JPH07502895A

JPH07502895A - 微生物細胞形質転換体を触媒として用いるグリコール酸のグリオキシル酸への酸化

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Publication number: JPH07502895A
Application number: JP5512540A
Authority: JP
Inventors: アントン，デイビツド・レロイ; デイコージモ，ロバート
Original assignee: ユニバーシテイ・オブ・アイオワ・リサーチ・フアウンデーシヨン
Priority date: 1992-01-06
Filing date: 1993-01-06
Publication date: 1995-03-30
Anticipated expiration: 2016-07-09
Also published as: ATE139796T1; EP0621900B1; NZ246786A; JP3183667B2; CA2127094C; WO1993014214A1; ES2089788T3; AU3434693A; KR940703922A; CA2127094A1; DK0621900T3; DE69303360D1; EP0621900A1; DE69303360T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称微生物細胞形質転換体を触媒として用いるグリコール酸のグリオキシル酸への酸化発明の背景１　発明の分野本発明は、グリコール酸の酵素触媒酸化によるグリオキシル酸の改良された製造方法に関する。より詳細には、本発明は、酵素グリコレートオキシダーゼ（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−酸オキシダーゼ。

ＥＣ１，１，３，１５）および所望によりカタラーゼ（ＥＣ１，１１，１，６）を発現する、遺伝子工学による微生物形質転換体の全細胞の使用に関する。

２、関連技術の説明葉の多い緑色植物および哺乳動物細胞に共通的にみられる酵素であるグリコレートオキシダーゼは、グリコール酸のグリオキシル酸への酸化を触媒し、またそれに伴って過酸化水素が生成する。Ｎ、ＥＴｏｌｂｃｒｔ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｂｃ耐、、　Ｖｏｌ、　１８１．９０５−９１４　（１９４９）はグリコール酸のグリオキシル酸の中間的生成を介す蟻酸およびＣＯ２までの酸化を触媒する、タバコの葉から抽出された酵素を報告した。

ある種の化合物例えばエチレンジアミンを添加すると中間体グリオキシル酸の更なる酸化が制限された。以」二の酸化は典型的には、約３〜４０１％ＩＩ（ミリモル）のグリコール酸濃度を用いて約８のｐｌ＋で行われた。グリコレート酸化の至適ｐＨは８９であると報告されてＬ）る。

／ユウ酸（１００ｍＭ）はグリコレートオキシダーゼの触媒作用を阻害すると報告されている。同様に、Ｋ、Ｅ、ＲｉｃｈａｒｄｓｏｎおよびＮＥ。

Ｔｏｌｂｅｒｔ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｌｌ、、Ｖｏｌ、　２３６．　１２８０−１２８４　（１９６１）はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含む緩衝剤がグリコール酸のグリコレートオキシダーゼ触媒酸化におけるンユウ酸形成を阻害することを示した。Ｃ，０，Ｃｌａｇｅｔｔ、　Ｎ、Ｅ、　ＴｏｌｂｅｒｔおよびＲ，１１，Ｂｕｒｒｉｓ。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ＋＋＋、、　Ｖｏｌ、　１７８．９７７−９８７　（１９４９）は酵素によるグリコレートオキシダーゼ触媒グリコール酸酸化の至適ｐＨが約７．８〜８，６であり、また至適温度が３５〜４０℃であることを報告している。

Ｉ、　ＺｅｌｉｔｃｈおよびＳ、　０ｃｈｏａ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ＋＋＋、、　Ｖｏｌ、２０１．７０７−７１８（１９５３）およびＪ、Ｃ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、Ｖｏｌ、　２３７゜２００１−２００９　（１９６２）は１１，０．をグリオキシル酸と非酵素的反応させるとほうれんそうグリコレートオキシダーゼ触媒グリコール酸酸化において蟻酸とＣ０２が形成されることを報告した。彼等は、■、０２の分解を触媒する酵素であるカタラーゼを添加すると、蟻酸とＣＯ２の形成を抑えることによりグリオキシル酸の収率が大きく向上することを認めた。フラビンモノヌクレオチド（ＦｉｌＮ）の添加も、グリコレ−ｌ−オキシダーゼの安定性を大きく増大させることがわかった。

Ｎ、Ａ、　Ｆｒｉｇｅｒｉｏおよび１１＾、　Ｈａｒｂｕｒｙ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　Ｖｏｌ、　２３１゜１３５〜１５７　（１９５８）は、はうれんそうから単離されたグリコール酸オキシダーゼの調製および性質について報告している。その精製酵素は溶液では極めて不安定であることが判明しており、またこの不安定性は、酵素の活性部位へのフラビンモノヌクレオチドの結合が比較的弱いため、および酵素活性のある酵素のテトラマーおよび／またはオクタマーが酵素活性のないモノマーおよびダイマーに解離しそれらが不可逆的に凝集し沈殿してしまうためとされている。酵素の溶液にフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を添加するとその安定性が大きく増大し、またタンパク質濃度が高いと、あるいはイオン強度が高いと酵素はオクタマーまたはテトラマーとして保持された。

グリコール酸オキシダーゼにより触媒されるグリコール酸の酸化には他に多くの文献が存在する。例えばニー酵素の単離（通常、アッセイ方法も含めて）：１、　Ｚｅｌｉｔｃｈ、　ｌ１ｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、１．＾ｃａｄｅｓ＋ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９５５．　ｐ、５２８−５３２　（はうれんそうおよびタバコの葉より）、麗、ＮｉｓｈＮ１５ｈｉ　ｅｔ　ａｌ、、＾ｒｃｈ、ロｉｏｃｈｅｗ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、、Ｖｏｌ、２２２゜３９７−４０２　（＋９８３）　（かぼちゃ子葉より）、■、＾５ｋｅｒおよびり、　Ｄａｖｉｅｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、＾ｃｔａ、、　Ｖｏｌ、　７６１゜１０３−１０８　（１９８３）　（ラット肝より）、Ｍ、Ｊ、Ｅｓｅｓおよびに、亀　Ｅｒｉｓｍａｎｎ、Ｉｎｔ、Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｓ、、　Ｖｏｌ、１６゜１３７３−１３７８（１９８４）（レムナ・マイナー・Ｌ　（Ｌｅｍｎａ　１ｉｉｎｏｒ　Ｌ）より）。

−酵素の構造：Ｅ、　Ｃｅｄｅｒｌｕｎｄ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｓ、、　Ｖｏｌ、　１７３．５２３−５３０（１９８ｇ）。

Ｙ、　ＬｉｎｄｑｕｉｓｔおよびＣ，Ｂｒａｎｄｅｎ、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　Ｖｏｌ、　２６４゜３６２４−３６２８　（１９８９）。

発明の概要本発明は、酵素グリコレートオキシダーゼ（（Ｓ）−２−ヒドロキソ−酸オキソダーゼ、ＥＣ１，１，３，１５）および所望によりカタラーゼ（ＥＣ１，１１，１，６）を発現する遺伝子工学による微生物形質転換体の全細胞の存在下にグリコール酸（＋１０ｃ１１２ｃ００Ｈ）（２００〜約２５００１１Ｍ）と酸素と水性溶液（ｐＨ７〜１０）中で反応させるグリオキシル酸（０（ＪＩＣＯＯＨ）の製造方法に関する。至適条件下では、グリコール酸の高転換率で極めて高収率のグリオキシル酸が得られ、またその遺伝子工学による微生物形質転換体は回収し再使用することができる。

発明の詳細な説明本発明はグリコレートオキシダーゼおよびカタラーゼを同時発現する微生物形質転換体（例えばアスペルギルス・ニジュランス（＾ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎ１ｄｕｌａｎｓ）、ビヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｓｏｒｐｈａ）および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ））の全細胞をグリコール酸（ヒドロキシ酢酸）からのグリオキシル酸の製造に使用することを記載する。グリコール酸の酸素との酵素触媒反応は多年にわたって知られているが、（９９％を超える）高いグリオキシル酸選択率はこれまで得られたことはな（、はたまたグリコール酸の酸化が０．２０Ｍ〜２．５Ｍ濃度で行われたこともない。すでに１９８９年１０月１６日に出願された「グリコール酸からのグリオキシル酸の製造」と題する、譲受人を共通にする出願、Ｕ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、　（米国出願番号）　０７／４２２．０１１．は酸素、アミン緩衝剤および可溶性酵素であるグリコレートオキシダーゼおよびカタラーゼの存在下におけるグリコール酸からグリオキシル酸への酵素的転換方法を記載している。この方法は（過酸化水素副生物を破壊するための）カタラーゼと生成グリオキシル酸との化学的アダクトを形成（そしてその更なる酸化を制限）できるアミン緩衝剤の両方を用いることの予想外の相乗効果を実証しており、そのような目的に対して、引用により本明細書の記載の一部に含める。カタラーゼまたはアミン緩衝剤を別々に添加したのでは双方が共存する場合にみられる高選択率は得られなかったし、また得られるグリオキシル酸のほぼ定量的な収率はカタラーゼまたはアミン緩衝剤半袖を用いた場合の単純な相加効果から予測される以上のものではなかった。

本発明は、可溶性酵素に代えて全微生物細胞を触媒として用いる点で前記方法の改良として位置（」けられる。

これまでに報告された可溶性酵素の触媒としての使用にはいくつかの課題がある。すなわち、再使用のための触媒回収が容易でない点、触媒安定性が固定化酵素または全細胞微生物触媒の場合に得ることができるものほど良好ではない点、および可溶性酵素が（酸素溶解速度、従って反応速度、を高めるのに必要とされる）酸素を用いた反応混合物のスバージングに対し安定でない点である。今般、はうれんそう由来グリコレートオキシダーゼおよび内生カタラーゼを発現するアスペルギルス・ニジュランス、ビヒア・パストリス、ハンセヌラ・ポリモルファおよび大腸菌のいくつかの形質転換体が、当業者に通有的に知られた遺伝子工学的方法を用いて構築された。

前述の方法にこれらの全細胞触媒を用いることによりいくつかの利点が得られる：すなわち、Ｉ）反応完了時に、全細胞触媒が再使用のために反応混合物から容易に回収されるのに対し、可溶性酵素は多大な困難および活性損失を伴ってのみ回収される点、２）可溶性酵素に対し得られる触媒ターンオーバー数についても、また反応完了時に回収される酵素活性についても全細胞触媒の方が可溶性酵素よりも安定である点、また３）最も重要なこととして、酸素溶解速度および反応速度を高めるために酸素を反応混合物にスパーンングする場合に、全細胞触媒は反応条件に対し安定であるのに対し、同様な反応条件下では可溶性グリコレートオキシダーゼは速かに変性してしまう点。

アスペルギルス・ニジュランス形質転換体は、まずグリコレートオキシダーゼをコードするほうれんそう遺伝子をクローニングし、次いでこの遺伝子を許容し得るレベルの内生カタラーゼをすでに生産するアスペルギルス・ニジュランス株に導入することにより調製した。アスペルギルス・ニジュランスａｌｃＡプロモーターの発現コントロール下にあるほうれんそうグリコレートオキシダーゼをコードするＤＮＡの多重コピー、およびアスペルギルス・ニジュランスａｌｋＲ遺伝子（その産生物はａｌｃＡプロモーターの機能を調節する）の多重コピーを含む遺伝子工学による微生物形質転換体アスペルギルス・ニジュランスＴ１７は、ブダペスト条約の規定に基づいて、１９９２年９月２４日にＮｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｏｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ　（米国、イリノイ州、ペオリア（Ｐｅｏｒｉａ））にＮＲＲＬ　Ｎｏ、２１０００として寄託された。得られた形質転換体は振盪フラスコまたは発酵槽中、各種培地（最少培地または高ＳＹＧ培地）で培養し、また付加的に様々な剤、例えばオレイン酸（ＯＬ）　、ヒドロキシ酢酸（ＩＩ＾）、またはコーンスチーブリ力−（Ｃ３Ｌ）を培地に添加してグリコレートオキシダーゼおよび／またはカタラーゼの発現レベルを高めた。次いで、様々な形質転換体を、（未処理）アスペルギルス・ニジュランス全細胞をカタラーゼおよびグリコレートオキシダーゼ活性についてアッセイし、そして細胞をグリコール酸からグリオキシル酸への酸化触媒として用いて反応を行うことによってスクリーニングした。全細胞は、グリコール酸からグリオキシル酸への酸化触媒として用いる際に、細胞内部での反応混合物の酵素への接近可能性を高めるために前処理されたり、透過性にされたりすることはなかった；反応混合物またはその成分のいずれかにさらされることによるか、あるいは必要とされる時まで全細胞触媒を貯蔵するのに用いられる凍結および解凍により、細胞の透過性化がいくらか生じている可能性はある。

可溶性酵素の欠点の多くはアスペルギルス・ニジュランスの全細胞を触媒として用いることにより除去された。全細胞触媒の回収および再使用は遠心分離により、あるいは触媒を反応混合物から濾取しそしてそれを新たな反応混合物に再循環することにより容易に行われた；このようにしてグリコレートオキシダーゼについて１０６もの高いターンオーバー数が得られる。（可溶性酵素を用いた場合にみられるような）酵素触媒の変性を伴うことなく反応混合物に酸素気泡を通じることができた結果、反応混合物に気泡を通じない場合の反応に比べ少なくとも１０倍の反応速度増加が得られ、またこの速度増加はこの方法のための製造コストを著しく軽減する。

グリコレートオキシダーゼ活性および内生カタラーゼ活性を発現するいくつかの付加的な微生物形質転換体を調製しそして本発明におけるそれらの微生物触媒としての用途を実証した。本発明において用いられる第二の微生物細胞触媒はハンセヌラ・ポリモルファ（メチロトローフ性酵母）の形質転換体である。十分なグリコレートオキシダーゼ活性を有するハンセヌラ・ポリモルファのいくつかの形質転換体を、グリコレートオキシダーゼに対するＤＮＡをフォルメートデヒドロゲナーゼ（ＦＭ口）プロモーターのコントロール下にある発現ベクターに挿入した。ハンセヌラ・ポリモルファをこのベクターで形質転換し、そして高レベルのグリコレートオキシダーゼを生産する株を選別しそしてハンセヌラ・ポリモルファＧＯ＋と指称した。

ハンセヌラ・ポリモルファ細胞触媒は典型的には、ハンセヌラ・ポリモルファ形質転換体の接種物をまず５００ｍ１のＹＰＤ　（Ｄｉｒｃｏ）　、　ｐＨ４，４、中で増殖させることにより調製した。この培養液を次にアミノ酸（１４ｇ）　、硫酸アンモニウム（５ｈ）およびメタ／−ル（１００９）を含まない酵母窒素ベース（Ｙｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａ５ｅ、　ＹＮＢ、　Ｄｉｆｃｏ）１０１を含む発酵槽にｐＨ５，０で接種した。その発酵槽を３７℃、４００ｒｐｍの撹拌速度、５，０の一定ｐＨ１（コントロールされる）４０％溶存酸素および１４ｐｓｉｇの空気で４２．５時間運転した。発酵完了時に１．０ｋｑのグリセロールを添加し、そして細胞を遠心分離により集め、液体窒素で凍結しそして一８０℃で貯蔵した。

本発明において用いられる第三の微生物細胞触媒は、はうれんそう由来グリコレートオキシダーゼ酵素および内生カタラーゼを発現するビヒア・バストリス（メチロトローフ性酵母）の形質転換体である。十分なグリコレートオキシダーゼ活性を有するビヒア・バストリスのいくつかの形質転換体は、はうれんそうグリコレートオキシダーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片をメタノール誘導可蛯なアルコールオキシダーゼ■プロモーターのコントロールを受けるようなビヒア・パストリス発現ベクター（ｐＨＩＬ−０４）に挿入してプラスミドｐＭＰｌを生成させることにより調製した。ピヒア・バストリス株ＧＴＳ１．＋５　（ＮＲＲＬ　Ｙ −１５８５１）をプラスミドｐＭＰｌで形質転換し、そして選別を行って直線化したプラスミドｐＭＰｌを染色体アルコールオキシダーゼＩ座に組み込みそしてアルコールオキシダーゼ遺伝子をグリコレートオキシダーゼ遺伝子で置換した。

次にががる形質転換体プールを発現カセットの組み込まれたコピーが最高数となるよう選別した。ピヒア・バストリス株ＧＳ１１５−ＭＳＰＩＯと指称される高コピー数形質転換体を単離しモしてＮＲＲＬ　（イリノイ州ベオリア）に寄託した（ＮＲＲＬ　Ｙ−２１００１、寄託日１９９２年９月２４日）。

ビヒア・パストリス細胞は典型的には接種物を１％グリセロールを含有する１００ｇ１のＹＮＢ中で増殖することにより調製した。３０℃で４８時間増殖させた後、細胞を、アミノ酸（１３４ｇ）　、グリセロール’　（１００ｇ）およびビオチン（２０１９）を含まない酵母窒素ベース（ＹＮＢ）より成るｌＯｐの培地を含む発酵槽に移した。発酵はｐＨ５，０（ＮＨ＜ＯＨでコントロール）、３０ ℃、２０Ｏｒｐｍの撹拌速度、５　ｓｌｐ＋１の通気、５ｐｓｉｇの空気および５０％飽和度より低くならないように維持された溶存酸素で操作した。グリセロールが涸渇すると、細胞は、グリセロールがメタノール（５０ｇ）で置き換わった以外は同一の培地中で増殖することによりグリコレートオキシダーゼを発現するように誘導される。誘導中のグリコレートオキシダーゼ活性は酵素アッセイによりフォローした。２４時間の誘導の後、細胞をグリセロール（１＆９）で処理した後に細胞を集めた。細胞を集めた後で液体窒素で凍結しそして一８０℃で貯蔵した。

アスペルギルス・ニジュランスと異なり、ハンセヌラ・ポリモルファおよびピヒア・バストリス細胞形質転換体はグリコール酸からグリオキシル酸への酸化触媒として用いる前に透過性化を必要とした。十分なグリコレートオキシダーゼ活性をもつ細胞の調製には様々な既知の透過性化方法が有用であった（Ｆｅｌｉｘ、１１．　Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ、１２０．２１１−２３４．　（１９８２）参照）。典型的には、０１％（ｖ／ｖ）　”ＴＲＩＴＯＮ″Ｘ−１００／２ｈＭポスフェート緩衝液（ｐＨ７、０）中の１０重量％湿細胞の懸濁液を１５分間混合し、次いて液体窒素で凍結し、解凍し、そして２０ｍＭホスフェート／　０．１１１１１　ＦＭＮ緩衝液（ｐＨ７、Ｏ）で洗浄した。もう一つの透過性化方法は、０．１％（Ｗ／ｖ）塩化ベンザルコニウム（Ｓｉｇｍａ）　／２０ｍＭホスフェート緩衝液（ｐＨ７，０）中のＩＯ重量％湿細胞の懸濁液を６０分間混合し、次いでそれら透過性化細胞を２ｈＭホスフェー）　１０．１ｅＭ　ＦＭＮ緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄することにより行った。

本発明において用いられる第四の微生物細胞触媒は、はうれんそう由来グリコレートオキシダーゼ酵素および内生カタラーゼを発現する大腸菌（細菌）の形質転換体である。かかる大腸菌形質転換体は、１ｌａｃｈｅｒｏｕｘ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、Ｖｏｗ、　１１３２．１１−１６　（１９９２）に記載の如く調製した。

反応に用いられる（アスペルギルス・ニジュランス、ピヒア・バストリス、ハンセヌラ・ポリモルファまたは大腸菌全細胞として添加される）グリコレートオキシダーゼは有効濃度で、通常は０．Ｏ１〜約１００ＩＵ／ｍｌ、好ましくは約０，１〜約１０１．０／＋＋／の濃度で存在すべきである。ＩＵ（国際単位）とは１分間あたり１マイクロモルの基質の変換を触媒する酵素量として定義される。

この酵素のアッセイ法は、１、　ＺｅｌｉｔｃｈおよびＳ、　０ｃｈｏａ、Ｊ、Ｂｊｏｌ、Ｃｈｅｗ、、　Ｖｏｌ、２０１．７０７−７１８（１９５３）にみられる。この方法は回収または再循環されたグリコレートオキシダーゼの活性のアッセイにも用いられる。

反応溶液のｐｌｌは７〜ＩＯ１好ましくは８０〜９．５である。酵素活性はｐｌｌに伴って変化するのでｐｌｌは緩衝液によって維持することができる。

反応ｐｉは反応の進行につれてわずかに低下するので、最大酵素活性ｐＨ域の上限近傍、約９．０〜９．５で反応を開始し反応中にｐＨが低下してもよいようにすることがしばしば有用である。１９８９年１０月１６日出願に係るＵ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、　０７／１２２，０１１に既に記載したように、（化学的または酵素的酸化に対しより安定なアミンを形成することにより）グリオキシル酸を錯化できるアミン緩衝液がカタラーゼと共に生成物選択率を最大にするために用いられる。

エチレンジアミン、あるいはさほどには好ましくないが、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以下Ｔｌ？ＩＳと記す）、ピペラジンまたはグリシルグリシンはグリオキシル酸の収率を向上させた。これらのアミンは１．０〜３，０、好ましくは１．０〜１．３３のアミン／グリコール酸（当初量）モル比で用いられる。この範囲内で、厳密な値を所望のｐＨが得られるように調節することができる。強塩基性アミンを高いアミン／グリコール酸比で用いる場合には、例えば塩酸または硫酸などの酸を添加するなどしてｐｌ＋を調整する必要があることがある。さほど塩基性の強くないアミン例えばＴＲｌ５を用いる場合には、所望のｐＨを維持するために塩基を添加する必要があることがある。

（アスペルギルス・ニジュランス、ビヒア・バストリス、）１ンセヌラ・ポリモルファまたは大腸菌全細胞として添加される）アクセス可能なカタラーゼの濃度は５０〜１００．０ＯＯＩＵ／　ｍｅ　（反応混合物）、好ましくは３５０〜１４．０００１１１／　ｍｌとすべきである。グリコレートオキシダーゼとカタラーゼの両酵素が同じ微生物細胞（この場合にはアスペルギルス・ニジュランス、ピヒア・バストリス、）１ンセヌラ・ポリモルファまたは大腸菌の形質転換体）内に共存しているのが好ましいが、付加的な微生物カタラーゼ源（あくまで例示であって限定するためのものではないが、サツカロマイセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）など）を添加して存在するカタラーゼを補うこともできる。更に、カタラーゼおよびグリコレートオキシダーゼ濃度は（３々ＩＵ単位で測定された）カタラーゼ　グリコレートオキシダーゼ比が少な（とも約２５０・１となるように前記範囲内で調節すべきである。フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）は任意添加成分であり、０．０〜２．　（ｌｄ、好ましくは０．０１〜０．２ｄの濃度で用いられる。

反応速度は、少なくとも部分的には、酸素が水性媒質に溶解し得る速度によってコントロールされる。酸素は空気中酸素として反応に添加することもできるが、比較的純粋な形の酸素を用いまた高められた圧力を用いるのが好ましい。酸素圧の上限は知られていないが、５０気圧までの酸素圧を用いることができ、また１５気圧の上限が好ましい。反応混合物に酸素をスバージング（バブリング）することは高い酸素溶解（従って反応）速度を維持する上で必要である。

反応混合物への酸素のスバージングは、０．０５〜５容（大気圧で測定された酸素）／容（反応混合物）７分（容／容・分）、好ましくは０．２〜２容／容・分の速度で行われる。更に、便利な撹拌形態、例えば撹拌（スターリング）が有用である。

反応温度は反応速度および酵素の安定性に影響するので重要な変数である。０℃ 〜４０℃の反応温度を用いることができるが好ましい反応温度範囲は５℃〜１５ ℃である。好ましい温度範囲での操作は反応終時における回収酵素活性を最大にする。

反応が完了しそして微生物細胞形質転換体触媒を濾過または遠心分離により除去した後、アミン緩衝剤は最も好都合には、イオン交換樹脂の使用により除去される。適切な酸性陽イオン交換樹脂には“＾ＭＢＥＲＬＩＴＥ″ＣＧ１２０または “＾１ｉＢＥＲＬＩＴＥ″ｌＲ１２０（Ｒｏｈｍ　＆　１ｌａａｓ　Ｃｏ、　）および“ＤＯＷＥＸ”　５０　（Ｄｏｔ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　）が包含される。そのアミンは次いで回収した１＆、前記樹脂を強塩基で処理することにより再循環する。

生成物であるグリオキシル酸はバニリンおよびエチルバニリンの調製に有用であると共に、イオン交換樹脂に、また医薬産業における酸触媒として用いられる（Ｕｌｌｍａｎｎｓ）。それは通常５０％（重量％）水性溶液として販売されている。本出願におけるグリオキシル酸への言及は、特にｐＨが約２．３よりも大きい溶液中にグリオキシル酸が存在する場合には、グリオキシレート陰イオンをも意味し得ることを理解すべきである。

振盪フラスコまたは発酵槽で培養される微生物細胞形質転換体のだめの培地微生物細胞形質転換体の培養に用いられる最少培地（ＷＩＮ）は、フラクトース（１％、１．０９／　ｌ　）、トレオニン（１０％Ｍ、　１１．９９／　ｅ　）、酒石酸アンモニウム（６，０９／　１　）　、微量元素Ｃ１，Ｍｌ／　ｌ）および塩溶液（１０１７！／　ｅ　）で構成し、またこの最少培地のｐＨを水酸化ナトリウムで６５に調節した。

微生物細胞形質転換体の培養に用いられるり、ソチ（ＳＹＧ）培地は、酵母エキス（０５％、５．０９／　ｌ　）　、硝酸アンモニウム（１００１１１１１，８，０９／ｅ）、リン酸カリウム（−塩基性、３３ａ＋Ｍ、４．５ｇ／　Ｒ）　、硫酸マグネシウム七水和物（２＋１１１．０．５９／　１　）　、微量元素（１，０ｗｌ／　ｌ　）で横［戊し、またそのｐｌ＋を５．５に調節し、オートクレーブ処理した後に、グルコースを２％（Ｗ／りとなるように添加した。

全細胞に対するグリコレートオキシダーゼおよびカタラーゼア・ソセヱ微生物細胞形質転換体のグリコレートオキシダーゼ活性は、（過料水分を除去するために濾紙上にプロットされた）約５〜１０ｍ９の湿細胞を、磁気撹拌棒と、２，６−シクロロフエノールーインドフエノール（ＤＣＩＰ）については０．１２ｍ１ｌまたＴＲ１Ｓｌｌ衝液（ｐＨ８，３）については８０ｆｆ１Ｍの２．０ｍｌの溶液とを含んだ３ｍ１石英キュベツト中に正確に秤量添加することによりアッセイした。そのキュベツトをゴム栓でキャップし、そしてその溶液を窒素で５分間バブリングすることにより脱酸素した。次いでそのキュベツトにシリンジで４０ａｌの１．０Ｍグリコール酸／１．０Ｍ　ＴＲｌ５（ｐＨ８，３）を添加し、そしてその混合物を撹拌しながら、６０５ｒｖ　（ε＝２２．０００）における吸光度の経時変化を測定した。

カタラーゼ活性は、約２〜５りの湿細胞を、磁気撹拌棒と２．０ｍｊ’の蒸留水とを含んだ３ｍ１石英キュベツト中に正確に秤量添加し、次に５Ｑｄホスフエート緩衝液（ｐＨ７，０）中の５０１１Ｍ過酸化水素を１．０璽ｌ添加しそして２４０ｎＩ１１（ε＝３９．４）における吸光度の経時変化を測定することによりアッセイした。様々な培質中で培養されたアスペルギルス・ニジュランス湿細胞のグリコレートオキシダーゼおよびカタラーゼ活性は、グリコレートオキシダーゼについては０．５〜２．ＯＤＣＩＰ■Ｕ／ｇ、そしてカタラーゼについては５００〜７０００　ＩＵ／　ｑの範囲であった。様々な培地で培養された（透過性化されていない）大腸菌全細胞のグリコレートオキシダーゼおよびカタラーゼ活性は、グリコレートオキシダーゼについては０．８〜４．０　ＤＣＩＰ　ＩＵ／　９湿細胞、そして内生カタラーゼについては１０００〜２０００　ＩＵ／　ｑ湿細胞の範囲であった。様々な培地で培養したハンセヌラ・ポリモルファまたはビヒア・パストリス湿細胞（透過性化されたもの）のグリコレートオキシダーゼおよびカタラーゼ活性はグリコレートオキシダーゼについては２０〜１２０ＤＣＩＰ　ＩＵ／９湿細胞、また内生カタラーゼについては３０、０００〜２００．０ＯＯＩ［Ｊ／　ｑの範囲であった。

グリコール酸、グリオキシル酸、シュウ酸および蟻酸の［１ＰＬＣ分析分析試料はまず１ｌｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ　ＩＣフィルターユニ、ット（１０，０００分子量カットオフ）を通して濾過した。グリコール酸、グリオキシル酸、シュウ酸および蟻酸の分析は、ＨｇＳＯ４（０，０ＩＮ）および１−ヒドロキシエタン−１，１−ジホスホン酸（０，１■Ｍ）の水性溶液を１．０８１７分で溶媒として用いて、Ｂｉｏ−Ｒａｄ＾ｍ１ｎｅｘ　ＩＩＰＸ−８７Ｔｌカラム（３００Ｘ７．８＋＋＋＋）での高性能液体クロマトグラフィー（ＩＴＰＬＣ）により４０℃で行った。Ｕｖ分析は２１Ｏｎ閣で行った。シュウ酸、グリオキシル酸、グリコール酸、蟻酸、およびプロピオン酸（内部標準）またはイソ酪酸（内部標準）の保持時間はそれぞれ４．２９．６．０９．７．７７．８６７９．１１．旧および１３．０５分であった。

実施例１２９ｗ１圧力反応ビン（Ｌａｂ　Ｇｌａｓｓ　＃ＬＧ−３９２１−１００）に、グリコール酸（０，７５０Ｍ）、エチレンジアミン（０，８６６Ｍ）、プロピオン酸（０，０７５Ｍ）およびフラビンモノヌクレオチド（０，０１ｍＭ）を含む溶液を１．　Ｏ＋＋１入れた（この溶液のｐＨ（約９．２）は調節しなかった）。その溶液を５℃に冷却し、次いで２００＠９の凍結アスペルギルス・ニジュランスＴ１７細胞をそのビンに添加した。このビンにクラウンキャ・ツブおよび隔膜（セプタム）（Ｌａｂ　Ｇｌａｓｓ　＃ＬＧ−３９２２−１００）を嵌装し、次いで、２２ゲージ針を用いて純酸素で７Ｑｐｓｉｇへの加圧、換気を５℃で５回行った後、酸素で７０ｐｓｉｇ　（４８３ｋＰａ）に加圧しそして針を除去した。前記キャップは、チューブを冷水に短時間漬けそして気泡を探すことにより漏れを点検した後、ふいて乾かし、そして回転振盪機の頂部に取り付けられた試験管ラックにまっすぐに立てて置いた。ビンの内容物を５℃で６時間、３００ｒｐ−で振盪後、ビンを換気し、そしてキャップを除き、ビンの内容物をｌ、　５＋＋／微小遠沈管に移した。細胞を短時間回転沈殿させ、そして１０ｈ／アリコートの上演をＨＰＬＣで分析した。次に細胞ペレットを回収グリコレートオキシダーゼおよびカタラーゼ活性についてアッセイした。酵素活性の回収率は全細胞の当初酵素活性に対するものとし、また１００％を超える回収率は反応の過程での細胞の透過性化に帰因している。

５Ｔ１７ＳＹＧ　６　４５　１３４　１１９ＳＴ１７ＳＹＧ１０Ｌ　６　６５　３０９　３１６ＳＴ１７ＳＹＧ１０Ｌ２　６　５１　８４７　２５４ＳＴ１７ＳＹＧ１０Ｌ）Ｉ＾　６　２４　２１９　１８０ＳＴ１７ＳＹＣ３Ｌ１０Ｌ　６　５３　１０２　６０ＦＴＩ７ＳＹＧ１０Ｌ　６　４７　’　１６４　７９ＳＴ１７１１１Ｎ　６　２５　６６　３４６ＳＴ１８ＭＩＮ　６　１４　１３　３９０ＳＴ１７ＳＹＧ１０Ｌ　２３　１００　０　５９７ＳＴ１７ＳＹＣ３Ｌ１０Ｌ　２３　１００　０　６４ＦＴ１７ＳＹＧ１０Ｌ　２３　１００　１４４　１５７０Ｌ＝オレイン酸実施例２３００＋＋１ＥＺＥ−３ｅａｌ撹拌式オートクレーブ反応器（Ａｕｔｏｃｌａｖｅ　Ｅｎｇｉ−ｎｅｅｒｓ）に、グリコール酸（０，７５Ｍ）　、ｘチレンジアミン（０，８６Ｍ、ｐＨ９，２）　、プロピオン酸（０，０７５Ｍ、　ＩＩＰＬｃ内部標準）およびフラビンモノヌクレオチド（０，０］ｍＭ）を含む溶液を７５＠ｌ仕込み、そしてその溶液を１５℃に冷却した。次にその反応器に１４９の凍結（−８０℃）アスペルギルス・ニジュランス５ＴＩ７ＳＹＧ１０Ｌ　（２５，２ＩＵグリコレートオキシダーゼおよび２０．４００Ｉｔｌカタラーゼ）を添加し、そしてそれら細胞を１５℃で解凍させた。得られた混合物を、該混合物を通して酸素を２０Ｍ１／分でバブリングしながら、４００ｒｐｍ、　１５℃で７０ｐｓｉｇ（４８３ｋＰａ）の酸素下に撹拌した。反応は、１００μｌアリコートの反応混合物を規則的時間間隔をおいて採取し、そのアリコートを３０ｈ１の０．ＩＮ硫酸と混合して反応をクエンチし、そのアリコートを濾過しそしてＩＩＰＬｃにより分析することによりモニターした。７時間後、グリオキシル酸、ンユウ酸、および蟻酸の収率は、それぞれ７９％、０％および０％であり、グリコール酸回収率は２．７％であった。グリコレートオキシダーゼおよびカタラーゼの最終活性は当初値の５５％および８０％３００ｇ＋／　ＥＺＥ−３ｅａｌ撹拌式オートクレーブ反応器（Ａｕｔｏｃｌａｖｅ　Ｅｎｇｉ−ｎｅｅｒｓ）に、グリコール酸（０，７５Ｍ）　、−ｒ−チレンジアミン（０，８６Ｍ、ｐＨ９，２）　、プロピオン酸（０，０７５Ｍ、　ＩＴＰＬｃ内部標準）およびフラビンモノヌクレオチド（０，０１ｍＭ）を含む溶液を１００ｄ仕込み、そしてその溶液を５℃に冷却した。次にその反応器に３２９の凍結（−８０℃）アスペルギルス・ニジユランスＦＴＩ７ＳＹＧ１０Ｌ　（２８，２１０グリコレートオキシダーゼおよび１５７．０００１１１カタラーゼ）を添加し、そしてそれら細胞を１５ ℃で解凍させた。得られた混合物を、該混合物を通して酸素を３（ｈｌ／分でバブリングしながら、４００ｒｐｍ、５℃で７Ｑｐｓｉｇ（４８３ｋＰａ）の酸素下に撹拌した。反応は、１００ｕｌアリコートの反応混合物を規則的時間間隔をおいて採取し、そのアリコートを３００１１１の０．ＩＮ硫酸と混合して反応をクエンチし、そのアリコートを濾過しそして＋１ＰＬｃにより分析することによりモニターした。２１時間後、グリオキシル酸、ソユウ酸、および蟻酸の収率は、それぞれ８８，２％、０％および０％であり、グリコール酸回収率は１０．０％であった。グリコレートオキシダーゼおよびカタラーゼの最終活性は当初値の０％および７５％であった。

実施例４３０（ｍ！　ＥＺＥ−３ｃａｌ撹拌式オートクレーブ反応器（Ａｕｔｏｃｌａｖｅ　Ｅｎｇｉ−ｎｅｅｒｓ）に、グリコール酸（０，７５Ｍ）　、エチレンジアミン（０，８６Ｍ、ｐＨ９，０）　、プロピオン酸（０，０７５Ｍ、　１（ＰＬＣ内部標準）およびフラビンモノヌクレオチド（０，ＯｌｍＭ）を含む溶液を１００＋＋１仕込み、そしてその溶液を５℃に冷却した。次にその反応器に２６９の凍結（−８０℃）アスペルギルス・ニジュランスＦＴ１７ＳＹＧ１０Ｌ　（２９，９１０グリコレートオキシダーゼおよび１７７、０００１０カタラーゼ）を添加し、そしてそれら細胞を５℃で解凍させた。得られた混合物を、該混合物を通して酸素を５０＠ｌ／分でバブリングしながら、４００ｒｐｍ、５℃で７０ｐｓｉｇ（４８３ｋＰａ）の酸素下に撹拌した。反応は、１００＋＋／アリコートの反応混合物を規則的時間間隔をおいて採取し、そのアリコートを３００ｔｒｌの０．ＩＮ硫酸と混合して反応をクエンチし、そのアリコートを濾過しモしてＦＩＰＬＣにより分析することによりモニターした。２３時間後、グリオキシル酸、ンユウ酸、および蟻酸の収率は、それぞれ９５％、０％および０％であり、グリコール酸は完全に転化した。グリコレートオキシダーゼおよびカタラーゼの最終活性は当初値の１２％および７６％で３００＊１ＥＺＥ−３ｅａｌ撹拌式オートクレーブ反応器（Ａｕｔｏｃｌａｖｅ　Ｅｎｇｉ−ｎｅｅｒｓ）に、グリコール酸（０，７５Ｍ）　、エチレンジアミン（０，８６Ｍ。

ｐｌ＋９．０）　、プロピオン酸（０，０７５Ｍ、　ＩＩＰＬｃ内部標準）およびフラビンモノヌクレオチド（０，旧■１１）を含む溶液を１００ｍ１仕込み、そしてその溶液を５℃に冷却した。次にその反応器に２６９の凍結（−８０℃）アスペルギルス・ニジュランスＦＴ１７ＳＹＧ１０Ｌ　（２４ＩＬＩグリコレートオキシダーゼおよび１９２．０ＯＯＩＵカタラーゼ）を添加し、そしてそれら細胞を５℃で解凍させた。得られた混合物を、該混合物を通して酸素を５０８１／分でバブリングしながら、４００ｒｐｍ、５℃で１２０ｐｓｉｇの酸素下に撹拌した。反応は、１００ａｌアリコートの反応混合物を規則的時間間隔をおいて採取し、そのアリコートを３００ｊｌの０．ＩＮ硫酸と混合して反応をクエンチし、そのアリコートを濾過しモしてＦＩＰＬＣにより分析することによりモニターした。１１．５時間後、グリオキシル酸、シュウ酸、および蟻酸の収率は、それぞれ９８％、０％および０％であり、グリコール酸は完全に転化した。グリコレートオキシダーゼおよびカタラーゼの最終活性は当初値の１００％および６２％であった。

反応が完了すると、反応混合物を５℃で遠心分離しモして上清を傾瀉した。得られたアスペルギルス・ニジュランス細胞のペレットを５℃で１００ｖ１の新たな反応混合物に再懸濁し、そして前述と同じ条件下に反応を繰り返した。１６時間後、グリオキシル酸、シュウ酸および蟻酸の収率はそれぞれ４７％、０％および０％であり、グリコール酸の回収率は５４％であった。１６時間目のグリコレートオキシダーゼおよびカタラーゼの回収活性は当初値の９１％および１００％であった。

３オンス（ｏｚ）　Ｆｆ、５ｃｈｅｒ−Ｐｏｒｔｅｒガラス製エーロゾル反応容器に磁気撹拌棒と、グリコール酸（０，７５０Ｍ＞、エチレンジアミン（０，８６３Ｍ）、イソ酪酸（口、１００Ｍ、　ＨＰＬＣ内部標準）およびフラビンモノヌクレオチド（０，０１ｄ）を含むｌＱ＋ｗｌのｐ）＋（１，０の水溶液とを入れ、そしてその溶液を５℃に冷却した。次にその容器に０．１％“ＴＲＩＴＯＮ ″Ｘ−１００／　１凍結−解凍で処理することにより透過性化された０、　７５　ｑのピヒア・パストリス形質転換体株Ｇ５１１．５−１１ＳＰＩＯ（３０１１１グリコレートオキシダーゼおよび３８．１００ＩＩＩカタラーゼ）を添加し、そしてその反応容器を密封し、そして反応混合物を５℃に冷却した。撹拌しながら７０ｐｓｉｇへの加圧および大気圧への換気を５回行うことにより容器に酸素を通し、次にその容器を７０ｐｓｉｇ酸素まで加圧しそしてその混合物を５℃で撹拌した。規則的時間間隔をおいて（容器内圧力の損失を伴うことなく）サンプル採取口を通してシリンジによりアリコート（０，２０１ｔ１）を取り出しＨＰＬＣによる分析にかけて反応の進行をモニターした。

６時間後、グリオキシレート、フォルメートおよびオキザレートの１１ＰＬＣ収率はそれぞれ９８．２％、０％および０％であり、またグリコレートは全く残っていなかった。残留する透過性化細胞グリコレートオキシダーゼおよびカタラーゼ活性はそれぞれ当初値の８５％および１１７％であった。

微生物細胞触媒を前述の反応混合物から遠心分離により回収した。

それ以上処理を行うことなく細胞ペレットをＩＯ＋＋１の新たな反応混合物と混合し、そして反応を繰り返した。この触媒再循環手順を１０回連続バッチ反応に対して行った。反応時間、カタラーゼおよびグリコレートオキシダーゼ活性の（透過性化細胞の当初活性に対する）回収率、およびグリオキシル酸、蟻酸、ンユウ酸およびグリコール酸の収率を下記表に列挙する；１　６．０　１１７　８５　９８．２　０　０　０２　４．０　７８　７８　９９．６　０　０　０３　４０　６８　６８　９７．１　０　１．３　０４　４．０　？２　７３　９９．５　０　０．５　０５　３．０　７７　７４　９９．２　０　０．５　０６　４．５　７１　７１　９９．０　０　０．５　０７　５．５　７０　７４　９８．０　０　２．０　０８　５．０　？２　６１　９９．５　０　０．５　０９　５．５　６０　４８　９８．６　０　１．４　０１０　５．５　５６　４２　９９．１　０　０．２　０実施例７Ｄｉｓｐｅｒｓｉｍａｘ　ｒｍｐｅｌｌｅｒ　（＾ｕｔｏｃｌａｖｅ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ）を輛えｔこ３００＋＋／ＥＺＥ−３ｅａｌ撹拌式オートクレーブ反応器に、グリコール酸（０，７５０Ｍ）、エチレンジアミン（０，８６３Ｍ）　、イソ酪酸（０，１００Ｍ、　ＩＩＰＬｃ内部標準）およびフラビンモノヌクレオチド（０，０１ｍＭ）を含むｐｎ！１．２５の溶液を１００ｍ／住込み、そしてその溶液を５℃に冷却した。次にその反応器に０１％塩化ベンザルコニウム（Ｓｉｇｍａ）処理により透過性化された５、０９のビヒア・パストリス形質転換体株ＧＳ］１５−Ｍ５Ｉ’ＩＯ（４２３１ＵグＩノコレートオキシダーゼおよび８６９．０ＯＯＴＵカタラーゼ）を添加し、そしてその反応器を酸素でパージした。次にその混合物を１０１００Ｏｒｐこれによりタービンインペラーの作用を介して混合物を通して酸素気泡が生じた）、および５℃で１２０ｐｓｉｇの酸素下に撹拌した。反応は、０、４１ｈｌアリコートの反応混合物を規則的時間間隔をおいて採取し、そのアリコートをＭｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ− ＭＣＩｏ、０００　ＮＭＷＬ　ＦｉｌｔｅｒＵｎｉｔを用いて濾過し、そしてその濾液をＩＩＰＬＣにより分析することによりモニターした。１．０時間後、グリオキシル酸、シュウ酸、および蟻酸の収率はそれぞれ９８．７％、１．３％および０％であり、グリコール酸は全く残留していなかった。透過性化細胞グリコレートオキシダーゼおよびカタラーゼの回収活性はそれぞれ当初値の８７％および８４％であった。

それ以上処理を行うことなく細胞ペレットを１００Ｉｌ／の新たな反応混合物と混合し、そして反応を繰り返した。この触媒再循環手順を２０回連続バッチ反応に対して行った。反応時間、カタラーゼおよびグリコレートオキシダーゼ活性の（透過性化細胞の当初活性に対する）回収率、およびグリオキシル酸、蟻酸、シュウ酸およびグリコール酸の収率を下記表に列挙する：２　１．０　８ｇ　１０４　９８．７　０　１．３　０３　１．０　８５　１０７　９８．８　０　１．２　０４　１．０　７９　＋２６　９８．７　０　１．３　０５　１．０　６９　１０４　９８．８　０　１．２　０６　１．０　？９　１０９　９８．９　０　１．１　０７　１．０　７１　１１０　９９．３　０　０．７　０８　１．０　６４　１＋３　９９．２　０　０．８　０９　１．０　６１　１０６　９９．４　０　０．６　０１０　１．０　６１　ｌｏｔ　９９．１　０　０．９　０１１　１．０　？２　１０４　９９．５　０　０．５　０１２　１．０　６８　９９　９９．４　０　０．６　０１３　１．５　７０　１０１　９９．３　０　０．７　０１４　１．５　５９　９６　９９．６　０　０．４　０１５　１．５　５８　８６　９９．６　Ｄ　０６４０１６　１．７５　５８　８３　９９．６　０　０．４　０１７　２．０　５６　７７　９７．２　０　２．８　０＋８　２．０　３７　９１　９９．７　０　０．３　０＋９　２．５　５０　７３　９９．７　０　０．３　０２０　３．５　４６　７２　９９．９　０　０．１　０実施例８Ｄｉｓｐｅｒｓｉｍａｘ　Ｔｍｐｅｌｌｅｒ　（＾ｕｔｏｃｌａｖｅ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ）を備えた３００ｍ／ＥＺＦ、−３ｅａｌ撹拌式オートクレーブ反応器に、グリコール酸（０，７５０Ｍ）、エチレンジアミン（０，８６３Ｍ）　、イソ酪酸（０，１００Ｍ５ＨＰＬＣ内部標準）およびフラビンモノヌクレオチド（０，０１ｍ１１）を含むｐＨ９，２５の溶液を１００ｖｔ’仕込み、そしてその溶液を５℃に冷却した。次にその反応器に０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００／６　凍結−解凍処理により透過性化された２、Ｏｇのピヒア・パストリス形實転換体株ＧＳ１１５−ＭＳＰＩＯ（２７６１１１グリコレートオキシダーゼおよび４９４．０ＯＯＩＵカタラーゼ）を添加し、そしてその反応器を酸素でパージした。次にその混合物を１１００Ｏｒｐ　（これによりタービンインペラーの作用を介して混合物を通して酸素気泡が生じた）、および５℃で１２０ｐｓｉｇの酸素下に撹拌した。反応は、０、４０ｍ１アリコートの反応混合物を規則的時間間隔をおいて採取し、そのアリコートをＭｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ１０，０００ＮＭＷＬ　Ｆｉｌｔｅｒｈｉｔを用いて濾過し、そしてその濾液をｎＰＬｃにより分析することによりモニターした。０．７５時間後、グリオキシル酸、シュウ酸、および蟻酸の収率はそれぞれ９９．１％、０．３％および０％であり、０．６％のグリコール酸が残留していた。透過性化細胞グリコレートオキシダーゼおよびカタラーゼの回収活性はそれぞれ当初値の１０４％および１０５％であった。

それ以上処理を行うことな（細胞ベレットを１００ｍ１！の新たな反応混合物と混合し、そして反応を繰り返した。１．０時間後、グリオキシル酸、シュウ酸および蟻酸の収率はそれぞれ９９．７％、０．３％および０％であり、グリコール酸は全く残留していなかった。透過性化細胞グリコレートオキシダーゼおよびカタラーゼの回収活性はそれぞれ当初値の１旧％および８５％であった。この触媒再循環手順を５回連続バッチ反応に対して行った。反応時間、カタラーゼおよびグリコレートオキシダーゼ活性の（透過性化細胞の当初活性に対する）回収率、およびグリオキシル酸、蟻酸、シュウ酸およびグリコール酸の収率を下記表に列挙する：１　０．７５　１０５　＋０４　９９．１　０　０．３　０．６２　１．０　８５　ｉｏｔ　９９．７　０　０゜３０３　１．５　８２　９７　９９．６　０　０．４　０４　１．５　６７　９６　９９．８　０　０．２　０５　２．０　９２　９３　９９．７　０　０．３　０実施例９Ｄｉｓｐｅｒｓｉｍａｘ　Ｉｍｐｅｌｌｅｒ　（＾ｕｔｏｃｌａｖｅ　Ｅｎｇｆｎｅｅｒｓ）を備えた３００１ＩＥＺＥ−３ｅａ　ｌ撹拌式オートクレーブ反応器に、グリコール酸（１，５００Ｍ）、エチレンジアミン（１，５７５Ｍ）　、イソ酪酸（０，３００Ｍ、　ＩＩＰＬｃ内部標準）およびフラビンモノヌクレオチド（０，０１ｍＭ）を含むｐＨ９，２５の溶液をｌｏｏｍｌ仕込み、そしてその溶液を５℃に冷却した。次にその反応器にＯ１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００／　１　凍結−解凍処理により透過性化された２、０ｇのビヒア・バスｉ・リス形質転換体株Ｇ５１１５−）ＩｓＰＩＯ（ｌ］４ＩＵグリコレートオキシダーゼおよび１４８．０ＯＯＩＵカタラーゼ）を添加し、そしてその反応器を酸素でパージした。次にその混合物を１０００ｒｐ■（これによりタービンインペラーの作用を介して混合物を通して酸素気泡が生じた）、および５℃で１２０ｐｓｉｇの酸素下に撹拌した。反応は、０、４（ｈ（！アリコートの反応混合物を規則的時間間隔をおいて採取し、ぞのアリコートをＭｊｌｌｉｐｏｒｅ　ＩＪｌｔｒａｆｒｅｅ−１１Ｃ１０，０００ＮＭＷＬ　ＦｉｌｔｅｒＵｎｉｔを用いて濾過し、そしてその濾液をＩＩＩ”ＬＣにより分析することによりモニターした。４５時間後、グリオキシル酸、シュウ酸、および蟻酸の収率はそれぞれ９８０％、０．４％および０％であり、グリコール酸は全く残留していなかった。透過性化細胞グリコレートオキシダーゼおよびカタラーゼの最終活性はそれぞれ当初値の１３６％および１１３％であった。

実施例１０３オンス（ｏｚ）　Ｆｉｓｃｈｅｒ−Ｐｏｒｔｅｒガラス製エーロゾル反応容器に磁気撹拌棒と、グリコール酸（０，７５０Ｍ）、エチレンジアミン（０，８６３Ｍ）、イソ酪酸（０，１００Ｍ、　ＩＩＰＬｃ内部標準）およびフラビンモノヌクレオチド（０，０１ｍ１ｌ）を含む１０ｍ／のｐＨ９，０の水溶液とを入れ、そしてその溶液を５℃に冷却した。次にその容器に０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ −１００／　１　凍結−解凍で処理することにより透過性化された０、　４７９のハンセヌラ・ポリモルファ形質転換体株ＧＯＩ　（１０，ＯＩＵグリコレートオキシダーゼおよび２２．１００ＩＵカタラーゼ）を添加し、そしてその反応容器を密封し、そして反応混合物を５℃に冷却した。撹拌しながら７０ｐｓｉｇへの加圧および大気圧への換気を５回行うことにより容器に酸素を通し、次にその容器を７０ｐｓｉｇ酸素まで加圧しそしてその混合物を５℃で撹拌した。規則的時間間隔をおいて（容器内圧力の損失を伴うことな（）サンプル採取口を通してシリンジによりアリコート（０，２０ｓｔ’）を取り出しＩＩＰＬＣによる分析にかけて反応の進行をモニターした。１６時間後、グリオキシレート、フォルメートおよびオキザレートの＋ＩＰＬＣ収率はそれぞれ９７．１％、２．９％および０％であり、またグリコレートは全く残っていなかった。残留する透過性化細胞グリコレートオキソダーゼおよびカタラーゼ活性はそれぞれ当初値の１０７％および２３１％であった。

実施例１１３０（ｈｅ　ＥＺＥ−５ｅａｌ撹拌式オートクレーブ反応器（＾ｕｔｏｃｌａｖｅ　Ｅｎｇｉ−ｎｅｃｒｓ）に、グリコール酸（０，７５０Ｍ）、エチレンジアミン（０，８６３Ｍ）、イソ酪酸（０，１００Ｍ、　ＨＰＬＣ内部標準）およびフラビンモノヌクレオチド（０，０１−Ｍ）を含むｐｒ１９．３の溶液を１．ＯＯｓ＋１仕込み、そしてその溶液を５℃に冷却した。次にその反応器に０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００／　１　凍結−解凍処理により透過性化された１１．９９のハンセヌラ・ポリモルファ形質転換体ＧＯＩ　（１００ＩＵり’Ｊ　コレ −トオキシダーゼおよび９９８．０ＯＯＩＵカタラーゼ）を添加し、そしてその反応器を酸素でパージした。次にその混合物を５００ｒｐ■および５℃で１２０ｐｓｉｇの酸素下に撹拌し、そして反応混合物の表面下に位置したスパーン管を用いて酸素をその混合物を通して１００Ｎ７’／分でバブリングした。反応は、０．４０ｍ１アリコートの反応混合物を規則的時間間隔をおいて採取し、そのアリコートをｌ１ｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣＩｏ、０００　ＮＩＩＷＬ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｕｎｉｔを用いて濾過し、そしてその濾液をＩＩＰＬｃにより分析することによりモニターした。２．２５時間後、グリオキシル酸、シュウ酸、および蟻酸の収率はそれぞれ１００％、０％および０％であり、グリコール酸は全く残留していなかった。透過性化細胞グリコレートオキシダーゼおよびカタラーゼの回収活性はそれぞれ当初値の１５８％および８２％であった。

実施例１２実施例６の反応を、０．！％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００／　１　凍結−解凍で処理することにより透過性化された１５０ｇのハンセヌラ・ポリモルファ形質転換体Ｇｏｔ　（＋０９ＩＵグリコレートオキシダーゼおよび５３０．０ＯＯＩＵカタラーゼ）を用いて繰り返した。その混合物を５０Ｏｒｐｍおよび５℃で＋２０ｐｓｉｇの酸素下に撹拌し、そして反応混合物の表面下に位置するスパーン管を用いてその混合物を通して５０＋＋１／分で酸素をバブリングした。３．７５時間後、グリオキシル酸、ンユウ酸、および蟻酸の収率はそれぞれ１００％、０％および０％であり、グリコール酸は全く残留していなかった。透過性化細胞グリコレートオキシダーゼおよびカタラーゼの回収活性はそれぞれ当初値の８５％および１６６％で実施例６の反応を、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００／　１　凍結−解凍で処理することにより透過性化された１５．０９のハンセヌラ・ポリモルファ形質転換体ＧＯＩ　（５１１Ｕグリコレートオキシダーゼおよび７３０．０ＯＯＩＵカタラーゼ）を用いて繰り返した。その混合物を１２５０ｒｐ諺（これによりｐｉｓｐｅｒｓｉ■ａＸタービンインペラーの作用を介して混合物を通して酸素気泡が生じた）、５℃で１２０ｐｓｉｇの酸素下に撹拌した。４．０時間後、グリオキシル酸、シュウ酸、および蟻酸の収率はそれぞれ９７．５％、０％および０％であり、０．６％のグリコール酸が残留していた。

透過性化細胞グリコレートオキシダーゼおよびカタラーゼの回収活性はそれぞれ当初値の１３２％および１２９％であった。

実施例１４Ｄｉｓｐｅｒｓｉｍａｘ　Ｉｍｐｅｌｌｅｒ　（＾ｕｔｏｃｌａｖｅ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ）を備えた３００ｔ／ＥＺＥ−３ｅａｌ撹拌式オートクレーブ反応器に、グリコール酸（０，７５０Ｍ）、エチレンジアミン（０，８６３Ｍ）　、イソ酪酸（０，１００Ｍ、　ＨＰＬＣ内部Ｆｌ準）およびフラビンモノヌクレオチド（０，０１ｍ１ｌ）を含むｐｔ＋９．３の溶液を１００＋＋／仕込み、そしてその溶液を５℃に冷却した。次にその反応器に０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００／　１　凍結−解凍処理により透過性化されたＩ５゜Ｏｇのハンセヌラ・ポリモルファ形質転換体ＧＯＩ　（２６２１Ｕグリコレートオキシダーゼおよび１．１３５Ｘ　１０’ｌｌｌカタラーゼ）を添加し、そしてその反応器を酸素でパージした。次にその混合物を１０００ｒｐ園（これによりタービンインペラーの作用を介して混合物を通して酸素気泡が生じた）、および５℃で２５０ｐｓｉｇの酸素下に撹拌した。反応は、０、４０＋＋（！アリコートの反応混合物を規則的時間間隔をおいて採取し、そのアリコートをｌ１ｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣＩｏ、０００　Ｎｌ１ｆＬ　ＦｉｌｔｅｒＵｎｉｔを用いて濾過し、そしてその濾液をＩＩＰＬＣにより分析することによりモニターした。１．０時間後、グリオキシル酸、シュウ酸、および蟻酸の収率はそれぞれ９６．９％、０．３％および０％であり、グリコール酸は全く残留していなかった。透過性化細胞グリコレートオキシダーゼおよびカタラーゼの回収活性はそれぞれ当初値の９８％および１２４％であった。

それ以上処理を行うことなく細胞ペレットをｌｏＯ＋＋１の新たな反応混合物と混合し、そして反応を繰り返した。この触媒再循環手順を８回連続バッチ反応に対して行った。反応時間、カタラーゼおよびグリコレートオキソダーゼ活性の（透過性化細胞の当初活性に対する）回収率、およびグリオキシル酸、蟻酸、シュウ酸およびグリコール酸の収率を下記表に列挙する。

１　１．０　１２４　９８　９６．９　０　０．３　０２　１．５　１４５　８４　９９．６　０　０．４　０３　２．０　１６２　７７　９７．４　０　０．３　０４　２．０　１１？　５７　９４．６　０　１．０　０５　２．５　１２８　４４　９７．７　０　０．７　０６　３．０　１３３　４０　９６．６　０　０．１　０７　５．０　１１＋　２３　９９．１　０　０．２　０８１６．５　１１．６　１９　９５．２　０　０．３　０寒衆圓井実施例９の反応を繰り返したが、ただしＦＭＮは反応混合物に添加しなかった。

触媒は、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００／　１　凍結−解凍処理により透過性化された５、０９のハンセヌラ・ポリモルファ形質転換体Ｇｏｔ　（８８０ＩＵグリコレートオキシダーゼおよび４５３．０ＯＯＩＵカタラーゼ）であった。

触媒再循環手順を、ＦＭＮを添加しない２０回連続パンチ反応に対して行った。

反応時間、カタラーゼおよびグリコレートオキシダーゼ活性の（透過性化細胞の当初活性に対する）回収率、およびグリオキシル酸、蟻酸、シュウ酸、およびグリコール酸の収率を下記表に列挙する・１　１．０　＋００　１００　９６．９　０．１　１．１　１．２２　１．０　８８　＋０９　９８．４　０．１　１．２　１，４３　１．０　１０２　１１０　９８．２　０．１　１．０　０．９４　１．０　ＩＱ３　１０７　９８．０　０．１　１．０　０．９５　１．０　８６　９０　９７．８　Ｑ、２　１．１　１．１６　１．０　８５　９５　９８．４　０．１　０．９　１．１７　１０　８９　１１６　９７．９　０．１　０．９　１．１８　１．３　８９　１１６　９９．１　０．１　１．１　１．０９　１．０　ｇ７　１０３　９８．０　０．１　１．０　１．０１０　１．０　１０６　１１６　９８．３　０．１　０．８　０．８１１　１．０　ｇ５　１０４　９７．９　０．１　０．８　０．９１２　１．５　９９　＋０１　９６．６　０．１　０．８　１．０＋３　１．５　９８　１０５　９８．１　０．１　０．７　１．０１４　１．０　７８　８５　９８．５　０．１　０．６　１．８１５　１．０　８８　８２　９８．３　０．２　０．５　１．１１６　１．０　９０　８２　９９．６　０．１　０．５　０．８１７　１．０　５９　５６　９８．８　０　０．５　１．０１８　１．０　４８　６０　９７．７　０．６　０．４　１．５１９　１．０　５４　６３　９８．６　０．１　０．６　１．７２０　１．５　８６　６１　９８．０　０．１　０．７　１．３実施例１６３０Ｃｈｌ　ＥＺＥ−５ｅａｌ撹拌式オートクレーブ反応器（Ａｕｔｏｃｌａｖｅ　Ｅｎｇｉ−ｎｅｅｒｓ）に、グリコール酸（０，７５０Ｍ）、エチレンジアミン（０，８６３Ｍ　”）、イソ酪！（０，１００Ｍ、　ＩＩＰＬｃ内部標準）およびフラビンモノヌクレオチド（０，ＤＩｍＭ）を含むｐｌ＋９．２の溶液を１００謂ｌ仕込み、そしてその溶液を５℃に冷却した。次にその反応器に３０９の大腸菌形質転換体ｄ０１（７２Ｉυグリコレートオキシダーゼおよび２９．６００１１１カタラーゼ）を添加し、その混合物を、１１０００ｒｐ　（これによりタービンインペラーの作用を介して混合物を通して酸素気泡が生じた）、５℃ で１２０ｐｓｉｇの酸素下に撹拌した。反応は、０．４０ｍ１アリコートの反応混合物を規則的時間間隔をおいて採取し、そのアリコートをｌ１ｌｌｉｐｏｒｅ　Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−１１ｃ１０．０００　ＮＩＷＬ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｕｎｉｔを用いて濾過しそしてＩＩＰＬｃにより濾液を分析することによりモニターした。２３時間後、グリオキシル酸、シュウ酸、および蟻酸の収率は、それぞれ７４．４％、１．１％および５．６％であり、６．３％のグリコール酸が残留していた。微生物グリコレートオキシダーゼおよびカタラーゼの回収活性はそれぞれ当初値の３０％および１９９％であった。

以上、本発明をある程度の具体性をもって説明し例示してきたが、以下の請求の範囲はそのように限定されるべきでなく、請求項の各要素およびその等価物の記載に準じた範囲が与えられるべきであることを理解すべきである。

国際調査報告　。ｒＴ／ｌｌｅ　６１Ｍ、、、、ｎＩＰ−一、ｌ、ｌ−り愉　ＰＣＴ／ＵＳ　９３１０００７７フロントページの続き（５１）　Ｉｎｌ　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号（Ｃ１２Ｐ　７／４０Ｃ１２Ｒ１ニア８）（ＣＩ　２　Ｐ　７／４０Ｃ１２Ｒ１：１９）（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、　ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ，ＳＮ、　ＴＤ。

ＴＧ）、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、ＦＩ、　ＨＵ。

Ｊ　Ｐ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　Ｎｏ、　ＮＺ、ＰＬ、　ＲＯ，ＲＵ、　ＳＤ、　ＵＡ、　ＵＳＩ

Claims

【特許請求の範囲】

１．遺伝子工学の結果として酵素グリコレートオキシダーゼである（Ｓ）−２− ヒドロキシ−酸オキシダーゼを発現する有効量の全徴生物細胞の存在下に水性溶液中でグリコール酸を酸素と接触させ、グリコレートオキシダーゼの有効濃度範囲０．０１〜約１００ＩＵ／ｍｌをグリコール酸をグリオキシル酸に接触的に転換するのに十分な時間達成し、次いでグリオキシル酸を回収することより成るグリオキシル酸の製造方法。
２．前記全徴生物細胞が酵素カタラーゼを同時発現しカタラーゼの有効濃度範囲５０〜１００，０００ＩＵ／ｍｌを達成する請求項１記載の方法。
３．前記グリコール酸と酸素との接触を、グリオキシル酸とのアダクトを形成し得るアミンの存在下に約７〜１０のｐＨで行い、その際アミン／グリコール酸当初モル比を１．０〜３．０としそして前記グリコール酸を当初に約２００ｍＭ〜２５００ｍＭの濃度で存在させる請求項２記載の方法。
４．グリオキシル酸生産選択率が少なくとも９９％である請求項２記載の方法。
５．グリコール酸オキシダーゼ濃度が０．１〜１０ＩＵ／ｍｌである請求項４記載の方法。
６．カタラーゼ濃度が３５０〜１４，０００ＩＵ／ｍｌである請求項５記載の方法。
７．反応を０°〜４０℃で行う請求項６記載の方法。
８．反応を大気圧〜５０気圧の酸素圧で行う請求項７記載の方法。
９．温度が５°〜１５℃である請求項８記載の方法。
１０．反応を１〜１５気圧の圧力で行う請求項９記載の方法。
１１．アミンがエチレンジアミンである請求項３記載の方法。
１２．アミンがトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンである請求項３記載の方法。
１３．アミンがピペラジンである請求項３記載の方法。
１４．アミンがグリシルグリシンである請求項３記載の方法。
１５．全徴生物細胞がアスペルギルス・ニジュランスの遺伝子工学による形質転換体である請求項１記載の方法。
１６．全徴生物細胞がピヒア・バストリスの遺伝子工学による形質転換体である請求項１記載の方法。
１７．全徴生物細胞がハンセヌラ・ポリモルファの遺伝子工学による形質転換体である請求項１記載の方法。
１８．全徴生物細胞が大腸菌の遺伝子工学による形質転換体である請求項１記載の方法。