JPH07502514A - 腫瘍及び肉腫の処置方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 腫瘍及び肉腫の処置方法 本発明は、一般に白血病阻害因子及びそれを含む医薬組成物の、哺乳動物の未分 化腫瘍及び肉腫の処置での用途に関する。本発明は、特にユーイング肉腫、横絞 筋肉腫及び結合組織、」、膀胱、腎臓、肝臓、肺、耳下腺又は牌の池の肉腫の処 置に向けられる。

白血病阻害因子（以下、ｒＬＩＦＪと称する）は精製され（１，２）、その分化 を誘発し、Ｍ１マウス骨髄白血病細胞系を抑制する能力（国際特許出願番号ＰＣ Ｔ／ＡＵ８８１０００９３参照）の基にクローン化され（３）、種々の作用を有 することが判った。それは骨組織からカルシウムを放出しく５）、正常胎児幹細 胞での自然分化を阻止する因子であり（６，７）、ＤＡＩ細胞増殖刺激分子であ り（４）、肝細胞を刺激して急性期蛋白を生成しく８．９）、モしてリポ蛋白リ パーゼインヒビターである（１０）。

本発明は、骨の全悪性腫瘍の約７％の原因となる、子供及び青年の第二の最も普 通の悪性腫瘍、ユーイング肉腫に対するＬＩＦの効果の研究から一部生じた。

これらの腫瘍の主な局在は、長骨の骨幹端及び腎孟てあり、四肢、肋骨及びを柱 又は全ての他の骨が影響を及ぼされるが、それらは又、肺に転移する。

肉眼的に、腫瘍はそれらの切口表面に出血のフォーカスを伴うセリ−状の塊であ る。肉眼的に、それらはひも状の組織隔壁により小グループ又は群に分けられた 、畜集して固まった未分化の小球細胞のノートから成り立っている。

最近の処置により、小さな局在腫瘍を有する書者は約５０％の生存機会を有する が、大きな又は転移腫瘍を有するものは、わずかな予後しか有しない（１２）。

新しい研究は、ユーイングの肉腫細胞が神経細胞への分化を受ける能力を有する ことを示し、この腫瘍の先祖細胞が神経系統から始まることを示唆した（１３） 。

これらの腫瘍の細胞遺伝学的研究により、大部分が転位に（１１：２２）関係す ることが明らかになった（１４）。現在、この転位の分子基本は依然判っておら ず、転位に近く位置する志願者腫瘍遺伝子の数が広く研究されたが、（Ｃ−５ｉ ｓ。

ｃ−ｅｔｓ、プロトオンコンーンを含む）ユーイング肉腫に含まれるものは見出 せなかった。さらに、今日までごくわずかなユーイング肉腫細胞系が報告された だけである（１５．１６）。

本発明に至る研究で、肉腫細胞系の増殖への種々の成長因子の影響を研究した。

本発明によれば、驚べべきことに、ＬＩＦが未分化腫瘍及び肉腫の処置で、抗腫 ｇＡ削としての可能性を示す、ａｍの大きさの有意な減少を生じることを発見し た。

従って、本発明の一局面は、未分化腫瘍及び／又は肉腫を保持している哺乳動物 の処置方法を意図し、その方法は該哺乳動物に有効量のＬＩＦ及び／又はその活 性断片又は誘導体を、未分化腫瘍及び／又は肉腫の大きさを消滅し又は減少する に十分な時間及び条件下、投与することを含む。

本発明の他の局面は、−又はそれ以上の他のサイトカイン、その誘導体及び／又 は−又はそね以上の化学療法剤の同時又は連続的投与、及び／又は放射線療法に よる同時又は連続的処置をさらに含む。「同時又は連続的」とは、ＬＩＦが他の サイトカイン又は化学療法剤ど又は放射線療法と共に投与され、又はその際、Ｌ ＩＦ投与が先になされるか又は非ＬＩＦ処置後になされることを意味する。「連 続的」治療がなされる場合、ＬＩＦ投与と非Ｌ　Ｉ　Ｆ処置の間の時間差は、処 置されている腫瘍又は肉腫、処置されている哺乳動物及び全ての処置に依存して 、分、時、日、週又は月でありうる。

本発明をユーイング肉腫細胞に対するインビトロ及びインビボでのＬＩＦの効果 により例証する。しかしながら、これは本発明が全哺乳動物、例えばヒト、家畜 動物及び仲間動物での、そして特にヒトでのＩｊＦのインビボ効果に、並びに全 ての未分化の腫瘍及び肉腫に及ぶという理解でなされる。

好ましくは、哺乳動物Ｌ　Ｉ　Ｆはヒト、ネズミ又は家畜起源、仲間動物、実験 室試験動物又はつながれている野生動物のものである。より好ましくは、それは ヒト又はネズミ起源のものてあり、最も好ましくは、もしＬＩＦがここに記載さ れた望ましい活性を有するならば、それはヒト起源のものである。この点につい ては、用いられるＬＩＦが処置される哺乳動物と「同種」でありうるとはそれが 、ＬＩＦが処置されるべき哺乳動物の種と同じ起源を有する（例えばヒトの処置 に対するヒトＬＩＦ又はマウスの処置に対するネズミＬＩＦ）ことを意味し、又 は処置されるべき哺乳動物と「異種」でありうるとは、ＬＩＦの種起源と哺乳動 物の種が異なる（例えば、マウスの処置に対するヒトＬＩＦ又はヒトの処置に対 するネズミＬＩＦ）ことを意味する。

活性成分は、又、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及び／又はその 混合物中並びに油中に調製した分散液で投与しうる。貯蔵及び使用の通常の条件 下、これらの調製品は保存剤を含み、微生物の生育を防止する。

注射可能な用途に適した医薬形態は無菌水溶液（水溶性）又は分散液及び無菌の 注射しうる溶液又は分散液の即席調製用の無菌粉末を含む。全ての場合に、形態 は無菌でなければならず、又、容易な注射可能性が存在する程度に流動性でなけ ればならない。それは製造及び貯蔵の条件下、安定てなければならず、又、微生 物、例えば細菌及びカヒの汚染作用に対し保護されなければならない。担体は、 例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコー ル及び液体ポリエチレングリコール等）を含む溶媒又は分散液媒体、その適当な 混合物及び植物油であることができる。適当な流動性は、例えば被覆剤、例えば レシチンの使用により、分散液の場合、要求される粒子の大きさの維持により、 そして界面活性剤（ｓｕｐｅｒｆａｃｔａｎｔｓ）の使用により維持てきる。微 生物の作用の防止は、種々の抗細菌及び抗力ヒ剤、例えばパラベン、クロロブタ ノール、フェノール、ソルビン酸、チルメロサール等によりもたらすことができ る。多くの場合、等張剤、例えば糖類又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい であろう。注射しつる組成物の遅延吸収は、組成物での遅延吸収剤、例えばアル ミニウム七ノステアリン酸塩及びゼラチンの使用によりもたらすことができる。

無菌の注射できる溶液は、適当な溶媒中、必要量の活性化合物を要求されるよう な上で挙げた種々の他の成分と混合し、次いて滅菌濾過することにより調製する 。一般に、分散液は種々の無菌活性成分（複数もあり）を、基本的な分散媒体及 び上で列挙したものからの必要な他の成分を含む無菌担体に混合することにより 調製する。無菌の注射しつる溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製 方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、予め滅菌濾過した溶液から活性成分 プラス全ての付加的な望ましい成分の粉末を生じる。

活性成分が上述したように適当に保護されると、組成物は例えば不活性希釈剤と 共に、又は同化性食用担体と共に経口投与しうるが、或はハード又はソフトセル ゼラチンカプセルに包含しうるが、或は常食の食物と直接混合しうる。経口治療 投与には、活性化合物は賦形剤と混合し、摂取しつる錠剤、バッカル錠、トロー チ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウェファ−等の形で用いつる 。そのような組成物及び調製品は少なくとも１重量％の活性化合物を含有すべき である。もちろん、組成物及び調製品のパーセントは変更しうるし、好都合には ユニットの約５ないし約８０重量％の間でありうる。医薬組成物中の活性化合物 （複数もあり）の量は、適当な投薬量が得られるであろうようなものである。

本発明の好ましい組成物及び調製品が製造され、それにより経口投与量単位形は 約０．５ｆｆｉｇと２０ｍｇの間の活性化合物を含む。

錠剤、トローチ、ピル、カプセル等も以下を含みうる：結合剤、例えばグラガカ ントガム、アカシア、コーンスターチ又はゼラチン、賦形剤、例えばリン酸ジカ ルシウム、崩壊剤、例えばコーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸等、潤 滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム及び甘味剤、例えばシュークロース、ラ クトース又はサッカリンを加えうるし、又は芳香剤、例えばペパーミント、冬緑 油又はサクシ芳香。

投与量単位形がカプセルである場合、それは上記の型の材料に加えて、液体担体 を念みうる。種々の他の材料が被覆剤として、又はさもなければ投与量単位の物 理形態を修飾するために含まれうる。例えば、錠剤、ピル又はカプセルは、セラ ｙ９．砂糖又は両者でコーチングしうる。ノロツブ又はエリキシル剤は、活性化 合物、甘味剤として／ニークロース、防腐剤としてメチル及びプロピルパラベン 、色素および芳香剤、例えばサクシ又はオレンジフレーバーを含みうる。もちろ ん、いずれの投与量単位形を製造するのに用いるいずれの材料も、製薬上純粋で あり、適用した量で実質的に無毒であるべきである。さらに、活性化合物は特効 性調製品及び処方に加えうる。

本明細書で用いられる限り、「製薬上許容しうる担体及び／又は希釈剤」は如何 なる、そして全ての溶媒、分散媒体、水溶液、コーチング剤、抗細菌及び抗カビ 剤、等張及び吸収遅延剤等を含む。そのような媒体及び試薬を製薬上活性な物質 に用いることは当分野でよく知られている。慣用の媒体および試薬が活性成分と 適合しない場合を除き、医薬組成物での用途自体を意図する。補助的活性成分も 組成分に混合しうる。

さらに本発明は、ＬＩＦ又はその活性断片、変異体又は誘導体をそれだけで、或 は−又はそれ以上の他のサイトカイン及び／又は化学治療剤と共に、腫瘍又は肉 腫、例えばユーイング肉腫、横絞筋肉腫及び結合組織、骨、膀胱、腎臓、肝臓、 肺、耳下腺又は牌の他の肉腫を持っている帝者の処置のための医薬の製造に使用 することに関する。

家畜動物は、ウノ、ブタ、ウマ及びヤギを含む。仲間動物はネコ及びイヌを含む 。実験室試験動物は、マウス、ウサギ、モルモット、ハムスターおよびニワトリ のような家禽を含む。つながれている野生動物は、エミュー、カンガル−及び野 鳥を含む。

適用するＬＩＦは、好ましくは国際特許出願番号ＰＣＴ／ＡＵ８８１０００９３ に記載されるような組換え形である。好ましくはＬＩＦはＰＣＴ／ＡＵ８８１０ ００９３の−又はそれ以上の図面に示されるアミノ酸配列を含むがそれと実質的 に同じである。その最も好ましい形では、ＬＩＦはＰＣＴ／ＡＵ８８１０００９ ３の図面１５．２６又は２９に示されるアミノ酸配列を有するか、或いは少なく とも７４０％、より好ましくは少な（とも５０％、さらにより好ましくは少なく とも６０％、もっとより好ましくは少なくとも７０−８０％、その上にもっとよ り好ましくは少なくとも９０−９５％、Ｐ　ＣＴ／、へＵ３８１０００９３の図 面１５．２６又は２９に示されるアミノ酸配列の少なくとも一つの部分と類似性 又は同一性を有する。ＬＩＦは、自体発生配列への単−又は多重アミノ酸挿入、 削除及び／又は付加をも含み、又、ＬＩＦの活性部位を有する部分に誘導化又は 断片化しうる。かかる全ての誘導化又は断片化されたＬＩＦ分子は、本発明に含 まれ、且つかかる全ての分子がインビトロで、実験室試験動物インヒポで又は処 置される哺乳動物で未分化腫瘍及び／又は肉腫の大きさを死滅し又は減する効果 を有するという条件で、表現ｒＬＩ　ＦＪに含まれる。

投与は、全ての適当な経路、例えば静脈内、鼻腔内、皮下、腸腔内、筋肉内、皮 肉、注入、座薬、インブラントおよび徐放カプセルを含む経口でありうる。しか しながらＩｊＦは短い血清半減期を有するので、注射調整品は血清崩壊を減少さ せるよう修飾すべきてあろうし及び／又は投与の経路を変更する必要があろう。

投与は又、処置すべき哺乳動物に導入されるウィルスベクターでのＬＩＦ遺伝子 の発現を含む遺伝子療法でありうる。別法として、ｉＦ遺伝子は細菌中に発現で き、細菌は次いで宿主の正常フロラに組み込まれる。

本発明により、ＬＩＦは、その効果が投与量依存であるあることを示す未処理対 照に比べてユーイング肉腫細胞の培養でのコロニー生育の数を有意に減少するこ とを見出された。ＬＩＦにより誘導されたコロニー減少の大きさは、インターロ イキン１．３．４及び６、Ｍ−Ｃ３Ｆ、Ｇ−Ｃ３ＦＳＧＭ−Ｃ８Ｆ、ＳＣＦ。

ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、ＥＧＦ、酸性及び塩基性ＦＧＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ−１ 、ＩＧＦ−１１、ＰＤＧＦ並びにインターフェロンγを含む試験した他の生長因 子により誘導されたものより大であり、そしてさらにユーイング肉腫細胞が多数 のＬＩＦレセプターを含むことを示した。これらの結果は、未分化の腫瘍及び肉 腫を処置するについてのＬＩＦの潜在的治療用途を示す。

ＬＩＦは未分画マウス骨髄細胞又は精製先祖細胞の慣用半流動培養においてコロ ニー刺激活性を有しないように思われるので、又、ユーイング肉腫細胞はＬＩＦ レセプターを発現するので、ユーイング肉腫細胞のコロニー形成についてのしＩ Ｆの効果は恐らく幾つかの他の因子と組合せて直接効果を示す。さらに本明細書 に記載されたＬＩＦの効果は、インヒポ正常造血細胞へのＬＩＦの明らかな不活 性と対照的である。

本発明を作用のモードのいずれか一つの仮説に限定することは望まないが、ＬＩ Ｆが腫瘍及び肉腫細胞を最初に誘導するのに作用しており、末端分化の通路に第 一段階として急やかに分裂することが可能である。これがＬＩＦの存在で浮遊培 養での場合であると、ＤＮＡ合成での最初の増加又は損傷クロノゲニシティがあ りうる。作用のモードに関係なく、インビボ及びインビトロ半流動培養でのしＩ Ｆの効果は、未分化腫瘍及び肉腫の大きさを死滅し、又は減少することである。

ＬＩＦの有効量は、哺乳動物及び処置すべき条件に依存するであろう。例えば、 約０．１ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１０００μｇ／ｋｇ体重／日にわたる量が、 腫瘍及び肉腫の大きさを死滅し又は減少するのに有用であると予期される。より 好ましくは、有効量はｌｎｇ／ｋｇ体重／日ないし１００μｇ／ｋｇ体重／日で ある。さらにより好ましくは、有効量は１０ｎｇ／ｋｇ体重／日ないし１０　ｐ ｇ／ｋｇ体重／日である。このような有効量は現実の投与プロトコールを反映し うるか、又は交互投与プロトコールの平均を反映しうる。プロトコールは、時間 、週又は月当りの或いは化学療法、放射線療法及び／又は外科手術と共同してＬ ＩＦを投与するのを変化しうる。

本発明の方法は、さらにＬＩＦを単独で或いは他のサイトカイン及び／又は化学 療法剤及び／又は放射線療法プロトコール及び／又は外科手術と組合せて投与す ることを意図する。そのようなサイトカインは、インターロイキン−１、ＴＮＦ −α及び／又はインターフェロンγを含むがこれらに限定されない。本発明で意 図される化学療法剤は、アクチノマインン、エトポサイド、アトリアマイノン、 イホスファマイド、ダウノルビシン、ビンクリスチン、サイクロホスファミド及 び／又はダクトマイノンを含むがこれらに限定されない。他のサイトカインの量 はＬＩＦの有効量と類似であろう。化学療法剤の有効量は試薬に依存して変るで あろう。例えばビンクリスチンは０．５−２ｍｇ／ｍ２て与えることができる。

サイクロホスファミドは一般に、例えば３０分にわたり１００ｍ１／ｍ２Ｎ食塩 水中、約６００　３０００ｎｇ／ｍ２で与えられる。アトリアマイノンは、５％ 冒／Ｖデキストロース中で一日に又は６時間注入で１．　Ｏ−６０ｍｇ／ｍ２て 都合よ（与えられる。アクチノマインノは、−日に２００−１２００＃ｇ／ｍ２ で与えることができる。放射線療法を用いる場合、放射線投与量は腫瘍又は肉腫 及び処置すべき哺乳動物に依存して週当り１−１０で１０−４０インクリメンツ で約２０２０−８Ｏでありうる。

上の例の全てにおいて、本発明は又、ＬＩＦの誘導体及び他のサイトカイン及び ／又は化学療法剤の誘導体の用途に及ぶ。「誘導体」とは、その誘導体が未分化 腫瘍の大きさを死滅及び／又は減少する能力を有する隔り、ＬＩＦ又は他のサイ トカイン又は化学療法剤の組換え体、化学的又は他の合成形、及び／又は全ての 変更、例えばＬＩＦ又は他のサイトカインの分子のアミノ酸配列成分への、或い は炭水化物又は他の会合分子部分への付加、置換及び／又は削除を意味する。

従って、本明細書においてｒＬＩＦＪ又はサイトカイン又は化学療法剤の表示は 、その誘導体の表示を含む。ＬＩＦの最も好ましい形はヒト組換えＬＩＦである 。

さらに本発明は、ＬＩＦ及び／又はその誘導体を単独で或いは−又はそれ以上の 池のサイトカイン及び／又はそれらの誘導体及び／又は化学療法剤及び−又はそ れ以上の製薬上許容しうる担体及び／又は希釈剤と組合せて含む医薬組成物に及 ぶ。そのような医薬組成物は未分化腫瘍又は肉腫の処置に有用である。

組換えＬＩＦ又はその変異体又は断片又は誘導体を単独で或いは−又はそれ以上 の他のサイトカイン及び／又は化学療法剤又はそれらの誘導体と共に含む医薬組 成物の活性成分は、個々の場合に依存する量で投与される場合、腫瘍又は肉腫を 有する患者を処置するのにすぐれた活性を発揮することを意図する。投与量は、 時間、日、週、月又は他の適当な時間間隔に分けて投与しうる。活性化合物は、 上記したような慣用手段で投与しうる。投与経路によって、活性成分は該活性成 分を不活性にしつる酵素、酸及び自然条件の作用からこれらを守るために材料で 被覆することが要求されつる。例えば、活性成分は、消化管でペプチド結合を切 断しうる酵素により、胃で酸加水分解により破壊されうる。非経口投与以外の投 与により組成物を投与するために、酵素はその不活性を防止する材料により被覆 し、又はそれと共に投与する。例えば活性成分はアジュバント中で投与し、酵素 阻害剤と共に又はリポソームとして投与しうる。アジュバントは最も広い意味で 用いられ、全ての免疫促進化合物、例えばインターフェロンを含む。本明細書で 意図するアジュバントは、レゾルシノール、非イオン界面活性剤、ポリエチレン オレイルエーテル及びｎ−ヘキサデンルポリエチレンエーテルを含む。便宜的に はアジュバントはフロイント完全又は不完全アジュバントである。酵素阻害剤は 膵臓トリプンン阻害剤、ノイソプロビルフルオロホスファート（Ｄ　Ｅ　Ｐ）及 びトランロールを含む。リポソームは水中油中水型エマルジョン及び慣用リポソ ームを含む。

本発明に従って記載された方法は、とりわけ未分化腫瘍又はユーイング肉腫、横 絞筋肉腫を含むがこれに限らない未分化肉腫、及び結合組織、骨、膀胱、肝、肺 、耳下腺又は牌の他の肉腫の処置に有用であろう。

本発明をさらに、以下の非限定図面及び実施例を引用することにより記載する。

図面において、 図１は、未りローン化ユーイング肉腫細胞系Ａ４へのＬＩＦ及び未処置コントロ ールの投与量反応効果を示すグラフ表現である。

図２は、クローン化ユーイング肉腫細胞系Ａ４へのＬＩＦ及び未処置コントロー ルの投与量反応効果を示すグラフ表現である。

図３は、＋２５１−ＬＩＦとユーイング肉腫細胞系の結合を示すグラフ表現であ る。

図４は、寒天培養てのユーイング細胞のクローン化性に対するＬＩＦの効果を示 すグラフ表現である。

図５Ａ、Ｂ及びＣは、最初の腫瘍の大きさ範囲に従ってグルレープ分けしｔこ５ ＣＩＤマウスに生育したユーイング腫瘍に対するＬＩＦの効果を示すり゛ラフ表 現である。図５Ａ及び５Ｂは、最初に中の大きさの腫瘍を有したマウス１こ生育 し一二腫瘍に対する・ＰＢＳ、ムｍＬＩＦ又は■ｈｌｌＦの効果を示す。図５０ で１ま、マウスは最初に大の大きさの＠瘍を有した。

図５　Ａ　−Ｄは、 Ａ　：　ＰＢＳて処置１８日後に取った、低力（Ｘ４０）倍率のヘマトキン「ノ ン　、及びニオノン染色皮下ユーイング肉腫異種移植片。腫瘍細胞は周りの組織 を冒した。

８２０μｇ／日ヒトＬＩＦて処置１８日後に取った、低力（Ｘ　４０）倍率のヘ マトキンリン及びエオンン染色皮下ユーイング肉腫異種移植片。分散性青白部分 は退行性壊死腫瘍細胞を示す。

Ｃ：　ＰＢＳの毎日の注射て処置の１８日後の、高力（Ｘ　４００）倍率のへマ ドキノリン及びニオノン染色皮下ユーイング肉腫異種移植片。黒く染まってし） る核を有する密集した丸い細胞体は、周りの皮下及び筋肉組織を冒す、有糸分裂 形を伴う生きている攻撃的腫瘍を示す。

Ｄ＝ヒトＬＩＦ（２０μｇ／日）で処置の１８日後の、高力（Ｘ　４００）倍率 のへマドキノリン及びニオノン染色皮下ユーイング肉腫異種移植片。青白部分は 、コントロール１ｌｆｆｉ瘍（図６Ｃ）に見られた多数の有糸分裂形と１ま対照 的（こ有糸分裂形に欠けていることにより識別された壊死退行性腫瘍細胞を示す 。

を示す写真グラフ表現である。

実施例１ １　材料及び方法 細胞 ユーイング肉腫の学者からの）くイオプシー及び骨髄検体力１ら得すこ腫瘍をこ れらの研究に用いた。本プロンエクトに対する承認は、ザ・ローヤル・チルドレ ンズ・ホスピタルの倫理委員会から得た。

腫瘍細胞の単一細胞懸濁液は、１８Ｇ又は２１Ｇ針による機械的破裂により、或 いはピペットで移すことにより得、次いで３７℃で１０分間、ｍｌ当り１．２単 位の濃度てデイスパーセ■（ベーリンカー）とインキュベートした。細胞（ま、 寒天培地への添加に先たち、緩やかにかきまぜて凝集するのを防Ｌ１ｆど。

クローン細胞系は、１０％Ｖ／〜つ／胎仔血消（Ｆｅ２：Ｃ３Ｌ’Ｊミテ・マド 、メルホルン、オーストラリア）を補足したイスコブ修飾ノニルベコ培地（ＩＭ ＤＭ）で成育し、１週又は２週継代した。本明細書で用いたニーインク゛肉腫細 胞系の特質は以下に記載される通りである。

腫ｆａ　標本　年令　性　継代数　染色体上記初代細胞系（Ａｌ及びＣｕ）から 誘導された細胞系はアラビア数字（例えばＡ１−１、Ａ１−５、Ａ１−８又は（ ｕ−１）により確認される。

半流動培養 膿瘍細胞を、イスコブ修飾ジュルベコ培地（ＩＭＤＭ）　及び１０％ｖ／ｖＦＣ ３を含む０．３Ｗ／Ｖ寒天に固定した。ＬＩＦ及び他の生長因子を種々の濃度で ３５ｍｍペトリ皿に加え、これに１ｍｌの細胞−寒天培地を緩やかに混合し、室 温でゲル化後、培養物を湿った５％Ｖ／ＶＣＯ２環境で１２−１８日間インキュ ベートした。

培養物は、コロニー（〉４０細胞）又は固り（く４０細胞）の存在を数えた。培 養物当り塗布した細胞の数はｍ１当り５００から１０．０００に及んだ。コロニ ーはオリンパス解剖顕微鏡で数えた。

生成因子 種々の商業的に入手しうる生成因子をこの研究に用いた。これらは、ＩＬ−１、 ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、Ｍ−Ｃ３Ｆ、Ｇ−Ｃ３Ｆ、ＧＭ−Ｃ５Ｆ、幹細 月包因子　（ＳＣＦ）　、　ＴＮＦａ、　ＴＧＦａ、ＴＧＦａ、　ＥＧＦ、ａＦ ＧＦ、ｂＦＧＦ。

ＮＧＦ、ＩＧＦｌ、１ＧＦｎ、ＰＤＧＦ及びＩＦＮ−γを含む。

組換えヒト白血病阻害因子（１，、ｌＦ）をアムラト・コーポレイション・リミ テッド、メルボルン、オース）・ラリアから得た。

２　ニーユング細胞系に対するＬ　Ｉ　Ｆ及び他の生成因子の影響衣１−３は、 異なるユーイング細胞系の数について、寒天培養でのコロニーの形成に対する種 々の生成因子及びリンホカインの影響を示す。培養当り０１と１００ｎ１００ｎ の間の生理的投与量で、ＬＩＦがコロニー数を有意に減することを見出した。他 の因子は、ＴＮＦ−αを除き、コロニー数に何の影響も示さなかった。しかしな がら、これらの研究て用いたＴＮＦ−αの投与量は生理的投与量よりはるかに上 であることに注意をしなければならない。

表１ 細胞　細胞の数　刺激　コロニー／培１Ａｌ−５１，０００ＮＴＬ　４８ 本培養の１８日での２回のコロニー数の平均衣２ 細胞　細胞の数　刺激　コロニー／培養本Ａｌ−８１，ＣＸ力　ＮＴＬ　７：！ 本培養の１８日での２回のコロニー数の平均衣３ 細胞　細胞の数　刺激　コロニー／培養本Ｃｕ−１＋Ｏ，ＯＯＯＮＴＬ　４８５ Ａｄ−１１，０００ＮＴＬ　７０ 本培養の１８日での２回のコロニー数の平均３、寒天培養でのユーイング肉腫細 胞に対するＬＩＦの影響懸濁培養の細胞系Ａ１−５からのニーユング肉腫細胞は 、ｍＬ当り５Ｘ１０”細胞で増殖寒天プレートの接種前に１１００ｎ／■Ｉ　Ｌ ＩＦの存在又は不存在で７日間インキュベートし、次いでさらに１８日間インキ ュベートしてコロニーを数える。３つの別個の実験結果を図４に示す。全ての例 で、ＬＩＦ−処置細胞から得たコロニーの頻度はコントロール細胞に比べて３５ −５５％低かった。ＬＩＦ活性化寒天培養での大きなコロニーの割合は、７−１ ４日浮遊培養でＬＩＦで前処理したことによりさらに減じた。

実施例２ ユーイング肉腫細胞のＬＩＦレセプター本実本実施用いた段階を試み、ユーイン グ肉腫細胞の特異的親和性レセプターを証明する。１０ｍＭへペス緩衝液ｐＨ７ ，４及び１０％ｖ／ｖウン胎仔血肩を含む１００ａｌのＲＰＭＩ−培地中のクロ ーン化ユーイング肉腫細胞系Ａ１５　（７ｘ１０６点当り）を５μｇ／ｍｌの未 標識ｈＬＩＦを存在させ又は不存在で、３時間氷上で増加する濃度ノ１２″Ｉ− ｈＬＩＦ　（Ｅ、：ｌり誘導）　（５０００−８００，０００ｃｐ１１＋　１０ ０．　ＯＯＯｃｐｍ／ｎｇ）とインキュベートした。次いてインキュベーション 混合物を１８０ａｌ冷つ／胎仔血清上に層状とし、エソペンドルフミクロフユー グで１０秒間最大速度で遠心し、細胞ペレットを含む管の先端を外科用メスで切 り、ガンマカウンターで計数するために取り除いた。

結合データのスキャチャード分析（特異的結合ｃｐｍ／フリーＣｐｆｆｉ対特異 的結合ｈＬＩ　Ｆ（ｐＭ））を図３に示す。分配は９０ｐＭの平衡解離定数を与 え、横座標のしゃ断は、細胞当り約６０ＯＬＩＦレセプターが存在することを示 した。異なるユーイング肉腫細胞の二次独立スキャチャート分析により、１３０ ｐＭの平衡解離定数ど細胞当り１００ＯＬＩＦレセプターを与えた。

実施例３ ユーイング肉腫腫瘍を伴うマウスての組換えヒトＬＩＦの影響本実施例は、ユー イング肉腫のインビボ生育に対するＬ　Ｉ　Ｆの影響を試験するために、ヌード 及び５ＣＩＤマウスを用いるユーイング肉腫用のインビボモデルを記載する。

１、材料及び方法 マウス ５ｃｉｄマウスはアニマル・リソース・センター、ウィレトン、ウェスタン・オ ーストラリアから得た。全てのマウスは５−８通合で、同性（雄）であった。重 症複合免疫不全症（ｓｃｉｄ）は、ＣＢ１７　（ＣＢ−１ｇＨ−１ｂ（Ｎ１７Ｆ ３４））類似遺伝子型系統で自然に生じた常染色体劣性変異である（１６）。こ の類似遺伝子型系統では、通交ＢＡＬＢ／ｃ系がＣ５７ＢＬ／Ｋａ系の免疫グロ ブリンＨ鎖対立遺伝子（Ｉｇｈ−１ｂ）を運んだ。５ＣＩＤ遺伝子位置は、クロ モシーム１６の中心部末端に位置を決めた（１６）。これらのマウスは欠損Ｔ及 びＢ細胞免疫を有し、従って、多くの外来細胞の植えっぎを考慮する。マウスは 層流単位に維持した。感染からの死亡率を減少させるために、マウスは加圧滅菌 したおりの中に保持し、加圧減圧した餌及び酸性化水を用いた。

試薬 Ｅ、コリ（ロット１２２、アムラド・コーポレイション・リミテッド）がら誘導 された組換えヒトＬＩＦ（ｈＬＩＦ）を用いた。組換えマウスＬＩＦ（ロット３ ０８、アムラド・コーポレイション・リミテッド）及びＰＢＳ／１％ｗ／ｖＢＳ Ａをインビボ注射用のコントロールとして用いた。

規範 本プロジェクトは、ジ・アニマル・エンクス・コミッティー・オブ・ザ・ローヤ ル・チルドレンズ・ホスピタル・リサーチ・ファウンデーション、メルボルン、 オーストラリアにより承認された。

異種移植片の確立方法 ５−８　Ｘ　１０”；Ｉ　ｏ−ン化ニーインク肉ｍ細胞（細胞系Ａ　ｌ−５）　 ヲＳ　ＣＩ　Ｄマウスに皮下注射した。約３週間後、はとんど全てのマウスで注 射部位に腫瘍が得られた。腫瘍細胞を分析し、１１：２２転位を含む同一開始染 色体異常を有することを示した。

２、結果 ｈＬＩＦの毒性 多くの予備的実験を行い、マウスでのｈＬＩＦの大体の１日投与量を測定した。

マウスは高投与量のｈＬＩＦ（マウス当り１００マイクログラム）を注射レニ。

これらの研究によりマウスはＬＩＦの毎日の皮下注射で２週間以内に死亡した。

ｈＬ　Ｉ　Ｆの低投与量（マウス当り５−２０マイクログラム）を用いる研究で は、はとんどのマウスが２０日以上生存した。後方眼窩採血を初めの３日間行い 、血小板数を測定した。１マイクログラム又はそれ以上のｈＬＩＦを毎日皮下注 射した全てのマウスで、血小板数は初めの３日間上昇した（基線予備処理水準の ２６−６０％増大）。本研究では２０μｇのｈＬＩＦの量を、ユーイング肉腫腫 瘍を保持している５ＣＩＤマウスに毎日皮下注射するのに選んだ。

５ＣＩＤマウスでのユーイング腫瘍増殖に対するｈＬＩＦの影響処置されている 哺乳動物に関係する不均質及び物質ＬＩＦの影響を試験するため、ｈＬＩＦ（マ ウス当り２０μｇ）、マウスＬＩＦ　（マウス当り１０１００ｕ、又はＰＢＳ／ １％Ｗ／〜ＢＳＡを注射した腫瘍保持５ＣＩＤマウスを用い、二重盲検制御研究 を実施した。ｈＬ　Ｉ　Ｆの有効量は、マウス内の高循環水準のｈＬＩＦ結合蛋 白の存在によりｍＬＩＦよりも高いことが要求された（１７）。８匹のマウスは 、２週間以上（範囲１５−３１日）生存しているｈＬ　Ｉ　Ｆ群の大部分のマウ スに注射した。腫瘍の大きさは目盛り付き内縁を用い腫瘍の深さ、長さ及び巾を 測定することにより評価した。異種移植片注射から３週間後、同様の大きさの腫 瘍を示したマウスは、図５Ａ、Ｂ及びＣに示すようにｈＬＩＦ（■）、ｍＬＩＦ （ム）及びＰＢＳ（釦を注射した。図５Ａ、Ｂ及びＣて観察された全体的傾向１ よ、独立の開始腫瘍の大きさ、超過時間、ｈＬＩＦ及びｍＬ［’注射マウスが、 ＰＢＳコントロールに比べ大きさが有意に減少した腫瘍を有することを示しｔこ 。ｈＬＩＦ処置マウスの小さな腫瘍についての傾向は、消耗症候群より前に明ら 力・であった。

本発明を作用のモードに関する何らかの一つの仮説に限定するつもりはなＬ１カ （、この現象はマウスてのＬＩＦ毒性の表明でありうる。はとんどの場合、この 傾向はｈＬＩＦ注射後７日以内で顕著であった。

皮下腫瘍の組繊学的実験を全てのマウスについて、完全な剖検であったが、行つ た。結果を図６Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤに示す。これらの研究は、ｈＬＩＦ処置マウス のユーイング肉腫腫瘍が生きている細胞から成り立っている腫瘍がごくわずかな パーセントである壊死領域から主として成り立っていることを明らかにした。コ ントロール腫瘍の組織学は、生きている攻撃的腫瘍細胞が周りの皮下及び筋肉組 織を侵略することを明らかにした。さらに、ｈＬＩＦ処置マウスの腫瘍にほとん ど有糸分裂形状が観察されず、これはいずれのコントロール腫瘍にも観察される 多数の有糸分裂形状と明らかに対照的であった。

従って、結果はｈＬＩＦ及びｏ＋Ｌ　Ｉ　Ｆ処置マウスでの腫瘍の大きさがＰＢ Ｓ処置マウスに比べて有意に小さかったことを示す。腫瘍の実験は、ｈＬＩＦ処 置腫瘍がコントロール（９０−１００％）に比べ少ない生存領域（く２０％）を 示すことを顕微鏡的に明らかにした。コントロールマウスの腫瘍細胞は悪性細胞 の形状を示しく高分裂指数、周りの組織の侵入性）、一方、ｈＬ　Ｉ　Ｆ処置マ ウスの腫瘍は、これらの形状を示さなかった。研究は、ｈＬＩＦ及びｍＬＩＦが マウスの増殖するユーイング肉腫細胞に生物学的効果を有すること、及びこれら の試薬がこれらの型の腫瘍を有する哺乳動物の処置に有効であろうことを示した 。

当業者は、本明細書に記載された発明が、特に記載されたちの以外の変更及び修 飾を受け入れうろことを理解するであろう。本発明はそのような全ての変更及び 修飾を含むことを理解すべきである。本発明は又、個々に又は集合的に本明細書 に引用し又は示された全ての段階、特徴、組成物及び化合物並びにいずれかの２ 又はそれ以上の該段階又は特徴のいずれかの及び全ての組合せを含む。

引用文献 １．トミダＭ１ヤマモトーヤマグチＹ１ホズミＭ１ジャーナル・オブ・バイオロ ンカル・ケミストシイ２５９　：　１０９７ｇ（１９８４）。

２、ヒルトンＤＪ、ニコラＮＡ、ガウフＮＭ、メトコツＤ、ジャーナル・オブ・ バイオロジカル・ケミストシイ２６３　＋　９２３８（１９８ｇ）。

３　ギアリングＤＰ、ガウフＮＭ、キングＪＡ、ヒルトンＤＪ、ニコラＮＡ、ノ ンブワンＲＪ、ナイスＥＣ，ケルソＡ、メトコフＤ、、ＥＭＢＯジ早−ナル６　 ：　３９９５（１９８７）。

４、モラウＪ−Ｆ１　ドナルドワンＤＤ、ベネットＦ１ウィテクーギアノティＪ Ａ。

クラークＳ０１ウオングＧＧ、ネイチャー３３６　：　６９０（１９８ｇ）。

５　アベＥ１タナカＨ１インミＹ、ミャウラＣ１ハヤンＴ、ナガサワＨ１トミダ Ｍ１ヤマグチＹ１ホズミＭ、スダＴ１プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・ アカデミイ・オブ・サイエンシズＵ　Ｓ　Ａ　８３　：　５９５ｇ（１９８６） 。

６、ウィリアムスＲＬ、ヒルトンＤＪ、ピースＳ１ウィルソンＴＡ、ステユワー トＣＬ、ギアリングＤＰ、ワグナ−ＥＰ、メトコフＤ１ニコラＮＡ、ガウフＮＭ 、ネイチャー３３６　：　６８４（１９８ｇ）。

７　スミスＡＧ、ヘルスＪＫ、ドナルドワンＤＤ、ウォングＧＧ、モラウＪ１ス トールＭ１０ノヤースＤ、ネイチャー３３６・６８８（１９８ｇ）。

８　バウマンＨ、ウォングに−Ａ１ジャーリースＧＰ、ジャーナル・オブ・バイ オロジカル・ケミストシイ２６４・８０４６（１９８９）。

９　バウマンＨ、ウォングＧＧ、ジャーナル・オブ・イムノロシイ＋４３　：　 １１６３（１９８９）。

１０　モリ間１ヤマグチに１アベに１バイオロジカル・アンド・バイオフィジカ ル・リサーチ・コミュニケー／ヨン１６０・１０８５（１９８９）。

１１、メトコフＤ１ギアリングＤＰ、プロノーデインダス・オブ・ナショナル・ アカデミイ・オブ・サイエンシズＵ　Ｓ　Ａ　８６　：　５９４８（１９８９） 。

１２／ヤーグンスＨ１ゴープル＼“、ミカエリスＪ１ラマクＷ１リチャーＪ１ソ ウアーＲ、トリナーＪ、ボンドＰＡ、ウィンクラ−Ｋ、ゴープルＵ、クリニツン エ・バーディアリ−９７（３）　：　２２５−３２（１９８５）。

１３、カバザナＡＯ、マイサーＪＳ、ジェファーワンＪ１　トリクＴＪ、アメリ カン・ジャーナル・オブ・パソロジイ１２７（３）　：　５０７−１８（１９８ ７）。

１４、オーリアスＡ１ランボートｃ１バフ、シュボウセフＪ１マザプロウドＡ、 ＣＲセイアーンス・アヵデミイ・オブ・サイエンシズ（Ｉｎ）　２９６（２３） 　：　１１０５−７＜１９８３）。

１５、リピンスキＭ１ヒルンユＭＲ，ジイゴスティニーブザンＨ１ヤマダ０、ツ ルズＴ１ゴリディスＣ、インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー４ ０（１）・８１−６　（１９８７）。

１６　ポスマ等、ネイｆ　＋　−３０１：　５２７−５３０（１９８３）。

１７　レイトン等、プロノーディンゲス・オブ・ナショナル・アヵデミイ・オブ ・サイエンシズＵ　Ｓ　Ａ　８９　：　８６１６−８６２０（１９９２）。

ＦＩＧｔＪＲＥ　３ （ｑ■±■−７口口 （ε山ＬＬＩ）　ｘ餓 国際調査報告　１−１−１□賜 ＰＣＴＩＡｕ１廖に１ 国際調査報告　１−−１□Ｍｅ Ｋゴ１ＡＩｆｆ２バ略−ロ Ｆ’ｅｗｍ　ＰＣＴｎＳｋｎ　１Ｇ　＋　ｍ＋１＋−１艶ａ　ｌ　ｗｃｏ＋ｖｌ 　ａｈａｍ　ＸＩ　ｕｌｙ　ｌ　９９２１　ｔｏｐｅｄ１輌」−カ鴫１亀即−− 煽Ｎう 国際調査報告　ＰＣＴｌＡＵ１□ Ｔｈ１ｓ　Ａｎｎｅｘ　１ｉｓｔｓ　ｌ）＋ｅｋｎｏｗｎ　”Ａ”　ｐｕｂｌｉ ｅａＬｉｏｎ　１ｅｖｅｌ　ｐａｔｅｎｔ　ｆａｍｉｌｙ　高■高ｂ■窒刀@ｒ ｅｌａｔｉｎｇ　ｔｏ鋤、ｐａｔｅｎｔｄｏｅｕｍｅｎＬｓｃｉｔｅｄ　ｉｎ山 ｅ　ａｂｃｙｅ−ｍｅｎｕｏｎｅｄｉｍｅｒｎａｔｉｏｎｄ　５ｅａｒｃｈ　ｒ ｅｐｏｎ、　Ｔｈｅ＾ｕｓ＋ｒａｌｉａ獅oａ＋ｅｍ　Ｏｍα：　＋ｓ　＋ｎ　 ｎｏ　ｗａｙ　ｌｉａｂｌｅｒｏｔｔｈｅｓｅｐａｒｔｉｃｕｌａｒｓｗｈｉｃ ｈａｒｅｍｅｒｅｌｙｇｉｖｅｎｆｏｒｔｈｅｐｕｒｐｏｓｅｏｒｉｎｆｏｒ＋ ｔ＋ａむ盾氏B Ｐｅｍ　Ｐｅｔ／１３Ａ／２１＆ｐａｗｍ　ｌａｍｕｙ　ａａ＋ｗｍＷＩｕｌｙ 　１９９２１カカー

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. １．未分化腫瘍及び／又は肉腫を保持している哺乳動物の処置方法であって、そ の方法は該哺乳動物に有効量の白血病阻害因子（ＬＩＦ）及び／又はその断片又 は誘導体を、未分化腫瘍及び／又は肉腫の大きさを消滅又は減少するのに十分な 時間及び条件下、投与することを含む。
2. ２．１又はそれ以上のサイトカイン、その誘導体及び／又は１又はそれ以上の化 学療法剤の同時又は連続的投与をさらに含む、請求項１の方法。
3. ３．哺乳動物がヒト、家畜動物、仲間動物、実験室試験動物又はつながれている 野生動物である、請求項１又は２の方法。
4. ４．哺乳動物がヒトである、請求項３の方法。
5. ５．腫瘍か本質的にユーイング肉腫、横絞筋肉腫及び結合組織、骨、膀胱、腎臓 、肝臓、肺、耳下腺又は脾の肉腫から成る一覧表から選択される、請求項１又は ２又は４の方法。
6. ６．腫瘍がユーイング肉腫である、請求項５の方法。
7. ７．ＬＩＦが処置すべき哺乳動物と同種である、請求項１の方法。
8. ８．ＬＩＦが処置すべき哺乳動物と異種である、請求項１の方法。
9. ９．ＬＩＦがヒト、ネズミ又は家畜動物起源である、請求項１の方法。
10. １０．ＬＩＦが組換え形である、請求項９の方法。
11. １１．ＬｌＦの有効量が約０．１ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１０００μｇ／ｋｇ 体重／日である、請求項１の方法。
12. １２．有効量が約１ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１００μｇ／ｋｇ体重／日である 、請求項１１の方法。
13. １３．有効量が約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１０μｇ／ｋｇ体重／日である 、請求項１１の方法。
14. １４．サイトカインが、本質的にｌＬ−１、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γから成る 一覧表から選択される、請求項２の方法。
15. １５．化学療法剤が本質的にアドリアマイシン、ダウノルビシン、ダクトマイシ ン、アクチノマイシン、エトポサイド、イフォスファマイド、ビンクリスチン及 びサイクロホスファミドから成る一覧表から選択される、請求項２の方法。
16. １６．ＬＩＦ又はその活性断片及び１又はそれ以上の他のサイトカイン又はそれ らの誘導体及び／又は１又はそれ以上の化学療法剤並びに１又はそれ以上の製薬 上許容しうる担体及び／又は希釈剤を含む、腫瘍及び肉腫を処置するための医薬 組成物。
17. １７．未分化腫瘍及び／又は肉腫を保持している哺乳動物の処置のための医薬の 製造でのＬＩＦ及び／又はその活性断片の用途。
18. １８．１又はそれ以上の他のサイトカイン、その誘導体及び／又は１又はそれ以 上の化学療法剤の使用をさらに含む、請求項１７の用途。
19. １９．哺乳動物がヒト、家畜動物、仲間動物、実験室試験動物又はつながれてい る野生動物である、請求項１７又は１８の用途。
20. ２０．動物がヒトである、請求項１９の用途。
21. ２１．腫瘍が本質的にユーイング肉腫、横絞筋肉腫及び結合組織、骨、膀胱、腎 臓、肝臓、肺、耳下腺又は脾の肉腫から成る一覧表から選択される、請求項１７ 又は１８又は１９の用途。
22. ２２．腫瘍がユーイング肉腫である、請求項２１の用途。
23. ２３．ＬＩＦが処置すべき哺乳動物と同種である、請求項１７の用途。
24. ２４．ＬＩＦが処置すべき哺乳動物と異種である、請求項１７の用途。
25. ２５．ＬＩＦがヒト、ネズミ又は家畜動物起源である、請求項１７の用途。
26. ２６．ＬＩＦか組換え形である、請求項２５の用途。
27. ２７．サイトカインが本質的にｌＬ−１、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γから成る一覧 表から選択される、請求項１８の用途。
28. ２８．化学療法剤が、本質的にアドリアマイシン、ダウノルビシン、ダクトマイ シン、アクチノマイシン、エトポサイド、イフォスファミド、ビンクリスチン及 びサイクロホスファミドから成る一覧表から選択される、請求項１８の用途。