎ。

Ａｃｔａ　Ｐｅｄｉａｔｒｉｃａ　５ｃａｎｄ、、７５巻、７０２〜７０７頁、 １９８６年）。牛乳に基づいた調合乳に対するアレルギーによる問題の大きさは 、大豆に基づいた調合乳が現在、米国におけるヒト乳児用調合乳の市場の大きな 部分を占めていることから理解することができる。

大豆タンパク質の調合乳は、炭水化物とタンパク質の起源は異なるか、ｔｈｅ　 Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、　Ｃｏｍｍ １ｔｔｅｅｏｎ　Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎの、乳児用調合乳の栄養レベルに対する勧 告にしたかって牛乳タンパク質調合乳に組成が似ている。異なっている点は、タ ンパク質のレベルが僅かに高くかつ炭水化物の含量かわずかに低いことである。

タンパク質源は一般に大豆タンパク質てあり；脂肪は植物油の混合物であり；お よび炭水化物源は通常スクロース、コーンシＯツブ固形物（ｃｏｒｎ　５ｙｒｕ ｐ　５ｏｌｉｄ）または両者の混合物である。しかし大豆調合乳を使用すると、 ウシベースのタンパク質の乳児用調合乳を使用する際に遭遇するアレルギーと消 化性の問題を起こすのに加えて、乳児の血清アルカリホスファターゼと血液尿素 のレベルを上昇させる傾向がある。

人乳は、全タンパク質含量か低く、カゼイン／乳清比が低くかつタンパク質組成 か異なる点て、ウシを含む他の哺乳動物の種の乳汁とは著しく異なっている。例 えば、人乳のカゼインのサブクラスはβ−カゼインとに一カゼインしかないが、 ウシのカゼインのサブクラスはα−カゼイン、β−カゼインおよびに一カゼイン である（　Ｍｉｌｌｅｒらの１９９０年の文献）。また人乳タンパク質のアミノ 酸組成は他の哺乳動物の乳タンパク質のそれとは異なっている。

に−カゼインはヒトを含むいくつかの種の乳汁中に存在するグリコノル化タンパ ク質である。ヒトのに一カゼインは、そのペプチド連鎖全体にわったで分布する いくつかの糖の接合団をウノとヒツソのに一カゼインの場合の０〜５個ではなく て、１０個まで含有していることか分かっている。

に−カゼインとに一カセインのペプチドについては多くの異なる生物活性か提唱 されている。再検討するには例えばＭｉｌｌｅｒらの１９９０年の文献とＦｉａ ｔとＪｏｌ１６ｓの１９８９年の文献を参照するとよい。に−カゼインはカルシ ウム結合部位をもっていることか分かっている（　ＦｉｔＺｇｅｒａｌｄとＳｗ ａｉｓｇｏｏｄの１９８９年の文献）。消化中に発揮されるに一カゼインまたは そのフラグメントの他の機能の例は、ガストリン分泌の阻害したかって胃内の酸 分泌の阻害（Ｓｔａｎらの１９８２年の文献）：胃腸ホルモンに対する調節作用 したがって外分泌膵臓からの酵素の放出に対する調節作用（Ｙｖａｎらの１９８ ７年の文献）；ラクトバシラス・ビフィダス・ペンシルバニクス（Ｌａｃｔｏｂ ａｃｉｌｌｕｓ　ｂｉｆｉｄｕｓ　ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃｕｓ）（Ｂｅｚｋ 。

ｒｏｖａｉｎｙらの１９７９年の文献）およびビフィダス・インファンティス（ Ｂｉｆｉｄｕｓ　ｉｎｆａｎｔｉＳ）（Ａｚｕｍａらの１９８４年の文献）に対 する成長促進作用；オピオイド−アンタゴニスト活性（Ｃｈｉｂａらの１９８９ 年の文献）；アンギオテンソンｌ変換酵素（ＡＣＥ）の阻害（Ｍａｒａｙａｍａ らの１９８７年の文献）、血小板凝集反応の阻害（ＪｏｌｌｅＳらの１９８６年 の文献）；免疫刺激特性（Ｊｏｌ１５ｓらの１９８２年の文献）および各種の抗 菌作用（Ｍｉｌｌｅｒらの１９９０年の文献）である。

ヒトに一カゼインの消化生成物（に−カゼイノグリコペプチド）は、ある種の細 菌、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅ ｕｍｏｎｉａｅ）およびヘモフィルス０インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌ ｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ）かヒト呼吸道の上皮細胞に粘着するのを阻害する ことが見出されている（Ａｎｉａｎｓｓｏｎらの１９９０年の文献）。

人乳に近い組成を育する乳児用調合乳、例えば人乳タンパク質を含有する調合乳 を製造して、牛乳ベースの乳児用調合乳に付随する上記欠点を回避できることが 望ましい。しかしこれを達成するには、人乳タンパク質を大量に入手することか 必要である。人乳タンパク質は人乳から直接精製することができるが、この方法 は、調合乳を大規模に生産するのに必要な大量を得るのに現実的でかつ充分に経 済的な方法ではなく、人乳タンパク質を含有する乳児用調合孔が製造できるよう になるには他の方法を開発しなければならない。

Ｃｈｏｂｅｒｔらは１９７６年に、いわゆるカゼイツマクロペプチドすなわちヒ トに一カゼインのグリコジル化Ｃ末端部を単離し、そのアミノ酸配列の一部を決 定した。ヒトに一カゼインのＣ末端の完全配列はＦｉａｔらが決定した（Ｆｉａ ｔらの１９８０年の文献）。ｐａｒａ−に−カゼインの配列すなわちに一カゼイ ンのＮ末端部分はその後Ｂｒｉｇｎｏｎらが決定した（Ｂｒｉｇｎｏｎらの１９ ８５年の文献）。未変性のヒトに一カゼインの完全配列は１５８個のアミノ酸を 含有していると報告された。

主としてげっ歯動物または酪農動物由来のいくつかの乳タンパク質の遺伝子はク ローン化されて配列が決定されているが、人乳タンパク質をコードする遺伝子の 知識は依然として少ない。

Ｈａｌｌらの１９８７年の文献にはヒトα−ラクトアルブミン遺伝子の配列か報 告された。ＭｅｎｏｎおよびＨａ　ｍの１９８７年の文献には、ヒトβ−カゼイ ンコードする部分ｃＤＮＡクローンの単離と配列決定が開示されたが、その完全 ｃＤＮＡ配列はその後Ｌｄｎｎｅｒｄａｌらか決定した（Ｌ６ｎｎｅｒｄａｌら の１９９０年の文献）。国際特許願公開第Ｗ０９］１０８６７５号には、組換え ヒトα−ラクトアルブミンおよびβ−カゼインを含有するヒト乳児用調合孔が記 載されている。ヒトラクトフェリンのｃＤＮＡの配列は、ＰｏｗｅｌｌとＯｇｄ ｅｎの１９９０年の文献に報告されている。人乳の胆汁酸塩で刺激されるリパー ゼのｃＤＮＡクローン化は、Ｎｉ　１ｓｓｏｎらの１９９０年の文献に報告され た。Ｍｅｎｏｎらの１９９１年の文献には、ヒトに一カゼインのアミノ酸配列（ ３°末端）の一部を演鐸できるｍＲＮＡが開示された。

発明の詳細な説明 本発明の目的は、組゛換えヒトに一カゼインを高収率で製造する手段を提供する ことである。

したがって、一つの態様において本発明は、ヒトに一カゼインの生物活性を有し 、アミノ酸配列ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：　２またはその類似配列もしくは変異配列 を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列からなり、前記ＤＮＡ配列の発現 を仲介できる５′−フランキング配列を有する発現系に関する。

形質転換細胞または形質転換動物はそのゲノム内に一つ以上の導入遺伝子を含有 している。導入遺伝子はゲノムの遺伝子座に組込まれたＤＮＡ配列であり、その 形質転換ＤＮＡ配列はさもなければ通常そのゲノムのその遺伝子座には見られな い。導入遺伝子は、非相同ＤＮＡ配列（他の種のゲノム内に見られる配列）また は相同ＤＮＡ配列（同じ種のゲノム由来の配列）で作ることができる。形質転換 動物はすでに報告されている。例えば米国特許第４．７３６．８６６号には、ｃ −ｍｙｃ癌遺伝子を含有する形質転換マウスが開示されている。形質転換動物の 他の報告としては、国際特許願公開第Ｗ０８２１０４４４３号（マウス接合体の 前核に注入されたウサギβ−グロビン遺伝子のＤＮＡフラグメント）：ヨーロッ パ特許願公開第０２６４１６６号（乳房組織に特異的な発現のだめの乳清酸性タ ンパク質プロモーターの制御下にあるＢ型肝炎の抗原と組織プラスミノーゲンア クチベーターの遺伝子）：ヨーロッパ特許願公開第０２４７４９４号（種々の形 態のインスリンをコードする非相同ＤＮＡを有する形質転換マウス）、国際特許 願公開第Ｗ０８８１００２３９号（乳清タンパク質のプロモーターの制御下にあ る、■因子をコードするＤＮＡ組織特異的発現）：国際特許願公開第Ｗ０８Ｂ１ ０１６４８（乳房ラクトゲン誘発性調節領域および非相同タンパク質をコードす る構造領域からなる組換え発現系を組込んだ乳房の分泌細胞を存する形質転換哺 乳動物、ヨーロッパ特許願公開第０２７９５８２号（形質転換マウスのラットβ −カゼインプロモーターの制御下でのクロラムフェニコールアセチルトランスフ ェラーゼの組織特異的発現）１国際特許願公開第Ｗ０９＋１０３５５１号（形質 転換動物の乳汁内での成長ホルモンの産生）、および国際特許願公開第ＷＯ９１ １０８２１６号（ウシの種による組換えポリペプチドの産生と形質転換方法）が ある。

本願で用いる場合、“組換えポリペプチド”　（すなわち組換えＤＮＡ配列がこ の組換えポリペプチドをコードする）は“非相同ポリペプチドである。非相同ポ リペプチドは通常形質転換動物か産生じないポリペプチドである。非相同ポリペ プチドの例としてはヒトに一カセインのような人乳タンパク質かある。

非相同ポリペプチドまたは相同ポリペプチドは各々、特異的なアミノ酸配列と核 酸配列が特徴である。しかしこのような配列には、その天然産の対立遺伝子の変 異および組換え法で産生される変異体が含まれると解すべきてあり、この組換え 法で、上記の核酸とポリペプチドの配列は、上記の核酸中の一つ以上のヌクレオ チドの置換、挿入および／または欠失を行って組換えポリペプチドの一つ以上の アミノ酸残基の置換、挿入または欠失を起こさせることによって修飾される。Ｄ ＮＡという用語か以下に用いられる場合、ＤＮＡがＲＮＡで置換できる場合はす べて、用語ＤＮＡは、当該技術分野の当業者にとって明らかなＲＮＡの実施態様 を含むと読むべきであると解すべきである。

一つの態様で、本発明は、ＳＥＱ　［Ｄ　Ｎｏ：　２に示すアミノ酸配列からな るポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、または１）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１ に示すＤＮＡ配列またはその特定部分と、緊縮ハイブリッド形成条件下でハイブ リッドを形成し、もしくは２）そのアミノ酸配列がＳＥＱ［ＤＮｏ：２に示すア ミノ酸配列と少なくとも８５％相同であるポリペプチドをコードし、もしくは３ ）前記ＤＮＡ配列の有効サブ配列（５ｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）を構成する、前記 ＤＮＡ配列の類似配列であって：ヒトに一カゼインの生物活性を有するポリペプ チドをコードするＤＮＡ配列に関する。

本発明の一つのＤＮＡ配列は、ヒト乳腺ｃＤＮＡライブラリーから単離されるｃ ＤＮＡクローンに基づいて決定される。

ヒトに一カゼインｃＤＮＡ配列を単離するのに用いる方法は実施例３に概略を示 しである。

先に引用した緊縮ハイブリッド形成条件はその通常の意味であると解すべきであ る。すなわちそのハイブリッド形成反応は、後述の実施例の“定義”の部分に記 載の方法を用い、２ＸＳＳＣ中６７°Ｃで実施し、最終洗浄はＩ　ｘｓｓｃ中６ ７°Ｃて行う。

“相同の”という用語は本願で用いる場合、与えられたポリペプチドのアミノ酸 配列とＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・２に示すアミノ酸配列の同一性の程度を示す。ＳＥ Ｑ　ＩＤ　Ｎｏ：　２に示すアミノ酸配列と比較されるアミノ酸配列はＤＮＡ配 列から演鐸することができ、例えば上記定義のハイブリッド形成によって得られ るが、または通常のアミノ酸配列決定法によって得られる。相同度は好ましくは 成熟ポリペプチドのアミノ酸配列について、すなわちリーダー配列は考慮せずに 測定する。相同度は、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　２に示すアミノ酸配列に対して少 なくとも８５％、例えば歩な（とも９０％好ましくは少なくとも９５％または９ ８％が好ましい。

先に用いた“有効サブ配列″という用語は、以下に定義されるようなヒトに一カ ゼインの活性について少なくとも部分的に機能するペプチドをコートするサブ配 列を意味する。このサブ配列は、ＤＮＡ配列のどちらかの末端を切取るがまたは ＤＮＡ配列内の一つ以上ヌクレオチドもしくはヌクレオチド配列を除去すること によって得られる。好ましくは、この有効配列は、ヒトに一カゼインの生物活性 を有するペプチドをコートする場合、少な（とも１５個のヌクレオチド例えば少 なくとも２０個のヌクレオチドを含有している。

また、ヒトに一カゼインの生物活性を有するサブ配列はさらに大きくてもよく、 例えば少なくとも５０個のヌクレオチドを含有し、例えば少なくとも７５、＋０ ０もしくは１２５個のヌクレオチド例えば１５０個のヌクレオチドを含有してい てもよい。

ヒトに一カゼインの“生物活性′という用語には、限定されないが、ヒトに一カ ゼインの報告されている活性、例えばヒトに一カゼインおよび／またはヒトに一 カゼイン由来のペプチドの“抗菌活性”、“オピオイド活性′、“免疫刺激活性 ”、“カルシウム結合活性２および“ミセル形成活性”の一つまたは二つ以上の 組合せが含まれると解すべきである。

“抗菌活性”という用語は、細胞、ウィルスまたは寄生生物のような病原体の付 着、定着または成長を阻害するに一カゼインの性能を意味する。この“抗菌活性 ２は、Ａｎｉａｎｓｏｎらの１９９０年の文献に開示されているようにして測定 することができる。

“オピオイド活性”という用語は、に−カゼイン由来のペプチドがアヘン剤の受 容体に結合する性能（アヘン剤受容体アフィニティー）を意味する。この“オピ オイド活性”はＣｈｉｂａらの１９８９年の文献に開示されているようにして測 定することができる。

“免疫刺激活性”という用語は、マクロファージによる食作用およびＢ細胞とＴ 細胞の分化のような免疫反応を刺激するヒトに一カゼインの性能を意味する。

“カルウシラム結合活性”という用語はカルシウムイオンを捕捉し輸送し送り込 むヒトに一カゼインの性能を意味し、一方“ミセル形成活性′という用語は、ヒ トに一カゼインがそれ自体でまたは他の乳タンパク質とともにミセルを形成する 性能を意味する。これらのミセルは、イオン、ビタミン、脂質、ペプチド、ポリ ペプチド、無機質、微量元素および成長因子を輸送し送り込む重要な機能を有す る。

この点について、用語“オピオイド活性”、“抗菌活性″、“免疫刺激活性”、 “カルシウム結合活性′およびミセル形成活性ならびに関連用語は、まず第一に 生物活性の性質のような活性の性質および／またはヒトに一カゼインについて測 定されるポリペプチドの活性のレベルについて定性的および／または定量的であ ると解すべきであることに留意しなければならない。

ヒトに一カゼインの消化フラグメントについては、その生物活性も、例えば抗菌 活性もしくはオピオイド活性をそれぞれ有するヒトに一カゼインの消化フラグメ ントに対し、文献に記載されているのと同し定量的／定性的性質を有する活性で ある。

この点について、“消化フラグメント“という用語は、人乳を与えられた乳児が ヒトに一カゼインを消化中に、天然に生成するペプチドのフラグメントを意味す る。このようなフラグメントは、例えば組換えヒトに一カゼインの分解、かよう なフラグメントをコートするＤＮＡ配列からの発現、または通常のペプチド合成 を用いることによって製造することができる。

他の態様で、本発明は、本発明のＤＮＡ配列によって産生されるポリペプチドで あって、好ましくはＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　２に示すアミノ酸配列または前記ア ミノ酸配列の変異配列もしくは類似配列のサブ配列からなり、上記のヒトに一カ ゼインの生物活性を存する組換えポリペプチドに関する。また特定の実施態様で 、本発明は、アミノ酸配列ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　２またはその類似配列もしく は変異配列を有する組換えポリペプチドに関する。変異配列とサブ配列は先に定 義されているがさらに後述する。

さらに別の態様で、本発明は前記定義の哺乳動物発現系を、哺乳動物の受精卵ま たは胚の細胞中に注入して前記発現系を該哺乳動物の生殖細胞系に組込み、つい で得られた注入受精卵もしくは注入胚を成熟雌哺乳動物中で発育させることから なる、本発明の組換えペプチドを発現できる非ヒト形質転換哺乳動物の製造方法 に関する。

別の実施態様で、本発明は、本願で定義するポリペプチドをコートするＤＮＡ配 列、このようなりＮＡ配列を保持し、がっ発現できる複製可能な発現ベクター、 かようなベクターを保育する細胞、上記ポリペプチドの製造方法、上記ポリペプ チドを発現することができる非ヒト形質転換動物の製造方法、このような形質転 換動物自体、かような形質転換動物からの乳汁、本願で定義されるポリペプチド を含有する乳児用調合孔、本願で定義されるポリペプチドの単離方法、および上 記定義の適正なポリペプチドに関する。

本発明の詳細な説明 本発明の発現系は、哺乳動物の乳タンパク質遺伝子由来の５゛フランキング配、 およびアミノ酸配列ＳＥＱ　［Ｄ　Ｎｏ＋　２またはその類似配列もしくは変異 配列を有し、かつヒトに一カゼインの生物活性を有するポリペプチドをコードす るＤＮＡ配列がらなり、そのフランキング配列が該ポリペプチドの発現を仲介で きる発現系である。

以下に詳細に考察するように、本発明の発現系は、多（の目的に用いられ、好ま しくはそのＤＮＡ配列が少なくとも一つのイントロン配列を含有し、かつ好まし くは少なくとも一つの許容ＲＮＡスプライスシグナルを有する発現系である。特 に本発明は、単一もしくは複数のイントロン配列がＳＥＱ　［ＯＮｏ：　３およ び／またはＳＥＱ　［Ｄ　Ｎｏ：　４で表されるイントロン配列から選択される 発現系、例えばＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　２のアミノ酸配列を含有するかまたはＳ ＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　２のアミノ酸配列であるポリペプチドをコードする発現系 に関する。

好ましい実施態様で、本発明の嘩乳動物発現系は、そのＤＮＡ配列が哺乳動物の 乳タンパク質をコードする遺伝子の調節要素と結合されてハイブリッド遺伝子が 形成され、このハイブリッド遺伝子はこれを保存する非ヒト唾乳動物の成熟雌の 乳腺で発現可能であり、その結果該ハイブリッド遺伝子が発現されるとき、該Ｄ ＮＡ配列がコードするポリペプチドが産生される発現系である。乳タンパク質を コードする遺伝子の例としては、カゼインの遺伝子または乳清の酸性タンパク質 （ＷＡＰ）から選択される遺伝子がある。また本発明にはこのようなハイブリッ ド遺伝子も含まれる。

上記のように本発明の発現系は、好ましくは、コードされるポリペプチドの類似 体または変異体がアミノ酸配列ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：２と少なくとも８５％相同 である発現系である。ＤＮＡ配列５ＥＱＩＤＮｏ：２に近い構造関係を発現する 他の方法はハイブリッド形成による方法である。すなわち、その発現系は好まし くは、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、緊縮ハイブリッド形成条件下 、ＤＮＡ配列ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：　１もしくはその一部とハイブリッドを形成 するＤＮＡ配列であるような発現系である。

ＳＥＱ　［ＯＮｏ：　１に示すヌクレオチド配列から演鐸されるアミノ酸配列は 、アミノ酸の配列を決定して報告された配列（Ｂｒｉｇｎｏｎらの１９８５年の 文献）と比べると８個の位置で異なっている。提案されているシグナルペプチダ ーゼ開裂部位に基づいて、そのペプチド連鎖は先に発表されたアミノ酸配列（Ｂ ｒｉｇｎｏｎらの１９８５年の文献）よりアミノ酸残基が４個多いことが示唆さ れる。もしそうであれば、そのＮ末端のアミノ酸配列はラットのそれと同一であ り、かつ他の種について報告されたものと非常に似ており、次のアミノ酸配列Ｇ ｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｉｎ−Ａｓｎをもっている。

Ｍｅｎｏｎらの１９９１年の文献には、ヒトに一カゼインのアミノ酸配列の一部 分（３°末端）を演鐸することができるｍＲＮＡ配列か開示されている。

ヒトに一カゼインポリペプチドに翻訳可能な興味深いＤＮＡ配列は、ヒトに一カ ゼインを発現することができるヒトに一カゼイン遺伝子またはその一部からなる 配列である。したがって、別の態様で、本発明は、ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：　３に 示すＤＮＡ配列とＳＥＱ［Ｄ　Ｎｏ・４に示すＤＮＡ配列を実質的に含有し、さ らに任意に、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　３とＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　４を連結する ＤＮＡ配列を存するＤＮＡ配列に関する。このことは、例えば実施例７に記載さ れているようにして実施することができる。

興味深い実施態様として、少なくとも一つのヌクレオチドが欠失、置換または修 飾されるか、または少なくとも一つの追加のヌクレオチドが挿入されて、ヒトに 一カゼインの生物活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が得られる 点で上記定義のＤＮＡ配列と異なる修飾ＤＮＡ配列がある。

他の態様で、本発明は、ヒトに一カゼイン遺伝子を含有するＤＮＡ配列、または ヒトに一カゼインの活性を有するポリペプチドもしくはその消化フラグメントを 発現できる要素を含有する該ＤＮＡ配列の有効サブ配列、または１）ＳＥＱ　［ Ｄ　Ｎｏ：　１に示すＤＮＡ配列またはその特定部分と、緊縮ハイブリッド形成 条件下でハイブリッドを形成し、もしくは２）そのアミノ酸配列がＳＥＱ　ＩＤ 　Ｎｏ：　２に示すアミノ酸配列と少なくとも８５％相同であるポリペプチドを コードし、もしくは３）前記ＤＮＡ配列の有効サブ配列を構成する、前記ＤＮＡ 配列の類似配列であって： ヒトに一カゼインの生物活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に関 する。

本発明のこの態様は、とりわけ、アミノ酸配列ＳＥＱ　ＩＤＮｏ：　２またはそ の類似配列もしくは変異配列を有しヒトに一カゼインの生物活性を有するポリペ プチドをコードするＤＮＡ配列に関する。一つの実施態様において、そのＤＮＡ 配列は少なくとも一つのイントロン配列を有し、他の実施態様ではそのＤＮＡ配 列は少なくとも一つの許容ＲＮＡスプライスシグナルを含有している。

好ましい実施態様では、そのＤＮＡ配列はＳＥＱ　［ＯＮｏ：　１に示すＤＮＡ 配列を実質的に含有している。あるいはそのＤＮＡ配列、少なくとも一つのヌク レオチドが欠失し、置換されもしくは修飾されているかまたは少なくとも一つの 追加のヌクレオチドが挿入されて、ヒトに一カゼインの生物に一カゼインに比較 して類似しているか、増大しているかまたは減少している生物活性を有するポリ ペプチドをコードするＤＮＡ配列になっているという点で上記定義のＤＮＡ配列 とは異なる修飾配列である。

本願において用いる場合“遺伝子”という用語は、ポリペプチド連鎖の産生に関 与し、かつコーティング領域（５゛−上流および３゛下流の配列）に先行する領 域と続く領域、ならびに個々のコーティングセグメント（いわゆるエキソン）間 またはその５′上流または３°下流の領域中に位置する介在配列いわゆるイント ロンを有するＤＮＡ配列を意味する。上記の５゛上流領域は遺伝子の発現を制御 する調節配列、一般にプロモータを含有している。３′下流領域は、遺伝子の転 写の終止に関与する配列、および任意に転写物のポリアデニル化反応に関与する 配列と３′非翻訳領域を含有している。

上記の調節配列または発現調節配列は、転写を制御するのに加えて、少なくとも ＲＮＡが転写される程度に、ＲＮＡの安定性とプロセシングにも寄与する。

このような発現調節配列は、組換えＤＮＡが組織特異的発現または細胞型特異的 発現を行うように選択される。組織または細胞型が発現を行なうために選択され ると、５゛発現調節配列および任意に３゛発現調節配列か選択される。一般にか ような発現調節配列は、選択された組織または細胞型に本来発現される遺伝子か ら誘導される。好ましくは、これらの発現調節配列が得られる遺伝子は、実質的 に選択された組織または細胞型内でのみ発現されるが、他の組織および／または 細胞型内での導入遺伝子内の組換えＤＮＡの発現が形質転換動物に対して有害で ない場合は、他の組織および／または細胞型内での二次発現も容認される。特に 好ましい発現調節配列は、扱われる動物の種に内在する配列である。しかし、ヒ ト遺伝子由来のような他の種由来の発現調節配列も使用できる。場合によって、 発現調節配列および構造ＤＮＡ配列（ゲノムもしくはｃＤＮＡの配列）は同じ種 由来のものであり、例えば各々、ウシの種由来がまたはヒト起源由来のものであ る。このような場合、発現調節配列とＤＮＡ配列は互いに相同である。あるいは 、発現調節配列とＤＮＡ配列（ｃＤＮＡもしくはゲノムの配列）は異なる種から 得られる。例えば発現調節配列はウシの種がら得られおよびＤＮＡ配列はヒトの 起源から得られる。このような場合、発現調節配列とＤＮＡ配列は互いに非相同 である。下記の場合は発現調節配列を内在性遺伝子から形成する。このような形 成は非内在性の非相同遺伝子由来の発現調節配列にも適用できる。

一般に、５°発現調節配列は、翻訳開始配列から上流の内在性遺伝子の転写され る部分（５′非翻訳領域もしくは５°ＵＴＲ）および機能プロモーターを含有す るそれから上流のそれらのフランキング配列を含有している。本願で用いる場合 、“機能プロモーター”という用語は、ＲＮＡポリメラーゼが内在性遺伝子に結 合するのを指示して転写を促進する必要な非転写ＤＮＡ配列を含んでいる。この ような配列は一般に、転写開始部位がら約２５〜３０ヌクレオチドの位置にある ＴＡＴＡ配列すなわちＴＡＴＡボックスを有している。またＴＡＴＡボックスは 特には近位シグナルと呼ばれる。多くの場合、プロモーターはさらに、近位シグ ナル（ＴＡＴＡボックス）の上流に位置し、転写を開始するのに必要な一つ以上 の遠位シグナルをもっている。かようなプロモーター配列は一般に、転写開始部 位から上流に位置する最初の１００〜２００個のヌクレオチド内に含有されてい るが、転写開始部位から５００〜６００個のヌクレオチド以上まで延びてもよい 。このような配列は、当該技術分野の筒業者にとって容易にわかるかまたは標準 の方法で容易に同定することができる。

このようなプロモーター配列は、単独もしくは５゛非翻訳領域と組み合わせて、 本願では“近位置５′発現調節配列”と呼ぶ。

このような近位５゛発現調節配列に加えて、追加の５°フランキング配列（本願 では“遠位５°発現調節配列′と呼ぶ）も導入遺伝子に含まれている。がような 遠位５°発現調節配列は、内在性遺伝子の発現を容易にする一つ以上のエンハン サ−および／または他の配列を含有し、その結果遠位と近位の５°発現調節配列 に作動可能に連結された構造ＤＮＡ配列の発現が容易になると考えられる。これ らの５°発現調節配列は、遺伝子発現の空間的および時間的の分布を調節する。

遠位５′発現調節配列の量は、その発現調節配列が誘導される内在性遺伝子によ って決まる。

しかし、一般にかような配列は、約１ｋｂの５゛フランキング領域を含有し、さ らに好ましくは１６ｋｂの最も好ましくは約３０ｋｂのフランキング領域をもっ ている。特定の内在性遺伝子から用いられる遠位５゛発現調整配列の最適量の決 定は、遠位５°発現調節配列の量を変えて最大の発現を得ることによって容易に 行なうことができる。一般に、この遠位５′発現調節配列は、隣接する遺伝子中 に延びるほと大きくはなく、かつ導入遺伝子の発現のレベルに悪影響をあたえる ＤＮＡ配列を含有していない。

さらに、３°発現調節配列も、組織もしくは細胞壓に特異的な発現を補充するた めに含有させることが好ましい。このような３°発現調節配列は、適正な内在性 遺伝子由来の３°近位と３°遠位の発現調節配列を含有している。その３°近位 発現調節配列は、組換えＤＮＡ配列中の翻訳終止シグナルから下流に位置する転 写されるか翻訳されないＤＮＡ（３′非翻訳領域または３°ＵＴＲと呼ぶ）を含 有している。かような配列は一般にポリアデニル化配列（内在遺伝子またはＳＶ ４０のような他の起源由来）およびＲＮＡの安定性に影響を与える配列で終止す る。一般に３’ＵＴＲは、３°調節配列か誘導される遺伝子中の翻訳停止シグナ ルから下流に約１００〜１０００個またはそれ以上のヌクレオチドを構成されて いる。遠位３゛発現調節配列は、近位３′発現調節配列から下流のフランキング ＤＮＡ配列を含有している。これら遠位配列のいくらかは転写されるがｍＲＮＡ の一部分を形成せず、一方この３°遠位発現調節配列の残りの配列は全く転写さ れない。

かような遠位３′発現調節配列は、発現を促進するエンハンサ−および／または 他の配列を含有していると考えられる。かような配列は、効率的なポリアデニル 化反応を行うのに必要であり、かつ転写終止配列を含有していると考えられる。

好ましくは、かような配列は、約２ｋｂの３゛フランキング配を含有し、より好 ましくは８ｋｂおよび最も好ましくは約１．５ｋｂの３°フランキング配列を含 有している。

５′と３°の発現調節配列の両方を使用することが好ましいが、本発明のいくつ かの実施態様では、内在性の３°調節配列は使用しない。このような場合、組換 えＤＮＡ配列によってコードされるゲノムＤＮＡに通常に結合されている３°近 位置発現調節配列を使用してポリアデニル化反応が行われる。さらに組換えポリ ペプチドをコードするゲノムＤＮＡ由来の遠位３′調節配列も、内在性３′発現 調節配列について規定されているのと同量で利用することが好ましい。このよう な場合、導入遺伝子がコードする組換えポリペプチドはゲノムＤＮＡまたはｃＤ ＮＡ由来の二本ＭＤＮＡからなると解すべきである。５°発現調節配列の場合と 同様に、３°発現調節配列の最適量は、組換えポリペプチドを最高に発現させる ために、３゛フランキング配の量を変えることによって容易に決定することがで きる。一般に、遠位３′調節配列は、内在性遺伝子または非相同の遺伝子由来で あれば、それが誘導される隣接遺伝子中には延びず、かつ導入遺伝子の発現のレ ベルに有害な影響を与えるいずれの配列も排除する。

さらに、本発明の導入遺伝子は、５′と３′の発現調節配列と組換えＤＮＡ　（ ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ由来のＤＮＡ）に加えて、導入遺伝子の転写される 領域を中断するイントロン配列を含有している。しかし、組換え介在配列も“ハ イブリッド介在配列″を含有している。かようなハイブリッド介在配列は、非相 同もしくは相同の起源からの介在配列由来の５’ＲＮＡスプライスシグナルおよ び３°ＲＮＡシグナルを含有している。

許容ＲＮＡスプライスシグナルを含有するかようなハイブリッド介在配列は、組 換えＤＮＡがｃＤＮＡ配列に対応するときに使用するのが好ましい。

上記のことに基づいて、好ましい導入遺伝子は、５°と３゛の発現調節配列を大 量に含有していることは明らかである。さらに組換えＤＮＡは、長さが数十〜数 百ｋｂのゲノムクローンから誘導されたものか好ましい。ＤＮＡをクローン化し 操作する現在の方法によれば、導入遺伝子の構築と顕微注射は事実上、長さが約 ５０ｋｂ以下の直鎖状ＤＮＡに限定されている。しかし本発明の導入遺伝子は、 特に長さが約５０ｋｂより大きいものを、所望の導入遺伝子の二つ以上のオーバ ーラツプフラグメントを標的の胚細胞に導入することによって容易に生成させる ことができる。

オーバーラツプフラグメントはこのように導入されると、相同的組換えを受けて 、標的細胞のゲノム中に、充分に再構成された導入遺伝子が組込まれる。一般に 、このような導入遺伝子のオーバーラツプフラグメントは、オーバーラツプする 領域で１００％相同であることが好ましい。しかし、効率的な相同的組換えが起 こるのであれば、低い配列相同性も許容できる。非相同性が相同配列の一部分の 間に存在する場合は、その非相同性は、相同配列の部分全体にわたって広がらず に分離した領域に位置していることか好ましい。１００％相同性の塩基対が１４ 個はどの少数でも哺乳動物の細胞内で相同的組換えを行うのに充分であるが（Ｒ ｕｂｎｉｔｚ、　Ｊ、およびＳｕｂｒａｍａｎｉ、　Ｓ、、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ １．　Ｂｉｏｌ、、　４巻、２２５３〜２２５８頁、１９８４年）、相同配列部 分は長い方が好ましく、各相同配列部分について、例えば５００ｂｐ、より好ま しくは１０００ｂｐ、さらに一層好ましくは２０００ｂｐで、最も好ましくは２ ０００ｂｐより大きい。

本発明の導入遺伝子が、ゲノムＤＮＡ由来もしくはゲノムＤＮＡに相当する組換 えＤＮＡ　（または前記ゲノムＤＮＡ配列で実質的に構成されている組換えＤＮ Ａ、例えば組換えポリペプチドをコードするコドンの約５０％以上、より好まし くは約７５％以上、最も好ましくは９０％以上がゲノム配列由来の場合）によっ てコードされている組換えポリペプチドをコードしている場合、形質転換牛乳の モル濃度とタンパク質レベルはｃＤＮＡの場合と同じかそれより高い。一般に、 かような形質転換乳牛の組みえポリペプチドのモル濃度は、好ましくは約５０μ Ｍより高く、より好ましくは約１５０μＭより大であり、最も好ましくは約５０ ０μＭより大きい。形質転換乳のタンパク質のレベルからみて、そのレベルは好 ましくは、約１■／艷より大で、より好ましくは約２．５■／−より大であり、 最も好ましくは５　ｍｇ／−より大きい。

形質転換牛乳の上記モル濃度とタンパク質レベルは、特定の組換えポリペプチド の分子量によって変化する。形質転換牛乳中に組換えポリペプチドを産生させる 場合の特別の利点は、原核発現系のような他の系では大量に産生ずることが特に 困難な比較的分子量が大きいポリペプチドを大量に産生することができるという ことである。

しかし、マウスは乳汁１ｒｎ１当たり５５〜８０■のタンパク質を通常産生ずる 。一方ウシは１ｒｎｌ当たり３０〜３４■のタンパク質を通常産生ずる。組換え ポリペプチドの産生量が例外的に高いレベルであると、内在性乳タンパクの産生 に有害な影響を与え、および／または哺乳動物の乳腺に悪影響を与えることがあ るので、組換えポリペプチドの濃度は、通常の牛乳のタンパク質濃度の約ｌ〜５ ０％（すなわち形質転換孔１−当たり約０．３〜１７■の組換えポリペプチド） が好ましく、より好ましくは牛乳中に産生されるタンパク質の通常の量の１０〜 ２０％（すなわち３〜約７■／ｒｎＩ）であり、最も好ましくは牛乳中に産生さ れるタンパク質の通常の量の１０〜１５％（すなわち約３〜５ｍｇ／＋ｎＪ）で ある。またこのような好ましい範囲によって、形質転換牛乳に産生されるタンパ ク質の上記のレベルに好ましい最大限界が与えられる。

遺伝子の“有効サブ配列′という用語は、ＤＮＡ配列について先に定義したのと 同様に解すべきである。

ハイブリット形成は、以下の実施例の“定義”の項に記載されているように、好 ましくは下記のＳＥＱ　１０　Ｎｏ：　１に示すＤＮＡ配列のコーティング部分 からなるプローブに基づいて実施する。

“相同サブ配列′および“有効サブ配列”という用語は上記定義と類似の方式で 用いられる。

本発明のＤＮＡ配列の類似配列でコードされるポリペプチドは、ＳＥＱ　ＩＤ　 Ｎｏ：　２に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％相同で例えば少なくとも９５ ％もしくは９８％相同である。

本発明のＤＮＡ配列の特定の類似配列の例は、イー、コリ（Ｅ。

ｃｏｌｉ）のような細菌、酵母、哺乳動物の細胞系または形質転換動物内で発現 するよう特に構成されたＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１に示すＤＮＡ配列の必須部分 またはその完全ＤＮＡ配列で構成されているＤＮＡ配列である。このＤＮＡ配列 は、適切な調節配列とともに本発明の発現系に挿入されると、ＳＥＱ　［Ｄ　Ｎ ｏ：　２に示すアミノ酸配列またはその類似配列もしくサブ配列を有するポリペ プチドが発現される。

上記のように、ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：　１に示すＤＮＡ配列は、ヒトに一カゼイ ンの単一／複数の機能ドメインならびにこのドメインと天然に結合しているシグ ナルペプチドを含有するポリペプチドをコードしている。はとんどの場合シグナ ルペプチドが存在することか、ＤＮＡ配列から発現されるポリペプチドを、それ が産生される細胞から移動させるのに前もって必要であるが、使用される特定の シグナルペプチドの性質と起源は変えることができ、ヒトに一カゼインに天然に 結合しているシグナルペプチドである必要はない。

したがって、本発明の特に興味深いＤＮＡ配列は、ＳＥＱ　［Ｄ　Ｎｏ、２のア ミノ酸２１〜１８２すなわち成熟ヒトに一カゼインに相当するアミノ酸を含有す るポリペプチドをコードするＤＮＡ配列である。

ヒトに一カゼインは、Ｃ末端部のセリンとトレオニンの残基において高度にグリ コジル化されており、に−カゼインのこのグリコジル化部分はその分子に抗菌作 用を付与すると考えられ組換えポリペプチドのグリコジル化は選択される発現系 に存在している。異なる種および／または組織が起源の真核細胞は、グリコジル 化の機構が変化することは公知である。したがって、重要なグリコジル化による 修飾を達成するには、翻訳後に適切なグリコジル化の修飾を行う性能を有する、 組換え分子産生用の宿主生物を選択することが大切である。

しかし、宿主生物のグリコジル化機構を改変できる方法も利用できる。このこと は、宿主生物、例えば宿主細胞もしくは形質転換動物のゲノムを、組換え遺伝子 因子の導入で変化させることによって実施することができる。これらの遺伝子因 子は、追加のもしくは修飾されたグリコジルトランスフェラーゼもしくは他の関 連酵素をコードしてそれらの発現を仲介するか、または内在性グリコジルトラス フエラーゼもしくは次の関連酵素の機能を阻害することができる。この阻害は、 内在性グリコジルトランスフェラーゼ遺伝子の機能を破壊するか、または内在性 グリコジルトランスフェラーゼｍＲＮＡ種に相補的であり、したがってアンチセ ンスＲＮＡとして機能するＲＮＡ配列をコードするベクターを導入することによ って達成することができる。

修飾されたＤＮＡ配列かコードするポリペプチドは通常、ヒトに一カゼインのア ミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する。本発明の修飾ＤＮＡ配列は、ヒト に一カゼインもしくはその消化フラグメントと比べて改変された活性または他の 類似の重要な活性を有する新規なポリペプチドを製造する際に重要である。

′置換″が行われる場合、全ヌクレオチド配列中の一つ以上のヌクレオチドが一 つ以上の異なるヌクレオチドで置換される。

“付加“が行われる場合、全ヌクレオチド配列のいずれかの末端に一つ以上のヌ クレオチドが付加される。゛挿入″が行われる場合、全ヌクレオチド配列内に一 つ以上のヌクレオチドが挿入される。そして、“欠失“が行われる場合、配列の いずれかの末端または配列内のいずれかの適切な場所にかかわらず全ヌクレオチ ド配列から一つ以上のヌクレオチドが欠失する。

修飾ＤＮＡ配列は、公知の方法例えば部位特異的な突然変異誘発を利用すること によって得ることができる。

本発明の重要な修飾ＤＮＡ配列の例は、グリコジル化および／またはリン酸化さ れるべき残基の数が増大しているポリペプチドをコードする修飾ＤＮＡ配列が得 られるようにセリンもしくはトレオニンの残基をコードする追加のコドンが挿入 されたＤＮＡ配列である。これらの追加の残基は、本発明のＤＮＡ配列のいずれ かの末端もしくは該配列内に付加するか、または本発明のＤＮＡ配列に存在する 一つ以上の非セリンもしくは非トレオニンのコドンを置換することによって挿入 される。このような修飾Ｄ　Ｎ　Ａ配列がコードするポリペプチドはグリコジル 化度およびリン酸化が高いと考えられる。かような修飾ＤＮＡ配列から産生され るポリペプチドは、例えば当該技術分野で公知の方法で医薬として許容できる担 体もしくは賦形剤と混合して栄養補給剤および／または医薬として用いることが できる。

興味深い修飾ＤＮＡ配列の他の例は、ＳＥＱ　１０　Ｎｏ＋　２に示すのとは異 なるアミノ酸配列を存する天然産ヒトに一カゼイン変異体のアミノ酸配列をコー ドするＤＮＡ配列である。これを得るには、関連するアミノ酸残基の交換／除去 を行う特定のオリゴヌクレオチドのプローブを用いて、部位特異的突然変異誘発 が行われる。

上記定義の本発明のＤＮＡ配列の他の重要な用途は、一方ではＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ ｏ：　２に示すアミノ酸配列または上記定義のようなその類似配列もしくはサブ 配列からなるポリペプチド、ならびに他方では他の起源のポリペプチド例えば人 乳タンパク質のごとき他の乳タンパク質のポリペプチドもしくはペプチド部分で ある例えばα−ラクトアルブミン、またはウシに一カゼインのごときウシもしく はヒツジの乳タンパク質のような乳タンパク質を含有する融合タンパク質を製造 する際の用途である。この融合タンパク質は、本発明のＤＮＡ配列を、その融合 タンパク質の残りの部分をコードするＤＮＡ配列および適正な調節配列と、その 融合タンパク質の発現を起こさせる方式で融合することによって製造することが できる。

本願で述べる本発明のＤＮＡ配列は、天然のＤＮＡ配列および合成のＤＮＡ配列 を含有し、その天然の配列は一般に、例えば下記のような哺乳動物の起源のｃＤ ＮＡもしくはゲノムＤＮＡから直接誘導される。合成の配列は、合成によってＤ ＮＡ配列を製造する通常の方法で製造することができる。勿論本発明のＤＮＡ配 列は、ｃＤＮＡとゲノム起源の混合、ｃＤＮＡと合成起源の混合、およびゲノム 起源と合成起源の混合でもよい。

またＲＮＡ配列は先に述べたのと同様にして利用することができる。

本発明による配列、サブ配列、類似配列およびポリペプチドに対して本願で用い られる“配列“、“サブ配列”、“類似配列”および“ポリペプチド”という用 語は、勿論、その天然の環境内ではこれらの現象を含まず、例えば生体外で単離 精製された形態かもしくは組換え形態でこれらの現象を含んでいると解すべきで ある。本発明のＤＮＡ配列が引用された場合は、上記の“類似配列”、“サブ配 列”および“修飾配列′を含むと解すべきである。同様に“本発明のポリペプチ ド”が引用された場合は以下に定義するいずれかのポリペプチドも含まれると解 すべきである。

他の重要な態様で、本発明は上記定義の本発明のＤＡＮ配列によってコードされ るポリペプチドに関する。本発明の特に興味深いポリペプチドは、ＳＥＱ　ＩＤ 　Ｎｏ：　２に示すアミノ酸配列またはそのサブ配列からなり、ヒトに一カゼイ ンの生物活性を有する組換えヒトに一カゼインポリペプチドである。前記アミノ 酸配列の重要なサブ配列からなる重要なポリペプチドの例は、シグナルペプチド なしの成熟組換えヒトに一カゼインに相当する、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　２に示 すアミノ酸配列のアミノ酸残基２１〜１８２からなるポリペプチドである。

上記の開示から明らかなように、本発明の他の興味深いボリペプチドは、ＳＥＱ 　［Ｄ　Ｎｏ：　２に示すアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有しかつヒト に一カゼインの活性と比べて生物活性が類似もしくは増大しているポリペプチド が得られるように、少なくとも一つのアミノ酸配列が異なるアミノ酸残基で置換 されたことおよび／または少なくとも一つのアミノ酸残基が欠失しもしくは不可 されたことが異なる、ＳＥＱ　［Ｄ　Ｎｏ：　２に示すアミノ酸配列からなるポ リペプチドとは異なるポリペプチドである。

本発明の修飾ポリペプチドを設計して製造する方策の例は以下の開示から明らか になる。

本発明のさらに他の興味深いポリペプチドは、少なくとも一つのアミノ酸残基が グリコジル化、リン酸化、アシル化またはメチル化のような翻訳後の修飾反応に よって修飾されたポリペプチドである。明らかに本発明のポリペプチドは、２種 以上の翻訳後の修飾に付することができる。本発明のある種の好ましい実施態様 では、本発明のポリペプチドは好ましくはグリコジル化された形態である。通常 グリコジル化は、ポリペプチドが、上記のように、酵母または好ましくは哺乳動 物のような高等生物の細胞で発現されると達成される。

グリコジル化は通常、アミノ酸残基のＡｓｎ、　Ｓｅｒ、　Ｔｈｒまたはヒドロ キシリジンについて見られる。

別の態様で、本発明は、ヒトに一カゼインをコードするＤＮＡ配列を保育しかつ その配列の発現を仲介できる複製可能な発現ベクターに関する。

本願において、“複製可能の”という用語は、ベクターが、導入された所定のタ イプの宿主細胞内で複製可能であることを意味する。ヒトに一カゼインＤＮＡ配 列のすぐ上流にはシグナルペプチドをコードする配列があり、このペプチドが存 在すると該ベクターを保有する宿主細胞によって発現されるヒトに一カゼインの 分泌が保証される。このシグナル配列は、ヒトに一カゼインＤＮＡ配列と天然に 結合しているものまたは他の起源のものでもよい。

本発明のベクターは通常組換えＤＮＡ法に付すことができるベクターであり、ベ クターの選択は、そのベクターが導入される宿主細胞によってきまることが多い 。したがって本発明のベクターは、自己複製ベクターすなわち染色体外構成要素 として存在するベクターであり、その複製は染色体の複製とは無関係であり、こ のようなベクターの例は、プラスミド、ファージ、コスミド、ミニクロモソーム またはウィルスである。あるいは本発明のベクターは、宿主細胞に導入されると 、宿主細胞のゲノムに組み込まれて、その組み込まれた染色体とともに複製する ベクターでもよい。適切なベクターの例は、実施例５に例示されているような細 菌発現ベクターおよび実施例６に例示れているような哺乳動物の細胞系内で発現 するように設計された発現ベクターである。本発明のベクターは、上記定義の本 発明のＤＮＡ配列のいずれかを保育し、かつ上記定義の本発明のポリペプチドの いずれかを発現するのに用いられる。

したがって本発明は、ｐｓａａｏ、　３３９．４１５および４２５と命名されか つＤＳＭ　７４１０．ＤＳＭ　７４１１．ＤＳＭ　７４１２およびＤＳＭ　７４ １３という受託番号で、ブタペスト条約の規定にしたがって、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ 　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ　ｕｎｄ　Ｚｅ ｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ　ＧｍｂＨ（ＤＳＭ）のコレクションに、１９９３年１年 ２０日付けで寄託された発現ベクター：ならびに前記の寄託された発現ベクター のＤＡＮ配列と異なるがヒトに一カゼインの生物活性を有する同じポリペプチド またはその類似体もしくは変位体をコードするＤＮＡ配列を発現し、かつ上記定 義のように複製可能な発現を行う発現ベクターであって、発現されるＤＮＡ配列 が、に−カゼインの生物活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列にな るように、少なくとも一つのヌクレオチドが欠失し、置換されもしくは修飾され たかまたは少なくとも一つの追加のヌクレオチドが挿入された点で前記の寄託さ れたベクターのＤＮＡ配列と異なっている発現ベクター：からなる群から選択さ れる複製可能な発現ベクターに関する。

さらに、本発明は、ｐｓ２７０と命名され、ブタペスト条約の規定にしたかつて 、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｅｎ　ｕｎｄ　Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ　ＧｍｂＨ（ＤＳＭ）のコレクション に１９９２年１月２０日付けで受託番号ＤＳＭ　６８７８で寄託されたプラスミ ド、　ｐｓ４５９およびｐｓ４６０と命名されブタペスト条約の規定にしたがっ てＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅ ｎ　ｕｎｄ　Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ　ＧｍｂＨ（ＤＳＭ）のコレクションに １９９３年１月２０日付けで受託番号ＤＳ）Ｊ　７４１４およびＤＳＭ　７４］ ５て寄託されたプラスミド：ならびにＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１に示すＤＮＡ配 列とは異なるかヒトに一カゼインの生物活性を有するＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　２ に示すポリペプチドまたはその類似体もしくは変異体をコードするＤＮＡ配列、 または緊縮ハイブリッド形成条件下でＤＮＡ配列ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　ｌもし くはその一部分とハイブリッドを形成するＤＮＡ配列を存するプラスミド：から なる群から選択されるプラスミドに関する。

さらに本発明は上記定義の複製可能な発現ベクターを保有する細胞に関する。原 則としてこの細胞はいずれのタイプの細胞でもよい。すなわち、例えばイー、コ リのような細菌のごとき原核細胞、単細胞の真核生物、真菌類もしくは酵母例え ばサツカロミセスセレビシェ、または多細胞生物例えば哺乳動物由来の細胞であ る。哺乳類動物の細胞は本発明の目的のために特に適しており以下に考察する。

他の重要な態様で、本発明は、ヒトに一カゼインをコードするＤＮＡ配列を、特 定の宿主細胞内で複製可能なベクター中に挿入し、得られた組換えベクターを宿 主細胞の中に導入し、その宿主細胞を、ヒトに一カゼインを発現させるのに適切 な条件下でかつ適切な培地内もしくは培地上で増殖させ、次いでヒトに一カゼイ ンを回収することからなる組換えヒトに一カゼインの製造方法に関する。該細胞 を増殖させるのに使用する培地は、本発明の目的を達成するのに適切な通常のい ずれかの培地でもよい。適切なベクターは上記ベクターのいずれかであり、適正 な宿主細胞は上記細胞のタイプのどれでもよい。ベクターを構築しそれを宿主細 胞中に導入するのに用いる方法は、組換えＤＮＡの技術分野内でかような目的の ために知られている方法であり、その例は実施例５と６に示す。宿主細胞によっ て発現される組換えヒトに一カゼインは分泌され、すなわち細胞のタイプとベク ターの構成によって、細胞膜を通過して放出される。

上記の方法は、上記定義の本発明のポリペプチドのいずれかをすなわち本発明の ＤＮＡ配列に基づいて製造するのに同様に有用である。

ヒトに一カゼインが組換え宿主によって細胞内で産生される場合、すなわち細胞 が分泌しない場合は、該カゼインは、機械的手段、例えば音波処理もしくはホモ ジナイゼーションによるかまたは酵素もしくは化学的手段によって細胞を破壊し 、次いで精製することからなる標準の方法で回収することができる。

分泌させるには、ヒトに一カゼインをコードするＤＮＡ配列の前にシグナルペプ チドをコードする配列を先行させねばならない。このシグナルペプチドが存在す ることによってヒトに一カゼインの細胞からの分泌が確実に行われ、その結果、 発現されるヒトに一カゼインの少な（ともかなりの量が培養培地に分泌され、回 収される。

したがって、別の態様で本発明は、特定の宿主細胞内で複製可能なベクター中に 上記ＤＮＡ配列を挿入し、得られた組換えベクターを宿主細胞中に導入し、得ら れた細胞を適切な培養培地中もしくは培養培地上で本発明のポリペプチドを発現 する適正な条件下で増殖させ次いで該ポリペプチドを回収することからなる本発 明のポリペプチドの製造方法に関する。

したがって、特定の実施態様で本発明は、アミノ酸配列ＳＥＱ［ＤＮｏ：２また はその類似配列もしくは変異配列を存しかつヒトに一カゼインの生物活性を有す る組換えポリペプチドを、このポリペプチドを実質的に細胞内で産生ずる哺乳動 物、細菌もしくは酵母の細胞から単離する方法であって一組換えポリペプチドを 保有する細胞を培養培地から分離し、分離された細胞を破壊してその組換えポリ ペプチドの含有物を放出させ、任意に、破壊された細胞の混合物から細胞の断片 を除き、次いでポリペプチドを単離することからなる方法に関する。他の実施態 様で、本発明は、ヒトに一カゼインが細菌、哺乳類動物または酵母の細胞の培養 物から単離されかつヒトに一カゼインは実質的に細胞外に産生される方法に関し 、この方法は、特に上記のようにして実施することができ、上記の分離と破壊の ステップは、細菌、哺乳動物もしくは酵母の細胞を培養培地から除くステップと 取替えられる。

また本発明は、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　２中のアミノ酸配列２１−１８２または その類似配列もしくは変異配列を有しヒトに一カゼインの生物活性を有する組換 えポリペプチドならびにアミノ酸配列ＳＥＱ　１ＯＮｏ：２または前記アミノ酸 配列の類似配列もしくは変異配列のサブ配列を有する組換えポリペプチドであっ て、生成したポリペプチドがヒトに一カゼインの生物活性を有する組換えポリペ プチドに関する。さらに本発明は、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　２に示すアミノ酸配 列とは異なるアミノ酸配列を有しかつヒトに一カゼインの生物活性を有するポリ ペプチドが得られるように、少なくとも一つのアミノ酸残基が異なるアミノ酸残 基で置換されおよび／または少なくとも一つのアミノ酸残基が欠失または付加さ れた本発明のポリペプチドに関する。

特に本発明は、少なくとも一つのアミノ酸残基が、グリコジル化のような翻訳後 の修飾によって修飾された本発明の組換えポリペプチドに関する。

細菌もしくは酵母のような低級生物または哺乳動物の細胞系を、いくつかの目的 のための産生生物として用いて、前述のようにおよび実施例５もしくは６に記載 されているようにしてヒトに一カゼインを組換え生産することは、例えばヒトに 一カゼインの収率が中程度で充分な場合、短期間の産生が望ましい場合、または タンパク質特に乳タンパク質のような他の哺乳類由来の物質を実質的に含有しな い高純度のヒトに一カゼインが所望の場合には満足すべきものであるが、本発明 の組換えヒトに一カゼインの本発明の好ましい製造方法は、ヒトに一カゼインを その乳汁中に放出することができる非ヒト形質転換哺乳動物を使用する方法であ る。非ヒトの形質転換哺乳動物を使うと、大収量の組換えヒトに一カゼインを妥 当なコストで得ることができ、そして特に非ヒト哺乳類かウシ、ヤギ、ヒツジ、 ラマ、ラクダ、マウス、ラット、ウサギまたはブタの場合、例えば乳児用調合孔 の通常の成分である乳汁中に組換えヒトに一カゼインが産生され、そのためその 組換えヒトに一カゼインが乳汁ベースの製品の栄養補給剤として使用されるとき は大がかりな精製は必要がないという利点がある。さらに非ヒト哺乳類のような 高等動物中で産生されると通常、例えば上記の翻訳後のプロセシングおよび適切 な折り畳み（ｆｏｌｄｉｎｇ）について哺乳類タンパク質の適切なプロセシング がなされる。また実質的に純品のヒトに一カゼインを大量に得ることができる。

したがってさらに重要な態様で本発明は、非ヒト哺乳類の成熟雌の乳腺中で発現 可能なハイブリット遺伝子を形成するように、哺乳類の乳タンパク質をコードす る遺伝子中に挿入されたヒトに一カゼインをコードするＤＮＡ配列を有する哺乳 類の発現系に関する。

ヒトに一カゼインをフードするＤＮＡ配列は、好ましくはＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ： ２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする上記ＤＮＡ配列、また はヒトに一カゼイン遺伝子またはその類似遺伝子もしくは有効なサブ配列である 。

発現組織としての乳腺および乳タンパク質をコードする遺伝子は一般に、乳タン パク質は乳腺中で高い発現レベルで天然に産生されるので、非ヒト形質転換動物 内で異種のタンパク質を産生されるため用いるのに特に適切であると考えられる 。また乳汁は集めることが容易で大量に入手できる。この点について、組換えヒ トに一カゼインを製造するのに乳タンパク質の遺伝子を使用することは、さらに 、該カゼインが、発現の調節と産生場所（乳腺）によって天然の産生条件に類似 の条件下で産生されるという利点がある。本願で用いる“ハイブリット遺伝子” という用語は、一方では前記定義のようなヒトに一カゼインをコードするＤＮＡ 配列を有しそして他方ではバイブリド遺伝子の産生の発現を仲介できる乳タンパ ク質遺伝子のＤＮＡ配列を育するＤＮＡ配列を意味する。“乳タンパク質をコー ドする遺伝子２または“乳タンパク質遺伝子“という用語は、問題の組織すなわ ち乳腺にハイブリット遺伝子の発現を仲介しおよび目標にすることができる全遺 伝子ならびにその有効サブ配列を意味する。乳タンパク質遺伝子はβ−ラクトグ ロブリン、α−ラクトアルブミンまたカゼインの遺伝子でもよいが、乳清の酸性 タンパク質遺伝子が特に好ましい。通常、有効なサブ配列は、一つ以上のプロモ ータ領域、転写出発部位、３°　と５°の非コーディング領域および構造配列を 少なくとも含有するサブ配列である。ヒトに一カゼインをコードするＤＮＡ配列 は例えばベクター配列のような原核配列を実質的に含有していない方ガ好ましく 、これらの配列は、例えば、そのクローン後に、上記ＤＮＡ配列と結合すること がある。

ハイブリッド遺伝子は、当該技術分野で公知の方法を用いて、ヒトに一カゼイン をコードするＤＮＡ配列を乳タンパク質遺伝子に生体外で挿入することによって 作ることが好ましい。あるいはヒトに一カゼインをコードするＤＮＡ配列は、相 同的組換え法によって生体内で挿入することができる。

通常ヒトに一カゼインをコードするＤＮＡ配列は、選択された乳タンパク質遺伝 子の第一エキソンのうちの一つが、または第一エキソンおよび好ましくは調節を 行うのに重要であると考えられる５゛フランキング配の実質的な部分を含有する 該遺伝子の有効なサブ配列に挿入される。

ハイブリッド遺伝子は好ましくは、ハイブリッド遺伝子の産物が乳腺中に正しく 分泌されるようにシグナルペプチドをコードする配列を有している。このシグナ ルペプチドは一般に、問題とする乳タンパク質遺伝子中に通常見られるシグナル ペプチドまたはヒトに一カゼインをコードするＤＮＡ配列と結合しているシグナ ルペプチドである。しかしハイブリッド遺伝子の産物の乳腺中への分泌を仲介で きる他のシグナル配列も適切なものである。勿論、ハイブリッド遺伝子の各種要 素は、その遺伝子産物を正しく発現しプロセシングを行えるよう＼な方式で融合 しなければならない。したがって、選択されたシグナルペプチドをコードするＤ ＮＡ配列は通常ヒトに一カゼインを°コードするＤＮＡ配列のＮ末端部分に正確 に融合しなければならない。

ハイブリッド遺伝子中、ヒトに一カゼインをコードするＤＮＡ配列は通常その終 止コドンを含有しているがそれ自体のメッセージクリーバンス（ｍｅｓｓａｇｅ 　ｃｌｅａｖａｎｃｅ）とポリアデニル化部位をもっていない。ヒトに一カゼイ ンをコードするＤＮＡ配列の下流に、乳タンパク質遺伝子のｍＲＮＡプロセシン グ配列が通常保持されている。

多数の因子が特定のハイブリッド遺伝子の実際の発現レベルに関与していると考 えられる。プロモーターおよび上記の他の調節配列の性能、唱乳動物のゲノム中 の発現系を組み込む部位、乳タンパク質をコードする遺伝子中のヒトに一カゼイ ンをコードするＤＮＡ配列を組込む部位、転写後の調節を行う要素、および他の 類似の因子が、得られる発現レベルに対して極めて重要である。ハイブリッド遺 伝子の発現レベルに影響する各種の因子の知見に基づいて、当該技術分野の当業 者は、本発明の目的を達成するのに有用な発現系をどのように設計するか分かつ ているであろう。

各種の異なる乳タンパク質が乳腺によって分泌される。二つの主要グループの乳 タンパク質が存在している。すなわちカゼイン類と乳清タンパク質類である。異 なる種由来の乳汁の組成はそのタンパク質について定性的および定量的に変動す る。非ヒト唾乳動物は大部分が、３種の異なるタイプのカゼインすなわちα−カ ゼイン、β−カゼインおよびに一カゼインを産生ずる。もっとも普通のウシ乳清 タンパク質は、α−ラクトアルブミンとβ−ラクトグロブリンである。各種の起 源の乳汁の組成はさらに詳細にＣ１ａｒｋらの１９８７年の文献に開示されてい る。

使用される乳タンパク質遺伝子は、発現系が挿入されるのと同じ種由来のものか 、または他の種由来のものでもよい。この点について、乳腺に遺伝子を発現する ことを目的とする調節要素は、線の境界を越えて機能を有していることが報告さ れている（祖先が共通している可能性が原因かもしれない）　（Ｈｅｎｎｉｇｈ ａｕｓｅｎらの１９９０年の文献）。

本発明の発現系の構築に使用するのに適切な乳タンパク質をコードする遺伝子ま たはその有効なサブ配列は通常、各種の哺乳動物起源の乳清タンパク質遺伝子、 例えば好ましくはねずみ起源の乳清酸性タンパク質（ＷＡＰ）遺伝子、および好 ましくはヒツジ起源のβ−ラクトグロブリン遺伝子中に見られる。また各種の起 源のカゼイン遺伝子例えばウサギβ−カゼインおよびウサギβ−カゼインの遺伝 子が、ヒトに一カゼインの形質転換産生を行うのに適している。本発明に用いる のに好ましい遺伝子はマウスのＷＡＰ遺伝子である。というのはこの遺伝子は、 各種の形質転換動物の乳汁中に多数の異種のヒトタンパク質を高レベルで発現す ることができることが見出されているからである（Ｈｅｎｎｉｇｈａｕｓｅｎら の１９９０年の文献）。

好ましくは本発明の発現系に連結される他の配列は、高レベル発現を仲介するこ とができる所謂発現安定化配列である。このような安定化配列は乳タンパク質遺 伝子の近くの上流に見られるという強い徴候がある。

本発明の発現系中に挿入すべきヒトに一カゼインをコードするＤＮＡ配列は、ｃ ＤＮＡの配列でゲノムもしくは合成物起源またはそれを組合わせたものである。

所望のタンパク質をコードするｃＤＮＡを用いたとき、いくつかの発現系は最高 に機能することが知られているが、他の配列は満足すべき発現を得るにはイント ロンなどの調節領域の存在が必要であることが見出されている（Ｈｅｎｎｉｇｈ ａｕｓｅｎらの１９９０年の文献）。場合によっては、ベクター構造中に、ｃＤ ＮＡ要素に匹敵するゲノム構造を導入することか有利である（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ らの１９８８年の文献）。上記のイントロンとエキソンの構造体によって、ｃＤ ＮＡベースのベクターを用いたときより一層高度に安定した状態のｍＲＮＡレベ ルか得られる。

本発明において、“イントロン”という用語には、天然のイントロンの全体また はその一部分が含まれる。

別の態様で、本発明は、哺乳動物の乳タンパク質をコードする遺伝子中に挿入し たヒトに一カゼインをコードするＤＮＡ配列を有するハイブリッド遺伝子に関し 、そのＤＮＡ配列は、該ハイブリッド遺伝子を保有する非ヒト哺乳類の成熟畦の 乳腺中で発現可能な方式で乳タンパク質遺伝子に挿入される。このハイブリッド 遺伝子とその成分は、さきに、詳細に考察されている。このハイブリッド遺伝子 は、前述の本発明の発現系を構築する際の重要な中間体を構成している。

他の態様で、本発明は上記定義の発現系を保有する非ヒト哺乳類の細胞に関する 。その哺乳類の細胞としては胚細胞または前核が好ましい。発現系は以下に説明 する方法を用いて哺乳類の細胞に適切に挿入される。

他の重要な態様で、本発明は、上記定義の本発明の発現系を哺乳類の受精卵もし くは胚の細胞に注入してその哺乳類の生殖細胞系中に該発現系を組込み、次いで その得られた注入された受精卵もしくは胚を成熟雌哺乳類中で発育させることか らなる。

ヒトに一カゼインを発現することができる非ヒト形質転換哺乳動物の製造方法に 関する。

さらに重要な態様で、本発明はアミノ酸配列ＳＥＱ　１０　Ｎｏ・２またはその 類似配列もしくは変異配列を有しかるヒトに一カゼインの生物活性を存するポリ ペプチドを発現できる非ヒト形質転換哺乳動物の製造方法であって、上記ポリペ プチドをコードするＤＮＡ配列を非ヒト哺乳動物のゲノム中の染色体に組込む方 法に関する。

別の実施態様で、本発明は、βカゼインをコードする別のＤＮＡ配列またはその 類似配列、変異配列もしくはサブ配列を非ヒト哺乳動物のゲノム中の染色体に組 込むことからなる、上記の方法の改変法に関する。この改変は、β−カゼインを コードするＤＮＡ配列またはその類似配列、変異配列もしくはサブ配列に限定す べきではなく、特に、所望の組換えポリペプチドをコードするあらゆる適切なり ＮＡ配列が含まれる。

したがって本発明は、に−カゼインをコードするＤＮＡまたはその類似配列、変 異配列もしくはサブ配列を有する発現系、およびβ−カゼインをコードする別の ＤＮＡ配列またはその類似配列、変異配列もしくはサブ配列を哺乳類の受精卵も しくは胚細胞に注入して該発現系を該哺乳類の生殖細胞系中に組込み、次いでそ の得られた注入された受精卵もしくは胚を成熟雌の哺乳動物中で成育させること からなる方法に関する。

他の重要な実施態様で、本発明は、１）Ｉｌｉ乳動物の内在性ポリペプチド発現 性能を破壊して内在性ポリペプチドが実質的に発現されないようにし、次いでア ミノ酸配列ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　２またはその類似配列もしくは変異配列を有 しかつヒトに一カゼインの生物活性を有するポリペプチドが該哺乳動物中に発現 されるような方式で、本発明の発現系を該哺乳動物の生殖細胞系に挿入し、およ び／または２）内在性ポリペプチドまたはその部分をコードする遺伝子を本発明 の発現系で置換して、前記非ヒト哺乳動物を対応する内在性ポリペプチドを実質 的に発現できないようにすることからなる方法に関する。別の実施態様で、本発 明は、２種以上の内在性ポリペプチドを発現する性能が破壊される上記定義の方 法に関する。これらの内在性ポリペプチドはα、βもしくはに一カゼインのよう な一つ以上のカゼインであるがこれらのポリペプチドには限定されない。

内在性ポリペプチド発現性能を破壊する方法は、２種以上の組換えポリペプチド を発現する方法と組合わすことができることは明らかである。

本発明の″非ヒト哺乳動物“には、“所望の表現型″を有する“非ヒト形質転換 哺乳動物”を産生できるすべての非ヒト哺乳動物が含まれる。このような哺乳動 物には、非ヒト霊長類、マウスの種、ウシの種、イヌの種などが含まれる。好ま しい非ヒト動物としてはウシ、ブタおよびヒツジの種が挙げられるが、最も好ま しいのはウシの種である。

非ヒト形質転換哺乳動物に対する望ましい表現型は、限定されないか、雌の非ヒ ト形質転換哺乳動物の乳汁中に組換えポリペプチドを産生ずることである。

本発明の非ヒト形質転換哺乳動物は、選択された動物の標的胚細胞に“導入遺伝 子′を導入することによって産生される。

本発明の一つの態様で、導入遺伝子は、非ヒト形質転換動物の細胞のゲノムに入 れたときに所望の表現型を産生できるＤＮＡ配列である。特定の実施態様では、 導入遺伝子は、“組換えポリペプチド′をコードする“組換えＤＮＡ配列″で構 成されている。このような場合、導入遺伝子は発現されて組換えポリペプチドを 産生ずることができる。

哺乳動物の生殖細胞系への発現系の組込みはあらゆる適切な方法を用いて実施す ることができる。例えば、Ｈｏｇａｎ　Ｂ、　Ｃｏｎ５ｔａｎｔｉｎｉ、　Ｆ、 およびＬａｃｙ、Ｅ、、　”Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　 Ｅｍｂｒｙ。

”　、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　 Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８６年または国際特 許願公開第ＷＯ９１１０８２１６号に記載されている方法がある。

標的の胚細胞に、導入遺伝子を導入または導入遺伝子のフラグメントをオーバー ラツプさせる方法には、非ヒト動物の受精卵母細胞の前核もしくはＥＳ細胞の核 に導入遺伝子を顕微注射する方法がある。マウスの種に対するこのような方法は 当該技術分野の当業者゛にとって公知の方法である。あるいは導入遺伝子は、導 入遺伝子を含有するレトロウィルスを有する接合体を感染させることによって動 物に導入することができる（Ｊａｅｎｉｓｃｈ、　Ｒ，、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　 １．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７３巻、１２６０〜１２６４頁、１９ ７６年）。好ましい方法は受精卵母細胞へ顕微注入する方法である。

この好ましい実施態様では、まず受精卵母細胞が標準方法で顕微注入される。次 いでこれらの細胞は、“着床前の胚″が得られるまで生体外で培養される。この ような着床前の胚は約１６〜１５０個の細胞を合作しているものが好ましい。１ ６〜３２個の細胞段階の胚は通常、桑実胚と呼ばれている。３３個以上の細胞を 含有するこれら着床前の胚は通常、胚盤胞と呼ばれている。胚盤胞は、一般に６ ４個の細胞の段階で胞胚腔の空洞が発生するのを示す特徴がある。受精卵母細胞 を着床前の段階まで培養する方法としては以下の文献に記載されたものがある。

マウスの胚に関するＧｏｒｄｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ ｇｙ、１０１巻、　４１４頁、１９８４年および−Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　 ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ’式ｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、米国、ニューヨーク州、コールドスプリング ハーバ−１９８６年中のＨｏｇａｎらの報告；ウサギとブタの胚に関するＨａｍ ｍｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、　３１５巻、６８０頁、１９８５年：ヒツジの胚に関 するＧａｎｄｏｌｆｉら、Ｊ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　Ｆｅｒｔ、　、　８１巻、２ ３〜２８頁、１９８７年およびＲｅｘｒｏａｄら、Ｊ、　Ａｎｉｍ、　Ｓｃｉ、 　、　１６６巻、９４７〜９５３頁、１９８８年：ならびにウシの胚に関するＥ ｙｅｓｔｏｎｅ、　Ｗ、　Ｈ，ら、Ｊ、　Ｒｅｐｒａｄ、　Ｆｅｒｔ、　、　８ ５巻、７１５〜７２０頁、１９８９年、Ｃａｍｏｕｓら、Ｊ、　Ｒｅｐｒｏｄ。

Ｆｅｒｔ、、　７２巻、７７９〜７８５頁、１９８４年、およびＨｅｙｍａｎら 、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ、　２７巻、５９６８頁、１９８７年である。

かような着床前の胚は次いで標準方法によって適切な雌に転移させて、導入遺伝 子が導入されるときの発育の段階によって、形質転移動物またはキメラ動物を出 生させることができる。よ（知られているように、モザイク動物を交配させて真 の生殖細胞系形質転換動物を得ることができる。

導入遺伝子が組込まれる頻度は低いことが多いので、着床前の胚に導入遺伝子が 組込まれているのを検出することが非常に望ましい。本発明の一つの態様で、遺 伝子導入（ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉＳ）か起こったので、形質転換胚の着床を行 って形質転換動物を作ることかできる胚を同定する方法が提供される。この方法 では、−個以上の細胞が着床前の胚から除かれる。等分裂（ｅｑｕａｌ　ｄｉｖ ｉｓｉｏｎ）を利用する場合、胚は桑実胚期（３２個の細胞）を超えて培養しな い方が好ましい。着床前の胚が分裂すると（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｔｈｅｒｉｏ ｇｅｎｏｌｏｇｙ、　２２巻、５２１〜５３１頁、１９８４年に概説されている ）２個の“生肝（ｈｅｍｉ−ｅｍｂｒｙｏ）”が生成しした後出産予定日まで子 宮内で発育させることができる。着床前の胚の等分裂が好ましいが、かような胚 は、必ずしも細胞数が等しくない二つの生肝に意図的もしくは非意図的に不均等 に分裂することがあると解すべきである。特に必要なことは、上記胚のうちの一 つで以下に述べるように分析されない胚が子宮内で臨月まで発育するのに充分な 細胞数をもっているということである。特定の実施態様では、本願で述べるよう に分析されない生肝は、遺伝子が導入されて形質転換されていることが分かった ならば、非ヒト形質転換動物のクローン集団を生成させるのに使用される。

着床前の胚の分裂で生成した各生肝のうちの一つは、導入遺伝子がその生物のゲ ノムに組込まれたか否かを決定するために分析される。残りの生肝は各々、次い でその種の受容者の雌に着床させるのに用いるために保持される。

組込まれた導入遺伝子を含有する着床前の胚の同定は、各生肝の一つからのＤＮ Ａを分析することによって行われる。そのＤＮＡは一般に該生肝を溶解し、こう して放出されたＤＮＡを実施例８に記載したようにして分析することによって得 られる。

ポリメラーゼ連鎖反応を利用して導入遺伝子の全部または一部を増幅する。全導 入遺伝子を増幅するときは、導入遺伝子の反対側の末端における反対側のストラ ンドに各相補的な２個の拡張プライマーを増幅に使用する。一般に生肝から増幅 したＤＮＡは電気泳動に付し、次に、前記の２個の拡張プライマー間の導入遺伝 子の領域に相補的な標識付きプローブとハイブリッドを形成させる。このように すると増幅されたＤＮＡ配列の大きさが測定し易くなり、そして生肝が得られた （ここでは“形質転換生肝”と呼ぶ）着床前の胚の中に導入遺伝子が組込まれた か否かが提示される。分析された生肝が導入遺伝子をもっていたならば、残りの 未処理の形質転換生肝を受容者の親に着床させる。子宮内で発育させた後、組込 まれた導入遺伝子で与えられる所望の表現型を有する非ヒト形質転換動物は、子 宮内もしくは出産後に適切な方法で同定される。

着床前の胚への遺伝子導入を検出する上記の方法によって、非ヒト形質転換動物 を経済的にかつ時間を節約して生成させる方法か提供される。なぜならば上記の 検出法によって、形質転換動物を産生するのに必要な妊娠の回数が減少し、かつ 着床させた胚か非ヒト形質転換動物を産生ずる可能性がかなり増大するからであ る。上記の方法は遺伝子導入の頻度が非常に低いかまたは全くゼロであった動物 例えばウシの種にとっては特に重要である。

別の実施態様では、着床前の胚への遺伝子導入を検出する上記の方法に形質転換 胚のクローン集団を生成させるクローン化ステップを組合わせる。得られたクロ ーン集団はその後、受容者の雌に着床させて同じ遺伝子型を有する非ヒト形質転 換動物のクローン集団を産生させる。この点については、形質転換胚および／ま たは形質転換非ヒト動物が同じ“遺伝子型”をもっているということは、そのゲ ノムＤＮＡが、胚および／または形質転換動物の集団の個体間で実質的に同一で あるということを意味する。しかし、有糸分裂中に、各種の体細胞突然変異が起 こり、一つ以上の細胞および／または動物の遺伝子型が変化することがあると解 すべきである。したがって同じ遺伝子型を有する集団が、個体または分集団（ｓ ｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）の変化を示すことがある。

生肝は、形質転換生肝として同定された後、クローン化される。このような胚の クローン化はいくつもの異なる方法で行うことができる。一つのクローン化法で は、形質転換生肝を、着床前の段階で個々の卵母細胞を培養するのに用いたのと 同じかまたは類似の培地中で培養する。このようにして形成された“形質転換胚 “　（好ましくは形質転換動物胚）を次に“形質転換生肝”に分裂させる。そし てこの形質転換生肝は次に受容者の雌に着床させて、二つの非ヒト形質転換動物 のクローン化集団を形成させることができる。あるいは、得られた二つの形質転 換生肝を再び着床前の段階まで培養し、分裂させ次いで形質転換胚の段階まで再 培養する。同じ遺伝子型を有するクローン形質転換胚の所望数が得られるまで上 記の方法を繰返す。このような形質転換胚を次に受容者の雌に着床させて非ヒト 形質転換動物のクローン集団を産生させることができる。

好ましいクローン化法では、Ｐｒａｔｈｅｒら、Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　 、　３７巻、８５９〜８６６頁、１９８７年；　Ｒｏｂｌｅら、Ｊ、Ａｎｉｍ、 　Ｓｃｉ、　、　６４巻、６４２〜６６４頁、１９８７年の方法にしたがい核ト ランスファー（ｎｕｃｌｅａｒｔｒａｎｓｆｅｒ）によって、形質転換胚をクロ ーン化する。この方法によれば、形質転換胚の核を脱核卵母細胞に移植し、その 各細胞は次に胚盤胞の段階まで培養される。この時点で、形質転換胚は、核移植 法によってさらにラウンドクローン化を行うか、または受容者の親にトランスフ ァーして同じ遺伝子型を存する形質転換された子孫を産生させることができる。

早期遺伝子導入を検出する前述の方法に加えて、他の方法を遺伝子導入の検出に 使用できる。このような方法に組織を子宮内および出産後に分析する方法がある 。子宮内での分析はいくつもの方法で行われる。その中の一つの方法では羊膜腔 の経膣穿刺がエコースコープの案内によって行われる（　Ｂｏｎｇｓｏら、Ｖｅ ｔ、　Ｒｅｓ、　、　９６巻、１２４〜１２６頁、１９７５年；　Ｒｕｍ５ｅｙ ら、Ｊ、　Ａｎｉｍ、　Ｓｃｉ、　。

３９巻、３８６〜３９］頁、１９７４年）。この方法では妊娠約３５日〜１００ 日の間に約１５〜２０ｍ１’の羊水が回収される。この容積の羊水は、発育中の 胚の尿生殖路、皮膚およびおそらく肺からの細胞を約１．０００〜１２．０００ 個／　ｍｌ含有している。しかしこれらの細胞の大部分は死んでいる。しかしか ような細胞は、遺伝子導入成功の指標として導入遺伝子に関するＰＣＲ分析に付 されるゲノムＤＮＡを含有している。あるいは胎児細胞を絨毛膜穿刺で回収して もよい。この方法を経膣的にエコースコープの案内で実施できる。この方法では 、受容者の動物の胎盤、特に胎盤構造体（膣壁に固定されている）を穿刺するの に針が使用される。

このようなサンプリングはウシの種の場合、妊娠的６０日目に行われる。絨毛膜 細胞は必要に応じて母体組織から分離し、遺伝子導入成功の指標として導入遺伝 子に関するＰＣＲ分析に付される。

また遺伝子導入は出産後に検出することもできる。かような場合、導入遺伝子の 組込みは、形質転換されたと推定される動物の例えば耳もしくは尾から適切な生 検試料を採取することによって検出できる。約１〜２ｃｍの尾もしくは約５〜１ ０ｍｍ”の耳を採取し、次いでＨｏｇａｎら、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈ ｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｏ＋ｂｒｙｏ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８６年 の方法にしたがって、導入遺伝子に対してプローブを用いてサザンプロット法に 付される。

通常、注入された卵子がすべてヒトに一カゼインを発現できる形質転換創始動物 まで発育するわけではない。形質転換創始動物は例えば実施例８に記載されてい るようにして同定することができる。統計的な観点からこれらの哺乳動物の約１ ／２は雄である。同定された形質転換個体に基づいて、雄と雌の子孫を樹立する ことができかつ形質転換動物の安定した系統が樹立される。

ヒトに一カゼインをコードするＤＮＡ配列は、生殖細胞系に組込まれると、高レ ベルで発現されて、正しくプロセスされた機能性のヒトに一カゼインを産生ずる 。次いで組換えポリペプチドを収穫できる形質転換された雌が、次の世代に生ま れるようにすることができる。

遺伝子標的化（ｇｅｎｅ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）とは、選択された内在性配列に 相同性の外在性ＤＮＡ配列で相同的組換えを行うことによる、細胞の内在性染色 体の選択された染色体遺伝子座の指向修飾（ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｏｄｉｆｉｃ ａｔｉｏｎ）を意味する。遺伝子標的化は、内在性遺伝子の発現を促進、修飾お よび破壊するの（こ用いられている（Ｂｏｌｌａｇら、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｇ ｅｎｅｔ、　、　２３巻、１９９〜２２５頁、１９８９年および国際特許願公開 第ＷＯ９２１０３９１７号参照）　ＣｒＩ＠乳動物細胞内での相同的組換え）。

別の態様で、本発明は上記の方法で製造される非ヒト形質転換動物に関する。

形質転換細胞および形質転換動物を作るのに使用されるＤＮＡは好ましくはｃＤ ＮＡではなくてゲノムＤＮＡで構成されている。その理由は、導入遺伝子の発現 が好ましくは組織特異的発現ならびに時間特異的発現（ｔｅｍｐｏｒａｌ−ｓｐ ｅｃｉｆｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）に限定されているからである。導入遺伝 子がゲノムＤＮＡから誘導される場合、イントロン中または構造遺伝子から離れ た領域中に配置されているエンハンサ−などの調節要素のような重要なシス作用 を行う調節配列を含めることができる。このような調節配列は転写中およびＲＮ Ａプロセシング中に失われるので一般にｃＤＮＡで誘導される導入遺伝子では得 られない。

別の態様て本発明は上記の方法で製造される非ヒト形質転換動物に関する。

その最も広い態様における本発明の非ヒト形質転換動物は、特定のタイプの哺乳 動物に限定されないが、通常、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ヤギお よびウシからなる群から選択される。ヒトに一カゼインの大規模生産を行うには 、ヒツジ、ヤギ、ブタ特にウシのような一層大型の動物の方が乳汁産生量が高い ため通常好ましい。しかし、マウス、ウサギおよびラットも、こられ動物の取扱 いが一層簡単なので、形質転換動物の試験結果が、例えばウシが関与している場 合より迅速に得られるので重要である。

ヒトに一カゼインを産生ずることができる、上記定義の形質転換動物の子孫も本 発明の適用範囲内に含まれる。

上記の説明から、本発明によって初めて、ヒトに一カゼインを含有する乳汁を非 ヒト哺乳動物から製造することができるようになることは明らかであろう。そし てその重要性と有用性は本願の説明から明らかであろう。したがうて別の態様で 本発明は組換えヒトに一カゼインを含有する非ヒト哺乳動物由来の乳汁を含んで いる。特に重要なのは、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　２に示すアミノ酸配列からなる 上記本発明のポリペプチド、または上記のそのＤＮＡ配列もしくはその類似配列 もしくはサブ配列がコードするポリペプチドを含有する、非ヒト哺乳動物由来の 乳汁である。

一般に本発明の乳汁は上記の本発明の形質転換哺乳動物から得られる。

本発明のポリペプチドの重要な用途が栄養補給剤としての用途、特に乳児用調合 乳の代替物としての用途であることは上記の説明から明らかであろう。したがっ て本発明は特に本発明のポリペプチドを含有する乳児用調合乳に関する。

したがって重要な実施態様において、本発明は、アミノ酸配列ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ ｏ：　２またはその類似配列もしくは変異配列を有しかつヒトに一カゼインの生 物活性を存するポリペプチド、ならびに他の乳タンパク質、脂質、炭水化物、ビ タミン、無機質などのヒト乳児の栄養必要量を満たすのに必須の栄養分から選択 される少なくとも一つの他の乳児用調合乳の成分を含有するヒト乳児用調合乳の 製造法であって；アミノ酸配列ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：　２またはその類似配列も しくはその変異配列を有しかつヒトに一カゼインの生物活性を有するポリペプチ ドをコードするＤＮＡが非ヒト哺乳動物の乳腺内で発現できるような方式で非ヒ ト哺乳動物のゲノム中に本発明の発現系を導入し、前記の非ヒト形質転換哺乳動 物によって上記ポリペプチドを発現させ、前記非ヒト形質転換哺乳動物によって 発現されたポリペプチドを収穫し任意に精製し、次いで前記ポリペプチドによっ てヒト乳児用調合乳を調合することからなる製造方法に関する。

さらに別の態様で、本発明は、組換えヒトに一カゼイン特に上記定義の本発明の ポリペプチドを含有する乳児用調合乳に関する。特定の実施態様で、本発明のヒ ト乳児用調合乳は組換えヒトに一カゼインのみならず組換えヒトβ−カゼインも 含有している。本発明の乳児用調合乳は、乳児用調合乳の通常の成分に、精製も しくは部分的に精製した形態の組換えヒトに一カゼインもしくは組換えポリペプ チドを添加することによって製造することができる。しかし、上記定義の本発明 の乳汁が特にウシ起源の場合、本発明の乳児用調合乳は上記の本発明の乳汁で作 ることが通常好ましい。本発明乳児用調合乳は通常の手順で作ることができ、無 機質、ビタミンなどのような必要な添加物を含有させてもよい。

別の態様で本発明は、上記定義の本発明の非ヒト形質転換哺乳動物から乳汁を集 め次いでその乳汁からヒトに一カゼインを回収することからなるヒトに一カゼイ ンを得る方法に関する。

その乳汁は、問題とする嘆乳類から乳汁を集めるのに通常用いられる適切な方法 で集めることができる。

乳児用調合乳の製造 ウシα−ラクトアルブミンとカゼインに基づいた乳児用調合乳の処方は定義され ている（　Ｖ、　Ｓ、　Ｐａｃｋａｒｄ、“Ｈｕｍａｎ　Ｍｉｌｋ　ａｎｄ　［ ｎｆａｎｔ　Ｆｏｒｍｕｌａ”　、１４７〜１５４頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒ ｅｓｓ社、１９８２年）。乳清タンパク質とカゼインが６０　：　４０の比率で あるか、または乳汁１００ｍ１当たり合計１．５ｇのタンパク質に対して０．９ 重量％のα−ラクトアルブミン対０．６重量％のカゼインが提案されている。

カルシウムは、生物学的に適合性の例えばＳＩＧＭＡ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　００ ０社か市販している試薬形態のものか好ましく、好ましくは最小で５０１Ｔ１ｇ ／　ＩＱＯｋｃａｌ存在していなければならない。リンの最小レベルは２５ｍｇ ／　１００ｋｃａｌである。ナトリウム、カリウムおよび塩化物イオンの最小量 と最大量も遵守しなければならない。これらのレベルは、６７０ｋｃａｌルを提 供する調合乳中、それぞれ６〜１７．１４〜３４および１１〜２９ミリ当量（ｍ Ｅｑ）の範囲内にある。

１ミリ当量は、原子価で割り算した元素の原子量（ｍｇ）に等しい。浸透圧モル 濃度（１１当り溶質のモル数）は４００ｍ０５ｍを越えてはならない。

乳児用調合乳のカロリー濃度（ｃａｌｏｒｉｅ　ｄｅｎｓｉｔｙ）　６７０ｋｃ ａｌ／ｌは正常の満期出産乳児に対してほぼ最適のようである。調合品のカルシ ウム−リン比は好ましくは１．１：１．０以上で２゜１未満でなければならない 。最も好ましくはこの比率は少なくとも一歳年の大部分を通じて約１．５：１で ある。−歳年まで適切な比率はほぼｌ：ｌである。

乳児用調合乳は組成を変えることができるがかなり範囲が狭くきわめて厳密な制 限がある。一般に人乳の完全な代替品としでは、調合乳は好ましくは、カロリー の７〜１６％がタンパク質、カロリーの３０〜５４％が脂肪、カロリーの２〜３ ％がリノール酸および残りのカロリーが炭水化物起源で構成されている。調合乳 の脂肪成分は各種の植物性脂肪で構成されている方が好ましい。食品の多くの汚 染物は脂肪に可溶性なので、特に精製された植物性脂肪および植物油によって調 合乳の内容をより良好に制御することかできる。脂肪酸がシスからトランスに変 換し、そのため必須脂肪酸が減少するのを防止するため、低温（もしくは超高温 ）処理を加工全体を通じて使用することが好ましい。

成分の代表的リストは以下のとおりである。

水 ラクトース（コーンシロップまたはスクロースを使用できる） ヒトα−ラクトアルブミン ヒトβ−カゼイン ヤシ曲 大豆油 調整トウモロコシデンプン モノグリセリドおよびジグリセリド α−トコフェリル酢酸（ビタミンＥ） フィトナジオン（ビタミンＫ） アスコルビン酸（ビタミンＣ） 塩化チアミン・塩酸（ビタミンＢｌ） リボフラビン ジアノコバラミン（ビタミンＢ１２） ナイアシンアミド パントテン酸カルシウム ピリドキシン・塩酸（ビタミンＢ６） ビオチン 葉酸 塩化コリン 無機質源 三塩基性すン酸カルシウム 硫酸第二銅 硫酸第一鉄 塩化マグネシウム 塩化カリウム クエン酸カリウム ヨウ化カリウム 硫酸亜鉛 上記各成分の量は、ＦＤＡ　（Ｖ、Ｓ、Ｐａｃｋａｒｄ、　”Ｈｕｍａｎ　Ｍｉ ｌｋ　ａｎｄＩｎｆａｎｔ　Ｆｏｒｍｕｌａ”　、　１４７〜１５４頁、　Ａｃ ａｄａｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、１９８２年）およびｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ａ ｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ（Ａｍ、Ａｃａｄ、ｏｆＰｅｄｉａ ｔｒｉｃｓ　Ｃｏｍｍ、ｏｎ　Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、　 ７２巻、３５９　′３６３頁、１９８３年）によって推奨され、以下に開示され ている（調合乳に対して提案された標準、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、　５７巻、２ ７８頁、１９７６年を含めて、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｐｅ ｄｉａｔｒｉｃｓ、Ｃｏｍｍ１ｔｔｅｅ　。

ｎ　Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ：Ｃｏｍｍｅｎｔａｒｙ　ｏｎ　Ｂｒｅａｓｔ−Ｆｅｅ ｄ４ｎｇ　ａｎｄ　［ｎｆａｎｔ　Ｆｏｒｍｕｌａｓから修正）最大と最小のガ イドライン内に各栄養成分を保持するように調節される。

炭水化物源はラクトース（またはラクトースを含有する乳汁および乳清産物）、 スクロース、コーンシロップ固形物（グルコース源）およびデンプンである。

適切な濃稠化剤、乳化剤、酸化防止剤およびｐＨを調節する化合物が使用される 。米国では、乳児用調合乳に添加剤を使用する条件は、米国連邦規則法典（Ｃｏ ｄｅ　ｏｆ　Ｆｅｄｅｒａｌ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）（ＣＦＲ）　２１条　 １７２．６２０項および１８０項によって規制されている。

乳児用調合乳に用いられるビタミン添加剤は食料農業機構（Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　 Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）　（ＦＡＯ）によって 認可される。特定の食品系における加工必要条件、利用効率および／または安定 性によって、どの形態が最高に役立つかが決まる。

ＦＡＯは乳児用調合乳の無機質源も認可する。与えられる無機質添加物の適切性 は食料製品の組成と湿分のレベルによって決まる。さらに各食品は各法およびテ クスチヤの安定性に対してそれ自体の必要条件を課する。酸化的酸敗性は、不飽 和脂肪を含有する鉄および／または銅を強化した食品に依然として存在する問題 である。ゲル化は、濃縮液体乳児用調合孔に起こりつる問題である。還元鉄また は電気鉄は、乾燥食品によく使用されるが、液体調合乳中では沈降物として沈降 する。またＦＡＯはｐＨを調節するのに酸と塩基が必要であることを認識してい るが、これらは所定の無機質の全含量を決定する際に考慮しなければならない。

ある種の無機質化合物、例えばカルシウムとリンの化合物は、乳児用調合乳には かなり大量に必要である。他の無機元素は痕跡量しか必要でない。乳児用調合乳 の成分中の痕跡無機質は、各種の乾燥成分を再構成するのに用いる給水中に添加 できるものとともに考慮しなければならない。給水はその全品質によって、本発 明の目的のために処理してもしなくてもよい。しかし水質は仕上げ調合乳の痕跡 無機質の含量とともに監視しなければならない。

痕跡無機質を調合乳に加えるときは普通硫酸塩を使用する。

しかし硫酸イオンの許容レベルは特定されていない（Ａｎｄｅｒｓｏｎらの１９ ８２年の文献）。メトヘモグロブリン血症を起こす可能性があるため硝酸塩は通 常、調合乳には添加しない。痕跡量は、植物製品で製造した調合乳に生成する。

硝酸塩も生じるが、いくつかの給水中に時々高レベルで見られることがある。銅 は水のもう一つの潜在的毒性成分である。しかし、生物学的に許容可能な塩の組 成は本発明に使用されると考えられる。

調合乳に通常添加される無機質としては、カルシウム、リン、マグネシウム、鉄 、銅、ヨウ素、亜鉛、カリウム、ナトリウム、マグネシウムおよび塩素（塩化物 として）がある。従来の乳児用調合孔組成物は、タンパク質成分とともに有意な 量の無機質を保有しているウシまたは大豆のタンパク質源を添加する必要がある 。このような無機質が存在すると、製造された乳児用調合乳の無機質成分測定の 精度が低下する。電気透析法、イオン交換法および限外濾過法を含む従来の方法 が、タンパク質を、これらに結合している無機質などの汚染物から分離するのに 普通用いられる。

本発明による組換えＤＮＡによって誘導されたヒトタンパク質をヒト乳児用調合 乳に用いると、精製を要するタンパク質の量か減少するので、無機質含量をより 正確に測定できるのでタンパク質処理に要する費用か減少する。

未熟児用の配合物 予定日前に出産したかまたは低体重の乳児（２５００ｇ以下）に対する調合乳は 、タンパク質と無機質のレベルを評価することによって通常修正される。コーン シロップ固形物のようなより容易に吸収できる炭水化物源で製造するという特徴 によって、ラクトースレベルを通常量の１／３〜１／２まで低下させることが好 ましい。脂肪、カルシウムおよびリンは容易に利用可能な形態で利用できなけれ ばならない。

カロリー濃度は８００〜１０００ｋｃａｌ／Ｌまで上げ、タンパク質からのカロ リーは約１１％および脂肪からのカロリーは５０％とすることが好ましい。一般 にトウモロコシ油と大豆油は、未熟児によってかなりよく吸収されるようである 。本発明のポリペプチドは、そのカゼインタンパク質が乳清タンパク質より一層 容易に消化されるので未熟児用の乳児用調合乳に特によく適合しており、そのた め未熟児用、ならびにヒトカゼインの前述の有利な特性が有用な他の目的のため 非常に適切なタンパク質源を構成している。

乳児用調合乳に加えて、他の食品の配合物も形質転換牛乳由来の組換えポリペプ チドで補充することができる。例えば、がような組換えポリペプチドは通常の食 事配合物を補充するのに使用できる。

したがって、形質転換ウシの種の乳汁中にヒトに一カゼインを産生させることに よってヒトに一カゼイン源が提供される。

かようなヒトに一カゼインは、配合に用いるため形質転換孔から精製してもよい 。あるいは全形質転換孔を、好ましくは低温殺菌を行った後、液体もしくは乾燥 した形態で使用してもよい。

図面の説明 図１は実施例３に記載したようにして得られたヒトに一カゼインをコードする全 長のｃＤＮＡを含有するプラスミドｐｓ２７０を示す。

図２は、実施例４に記載されているようにして、５ａｉｌで消化させたｐＵｃ１ ９中にクローン化された精製人ファージ分離株＃４２由来のヒトに一カゼインゲ ノム配列を含有するプラスミドｐＳ４５９の環状地図を示す。ＥｃｏＲｌ制限部 位がに一カゼイン遺伝子フラグメントの配向に対して示されている。矢印はに一 カゼイン遺伝子の転写方向を示す。エキメンが黒色の円弧部として示され、その 番号はヒトに一カゼイン遺伝子中のそれらエキメンの位置を示す。

図３は、実施例４に記載されているようにして、Ｘｍａ　［とＨｉｎｄ■で消化 させたｐＵｃ１９中にクローン化したヒトに一カゼイン遺伝子のＰＣＲ増幅領域 由来のゲノム配列を有するプラスミドｐＳ４６０の環状地図を示す。制限部位は に一カゼイン遺伝子フラグメントの配向に対して示す。矢印はに一カゼイン遺伝 子の転写方向を示す。エキメンは黒色円弧部として示し、その番号はそのエキメ ンのヒトに一カゼイン遺伝子中の位置を示す。

図４はヒトに一カゼイン遺伝子座の物理学的地図を示す。エキメンとイントロン の体制および制限酵素部位の位置を示しである。エキメンは１〜５０番号を付け た黒色ボックス印で示す。

示されている制限酵素は次のとおりである。Ｅ＝ＥｃｏＲＩ　、　Ａ＝Ａｃｃ１ 　、　Ｘ＝Ｘｂａ　Ｉ、５＝Ｓａｃ　Ｉ、Ｐ＝Ｐｓｔ　Ｉ、Ｈ＝Ｈｉｎｄｌ［、 Ｋ＝Ｋｐｎ　Ｉである。二つのゲノムフラグメンのプラスミド源も示しである。

図５はｐＳ４５９の制限地図と１８種のサブクローンｐｓ４６１〜４７８の位置 を示す。これらのサブクローンは配列分析に使用した（実施例４）。ｐｓ４６１ 〜４６７は異なるＨｉｎｄＩ［フラグメントを表し、ｐＳ４６８〜４７０は異な るＸｂａ１７ラグメントを表し、ｐｓ４７１〜４７４は異なるＥｃｏＲＩフラグ メントを表し、およびｐＳ４７５とｐＳ４７６は異なるＰｓｔＩフラグメントを 表し、ｐＳ４７７はＡｃｅ　［／　ＥｃｏＲＩフラグメントを表し、およびｐＳ ４７８はＡｃｃ　Ｉフラグメントを表す。

これらフラグメントはすべてｐＵｃ１９中にサブクローン化した。

酵素の記号は、Ｈ＝Ｈｉｎｄｌｌｒ、Ｅ−ＥｃｏＲＩ　、　５＝Ｓａｃ　Ｉ、Ｘ ＝Ｘｂａ　Ｉ　、　Ｐ＝Ｐｓｔ　Ｉ　、　Ａ＝Ａｃｃ　Ｉ　５Ｋ＝Ｋｐｎ　Ｉで ある。

図６はｐｓ４６０の制限地図と６種のサブクローンｐＳ４７９〜４８４の位置を 示す。これらのサブクローンは配列分析に使用した（実施例４）。ｐＳ４７９と ｐｓ４８０は２種のＥｃｏＲＩフラグメントを表し、ｐｓ４８１はＨｉｎｄＩＩ ［／ＡｃｃＩフラグメントを表し、ｐＳ４８２はＡｃｅ　Ｉ　／　Ｓａｃ　Ｉフ ラグメント表し、ｐＳ４８３はＨｉｎｄＩ［／Ｘｂａ　Ｉフラグメントを表し、 およびｐＳ４８４はＸｂａＩ／５ａｃＩフラグメントを表す。これらのフラグメ ントはすべてｐＵｃ１９中にサブクローン化した。

酵素の記号は次のとおりである。Ｅ＝ＥｃｏＲＩ　５Ａ＝Ａｃｃ　Ｉ　５Ｘ＝Ｘ ｂａＩ、Ｈ＝Ｈｉｎｄｎ［。

図７は実施例５に記載されているようにして構築された発現ベクターｐｓ４１５ の環状地図である。この発現ベクターは組換えヒトに一カゼインのイー、コリ（ Ｅ、ｃｏｌｉ）による細胞内発現を仲介する。

図８は実施例５に記載されているようにして構築された発現ベクターｐＳ４２５ の環状地図である。この発現ベクターは組換えヒトに一カゼインのイー、コリに よる細胞外発現を仲介する。

図９は、発現ベクターｐｓ１４、ｐｓ４１５およびｐＳ４２５をそれぞれ保有す るイー、コ’Ｊ　ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳによって発現された組換えヒト に一カゼインの５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンプロット分析の結果を示す。

細菌の細胞は試料緩衝液中で煮沸し次いでタンパク質を分離した。ｐｓ１４は、 に−カゼイン配列を欠いておりかつ陰性対照として機能することを除いてｐｓ４ １５と同じである。組換えヒトに一カゼインは、高度に精製したヒトに一カゼイ ンに対するアルカリ性標識ポリクローメルウサギ抗体を用いて視覚化した（実施 例２）。培養条件と誘導法は実施例５に記載されているようにして実施した。

レーン１　予め染色された（　ｐｒａｓｔａｉｎｅｄ）分子量マーカー＋０６、 ８０．４９．５．３２．５．２７．５および！８．５ｋＤａ（ＢｉｏＲａｄ社） レーン２　未誘導ｐｓ１４ レーン３　誘導ｐｓ１４ レーン４　未誘導ｐｓ４１５ レーン５　誘導ｐｓ４１５ レーン６　未誘導ｐＳ４２５ レーン７　誘導ｐＳ４２５ レーン８　精製ヒトに一カゼイン（５，ｏｏｎｇ）図１０は実施例６に記載され ているようにして構築された発現ベクターｐｓ３３０の環状地図である。この発 現ベクターは組換えヒトに一カゼインの哺乳動物細胞による発現を仲介する。

図１１は組換えに一カゼイン遺伝子の哺乳動物細胞による発現の分析結果を示す 。全ＲＮＡをｃ１２７細胞がら製造し１％ホルムアルデヒド−アガロースゲル上 で分離し、ニトロセルロースの膜に移行させ、次いでｐｓ２７０由来の３２ｐで 標識を付けたに一カゼインプローブとハイブリッドを形成させた。実験手順はＡ ｕ５ｕｂｅｌらの１９９１年の文献にしたがって実施した。発現ベクターｐｓ３ ３０を保存する３種の細胞系を単離して分析した（実施例６）。対照として、ベ クターｐｓ３０６を保有するｃ２１７細胞系を使用した。ｐｓ３０６は、に−カ ゼインをコードする配列を欠いているとを除いてｐｓ３３０に類似している。

レーン１　ｐＳ３３６／Ｃ１２７細胞由来のトータルＲＮＡ５μｇレーン２　ｐ ｓ３３０／Ｃｌ２７細胞系９由来のトータルＲＮＡ５μｇレーン３　ｐｓ３３０ ／Ｃｌ２７細胞系１４由来のトータルＲＮＡ５μｇレ−ン４　ｐｓ３３０／Ｃｌ ２７細胞系２０由来のトータルＲＮＡ　Ｓ　ｕ　ｇサイズマーカーは左側に示し である。

図１２は実施例７に記載されているようにして構築した発現ベクターｐＳ３３９ の環状地図である。この発現ベクターは、形質転換動物の乳腺による組換えヒト に一カゼインの発現を仲介する。

図１３は、ｐＳ３３９における、マウスＷＡＰ／に一カゼイン組換え遺伝子の構 造を示す。ＷＡＰエキソンを黒色ボックス印で示し番号■〜■を付けである。に −カゼインｃＤＮＡは白色ボックス印で示し、ｃＤＮＡを挿入するのに用いた制 限部位ＫｐｎＩとＳａｌ　Ｉを示しである。要素の配向のための制限部位および 組換え遺伝子の単離のための制限部位も示しである。組換え遺伝子の転写方向は 矢印で示しである。

図１４は、実施例７に記載されているようにして、ヒトに一カゼイン形質転換動 物を同定するのに用いたＰＣＲプライマーの局在性を示す概略図である。その５ ′プライマーは、ＷＡＰとに一カゼインｃＤＮＡの融合位置の１４８ｂｐ上流の 位置に発するマウスＷＡＰ配列内の配列の相補的である。

図１５は、実施例７に記載されている実験から得られる、形質転換された可能性 のあるマウスのＰＣＲ分析結果を示すアガロースゲルである。ＤＮＡは、マウス から分離した尾の試料から調製し、実施例７と図１５に記載されているプライマ ーを用いるＰＣＲスクリーニング実験に用いた。得られるＰＣＲ増幅ＤＮＡ試料 は１％アガロースゲルで分離し、臭化エチジウムで染色した。Ｍは分子量マーカ ーであり、大きさくｋｂ）は左側に示しである。レーン１は陽性対照である、鋳 型ＤＮＡとしてプラスミドｐＳ３３９を用いて増幅して生成させたＰＣＲ産物； レーン２は陰性対照である、非形質転換マウスから調製したＤＮＡのＰＣＲ分析 ：レーン３〜１３、形質転換創始動物の可能性がある動物を表す異なる個々のマ ウスから調製したＤＮＡ試料のＰＣＲ分析。レーン７と１３において、ＰＣＲで 生成したバンドは明らかに目視可能であり、ＤＮＡ調製に用いた生検試料はこれ らの試料中の形質転換動物から採取されたことを示している。ＰＣＲで増幅され たフラグメントの予想の大きさ４８６ｂｐは右側に示しである。

図１６は、非形質転換マウスおよびｐＳ３３９の組換えＷＡＰＩに一カゼイン遺 伝子で形質転換されたマウス（１１−１１系）由来の乳汁試料のウェスタンプロ ットの分析結果を示す。これらのタンパク質はＳ　Ｄ　Ｓ　−ＰＡＧＥで分離し 、次いでＩｍｍｏｂｉｔｉｎ膜（Ｍｉ１１ｉｐｏｒｅ社）に移し、次いで高度に 精製したヒトに一カゼインに対するアルカリホスファターゼの標識をつけたポリ クローナルウサギ抗体で可視化されている（実施例２）。

レーン１　ｐＳ３３９形質転換マウス１１−１１系由来の乳汁２μｌレーン２　 非形質転換マウス由来の乳汁２μ１図１７は、実施例７に記載されている、に− カゼインイントロン配列を含有するマウスＷＡＰ／に一カゼイン組換えミニ遺伝 子の構造を示す。ＷＡＰエキソンは黒色ボックス印で示し、に−カゼインエキソ ンは番号１〜５を付けた白色ボックス印で示す。ヒトとマウス起源のＤＮＡフラ グメントが表示した制限部位で融合されている。

図１８は、実施例７に記載されている、に−カゼインイントロン配列を含有する マウスＷＡＰ／に一カゼイン組換えミニ遺伝子変異体の構造を示す。ＷＡＰエキ ソンは黒色ボックス印で示し、に−カゼインエキソンは２〜５の番号をつけた白 色ボックス印で示す。ヒトとマウス起源のＤＮＡフラグメントが表示した制限部 位て融合されている。

引用文献 ヨーロッパ特許公告第０２４７４９４号ヨーロッパ特許公告第０２６４１６６号 （Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　ＩｎＣ５社） ヨーロッパ特許公告第０２７９５８２号（Ｂａｙｌｏｒ　ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ 　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ） 国際特許願公開第ＷＯ３２１０４４４３号（Ｏｈｉｏ　Ｌｌｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ）国際特許願公開第ＷＯ３８１００２３９号（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　 ＰｒｏｔｅｉｎｓＬｔｄ、社） 国際特許願公開第ＷＯ３８１０１６４８号（Ｉｍｍｕｎｅｘ　Ｃｏｒｐｏｒａｔ ｉｏｎ社）国際特許願公開第Ｗ０９１１０３５５１号（Ｔｓｉ−Ｍａｓｏｎ　Ｒ ｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ社） 国際特許願公開第ＷＯ９１１０８２１６号（Ｇｅｎｐｈａｒｍ　Ｉｎｔｅｒｎａ ｔｉｏｎａ１社） 国際特許願公開第ＷＯ９２１０３９１７号（Ｇｅｎ−Ｐｈａｒｍ　Ｉｎｔｅｒｎ ａｔｉｏｎａ１社） （以下余白、次頁につづく） °　＾Ｌａｘａｎｄａｒ、　ＬＪ、、　Ｓｅａｗａｒｔ、　Ａ、Ｆ、、　Ｈａｅ ＫｉｎＬａｖ、　Ａ、Ｇ、、　１ｃａｐｅＬｉｎｓｌｃａｖ＝B Ｔ、Ｖ、　、　τｋａｃｈ、Ｔ、Ｍ、、Ｇａｒｏｄａｃｓｋｙ、５．１．、Ｅｕ ｒ、Ｊ、ＢＬＯＣｊｌｌｌｌ！１ｓｅＴ７．　Ｌ７８゜３９５．４Ｏｆ、１９８ ８ −　ＡｆｆｉｅｒＬｃａｎ　ＡＣ１ｄ＠ｔｎｙ　ｏｆ　Ｐｅｄｔａ：ｒｉｅｓ、 Ｃ０１１１１！１１（ｅｌ！１１．Ｏｎ　Ｎｕｃｒｉｅｔｏ氏F　Ｃｏｍｍａｎ ｃａｒｙ ｏｎ　Ｂｒａａｉｅ−Ｆｅｅｄｉｎｇ　ａｎｄ　Ｉｎｆａｎ＋：Ｆｏｒｍｕｌａ ｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｐｒｏｐｏｓａｄ　５ｃａｎ−ｄ１τｄｓｆ口ｒ　ｆ ｏｒｍｕｌａｓ、Ｐｅｄｉａｃｒｘｃｓ　５７．　２７Ｂ−２８５（１９７６） −ｍａｒｉｃａｎ　ＡｃａｄｅＩＩＩｙ　ｏｆ　Ｐｅｄｉａｃｒｉｃｓ、　Ｃｏ ｍｍ１ｃｅｔｅ　ｏｎ　Ｎｕｃｒｉｃｉｏｎ、　Ｐｅｄｉａモ窒奄モ■ ７２．３５９−３６３　（１９８：ｌ）−八ｎｄｅｒｓｏｎ、Ｓ、Ａ、、Ｃｈｉ ｎｎ、！（，１，、Ｆｉｓｈｅｒ、に、Ｄ、ＨＬｓｅｏｒｙ　ａｎｄ　ｃｕｒｒ ｅｎｃｓｃａｃｕｓ　ｏｆ　１ｎｆａｎｃ　ｆｏｒＩ！Ｉｕｌａ、　ｍ、　Ｊ、 　Ｃｌ１ｎ、　Ｎｕｅｒ、３５．　３８Ｌ−３９７，１９８２・　＾ｎ１ａｎｓ ｓＯｎ、Ｃ，、ｋｎｄｅｒ：５ｓｏｎ、Ｂ、、Ｌｉｎｄｓｔａｄｃ、　Ｒ，ａｎ ｄ　Ｓｖａｎｂｏｒｇ、Ｃ，Ａｎｃｉ・！ｄｈｅｓｉｖ＠ａｃｃｉｖｉｔｙｏＥ ｈｕｍａｎｃａｓａｉｎａｇａｉｎｓｃＳｃｒａｐ仁ｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍ ｏｎｉａｓａｎｄ　）ｌａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　１ｎｆＬｕｅｎｚａｅ、　Ｍｉ ｃｒｏｂｉａＬ　Ｐａｅｈａｇｅｎｅｓｉｓ　８．３１５−３２３゜−ＡｕＳｕ ｂｅｌ、Ｆ、Ｍ、、Ｂｒｅｎｅ、Ｒ，、にｉｎｇｓｅｏｎ、Ｒ，Ｅ、、Ｍｏｏｒ ｓ、Ｄ、ＤｌＳｅｉｄａａｎ。

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−　Ｊａｅｎｉｓｃｈ、Ｒ，（１９７６）、Ｐｒｏｃ、、’／ａｃｌ　Ａｃａｄ 、ＳｃＬ、ＵＳＡ、７３．　１２６０−１２６４−　Ｊｏｕｌｅｓ、　Ｆ’、、 　Ｐａｒｋｅｒ、　Ｆ、、　Ｆｌｏｃｈ、　Ｆ、、　Ｍｉｇｌｉｏｒａ、　Ｄ、 、　Ａ１１ｉｅｄ、　？ＺｅｒｉａＬ、　Ａ、　ａｎｄ　１ＪｅＬｎａｒ、　Ｃ ，Ｈ，ＩｍｕｎｏｓｃｉｍｕＬａｃｉｎｇ　５ｕｂｓｃａｎｅａｓ　Ｅｒｏ＝ｈ ｕａａｎ　ｃａｓｅｉｎ、　Ｊ、　１ｏｍｕｎａｐ？ｕｎ＋ｕｃａ１３．１６４ −１６９．１９８２−　ＪｏｌＬａｓ、’Ｐ　、Ｌｅｖｙ−ＴｏＬａｄａｎｏ、 Ｓ、、ＦＬａｃ、八、Ｍ、５ａｒｉａ、Ｃ，、ＣＬｌｌｅｓｓｅｎ。

Ｄ、、　Ｔｈ０ａ＋Ａｉｄｉ！、　Ａ、、Ｄｕｎｎ、　Ｆ、ｌＪ、、　Ｃａａｎ 、　Ｊ、Ｐ、　Ａｎａｌｏｇ　ｂａｄ：ｗｅａｎ　ｆｉｂｒ奄獅潤| ｇ＠ｎａｎｄｃａｓｅｉｎ、εｆｆａｃｃｏｆａｎｕｎムｃａｐｔｐｃｉｄａｉ ｓｏＬａｅｅｄｆｒｏｍｘ−ｃａｓｅｉｎａｎ　ｐＬａｃｅＬｅｅ　ｆｆｕｎｃ ｅｉａｎ、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　ＢＬｏｃｈｅｍ、　１５１１．　３７９−３８２ ．１９８６°　にｉｎｇ、　Ｄ、ａｃ　ａｌ、（１９８ｇ）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ 　Ｐ！ｅｐｒｏｄｕｃｃＬｏｎ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｒｎｅｎ：　P゜ ５７・６２゜ ・Ｌ６ｎｎｅｒｄａ１．Ｂ、、　Ｂｅｒｇｓｃｒｏａ＋、　Ｓ、　Ａｎｄｅｒｓ ｓｏｎ、　ＹｌＨｊａｌｍａｔｓｓｏｎ　に５ｕｎｄｑｖｉｓｃ、　Ａに、ａｎ ｄ　）ｌａｒｎａＬｌ、　Ｏ，ＣＬｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ 　ｏｆ　ａ　ｃＤＮＡ＠ｎｃｏｄｉｎｇ　ｈｕｘＬＬｎ　ａ＋ｉｌｋβ−ｃｉｉ ａｉｎ、　ＦＥＪＩＳ　Ｌａｃ：、　２６９．　１５３−１５６．　１９９０・ Ｌｕ５ｋｙ、　Ｋ、、　ａｎｄ　！１ｏｃｃｈａｎ、　Ｍ、Ｒ，、Ｃｅ１ｌ　３ ６．１９１４０１．１９８６−　Ｋａｒａｙａｍａ、　Ｓ、、　ＭｉｃａｃｈＬ 　Ｈ，、τ１ｎ直ム　ｄ、、τ０ｚｉｚｕｌｃａ、コｉ、、　５ｕｚｕｋｉ、　 Ｈ５仁ｕｄｉ＠ｓｏｎ；ｈｅｉｃｃｉｏ、′ｅｓｔｃａａｎｄａｎｃｉｈｙｐｅ ｒｃｅｎｓｉｖｅａｃｃｉ〜°ｔｃｙｏｆａｎ−ｇｉｏ仁＠ｎ５ｉｎ　Ｌ　−ｃ ｏｎｖ＠ｒ：ｉｒ＋ｇ　ｅｎｚｙｍｅ　１ｎｈｉｂｉｃｏｒｓ　ｄｅｒｉｖｅｄ 　ｆｒｏｍ　ｃａｓｅｉｎ。

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・Ｐｘｒｒｉｓｈ　ｅｅ　ａｌ、　（１９８６）　Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇ ｙ　２５．５９Ｌ−６００−Ｐａｒｒｉｓｈ　ｅｃ　ａＬ、　（１９８１１１Ｒ ｉａｌ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　Ｊｌｌ、　１１７１−１１８０・　ＰａｖＬａｋｉ ｓ、Ｃ，Ｍ、、ａｎｄ　Ｈａｍｅｒ、Ｄ、Ｈ，、Ｆｒｏｅ、ＮａｃＬ、Ａｅａｄ 、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８０゜３９７−４０１．　Ｌ９Ｂ］ ＯＣａ　ｃｏＬＬ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　（１２，２６９−２７５ ，１９８１・Ｐｒ１ｃｒｖｒｅｃａｈ、（Ｌ９８７Ｔ３ｉ０Ｌ尺ａｐｒｏｄ、３ ７．８５９−８６６・　Ｒｅｘｒｏａｄ　ｅｃ　ａＬ、（１９１１８）　Ｊ　＾ ｎｉｍ、Ｓｃｉ、６６、　９ム７．９５］−Ｒｏｂｅｓ　ｅｃ　ａＬ、　（１９ ８７）　Ｊ、　ＡｎＬｒｓ、　Ｓｃｉ、　６４．６４２−６６＝−Ｒａｗｌａｎ ｄ、ＳＪ、Ｊ、Ｄａｉｒｙ　Ｐ、ｅｓ、９．　ム７−５７．　１９３８・Ｒｕｂ ｎｉｔ：、　Ｊ、　ａｎｄ　ＳｕｂｒａｍａｎＬ、　Ｓ、　（１９８４）　Ｍｏ １．　Ｃａ１１．　Ｂｉｏｌ、　４．２２５３−−５ａｎ＋ｃ＋ｒｏｏｋ、　Ｊ 、Ｆｒ１Ｃｓｃ＋１．　Ｅ、Ｆ、　ａｎｄ　Ｍａｎｉａｃｉｓ　τ、Ｅ、　Ｍｏ １ｅｃｕｌａｒ　ｃｒａｎｉ獅■B ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ＩＩａｎｕａｌ、２＊ｄ　ａｄ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ ｊｎｇ　）ｌａｔｔ＋ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　？τｅ唐■ −５ａｒｖｅｒ、Ｎ、、Ｂｙｒｎｅ、Ｊ、Ｃ，、ａｎｄ　ＨｏｗｅＬＬ、Ｐ、Ｍ 、、Ｐｒｏｃ、ＮａｅＬ　八ｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳ＾７９．７１４７−７１５１．１９８２・　５Ｌｒａｒｄ　ｅｅ　ａＬ、（ １９８８）　Ｋｏｌ、Ｒａｐｒｏａ、３９．　５４６−５５２−　５ｃｉｎ、Ｅ 、Ｙ、Ｃｈｅｒｎｉｌｃｏｖ、　ｌ（、Ｐ、　Ｆａｎｏａｔｉａｎ　ｏＥ　ａ　 ｐｅｐｃｉｄｅ　１ｎｈｉｂＬ：ｏｒ　ｏ■ ｇａｓｔｒｉｃ　ｓａｃｗｔｃｉｏｎ　ｆｔｏｍ　ｒａｃ　ｍ１ｌｋ　ｐｒｏｃ ｅｉｎｓ　ｉｎ　ｖＬｖｏ、　Ｂｕｌｋ　Ｅｘｐ、　ＲＬｏk −５ｃｕｄＬａｒ、Ｆ、ＩＪ、、Ｒｏｓ＠ｎｂｅｒｇ、八、Ｈ，、Ｄｕｎｎ、　 Ｊ、Ｊ、ａｎｄ　Ｄｕｂｅｎｄｏｒｆｆ、Ｊ、ｔＪＵｓｅ　ｏｆτ７　ＲＮＡ　 Ｐｏｌｙｍｅｒａｓａ　ｃｏ　ｄｉｒａｃｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａ ｔｏｎｅｄ　ｇａｎｇｓ、　Ｉ■ Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥｎｚｙｍｏＬｏｇｙ、　ａｄ、　Ｄａｖｉｄ　Ｖ、　 Ｇｏａｄｄｅｄ、　ｐ、　、６０−８９．　Ａｃａｄａｏａ奄■ Ｐｒａｓｓ、１９９０ −　ｕａＬｌ　ｅｃ　ａｌ、（１９８５）　Ｂｉｏｌ、Ｒａｐｒｏｄ、コ２．６ ム５−６５１゜−ｕＬＬＬＬ五Ｇ５ｅｃａＬ、（１９８４）ｒｈｅｒ上ｏｇｅｎ ｏｉｏｇｙ２２．５２に一５３１ＩＣＬＯＩ’ｌ　Ｏ（ｐＨｐｃＬｄｅｉ　ｒ＠ ｓｕｌｃｔｎｇ　ｆｒｏｌＩｃａｓｅｔｎ　ｈｙｄｒｏＬｖｓｔｓ　Ｌｎ　ｃｈ ｅ　５＝ｏｎ{ａｅｈ ｏｆ仁ｈｅ　ｅｉＬｆｆ、　ＪＡｇｒｉｃ、　ａｎｄ　Ｆｏｏｄ　Ｃｈａｏｓ、 　３５：ＬｋＢ−Ｌ５６　（１９８７）（以下余白、次頁につづく） 実施例 以下の実施例は本発明を例示するのを目的とするものであり本発明を限定するも のではない。

本発明の発現系の構築および該発現系の分子生物学的特性決定には組換えＤＮＡ の技術分野で一般に公知の標準方法を使用する。特にことわらない限り、使用す る方法はＳａｍｂｒｏｏｋらの１９８９年の文献とＡｕ５ｕｂｅｌらの１９９１ 年の文献に記載されている方法である。

定義 ＤＮＡのハイブリッド形成 例えばニトロセルロースフィルター上に存在するＤＮＡを２ｘ　ＳＳＣＣＩ　Ｘ 　ＳＳＣ：０．１５Ｍ　ＮａＣ１，０，００１５Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ７゜ ０〕で濡らし、予め加温した（６７℃）プレハイブリダイゼーション溶液の入っ た熱シールプラスチックバッグ内に入れた。

プレハイブリダイゼーションは６７°Ｃで２時間行う。その間バッグはゆるやか に振盪する。上記溶液を予め加温した（６７°Ｃ）ハイブリット形成溶液と交換 し、放射能プローブを添加し、バーｒブリッド形成を６７゛Ｃで１８時間行う。

バッグはゆるやかに振盪し、ニトロセルロースフィルター上の液体か常に移動す るのを保証する。ハイブリッド形成後、洗浄工程を実施する。

放射能プローブは、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　ｌに示すＤＮＡ配列またはその一部 分特にアミノ酸１〜２１０に対応するヌクレオチドのようなコーティング部分、 または上記定義のＤＮＡ配列の有効なサブ配列に基づいて、例えばＳａｍｂｒｏ ｏｋらの文献に記載されている公知の方法を用いて製造される。

使用されるプレハイブリダイゼーション溶液とノへイブリッド形成溶液は、ＩＯ Ｘデンハート溶液、４ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ。

ｌＯｕ　ｇ／ｍｊｐｏｌｙＡ、５０℃ｇ／＋＋＋ｊ’の被分析変性ＤＮＡおよび 変性（熱による）放射能プローブで構成されている。フィルターは、予め加温し た（６７°Ｃ）溶液；ｌＯ×デンハート、２ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ内で２× １５分間洗浄し、次いでｌ　ｘｓｓｃ、０．１％ＳＤＳで４×１５分間洗浄する 。それらのフィルターを風乾し、Ｖｉｔａ−Ｗｒａｐをかぶせ次にＸ線フィルム を増感スクリーンを使用もしくは使用せず１こ、上記フィルターに３時間〜３週 間露出させる。

実施例１ 未変性に一カゼインの人乳からの精製 人乳を１５．０００Ｘｇで４５分間遠心分離し浮遊脂肪層を除いた。

生成した脱脂乳をＨＣＩでｐＨ４，３まで酸性にし、室温で１時間撹拌しながら インキュベートし次いで１８，０００Ｘｇで９０分間遠心分離に付した。生成し たペレット（カゼインの画分）を２０ｍＭエタノールアミン、６Ｍ尿素、ｐ）ｔ ９．’５に溶解し次に同じ液に対して透析させ、次いで振盪しなからへキサンで 数回抽出した。抽出後、水相を水に対して透析させて次に凍結乾燥させた。

上記の凍結乾燥されたカゼイン画分を、５０ｄイミダゾール−ＨＣｌ　ｐＨ７， ０，０，５％ＳＤＳ、０．５％２−メルカプトエタノールに溶解し、３７℃で１ 時間インキュベートし、次いで２−メルカプトエタノールが０．０１％である巳 とを除いて同じ緩衝液で平衡化させた１、６Ｘ１２０ｃｍのセフアゾ、ソクスＧ −２００カラム（こカロヌ、ｔこ。

クロマトグラフィーは室温のみならず４°Ｃでも起こる複合体の生成を避けるた め３７゛Ｃで行った。に−カゼインか溶出すると予想される溶出画分と炭水化物 含量（こつり）て分析し、炭水イし物を含有する両分をさらに精製するため（こ ブールした。この画分の主な不純物はβ−カゼインでありブール中のタンノくり 質の約９０％を構成していた。そのブールは第一（こ４０％メタノール（二対し て透析し次１ｍ２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐ）１６．８．０．１％Ｔｗｅｅ ｎ２０．０．０１％２−メルカプトエタノール（こ対して透析した。

上記の不純物からに七ゼインを取出すため（こ、上記ブールが透析されたのと同 じ緩衝液で平衡化させたＩＸ６．５ｃｍのヒドロキシアパタイトのカラムに注入 し、０．０２〜０．４ＭのＩノン酸カリウム勾配液を用いて溶離した。この場合 も、複合体の生成を避けるためクロマトグラフィーは３７°Ｃで行わね（ｆなら な力１つだ。

大部分のに一カゼインは上記カラム（こ結合しな力１つた力１β−カゼインはほ とんど完全に捕捉された。その未結合の物質をブールし、水に対して透析し次い で凍結乾燥した。に−カゼイン（ま、Ｓ　Ｄ　５−ＰＡＧＥで分析して３５〜４ ９ｋＤａ［の位置（こ（Ｘや（すた不鮮明なバンドとして見出されたが、クーマ シー・ブＩＪ　ＩＪアント・フ゛ルー染料で弱く染色された。

上記タンパク質の所在はアミノ酸分析（こよって検出した力く、イブロイシン／ ロイシン比が高いこと力（このタンノくり質の最も特徴的な特性である。またこ のタンノ（り質（よ、力・ような高度（二グリコジル化されたタンノくり質に対 して予想されるよう（こシ・ツク試薬によって染色された。

実施例２ に−カゼインに対して反応性のポリクローナル抗体の製造と精製 実施例１に記載されているようにして精製されたに一カゼインを用いてウサギを 免疫化した。に−カゼインに対して反応性の抗血清か得られたときその抗血清は 、乳清タンパク質とβ−カゼインの両者と交差反応し、ならびにタンパク質プロ ッティングに用いた場合はイー、コリタンパク質と交差反応した。それ故に、多 数の方法を用いて抗血清の特異性を増大させた。

第一に、抗血清をイー、コリの細胞溶解物とともにインキュベートして、イー、 コリタンパク質に対して反応性の非特異的抗体を吸着させて沈殿させた。この抗 血清を１時間インキュベートした後遠心分離（５０００ＸｇＳ１５分間）に付し 、生成したペレットを廃棄した。第二に、抗血清をさらに精製するため、高度に 精製された組換えβ−カゼインをＣＮＢｒで活性化されたセファロース上に固定 化し次に抗血清をこのカラムを数回通過させてβ−カゼインに対して反応性の抗 体を吸着させた。第三に、実施例１に記載されているようにして人乳から製造し た未変性に一カゼインをＣＮＢｒ活性化セファロースに固定化し、上記抗血清を このゲル上でアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。第四に、上 記抗血清を人乳から製造した乳清タンパク質で沈殿させた。これらのすべてのス テップで精製された抗血清は、タンパク質プロッティング法で分析すると、やは り他の乳タンパク質といくぶん交差反応を行ったが、乳清ンパク質試料が電気泳 動法で分離され、エレクトロプロ・ントされ、次いでこの抗血清を用いて染色さ れると、に−カゼインとはるかに強力に反応した。

上記の交差反応性は、人乳から純粋なβ−カゼインと純粋なに一カゼインを製造 することが非常に困難であることによって説明できる。さらにこれらカゼイン類 は、乳清タンノくり質かカゼインの画分中に存在しているのと同じように、乳清 画分中に常に少量存在している。このため、免疫化用に完全に純粋なタンパク質 を得ることが極めて困難でかつ他の乳タンパク質を完全に含有していないカゼイ ンカラムを製造することも困難であるということになる。それ故、得られた抗血 清は最終的に、高度に精製するのではなくて特異的抗体で強化されるか多数の精 製法が使用されている。

実施例３ ヒトに一カゼインをコードするｃＤＮＡのクローン化と配列決定 本発明の発現系の構築およびその分子生物学的特性決定には、組換えＤＮＡの技 術分野で一般に公知の標準方法か用いられる。

特にことわらない限り、使用される方法はＳａｍｂｒｏｏｋらの１９８９年の文 献に記載されている方法である。

ヒト乳腺から単離した組織生検試料から調製したｍＲＮＡから得られるλ−ｇｔ ｌｌヒト乳腺ｃヒトＡライブラリーを作製した。上記生検試料のドナーは授乳婦 であった。このライブラリーは実施例２によって製造されたに一カゼインポリク ローナル抗体を用いる免疫学的方法でスクリーニングした。

使用した緩衝液は、Ｔ　Ｂ　Ｓ　（５０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ　ｐＨ７，９，１ ５０ｍＭＮａＣ１）　、　ＴＴＢＳ　（０，０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ） であった。

利用した手順は次のとおりであった。イー、コリＹ１０９０細菌を、５０μｇ／ −のカルベニシリンを含有するＬＡプレート上で増殖させた。単コロニーを単離 し、次いで０．２％マルトースと１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ＋を含有するＬＢ中で一夜 増殖させた。その培養物０゜４艷を希釈されたライブラリーファージと混合し、 ３７℃で１５分間吸着を行わせた。この感染させた培養物を軟アガロース７ｍ１ （ＬＢ中０．７５％のアガロースおよび１０ｍＭ　Ｍｇ５０４）と混合した。

得られた軟アガロース混合物を１５０ｍｍＬＡプレート上に注いだ。

これらプレートを、プラークが目視可能になるまで４２°Ｃにて約３．５時間イ ンキュベートした。次いで各プレートに、予め１０ｍＭＩＰＴＧ　（イソプロピ ル−β−Ｄ−チオガラクトシド）で飽和した膜（ＤｕＰｏｎｔ　ＮＥＮ、Ｃｏ１ ｏｎｙ　Ｐｌａｑｕｅ　５ｃｒｅｅｎ）をかぶせて−夜３７°Ｃでインキュベー トした。膜の位置は膜を取除く前に表示した。

次にこれらの膜をＴＴＢＳで洗浄し２０％ＦＣＳおよび１：２５に希釈されたポ リクローナルに一カゼイン抗血清を含有するＴＴＢＳ中で室温にて２時間インキ ュベートした。これらの膜を、ＴＴＢＳ中、室温にて５分間づつ２回洗浄した。

ＴＢＳ中のビオチニル化ヤギ抗ウサギＩｇＧを添加し、膜を室温にて１時間イン キュベートした。次いでこれらの膜を室温にて５分間づつ２回ＴＴＢＳで再び洗 浄した。ＴＴＢＳ中の、ストレブタビジンとビオチチニル化アルカリホスファタ ーゼの接合体を添加し、次いで室温で１時間インキュベートした。次のステップ でこれらの膜を５分間づつ４回ＴＴＢＳ中で洗浄し、次いで５０ｍＭ　トリス− ＨＣｌ　ｐＨ９，８，３ｍＭ　ＭｇＣ１ｔ、　５０ｐｇ／ｍｊＸ　Ｐ　（５−ブ ロモ−４−り四ロー３−インドリルホスフェ−）（Ｎａ塩）〕、および１００μ ｇ／ｒｄＮＢＴにトロブルー　テトラツリウム　グレード■）を含有する緩衝液 中で３回膜をすすいだ。実施例２に記載したようにして製造した抗体と反応させ ることによって約１００個の陽性プラークを同定した。

単離されたプラークを希釈および繰返しスクリーニングを行うことによって精製 した。ファージＤＮＡをＳａｍｂｒｏｏｋらの１９８９年の文献に記載されてい る方法にしたがって製造し、次いでそのＤＮＡ製剤をＥｃｏＲＩで消化した。消 化されたＤＮＡをアガロース電気泳動法によって分離し、多数のＥｃｏＲ［フラ グメントを、ＥｃｏＲｌで消化しかつアルカリホスファターゼ処理したｐＵｃ１ ８プラスミド中にクローン化し、次いでこのフラグメントを用いてイー、コリＴ Ｇ２を形質転換した。形質転換体を、５０ｐｇ／−のカルベニシリン、４０ｐｇ ／−のＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラク トシド）および１ｍＭＩＰＴＧ　（イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトシド） が入っているプレート上で選択した。プラスミドのＤＮＡを多数の形質転換体か ら分析した。これらの形質転換体の一つが、ヒトに一カゼインをコードする全長 ｃＤＮＡフラグメントを含有するプラスミドを保存することか見出された。この プラスミドをｐｓ２７０と命名し図１に示す。プラスミドｐｓ２７０　Ｄ　Ｎ　 Ａを制限エンドヌクレアーゼ分析に付した。に−カゼインをコードする領域の両 ストランドを完全ヌクレオチド配列を、Ｔ７配列決定キット（Ｐｈａｒ［［ｌａ ｃ　ｉａ社、アブサラ、スエーデン）を用い、メーカーが記載しているようにし て二本鎖の鋳型上で測定した。配列決定反応に用いるプライマーとして、ｐＵｃ ｌＢまたはに一カゼイン配列に相補的な特定のオリゴヌクレオチドを使用した。

そのヌクレオチド配列（ＳＥＱ　［Ｄ　Ｎｏ：　１　）は、１６２個のアミノ酸 および２０個のアミノ酸のシグナルペプチド構成されたに一カゼイン前駆物質タ ンパク質の全アミノ酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　２　）をコートするのに充 分な読取り枠を含有していた。

実施例４ ヒトに一カゼインゲノムフラグメントのクローン化、配列決定および体制 ヒトに一カゼイン遺伝子の構造体制と配列を決定するために、ヒトゲノムＤＮＡ ライブラリーとヒトゲノムＤＮＡをスクリーニングして分析した。ヒトゲノムラ イブラリーはＣ１ｏｎｔｅｃｈ社（米国、パロアルト）から入手した。これらの ライブラリーはＥＨｌＤＮＡ　（ｊＪタロ’）’ｆＪ　ＨＬ１０６７Ｊ）または 女性白血球ＤＮＡ（カタログＲＨＬＩＩＩＩＪ）から構築され、λＥＭＢＬ−３ ベクター中にクローン化された。挿入断片の平均の大きさは、１５ｋｂまたは１ ６ｋｂであり、独立クローンの数はそれぞれ２．５ＸｌＯ’またはｌ。

７Ｘ　１０’である。ヒトゲノムＤＮＡ製剤はヒト組織試料またはヒト細胞系か ら抽出した。ヒトゲノムＤＮＡもＣ１ｏｎｔｅｃｈ社（カタログＲ６５５０−２ ）から入手した。ヒトに一カゼイン遺伝子のエキソンとイントロンの配列を含有 する組換えファージを単離するため、直径か１５０ｍｍの１９５個の個々の細菌 のプレートおよび約１０４の個々のプラーク／プレートをスクリーニングした。

これらの方法および使用した溶液は、Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌ　Ｈａ ｎｄｂｏａｋ：Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｈｙ ｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌａｍｂｄａ　Ｐｈａｇｅ　Ｌｉｂｒａｒｉｅ ｓ　ｗ／ＤＮＡ　Ｐｒｏｂｅｓ　（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ社）に記載されているもの を、下記のことから明らかないくらか改変したものである。

実験は特に下記のように実施した。番号はプレートの底部ごとに付けた。滅菌人 希釈剤０．１ｍｌで希釈されたファージライブラリーの試料を、１０．０００ｐ ｆｕ（プラーク形成単位）の推定力価を得るために調製した。イー、コリ宿主菌 株ＮＭ５３９（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ社から入手した）のＬＢ培地培養物０．６ｍｊ ’（：１０，０ＯＯｐｆｕｉｊｉ換えファージを感染させ、次いで０．３Ｍ　３ Ｍ緩衝液を添加した。

その感染培地物を３７°Ｃで２０分間インキュベートした。

次にその培養物をトップアガロース（アガロース７．２ｇをＬＢＩ！！当りに添 加したもの）と混合し、ＬＢプレートに注入した。これらのプレートを３７°Ｃ て約７時間インキュベートした。

次にプレート４°Ｃて冷却した。

プラークハイブリッド形成実験は以下のように行った。膜フィルターのＣｏ１ｏ ｎｙ／Ｐｌａｑｕｅ　５ｃｒｅｅｎ　（ＤｕＰｏｎｔ社、米国）を上記ブｌノー トの上面に２〜３分間置いた。ＤＮＡを変性するため、フィルターを取外し、プ ラークの側を上にして、０．５Ｍ　ＮａＯＨ中プラスチックラップ上に２分間浮 かした。このステップは有効な変性を確実に行うためもう一回繰返した。上記膜 フィルターを次に中和溶液１ＭトリスＨＣＩ　ｐＨ７，５に２分間づつ２凹入れ て、有効な中和を確実に行った。次にフィルター膜を乾燥させた。

膜フィルターのＲＮＡハイブリッド形成スクリーニングを行うのに用いるプロー ブを得るため、ｐｓ２７０をＥｃｏＲ［で消化し、８５７ｂｐのフラグメントを アガロース電気泳動法で分離し、切り取って、ポリプロピレン製の微量遠心分離 管中に入れた。単離されたｃＤＮＡフラグメントは、マルチプライムＤＮＡラベ リングシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用い、下記の手順で３２ｐで標識をつ けた。水をゲルＩｇ当り３−の比率で添加し、沸水溶上に７分間おいて、ゲルを 溶融させてＤＮＡを変性させた。上記微量遠心分離管を次に３７°Ｃの湯浴中に 少なくともＩＯ分間入れた。

メーカーの指示にしたがって、Ｄ　Ｎ　Ａ　０．２５ｎｇを含有するある容積の ＤＮＡ／アガロース溶液を、メーカーの指示にしたがってラベリング反応液に添 加した。

ハイブリッド形成方法は、下記の方法による６５°Ｃにおける緊縮条件下の方法 であった。フィルター膜は、ハイブリッド形成オーブン（Ｈｙｂａｉｄ）を用い 、６５°Ｃで少なくとも１時間、びん中で１％ＳＤＳ、ＩＭＮａＣ１，１０％硫 酸デキストランの溶液で処理することによってプレハイブリダイゼーションを行 った。プレハイブリダイゼーションに続いて、最終濃度か１００■／イの変性ニ シン精子ＤＮＡおよび濃度が＜　ｌＯｎｇ／−の２２　ｐ標識ＤＮＡブローブを 含有する溶液を（最適シグナル対バックグランド比を得るため）上記プレハイブ リダイゼーション溶液に加え、膜フィルターを６５”Ｃで１０〜２０時間インキ ュベートした。膜フィルターを洗浄するためにハイブリッド形成溶液を除いた。

第１ステツプでは膜フィルターを２　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ（０，３Ｍ　ＮａＣ１，０ ，０３Ｍクエン酸ナトリウム）、１％ＳＤＳ溶液中で２回室温で５分間づつ洗浄 した。次のステップで膜フィルターを同じ溶液中で２回、６５°Ｃで３０分間づ つインキュベートした。第三のステップでは、フィルターを、０．ｌＸ５ＳＣ中 室温で２回洗浄した。最後に膜フィルターを、１枚の濾紙の上にＤＮＡ面を上に して置いて乾燥させた。乾燥された膜フィルターを次にＸ線フィルムに露出させ てオートラジオグラムを作製した。

上記のようにして分析した約２Ｘ１０’個の個々のプラークの内３個のハイブリ ッドを形成しているプラークか検出され単離した。これら３個の単離物はそれぞ れ＃２．４１および４２と命名された。何回かの再スクリーニング実験の後、組 換えファージＤＮＡをＳａｍｂｒｏｏｋらの１９８９年の文献の方法にしたがっ て精製した。精製したＤＮＡを５ａｌＩで消化し、挿入断片を示すフラグメント をアガロース電気泳動法で単離した。

挿入断片の大きさは、単離物＃２では約１８ｋｂであり、単離物＃４１では１５ ｋｂであり、単離物＃４２では１７ｋｂであった。これらのフラグメントは５ａ ｌＩで消化され線状化したｐＵｃ１９中にクローン化し、ｐＳ４５７　（単離物 ＃　２）　、ｐＳ４５８　（単離物＃４１）　、ｐＳ４５９（単離物＃４２）（ 図２）を得た。これらの３つのプラークからの挿入断片で、ｐＳ２７０由来のに 一カゼインｃＤＮＡプローブとハイブリッドを形成するものをＰＣＲ１制限地図 の作成、次いでに一カゼイン遺伝子の各種領域を示す２１ｐ標識化オリゴヌクレ オチドとのハイブリッド形成によって分析した。またこれらのフラグメントは互 いにハイブリッドを形成した。単離物＃４２からの挿入断片はに一カゼイン遺伝 子の大きな部分を含有していることを示したが、転写される領域全部ではなかっ た。単離物＃２のクローン化フラグメントは単離物＃４２に対して部分相同性を 示すことが見出された。しかし、この２つの単離物の間には多数の相違が観察さ れた。ＰＣＲ分析法を用いてヒトゲノムＤＮＡと比較すると、単離物＃２は部分 的に再配列された領域を含有することが証明された。単離物＃４１中の挿入断片 はｃＤＮＡの３゛末端と相同性であることが分かりかつその挿入断片はに一カゼ イン遺伝子の転写される部分のさらに下流に延びていることが分かった。したが って、に−カゼインのエキソンとイントロンの配列と体制の分析と特性決定を行 うために単離物＃４２からの挿入断片を選択した。

ｐＳ４５９の中にクローン化れたフラグメント（図２）を、ＥｃｏＲ工、）Ｉｉ ｎｄＩ［［、ＸｂａＩＳＡｃｃＩＳＰｓｔＩ、ＫｐｎＩおよびＳａｃ　Ｉを用い て、制限酵素地図を作成して特性を決定した。得られた制限地図を図５に示す。

エキソンの近似位置とイントロンの近似的な大きさをＰＣＲと電気泳動法で分析 した。ｐＳ４５９クローンから得られた結果を、鋳型としてＤＮＡを用いる同じ ＰＣＲプライマーで得た結果と比較した。これら二つの鋳型から得た結果は同一 であった。

ヌクレオチドの配列の分析を容易にするために、ｐＳ４５９由来の１８個の制限 断片を単離し次いでｐＵｃ１９中にサブクローン化してｐｓ４６１−４７８を得 た（図５）。サブクローン化されたフラグメントの配向をＰＣＲ分析法で測定し た。以下の方法を用いた。

すなわちｐＵｃＩ９配列中、クローン化部位内のクローン化部の各側に別々に配 置されたＰＣＲプライマー、および所定の配向を有し、測定が可能なに一カゼイ ン誘導サブクローン化フラグメントに特異的な他のＰＣＲプライマーを組合せる 方法である。

１８個のプラスミドＩ）Ｓ４６１〜４７８中の挿入断片をヌクレオチド配列分析 に付した。全サブクローンに対する完全ヌクレオチド配列を、メーカーが述べて いるように二本鎖鋳型上でＴ７配列決定キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、スエー デン　すなわち米国のＵｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ１社 ）を用いて決定した。配列決定反応用のプライマーとして、Ｉ）ＵＣｌ３に相補 的な特定のオリゴヌクＬ、　才ｆ　ト［Ｅ２０５−ＧＴＴＧＧＧＴＡＡＣＧＣＣ ＡＧＧＧＴＴＴＴＣ−３°（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：５）；ＳＹＭ　１１２１５− ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３’　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：６）＋Ｓ ＹＭ　２５８９５’−ＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＴＧＧ−３°（ ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏニア）］またはに−カゼインに相補的なプライマー（表１参 照）を使用した。

（以下余白、次頁につづく） 表１ ヒトに一カゼイン遺伝子の配列決定に 用いたプライマー ブライ７−　位　置　配　列　方向　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　ヌクレオチド”ｉ ’ｆＭ　３５７０　ヒα艶ｚＬ　Ｌ　５”−３’　Ｌｈ　℃３７−％５７テ爪３ ６１２　論ご艶Ｌ　’　３′−５′］　Ｌ又２９口２３（以下余白、次頁につづ （） ｐＳ４５９中にクローン化されたゲノムフラグメントは、ヒトに一カゼイン遺伝 子の転写される部分の大きな部分を含有している。ｐＳ４５９にクローン化され たすべてのエキソンとイントロンの完全な配列はＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：４に示し である。これらのクローン化された配列は、第二のイントロンから最後のエキソ ンの下流の配列まで延びて、１１７４８個のｂｐのイントロン配列を含有してい る。

ヒトに一カゼイン遺伝子の第一イントロンの長さと配列に関する情報を得るため ＰＣＲ実験を計画した。ヒトｃＤＮＡ配列を、公表されているウシに一カゼイン ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ配列および体制と比較することによって、推定のエ キラン／イントロンの境界をヒトに一カゼイン遺伝子に対して仮定した。エキソ ンｌと２の間の仮定された境界の両側の配列に対して相補的な、ＰＣＲプライマ ーとして用いられる一組のオリゴヌクレオチド［ＳＹＭ　３５７９５−ＡＴＣＣ ＣＧＧＧＣＡＧＧＧＴＴＡＡＴＧＣＣＡＧＧＧＣ−３’（ＳＥＱ　１０　Ｎｏ： ８）、　ＳＹＭ３５８０５−ＣＧＡＡＧＣＴＴＣＡＧＣＴＣＡＡＣＣＴＡＣＴＧ ＣＣＡＡＣ−３’　（ＳＥＱ　［Ｄ　Ｎｏ：９）］を設計し合成した。これらの プライマーによるＰＣＲ実験で得た結果は第一イントロンの大きさかつ約２．′ ｌｋｂであることを示した。イントロンｌおよびエキソンｌと２の部分配列を表 すＳＹＭ　３５７９と５Ｙｌｉｌ　３５８０を用いて得たＰＣＲフラグメントを 、分析するために、Ｘｍａ　ＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐｔＪｃ　１９中に クローン化した。このクローン化されたフラグメントについて詳細な制限地図を ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩ［Ｉ、Ｘｂａ　Ｉ、Ａｃｅ　Ｉ、ＰｓｔＩ、Ｋｐｎ　Ｉ およびＳａｃ　Ｉを用いて作成した（図４）。ＰＣＲによって起こる可能性があ る突然変異の危険を排除するため個々の形質転換体を分析しかつ異なる鋳型のＤ ＮＡを用いてＰＣＲで生成させたフラグメントを分析した。配列分析を容易行え るように、イントロンｌの配列を示す６個の制限フラグ−ントを単離しｐｔＪｃ １９にサブクローン化した（　ｐＳ４７９〜４８４）　（図６）。ヒトに一カゼ イン遺伝子のイントロンｌの完全配列は記の方法によって得た。ＳＥＱ　［Ｄ　 Ｎｏ：　３に示す配列（エキソンｌおよびエキソン２の一部ならびにイントロン ｌを含有している）を存するこのＰＣＲフラグメントを含有するｐＵｃ１９プラ スミドを固定してｐｓ４６０と命名した（図３）。

ヒトに一カゼイン遺伝子は５個のエキソンと４個のインドロンで構成されている （図４）。翻訳開始点（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　５ｔａｒｔ）はエキソン ２に配置されおよび翻訳終始点はエキソン４に配置されている。これらのエキソ ンは比較的小さくその大きさの範囲は３３ｂｔ１〜４９６ｂｐである。これらヒ トエキソンの構造と体制はウシに一カゼイン遺伝子のそれと非常に似ている（Ａ ｌｅｘａｎｄｅｒらの１９８８年の文献）。ヒトとウシのに一カゼイン遺伝子の 構造の主な差は、ヒトの遺伝子の第二イントロンがウシ遺伝子の第二イントロン よりはるかに長いということである。

表２から分かるように、エキラン／イントロンの境界は、ＡＧ／ＧＴルールにし たがっており、Ｍｏｕｎｔらの１９８２年の文献に示唆されている共通配列によ く似ている。

（以下余白、次頁につづく） 表２ に−カゼイン遺伝子のエキソンーイントロン境界エキソンーイントロン結合部分 の配列 ５゛スプライスドナー　３゛スプライスアクセブターエキソン４−エキソン５　 τＣτＴＣＣＣＴＣｇｃａａａｅ　、、、ｃｅａｃａｇ　ＧＡＣττＧＣτＣｃ ＤＮＡ配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１　）およびゲノムＤＮＡ配列（ＳＥＱ［ ＤＮｏ：４）から誘導される演鐸アミノ酸配列を比較すると、１１０位のアミノ 酸に対するコドン（ＳＥＱ　［Ｄ　Ｎｏ：　２　）がアルギニンをコードするコ ドン（ｃＤＮＡ）からロイシンをコードするコドン（ゲノムＤＮＡ５ＥＱ　［Ｏ Ｎｏ：４ヌクレオチド１０２５５〜１０２５７）に変化したことを示している。

この観察結果はおそらく、遺伝子変異体が通常生成することを示している。

実施例５ 組換えヒトに一カゼインの細菌系内での発現組換えヒトに一カゼインをイー、コ リ内で産生されるために、に−カゼインをコードする配列を二つの異なるベクタ ー中に導入した。一方のベクターは、に−カゼインのコーティング配列の前にシ グナルペプチドを含有しているが、他方のベクターはこのようなシグナルペプチ ドを欠いている。

前述のようにして（実施例３）、ヒトに一カゼインのブローポリペプチドをコー ドするｃＤＮＡを単離しｐＵｃ１９中にクローン化してｐｓ２７０を得た。得ら れたｃＤＮＡを次に発現ベクターｐＳ３３９に導入した。この発現ベクターは、 後述のようにして（実施例７）組換えヒトに一カゼインを形質転換動物中で期間 （３ｔａｇｅ）特異的および組織特異的発現を行うように設計されている。

発現ベクターに導入し易くするため、翻訳終止コドンのすぐ下流にＳａｌ　Ｉ制 限部位を含有するに一カゼインｃＤＮＡフラグメントをｐＳ３３９プラスミドか ら単離した。５゛末端に使い易い（Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ）部位を得るために、 シグナル配列の下流に配置されたユニークｓｐｈ　１部位を使用した。ｐＳ３３ ９から誘導された約４６９ｂｐのｓｐｈ　Ｉと５ａｌｌで消化された制限フラグ メントをアガロース電気泳動法で単離した。このフラグメントを、ｓｐｈ　Ｉと Ｓａｌ　Ｉで消化したｐＵｃ１８中にクローン化してプラスミドｐＳ４２８を得 た。

成熟に一カゼインをコードしシグナルペプチドのない発現ベクターを得るために 、下記の３種のフラグメントを連結した。

第一に、に−カゼインｃＤＮＡの主要部を、ｐＳ４２８から、これをｓｐｈ　Ｉ とＢａｍＨＩで消化することによって４８１ｂｐのフラグメントとして単離した 。

第二に、に−カゼインをコードする配列の前に、翻訳出発コドンと組合わせてＮ ｄｅ　Ｉ制限部位を形成するため合成オリゴヌクレオチドを設計した。さらにこ の合成オリゴヌクレオチドは、ｐＳ３３９フラグメントには欠けている８個のに 一カゼインアミノ酸をコードする配列を含有している。これらのアミノ酸は、ヒ ト成熟に一カゼインのもとのアミノ末端である。これら二つの合成オリゴヌクレ オチドの配列は、ＳＹＭ　３０４７５’　−ＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＴＧＧＴＴ ＴＴＧＡＡＣＣＴＣＣＡ−３’　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：１０　）およびＳＹＭ 　３０４８５’　−ＴＡＴＧＧＡＧＧＴＴＣＡＡＡＡＣＣＡＧＡＡＡＣＡＡＣＣ ＡＧＣＡＴＧ−３’　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：１１）である。

第三に、調節要素、複製シグナルおよび選択マーカーを与えるために、プラスミ ドｐＳ２６をＮｄｅ　ＩとＢａｍＨＩで消化した。ベクターｐＳ２６はバクテリ オファージＴ７　ＦＩＯとＦターミネータ−を保育しく５ｔｕｄｉｅｒらの１９ ９０年の文献）、組換えに一カゼインの発現を調節する。またｐＳ２６は、プラ スミドｐＢＲ３２２の複製開始点とアンピシリン耐性をコードする配列も含有し ている。

これらの三つのフラグメントを連結し、その連結体を用いてイー、コリのコンピ テント細胞を形質転換した。上記プラスミドを保育する形質転換体を単離した。

このプラスミドを制限地図を作成し、配列決定を行うことによって分析しｐｓ４ １５と命名した（図７）。

ヒト成熟に一カゼインをコードする配列の前に細菌のシグナル配列を存する発現 ベクターを構築するために、次の方法を採用した。選択した細菌シグナル配列は 、イー、コリの熱に安定なエンテロトキシン■、ＳＴＩ［（Ｐｉｃｋｅｎらの１ ９８３年の文献）のシグナルペプチドをコードする配列であった。第一にヒトに 一カゼインｃＤＮＡの主要部分を得るため、前述したのと同じｐＳ４２８由来の ５ｐｈｌとＢａｍＨＩフラグメントを使用した。第二に、ヒトに一カゼインの天 然のアミノ末端をコードする配列をあたえて、に−カゼイン配列の前に５Ｔｌｔ シグナル配列を翻訳フレーム中に導入するため、下記の二つのオリゴヌクレオチ ド：　ＳＹＭ　３２４０５−ＴＡＴＧＣＡＧＡＧＧＴＴＣＡＡＡＡＣＣＡＧＡＡ ＡＣＡＡＣＣＡＧＣＡＴＧ−３’　（ＳＥＱ　［Ｄ　Ｎｏ＋１２）およびＳＹＭ 　３２４１５’　−ＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＴＧＧＴＴＴＴＧＡＡＣＣＴＣＴＧ ＣＡ−３’　（ＳＥＱＩＤ　Ｎｏ：１３）を合成した。

第三に、上記のように調節要素、複製シグナルおよび選択マーカーを与えるのに 加えて、プラスミドｐＳ２８をＮｄｅ　ＩとＢａｍＨＩで消化することによって シグナル配列を誘導した。このプラスミドは、５Ｔｌｌソゲナル配ナル下７プロ モーターの下流に導入されていることを除いてｐＳ２６に似ている。

これら三つのフラグメントの連結と形質転換によって発現ベクターｐＳ４２５　 （図８）を得た。このｐＳ４２５ベクターは配列分析と制限地図作成によって確 認した。

これらの発現ベクターｐｓ４１５とｐＳ４２５を用いて、イー、コリ菌株のＢＬ ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）　ｐＬｙｓＳおよびＢＬ２１（ＤＥ３）ｐ ＬＹｓＥＣＳｔｕｄｉｅｒらの１９９０年の文献）を形質転換した。これらの実 験は５ｔｕｄｉｅｒらの１９９０年の文献に記載されているようにして実施した 。

これら生成物を、５ＯＳ−ＰＡＧＥ、およびヒトに一カゼインに対するポリクロ ーナル抗血清（実施例２）を用いる免疫プロット法で分析した。得られた結果は 、組換えヒトに一カゼインが、２種の発現ベクターによって、約２５ｋＤａの非 グリコジル化タンパク質として効率的に発現されたことを示している（図９）。

実施例６ 哺乳動物の細胞内での組換えヒトに一カゼインの発現哺乳動物細胞の培養系で組 換えヒトに一カゼインを産生させるだめに、ヒトに一カゼインｃＤＮＡを真核発 現ベクター中に導入した。

要約すると、上記ベクターはマウスメタロチオネイン１　（ｍＭＴ−１）の上流 調節要素の制御下でヒトに一カゼインｃＤＮＡを含有している（Ｐａｖｌａｋｉ ｓおよびＨａｍｅｒの１９８３年の文献）、ｍＲＮＡプロセシングシグナルは、 エキソン■の一部、イントロン■、エキソン■、およびに−カゼインｃＤＮＡの 下流に挿入されているウサギβ−グロビン遺伝子の下流要素を含有するゲノムフ ラグメントで与えられる。この転写ユニットを、ウシ乳頭腫ウィルスタイプｌ　 （ＢＰＶ−１）の全ゲノムを含有するベクター中にクローン化した。転写はＢＰ Ｖ−１とに一カゼイン転写ユニットに対して一方向性であった。イー、コリ中で プラスミドを増殖させて選択するため、上記ベクターはｐＢＲ３２２の誘導体の ｐＭＬ２ｄ（Ｓａｒｖｅｒらの１９８２年の文献）を含有している。

この発現ベクターを構築するのに以下の方法を採用した。に−カゼインｃＤＮＡ の末端を修飾してその後のクローン化を容易にするために、鋳壓としてｐｓ２７ ０を用いるＰＣＲ実験を実施した。５゛末端にＢｇｌＩＩ部位を含有し３′末端 に５ａｌＩ部位を含有するに一カゼインｃＤＮＡを増幅するために以下の二つの 合成オリゴヌクレオチドを設計した。すなわちＳＹＭ　２６９９５−ＧＧＧＧＴ ＣＧＡＣＴＧＧＴＧＴＴＴＴＴＡＴＧＣＣＧＴＡＧＧＴ−３’　（ＳＥＱ　［Ｄ 　Ｎｏ：１４）とＳＹＭ　２７０７５−ＧＡＧＡＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＣＴＧＧ ＣＡＣＧＡＧＧＡＡＡＧＧ−３’　（ＳＥＱ　［ＤＮｏ：１５）である。生成し たＰＣＲＤＮＡをＢｇｌＩ［と５ａｌＩで消化し、アガロース電気泳動法で分離 し、次いで５９２ｂｐのフラグメントとして単離した。このフラグメントを次の 二つのフラグメントと連結した。

第一に、全ＢＰＶ−１ゲノム、ウサギβ−グロビン要素、ｐＭＬ２ｄプラスミド 配列およびｍＭＴ−１上流調節要素を含有するプラスミドｐＳ４２をＳａｃ　Ｉ と５ａｉｌで消化し、アガロース電気泳動によって約１２．８ｋｂのフラグメン トを単離した。ユニークＳａｃ　Ｉ部位をｍＭＴ−１配列中に配置し、ユニーク ５ａｉｌ部位をウサギβ−グロビン要素の上流に配置した。第二に、全ｍＭＴ− １遺伝子を含有するプラスミドのｐＳ６５をＳａｃ　ＩとＢｇｌＩ［で消化して ｍＭＴ−１プロモーター要素の近位部分を約２２０ｂｐのフラグメントとして単 離した。

これら三つのフラグメントを連結し、その連結体でイー、コリのコンピテント細 胞を形質転換した。制限地図の作成と配列を決定するため、形質転換体から約１ ３．６ｋｂのプラスミドを単離調製した。に−カゼインｃＤＮＡ配列中にＰＣＲ によって突然変異か起こるので、二つの異なるプラスミド単離物からの配列を結 合することが必要であった。これら二つの単離物はに一カゼインｃＤＮＡ中に配 置されたｓｐｈ　Ｉ部位の両側に突然変異部分を含んでいるので以下の方法を用 いた。これら二つのプラスミドをＳａｃ　ＩとＳｐｈ　ｒならびにｓｐｈ　Ｉと ５ａｌＩで別々に消化して正しいに一カゼインｃＤＮＡフラグメントを得た。こ れらの二つのフラグメントを、上記のｐＳ４２のＳａｌ　ＩとＳａｃ　Ｉで処理 して得たフラグメントと再度連結した。プラスミド単離物を多数の形質転換体か ら製造して、配列分析と制限地図作成を行った。

得られた発現ベクターをＩ）Ｓ３３０（図１０）と命名した。

この発現ベクターｐｓ３３０は、ハーベー肉腫（Ｈａｒｖｅｙ　Ｓａｒｃｏｍａ ）ウィルスの５°長長端端復（ＬＴＲ）およびシミアンウィルス４０のポリアデ ニル化シグナルで駆動されるネオマイシン耐性遺伝子をコードするベクター（Ｌ ｕｓｋｙとＢＯｔＣｈａｎの１９８４年の文献）とともに、マウス細胞系Ｃ１２ ７（ＡＴＣＣＣＲＬ　１６１６）およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ） 細胞系に、カルシウム沈殿法（Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂの１９ ７３年の文献）にしたがって、同時にトランスフェクト（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅ ｃｔ）された。その細胞を、ｌＯ％ウシ胎児血清で補充したＨａｍ’　ｓ　Ｆ１ ２−Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’　ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ＥａｇｌｅｓＭｅｄｉｕｍ　 （ＤＭＥＭ）　（１：　１）中で培養した。ネオマイシン耐性の細胞のクローン を、Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ）の１．５ｍｇ／ｍｌ　（ＣＩ２７）または０．５ｍ ｇ／ｍｌ　（ＣＨ○）で選択し、２〜４週間後に、耐性細胞のクローンを、分析 するためにマスタープレートから単離して継代培養を行った。

細胞調整培地と細胞を、５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびヒトに一カゼインに対するポリ クローナル抗血清（実施例２）を用いる免疫プロッティング法によって、組換え ヒトに一カゼインの産主について分析した。発現を分析するため、アガロース− ホルムアルデヒドゲルの電気泳動法によって分離した細胞からＲＮＡを調製し　 −（Ａｕｓｕｂｅｌらの１９９１年の文献）、膜にプロットして標識ヒトに一カ ゼインプローブとハイブリッドを形成させた。

得られた結果は組換えヒトに一カゼインの有効な発現を示している（図１１）。

実施例７ 形質転換動物内での組換えヒトに一カゼインの発現形質転換動物の授乳中の乳腺 内に組換えヒトに一カゼインを期間および組織に特異的な発現を行わせて、乳汁 から組換えタンパク質を収穫できるようにするために以下の方法を使用した。

マウス乳清酸性タンパク質（ＷＡＰ）のゲノムフラグメントを含有する二つのプ ラスミドをＬｏｔｈａｒ　Ｈｅｎｎｉｇｈａｕｓｅｎ博士から入手した（Ｃａｍ ｐｂｅｌｌらの１９８４年の文献）。そのゲノムフラグメントは約４．５ｋｂの 上流調節配列、４個のエキソンと３個のイントロンで構成されている全転写領域 、および約１．６ｋｂの３゛フランキング配を含有している。

ＷＡＰエキソン１内のユニークＫｐｎ　Ｉ部位の位置にに一カセインｃＤＮＡを 導入するため、この位置に合成オリゴヌクレオチドリンカーのＳＹＭ　２４０１ ５−ＣＧＴＣＧＡＣＧＴＡＣ−３’　（ＳＥＱ　［Ｄ　Ｎｏ：１６）およびＳＹ Ｍ　２４０２５−ＧＴＣＧＡＣＧＧＴＡＣ−３’　（ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：１７ ）を挿入することによって上記部位を修飾して、先のＫｐｎ　Ｉ部位の３′に新 しい５ａｉｌ部位を付加した。このリンカ−を挿入する前に、第３エキソン中の 天然産生ユニーク５ａ１１部位を５ａｉｌによる消化で破壊し、フレノウ酵素を 用いる充填反応（ｆｉｌｌ−ｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）と再連結によって平滑化 （ｂｌｕｎｔ）　シた。ユニークＫｐｎ　Ｉ部位と５ａｉｌ部位を第１エキソン 中に存するプラスミドはｐｓ３１４と命名する。

に−カゼインｃＤＮＡの末端を修飾してこのベクターへの導入を容易にするため 、鋳型としてｐｓ２７０を用いるＰＣＲ実験を実施した。５′末端にＫｐｎ　１ 部位を存しかっ３゛末端にＳａｌ１部位を存するに一カゼインｃＤＮＡを増幅す るため、二つの合成すリボヌクレオチド　ＳＹＭ　２６９９５’　−ＧＧＧＧＴ ＣＧＡＣＴＧＧＴＧＴＴＴＴＴＡＴＧＣＣＧＴＡＧＧＴ−３’　（ＳＥＱ　１０ 　Ｎｏ：１４）およびＳＹＭ　２６９８５’　−ＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＴＧＡＡ ＧＡＧＴＴＴＴＣＴＴＣＴＡＧＴＴＧ−３’　（ＳＥＱ　［ＯＮｏ：１８）を設 計した。生成したＰＣＲＤＮＡをＫｐ口■と５ａｌＩで消化し、アガロース電気 泳動によって分離して５６６ｂｐのフラグメントとして単離した。このＫｐｎ　 Ｉと５ａｉｌによって得たフラグメントを、Ｋｐｎ　Ｉと５ａｌＩで消化したｐ ｓ３１４に連結した。形質転換体を単離し、プラスミドを調製し、制限地図作成 と配列決定によって分析した。

プラスミド配列を除くために、ＮｏｔＩリンカ−を、ＷＡＰ／に一カゼイン組換 え遺伝子の５゛と３′に挿入した。得られた発現ベクターはｐＳ３３９と命名す る（図１２と１３）。発現ベクターを胚に注入する前に、ｐＳ３３９をＮｏｔ　 Ｉで消化し、ＷＡＰ／に一カゼインフラグメントをアガロース電気泳動で単離し 、次いでＤＮＡを電気溶出した。溶出されたＤＮＡをエタノールで沈殿させ、顕 微注入を行うため、１０ｍＭ　トリス（ｐＨ７，５）および０．１ｍＭ　ＥＤＴ Ａに溶解した。

形質転換動物を得るため利用した実験手順はＨｏｇａｎらの１９８６年の文献に 記載されている。

過排卵を行うために、５［Ｕの妊娠能ウマの血清ゴナドトロピンでプライム（ｐ ｒｉｍｅ）　Ｌ／次いで４８時間後に５１０のヒト漿膜ゴナドトロピンでプライ ムしたドナーマウスから得たＣ５７Ｂｌ／６ＪｘＣＢＡ／２Ｊ−ｆ２胚の前核に 、上記の単離されたフラグメントを、３ｎｇ／−の濃度で注入した。Ｃ５７Ｂｌ ／６Ｊ　Ｘ　ＣＢＡ／２Ｊ−ｆ、動物はＢｏｍｈｏ　ｌｔｇａａｒｄ　Ｂｒｅｅ ｄｉｎｇ　ａｎｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ　Ｌｔｄ、社（デンマーク 、Ｒｙ）から入手した。卵管から胚を集めた後、培地Ｍ２　（）Ｉｏｇａｎらの １９８６年の文献）中ヒアルロニダーゼで処理することによって、胚と小丘細胞 から分離した。洗浄した後、これらの胚を培地Ｍ１６　（Ｈｏｇａｎらの１９８ ６年の文献）に移し、５％ＣＯ２雰囲気のｍｉｃｒｏｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒお よびＮｏｍａｒｓｋｉレンズを備えたＮ１ｋｏｎ倒立顧微鏡を用い、パラフィン 軽油のもとでＮ２のマイクロドロップ（ｍｉ　ｃｒｏｄｒｏｐ）中で行った。注 入を行った後、健康に見える胚を、２．５％のアバ−ティン０．３７ｒｎｌを腹 腔内投与された偽妊娠Ｃ５７ＢＩ／６Ｊ　ｘ　ＣＢＡ／２Ｊ−ｆ　、受容者に着 床させた。

形質転換動物は、切取った尾の試料から調製したＤＮＡを分析することによって 同定した。この組織の試料をブロティナーゼにとともにインキュベートし次いで フェノールクロロホルムで抽出した。発現ベクターフラグメントを示す非相同的 に導入されたＤＮＡが存在している場合、上記の単離されたＤＮＡを、特定のフ ラグメントを増幅する、プライマーによるポリメラーゼ連鎖反応に使用した。ま たこれらの動物は、ＤＮＡハイブリッド形成実験で分析して、ＰＣＲデータを確 認し、組込まれたベクター要素の起こる可能性がある再配列、構造について試験 し、次いで組込まれたベクター要素のコピー数についての情報を得ることによっ て分析した。

１セツトの実験で１１頭のマウスを分析した。このスクリーニングに用いたＰＣ Ｒプライマーは、マウスＷＡＰ配列に相補的な５ＹＩｉ１２２２８　（５−ＣＴ ＧＴＧＴＧＧＣＡＡＧＡＡＧＧＡＡＧＴＧＴＴＧＴ−３’　、　（ＳＥＱ　ＩＤ 　Ｎｏ：１９）〕およびヒトに一カゼインｃＤＮＡに相補的なＳＹＭ　２６０３ （５−ＧＧＴＴＴＧＧＧＣＧＡＣＧＴＡＣＣＡＣＡ−３’、　（ＳＥＱ　ＩＤＮ ｏ：２０）　）であった。

これら二つのＰＣＲプライマーの位置を図１４に示す。ｐＳ３３９ベクターを保 育する動物由来のＰＣＲで増幅させたＤＮＡの予想される大きさは４８６ｂｐで ある。分析の結果、ｐＳ３３９の組換えＷＡＰ／に一カゼイン遺伝子を有する二 つの形質転換創始動物が同定され（図１５）一方が雄で一方が鰭であった。

ｐＳ３３９ベクターＤＮＡ要素を有することが同定されたマウスの創始動物を交 配させ、次いでそのＦｌ−腹子を同じ方法によって遺伝子導入について分析した 。

乳汁の試料を、２１０のオキシトシンを腹腔内に注入した雌の授乳動物から集め 、１０分後に２．５％アバ−ティン０．４０−を腹腔内に注射して麻酔させた。

乳汁収集器をシリコン処理をされたチュービングを通じて乳頭に取付け、乳腺を ゆるやかにマツサージすることによって乳汁を１．５１ｎｌエツペンドルフ管中 に収集した。乳汁の量は授乳の日によって変動し、−頭のマウスの一回の収集当 り０．１〜０．５ｍｌである。収集した乳汁を組換えヒトに一カゼインの存在に ついて分析した。この分析は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ１ニトロセルロース膜への移行 および未変性ヒトに一カゼインに対するポリクローナル抗体とともにインキュベ ートすることによって行った。得られた結果は、形質転換マウスからの乳汁中に 組換えヒトに一カゼインが発現されていることを示したく図１６）。

形質転換動物の安定した系統が生成している。

ヒトに一カゼイン遺伝子由来のイントロン配列を合作するゲノムフラグメントを 用いて、組換えヒトに一カゼインを、形質転換動物からの乳汁中に高レベルで発 現させるために、下記の発現ベクターを構築した。

第一の発現ベクターは、マウスＷＡＰ上流調節配列の転写制御下にあるヒトに一 カゼイン遺伝子のイントロン１．　３および４の全配列を合作している。下流の 調節配列とｍＲＮＡプロセシングシグナルは、エキソン５の下流に約４．５ｋｂ 延びているヒトに一カゼインゲノムフラグメントによって得られる。この発現ベ クターの構造を図１７に図式的に示す。

要約するとこの発現ベクターは以下のようにして構築する。

エキソン２に配置されたＢｓａＪ　Ｉ開裂部位からエキソン３に配置されたＭｎ ｌＩ部位まで延びる下記の二つの合成オリゴヌクレオチドを合成する。ＥｃｏＲ １部位をＢｓａＪ　１部位の上流に付加して、次に行うこのフラグメントのクロ ーン化を行い易くする；５−ＡＡＴＴＣＣＣＣＴＧＧＣＡＴＴＡＡＣＣＣＴＧＣ ＣＴＴＴＴＴＴＧ−３’　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：２１）および５−ＡＡＡＡＡ ＡＧＧＣＡＧＧＧＴＴＡＡＴＧＣＣＡＧＧＧＧ−３’　（ＳＥＱ　［Ｄ　Ｎｏ： ２２）　、これらの二つの合成オリゴヌクレオチドをアニールした後、ｐＳ４６ ５由来の単離されたＭｎｌ　Ｉ　／ＨｉｎｄｎＩ　３４０ｂｐフラグメントと連 結し、次いでＥｃｏＲＩ　／　ＨｉｎｄＩ［［で消化したｐＵｃ１９中にクロー ン化する。

クローン化されたフラグメントを配列分析に付し次いで挿入断片をＢｓａＪ　Ｉ 　／　ＨｉｎｄＩ［フラグメントとして単離する。次にこのフラグメントを、ｐ ｓ４６０から単離した０、　６６ｋｂのＸｂａ　Ｉ　／　ＢｓａＪ　Ｉフラグメ ントに連結する。ｐＳ４６０から得たＸｂａ　Ｉ　／　ＢｓａＪ　Ｉフラグメン ト、およびＢｓａＪ　Ｉ　／ＨｉｎｄｌＩ［フラグメントを、Ｘｂａｌ／Ｈｉｎ ｄ■で消化したｐＵｃ１９中にクローン化する。このプラスミドから約１ｋｂの Ｘｂａ　Ｉ　／　ＨｉｎｄＩ［フラグメントを単離して下記のＰＣＲフラグメン トに連結する。

Ｋｐｎ　Ｉ部位を５′非翻訳リーダー配列に導入するため、エキラン１配列とイ ントロンｌ配列を含有しＸｂａ　Ｉ部位まで延びるＰＣＲフラグメントを製造す る。この実験を行うために、二つのＰＣＲプライマー：　５’　ＣＣＧＧＴＡＣ ＣＡＡＧＡＣＣＴＧＡＣＴＧＧＣＡＣＧＡＧＧＡ−３°（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ： ２３）および５−ＡＴＴＣＴＡＧＡＣＣＡＧＧＣＣＴＴＡＴＣＴ−３’　（ＳＥ Ｑ　１０　Ｎｏ：２４）を合成する。得られた０、　７７ｋｂのフラグメントを 上記のｌｋｂのＸｂａ　Ｉ　／　ＨｉｎｄＩ［に連結する。これら二つのフラグ メントをＫｐｎ　Ｉ　／）ｌｉｎｄｌＩ［で消化したｐＵＣ１９にクローン化す る。得られたプラスミドから約１．８ｋｂのＫｐｎ　Ｉ　／　ＨｉｎｄＩ［フラ グメントを単離する。このフラグメントはに一カゼインのミニ遺伝子の５°部分 を合作している。

次のステップにおいて、ｐＳ３３９をＮｏｔｌとＫｐｎ　Ｉで消化し、次いでＷ ＡＰの上流調節配列を約４．５ｋｂのフラグメントとして単離する。次にこのＷ ＡＰフラグメントを、に−カゼインのミニ遺伝子の５°部分を合作するＫｐｎ　 Ｉ　／　ＨｉｎｄＩ［１，８ｋｂフラグメントに連結し、修飾されたｐＵｃ１９ であるｐＵｃ１９−Ｎ中にクローン化する。このｐＵｃ１９−Ｎはその中のＥｃ ｏＲＩ部位がＮｏｔＩ部位に変えられている。得られたプラスミド（ｐＷＡ　Ｐ 　／Ｋ１−５’と命名）は、に−カゼインミニ遺伝子の５°部分の前に、ＷＡＰ ５’調節配列を約６．３ｋｂのＮｏｔ　Ｉ　／ＨｊｎｄＩＩ［フラグメントとし て含有してい最終目的の発現ベクターを完成するために、この６．３ｋｂのＮ。

ｔ　Ｉ　／　ＨｉｎｄｌＩ［７ラグメントを、ｐＳ４５９から誘導された約７． ８ｋｂの５ａｌＩおよび部分的にＨｉｎｄＩＩ［で消化されたフラグメントに連 結して、に−カゼインミニ遺伝子の転写される部分の３゛レスト（ｒｅｓｔ）お よび３゛フランキング非転写配列を得る。次にこれら二つのフラグメントを５ａ ｌｌ／Ｎｏｔｌで消化したｐＵｃ１９−Ｈに連結する。得られた組換えＷＡＰ／ に一カゼインミニ遺伝子を図１８に示す。

第二発現ベクター中、ヒトに一カゼイン遺伝子のエキフン２内に配置された翻訳 開始部を、マウス遺伝子のエキフン１内に配置されたＫｐｎ　Ｉ部位に直接連結 する。マウスＷＡＰの天然の翻訳開始部はＫｐｎ　１部位のすぐ下流に配置され ている。したがって、この位置のまわりの配列は進化して翻訳開始の最適条件が 得られたと考えられる。この組換え遺伝子を図１８に示す。

ベクターは以下のようにして構築する。翻訳開始コドンＡＴＧのすぐ上流にＫｐ ｎ　１部位を含有するＰＣＲフラグメントを、下記の合成オリゴヌクレオチド、 　５−ＣＣＧＧＴＡＣＣＡＴＧＡＡＧＡＧＴＴＴＴＣＴＴＣＴＡＧＴＴ−３’　 （ＳＥＱ　［Ｄ　Ｎｏ：２５）および５−ＴＴＡＡＧＣＴＴＴＡＣＴＴＡＴＧＴ ＴＴＴＣＡＴＴ−３’　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：２６）をプライマーとして用い て調製した。

得られた０、　４ｋｂのＫｐｎ　Ｉ　／ＨｉｎｄＩ［ＩフラグメントをＫｐｎｌ ／Ｈｉｎｄ■で消化したｐＷＡＰ／Ｋ１−５’　（上記のもの）中にクローン化 する。得られたプラスミド（ＷＡＰ／に２−５°と命名）を使用して最終目的の 発現ベクターを完成する。先に述べたのと同じ方法を利用する。要約すると、ｐ 　ＷＡ　Ｐ　／に２−５’由来の４．９ｋｂのＮｏｔ　Ｉ　／Ｈｉｎｄｌｆｆ　 ７ラグメントを、１）Ｓ４５９由来の約７．８ｋｂの５ａ１１／Ｈｉｎｄｌ［Ｉ フラグメントを、ｐｓ４５９由来の約７．８ｋｂのＳａｌ　Ｉと部分的にＨｉｎ ｄＩＩ［で消化したフラグメントに連結して、に−カゼインミニ遺伝子の転写さ れる部分の３゛レストと３′フランキング非転写配列を得る。次にこれらの二つ のフラグメントを５ａｌＩ／Ｎｏｔｌで消化したＩＩＵＣ１９−Ｎに連結する。

得られた組換えＷＡＰ／に一カゼインミニ遺伝子変異体を図１８に示する。

またこれら二つのに一カゼインミニ遺伝子のフラグメントは、例えばβ−ラクト グロブリンおよびβ−カゼインのような他の哺乳動物の乳タンパク質の遺伝子由 来の他の上流調節配列の転写制御下でクローン化される。

実施例８ ヒトに一カゼインの遺伝子変異体 ヒトに一カゼインには限られた数の遺伝子変異体があると考えられる。これらの 変異体は、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　ｌに示すｃＤＮＡ配列から演鐸されるアミノ 酸配列と比べて多数のアミノ酸が置換されている。この予想は、今まで研究され てきた他の大部分の種に遺伝子変異体があるということだけでなく、得られたｃ ＤＮＡ配列（ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：　１　）と実施例４に記載されているゲノム 配列とＭｅｎｏｎらが測定した部分配列との間に見られる差異に基づいている。

遺伝子変異体すなわちＳＥＱ　［ＯＮｏ：　１に示すＤＮＡ配列の類似体は、以 下の方法で単離して特性を決定することができる。

ＤＮＡは各種の遺伝的背景（民族性）を有するドナーから提供された新鮮な人乳 から単離した。同様にｍＲＮＡは新鮮な乳汁から単離し、ｃＤＮＡは逆転写酵素 法を利用して合成する。

アミノ酸が明白に異なっている配列を両側に有する領域から選択した特定の合成 オリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ法を利用しＤＮＡフラグメントを合成する 。合成されたＤＮＡフラグメントはアガロースゲルから単離して、ジデオキシ連 鎖終結法によって配列を決定する。

実施例９ ウシ卵母細胞の生体外成熟、受精および培養未成熟の卵母細胞は、畜殺場で得ら れる卵巣卵胞を吸引することによって大量に得られる（４００〜６００個／日） 。未成熟卵母細胞は、受精を受容できるようになるまで生体外である期間培養さ れる。卵母細胞は、“成熟“すると、成熟しているかまたは生体外で“受精能を 獲得させた（ｃａｐａｃｉｔａｔｅｄ）”精子を受精させる。次に受精卵母細胞 の前核に、ヒトに一カゼインの発現と分泌をコードする導入遺伝子を注入する。

この生体外での受精と穎微注入から得られる接合体を、調製された培地または卵 管組織で“調整された″培地中で後期桑実胚期もしくは胞盤胚期（５〜６日間） まで培養する。次に胞盤胚を、妊娠の平衡を得るため受容者のウシの種に外科手 術なしで移行させるがまたは本願に記載されているように導入遺伝子の組込みに ついて分析する。

生体外での成熟（ＩＶＭ） 卵巣を地域の畜殺場で屠殺直後に入手して卵母細胞を回収する。あるいは、卵母 細胞を、外科手術、エンドスコープもしくは経膣超音波による方法によって生き ているウシの種から得られる。いずれの場合でも、卵母細胞は卵巣細胞から吸引 される（２〜１０ｍｍ直径）。洗浄後、卵母細胞を、１０％のウシ胎児血清で補 充したＭ１９９で構成された培地のような成熟培地内に置いて３９°Ｃで２４時 間インキュベートする（Ｓｉｒａｒｄら、Ｒｉａｌ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　、　３ ９巻、５４６〜５５２頁、１９８８年）。

生体外での受精（ＩＶＦ） 成熟した卵母細胞に新鮮なまたは解凍した精子を受精させる。

精子は、まず運動性を高められた精子集団をスイム−アップ（ｓｗｉｍ−ｕｐ） 分離法によって得ることによって受精用に準備される（Ｐａｒｒｉｓｈら、Ｔｈ ｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ、　２５巻、５９１から６００頁、１９８６年）。次 に自動性精子は精子受精能獲得を誘発するようヘパリンを補充した（Ｐａｒｒｉ ｓｈら、Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　、　３８巻、１１７１〜１１８０頁、１ ９８８年）改変タイロード液（Ｐａｒｒｉｓｈらの１９８６年の上記文献）で構 成されている受精培地に添加する。精子の受精能獲得は受精するのに必須の最終 の精子成熟過程である。精子と卵母細胞は１８時間、共培養される（ｃｏ−ｃｕ ｌｔｕｒｅ）　ａこのＩＶＦ法の有用な特徴は、（凍結精子の場合）特定の射精 液に対する最適の受精条件が形成されたならば堅実で繰返し可能な結果が得られ るということである（Ｐａｒｒｉｓｈらの１９８６年の上記文献）。

生体外での培養（ＩＶＣ） 従来の培養系は、マウス、ウサギまたはひとの卵子の発育を保持するが、ウシの 胚は８〜１６個の細胞分裂時期を過ぎると発育を保持されない。この問題は、培 養培地を卵管組織で前調整しておくことで克服されている。卵管で調整された培 地は、生体外で８〜１６個の細胞分裂時期を過ぎて胞盤胚の時期までウシの胚を 保持する（ＥｙｅｓｔｏｎｅおよびＦｉｒｓｔ、Ｊ、Ｒｅｐｒｏｄ、Ｆｅｒｔ、 、８５巻、７１５〜７２０頁、１９８９年）。

Ｃａｍｏｕｓらが（Ｊ、Ｒｅｐｒｏｄ、　Ｆｅｒｔ、　、　７２巻、７７９〜７ ８５頁、１９８４年）をトロホブラストの組織ととも共培養したとき２１６個の 細胞まで分裂することを示すまで、ウシ胚を生体外で８〜１６個の細胞“ブロッ ク”を過ぎて培養しようとする試みは成功しなかった。

この共培養法は、接合体から胞盤胚までの発育を保持するホモ卵管もしくはヘテ ロ卵管の性能に基づいて卵管の組織まで拡大した。したがって、卵管組織ととも 共培養されたかまたは卵管組織によって調整した培地で共培養されたウシ胚は、 生体外テ接合体カラ胞盤胚まで発育した（ＥｙｅｓｔｏｎｅおよびＦｉｒｓｔ、 　Ｊ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　Ｆｅｒｔ、　、　８５巻、７１５〜７２０頁、１９８ ９年；Ｅｙｅｓｔｏｎｅ、Ｗ、Ｈ，（１９８９年）　”Ｆａｃｔｏｒｓ　ａｆｆ ｅｃｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｅａｒｌｙ　ｂｏｖｉ ｎｅ　ｅｍｂｒｙｏｓ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　ａｎｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ”、Ｐｈ、 Ｄ、Ｔｈｅｓｉｓ、ライスコンシン大学）。胞盤胚は、この系で、過剰排卵およ び人工授精の後、または未成熟卵母細胞の生体外での熟成（ＩＶＭ）および生体 外での受精によって産生された。この方式で産生された胞盤胚は、受容者の動物 に移された後、妊娠されて仔ウシが生まれた。得られた結果は以下のとおりであ る。

効率　数 ステップ　（％）（１００当り） ＩＶＭ　９０　９０ Ｉ　Ｖ　Ｆ　８０　７２ １　Ｖ　Ｃ３０２２ 胚の移行　５０１１ （％妊娠） それ故、最初に１日当り収穫される５００個の卵母細胞から約５５の妊娠が達成 されると考えられる。

卵管組織の調製 共培養と調整培地 １、屠殺後または卵管切除法によって卵管を得る。

２、無傷の卵管をスライドガラスでゆるやかにかきとることによって収穫する。

３　改変タイロード−へペス溶液１０−中で５回組織を洗浄する（Ｐａｒｒｉｓ ｈら、Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　、　３８巻、１１７１〜１１８０頁、１９ ８８年）。

４、組織ｌ容積：培地５０容積の比率で、最終の組織ペレットをＭ１９９＋　１ ０％ウシ胎児血清中に再懸濁する。

５、組織懸濁液は胚の共培養に使用する。

６、あるいは、培地は４８時間調整してもよく、懸濁液を遠心分離した後上澄み 液は胚の培養培地として使用できるＯ調整培地は所望により一７０°Ｃで貯蔵す る。調整培地１よ胚の培養蚤こ全３蛍度で（希釈せずに）使用しなければならな い（Ｅｙｅｓｔｏｎｅの前記１９８９年の文献）。

実施例１Ｏ ウシ前核に対するヒトに一カゼイン導入遺伝子の顕微注入ヒトに一カゼイン発現 系を含有しているＤＮＡフラグメントを、適正な制限酵素で消化することによっ てベクターから切取り、次いでアガロースゲル上で分離する。得られたフラグメ ントは電気溶出で精製し、 分離した後上澄み液は胚の培養培地として使用できる。調整培地は所望により一 ７０°Ｃで貯蔵する。調整培地は胚の培養に全強度で（希釈せずに）使用しなけ ればならない（Ｅｙｅｓｔｏｎｅの前記１９８９年の文献）。

実施例ＩＯ ウシ前核に対するヒトに一カゼイン導入遺伝子の顕微注入ヒトに一カゼイン発現 系を含有しているＤＮＡフラグメントを、適正な制限酵素で消化することによっ てベクターから切取り、次いてアガロースゲル上で分離する。得られたフラグメ ントは電気溶出で精製し、フェノールとクロロホルムで抽出し次いでエタノール で沈殿させる（Ｍａｎｉａｔｉｓｓら）。得られたＤＮＡフラグメントを１〜２ μｇ／ｍｌの濃度で１０［１１Ｍトリス、０．１ｍＭＥＤＴＡ　ｐ８７．２に溶 解し、同じ液に対して透析した。ａｍ注射用の針は透析されたＤＮＡ溶液で満た す。

生体外受精を行う前に、最大速度で２分間攪拌するかまたは卵子を標準ミクロピ ペット内で上下数回ピペッティングを行う゛ことによって、卵子から小丘細胞を 除去する。ウシの前核は、前核を目視できるようにするため追加の遠心分離ステ ップを加えて、原則としてマウスの前核と同様にして注入を行う（Ｍａｎｉｐｕ ｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｍｏｕｓｅ　ｅｍｂｒｙｏ、ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　 Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社中のＨｏｇａｎ　Ｂ、らの１９８６年 の文献）。この注入は受精してから１８〜２４時間後に行う。この時間は、精液 源として使用される雄ウシによって変わる。異なるバッチの精液によって前核が 目視可能になる時間が変化する。

生体外で成熟させて受精されたウシ卵母細胞を、タイロードーヘペス溶液１−中 （Ｐａｒｒｉｓｈの１９８７年の文献）エッペンドルフ管内で１４５００まで８ 分間遠心分離に付す（Ｗａｌｌら、Ｂｊｏｌ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　、　３２巻、 ６４５〜６５１頁、１９８５年）。得られた胚をパラフィン油で覆った顕微鏡ス ライドガラス上の一滴のタイロードーヘペス溶液中に移す。油圧システム（ｈｙ ｄｒａｕｌｉｃ　ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、両方の前核か目視できるようなしか たで（干渉差レンズもしくは位相差レンズを用いる）、卵母細胞を卵子ホルダー に固定する。必要に応じて、卵母細胞は、卵子ホルダー上で回転させてその位置 を変え、前核を目視できるようにする。注入針を、一方の前核と同じ鮮鋭な焦点 に合わす。次に針を透明帯と細胞質を通って前核中に前進させる。１３ｐｌの小 容積（２０〜１００個のＤＮＡコピーを含有している）を、一定流量もしくはパ ルス流量（スイッチ使用）のＤＮＡ溶液を用いることによって、針から前核に注 入する。あるいは、二つの細胞期の胚を上記のように遠心分離し、両方の卯割球 （ｂｌａｓｔｏｍｅｒｓ）の核を上記のように注入する。この注入された胚は、 桑実胚期もしくは胞盤胚期まで発育させるために、実施例６に記載のようにして 一滴の共培養培地に移行させる。

実施例１１ ヒトに一カゼイン導入遺伝子の遺伝子導入の早期検出実施例７に記載されている ように構造体の穎微注入を行ってその卵母細胞を培養する。各胚の適正な部位を 分割して、溶解しくＫｉｎｇ、　Ｄ、ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｒｅｐｒｏｄｕ ｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１１巻、５７〜６２頁、１９８８ 年）、タンパク質分解を行い（Ｈｉｇｕｃｈｉ、　Ｒ，。

”Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ”　（Ａ　ｆｏｒｕｍ　ｆｏｒ　ＰＣＲＵｓｅ ｒｓ１２巻、１〜３頁、１９８９年）および消化を行う。ＰＣＲは実施例４に先 に述べたようにして行う。すなわち、２つのプライマー〔一方がエキラン３中に あり（ＳＹＭ　３１２０）　（表１参照）および他方がエキラン４中にある（Ｓ ＹＭ　２８８７）：ｌのセットを用いて行う。

実施例１２ ウシの種の乳汁中へのヒトに一カゼインの産生顧微注入された卵母細胞から発育 したウシ桑実胚をＤｏｎａｈｕｅの方法（Ｊ、　Ｗａｒｒｅｎ　Ｅｖａｎｓら編 集”Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｔｓ’　、Ｐ ｌｅｎｕｍ社中のＤｏｎａｈｕｅ、　Ｓ、の１９８６年の報告）にしたがって分 割する。桑実胚の％は胞盤胚まで発育させるため培養液中に保持する。残りの％ は実施例８に記載されているようにしてＤＮＡ分析を行う。この分析の結果が分 かってから、培養液中に保持された桑実胚を胞盤胚まで発育させるか、または脱 核接合体中に核転移させるための起源として用いる。同期化された雌ウシへの胞 盤胚の転移はＢｅｔｔｅｒｉｄｇｅの方法にしたがって実施する（“Ｅｍｂｒｙ ｏ　ｔｒａｎｓｔｅｒ　ｉｎ　ｆａｒｍ　ａｎｉｍａｌｓ：ａ　ｒｅｖｉｅｗ　 ｏｆ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅＳ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”中のＢｅｔ ｔｅｒｉｄｇｅ、　Ｋ、　Ｊ、の１９７７年の報告）。

ヒトに一カゼインは、実施例８に記載の方法を用いて、授乳中の形質転換された 子の乳汁中に検出される。

寄託 ｐｓ２７０と命名されたプラスミドＤ　Ｎ　Ａ　Ｉｔ、ドイツ、Ｄ　−３３００ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ　Ｗｅｇ　ｌｂに所在のＤ ｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　！Ｊｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅ ｎ　ｕｎｄ　Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ　ＧｍｂＨのコレクションに、ブダペス ト条約の規定にしたがい１９９２年１月１７日付けで寄託され、受託番号ＤＳＭ 　６８７８によって特定された。

ｐＳ４５９およびｐＳ４６０と命名されたプラスミドＤＮＡは、ドイツ、Ｄ　− ３３００、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ　Ｗｅｇ　ｌｂ に所在のＤｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎ ｉｓｍｅｎ　ｕｎｄ　Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ　ＧｍｂＨのコレクションに、 プダベスト条約の規定にしたがい、１９９３年１月２０日付けで寄託され、それ ぞれ受託番号ＤＳＭ　７４１４とＤＳＭ　７４１５で特定されている。

ｐｓ３３０．３３９．４１５および４２５と命名された発現ベクターは、ドイツ 、Ｄ−３３００８ｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ　Ｗｅｇ　 ｌｂに所在のＤｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｗｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇ ａｎｉｓｍｅｎ　Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ　ＧｍｂＨのコレクションに、ブダ ペスト条約の規定にしたがい、１９９３年１月２０日付けで寄託され、それぞれ 受託番号ＤＳＭ　７４１０ＳＤＳＭ７４１１、　ＤＳＭ　７４１２およびＤＳＭ 　７４１３によって特定されている。

配列の一覧表 （１）一般情報： （ｉ）出願人 （Ａ）名称・ＳＹＭＢＩＣＯＭ　ＡＢ （Ｂ）ストリー）　：　Ｔｖｉｓｔｅｖａｇｅｎ　４８．Ｐｏ５ｔｂｏｘ　１４ ５１（Ｃ）市：　Ｕｍｅａ （ε）国：スエーデン （Ｆ）郵便番号：　（ＺＩＰ）　：　Ｓ−９０１２４ＣＧ）　を話：　＋４６− ９０１９０１２０（Ｈ）テレファックス：　＋４６−９０１９２３３２（２）発 明の名称：ヒトタンパク質をコードするＤＮＡ。

そのタンパク質を得る方法および用途 （ｉｉｉ）配列の数：２７ （１ｖ）コンピュータが読取り可能な形態：（Ａ）媒体のタイプ・フロッピー　 ディスク（Ｂ）コンピュータ　ＩＢＭ　ＰＣコンパチブル（Ｃ）　ｔベレーティ ングシ：）、　ｙ　ム：　ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：　 Ｐａｔｅｎｔ　Ｉｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　＃　１．０゜Ｖｅｒｓｉｏｎ＃１．２５ （ＥＰＯ） （ｖｉ）原出願のデータ・ （Ａ）出願番号：　ＤＫ８８／９２ （Ｂ）出願日：　１９９２年１月２３日（２）　ＳＥＱ　［Ｄ　Ｎｏ：１に関す る情報：（ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ＝８５７個の塩基対 （Ｂ）タイプ、核酸 （Ｃ）ストランデッドネス二一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （１１）分子のタイプ：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）仮説（ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ）　：なしくｖｉ）起源： （Ａ）生物：ホモ・サピエンス （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：ＣＤ５ （Ｂ）位置：　４５．．５９３ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：ｍａｔ−ペプチド （Ｂ）位ｆｔ　：　４５．．５９３ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：ｓｉｇ−ペプチド （Ｂ）位置：　４５．　、１０４ １０　（ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：　５’　ＵＴＲ （Ｂ）位置：　１３．．４４ （ｉｘ）特徴： １５　（Ａ）名称／キー：３’ＬＩＴＲ（Ｂ）位（１：　５９４．．８４８ （Ｘ］）配列の性状：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　Ｉ　：ａ　ａ　ＭＡＡＡＡＡＡ ＣＣＧＧＡＡＴＴＣ［１５７（１ｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：エキソン ＣＢ）位置：　２１８７．．２２４１ ５　（ｘｉ）配列の性状：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　３　：ＧＡＧＴＣＴＧＣＴ Ｔ　ＡＧＡＴＴにＴＴＣＡ　ＡＡＴｒＧＡＴＴＣＣＡＡＡＴＧＡＧＴｒＣＣＡＴ ＣＡＡＡＴＧＧ　ＡＭＴｒＴにＡＴＧ　W４０ ＡＣＡＴＣＧＴＡＴＣｃｃｃａｃ’ｒｒｒｒｃ　ＡＡＧＴＣＡＣＴＴｒ　ＡＧ’ ＴＡＧＡＣＡＧＣＣＴｒＣＣＴＡＡＴＣλｒｒＡｒｒｃｃｃ秩@９００ ｒｃｃｃｃｒｃｃｃＡＴＴＡＡＣＣＣＴｃＣＣ２２４１ＧＡＴＣＴＣＴｒＣＡ　 ＡＡＴＴ（ＴｒｃＡＴ　ｃＣ：ＴＣｋＣｃＴＴＧ　ＧＡＣＡＡＧＡＧＡＣＴＴＣ ＡＣＴｒＣＴＡ　ＴＡＴ口ＧＧＡＴ`　６０ ＡＴＴＴｆ：ＡＡＴＣＴ　ＣＡＡＣＡＴＴｒＴＣＡＧＡＡＡＧＡＧＣＴ　ＴにＡ ＴＧＴＡＡＡＧ　Ｃσｎ了ＡＣＡＣＴττσｒＴＧ丁ＣＡＴ@１２００ ＴにＴＡＧＣＴＧτＡ　ＣＴＡτＣＡＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＴｒＣＧ　ＡＣＡＴ ｒＣＡＡＡＡ　ＴＣｒＧＡＣｌＴＣＡ　ＧＡσｍＡＡＣτ　k２６０ τＴＣＣｋＴＣＡＡＡ　ＴＧＡＡＭ−ＭＣＣＴＡＡＴＣＴｒＧＴｒ　ＡＡＧＡＡ ＴＡＡＡＴ　ＣＡＣＡＧＧＣＴＣＡ　ＴｒＧＡＣＴＣＴＣＡ@２５２０ ＣＣＣｒＴｋＴｋＣＣＡＴＴＴＡＴＴＣＡＴ　ζＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣ ＣＡＣＣＡ　ＣＡＡＴＴＡＣＣＡＴ　ＣＡＣＣＣＴＣＡＣＡ@２５８０ ＡＣτ＾λＣＣＴＴＴ　にＣＡ（：にＡＣＡＡＡ　τＣＴＣ，ｌ　ＬＣＣＣＩ、 ＡＧＴＡＡＴＣＴＣｃｃｃ、ｘｃｃてＣτＡ　ＣＣＡＡＧ（AτＡＣ，’、　２ ６（，０ （：ＣＡＣＴＣＣＣＡＣＡＣＴＣＡＣＣＴＣＡ　ＴＣＴＣＡＴＡＣＴ（：　ＣＣ ＴＣＣＣＣＣ，ＩＣＴＡＴＧＧＡＣＴＣＡ　ＡにＴＴｒＧＡfＡＣ２７００ Ｃ＾τＡＧＴＣＡＡＴ　ＣＡＡＧＡＧＣＴＴ（：　ＡＴＴＡＡＧτロム八Ｇｍτ ＣへＴＣ買Ｃ＾ｃｃｃ、ｘＴＣＡＣ晶ＴＡ−Ａ人込　２７６O ＡＧＡＡＡＡＣＴＩＴ　ＡＡＡＡＴＧＡＡＡＡ　Ａ−Ａ−ＡＧ（ｉＧＡＡ−Ａハ 患ＣＴＡＧＡ−Ａ　ＴＴＣＡＧＣＡＡＣＡ　にＧＡＧＴＡＣsＴ（２８２０ Ｃ＾τＣＡＡＧＡＡＧＴｒＴＡＡＡＡＴＡＣＴ’ＴＣＴ（ＴＣＡＴＣＴＣＡＡＴ ＴＣＴＣＡＴＴＣＣｋＣ工ＡＣＴｒＴＡＣＡＣＴＧ　２８１P０ τ（：ＡＧＡＣＧＡＡＴ　ＴＴＣＣＴＴＣＴＴＡ　ＣＴＴ、ＡＧ（：Ｇ；ＣＴＣ ＡｒｒｒＡｒｒｃｒｃ　［：ＣＡ、ｕｃＴｃｃＡ　ＣＴＣＴbＴＣＴＡＧ　２９ ６０ ＡＣ（：ＧＣＡＴＧＡＴＴＡＴ人ＡＧτ−ＣＣＡＧＴＣＡ（＋ＴＡＧλＡＴＧＡ ＡＡＧ：（：ＴＣＴＴＴＴＴＡＴＴｒＴ（：ＣＴＴＴＧＧＡf１０００ ７：τＡＣＣＣＣＴ　ＣＴＴｒ’ＴＴＣＴＣＴ　ＣＴＣＴＴＴＴＣＴＣＣＣに（ ＴＴＣＣＣＴ　ＣＴハＴＴＣＣＴに　ＣＴＴＴＣＴＡＣＣＴ@３０６０ ＧＣＡＣπＣＡＴＡ　Ａ、ｌ込ＣＴＣＴＣＣτＧ晶ＴＧＣ；にＴＣττ訂ＣＴＴ ＣＣＣＣＣｒゴＣ晶ＴにＣＣ，１ｕｌｌ；ＴＣんｄτＣ３１Q０ Ｃ，ｔ＾、ＣＴＣＣｒＴＣＣＬ：ＣＣＣ入入ＣＴＡ　ＴＣＣＣＣτＴζ入ＡＴ八 ＡτＡ丁τ入へ人　τ人ＡＣＡτＣτζτ　ＣＴ起入ＡＣ入`τ八へ　３Ｌ８〇 二ＣＴＡＣＴ　、Ｉｖ、Ｔ　ＴＡＴＴ屯ＴＣＣＡＡ　ＴＣＡにＧＡＴＴ；−Ａ　 ＴＴＧにＣＴＴＴＣＴ　ＡＣＴＣτＣＴＡＣＡ　ＣＣＡττ■H−ＡＡＡ　３２ ４０ ＾ＧＡＡＧＡττＣＴ　ＴＣＴＣフ（：１ｌＣＡ　ＴＣＴｒＣＩ、１ＩＩＡＡτ 　ＣＴＣτＣＴＣＣＣτ　τＣＡτＣＴτＴｏτ　丁τＴτbＣＣＣＴτ　３３ ００ Ａ（：ＡＣＴＡＣＡＡＧ　ＣＣττττＳ入ＡＧ　ＡＡにＣＡＣＣＴＩ：Ａ　Ａ Ｃ＾ＣττＣＣＡに　ＣＣＴτＡＣＡτＣＡ　人ＡＴＴＣＴsＴＧＣ３３６０ ＣＡＣＣＴＴｒＣＡＣｋＡＡｃｃｃｃＴＬ：　ＣＴＡＣＣＴＡＴＣＡ　ＡＡＣＣ ＣＣＡＡＴＴ　ＴＣ：ＡＡＣＡｌ：ＴＴＴ　ＴＣＴＡＣＣＣ`ＴＧ３４２０ ＡＡ（ＡＡＴＴＡＡＡ　ＣＴＴＴＣＡＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＣＴＣＴ　ＴＴＣＴ ＩＴＴＣＩＩ　ＴＴＡＧＣＡＡＣＡＴ　ＴＡＡＣＣＡＴＣＣH　３４８０ ＣＣＣＴＴＧＣＣＴＣＴＴＴＣＴＣＴＡにＡ　ＡＣ（：ＧＴＴＡＡＧＡ　ＡＴＴ ＡＴＡＴＣＡＣＴＡＡＡＴＣＡＣＴＡ　Ｔ丁ＧＧＡＴＴ’ＣC、）５４０ Ｃ＾τＣＡＣτＡＣＡ　ＡＡＧＡＴにＡＣＴＡ　ＡＧτＣＡＣＡＣ；（：Ａ　Ｔ ｃＴＡＡＧ（：ＡＴＡ　ＴＴＴＡτにＡＡＡＡ　ＧＡＴＣＣ`ＡＧＧ、、　３６ ００ ζ入＾ＣτＣＡＴＧＡ　ＣＣＣＡＣＣＡＴＴＡ　τｃ’ｒτＣττＡτＡＣ＾Ｃ ＴＣ＾Ｇ＾ＴＧ　（：ＣＡＡＡＣＣτＣτ　にＣＣＣＣＣＡfＡ（：　１６６０ Ｔｃ′ＴＣＣＣＡＧＣＣＣＡＣＴＧＡＧＣＣＣＡＣＴＧＣＣＴＴＣＣＴＴＴＩＴ ＣＣＣＴＴ　ＡＧＧＧＧにＴＡＴＣＣＴＣＴＣＣＣＴｒＣ３V２０ ＣＴＣＣＣＧＴｒＣＣＡＴＡＣＴＴＣＣＣＣＴ’ＴＣＴｋＣＴＣＣＣＴＣＡ（： ＧＡＴにＧＧＡＡＧＴＡＣＡＡＴＧ　ＣＣＡＡＣＴＣＣＴＣR７ＢＯ ＴＣＡＣｒＴＣＡＣＣＣＣＡＧにＡＧＧＴｒ　ＣｋＡＣＣｒＣＣＡＣＴＣＡＣＣ ＴＣＴＣＡ　ＴＣＣＡＴＡＣＣＡＴ　ＴＧＴＡＣＴＣＣＡＡ@’−３２０ ＣＣＴＧ；ＧＧＣＡＡＴ　ＣＣＡＣＴＣＡＧＴＣσにτＣＴＣＡＡＡ　ＡＡＡＩ 晶んμＴＡτＡＡＡＡＡＡτＡＡＴんりＪτＣＡＡ　Ｉａ３W０ ＡＧＧＡＡＣＡＧＡＧ　ＡＡＣＣＣＧＡＡＡＣτにＡＡＴＣＣＡＴＴ　＾ＣτＧ ＡＣＡＴ人Ｔ　（：ＣＴＴ（ＴＧＡτ（ｉ　ＧＡＣＣ八τＴ■fＧ　４８６０ ＴＴＣτλＡτＧにＡ　ＣτＡＣＣＴＣＴＣＣＣＴＡＡＡＧＡＧ；にＣＴＣＣＴ ＣＣＣＴＡＡ　ＣＡＡＴＣＣＡＧＣＴ　（：ＡＡＡＩ：（：`ＡＴＡ　４９２０ ＣＡＣＡＣＣＣＡＣＣＣＣＡＡＴＴＡＡＴＴ　ＴＣＴＣＣＡ（：ＣＡＡ　ＣＡＡ ＡＧＣＣＴＴＡ　ＧＴロゴＴＡＧＡＧ　α℃τＧ（ＴＴＣＡ@４９８０ τττＡＴｒＣＡＡＡ　ＴｒＣＴＧＴＡＣＧＡ　ＣＡＣＴＧＡＧＴＣＡ　ＴＡＡ ＧＴにＣＣＡに　ＴＣＴＴＣＡτＣＴＡ　ＧＣＣＴｒＣＴＴ■■@５１６０ ＡＴＴＴＣＡＧＡＡＴ　ＡＴｒＴＡＡＡＧＡＧ　ＡＣＡＡＡＧＧＴＡＣＡＣＡＧ ＡＧＧＧＧＡ　ＧＡＧＣＡＣＴＧＡＧ　ＡＧＧＡＣＴＣＴＧ`　５２２０ Ｔ（：ＣＣＡＴＴｒにＧ　ＴにＣＴｒＡＡＧＡＡＣＴＴにＣＡＴＣＣＡ　ＴＣＡ にＴｒにＧＣＣＴｒ（：ＡＧＧＧα７　ＧＴＣＣＡＡＧＧにf　５２８０ τＴＣＴＡ丁ＴＴτＣτｋｋＡＡＣ；τＴにＧ　ＧＧＡＡ＾ＣＡＴτＣＡ＾Ｃτ ＣＣλＡ＾丁　ｃＴｃｃτＴＡ＾Ｔτ　＾ＡττＡＡＴＴＡO　５７６０ ＴＴＡＡＴＴＣＡＧＴ　ＣＡＴＴＣＡＣＴＣＡ　ＡＣＡＡＧＴＡＴＴＴ　ＡＴＴ ＧＡＧＴＣＣＣＣＴＩＴＡＴｒＧ（：ＣＣＡＧＧＣＡＣＴＣs　５８２０ ＴＣＴＴＡ（ＴＣＣＣＡＣＣＧＡＣＡＣＡＡ　ＣｋＴＴＣＡＣＣｋＡ　ＡＧＣＡ ＧＡＴＴＣＣτＣＣＣσｉτＡＧＡＡ−了ＡＡＡ（７５８８O τＣＴＣＡＣ’ｒＣＡＧ　Ｔ人ｃＴＴＣＣＣＡＡ　ＣＣＡＣＴＡＴＣＣＡ　ＴＡ ＴＴＡｃＴＡＴＣＣＴＣＣＡＡＣＡＡＧ　ＣττττＡＡＡ`Ｃ６０６０ ＣＡＴＴＣＧＴＣＴＣＴＣｃｃＣＣＣＣＡＧ　ＣＣＴＬＡＡＡｋＴＴ　ＴＴＡＡ ＴＴＴＴＴＴ　＾ｃｃｃ’ｒｒｃ’ｒｃｃ　ｃ、＋、ｃｒｃ窒モ窒モメ@６１２ ０ ＴＴＡＡＡＡＴＴＡＡ　ＣＣＴｌ：ＡＣＭＴＡ　ＡＡＡＴＣＴＣＣＣ”：　ＴＧ ＡＣＴＧＡＣＴＡ　ＴＡＧＣＴにτＣＡＡＣＡＴＧＧＣＣＴiＴ　７９２０ ＾ＣＧＴＣＴＣＴ（１（：Ｃ（：ＣＣＡｒＴＣＴ　ＧＴ（ＴＧＴＧＴＣＴ　にＣ ＡＴＧＴτ’ｃＴｃ　ｃｒτＣτＣτＡＴＡ　ＡＣＡＴ（ＴbＡＡＡ　９６６０ ＾ＣＡＡＡＡＣＣＴτ　ＣＣＴＴＣＴＴＴＣＡ　ＴＣτＣＣＴτＣＣＣＴＡＡＴ にＡＣＣＡＴ　Ａに（：ＣτＡＣτＣＡ　ＴＴＡＣτττＣsＣＬＬＡ６０ （２）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：５に関する情報：（ｉ）配列の特性。

（Ａ）長さ２２２個の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランデッドネス二一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉ　ｉ）分子のタイプ：　ＤＮＡ （ｘｉ）配列の性状＋　ＳＥＱ　［Ｄ　Ｎｏ：　５　：ＧＴＴＧＧＧＴＡＡＣＧ ＣＣＡＧＧＧＴＴＴ　ＴＣ（２）　ＳＥＱ　１０　Ｎｏ＋６に関する情報：（ｉ ）配列の特性： （Ａ）長さ＋１７個の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランデ・ソドネスニ一本鎖 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｉ）分子のタイプ：　ＤＮＡ （ｘｌ）配列の性状：　ＳＥＱ　［Ｄ　Ｎｏ：　６　：ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧ　 ＣＴＡＴＧＡＣ１７（２）　ＳＥＱ　１０　Ｎｏゴに関する清報：（ｉ）配列の 特性： （Ａ）長さ２２２個の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランデッドネス二一本鎖 （Ｄ）トポロジー二線状 ２２　（＋＋）分子のタイプ：　ＤＮＡ（ｘｉ）配列の性状：　ＳＥＱ　１０　 Ｎｏ：　７　：ＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧ　ＴＡＴＧＴＴＧＴＧＴ　ＧＧ　２２（２ ）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：８に関する情報：（ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ＋２６個の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランデッドネス二一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｘｉ）配列の性状：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　８　：ＡＴＣＣＣＧＧＧＣＡ　 ＧＧＧＴＴＡＡＴＧＣＣＡＧＧＧＣ２６（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：９に関す る情報：（ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ＋２８個の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランデッドネス、一本鎖 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｘｉ）配列の性状：　ＳＥＱ　［Ｄ　Ｎｏ：　９　：ＣＧＡＡＧＣＴＴＣＡ　 ＧＣＴＣＡＡＣＣＴＡ　ＣＴＧＣＣＡＡＣ２８（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：１ ０に関する情報：（ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ＋２７個の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランデッドネス二一本鎖 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｉ）分子のタイプ：　ＤＮＡ （ｘｉ）配列の性状：　ＳＥＱ　［ＯＮｏ：１０　：ＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴ　Ｃ ＴＧＧＴＴＴＴＧＡ　ＡＣＣＴＣＣＡ　２７（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：１１ に関する情報：（ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ＋３３個の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランデッドネス二一本鎖 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｉ）分子のタイプ：ＤＮＡ （ｘｉ）配列の性状：　ＳＥＱ　［Ｄ　Ｎｏ：　１１ＴＡＴＧＧＡＧＧＴＴ　Ｃ ＡＡＡＡＣＣＡＧＡ　ＡＡＣＡＡＣＣＡＧＣＡＴＧ　３３（２）　ＳＥＱ　ＩＤ 　Ｎｏ：１２に関する情報：（ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：３５個の塩基対 （Ｂ）タイプ、核酸 （Ｃ）ストランデッドネス二一本鎖 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｉ）分子のタイプ：　ＤＮＡ （ｘｉ）配列の性状：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｉ２：ＴＡＴＧＣＡＧＡＧＧ　Ｔ ＴＣＡＡＡＡＣＣＡ　ＧＡＡＡＣＡＡＣＣＡ　ＧＣＡＴＧ（２）　ＳＥＱ　［Ｄ 　Ｎｏ：１３に関する情報：（ｉ）配列の特性。

（Ａ）長さ：２９個の塩基対 （Ｂ）タイプ、核酸 （Ｃ）ストランデッドネス、一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （１１）分子のタイプ：　ＤＮＡ （ｘｉ）配列の性状：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：１３：ＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴ　Ｃ ＴＧＧＴＴＴＴＧＡ　ＡＣＣＴＣＴＧＣＡ　２９（２）　ＳＥＱ　［ＯＮｏ：１ ４に関する情報：ｉ　（ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ；３０個の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランデッドネス二一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 ３５　（ｉｉ）分子のタイプ：　ＤＮＡ（ｘｉ）配列の性状：　ＳＥＱ　ＩＤ　 Ｎｏ：１４：ＧＧＧＧＴＣＧＡＣＴ　ＧＧＴＧＴＴＴＴＴＡ　ＴＧＣＣＧＴＡＧ ＧＴ　３０（２）　ＳＥＱ　［Ｄ　Ｎｏ：１５に関する情報：（１）配列の特性 ： （Ａ）長さ２３０個の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランデッドネス二一本鎖 （Ｄ）トポロジー・線状 （２）　ＳＥＱ　［Ｄ　Ｎｏ：１９に関する情報：（ｉ）配列の特性。

（Ａ）長さ１２５個の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランデッドネス二一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （１１）分子のタイプ：　ＤＮＡ （ｘｉ）配列の性状：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：１９：ＣＴＧＴＧＴＧＧＣＡ　Ａ ＧＡＡＧＧＡＡＧＴ　ＧＴＴＧＴ（２）　ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：２０に関する情 報：（１）配列の特性。

（Ａ）長さ　２５個の塩基対 （Ｂ）タイプ、核酸 （Ｃ）ストランデッドネス二一本鎖 （Ｄ）トポロジー二線状 （１１）分子のタイプ：　ＤＮＡ （ｘｉ）配列の性状：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：２０：ＧＧＴＴＴＧＧＧＣＧ　Ａ ＣＧＴＡＣＣＡＣＡ　２０（２）　ＳＥＱ　［ＯＮｏ：２１に関する情報：（ｉ ）配列の特性： （Ａ）長さ：３１個の塩基対 （Ｂ）タイプ、核酸 （Ｃ）ストランデッドネス二一本鎖 （Ｄ）トポロジー二線状 ２５　（ｉｉ）分子のタイプ：　ＤＮＡ（ｘｌ）配列の性状：　ＳＥＱ　ＩＤ　 Ｎｏ：２１：ＡＡＴＴＣＣＣＣＴＧ　ＧＣＡＴＴＡＡＣＣＣＴＧＣＣＴＴＴＴＴ Ｔ　Ｇ　３１（２）　ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：２２に関する情報：（１）配列の特 性： （Ａ）長さ＝２６個の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランデッドネス二一本鎖 ＣＣＧＧＴＡＣＣＡＴ　ＧＡＡＧＡＧＴＴＴＴ　ＣＴＴＣＴＡＧＴＴ（２）Ｓ巳 Ｑ　［Ｄ　Ｎｏ：２６に関する情報：（ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ＝２４個の塩基対 ＣＢ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランデッドネス二一本鎖 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｉ）分子のタイプ：　ＤＮＡ ＴＴＡＡＧＣＴＴＴＡ　ＣＴＴＡＴＧＴＴＴＴ　ＣＡＴＴＨｉｎｄｌｌｌ　Ｐｖ ｕｌｌ ｃｃｌ ｐｈｌ ＥｃｏＲｌ　、ｃｉセインｃＤＮ４　ＥｃｏＲＩｃｄ ｐｈｌ Ｈｉｎｄｌｌｌ　ＰＶＬ ｖｕｌ１ 図１ 図３ 図８ 図９ 図１０ 図１１ 図１２ Ｍ　１　２３４５６　７８９１０１１１２１３Ｍ・図１５ 図１６ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） ｌ、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＤＫ　９３１０　Ｏ０２４ ２、発明の名称 に−カゼインをフードするＤＮＡ、そのタンパク質を得る方法および用途３、特 許出願人 住　所　スエーデン、ニス−９０１２４ウメア、ツビステベーゲン４８、ホック ス　１４５１ 名　称　ノンビコム　アクティポラーク国　籍　スエーデン ４代理人〒５３０ 住　所　大阪市北区西天満５丁目１−３クォーター・ワンビル５　補正書の提出 年月日 請　求　の　範　囲 １．ヒトに一カゼインの生物活性を有するＳＥＱ　ＩＱ　Ｎｏ：　２のアミノ酸 配列２１〜１８２またはその類似体もしくは変異体を有するポリペプチドをコー ドするＤＮＡ配列と該ＤＮＡ配列の発現を（中介することができる５゛−フラン キング配列とからなる発現系。

２、＠乳動物の乳汁タンノくり質遺伝子からの５゛フランキング配とヒトに一カ ゼインの生物活性を有するＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　２のアミノ酸配列２１〜１８ ２またはその類似体もしくは変異体を有するポリペプチドをコートするＤＮＡ配 列とからなり、該５°フランキング配列が該ＤＡＮ配列の発現を仲介することか できる発現系。

３、ＤＮＡ配列が、少なくとも１つのイントロン配列を含有する請求項１または ２による発現系。

４、単一もしくは複数のイントロン配列が、ＳＥＱ　［Ｄ　Ｎｏ：　３および／ またはＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　４で表されるイントロン配グ１力為ら選択される 請求項３による発現系。

５、ＤＮＡ配列が、少なくとも１つの許容ＲＮＡスプライスシグナルを含有する 請求項３または４による発現系。

リペブチトをコードするＤＮＡ配列が、／％イブリ・ノド遺伝子力く発現される ときに該ＤＮＡ配列によってコードされるボ１ノペプチドか産生されるように、 該）１イブリ・ノド遺伝子を保存する悲ヒト鴫乳動物の成熟雌の乳腺で発現可能 なノ＼イブリッド遺伝子を形成するために、哺乳動物の乳汁タンｌくり質をコー ドする遺伝子の調節要素と結合される請求項１〜５のいずれかによる哺乳動物発 現系。

７、乳タンパク質をコードする遺伝子が、カゼイン遺伝子または乳漿の酸性タン パク質（ＷＡＰ）の遺伝子から選択される請求項６による発現系。

による発現系。

９、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、ストリンジェントハイブリッド形 成条件下でＤＮＡ配列ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１もしくはその一部とハイブリッ ドを形成するＤＮＡ配列である請求項６による発現系。

１０、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、少なくとも一つのイントロン配 列を含存し、かつストリンジエントノ１イブ１ルノド形成条件下でＤＮＡ配列Ｓ ＥＱ　［Ｄ　Ｎｏ：　１もしくはその一部分とハイブリッドを形成する請求項９ による発現系。

１１　単一もしくは複数のイントロン配列が、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　３および ／またはＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　４で表されるイントロン配列から選択される請 求項１Ｏによる発現系。

１２、　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ＋２のアミノ酸配列２１〜１８２を有するポリペプ チドを特徴とする請求項１−１１のいずれかによる発現系。

）酸配列２１〜１８２またはその類似体もしくは変異体を有するポリペプチドを コードするＤＮＡ配列。

１４　実質的にＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　ｌに示されるＤＮＡ配列力λらなる請求 項１３によるＤＮＡ配列。

１５、実質的にＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　３に示されるＤＮＡ配列とＳＥＱ　ＩＤ 　Ｎｏ：４に示されるＤＮＡ配列とからなり、さらに任意（こＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ ｏ：３とＳＥＱ　［Ｄ　Ｎｏ：　４を連結するＤＮＡ配列を有する請求項１３１ こよるＤＮＡ配列。

１６　少なくとも一つのヌクレオチドが欠失、置換また（よ修飾されるか、また は少なくとも一つの付加ヌクレオチドカベ挿入されて、ヒトに一カゼインの生物 活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列になっている点で、請求項１ ３〜１５のし）ずれ力１に定義されたＤＮＡ配列と異なる修飾ＤＮＡ配列。

１７、請求項１−１６のいずれかに定義されたＤＮＡ配列を保持し、かつ該ＤＮ Ａ配列の発現を仲介することができる複製可能な発すペプチドをコードするＤＮ Ａ配列を保持し、かつ該ＤＮＡ配列の発現を仲介することができる複製可能な発 現ベクター。

＋９．　ＤＮＡ配列が、ＳＥＱ　［ＯＮｏ・２のアミノ酸配列２＋−１８２力１ らなるポリペプチドを特徴とする請求項１８による複製６可能な発現ベクター。

２０　ドイチュ　サムルング　フォノ　ミクロオルガニスメンランド　セルクル トゥーレン　ゲーエムビーハー（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ 　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ　ｕｎｄ　Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ　Ｇｍ ｂＨＸＤＳＭ）のコレクションに、ブダペスト条約の規定にしたがって、１９９ ３年１月２０日付けで寄託され、受託番号ＤＳＭ　７４１０．　ＤＳＭ　７４１ １、ＤＳＭ７４１２およびＤＳＭ　７４１３をうけているｐＳ　３３０、ｐｓ　 ３３９、ｐｓ　４１５およびｐＳ　４２５と命名された発現ベクター、および該 寄託された発現ベクターのＤＮＡ配列とは異なるが、ヒトに一カゼインの生物活 性を存する同じポリペプチドまたはその類似体もしくは変異体をコードするＤＮ Ａ配列を発現する発現ベクターからなる群から選択される複製可能な発現ベクタ ー。

２１、発現されるＤＮＡ配列が、少なくとも一つのヌクレオチドが欠失、置換ま たは修飾されているか、または少なくとも一つの付加ヌクレオチドが挿入されて 、に−カゼインの生物活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列になっ ている点で、寄託されたベクターのＤＮＡ配列と異なるＤＮＡ配列である請求項 ２０による複製可能な発現ベクター。

２２、ドイチュ　ザムルング　フォノ　ミクロオルガニスメンウンド　セルクル トゥーレン　ゲーエムビーハー（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａ　、ｍｍｍ１ｕｎ　ｖ ｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ　ｕｎｄ　Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ　 ＧｍｂＨＸＤＳＭ）のコレクションに、ブダペスト条約の規定にしたがって、　 １９９２年１月２０日付けで寄託され、受託番号ＤＳＭ　６８７８をうけている ｐＳ　２７０と命名されたプラスミド、ドイチュ　ザムルング　フォノミクロオ ルガニスメン　ランド　セルクルトゥーレン　ゲーエムビーハ−（Ｄｅｕｔｓｃ ｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ　ｕｎｄ　 Ｚｅｌ１ｋｕｌｔｕｒｅｎ　ＧｍｂＨ）（ＤＳＭ）のコレクションに、ブタペス ト条約の規定にしたがって、１９９３年１月２０日付けで寄託され、受託番号Ｄ ＳＭ　７４１４およびＤＳＭ　７４１５をうけているｐｓ　４５９およびｐＳ　 ４６０と命名されたプラスミド、およびＳＥＱ　１０　Ｎｏ：　１に示されるＤ ＮＡ配列とは異なるが、ヒトに一カゼインの生物活性を有するＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ ｏ２に示されるポリペプチドまたはその類似体もしくは変異体をコードするか、 またはストリンジェントハイブリッド形成条件下でＤＮＡ配列ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ ｏ：　ｌもしくはその一部とハイブリッドを形成するＤＮＡ配列を存するプラス ミドからなる群から選択されるプラスミド。

２３　請求項１７〜２２のいずれかで定義されたベクターを保存する細胞。

２４、原核細胞、単細胞真核生物もしくは多細胞生物由来の細胞である請求項２ ３による細胞。

２５　多細胞生物、例えば動物由来である請求項２４による細胞。

２６、ポリペプチドをコードするＤＮＡが非ヒト哺乳動物の分泌線内で発現され るような様式で非ヒト哺乳動物のゲノム中に請求項１〜１２のいずれかに記載の 発現系を導入し、および腺から分泌される分泌物を集収することからなる、ヒト に一カゼインの生物活性を有するＳＥＱ　ＩＤＮｏ：　２のアミノ酸配列２１〜 １８２またはその類似体もしくは変異体を存するポリペプチドを産生ずる方法。

２７　分泌線か乳腺てあり、分泌物か乳汁である請求項２６に記載の方法。

２８、非ヒト哺乳動物のゲノム中にポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を染色 体的に導入することからなる、ヒトに一カゼインの生物活性を育するＳＥＱ　Ｉ Ｄ　Ｎｏ＋　２のアミノ酸配列２１−１８２またはその類似体もしくは変異体を 有するポリペプチドを発現することができる遺伝子導入非ヒト哺乳動物を作成す る方法。

２９、さらに非ヒト哺乳動物のゲノム中にβ−カゼインをコードするＤＮＡ配列 またはその類似体、変異体もしくはサブ配列を染色体的に導入することからなる 請求項２８による方法。

３０、哺乳動物の受精卵または胚の細胞に請求項１〜１２のいずれかで定義され た発現系、および任意にさらにβ−カゼインをコードするＤＮＡまたはその類似 体、変異体もしくはサブ配列を注射して哺乳動物の生殖細胞系に発現系を導入し 、およびその注射された受精卵または胚を成熟雌哺乳動物中で発育させることか らなる請求項２８または２９による方法。

３１、１）実質的に非内在性のポリペプチドが発現されるように哺乳動物の内在 性のポリペプチド発現能力を破壊し、およびヒトに一カゼインの生物活性を有す るＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　２のアミノ酸配列２１〜１８２またはその類似体もし くは変異体を存するポリペプチドか哺乳動物内で発現されるような方法で哺乳動 物の生殖細胞系に請求項１〜１２のいずれかで定義された発現系を挿入し、およ び／または ２）内在性のポリペプチドまたはその一部をコードする遺伝子を請求項１〜１２ のいずれかで定義された発現系で置き換え、それによって該非ヒト哺乳動物が、 実質的に、相当する内在性のポリペプチドを発現することができないようにする ことからなる請求項２８または２９による方法。

３２．１以上の内在性ポリペプチドの発現能力か破壊された請求項３１による方 法。

３３、非ヒト哺乳動物ゲノムあるいは該非ヒト哺乳動物の始祖のゲノムへの染色 体的な導入の結果として、生殖細胞および体細胞か、ヒトに一カゼインの生物活 性を有するＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・２のアミノ酸配列２１〜１８２またはその類似 体もしくは変異体を存するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含有する遺伝 子導入非ヒト哺乳動物。

３４、ＤＮＡ配列か、請求項１−１６のいずれかによるＤＮＡ配列である請求項 ３３による遺伝子導入非ヒト哺乳動物。

３５、ＤＮＡ配列が、哺乳動物の乳汁タンパク質遺伝子中に存在する請求項３４ 記載の遺伝子導入非ヒト哺乳動物。

３６、請求項２８〜３２のいずれかによる方法によって作成された遺伝子導入非 ヒト哺乳動物、および前記哺乳動物の子孫。

３７　マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ラマ（ｌａｍａ）、ラク ダおよびウシ種からなる群から選択される請求項３３〜３６のいずれかによる哺 乳動物。

３８、請求項３３〜３７のいずれかに記載の哺乳動物から乳汁を集収し、および 任意に乳汁からその組換えポリペプチドを回収することからなる、ヒトに一カゼ インの生物活性を有するＳＥＱ　（Ｄ　Ｎ０２のアミノ酸配列２１〜１８２また はその類似体もしくは変異体を存するポリペプチドを得る方法。

３９　ヒト乳汁構成物と異なる乳汁構成物と共に、ヒトに一カゼインの生物活性 を存するＳＥＱ　［Ｄ　Ｎｏ＋　２のアミノ酸配列２１−１８２またはその類似 体もしくは変異体を育するポリペプチドを含有する非ヒト哺乳動物由来の乳汁。

４０、非ヒト哺乳動物に対して内在性である乳汁構成物と共に、ヒトに一カゼイ ンの生物活性を存するＳＥＱ　［Ｄ　Ｎｏ：　２のアミノ酸配列２１〜１８２ま たはその類似体もしくは変異体を存する請求項３９による乳汁。

４１、請求項３３〜３７のいずれかによる遺伝子導入哺乳動物から得１　られる 乳汁。

４２、請求項３９〜４１のいずれかで定義された乳汁、または請求項２７により 製造された乳汁から製造された乳児用調合孔。

４３、ヒトに一カゼインの生物活性を有するＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・２のアミノ酸 配列２１〜＋８２またはその類似体もしくは変異体を有するポリペプチドをコー ドするＤＮＡが非ヒト哺乳動物の乳腺で発現されつる様式で非ヒト哺乳動物のゲ ノム内に請求項１〜１２のいずれかによる表現系を導入し、該遺伝子導入非ヒト 哺乳動物によるポリペプチドの発現を得、該遺伝子導入非ヒト哺乳動物よ　−り 発現されたポリペプチドを収穫しおよび任意に精製し、および該ポリペプチドを 存するヒト乳児用調合乳を調合することからなる、ヒト乳児の栄養的要求を満た すために必須の、他の乳汁タンパク質類、脂質類、炭水化物類、ビタミン類、無 機物類および他の栄養物から選択される少なくとも一つの他の乳児用Ｑ　［Ｄ　 Ｎｏ・２のアミノ酸配列２１〜１８２またはその類似体もしくは変異体を育する ポリペプチドからなるヒト乳児用調合孔を製造する方法。

４４、ヒトに一カゼインの生物活性を有するＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　２中のアミ ノ酸配列２１〜１８２またはその類似体もしくは変異体を有する組換えポリペプ チド。

４５、アミノ酸配列２１〜１８２ＳＥＱ　［ＯＮｏ：　２または前記アミノ酸配 列の類似体もしくは変異体を有し、生成するポリペプチドが、ヒトに一カゼイン の生物活性を有する組換えポリペプチド。

４６、請求項１〜１６のいずれかに記載のＤＮＡ配列によってコートされる組換 えポリペプチド。

４７、　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：２のアミノ酸配列２１〜＋８２とは異なるアミノ 酸配列を有しかつヒトに一カゼインの生物活性を有するポリペプチドが得られる ように、少なくとも一つのアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基で置換されおよび ／または少なくとも一つのアミノ酸残基が欠失または付加された請求項４４〜４ ６のいずれかによるポリペプチド。

４８、少なくとも一つのアミノ酸残基が翻訳後の修飾によって修飾された請求項 ４４〜４７のいずれかによる組換えポリペプチド。

４９、グリコジル化された形態である請求項４４〜４８のいずれかによるポリペ プチド。

５０、請求項２６．２７または３８による方法によって製造された請求項４４〜 ４９のいずれかによるポリペプチド。

５１、請求項４４〜５０のいずれかに定義されたポリペプチドからなる乳児用調 合乳。

５２、栄養補促物としての請求項４４〜５ｏのいずれかによるポリペプチドの使 用。

５３、栄養補促物が乳児用調合乳中に含まれる請求項５２による使用。

フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１４／４７　８ ３１８−４ＨＣ１２Ｎ　１／２１　７２３６−４Ｂ Ｃｌ３Ｆ　２１１０２　Ｃ９２８２−４Ｂ／／（ＣＬ　２　Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：１９） （Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：１９） （Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：９１） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＰＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＳＮ、　ＴＤ。

ＴＧ）、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＺ、ＦＩ。

ＨＵ、Ｊ　Ｐ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＯ，ＮＺ 、ＰＬ、　Ｒ○、　ＲＵ、ＳＤ、ＳＫ、　ＵＡ、　ＵＳＩ （７２）発明者　ヘルネル、オレ スエーデン、ニス−９０２４０ウメア、ジムポルスベーゲン　１４ （７２）発明者　テレネル、ヤシ スエーデン、ニス−４２１５０ヴエストラフレランダ、クラヴエスケルスガータ ン

Claims (53)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒトκ−カゼインの生物活性を有するアミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮｏ：２また はその類似体もしくは変異体を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と該 ＤＮＡ配列の発現を仲介することができる５′−ブランキング配列とからなる発 現系。
2. ２．哺乳動物の乳汁タンパク質遺伝子からの５′ブランキング配列とヒトκ−カ ゼインの生物活性を有するアミノ酸ＳＥＱＩＤＮｏ：２またはその類似体もしく は変異体を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列とからなり、該５′フラ ンキング配列が該ＤＡＮ配列の発現を仲介することができる発現系。
3. ３．ＤＮＡ配列が、少なくとも１つのイントロン配列を含有する請求項１または ２による発現系。
4. ４．単一もしくは複数のイントロン配列が、ＳＥＱＩＤＮｏ：３および／または ＳＥＱＩＤＮｏ：４で表されるイントロン配列から選択される請求項３による発 現系。
5. ５．ＤＮＡ配列が、少なくとも１つの許容ＲＮＡスプライスシグナルを含有する 請求項３または４による発現系。
6. ６．ヒトκ−カゼインの生物活性を有するアミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮｏ：２また はその類似体もしくは変異体を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、 ハイブリッド遺伝子が発現されるときに該ＤＮＡ配列によってコードされるポリ ペプチドが産生されるように、該ハイブリッド遺伝子を保有する非ヒト哺乳動物 の成熟雌の乳腺で発現可能なハイブリッド遺伝子を形成するために、哺乳動物の 乳汁タンパク質をコードする遺伝子の調節要素と結合される請求項１〜５のいず れかによる哺乳動物発現系。
7. ７．乳タンパク質をコードする遺伝子が、カゼイン遺伝子または乳漿の酸性タン パク質（ＷＡＰ）の遺伝子から選択される請求項６による発現系。
8. ８．ポリペプチドの類似体または変異体が、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮｏ：２と 少なくとも８５％の相同性がある請求項６による発現系。
9. ９．ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、ストリンジェントハイブリッド形 成条件下でＤＮＡ配列ＳＥＱＩＤＮｏ：１もしくはその一部とハイブリッドを形 成するＤＮＡ配列である請求項６による発現系。
10. １０．ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、少なくとも一つのイントロン配 列を含有し、かつストリンジェントハイブリッド形成条件下でＤＮＡ配列ＳＥＱ ＩＤＮｏ：１もしくはその一部分とハイブリッドを形成する請求項９による発現 系。
11. １１．単一もしくは複数のイントロン配列が、ＳＥＱＩＤＮｏ：３および／また はＳＥＱＩＤＮｏ：４で表されるイントロン配列から選択される請求項１０によ る発現系。
12. １２．ＳＥＱＩＤＮｏ：２のアミノ酸配列２１〜１８２からなるポリペプチドを コードする請求項１〜１１のいずれかによる発現系。
13. １３．ヒトκ−カゼインの生物活性を有するアミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮｏ：２ま たはその類似体もしくは変異体を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列。
14. １４．実質的にＳＥＱＩＤＮｏ：１に示されるＤＮＡ配列からなる請求項１３に よるＤＮＡ配列。
15. １５．実質的にＳＥＱＩＤＮｏ：３に示されるＤＮＡ配列とＳＥＱＩＤＮｏ：４ に示されるＤＮＡ配列とからなり、さらに任意にＳＥＱＩＤＮｏ：３とＳＥＱＩ ＤＮｏ：４を連結するＤＮＡ配列を有する請求項１３によるＤＮＡ配列。
16. １６．少なくとも一つのヌクレオチドが欠失、置換または修飾されるか、または 少なくとも一つの付加ヌクレオチドが挿入されて、ヒトκ−カゼインの生物活性 を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列になっている点で、請求項１３〜 １５のいずれかに定義されたＤＮＡ配列と異なる修飾ＤＮＡ配列。
17. １７．請求項１〜１６のいずれかに定義されたＤＮＡ配列を保持し、かつ該ＤＮ Ａ配列の発現を仲介することができる複製可能な発現ベクター。
18. １８．ヒトκ−カゼインの生物活性を有するアミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮｏ：２ま たはその類似体もしくは変異体を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を 保持し、かつ該ＤＮＡ配列の発現を仲介することができる複製可能な発現ベクタ ー。
19. １９．ＤＮＡ配列が、ＳＥＱＩＤＮｏ：２のアミノ酸配列２１〜１８２からなる ポリペプチドをコードする請求項１８による複製可能な発現ベクター。
20. ２０．ドイチュザムルングフォンミクロオルガニスメンウンドセルクルトゥーレ ンゲーエムビーハー（ＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍｌｕｎｇｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒ ｇａｎｉｓｍｅｎｕｎｄＺｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎＧｍｂＨ）（ＤＳＭ）のコレ クションに、ブダペスト条約の規定にしたがって、１９９３年１月２０日付けで 寄託され、受託番号ＤＳＭ７４１０、ＤＳＭ７４１１、ＤＳＭ７４１２およびＤ ＳＭ７４１３をうけているｐＳ３３０、ｐＳ３３９、ｐＳ４１５およびｐＳ４２ ５と命名された発現ベクター、および該寄託された発現ベクターのＤＮＡ配列と は異なるが、ヒトκ−カゼインの生物活性を有する同じポリペプチドまたはその 類似体もしくは変異体をコードするＤＮＡ配列を発現する発現ベクターからなる 群がら選択される複製可能な発現ベクター。
21. ２１．発現されるＤＮＡ配列が、少なくとも一つのヌクレオチドが欠失、置換ま たは修飾されているか、または少なくとも一つの付加ヌクレオチドが挿入されて 、κ−カゼインの生物活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列になっ ている点で、寄託されたベクターのＤＮＡ配列と異なるＤＮＡ配列である請求項 ２０による複製可能な発現ベクター。
22. ２２．ドイチュザムルングフォンミクロオルガニスメンウンドセルクルトゥーレ ンゲーエムビーハー（ＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍｌｕｎｇｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒ ｇａｎｉｓｍｅｎｕｎｄＺｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎＧｍｂＨ）（ＤＳＭ）のコレ クションに、ブダペスト条約の規定にしたがって、１９９２年１月２０日付けで 寄託され、受託番号ＤＳＭ６８７８をうけているｐＳ２７０と命名されたプラス ミド、ドイチュザムルングフォンミクロオルガニスメンウンドセルクルトゥーレ ンゲーエムビーハー（ＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍｕｎｇｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒｇ ａｎｉｓｍｅｎｕｎｄＺｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎＧｍｂＨ）（ＤＳＭ）のコレク ションに、ブダペスト条約の規定にしたがって、１９９３年１月２０日付けで寄 託され、受託番号ＤＳＭ７４１４およびＤＳＭ７４１５をうけているｐＳ４５９ およびｐＳ４６０と命名されたプラスミド、およびＳＥＱＩＤＮｏ：１に示され るＤＮＡ配列とは異なるが、ヒトκ−カゼインの生物活性を有するＳＥＱＩＤＮ ｏ：２に示されるポリペプチドまたはその類似体もしくは変異体をコードするか 、またはストリンジェントハイブリッド形成条件下でＤＮＡ配列ＳＥＱＩＤＮｏ ：１もしくはその一部とハイブリッドを形成するＤＮＡ配列を有するプラスミド からなる群から選択されるプラスミド。
23. ２３．請求項１７〜２２のいずれかで定義されたベクターを保有する細胞。
24. ２４．原核細胞、単細胞真核生物もしくは多細胞生物由来の細胞である請求項２ ３による細胞。
25. ２５．多細胞生物、例えば動物由来である請求項２４による細胞。
26. ２６．ポリペプチドをコードするＤＮＡが非ヒト哺乳動物の分泌腺内で発現され るような様式で非ヒト哺乳動物のゲノム中に請求項１〜１２のいずれかに記載の 発現系を導入し、および腺から分泌される分泌物を集収することからなる、ヒト κ−カゼインの生物活性を有するアミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮｏ：２またはその類 似体もしくは変異体を有するポリペプチドを産生する方法。
27. ２７．分泌腺が乳腺であり、分泌物が乳汁である請求項２６に記載の方法。
28. ２８．非ヒト哺乳動物のゲノム中にポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を染色 体的に導入することからなる、ヒトκ−カゼインの生物活性を有するアミノ酸配 列ＳＥＱＩＤＮｏ：２またはその類似体もしくは変異体を有するポリペプチドを 発現することができる遺伝子導入非ヒト哺乳動物を作成する方法。
29. ２９．さらに非ヒト哺乳動物のゲノム中にβ−カゼインをコードするＤＮＡ配列 またはその類似体、変異体もしくはサブ配列を染色体的に導入することからなる 請求項２８による方法。
30. ３０．哺乳動物の受精卵または胚の細胞に請求項１〜１２のいずれかで定義され た発現系、および任意にさらにβ−カゼインをコードするＤＮＡまたはその類似 体、変異体もしくはサブ配列を注射して哺乳動物の生殖細胞系に発現系を導入し 、およびその注射された受精卵または胚を成熟雌哺乳動物中で発育させることか らなる請求項２８または２９による方法。
31. ３１．１）実質的に非内在性のポリペプチドが発現されるように哺乳動物の内在 性のポリペプチド発現能力を破壊し、およびヒトκ−カゼインの生物活性を有す るアミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮｏ：２またはその類似体もしくは変異体を有するポ リペプチドが哺乳動物内で発現されるような方法で哺乳動物の生殖細胞系に請求 項１〜１２のいずれかで定義された発現系を挿入し、および／または ２）内在性のポリペプチドまたはその一部をコードする遺伝子を請求項１〜１２ のいずれかで定義された発現系で置き換え、それによって該非ヒト哺乳動物が、 実質的に、相当する内在性のポリペプチドを発現することができないようにする ことからなる請求項２８または２９による方法。
32. ３２．１以上の内在性ポリペプチドの発現能力が破壊された請求項３１による方 法。
33. ３３．非ヒト哺乳動物ゲノムあるいは該非ヒト哺乳動物の始祖のゲノムヘの染色 体的な導入の結果として、生殖細胞および体細胞が、ヒトκ−カゼインの生物活 性を有するアミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮｏ：２またはその類似体もしくは変異体を 有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含有する遺伝子導入非ヒト哺乳動 物。
34. ３４．ＤＮＡ配列が、請求項１〜１６のいずれかによるＤＮＡ配列である請求項 ３３による遺伝子導入非ヒト哺乳動物。
35. ３５．ＤＮＡ配列が、哺乳動物の乳汁タンパク質遺伝子中に存在する請求項３４ 記載の遺伝子導入非ヒト哺乳動物。
36. ３６．請求項２８〜３２のいずれかによる方法によって作成された遺伝子導入非 ヒト哺乳動物。
37. ３７．マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ラマ（ｌａｍａ）、ラク ダおよびウシ種からなる群から選択される請求項３３〜３６のいずれかによる哺 乳動物。
38. ３８．請求項３３〜３７のいずれかに記載の哺乳動物から乳汁を集収し、および 任意に乳汁からその組換えポリペプチドを回収することからなる、ヒトκ−カゼ インの生物活性を有するアミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮｏ：２またはその類似体もし くは変異体を有するポリペプチドを得る方法。
39. ３９．ヒト乳汁構成物と異なる乳汁構成物と共に、ヒトκ−カゼインの生物活性 を有するアミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮｏ：２またはその類似体もしくは変異体を有 するポリペプチドを含有する非ヒト哺乳動物由来の乳汁。
40. ４０．非ヒト哺乳動物に対して内在性である乳汁構成物と共に、ヒトκ−カゼイ ンの生物活性を有するアミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮｏ：２またはその類似体もしく は変異体を有するポリペプチドを含有する請求項３９による乳汁。
41. ４１．請求項３３〜３７のいずれかによる遺伝子導入哺乳動物から得られる乳汁 。
42. ４２．請求項３９〜４１のいずれかで定義された乳汁、または請求項２７により 製造された乳汁から製造された乳児用調合乳。
43. ４３．ヒトκ−カゼインの生物活性を有するアミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮｏ：２ま たはその類似体もしくは変異体を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが非ヒ ト哺乳動物の乳腺で発現されうる様式で非ヒト哺乳動物のゲノム内に請求項１〜 １２のいずれかによる表現系を導入し、該遺伝子導入非ヒト哺乳動物によるポリ ペプチドの発現を得、該遺伝子導入非ヒト哺乳動物より発現されたポリペプチド を収穫しおよび任意に精製し、および該ポリペプチドを有するヒト乳児用調合乳 を調合することからなる、ヒト乳児の栄養的要求を満たすために必須の、他の乳 汁タンパク質類、脂質類、炭水化物類、ビタミン類、無機物類および他の栄養物 から選択される少なくとも一つの他の乳児用調合乳構成物と共に、ヒトκ−カゼ インの生物活性を有するアミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮｏ：２またはその類似体もし くは変異体を有するポリペプチドからなるヒト乳児用調合乳を製造する方法。
44. ４４．ヒトκ−カゼインの生物活性を有するＳＥＱＩＤＮｏ：２中のアミノ酸配 列２１〜１８２またはその類似体もしくは変異体を有する組換えポリペプチド。
45. ４５．アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮｏ：２または前記アミノ酸配列の類似体もしく は変異体を有し、生成するポリペプチドが、ヒトκ−カゼインの生物活性を有す る組換えポリペプチド。
46. ４６．請求項１〜１６のいずれかに記載のＤＮＡ配列によってコードされる組換 えポリペプチド。
47. ４７．ＳＥＱＩＤＮｏ：２に示されるアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有 しかつヒトκ−カゼインの生物活性を有するポリペプチドが得られるように、少 なくとも一つのアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基で置換されおよび／または少 なくとも一つのアミノ酸残基が欠失または付加された請求項４４〜４６のいずれ かによるポリペプチド。
48. ４８．少なくとも一つのアミノ酸残基が翻訳後の修飾によって修飾された請求項 ４４〜４７のいずれかによる組換えポリペプチド。
49. ４９．グリコシル化された形態である請求項４４〜４８のいずれかによるポリペ プチド。
50. ５０．請求項２６、２７または３８による方法によって製造された請求項４４〜 ４９のいずれかによるポリペプチド。
51. ５１．請求項４４〜５０のいずれかに定義されたポリペプチドからなる乳児用調 合乳。
52. ５２．栄養補促物としての請求項４４〜５０のいずれかによるポリペプチドの使 用。
53. ５３．栄養補促物が乳児用調合乳中に含まれる請求項５２による使用。