JPH07501922A

JPH07501922A - Ｔａｇ−７２に結合できるヒトサブグループｉｖ　ｌ鎖の複合抗体

Info

Publication number: JPH07501922A
Application number: JP4502011A
Authority: JP
Inventors: メゼス，ピーター　エス．; リチャード，ラス　エー．; ジョンソン，キム　エス．
Original assignee: ザ　ダウ　ケミカル　カンパニー
Priority date: 1991-12-13
Filing date: 1991-12-13
Publication date: 1995-03-02
Also published as: AU9058291A; CA2121041C; CA2121041A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ＴＡＧ−７２に結合できるヒトサブグループＩＶ　Ｌ鎖の複合抗体本発明は、免疫学及び遺伝子工学の分野に関する。

次の情報は、出願者により信じられる既知の情報を本発明に関して可能なものにする目的のために提供される。次の情報のいづれかが本発明に対する従来技術を構成するものとして必ずしも意図されないし又は解釈らされるへきてはない。

抗体は、外来性タンパク質、糖タンパク質、細胞又は他の抗原性外来物質による挑戦に応答してを椎動物の免疫システムにより生成される特異的免疫グロブリン（１ｇ）ポリペプチドである。特定の抗原に対してのそのようなポリペプチドの結合特異性はひじょうに精密であり、そして個々の抗体はそれを誘発した特定の抗原にほとんと独占的に向けられる。

を椎動物の抗体を生成する２種の主要方法が現在使用されている：哺乳類Ｂリンパ球による現場生成及びＢ−細胞ハイブリッドによる細胞培養物での生成。抗体は血漿細胞中への未分化Ｂリンパ球の分化の結果として現場生成される［Ｇｏｕｇｈ（１９８１）、Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　ＢｉｏｃｈｅｍＳｃｉユ６　：２０３（１９８１）を参照のこと〕。単一の抗原が特定哺乳類のために免疫システム中に導入される場合でさえ、一定抗体集団は生ぜず、すなわちその応答はポリクローナル的である。

ポリクローナル抗体の限定されないが、しかし固有の異質性は、Ｂ細胞ハイブリドーマにより細胞培養物に“モノクローナル”抗体を創造するようにハイブリドーマ技法の使用により克服される（Ｋｏｈ−Ｉｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（＋９７５）、　Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９７）。この方法においては、哺乳類が抗原により注射され、そしてその比較的短命の又は死すべき牌臓細胞又はリンパ球が不滅の腫瘍細胞系により融合される。この融合物がハイブリッド細胞又は不滅であり、そして１３細胞の遺伝的にコードされた抗体を生成できる“ノーイブリドーマ”を生成する。

多くの用途において、非ヒト動物に生成されるモノクローナル抗体の使用は厳しく制限され、すなわちモノクローナル抗体はヒトにおいて使用される予定であるからである。“外来性”抗体、たとえばマウス抗体のヒトにおける反復注射は、有害な過敏性反応、すなわち抗−イディオタイプ又はヒト抗−マウス抗体（ＩＩＡＭＡ）応答を導種々の試みが、ヒトハイブリドーマを用いることによってヒト由来のモノクローナル抗体を製造するためにすてに行なわれて来た（ＯＩＳＳＯｎなど、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、υ、　Ｓ、　Ａ、　、　７７　：　５４２９（１９８０）及びＲｏｄｅｒなと、、（＋９８６）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　＋２１：４０〜１６７を参照のこと）。不運なことには、ヒト／％イブリドーマ細胞系からのモノクローナル抗体の生成は、マウスハイブリドーマに比較して、比較的低い。さらに、免疫グロブリンを発現するヒト細胞系は、マウス細胞系に比較して比較的不安定であり、そしてそれらのヒト細胞系の能力を生成する抗体は過渡的である。従って、ヒト免疫グロブリンがひしように所望されるが、ヒトハイブリドーマ技法は、必要とされる抗原特異性を有するヒトモノクローナル抗体が容易に得られる段階にはまだ、達していない。

従って、非ヒト起源の抗体が遺伝子的に構築され、又は“人体適応化されて来た（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）”。人体適応化された抗体は、マウス抗体によるヒト患者への注射の後に予測される応答に比較して、ＩＩＡＭ八応答へ減じる。たとえば、非ヒトに由来する抗体の人体適応化は、２種の主要形、すなわち免疫グロブリン一定配列の非ヒト領域が対応するヒト領域により置換されているキメラ化（たとえば、ＵＳＰ第４、８１６．５６７号、Ｃａｂｉｌｌｙなど、、Ｇｅｎｅｎｔｃｃｈを参照のこと）及びヒト骨格領域（ＰＲ）中への相補的決定領域（ＣＩＩＲ）の移植（ヨーロッパ特許出願（ＥＰＯ）第０２３９．４００、Ｗｉｎｔｅｒを参照のこと）を採用して来た。

何人かの研究者は、Ｆｖ抗体（ＵＳＰ第４．６４２．３３４号、Ｍｏｏｒｅ、　ＤＮＡＸ）及び単一鎖Ｆｖ（ＳＣＦＶ）抗体（ＬＩＳＰ第４．９４６．７７８号、Ｌａｄｎｅｒ、　Ｇｅｎｅｘ）を生成している。

上記特許出願は、可変ドメインのいくらかの部分が非ヒトＶ遺伝子領域によりコードされている抗体フラグメントの生成を単に示す。

人体適応化された抗体は、非ヒト起源のし及びＨ鎖可変領域の種々の部分を保持し、すなわちキメラ性Ｆｖ及び一本領Ｆｖ抗体は非ヒト起源の全可変部分を保持し、そしてＣＤＲ−グラフトされた抗体は非ヒト起源のＣ［）Ｒを保持する。

そのような非ヒト由来の領域は、ヒト患者に投与される場合、免疫原性反応を誘発することが予測される（Ｂｒｉｉｇｇｅｍａｎｎなど、　、　（１９８９）、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　、　１７０：２１５３〜２１５７；及びＬｏ　Ｂｕｇｌｉｏ（１９９１）、Ｓｉｘ　Ｉｎｔｅｒｎａｔ−ｉｏｎａｌ　Ｃｏｍｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｎ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ　ｆｏｒＣａｎｃｅｒ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、Ｃａを参照のこと）。従って、選択された抗原に結合できるヒト可変領域を得ることが最とも所望される。

１つの知られたヒト癌腫瘍抗原は、モノクローナル抗原８１２．３により定義されるような腫瘍関連糖タンパク質−７２（ＴＡＧ−７２）である（Ｔｈｏｒなど、（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４６：３１１Ｂ〜３１２４　；及びＪｏｈｎｓｏｎ、なと、（１９８Ｂ）、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、４６：８５０〜８５７を参照のこと）　。ＴＡＧ−７２は、ヒト起源のある腫瘍細胞の表面、特にＬＳ１８０（ＡＴＣＣＮｏ、ＣＬ１８７）結腸腺癌系の変異体である、ＬＳＩ７４Ｔ腫瘍細胞系（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　ＣｕｌｔｕｒｅＣｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）Ｎｏ、Ｃ１，＋８８）に関連している。

ＴＡＧ−７２に対しての結合特異性を有する多くのネズミモノクローナル抗体が開発されて来た。典型的なネズミモノクローナル抗体は、固定された抗−ＴＡＧ　−７２抗体、Ｂ７２．３（ＡＴＣＣ１（Ｂ−８１０８）を含む免疫親和性カラム」二で精製されたＴＡＧ−７２を用いて開発されたネズミモノクローナル抗体のライブラリィ−であるＣＣ”　（結腸癌）モノクローナル抗体を包含する（ＥＰ第３９４２７７号、Ｓｃｈｌｏｍなど、、Ｎａｔｉｏｎａｌ　ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅを参照のこと）。いくつかのＣＣ抗体は、ＡＴＣＣ：ＣＣ４９（ＡＴＣＣＮｏ、ＩＩＢ９４５９）：ＣＣ８３（ＡＴＣＣＮｏ、１１８９４５３）；ＣＣ４６（ＡＴＣＣＮｏ、１１８０４５８）；ＣＣ９２（八ＴＣＣＮｏ、　ＨＢ９４５４）　；ＣＣ３０（ＡＴＣＣＮｏ、　ＨＢ９４５７）　；ＣＣＩＩ（ＡＴＣＣＮｏ、　１−ＩＢ９４５５）及びＣＣｌ５（ＡＴＣＣＮｏ、ＨＢ９４６０）として寄託されている。ＣＣシリーズの種々の抗体がキメラ化されて来た（たとえば、ＥＰＯ第０３６５９９７号、Ｍｅｚｅｓなど、。

Ｔｈｅ　Ｄｏｗ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙを参照のこと）。

従って、ヒト抗体に由来するし及び／又は）−１鎖可変領域を含むＴＡＧ−７２に対する抗体を開発することに高い興味が存在する。しかしながら、従来技術は、Ｌ鎖及び／又は■（鎖可変領域がＴＡＧ−７２に対する特異性及び親和性を有し、そし７てたぶん低い又は存在しないＩＩＡＭへ応答を誘発するためにヒト配列に由来する；抗−ＴＡＧ　−７２抗体を通常生成できる組換え技法及び免疫学的技法を単純には教授していない。免疫グロブリン分子の機能がその立体構造に依存しており、これはその主要アミノ酸配列に依存することは知られている。抗体の結合機能に強く影響を及ぼすことができるいくつかの又はたった１個のアミノ酸の変化が抗体のその結合親和性に強く影響を及はすことができ、すなわち得られた抗体は一般的に、非特異的免疫グロブリン（ＮＳＩ）、すなわち抗体特性を欠いていることが推定される（たとえばＵＳＰ第４．８１６．５６７号、Ｃａｂｉｌｌｙなど、　、　Ｇｅｎｅｎ　１ｅｃｈを参照のこと）。

驚くべき事には、本発明はそれらの上記必要性の多くの満たすことができ、そして所望する抗体の供給方法を提供する。たとえば、１つの観点においては、本発明はＴＡＧ−７２に対する結合特異性を有する複合抗体を発現できる細胞を提供し、ここで前記細胞は、（ａ）ヒトサブグループ１ｖ生殖系遺伝子（ＩＩｕｍ４　Ｖｌ、　）に効果的に相同なＬ鎖可変領域（Ｖｔ　）の少なくとも一部をコードするＤＮＡ配列；及びＴＡＧ−７２に結合する能力を有する立体構造中にＶｌ、と結合できるＨ鎖可変領域（Ｖ、、）の少なくとも一部をコードするＤＮＡ配列セグメントにより形質転換される。

もう１つの観点において、本発明は、（ａ）ヒトサブグループ１ｖ生殖系遺伝子（Ｈｕｍ４　Ｖｔ　）に効果的に相同なＩ、鎖可変領域（ＶＬ　）の少なくとも一部をコードするＩ）Ｎへ配列：及びＴＡＧ−７２に結合する能力を有する立体構造中に■２．と結合できるｌ（鎖可変領域（ＶＵ）の少なくとも一部をコードするＤＮＡ配列セグメントを含んで成る、ＴＡＧ−７２に対して結合特異性を有する複合抗体又は抗体を提供する。

本発明は、さらに前記抗体を単独で又はイメージングマーカー又は治療剤に接合されて包含する。本発明はまた、医薬的に許容できる非毒性無菌キャリヤーにおいて、接合されていない又は接合された形で前記抗体を含んで成る組成物を包含する。

本発明はまた、癌病変の現場検出のために前記組成物の医薬的有効量を、ＴＡＧ −７２を発現する腫瘍を含む動物に投与することを含んで成る、癌のインビボ診断のための方法にも向けられる。

本発明はまた、（ａ）前記組成物の医薬的有効量を、ＴＡＧ−７２を発現する腫瘍を含む患者に投与し、それによって、腫瘍が局在化し、そして（ｂ）その局在化された腫瘍を刺激することを含んで成る、内部効果治療のための方法にも向けられる。

さらに、本発明はまた、複合抗体を調製し、そして発現するための方法にも関する。それらの方法のいくつかは次の通りである：ヒトサブグループ１ｖ生殖系遺伝子（ｌＩｕｍ４　ＶＬ　）に効果的に相同なし鎖可変領域（ＶＬ）の少なくとも一部をコードするＤＮＡ配列；及びＴＡＧ−７２に結合する能力を有する立体構造を形成するためにＶｌ　と結合できるＨ鎖可変領域（Ｖ、Ｉ）の少なくとも一部をコードするＤＮＡ配列セグメントにより細胞を形質転換することを含んで成る方法。

ヒトサブグループ１ｖ生殖系遺伝子（Ｈｕｍ４　Ｖｔ　）に効果的に相同なＬ鎖可変領域ｃＶｌｉの少なくとも一部をコードするＤＮＡ配列；及びＴＡＧ−７２に結合する能力を有する立体構造中にＶ、と結合できる■鎖可変領域（Ｖ、Ｉ）の少なくとも一部をコードするＤＮＡ配列セグメントを含む細胞を、免疫グロブリンＬ鎖及び免疫グロブリンＨ鎖を発現するのに十分な条件下で培養することを含んで成る、複合抗体又は抗体を調製するための方法。前記抗体とイメージングマーカー又は治療剤とを接触せしめることを含んで成る、抗体接合体を調製するための方法。

図面の説明第１図は、基本的な免疫グロブリン構造を示す。

第２図は、Ｖ　ｌｌαＴＡＧ、ＣＣ４６Ｖ、　、　ＣＣ４９Ｖ、　、　ＣＣ８３Ｖ、及びＣＣ９２Ｖ　ｌ。

のヌクレオチド配列を示す。

第３図は、Ｖ）ｌ　７ＺＴＡＧ、ＣＣ４６ＶＩＩ　、　ＣＣ４９Ｖｕ　、ＣＣ８３Ｖ＋ｔ　及びＣＣ９２Ｖ、。

のアミノ酸配列を示す。

第４図は、抗体旧７Ｘ２のＶｌ、ヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。

第５図は、ｐＮＰ９からのマウス生殖系Ｊｉｒ遺伝子を示す。

第６図は、ｐ４９　ｇｌ−２，３のプラスミド地図を示す。

第７図は、９８３　ｇｌ−２，３のプラスミド地図を示す。

第８図は、ｌ（ＵＭＶＬ（＋　）及びＩＩＬＩＭＶＩ、（−）　ノ完全な配列を示す。

第９図は、ヒトＪ４（ＩＩＪ４）ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す。

第１０図は、ｌｌｕｍ４　Ｖｌ　、　Ｃ１ａｌ−１１ｉｎｄｌセグメントのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す。

第１１図は、ＰＣＲのための標的としてのヒト生殖系サブグループ１■ＶＬ遺伝子（Ｈｕｍ４　Ｖｌ）の図的な表示である。

第１２図は、Ｈｕｍ４　Ｖ＋遺伝子を得るためにＩ’ＣＲ反応のアザロースゲル電気泳動の効果を示す。

第１３図は、ｐＲｌｌｏｏｏの制限酵素地図、及び前駆体プラスミドｐｓＶ２ｎｅｏ　、ｐｓＶ２ｎｅｏ−１０１及びｐｓＶ２ｎｅｏ−１０２を示す。“Ｘ″は、ｐＳＶ２ｎｅ。

の旧ｎｄｌｌｒ部位が破壊されている部位を示す。

第１４図は、２つのオリゴヌクレオチド：ＣＩＩ（＋）及びＣＩＩ（−）を合成することによって製造されるポリリンカーセグメントを示す。

第１５図は、ｐＳＶ２ｎｅｏ−１０２のいくつかのクローンからのプラスミドＤＮＡを配列決定するために使用されるプライマー、ＮＥＯＩ０２ＳＥＧを示す。

第１６図は、ｐｓＶ２ｎｅｏ−１０２におけるポリリンカー領域のＤＮＡ配列を示すオートラジオグラムを示す。

第１７図は、ｐＲＬｌｏｏｏの一部のヌクレオチド配列セグメントを示す。

第１８図は、ｐＲＬｌｏｏｌの制限酵素地図を示す。

第１９図は、ｐＲＬｌｏｏｌ　クローンのめたの［）ＮＡ配列のオートラジオグラムを示す。

第２０図は、複合Ｈｕｍ４　Ｖｌ、　、　Ｖｎ　ａＴＡＧ抗体を用いてのＴＡＧに結合するための競争アッセイを示す。

第２１図は、一本領複合Ｈｕｍ４　Ｖｌ、Ｖｕ　（ＩＴＡＧの一般的なりＮＡ構成を示す。

第２２図は、５ＣＦＶＩのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す。

第２３図は、プラスミドｐｃＧｓ５１５／　５ＣＦＶＩの構成を示す。

第２４図は、プラスミドｐｓｃＦＶ３１の構成を示す。

第２５図は、Ｈｕｍ４　Ｖ＋を含むＥ、コリ５ＣＦＶ発現プラスミドの構成を示す。

第２６図は、ｐｓｃｐｖｕｏｎに存在するｌＩｕｍ４　Ｖ　１．　ＣＣ４９Ｖ　ｕ　５ＣＦＶのＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す。

第２７図は、プラスミドｐｓｃＦＶＵＩＩＩＩの構成及びＶｌ＋遺伝子とＩＩｕｍ４　Ｖ。

との組合せライブラリーの図を示す。

第２８図は、ｐＡＴＤＦＬＡＧにおけるＦＬＡＧペプチドアダプターのヌクレオチド配列を示す。

第２９図は、ｐＡＴＤＦＬＡＧ、　ｐｔ（ｕｍ　ＶＬ　−１１ｕｍ　Ｖｌｌ　（Ｘ　）及びｐｓｃ４９ＦＬＡＧの構発明の詳細な説明略語化される場合、核酸、アミノ酸、ペプチド、保護基、活性基及び同様のものは、ＩＬＩＰＡｃ　ＩＬＩＢ（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｉａｚｕｒｅ）又は関連分野の実施に従って略語化される。

基本的な免疫グロブリン構造単位は第１図に示される。用語“不変”及び“可変 ”は、機能的に使用される。Ｌ鎖（Ｖｔ）及びＨ鎖（Ｖｕ）の両者の可変領域は、抗原への結合認識及び特異性を決定する。Ｌ鎖（ＣＬ）及びＨ鎖（Ｃ，、）の不変領域ドメインは、重要な生物学的性質、たとえば抗体鎖関連、分泌、トランス胎盤移動性、補体結合、Ｆ、レセプターへの結合及び同様のものを付与する。

本発明の免疫グロブリンは、従来技術の問題を克服するために開発されて来た。

本発明の方法は複合抗体を生成し、そして本発明はその複合抗体に関する。“複合抗体”とは、天然においてお互いとは関連することがこれまで見出されていない可変領域を含んで成る免疫グロブリンを意味する。“複合１１ｕｍ４　Ｖｌ、　、Ｖｏ抗体”とは、１（ｕｍ４　ＶＬ生殖系遺伝子に由来するＤＮＡによりコードされるＶＬ領領域少なくとも一部、及びＴＡＧ−７２に結合する能力を有する立体構造を形成するためにＶＬと結合できるｖｌｌ領域の少なくとも一部を有することによって特徴つけられる抗体又はその免疫反応性フラグメントを意味する。

本発明の複合ｔｌｕｍ４　ＶＬ、　Ｖ、抗体は、標準のアッセイ技法（たとえば酵素結合イムノソルベント　アッセイ（ＥＬＩＳＡ）　、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）　、又は蛍光活性化された細胞ソーター分析（ＦＡＣ５）、免疫組織化学及び同様の技法）を用いて単離され得る複合体を形成するために、ＴＡＧ− ７２に特異的に且つ十分な強さて結合する抗原結合部位を有する形態を想定する。好ましくは、本発明の複合１１ｕｍ４　ＶＬＴ■ｏ抗体は、　１０’／Ｍ、より好ましくは１０＠／Ｍ以上及び最とも好ましくは１０’／Ｍ以上の抗原結合親和性又は結合活性を有する。免疫グロブリン結合親和性を生成するための技法のためには、Ｍｕｎｓｏｎ（＋９８３）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｖ＋ｏ１．、９２：５４３〜５７７；及び５ｃａｔｃｈａｒｄ（１９４９）、Ａｎｎ、　Ｎ、　Ｙ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　５１　：６６０〜６７２を参照ノコと。

ヒト抗体カッパ鎖は、不変のアミノ酸配列に基づいて４つのサブグループに分類されている（たとえば、Ｋａｂａｔなど、　、　（１９９１）、鉢基−ｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ　（第４版）　、Ｕ、Ｓ。

Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　５ｅｒｖｉｃｅｓにより出版されている、を参照のこと）。約８０個のヒトＶＫ遺伝子が現われたが、しかしたった１つのサブグループ＋Ｖ　Ｖ、遺伝子がヒトゲノムに固定されている（Ｋｌｏｂｅｃｋ、　など、（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１３：６５１６〜６５２８を参照のこと）。Ｈｕｍ４　Ｖｔのヌクレオチド配列は、Ｋａｂａｔなど、（１９９＋）、前記；及びＷａｎｇなと、（＋９７３）、Ｎａｔｕｒｅ、２４３：１２６〜＋２７に示されている。

ひじょうに驚くへきことには、Ｈｕｍ４　ＶＬに由来する遺伝子によりコードされる■、の少なくとも一部と共にＬ鎖を有する免疫グロブリンは、適切なＶ　Ｉ＋と組合される場合、ＴＡＧ−７２に対する結合特異性を有することが見出された。

選択される。Ｊ１遺伝子セクメントのタイプは本発明に対して臨界ではなく、ここで、いづれかのＪｌ、は、存在するなら、ｌｌｕｍ４　Ｖ。

に関連することができる。本発明は明らかに、ヒトＪｌ配列と関連してのＨｕｍ４　Ｖ＋　に向けられる。５つのヒトＪｌ配列が、Ｈｅ１ｔｅｒなと、（１９８２）　、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３５７：１５１６〜１５２２に示される。しかしながら、本発明はヒトＪＫに制限されるつもりはない。本発明は、少なくとも６つのヒトＪ８遺伝子のいづれかと関連してｌＩｕｍ４　■＋　に特に向けられる（Ｈｏ１１ｉｓなど、（＋９８２）、Ｎａｔｕｒｅ、　２９６＋３２１−３２５を参照のこと）。

噌□雫□１■■■■□−□１■−一□−一■■―−■■―■□□選択されたＪ１セグメントよりＨｕｍ４　Ｖ＋　を構築するための典型的な技法は、標的ＤＮＡとハイブリダイズしない、いわゆる“揺れる尾（ｗａｇｇｉｎｇ　ｔａｉｌ）” を有するプライマーを合成することを包含し。

この後、その配列はオーバーラツプ拡張により増幅され、そして−複合Ｈｕｍ４　Ｖｔ　、　Ｖｏ抗体のＣＬは本発明に臨界ではない。今日まて、Ｈｕｍ４　Ｖ、は、一本の０７遺伝子により天然において再配列されたものとして単に報告されている（ｔｌｅｉｔｅｒなと、（１９８０）、Ｃｅ１ｌ。

２２・１９７〜２０７を参照のこと）。しかしながら、本発明は、Ｃ，Ｌ鎖不変ドメインに限定されるつもりはない。すなわち、Ｃ１遺伝子セグメントはまた、少なくとも６つのＣ％遺伝子のいづれかであり得る（ｌｌｏｌｌｉｓなど１．前記を参照のこと）。

Ｈ鎖可変領域をコードするＤＮＡは、おおまかには、１１鎖可変（Ｖ、、）遺伝子配列、Ｈ鎖多様性ＣＤ、、）遺伝子配列及び１１鎖連結（Ｊ、ｌ）遺伝子配ダ１から成る。

本発明は、ＴＡＧ−７２に結合する能力を有する立体構造を形成するために、ヒトサブグループ１■生殖系遺伝子によりコードされるＬ鎖可変領域に対して効果的に相同であるＬ鎖可変領域と結合できるいづれかの■□に向けられる。

複合Ｈｕｍ４　ｖＬ、　、　Ｖｏ抗体のＨ鎖多様性（Ｄｌｌ）セグメント及びＨ鎖連結（Ｊ、、）セグメントの選択は、本発明に臨界ではない。明らかに、ヒト及びネズミＤ　ｏ及びＪｎ遺伝子セグメントが企画され、但腰一定の組合せはＴＡＧ−７２への結合を有意に下げない。特に、ＣＣ４６Ｖ□、　ＣＣ４９Ｖ　Ｈ，ＣＣ８３Ｖ　ｎ及びＣＣ９２Ｖ１．を用いる場合、複合Ｈｕｍ４　ＶＬ　、　ＶＩＩ抗体は、それぞれの／１イブリドーマのＶ　１１と天然において関連するＤ　ｕ及びＪｕ上セグメント利用するように企画されるであろう（第２及び３図を参照のこと）。典型的なネズミ及びヒトＤ　Ｉ＋及びＪ１１配列は、Ｋａｂａｔなど、（１９９１）、前記に示される。

選択されたＶＨ配列と共にそのような選択されたＤＨ及びＪＨ上セグメント構築するための典型的な技法は、クローニング方法に従って、選択されたオリゴヌクレオチドを合成し、アニール腰そして連結することを包含する（Ｈｏｒｔｏｎなど１．前記を参照のこと）。

特定の態様において、複合Ｈｕｍ４　Ｖ、　、　Ｖｕ抗体は、）ｌｕｍ４　ＶＬ生殖系遺伝子に由来する［）ＮＡによりコードされるｖＬ領領域少なくとも一部、及び■□αＴＡＧ生殖系遺伝子に由来する１）ＮＡにコードされる■。領域の少なくとも一部を有することによって特徴づけられる抗体又はその免疫反応性フラグメントを意味する“複合Ｈｕｍ４　Ｖｔ　。

Ｖ、、αＴＡＧ抗体”であろう（たとえば、ＥＰＯ第０３６５９９７号、Ｍｅｚｅｓなと、　、　ｔｈｅ　ｌ）ｏｗ　Ｃｈｅ＋ｎ１ｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙを参照のこと）。第２図は、ＶｌｌαＴＡＧのヌクレオチド配列及びそれぞれＣＣ４６，ＣＣ４９，ＣＣ８３及びＣＣ９２抗体のＶｌ＋をコードするヌクレオチド配列を示す。第３図は、Ｖ　１１αＴＡＧ、ＣＣ４６Ｖ、　、　ＣＣ４９Ｖ、、　、　ＣＣ８３Ｖ、、及びＣＣ９２Ｖ、、の対応するアミノ酸配列を示す。

Ｖ　ｎαＴＡＧ、ＣＣ４６Ｖ、、　、　ＣＣ４９Ｖ、、　、　ＣＣ８３Ｖ、、及びＣＣ９２Ｖｕのヌクレオチド及びアミノ酸配列の比較は、それらのＣＣ抗体がＶｕαＴＡＧに由来することを示す。Ｂ細胞におけるＶｌｌαＴＡＧに由来する ■）１の生産性再配列の間に生じる体細胞変異は、生産性再配列化されたハイブリドーマ間での相同性アミノ酸変化をもたらすことができるか又はできないいくつかのヌクレオチド変化を生ぜしめた（ＥＰＯ第０３６５９９７号を参照のこと）。

ＶｌｌαＴＡＧ及びＨｕｍ４　ｖｌ、生殖系遺伝子のヌクレオチド配列が本明細書に供給されているので、本発明は、ＶｕαＴＡＧ生殖系遺伝子から生産性再配列される他の抗体遺伝子を包含するように企画されている。ｖＨαＴＡＧに由来するＤＮ八によりコードされる他の抗体は、■ＨαＴＡＧ又は組換えされたＶＨ αＴＡＧを含む再配列化された遺伝子の１）ＮＡ又はＲＮＡから製造されたハイブリダイゼーションプローブを用いることによって同定され得る。特に、そのプローブは、Ｖ　＋＋αＴＡＧ生殖系遺伝子及びそのフランキング領域のすべて又は一部を含むであろう。“フランキング領域”とは、Ｖ、ＩαＴＡＧの５′端からその上流の遺伝子の３′端、及びＶＨαＴＡＧの３′端からその下流の遺伝子の５′端のそれらのＤＮＡ配列を包含することを意味する。

■８αＴＡＧに由来する抗体の可変領域からのＣＤＲは、選択されたＶＵのＰＲｌすなわちヒト抗体のＦＲ上に移植され得る（ＥＰＯ第０２３９４００号、Ｗｉｎｔｅｒを参照のこと）。たとえば細胞系旧７Ｘ２は、Ｈｕｍ４　Ｖ＋。

に由来する遺伝子によりコードされる可変り鎖及び安定したＶ、及び■８の組合せを製造する可変トＩ鎖を用いる抗体を発現する（Ｍａｒｓｈなど、（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｂ：６５３１〜６５４４　；及びＰｏ１ｋｅなど、（＋９８２）、１ｍｍｕｎｏｂｉｏ１．１６３：９５〜１０９を参照のこと）　。ＢＩ７Ｘ２のためのＶ　ｌｌ鎖のヌクレオチド配列が、第４図に示される。Ｂ１７Ｘ２細胞系は、Ｄｒ、Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ　Ｐａ１ｋｅ、ＵｎｉｖｅｒｓｉｊＡｔｓ−Ｋｉｎｄｅｒｋｌｉｎｉｋ、Ｊｏｓｅｆ −５ｃｈｎｅｉｄｅｒ−５ｔｒ、２．８７００　Ｗｌ）ｒｚｐｕｒｇ、ＦＲＧから入手てきる。ＢＩ７Ｘ２はＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンに向けられ、そしてＴＡＧ−７２に対して特異的ではない。

しかしながら、Ｖ　ＩｔαＴＡＧのＣＤＲＩに由来する抗体のコンセンサス配列（第３図のアミノ酸残基３１〜３５）がＢ１７Ｘ２中に挿入され得（第４図のアミノ酸残基３１〜３７）、モしてＶ□αＴＡＧのＣ［）Ｒ２（第３図のアミノ酸残基５０〜６５）は旧７Ｘ２中に挿入され得る（第４図のアミノ酸残基５２〜６７）。ＣＤＲ３は、ＴＡＧ−７２のための抗体の結合に影響を及ぼさないいづれかのＤｌｌ及びＪｕ配列により置換され得るが、しかし特異的には、ＶｌｌαＴＡＧに由来°るそのＶ　Ｉ＋を有する抗体、たとえばＣＣ４６，ＣＣ４９，ＣＣ８３及びＣＣ９２のＣＤＲ３により置換され得る。そのような置換のための典型的な技法は、Ｈｏｒｔｏｎなど、、前記に示されている。

たとえばＶ、αＴＡＧ遺伝子に由来する免疫グロブリンＨ鎖のＣＩ＋ドメインは、既知の技法によりヒト配列に変えられ得る（ＵＳＰ第４、８１６．５６７号、Ｃａｂｉｌｌｙ、Ｇｅｎｅｎｊｅｃｈを参照のこと）、Ｃ，、ドメインは、種々の完全な又は短くされたヒトイソタイプ、すなわちＩｇＧ（たとえばＩｇＧ＋、　Ｉｇｃ２．　Ｉｇｃ３、及びＩｇＧ、）　、ＩｇＡ（たとえばＩｇＡｌ及びＩｇＡ２）、ＩｇＤ、　ＩｇＥ、　ＩｇＭ並びに個々のグループの種々のアロタイプのドメインであり得る（Ｋａｂａｔなど、（１９９１）、前記参照のこと）。

本発明の技法が付与される場合、ヒトＶ□遺伝子が、Ｈｕｍ４　Ｖ＋。

遺伝子と共に抗−ＴＡＧ−７２免疫グロブリンの組合せを生成するそれらの能力について試験され得ることは当業者にとって明らかであるはずである。ＶＬは、適切なＶｌ（を選択するためにｌＩｕｍ４　Ｖｔ遺伝子を用いて組合せのライブラリィ−を生成することによって、天然においては存在し得ないＩＩｕｍ４　Ｖ　＋及びＶ、１の無数の組合せを試験するためにＴＡＧ−７２に結合する能力を有するＶ　Ｉ＋をコードする遺伝子を単離するために使用され得る。それらの可能な技法の例は、ｆｄファージの表面」二に発現されるＦａｂ又は一本領抗体（５ＣＦＶ）型を用いて（Ｃｌａｃｋｓｏｎ、など、（＋９９１）、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４〜６２８　、又はＦｖ’　ｓ又はＦａｂｓの発現のためのλフアージ系を用いて（Ｈｕｓｅ、なと、（＋９８９）、５ｃｉｅｎｃｅ　、　２４６：１２７５〜１２８１）　、Ｖ＋、−Ｖｌ＋の組合せの組合せライブラリーのスクリーニングを包含する。しかしながら、本明細書に示される教授によれば、Ｅ、コリに５ＣＦＶ抗体をクローン化し、そしてその５ＣＦＶを分泌された可溶性タンパク質として発現することが可能である。Ｈｕｍ４　Ｖｃ遺伝子を含むＥ、コリに生成される５ＣＦＶタンパク質は、たとえば２膜フイルタースクリーニングシステムを用いて、ＴＡＧ−７２への結合のためにスクリーンされ１尋る（Ｓｋｅｒｒａ、など、（＋９９１）、Ａｒａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９６：１５１〜１５５）。

所望する遺伝子レパートリ−は、いづれかの適切な源、たとえばＴＡＧ−７２を含む腫瘍を有する患者の末梢血液リンパ球、膵臓細胞及びリンパ節から得られたヒト遺伝子材料から単離され得る。多くの場合、たとえば年齢、健康及び免疫応答の種々の段階のいづれか１つの段階においてを椎動物からの細胞（細胞Ｒ）を、核酸源として用いることによって、予備選択された活性のためのレパートリ− を一方に傾かせることが所望される。

所望する配列をコードする細胞が、単離され、モしてゲノムＤＮＡが１又は複数の制限酵素によりフラグメント化され得る。ＴＡＧ−７２に暴露された動物からの組織（たとえば−次及び二次リンパ器官、新生組織、末梢血液からの白血球細胞及びハイブリドーマ）は、選択された抗体産生Ｂ細胞についてプローブされ得る。通常の生殖系遺伝子に由来するＢ細胞間の変動性は、生産性再配列の間に生じる体細胞変異に起因する。

一般的に、生殖系遺伝子又は再配列された遺伝子のゲノムＤＮＡから製造されたプローブは、未知の細胞からの相同配列を見出すために当業者により使用され得る。たとえば、Ｈｕｍ４　ＶＬ及びＶｌｌαＴＡＧから得られる配列情報は、５ ′及び３′非翻訳フランキング領域を包含する、天然に存在する再配列された■ 領域のためにハイブリダイゼーションプローブを生成するために使用され得る。

ゲノムＤＮＡはその一部のために天然に存在するイントロンを含むが、但し、機能的スプライス　ドナー及びスプライスアクセプター領域が哺乳類細胞源の場合に存在したという条件を伴う。

さらに、　ＤＮＡはまた、ｃＤＮＡライブラリィ−からも得られる。■］又はＬ鎖可変ドメインをコードするｍＲＮＡが、単離の標準技法を用いて、適切な源、たとえば成熟Ｂ細胞又はハイブリドーマ培養物から単離され得る。ＤＮＡ又はアミノ酸はまた、フラグメントのアニーリング及び連結の標準技法により合成的に合成され、そして構成され得る（Ｊｏｎｅｓ、なと、（１９８６）、Ｎａｔｕｒｅ、　３２１　：５２２〜５２５；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎなど、（＋９８８）、Ｎａｔｕｒｅ、　３３２：３２３〜３２７；Ｓａｍｂｒｏｏｋ、など、（１９８９）、前記及びＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　など、（１９６３）、Ｊ、　Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓａｃ、　、　８５：２１４９〜２１５４を参照のこと）。Ｈ及びＬ鎖は、抗体活性を得るためにインビボで組合され得る（Ｅｄｅｌｍａｎ、など、（１９６３）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、５０ニア５３を参照のこと）。

本発明はまた、ＶＨαＴＡＧ相同体、好ましくはＶＨαＴＡＧのヒト相同体の遺伝子ライブラリィ−にも向けられる。“相同”とは、ＴＡＧ−７２に結合する能ノＪを有する立体構造を形成するために、ヒトサジグループ１ｖ生殖系遺伝子によりコードされるＩ、鎖可変領域に効果的に相同な■、鎖可変領域と結合できるＶ１１領域（Ｖ５．αＴ八へ生殖系遺伝子に必ずしも由来する必要はなく、又はそれに効果的に相同である必要もない）をコードする遺伝子を意味する。

好ましくは、遺伝子ライブラリィ−は、プライマー拡張反応又は本明細書に記載されるようなプライマー拡張反応の組合せにより生成される。■、、αＴＡＧ相同体は好ましくは、単離された形で存在し、すなわち、たとえばプライマー拡張反応剤及び／又は基質、ゲノムＤＮＡセグメント及び同様のもののような材料を実質的に有さない形で存在する。従って、本発明は、核領域の転写体を表わすメンセンンヤーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）又は可変領域を発現する遺伝子を含むゲノム材料のようなポリヌクレオチドコード鎖から成るレパートリ−からのＶ　ＩＩαＴＡＧ−コードＤＮＡ相同体をクローニングすることに向けられる。

■□αＴＡＧコード相同体をコードする核酸は、ＩｇＡ、　ＩｇＤ、　ＩｇＥ、　ＩｇＧ、又はＩｇＭを生成する細胞、最とも好ましくはＩｇＭ及びＩｇＧを生成する細胞に由来する。

■１１αＴＡＧコードＤＮＡ相同体は、プライマー拡張により生成され得る。本明細書で使用される場合、用語“プライマー”とは、核酸鎖に相補的であるプライマー拡張生成物の合成が、ヌクレオチド及び重合のための剤、たとえばＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素及び同様のものの存在下で及び適切な温度及びｐＨて誘発される条件下に置かれる場合、核酸制限消化物から精製されても又は合成的に生成されても、合成の開始の点として作用することができるポリヌクレオチドを言及する。

好ましくは、ＶｌｌαＴＡＧコードＤＮＡ相同体は、２種のプライマーが指数的に増幅されるべき核酸の個々のコード鎖のために使用される、二本鎖ゲノム又はｃＤＮＡのポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）増幅により生成され得る。最初のプライマーは、ナンセンス（−又は相補的）鎖の一部になり、そしてレパートリ−内のＶｎ　（＋）踏量で保存されるヌクレオチド配列にハイブリダイズする。ＰＣＲは、Ｍｕｌｌｉｓなど、（＋９８７）、Ｍｅｌｈ、Ｅｎｚ、、＋５５：３３５〜３５０；及びＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｅｒ１ｉｃｈ（出版者）（＋９８９）に記載されている。抗体産生細胞からのｍＲＮＡのＰＣＲ増幅は、０ｒｌａｎｄｉなど、（＋９８９）、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ　ｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　ＵＳＡ、　８６　：　３９８７〜３８３７に示されている。

好ましい方法によれば、ＶｌｌαＴＡＧコードＤＮＡ相同体は、ＴＡＧ−７２に結合できる立体構造を有する５ＣＦＶを形成するためにリンカ−を通して結合される。その５ＣＦＶ構造体は、Ｖ、−Ｌ−Ｖ、、又はＶｌｌ−Ｌ−Ｖ、形態て存在できる。５ＣＦＶの論議のためには、Ｂｉｒｄなど、（＋９８８）、５ｃｉｅｎｃｅ　、２４２・４２３〜４２６を参照のこと。適切なペプチドリンカ−領域の企画は、ＵＳ特許第４．７０４．６９２号、Ｌａｄｎｅｒなど、　、　Ｇｅｎｅｘに記載されている。

プライマーのヌクレオチド配列は、機能的な（結合できる）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が得られるように、Ｖ１１α丁ＡＧコードＤＮＡ相同体に実質的に隣接する部位で多くの免疫グロブリンＨ鎖遺伝子とハイブリダイズするように選択される。プライマーのヌクレオチド配列の選択は、種々の要因、たとえば所望するレセプターをコードする領域からの核酸上での距離、使用されるいづれかの第２プライマーに関しての核酸上でのそのハイブリダイゼーション部位、ハイブリダイズするレパートリ−における遺伝子の数及び同様のものに依存する。ＶＨａＴＡＧコードＤＮＡ相同体の多くの異なった核酸鎖にハイブリダイズするためには、プライマーは、その異なった踏量に保存されるヌクレオチド配列の実質的な補体であるべきである。

ペプチドリンカ−は、種々の遺伝子ライブラリーを調製するために使用されるポリヌクレオチドブライマーの一部である核酸配列によりコードされ得る。ペプチドリンカ−をコードする核酸配列は、プライマーの１つに結合される核酸から製造され得、又はペプチドリンカ−をコードする核酸配列は遺伝子ライブラリィ− を創造するために使用されるいくつかのポリヌクレオチドブライマーに結合される核酸配列に由来する。さらに、非相補的塩基又はより長い配列は、プライマー中に点々と配置されるが、但し次の条件下を満たすべきである。すなわち、プライマー配列は、非ランダムハイブリダイズし、そしてそれによって、ポリヌクレオチド合成条件下で拡張生成物を形成するために合成され又は増幅される鎖の配列との十分な相補性を有する（１１ｏｒｊａｎなど、（＋９８９）、Ｇｅｎｅ、７７：６１〜６８）。

相補的プライマーが合成され得る典型的なヒトＶ　ｌｌ配列は、Ｋａｂａ　ｔなど、（＋９９１）、前記：　Ｈｕｍｐｎｒｉｅｓなど、（１９８８）、Ｎａｔｕｒｅ、　３３１　：４４６〜４４９　：　５ｃｈｒｏｅｄｃｒなと、（＋９９０）、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ口、八ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８７：６１４０〜６１５０　：　Ｂｅｒｍａｎなと、（１り８８）、ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ、７：７２７〜７３８；　Ｌｅｅなと、８８・２４３２〜２４３６に示される。ＶＨコードＤＮＡ相同体を生成するためには、従って第１プライマーが、免疫グロブリン遺伝子及び同様のものの、Ｊ領域、Ｃ旧領域、ヒンン領域、ＣＨ２領域又はＣＩ＋３領域内の保存された領域にハイブリダイズするように（すなわち前記領域に相補的である）選択される。従って、第２プライマーが、リーダー又は第１骨格領域をコードするその部分において■□αＴＡＧコードＤＮＡ相同体の５′ 端で、保存されたヌクレオチド配列とハイブリダイズするように選択される。

他方、ペプチドリンカ−をコードする核酸配列は、適切なベクターの一部として企画され得る。本明細書で使用される場合、用語“発現ベクター”とは、それらが操作的に結合される遺伝子の発現に向けられ得る核酸分子を言及する。Ｖｌｌ αＴＡＧコードＤＮＡ相同体が操作的に連結されるベクターの選択は、当業界において良く知られているように、所望される機能的性質、たとえば複製又はタンパク質発現、及び形質転換される宿主細胞（真核又は原核細胞）に直接的に依存し、それらは組換え［）ＮＡ分子を構成する業界において固有の限界である。好ましい態様においては、使用される真核細胞発現ベクターは、真核細胞において効果的である選択マーカー、好ましくは耐薬物性選択マーカーを包含する。

原核細胞と適合できる発現ベクターは当業界において良く知られており、そしていくつかの市販源から入手できる。原核細胞のために適切な典型的ベクタープラスミドは、ＢｉｏＲａｄ　ｌ、ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｉｃｈｍ−ｏｎｄ、　ＣＡ）から入手できるｐＵｃ８．　ｐＵｃ９．　ｐＢＲ３２２、及びｐＢＲ３２９、及びＰｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｇ、　ＮＪ）から入手できるｐｐｔ、及びｐＫＫ２２３である。

真核細胞と適合できる発現べ゛フタ−、好ましくはを椎動物細胞と適合できる発現ベクターがまた使用され得る。真核細胞発現ベクターは当業界において良く知られており、そしていくつかの市販源から入手できる。典型的には、所望するＤＮＡ相同体の挿入のための便利な制限部位を含むそのようなベクターが供給される。真核細胞のために適切な典型的ベクタープラスミドは、ｐｓＶ２ｎｅｏ及びｐＳＶ２ｇｐｔ（ＡＴＣＣ）、ｐｓＶＬ及びｐＫｓＶ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＢＰＶ−１／ＰＭＬ２ｄ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏ−ｎａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　Ｉｎｃ、）　、及びｐＴＤＴｌ　（ＡＴＣＣ）である。

Ｖ　ｎａＴＡＧコードＤＮＡ相同体の遺伝子を発現するためにウィルス発現ベクターの使用がまた、意図される。本明細書で使用される場合、用語“ウィルス発現ベクター”とは、ウィルスゲノムの長い末端反復（シＴＲ）領域に由来するプロモーター配列を含むＤＮＡ分子を言及する。典型的なファージは、λファージ及び「ｄファージを包含する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、など、（１９８９）、Ｍｏ１ｅｃａｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎ−ｕａｌ、　（第２版）、及びＭｃＣａ［ｅｒｔｙなど、（＋９９０）、Ｎａｔｕｒｅ、　６３０１＋５５２〜５５４を参照のこと）。

次に、Ｖ１１αＴＡＧ１１αＴＡＧコ一ドＤＮＡ相同−の集団が、共有制限部位でエンドヌクレアーゼにより切断される。種々の方法が、相補的付着末端を通してベクターにＤＮＡを操作的に連結するために開発されて来た。たとえば、相補的付着末端が、前で論ぜられたように、適切に企画されたポリヌクレオチド合成の使用により、プライマー拡張反応の間、Ｖ　１１αＴＡＧコ一ドＤＮＡ相同体中に構築され得る。次に、ベクター及びＤＮＡ相同体の相補的付着端が、単位の二本鎖ＤＮＡ分子を生成するために操作可能的に結合（連結）される。

Ｈｕｗ＋４　Ｖｔ　コード［ｌＮＡ及びＶｎαＴＡＧコード１）ＮＡ相同体集団の制限フラグメントが、切断されたベクターにランダムに連結される。

種々のランダム集団が、同し読み取り枠に及びベクターのプロモーターの制御下で位置する、Ｖ１１αＴＡＧ１１αＴＡＧコ一ドＤＮＡ相同ｍ４■、コードＤＮＡを有する個々のベクターにより生成される。

次に、得られた一本鎖構造体が、複合Ｈｕｍ４　Ｖ、　、　Ｖ、αＴＡＧ相同体一本鎖抗本領増幅及び／又は発現を付与するために適切な宿主中に導入される。

本発明の組換えＤＮＡ分子による適切な細胞宿主の形質転換が、使用されるベクターの型に典型的には依存する方法により達成される。原核宿主細胞の形質転換に関しては、たとえばＣｏｈｅｍなと、（１９７２）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅ。

ＵＳＡ、　６９　：２１１０　、及びＳａｍｂｒｏｏｋなど、（１９８９）、前記を参照のこと。

ｒＤＮＡを含むレトロウィルスベクターによるを椎動物細胞の形質転換に関しては、たとえばＳｏｒｇｅなと、（１９８４）、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、４：１７３０〜１７３７　；　Ｇｒａｈａｍなど、（１９７３）、Ｖｉｒｏｌ、　、　５２：４５６；及びＷｉｇｌｅｒなと、（＋９７９）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ、７６　：１３７３〜１３７６を参照のこと。

宿主として使用され得る典型的な原核細胞株は、Ｅ、コリ、バシラス及び他の腸内細菌、たとえばサルモネラ　チフィムリウム（Ｓａｌｍｏ−ｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍａｒｉｕｍ）及び種々のブスイドモナス（Ｐｓｅａｄｏｍｏｎａｓ）を包含する。通常の真核細胞微生物は、Ｓ、セレビシアエ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びピチア　パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）を包含する。通常の高等真核宿主細胞は、５ｐ２１０．　ＶＥＲＯ及びＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＩＯ）細胞系及びＷ１３８．　ＢＨＫ、　ＣＯ５ −７並びにＭＤＣＫ細胞系を包含する。さらに、）Ｉｕｍ４　Ｖｔを生成するいづれかの細胞系、たとえばＩ］１７Ｘ２ヒト細胞系が、ＴＡＧ−７２への結合を可能にするｌ＋ｕｍ４　ＶＬに相補的なＶ□遺伝子の導入のための受容体ヒト細胞系として使用され得ることもまた明らかである。たとえば、Ｂ１７Ｘ２１（鎖は良く知られた方法により内因性１１鎖を生成しないように遺伝的に変性され得・この場合、生成される抗体のグリコジル化パターンはヒト由来のものであり、そして非ヒト由来の゛ものではない。

都合良く形質転換された細胞、すなわちベクターに操作可能的に連結される複合Ｈｕｍ４　Ｖｂ　、　ＶＨαＴＡＧ相体−水路抗体をコードする遺伝子を含む細胞が、リガンドへのレセプターの結合を検出するためにいづれか適切な良く知られた技法により同定され得る。好ましいスクリーニングアッセイは、ＴＡＧ−７２への複合）１ｕｍ４　ＶＬ　、ＶｌｌαＴＡＧ相同体−末鎖抗体の結合が検出可能なシグナルを、直接的に又は間接的に生成するアッセイである。生成性１１ｕｍ４　Ｖｔ、及びＶｌｌαＴＡＧ相同体組合せ相同心組スクリーニング、又は換言すれば、ＴＡＧ−７２への効果的抗原結合部位のための試験は、たとえば放射性ラベルされた又はビオチニル化されたスクリーニング剤、たとえば抗原、抗体（たとえばＢ７２．３　、ＣＣ４９，ＣＣ８３，ＣＣ４６，ＣＣ９２，ＣＣ５０，ＣＣＩＩ及びＣＣｌ５）　、又は抗−イジオタイプ抗体を用いることによって（Ｉｌｕｓｃｔｊと、、前記、及びＳａ＋ｎｂｒｏｏｋなと１．前記を参照のこと）；又は５ＣＦＶ横遺体のＮ１１２−又はＣ００ＩＩ−末端へのマーカーペプチドの使用（こより（１１ｏｐｐなど、、（１９８８）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：１２０４〜１２１０を参照のこと）可能になる。

もちろん、ｌＩｕｍ４　Ｖ、−コードＤＮＡ及びＶ　ｕ　ａ　ＴＡＧ　−：＋− ドＤＮへ相同体は、個々のポリペプチド鎖（たとえばＦｖ）として、又（ま完全な又はフラグメント化された不変領域（たとえばＦａｂ及びＦ　（ａｂ’　）２）により表わされ得る。従って、Ｈｕｍ４　Ｖ、−コードＤＮＡ及びＶｌｌαＴＡＧ−コードＤＮＡ相同体は、それぞれＣＬ又はＣｕ又（まそのフラグメントを含むベクター中に個々に挿入され得る。０力為（こ適切なベクターを調製するかについての教授については、ＥＰＯ第０３６５９９７号（Ｉｌｅｚｅｓなと、、Ｔｈｅ　Ｄｏｗ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）を参照のこと。

複合１１ｕｍ４　Ｖｌ、　、Ｖｎ抗体のＬ鎖及び１１鎖をコードするＤＮ八へ己列は、別の発現ビークル又は同し発現ビークル中に挿入され得る。同し生物内において、同しか又は°異なったベクター上↓こ同時発現される場合、官能的活性Ｆ５が生成される。Ｖ　ｌｌαＴＡＧ−コードＤＮＡ相同体及びＨｕｍ４　Ｖ、ポリペプチドが異なった生物（こ発現される場合、それぞれのポリペプチドが単離され、そして次に、Ｆｖを斤ニ成するために適切な培地において組合される。

Ｇｒｅｅｎｅなど、、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ’＋Ｉｏｌｃｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、第９巻、Ｗｉｃｋｎｅｒなと１．；及びＳａｍｂｒｏｏｋ？、Ｃと、。

前記を参照のこと。

続く組換えは、ｌｕｍ４　Ｖ、−コートＤＮＡ相同体を生成するｔこめ（こＶ＋＋ａＴＡＧ−コートＤＮＡ相同体を使用してのｌｌｕｍ４　ＶＬ　−コードＤＮＡ配列の切断及び除去を通してもたらされ得る。ｌｌｕｍ４　Ｖ、−コー）”ＤＮＡ相同体を生成するためには、まず、免疫グロブｌ：／Ｌ鎖遺伝子皮び同様のものの、Ｊ領域又は不変領域内での保存されｔコ領域とハイブリダイズする（すなわちそれに相補的である）プライマーが選択される。第２プライマーはコード（＋）鎖の一部になり、そして（−）踏量に保存されるヌクレオチド配列にハイブリダイズする。

Ｈｕｍ４　Ｖｔ、−：ｌ−ドＤＮＡ相同体は、Ｖ　ｕ　ａ　ＴＡＧ　−コード［ｌＮ八へ同体を含むベクター中に連結され、それによって発現ベクターの第２集団が創造される。従って、本発明は、ポリヌクレオチドコード鎖、たとえば可変領域、又は可変領域の転写体を表わすｍＲＮ＾を発現する遺伝子を含むゲノム材料から成るレパートリ−からＨｕｍ４　Ｖｔ　−コードＤＮＡ相同体をクローニングすることに向けられる。従って、■ＨαＴＡＧ−コードＤＮＡ相同体及びＨｕｍ４　ＶＬ−コードＤＮＡ相同体が可能である。

本発明は、効果的に相同の可変領域及び不変領域アミノ酸配列を含むように抗体可変及び不変領域を遺伝子的に変性することにも関する。一般的に、可変領域の変更は、レセプターの抗原結合性質を改良し又は変性するために行なわれるであろう。抗原レセプターの不変領域の変更は、生物学的性質、たとえば補体固定、膜との相互作用及び他のエフェクター機能を改良し又は変性するために行なわれるであろう。

“効果的に相同”とは、可変領域の主要構造の差異が抗原レセプターの結合特性を変更しない概念を意味する。通常、Ｉ）ＮＡ配列は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％及び最とも好ましくは少なくとも９０％のＤＮＡ配列の活性部分が相同である場合、第２　ＯＮへ配列に対して効果的に相同である。そのような変更は、得られる抗原レセプターがその所望する性質を保持する限り、効果的に相同のアミノ酸配列において許され得る。

配列の相同位置間に保存性差異が存在する場合、それらは一定環境下で同等物として見なされ得る。潜在的に同等のアミノ酸の一般的カテゴリーが下記に示され、ここでグループ内のアミノ酸は、次のグループにおいて他のアミノ酸と置換され得る：　（１）グルタミン酸及びアスパラギン酸：　（２）疎水性アミノ酸、たとえばアラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン：　（３）アスパラジン及びグルタミン；　（４）リシン及びアルギニン及び（５）トレオニン及びセリン。

ヌクレオチド置換についての典型的な技法は、適切な読み取り枠が維持される限り、種々のヌクレオチドの付加、欠失、又は置換を包含する。典型的な技法は、ポリヌクレオチド介在の部位特異的変異誘発の使用、すなわち変異を含む鎖を生成するためにオリゴヌクレオチドの拡張のための鋳型としての一本鎖の使用（Ｚｏｌ　Ｉｅｒなど。

（＋９８２）、Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　、　ＩＯ＋６４８７〜６５００：Ｎｏｒｒｉｓなど、　（＋９８３）、こと）、及びポリメラーゼ鎖反応、すなわち選択された変更を組込むように配列特定化オリゴヌクレオチドを用いてインビトロでＤＮＡを指数的に増幅することの使用（ＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｅｒ１ｉｃｈ、（１９８９）；及びＨｏｒｔｏｎなと、前記を参照のこと）を包含する。

さらに、抗体は、変性されたそれらの不変領域ドメインを有することができ、すなわち抗体ポリペプチド鎖のＣ１，、ＣＩｌ＋、ヒンジ、ＣＩ＋２．ＣＨ３及び／又はＣＩ＋４ドメインは欠失され、挿入され又は変更され得る（ＥＰＯ第３２７３７８号、ＡＩ、　Ｍｏｒｒｉｓｏｎなど、、　Ｔｈｅ　Ｔｒｕｓｔｅｅｓ　ｏｒＣｏｌｕｍｂｉａ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；ＵＳＰ第４．　（ｉ４２．３３４号、Ｍｏｏｒｅなど、　、　ＤＮＡＸ　；及びｕｓｐ第４．７０４．６９２号、Ｌａｄｎｅｒなど、　、　Ｇｅｎｅｘを参照のこと）。

さらに、抗体は毒性されたそれらの不変領域ドメインを有し、すなわち抗体ポリペプチド鎖のＣＬ、ＣＩ（１，ヒンジ、ＣＩ＋２．　Ｃ１１３及び／又はＣＨ４ドメインは欠失され、挿入され又は変更され得る（ＥＰＯ第３２７、３７８号、ＡＩ、　Ｍｏｒｒｉｓｏｎなど、、ｔｈｅ　Ｔｒｕｓｔｅｅｓ　ｏｆ　Ｃｏｌｕｍｂｉａ　Ｕｎｉｖ−ｅｒｓ　ｉ　ｔｙ　；ＵＳＰ第４．６４２．３３４号、Ｍｏｏｒｅなど、、ＤＮＡＸ、及びｕｓｐ第４．７０４．６９２号、Ｌａｄｎｅｒなと、　、　Ｇｅｎｅｘを参照のこと）。

最終ＤＮＡ構造体が得られたならすぐに、複合ｔｌｕｍ４　ＶＬ、　、　Ｖｕ抗体がブリスタンドよりプライムされたマウスの腹腔中に宿主細胞を注射し、そして適切な時間（約１〜２週）の後、マウスから腹水を収穫し、ここでひじょうに高い力価の均質複合Ｈｕｍ４　ＶＬ　＋　Ｖｕ抗体が生成され、そして当業界において良く知られた方法（Ｓｔｒａｍｉｇｎｏｎｉ。

など、（１９８３）、Ｉｎｔｌ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、３１：５４３〜５５２を参照のこと）により複合Ｈｕｍ４　Ｖい　■１抗体を単離することによって、多量に生成され得る。宿主細胞は動物において腫瘍としてインビボで増殖され、その血清又は腹水が約５０ｍｇ／−までの複合）１ｕｍ４　Ｖｔ、　＋　Ｖｕ抗体を供給することができる。通常、マウス又はラット中への約１０’〜１０’個の組織適合性宿主細胞の注射゛（好ましくは、腹腔内）は、数週間後、腫瘍形成をもたらすであろう。原核及び真核細胞の発酵培養ブイヨンから、又はＥ、コリ細胞の封入体から複合Ｈｕｍ４　ＶＬ　、　Ｖ＋＋抗体を得ることが可能である（Ｂｕｃｋｈｏｌｚ　ａｎｄ　Ｇｌｅｅｓｏｎ（１９９１）、ＢＩＯ／ＴＥＣ）ＩＮＯＬＵＧＹ、９；１０６７〜１０７２を参照のこと）。次に、複合１（ｕｍ４　Ｖｔ　＋ＶＨ抗体が良く知られた方法により採集され、そして処理され得る（一般的には、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、第１及び■巻、ｔ、ｅｒｂｏｖｔｔｓ。

１、ａｎｄ　Ｐｅｒｎｉｓ、Ｂ、、　（１９７９＆　１９８１）Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｎ、Ｙ、及びＨａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗｅｉｒ、Ｄ、、（１９７Ｂ）［ｌＩａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｓｔ几ｏｕｉｓ、ＭＯ，を参照のこと）。

次に、複合Ｈｕｍ４　Ｖｔ　、ＶＨ抗体は、一般的に追加の使用のために安定した抗体溶液を付与する、種々の緩衝溶液、たとえばリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に貯蔵され得る。

使用複合１１ｕｍ４　ＶＬ　、Ｖｕ抗体は、種々の蒸処理に使用するためのユニークな利点を提供する。悪性細胞及び局在化された腫瘍に特異的に結合するが、しかし主要器官における正常な細胞、たとえば線維腎細胞、内皮細胞又は外皮細胞には結合しない能力の他に、複合Ｈｕｍ４　ＶＬ　、Ｖ１１抗体はＡＮＩＩＡ応答を最少にし又は排除するために使用され得る。さらに、ＴＡＧ−７２は種々のエピトープを含み、そして従って、Ｈｕｍ４　ＶＬとの組合せにより種々のＶ　１１を利用するいくつかの異なった複合Ｈｕｍ４　ＶＬ、　、　Ｖｎ抗体を投与することが所望される。

特に、複合１１ｕｍ４　Ｖ　ｔ　、　Ｖ　ｕ抗体は、診断、治療、イメージング及びバイオセンサーへのインビボ及びインビトロ使用に有用であるが、イリし、これだけには限定されない。

複合Ｈｕｍ４　Ｖｌ、〜’ＩＩ抗体は医薬的に許容できる、非毒性殺菌キャリヤー中に導入され得る。本発明の注射用組成物は、懸濁形又は溶液形のいづれても良い。溶液形においては、複合体（又は別の成分を所望する場合）は、医薬的に許容できるキャリヤーに溶解される。そのようなキャリヤーは、適切な溶媒、保存剤、たとえばベンジルアルコール（必要とされる場合）及び緩衝液から成る。

有用な溶媒はたとえば、水、水性アルコール、グリコール及びホスホネート又はカーボネートエステルを包含する。そのような水溶液は一般的に、５０体積％よりも多くない有機溶媒を含む。

注射用懸濁液は、アジュバントを含んでも又は含まなくても良いが、キャリヤーとして液体懸濁媒を必要とする。その懸濁媒はたとえば、水性ポリビニル−ピロリドン、不活性オイル、たとえば植物油又は高く精製された鉱油、又は水性カルボキシメチルセルロースであり得る。適切な生理学的に許容できるアジュバント（複合体を懸濁液に維持する必要がある場合）、増粘剤、たとえばカルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチン及びアルギネートから選択され得る。多くの界面活性剤、たとえばレシチン、アルキルフェノール、ポリエチレンオキシドアダクト、ナフタレンスルホネート、アルオルベンゼンスルホネート、及びポリオキシエチレンソルビタンエステルが、懸濁媒として有用である。

液体懸濁媒の疎水仕度、密度及び表面張力に影響を及はす多くの物質が、個々の場合において注射用懸濁液の製造において助けることができる。

たとえば、シリコーン消泡剤、ソルビトール及び糖は有用な懸濁剤である。

複合Ｈｕｍ４　ＶＬ、　、　Ｖｏ抗体及び治療剤の複合体の調製及び投与法は良く知られており、又は容易に決定される。さらに、適切な投与量は、患者の年齢及び体重及び使用される治療剤に依存し、そして良く知られており、又は容易に決定される。

複合Ｈｕｍ４　ＶＬ　、Ｖｏ抗体及びイメージングマーカーの接合体は、ＴＡＧ −７２を発現する腫瘍を有し、そして次に、適切な検出手段によりイメージングマーカーの存在を検出する患者において、ヒト癌又はその転移のインビボ診断アッセイのために医薬的に有効な量で投与され得る。

複合Ｈｕｍ４　Ｖｃ　、　Ｖｎ抗体及びイメージングマーカーの接合体の投与及び検出、並びにイメージングマーカーに複合Ｈｕｍ４　Ｖｔ　、Ｖｎ抗体を接合する方法は、知られている方法により達成され又は容易に決定される。そのような接合体の投与量は、患者の年齢及び体重に依存して変化する。一般的に、その投与量は、正常な組織から異なった腫瘍部位を可視化し又は検出するために有効であるべきである。好ましくは、一度での投与量は、複合Ｈｕｍ４　ＶＬ抗体及びイメージングマーカーの接合体０．１ｍｇ〜２００　ｍｇ　（患者当たり）であろう。

複合Ｈｕｍ４　Ｖｌ　抗体に接合され得るイメージングマーカーの例は良く知られており、そしてγスキャナー又は手動性γプローブを用いて診断イメージングにより検出され得る物質、及び核磁気共鳴分光計を用いて核磁気共鳴イメージングにより検出され得る物質を包含する。

γスキャナーを用いて検出され得る物質の適切な（但し、制限されない）例は、　＋２！１．＋３１１，１″１９口１１ｎ、　１ＱｓＲ１，１６１３，”Ｃｕ、　８１６゜”’ｌｌｏ＋　１７Ｌｕ、１ＩＧＲ，Ｉ■Ｒｅ及び■″Ｔｃであり得る。核磁気共鳴分光計を用いて検出され得る物質の例は、ガドリニウムである。

複合Ｈｕｍ４　ＶＬ　、Ｖ□抗体及び治療剤の接合体は、ＴＡＧ−７２を発現する腫瘍を有する患者において、ヒト癌又はその転移のインビボ処理のために医薬的に有効な量で投与され得る。複合Ｈｕｍ４　ＶＬ抗体の“医薬的に有効な量” とは、医薬組成物における前記抗体（治療剤に接合されていない、すなわち裸の抗体、又は接合された抗体のいづれか）の鏝が、ＴＡＧ−７２への効果的な結合を達成するのに十分であるべきであることを意味するｉ典型的な裸の抗体治療は、複合体が癌及びエフェクター細胞、たとえばキラー細胞、たとえばＴ細胞又は単球の両者に結合するように、他の抗体により結合され又は組合されるヘテロニ官能価複合ＦＩｕｍ４ＶＬ　、Ｖ＋＋抗体を投与することを包含する。この方法においては、複合Ｈｕ＋ｎ４　Ｖ＋抗体−治療剤接合体は、癌部位に投与され、それによって治療剤に癌組織が直接的に暴露される。他方、裸の抗体治療も可能であり、ここで抗体依存性細胞毒性又は補体依存性細胞毒性が複合Ｈｕｍ４　ＶＬ抗体により介在される。

治療に使用され得る抗体−治療剤複合体の例は、放射性核種、たとえば目’ｌ、 ”ＹＬ”５Ｒｈ、”Ｓｃ＋”Ｃｕ％目Ｂｉ＋”’ＡＬＵ”Ｇａ、ｌ２ｓＩｔ目’ Ｒｅ。

…Ｒｅ、口Ｉ　Ｌ　ｕ　、　ｇ書ＭＴ、　１１８３．１２１１及び１ｌ１１ｎ、薬物、たとえばメトトレキセート、アドリアマイシン；生物学的応答変性体、たとえばインターフェロン及びトキシン、たとえばリジンに結合される抗体を包含する。

複合ｔ＋ｕｍ４　Ｖｔ　、　Ｖｕ抗体及び治療剤の接合体の調製及び投与法は良く知られており又は容易に決定される。医薬組成物は、単−投与形又は複合投与形で投与され得る。さらに、適切な投与量は、患者の年齢及び体重、及び使用される治療剤に依存し、そして良く知られており又は容易に決定される。

複合Ｈｕｍ４　ｖＬ　、　Ｖｕ抗体及び特にその複合Ｈｕｍ４　ＶＬ　、　ＶＨ −末鎖抗体がラジオイムツガイシド手術（ＲＩＧＳ）のために特に適切である。

ＲＩＧＳにおいては、イメージングマーカーによりラベルされた抗体が、ＴＡＧ −７２を発現する腫瘍を有する患者に注射される。抗体は、腫瘍に局在し、そして手動性γ検出プローブ（ＧＤＰ）により検出され参照のこと）。典型的なＧ叶は°、Ｎｅｏｐｒｏｂｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　Ｃｏｌｕｍｂｕｓ。

ＯＨから入手できるＮｅｏｐｒｏｂｅ（ＴＭ）スキャナーである。複合＋１ｕｍ４　Ｖｔ。

ＶＨ−末鎖抗体の比較的小さなサイズ及びヒト特徴は、完全な身体クリアランスを促進し、そして従って、手術が効果的に開始される前と注射の後との待ち時間を感じるであろう。

複合Ｈｕｍ４　ＶＬ　、ＶＩＩ抗体−イメージングマーカー接合体の投与及び検出は、良く知られている方法により達成され得、又は容易に決定され得る。

投与量は患者の年齢笈び体重に依存して変化するが、しかし一般的には、一度での投与量は、患者当たり約Ｏ１１〜２００　ｍｇの抗体−マーカー接合体が投与される。

実施例下記実施例は複合１１ｕｍ４　ｖｌ、　、Ｖ＋＋抗体の構築と発現を単に例示するのを目的とするものであり本発明を限定するものではない。ことわらない限り温度の単位はすべて００である。ことわらない限り％の単位はすへて重量％である。

実施例ＩＣＣ４９とＣＣ８３を、プローブとしてｐＮＰ９を用いてそれぞれのハイブリドーマから単離した（図５参照）。ヨーロッパ特許第ＥＰＯ０３６５９９７号に記載されている方法にしたがって、ＣＣ４９Ｖｕはｐ４９ｇ！−２，３から入手しく図６参照）およびＣＣ８３Ｖ　Ｈハｐ８３ｇｌ−２，３かう得り（図７　参照）。

抗体の軽鎖をコードするＤＮＡは、いくらが改変したＭａｄｉｓｃｎら、Ａｍ、　、１．　Ｍｅｄ、　Ｇｅｎｅ　ｔ、　、　２７巻、　３７９〜３９０頁、１９８７年のプロトコルにしたがってヒトの血液の試料がら単離した。紫色キャップの５ｙｎ！バキユテーナー管２木に（抗血液凝固剤としてＥＤＴＡが入っている）、血液を満たし周囲温度下で２時間保管した。これらの試料を２本の４．５４遠心分離管に移した。容管に、フィルター滅菌を行った赤血球溶解液緩衝液（０，１５５ＬＩ　ＮＨ，ＣＩおよび０．１７Ｍ　トリフ、　ｐＨ７，６５を９川の容積比で含有）２２．５Ｊを添加し３７℃で６．５分間インキュベートした。

遠心分離管内容物は溶解した赤血球のため暗赤色になった。これらの試料を、ＳＳ　−３４のローターと５ｏｒＶａｌｌ遠心分離器を用イ、５．３００ｒｐｍ（３，４００ｋｇ）で９℃にて１０分間遠心分離した。得られた白血球のペレットを０．１５Ｍ　ＮａＣｌ水溶液水溶液２巾を上記と同様にして遠心分離した。得られたペレットを、０．　１５ＭＮａＣｌ水溶液５００μＩ２中に再懸濁させ、１．５ｍＬの微量遠心分離管に移した。その白血球を、こんどは微量遠心分離器で、３，０００　ｒｐｍにて３分間ふたたびペレット化した。ごくわずかの赤血球がペレットに残った。上清％液を２本の微量遠心分離管からデカントした後、高ＴＥ緩衝液（１００ｍｌＪトリス、ｐＨ８．　０）０．　６−を添加した。これらの管を１０分間および１５分間まで振盪した。得られた粘稠溶液を、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの前記文献に記載されているのと同様に、フェノール、フェノール −クロロホルムおよび最後にクロロホルムだけで抽出した。抽出してプールしたＤＮＡ溶液３．９　ｍＬニＮａＯＡｃ（３Ｍ．　ｐＨ５　）　０．４　ｍＬおよび１００％エタノールＩＯｍＬを添加した。白色曳糸性の沈澱を黄色ピペットチップ（ｙｅｌｌｏｗ　ｐｉｐｅｔｔｅ　１ｉｐ）で回収し、新しいエツペンドルフ管（Ｅｐｐｃｎｄｏｒｆ　ｔｕｂｅ）に移し７０％エタノールで一回洗浄し最後に１００％エタノールで洗浄した。得られたＤＮＡを減圧下で一分間乾燥し、次いて脱イオン水０．　７５ｍ１に溶解した。得られた溶液の２０μＬを１．０ｍＬまで希釈し、ＯＤ２６０ｎｍ値を測定し記録した。原溶液のＤＮＡの濃度は０、３０ｍｇ／ｍＬと算出された。

オリゴヌクレオチド（オリゴ）を、０．２μＭ固体支持体カラムで開始する３８０　Ａ　ＤＮＡ合成器（米国、カリフォルニア州、フォスターのＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）でホスホルアミダイト化学反応を用いて合成した。

最終生成物の保護基は濃アンモニア溶液中で５５℃にて１２時間加熱することによって除いた。オリゴヌクレオチドの粗製混合物（約１２　０Ｄ２６０止単位）を、１６％ポリアクリルアミド尿素ゲルに加えて電気泳動に付した。ゲル中のＤＮＡは短波長の紫外光線で視覚化した。バンドを切取り、そのゲルピースを６５ ℃に２時間加熱することによってＤＮＡを溶出させた。最終の精製は次のようにして行った。

溶出されたＤＮＡ溶液をＣ−１８　５ｅｐ−Ｐａｃ　（登録商標）カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に加え、捕捉されたオリゴヌクレオチドを６０％メタノール溶液で溶離した。得られた純品のＤＮＡを脱イオン蒸留水（ｄｄＨ２０）に溶解し、次いて０Ｄ２６０　ｎｍを測定することによって定量した。

ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）　ＤＮＡ増幅キット（米国、カリフォルニア州、工メリービルのＣｅｔｕｓ　Ｃｏｒｐ、社）を用いて、メーカーの指示にしたがって組立てたＰＣＲによってＢａｍ４　ＶＬ生殖系遺伝子をクローン化した。熱サイクラ−を使用して、変性（９４℃）、アニーリング（４５℃）および延長（７２℃）のステップを行った。１サイクル中のこれら３ステツプは各々４分間行い、合計３０サイクル行った。

Ｂａｍ４　Ｖ＋生殖系遺伝子中の調節配列の上流に、ユニークＣ１ａｌ制限酵素部位がある。それ故に、ＰＣＲ法に使用する５′末端のオリゴヌクレオチド（ＨＵＭＶＬ（＋）と呼称する、図８〕はこのＣｌａｌ部位を含有するように設計した。

ＨＵＭＶＬ（−１）と呼ばれる３′末端オリゴヌクレオチド（図８）は。

ユニーク旧ｎｄｍ部位：有効なスプライスドナー機能を行うことができる、スプライシング部位の後の充分なマウスイントロン配列；Ｂａｍ４　ＶＬの■、エキソンの３′末端に隣接し、■Ｌ領領域ＣＤＲ３とＦＲ４の配列を完成するヒトＪ４配列（図９と１０参照）、ＣＤＲ３の９４位のチロシン残基をコードするためのヌクレオチド：およびＢａｍ４　ＶＬのＶＬエキソンの３′末端に近゛い２９のヌクレオチド（図３のオリゴヌクレオチド）ＩＵＭＶＬ（−１）に下線を引いて示す。そしてこのヌクレオチドはヒトＤＮＡでアニールする）を含有していた。ＰＣＲ用のこの３′末端オリゴヌクレオチドは合計して、非アニーリングセグメント〔ワギング・テール（Ｗａｇｇｉｎｇ　ｔａｉｌ）］の６９個のヌクレオチドを含む９８塩基の長さのものであった。Ｂａｍ４　ＶＬ遺伝子標的およびＰＣＲに用いられるオリゴヌクレオチドの概略図を図１１に示す。

ＰＣＲ反応は１００μｌの反応容積で合計１μｇのヒトＤＮＡで行った。

プライマーのＨＵＭＶＬ（−）とＨＵＭＶＬ（＋）の初期濃度は各々１００１００ｐであった。Ｔａｇポリメラーゼ（２，５単位／反応）を添加する前に、鉱油１００μＬを使用して試料をおおった。対照の試料を以下に概略述べるようにして作製した。試料は９５℃で３分間加熱した。ＰＣＲが完了したならば、アガロースゲル電気泳動によって分析するため試料２゜μＬを取出した。

クローン化すべき）ｌｕ＋ｎ４　ＶＬ　ＤＮＡフラグメントの公知の大きさおよびその遺伝子を標的とするのに用いられるオリゴヌクレオチドの大きさに基づいて、１０９９ｂｐの生成物を予想した。この大きさに相当するバンドが反応で得られた（図１２のレーン７に示す）。

Ｂａｍ４　ＶＬ遺伝子をクローン化し次いで発現するのに適切なプラスミドを調製するため、プラスミドｐｓＶ２ｎｅｏをＡＴＣＣがら入手し、次いで修飾した。ｐｓＶ２ｎｅｏは以下に述べるようにして修飾した（図１３参照）。

ｐＳＶ’２ｎｅｏ−１０１を次のようにして製造した。精製ｐｓＶ２ｎｅｏ　ｌＯｕ　ｇをＨｉｎｄｌ１４０単位を用いて３７℃で１時間消化した。線形化プラスミドＤＮＡをエタノールで沈澱させ、洗浄し、乾燥し水１０μＬに溶解した。

ｌ。

ｍＭのｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを各々２μＬづつならびに１０ｘリガーゼ緩衝液２μＬを添加した。ＤＮＡポリメラーゼ１５単位（１ μＬ）を添加して旧ｎｄＩＩ［の粘着末端を平滑にした。得られた反応混合物を室温で３０分間インキュベートした。反応混合物を６５℃で１５分間加熱することによって酵素を不活性化した。反応混合物をフェノールで抽出し、エタノールで沈澱させてベレットを得た。そのペレットを脱イオン蒸留水２０μｍに溶解した。得られた溶液の２μＩ（約１μｇ）を標準の連結反応液２０μＬに添加し、次いで４℃にて一夜インキユベートした。

イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｄ）＋１のコンピテント細胞を、メーカーの指針にしたがって、連結ミックス（米国、カリフォルニア州、サンディエコ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）　１μＬおよびｌＯｕＬで形質転換した。アンピシリン耐性のコロニーを、１００　ｕ　ｇ／＋ｎＬのアンピシリンを含有するＬＢプレートで得た。２．０ｍＬ培養液で一夜培養して、選択されるクローンを調製した。プラスミドＤＮＡの試料を、１ｌｉｎｄｌｌｌとＢａｍＨＩで別個に消化し、正しい代表的クローンを選択した。

生成しただプラスミドｐｓＶ２ｎｅｏ−１０１を、サイズマツピング（ｓｉｚｅｍａｐｐｉｎｇ）と旧ｎｄｎｌによって消化されないことによって確認した。

ｐｓＶ２ｎｅｏ−１０のミニ−ライゼート（＋ｎ１ｎｉ　Ｉｙｓａｔｅ）由来のＤＮＡの試料を、Ｂａｍｔ（Ｉ　５０単位を用い３７℃で２時間消化して調製した。線状化プラスミドを、４％ＤＮＡポリアクリルアミドゲルから、電気溶出法で精製した。そのＤＮＡの両末端は、ｐｓＶ２ｎｅｏｉｏＩの旧ｎｄｌ［ｒ部位について先に述べたようにして、ｄＮＴＰとクレノーフラグメントを用いてＢａ＋ｎＨＩ部位に充填することによって平滑にした。

多数のクローン化部位を含有するポリリンカーセグメントをｐｓＶ２ｎｅ。

−１０１のＢａｍ８１部位に組込んでｐｓＶ２ｎｅｏ−１０２を創製した。等モル量の二ツノオリゴヌクレオチドＣＩ（＋）とＣＨ（−）（図１４ニ示す）を、９０℃で３分間加熱し次いで５０℃まで冷却することによってアニールした。アニールされたリンカ−ＤＮＡと末端を平滑化されたｐｓＶ２ｎｅｏ−１０１とを、４０：１のモル容積て標準の連結反応後２０μＬに添加した。イー・コリＤＨＩを、連結混合物（ｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）０．５μＬと５μして形質転換した。１２個のアンピシリン耐性コロニーをプラスミドＤＮＡの分析を行うために選択し、リンカ−が組込まれたか否かを確認した。

ミニ−ライゼートプラスミドＤＮＡを旧ｎｄｌＩ［で消化したところ、上記クローンのうちの６個にリンカ−が組込まれていることが明らかになった。いくつかのクローン由来のプラスミドＤＮＡの配列を決定して、ｐｓＶ２ｎｅｏ１０１に平滑末端で連結されたリンカ一単位の数ならびにそのリンカ−との相対配向度を決定した。配列の決定を行うクローンは旧ｎｄｌｌ［による正の消化に基づいて選択した。

５ｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）配列決定キット（米国、オハイオ州、クリーブランドのＵｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、社）を用いてそのＤＮＡの配列を決定した。プライマーのＮＥＯ＋０２ＳＩＥＱを、配列決定を行うために用いたがそれを図１５に示す。それはベクターのＢａｍ１ｌ　Ｉ部位から上流に位置する配列に対して相補的である。イー・コリのミニ −ライゼートから単離したプラスミドＤＮＡ３ｕｇ〜５μｇを配列決定に用いた。このＤＮＡを、メーカーの指示にしたがって変性し沈澱させてからアニールした。電気泳動を１５００ボルトで実施し、ゲルを乾燥してから、Ｋｏｄａｋ　Ｘ線フィルムに対して露出させた。データを、日立のＤＮＡ５ＩＳ　（登録商標）コンピュータプログラムを用いて処理した。

図１４の予想配列に比べて、分析された四つのクローンのＤＮＡ配列データから（図１６のオートラジオグラムの写真参照）、所望の配向を有する二つのクローンを得た。代表的クローンを選択してｐ５Ｖ２ｎｅ。

１０２と命名した。

ヒトＣｋ遺伝子をｐｓＶ２ｎｅｏ−１０２に挿入しｐＲｌ、１００Ｏを作製した。このヒトＣｋＤＮＡは５．　Ｏｋｂの旧ｎｄｌｌｌ〜Ｂａｍ１ｌ　Ｔフラグメントに含有されていた（Ｈｉｅｔｅｒら、Ｃｅ１ｌ、２２巻、　１９７〜２０７頁、１９８０年）。

ｐｓＶ２ｎｅｏ−１０２のミニ−ライゼート由来のＤＮＡの試料３μｇをＢａｍＨ１および旧ｎｄｎｌて消化した。ベクターＤＮＡを、反応で生成した。Ｂａ＋ｎＨＩ−Ｂｉｎｄｌｌｌリンカ−の小フラグメントから、３．７５％ＤＮＡポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によって分離した。所望のＤＮＡフラグメントを電気溶出法で回収した。ヒトＣｋ遺伝子の５．　Ｏｋｂ　Ｈｉ　ｎｄ　Ｉ［Ｉ　−Ｂａｍ１ｌ　Ｉフラグメント（Ｈｉｅｔｅｒらの上記文献参照）を含有するｐＢＲ３２２クローンをｐｈｕｍＣｋと命名した。この５．　Ｏｋｂの旧ｎｄ　ｌｌｌ−ＢａｍＨＩフラグメントをｐＳＶ２ｎｅｏ−１０２と連結し、次いでイー・コリＤｔ（１（ｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入した。アンピシリン耐性のコロニーをスクリーニングし、ヒ１−Ｃｋ遺伝子を含有するクローンをｐＲＬｌｏｏＯと命名した。

最後に、イー・コリ由来のミニ−ライゼートプラスミドＤＮＡを旧口ｄｎｌとＢａ＋ｎｌｌ　Ｔで試験することによって、ｐＲＬＩｏｏｏクローンをスクリーニングした。二つのバンドをすなわち一方は５．８ｋｂの位置に（ベクターを示す）他方は５．０ｋｂの位置に（ヒトＣｋ挿入断片を示す）示すプラスミドを産生ずるクローンを選択した。ｐＲＬｌｏｏＯのその外の特性決定は、そのヒトＣｋ挿入断片のイントロン領域の旧ｎｄＩ１１部位の下流の配列を決定することによって行った。配列決定反応を開始するのに用いたオリゴヌクレオチドはＮＥＯ１０２３ＥＱ（図５）であった。

２１７個の塩基を決定した（図１７参照）。１ｌｉｎｄｌｆｆ部位の近くの（− ）ストランドに対応する新しいオリゴヌクレオチド（図１７に示す）を合成し、その結果ｐＲＬＩｏｏｏ（図１３参照）　（７）Ｃ１ａｌとｌ１ｉｎｄＩ［Ｉ）部位ニクローン化された、Ｈｕｍ４　Ｖ＋遺伝子含有クローンの配列を決定することができた。

ＰＣＲによって得た、ｌＩｕｍ４　Ｖ＋、を含有するＣ１ａｌ−１１ｉｎｄｌｌＩ　ＤＮＡフラグメントをプラスミドベクターｐＲＬ１０００中にクローン化した。ｐＲＬＩｏｏ。

とＨｕｍ４　ＶＬのＤＮＡをＣ１ａｌと旧ｎｄｌ［Ｉで処理し、生成したフラグメントを先に述べたのと同様にして電気泳動法でゲルによる精製を行った。

ｐＲＬＩｏｏＯＤＮＡフラグメントおよびＨｕｍ４　ＶＬ遺伝子を含有するフラグメントを連結し、次いでその連結混合物を用い、メーカーのプロトコルにしたがってイー・コリＤＨ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換した。

アンピシリン耐性クローンを、Ｈｕｍ４　ＶＬ遺伝子の存在について、制限酵素分析法によってスクリーニングし、代表的なりローンをｐＲＬｌｏｏｌ　と命名した（図１８に示す）。

正しいＣ１ａｌ−１（ｉｎｄＩ［［制限パターンを有する四つのプラスミドを、挿入領域のＤＮＡ配列を決定することによってさらに分析した（図１９参照）　。ｌｌ１ｎｄ［ＩＩＣｋ　（−１）（図１７に示す）　、ＨＵＭＬＩＮＩ（−）（図１０に示す）、＋１ＵＭＬＩＮ２（−）（図１０に示す）を配列決定プライマーとして用いた。分析した四つのプラスミドのうち二つは、コーディング領域中に予想された配列をもっていた（図１９、クローン２と９）。

細胞の形質転換と他の分析を行うのに充分なプラスミドＤＮＡを生成させるためクローン２を選択して使用した。このプラスミドはｔｌｕｍ４　ＶＬおよびＣｌａｌ部位に対し上流の領域を通じて配列を決定するために使用した。発表されている配列（Ｋｌｏｂａｃｋらの１９８５年の前記文献）と比べて、ＣからＧまでの８３位のヌクレオチドに一つだけの変化（図１０）がみとめられた。そのＤＮＡ配列のデータと、ＰＣＨに用いたオリゴヌクレオチドが標的配列に正しく組込まれていたことを示している。

Ｂｉｏｒａｄ　Ｇｅｎｅ　Ｐｕ１ｓｅｒ　（登録商標）装置を用いて、５ｐ２１０細胞を、軽鎖構造体または重鎮構造体を含有する線状化プラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。ｌｌｕｍ４　Ｖ＋　は、表１に示す共トランスフェクション（Ｃｏ　−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）計画で、対応する重鎮とともに５ｐ２１０細胞に導入された。

表１合計８．ＯｘｌＯ’　（７）Ｓｐ２１００’）細胞を滅菌ＰＢＳ緩衝液（Ｉ　Ｘ　１０７生細胞１ｍＬ、０．８Ｊ）で洗浄し、氷上に１０分分間−た。Ｃｌａｌ部位で線状化したｐＲＬｌｏｏｌのＤＮＡ、ならびにそれぞれのＮｄｅ１部位で線状化したｐ４９ｇ＋−２，３またはｐ８３ｇｌ−２，３（７）　ＤＮＡを含有する滅菌ＰＢＳを、細胞に添加しくプロトコール−表２参照）次いて０℃でさらに１０分間保持した。２０〜３０ミリセカンド続く弔−の２００ボルト９００μ Ｆの電気パルスを用いてエレクトロポレーションを行った。摂動された細胞（ｐｅｒｔｕｒｂｅｄ　ｃｅｌｌ）を水上に５分間保持した後、ラン胎児血清を１０％含有するＲＰＭＩ培地２５ｍ１を導入し、次いて２４ウエルの組織培養プレートに１．ＯｍＬづつ試料を入れた。その細胞を５％ｃｏ２含有大気中で３７℃にてインキュベートした。４８時間後、培地を、Ｉｍｇ／ｍＬのＧｅｎｅ　ｔ　ｉ　−ｃｉｎ（Ｇ４１８）（Ｄｉｂｃｏ社）および０．３ｔｔｇ／ｍｌのマイコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｃｎｏｌｉｃ　ａｃｉｄ）　／ｇｐｊ培地をともに含有する新しい選択培地で交換した。耐性細胞を７〜１０日間培養した。

医療耐性コロニーを有するウェルがら得た上澄み液をＴＡＧ−７２に対する活性についてＥＬＩＳＡバレートで試験した。ＬＳＩ４７７腫瘍異種移植細胞から調製した約１０％の純粋ＴＡＧ−７２溶液を１・４ｏに希釈し、その希釈液を用いて可撓性ポリ塩化ビニル微量滴定プレート（ＤｙｎａｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、社）をコートした。ウェルは一夜風乾し、翌日Ｉ％ＢＳＡでブロックした。抗ＴＡＧ−７２抗体について試験すべき上澄み液の試料を、洗浄したウェルに添加し、３７℃で１〜２時間インキュベートした。アルカリホスファターゼで標識を付けたヤギ抗ヒトＩｇＧ（１：２５０に希釈）（米国、アラバマ州、バーミンガム、５ｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ社）をプローブ抗体として使用した。インキュベーションは１時間行った。使用した基質はｐ−ニトロフェニルホスフェートであった。発色は１．ＯＮ　ＮａＯＨを添加することによって停止させた。プレートは、分光測光法て４０５ｎｍと４５０ｎｍにて読取ったが得られた値は４０５ｎｍ〜４５０ｎｍであった。

検定時に高い値を示す試料を、元の２４ウエルプレートから９６ウエルのプレートにサブクローン化した。ブレーティングは、純粋なモノクローナル細胞系を得るため、１ウェル当り１／２細胞の細胞密度（公称５０細胞）で行った。抗体を産生ずる細胞系をＤＭＳＯを１０％含有する培地中で凍結させた。

名称がＭＰＩ−４４８およびＭＰＩ−８４１１の二つの細胞系を入手した。ＭＰＩ−４４１１は、ＣＣ４９ｇ１重鎖とｌｕｍ４　ＶＬ軽鎖のキメラ体を有し、ＭＰＩ−８４１１は、ＣＣ８３ｇ１ｆｆｉ鎖とｌｌｕｍＶＫＩＶ軽鎖のキメラ体をもっている。

細胞系ＭＰＩ−４４１１の撹拌培養物１．ＯＬを３７℃で５日間培養して抗体を産生させた。培養物を遠心分離し、０．２２　ミクロンフィルターの装置によって濾過することによって、細胞を含有していない培養物上澄み液を得た。得られた透明な」二澄み液をプロティンへのカートリッジ（米国、ニューヨークのＮｙｇｅｎｅ社）を通過させた。免疫グロブリンを、Ｏ，ＩＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐｌ＋３０を用いて溶離した。抗体を含有する溶出画分のｐＨは、トリス塩基ｐｌ＋９．０を添加することによって中性まで上昇させた。抗体を含有する画分を濃縮し、Ｐｈａｒｍａ−ｃｉａ　５ｕｐｅｒｏｓｅ　１２１１Ｒ１０／３０ゲル濾過カラムを通過させた。タンパク質は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって均一であると判定した。さらに等電点電気泳動法によって、ＭＰＩ−４４８が純品であることが証明された。

ヒト１合抗体のＭＰＩ−４４Ｈの生物学的性能を、免疫組織化学の試験結果を、二つの池の抗−ＴＡＧ−７２抗体すなわちＣＣ４９（ＡＴＣＣ番号ＨＢ９４５９）およびＣｈ４４　（ＡＴＣＣ番号ＨＢ９８８４）と比較することによって評価した。

パラフィン中に埋包したヒト結腸腫瘍の切片を、当該技術分野の当業者に公知の方法で、三つの抗体を用いて試験した。これら三つの抗体はすべて、腫瘍組織試料上に存在する腫瘍抗原に対するは＼゛等しい結合認識性を示した。

ヒト複合抗体ＭＰＩ−４４Ｈのアフィニティーおよび生物学的完全性のその外の試験法は、抗体の放射性ヨウ素の標識を付けたバージョン（ｖｅｒｓｉｏｎ）と、ＣＣ４９およびＣｈ４４とをすべての組合わせて交差競合させることによる競合検定法である。図２０に示すデータから、三つのすべての抗体のアフィニティーが同等で腫瘍の抗原に有効に結合しうろことは明らかである。

ＭＰＩ−４４１１（ＡＴＣＣＩＩＢ　１０４２６）およびＭＰＩ−８４１１（ＡＴＣＣ１１８１０４２７）は、Ａｍｅｒ−ｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｃｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されている。ＡＴＣＣとの契約には、寄託を記載し確認している米国特許もしくは刊行物の発行時または米国特許願もしくは米国以外の国での特許願が公開されるときの最初の場合に公衆にその細胞系が永久的に入手できるようにし、かつ３５ＣＦＲ！ｌｉ　＋２２およびこれに準する米国特許商標庁長官の規則（特に８８６０Ｇ６３８を参照する３７ＣＦＲａ　１．１４を含む）にしたがって権限を与えられている米国特許商標庁長官が決定した者がその細胞系を入手できることが規定されている。本願の譲渡人は、寄託された細胞系が、寄託後３０年間または最新の請求を受領してから５年間適切な条件下で培養されているときに万−死ぬかまたは失われるかまた破壊された場合、通知によって生存可能な代替の細胞系て速やかに取替えることに同意している。

実施例２一本鎖抗体はＶ、、、ＶＨおよびＶ、とＶ、の領域を結合して５ｃｐｖを生成するペプチドリンカ−で構成されている。一本領の抗体の５ＣＦＶＩを、■領域１としてＨｕｍ４　Ｖｔを有しかつＶ領域２としてＣ（，４９Ｖｌ＋を有するよう構築した（図２１参照）。

二つのＶ領域を結合するポリペプチドリンカ−は、Ｆ’ＣＲ中、ＶＬＤＮＡの３ ′末端に導入されたＤＮＡによってコードされていた。オリゴヌクレオチドの５ＣＦＶＩａと５ＣＦＶ２は、酵母インベルターゼリーダー配列の一部、Ｈｕｍ４　Ｖ、および５ＣＦＶリンカ−を組入れているＤＮＡセグメントが得られるように設計した。

５ＣＦＶＩのポリペプチドリンカ−はオリゴヌクレオチド５ＣＦＶｌＧ　Ｃ下記参照）にコードされていた。オリゴヌクレオチド５ＣＦＶ１ａと５ＣＦＶ１ｂの下線をつけた部分はそれぞれＨＬＩＩＩ１４　ＶＬとリンカ−の配列に相補的である。５ＣＦＶ１ａと５ＣＦＶ１ｂの配列は下記のとおりで、ハイブリッド形成配列には下線を付けである。

５ＣＦＶＩａ　（ｔｌｉｎｄ１１１部位は肉太文字で示す）ｔ（ｉｎｄｌ５’　ＣＴＧＣＡＡＧＣＴＴＣＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＧＧＣＴＧＧＴＴＴＴＧＣＡＧＣＣＡＡＡＡＴＡＴＣＴＧＣ八ＧＡＣＡＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣ−３’５ＣＦＶ１ｂ（Ａａｔ　１１部位は肉太文字で示す）へ’　−ＣＧＴＡＡＧＡＣＧＴＣＴＡＡＧＧＡＡＣＧＡＡＡＴＴＧＧＧＣＣＡＡＴＴＧＴＴＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＣＧＡＡＣＣＴＧＡＣＴＣＣＴＴＣＡＣＣＴＴＧＧＴＣＣＣＴＣＣＧＣＣＧ−３’ＰＣＲにおける標的ＤＮＡはｐＲＬＩｏｏｌであった（図１８に示す）。そのＰＣＲはＭｕｌｌｉｓらの前記文献の教示事項にしたがって実施した。５ＣＦＶＩを構築するのに用いるＨｕｍ４　ＶＬ−リンカ−ＤＮＡ要素を含有するＤＮＡフラグメントは、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの前記文献の教示事項にしたがってポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって人手し精製した。

ＣＣ４９ＶＨを含有するｐ４９ｇｌ−２，３はＰＣＲ１，：おける標的ＤＮＡテあった。

ＰＣＲはＭｕｌｌｉｓらの前記文献の方法にしたがって実施した。ＣＣ４９Ｖｌ（のＰＣＨに用いたオリゴヌクレオチドは下記のとおりである。ハイブリッド形成配列には下線を引いである。

５ＣＦＶ１ｃ（Ａａｔ　１１部位は肉太文字で示す）５’　−ＣＣＴＴＡＧＡＣＧＴＣＣＡＧＴＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＡＣＧＣ−３’５ＣＦＶＩｄ　（Ｈｉｎｄｌ［１部位は肉太文字で示す）５’　−ＧＡＴＣＡＡＧＣＴＴＣＡＣＴＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＡＧＧＴＴＣＣ−３’精製したＨｕｍ４　ＶＬ　− リンカ−およびＶＨＤＮＡフラグメントを、メーカーのプロトコルにしたがってＡａｔｌｌ　（米国、マサチューセッツ州、ベバリーのＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ旧ｏｌａｂｓ社）で処理し、電気泳動法を行った後５％ポリアクリルアミドゲルから精製した。Ａａｔ　Ｕフラグメントの当モル混合物を一夜連結した。連結反応混合物を６５°Ｃで１０分間加熱することによって、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを熱で不活性化した。

塩化ナトリウムを混合物に添加し、最終濃度を５０ｍＭにし、その混合物をさらに１ｌｉｎｄＴ［ｌで処理した。ｉｉｎｄｍ　ＤＮＡフラグメントを単離し、４．５％ポリアクリルアミドゲルから精製し、酵母発現ベクター中（こクローン化した（”　ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、八Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、”Ｇｌｏｖｅｒ編集、■巻、　用〜１６１頁のＣａｒｔｅｒらの論文（１０８７年参照）。隣接５ＣＦＶＩ構造を含有するフラグメントの配列は図２２に示す。

本願に記載の抗−ＴＡＧ−７２５ＣＦＶＩは、酵母インベルターゼシグナル配列（図２２の一１９位〜−１位として示す）　、ｌｌｕｍ４　Ｖｔ　（図２２の１位〜１１３位として示す）、１８アミノ酸リンカ−（図２２の１１４位〜１３２位として示す）、およびＣＣ４９ＶＩ＋　（図２２の１３３位〜２４８位として示す）をｆす用した。

５ＣＦＶＩの完全なりＮＡとアミノ酸の配列を図２２に示す。５ＣＦＶＩのへ己列を決定するに使用したオリゴヌクレオチドを以下（こ示す。

ＴＩ”ｌ：５′−ＣＡＡＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＡＴＴＣＴＴＴＴＣ−３’１１ＵＶＫＦ３：５’　−ＣＣＴＧＡＣＣＧＡＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧ−３’ＤＣ１１３：５’　−ＴＣＣＡＡＴＣＣＡＴＴＣＣＡＧＧＣＣＣＴＧＴＴＣＡＧＧ−３’５ＬＩＣ２Ｔ・５’　−ＣＴＴＧＡＡＣＡＡＡＧτＧＡＴＡＡＧＴＣ−３’実施例３プロレニン遺伝子を含有するプラスミドｐｃＧｓ５１７（図２３）をＨｉｎｄ［ｌＩて消化し、６．５ｋｂのフラグメントを単離した。プラスミドＩ）ＣＧＳ５１７は、トリオースリン酸イソメラーゼプロモーター、インベルターゼＣ３ＶＣ２）　シグナル配列、プロレニン遺伝子および（５ＶＣ２）ターミネータ−をもっている。先に得た旧ｎｄＴｆｌで消化した５ＣＦＶＩ挿入断片（図２３参照）を、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ（米国、カリフォル−ニア州、う・ホーヤのＳｊｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて、ｐｃＧｓ５１７の旧ｎｄＴＩＩフラグメントと一夜連結した。

インベルターゼシグナル配列の一部分を含有する挿入断片のｌｌｉｎｄｍ部位がベクターＤＮＡに連結して隣接シグナル配列を有する遺伝子を形成したとき、正しい配向が存在していたのである。イー・コＩＪ　Ｄｌｌ　１（ｌ　ｎｖ　ｉ　ｔ　ｒｏｇｅｎ社）細胞を形質転換し、次０でコロニーを、フィルター−マイクロ波法を用いてスクリーニングした（Ｂｕｌｕｗｅｌａら、Ｎｕｅｌ−ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１７巻、４５２頁、１９８９年参照）。数百側のコロニーを有する形質転換プレートから、３個の陽性コロニーを１％た。

候補的プラスミドを５ａｉｌおよびｋｐｎｌ　（各々シングルカ・ツタ−である）で消化したところ、産生されるＤＮＡフラグメントの大きさ（こよって配向の差が識別された。単一クローンｐＤＹｓｃＦＶＩ　（図２３）（よ正しく嵐配向を有し、その後の試験とクローン化に用０た。使用されｔこプローブは、Ｋｐｎ　ｌとＣａ１ｌて消化したｐＲＬｌｏｏｌから誘導しｔコ（図１８参ＩＩｒＡ）。

そのプローブＤＮＡには、ランダムオリゴヌクレオチドプライマー標識付はキット（米国、ニュージャージイー州、ビス力タウエイ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ旧ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇＹ社）を用０て３２ｐ　ａ−ｄＣＴＰで標識をつけた。

次のステップは、ｐ［）ＹＳＣＦＶＩ由来のＢｇｌ　ｌｌ−３ａｌｌフラグメントを、ｐｃＧｓ５１５（図２３）から誘導された他のベクター（約９　ｋｂ）の同じ勺１限部位に導入して、ニス・セレビシェ（Ｓ、　Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）内て自律的に複製するプラスミドを得るステ・ツブである。

上記のフラグメントを挿入されたベクター由来のＤＮＡを、ｆｏｘ緩新液Ｎｎ３（５０ＭＭ）リス−１１ｃＩ　（ｐＨ８，Ｏ）、ｌ００ｍＭ　ＮａＣｌ、　ＢＲＬ）を用いて口ｇｌ■と５ａｌｌで別個の反応で消化した。ｐＤＹｓｃＦＶ１由来のＤＮＡフラグメントを、５％ポリアクリルアミドゲル中を電気泳動させ次に電気溶出を行った。そしてその挿入断片のＤＮＡを、３．７５％のポリアクリルアミドゲル中を電気泳動させ次いで電気溶出を行った。Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて標準の連結を行い、次いでイー・コリＯＨ１（ｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて形質転換を行った。Ｂｇｌ　ＩＩとＳａｌ　Ｕでスクリーニングを行うために選択した６個のクローンがすべて正しく配向されていた。一つをｐｃＧｓ５１５／　５ＣＦＶｌ　と命名した（図２３）。

ｐｃＧｓ５１５／５ＣＦＶＩ　ＤＮＡ　（７）　ＤＮＡ配列決定を、ｐｃＧｓ５１５／５ＣＦＶＩＤＮＡを用いる５ｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）キット（米国、オハイオ州、クリーブランドのＵ、　Ｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ１社）を利用して行った。試験結果を図２２に示したが、リンカ−１Ｈｕｍ４　Ｖｔ　およびＣＣ４９Ｖｏに基ついて予想した配列を確認する。

自律的に複製するプラスミドｐｃＧｓ５１５／５ＣＦＶＩを使用する酵母細胞の形質転換を、目０ら、Ｊ０口ａｃｔｅｖｉｏ１．　、１５３巻、　１６３〜１６８頁、１９８３年；および“Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ″Ａｕ５ｅｂｅｌ　ら編集、２　：　１３．７１−１３．７６に記載されているＴｒｅｃｏの文献１９８７年に記載されている酢酸リチウム法で実施した。ニス・セレビシェの受容菌株は、遺伝子型−ＭＡＴ α（交配菌株α）　、ｕｒａ３−５２　（ウランル栄養要求性＞　、５ＳＣＩ− １［超分泌性−１（ｓｕｐｅｒｓｅｃｒｅｔｉｎｇｌ）　）　、およびＰＰＰ４ ″　（ペプチダーゼ４陽性）を有するＣＧＹＩ　２８４であった。

５ＣＦＶプラスミドを有するＣＧＹＩ２８４の形質転換クローンは、ウラシルなしの最少培地で増殖するそれらの性能によって選択した。形質転換されたコロニーは３〜５日以内に出現した。これらのコロニーをＹＥＰ［ｌ培地に移し、増殖させ次いてプレートした。振盪フラスコを用いて、発現した産物を含有する培養上澄み液を得た。

ＥＬＩＳＡ法を用いて５ＣＦＶＩの生物活性を検出した。この検定は５ＣＦＶが、ＥＬＩＳＡプレート上のＴＡＧ−７２抗原との結合についてビオチニル化ＣＣ４９（ビオチン−ＣＣ４９）と競合させて行った。

５ＣＦＶＩタンパク質は、５ｕｐｅｒｏｓｅ１２ゲル濾過カラム（Ｐｈａｒ＋ｎａｃｉａ　ＬＫＢＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いて、粗製の酵母培養上澄み液から部分的に精製したが、ビオチニル化ＣＣ４９と競合することが競合ＥＬＩＳＡ法で見出された。これらの試験結果は、５ＣＦＶＩがＴＡＧ−７２結合活性をもっていたことを示している。

５ＣＦＶＩ　タンパク質は標準のウェスターンプロトコルによって検出さた（Ｔｏｗｂｉｎ　ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、ＵＳＡ、　７６巻、４３５０〜４３５４頁、１９７９年参照）。検出試薬はビオチニル化ＦＡＩＤ１４（ＡＴＣＣＮａＣＲＬ　１０２５６）であり、これはＣＣ４９で免疫化されたマウスから製造した抗イデイオタイプモノクローナル抗体であった。見掛けの分子量が約２６．０００ダルトンのバンドが視覚化されたが、これは５ＣＦＶＩの予想された大きさであった。この試験結果は、５ＣＦＶＩが分泌されて適正にプロセスされたことを示している。

実施例４以下の実施例は、Ｈｕｍ４　ＶＬおよびＵＮＩＩＩＯＰＥと呼ばれる２５アミノ酸リンカ−をコードする配列を有する５ＣＦＶプラスミド構造体へのヒトＶ１．ｌ遺伝子のクローン化を示す。

ベクターは、クローン選択に用るクロラムフェニコール耐性（Ｃａｍ’　）遺伝子、およびｐｅｎＰのプロモーターとターミネータ−を有するｐｅｎＰ遺伝子（Ｍｅｚｅｓら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　、　２５８巻、＋１２１１−１１２１８頁、１９８３年）およびｐｅｌＢシングル配列（Ｌｅｉらの１９８７年の前記文献）を含有するプラスミドｐＲＷ８３から製造した。このベクターはフラグメントＡと命名した（図２４参照）。ｐｅｎＰ遺伝子は旧ｎｄｌｌｌ／Ｓａｌ　ｌによる消化で除去した。

ｐｅｎＰプロモーターとｐｅｌ　Ｂ　シグナル配列は、鋳型としてｐＲＷ８３を用いおよびプライマーとしてオリゴヌクレオチドのｐｅｎＰ　ＩとｐｅｎＰ２を用いてＰＣＲによって得た。そのフラグメントをフラグメントＢと命名した（図２４参照）。Ｎｅｏ　ｌ酵素制限部位を、ｐｅｎＰ２オリゴヌクレオチドによって、シグナル配列領域の３′末端に導入した。

ｐｅｎｐｌ　：５’　−ＣＧＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＣＡＴＣＡＣＴＴＣＣ−３’ｐｅｎｐ２：５’　−ＧＧＣＣＡＴＧＧＣＴＧＧＴＴＧＧＧＣＡＧＣＧＡＧＴＡＡＴＡＡＣＡＡＴＣＣＡＧＣＧ　ＧＣＴＧＣＣＧＴＡＧＧＣＡＡＴＡＧＧＴＡＴＴＴＣＡＴＣＡＡＡＡＴＣＧＴＣＴＣＣ（：ＴＣＣＧＴＴＴＧＡＡ−３’Ｈｕｍ４　Ｖｔ、　、ＣＣ４９Ｖｏおよび１８アミノ酸リンカ−（Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　５ｅｙＧｌｙ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ）で構成された５ＣＦＶは、オリゴヌクレオチドのｐｅｎＰ３とｐｅｎＰ６を用いＰＣＲによってｐｃＧｓ５１５／５ＣＦＶＩから得た。このフラグメントをフラグメントＤと命名した（図２４参照）。ｌ１ｅｌ　１部位を、ｐｅｎＰｆ３オリゴヌクレオチドによって、Ｖ１１領域の３′末端に導入した。

ｐｅｎＰ３　：５’　−ＧＣＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＣ八ＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣ−３’へｅｎＰ６（−）　：５’　−ＣＴＣＴＴＧＡＴＣＡＣＣＡＡＧＴＧＡＣＴＴＴＡＴＧＴＡＡＧＡＴＧ八ＴＧＴＴＴＴＧ　ＡＣＧＧＡＴＴＣＡＴＣＧＣＡＡＴＧＴＴＴＴへＡＴＴＴＧＣＣＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＡＧＧＴＴＣＣ−３’フラグメントＢとＤを、Ｈｏｒｌｏｎらの上記文献の方法にしたがって、オリゴヌクレオチドのｐｅｎＰＩ　とｐｅｎＰ６を用いＰＣＩＩて連結した。この新しいフラグメントをフラグメントＥと命名した（図２４参照）。

ｐｅｎＰ終止コドンを含有するフラグメントＣは、ｐＲＷ８３を日ｃｌｌと５ａｌｌて消化することによりで単離し、フラグメントＣと命名した。ｐＲＷ８３は、イー・コリ菌株ＧＭＩ６１から単離した。なおこの菌株はＤＮＡメチラーゼマイナスすなわちｄａｍ−′である。

プラスミドｐＳＣＦＶ３１（図２４参照）は、三つの部分の連結フラグメントＡ、　ＣおよびＥて創製した。

ＣａＩＩ＋’遺伝子内のＮｅｏ　ｌ制限酵素部位およびｐｓｃＦＶ３１のｐｅｎＰプロモーターの５′末端に配置された旧ｎｄ［［１部は、ＰＣＲＤＮＡ増幅によって破壊され、この増幅には、オリゴヌクレオチドのＮｃｏｌ、　１とＮｃｏｌ、３（−）を用いてＥｃｏＲｌ−Ｎｃｏ＋フラグメントを生成させ、およびオリゴヌクレオチドのＮｃｏｌ、２とＮｃｏｌ、４ｃ　（−）を用いてＮｃｏ　ｌ −ＮｃｏＲＩフラグメントを生成させた。これら二つのフラグメントを、オリゴヌクレオチドＮｃｏ１．　ｌとＮｃｏｌ、　４ｃ（−）を用いてＰＣＲ−３ＯＥによって連結した。これらのオリゴヌクレオチドは下記のとおりである。

Ｎｃｏｌ、１　＋５’　−ＴＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＴＡＴＧＧＣＡＡＴＧＡ−３’Ｎｃｏ１．３（−）：５’　−ＣＴＴＧＣＧＴＡＴ八ＡＴＡＴＴＴＧへＣＣＡＴＣＧＴＧＡＡＡＡＣＧＧＧＧＧＣ−３’Ｎｃｏ１．２　：５’　−ＡＴＧＧＧＣＡＡＡＴＡＴＴＡＴＡＣＧＣＡＡＧ−３’Ｎｃａ１．４ｃ（−）：５’　−ＣＡＣＴＧＡＡＴＴＣＡＴＣＧＡＴＧＡＴＡＡＧＣＴＧＴＣＡ八ＡＣ八ＴＧ八Ｇ−３′ｐｓＣＦｖ３１をＥｃｏＲＩで消へし、へきいへのフラグメントをポリアクリルアミドゲル電気泳動で単離した。自己連結を防止するため、（ＩＮＡは、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの上記文献の教示にしたがって仔つシ腸アルカリ性ホスファターゼを用い脱リン酸化させた。ｐｓｃＦＶ３１を消化して得た大きいフラグメントとＰＣＲ−３ＯＥフラグメントの二つの部分を上記のようにして連結しｐｓｃＦＶ３１ｂを創製した（図２５参照）。

ｐｓｃＦＶ３１ｂをＮｅｏ　ｌと５ａｌｌで消化してＣａｍ’遺伝子を含有するフラグメントを単離した。

Ｈｕｗ＋４　Ｖｔは、鋳型としてｐｃＧｓ５１５／５ＣＦＶＩを用い、プライマーとしてオリゴヌクレオチドの１０４Ｂ旧と１０４８Ｈ２（−）を用いてＰＣＲＤＮＡ増幅法で得た。

１０４ＢＨＩ・５’　−ＣＡＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＣＡＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡ−３’１０４８Ｈ２（−）　：５’　−ＡＡＧＣＴＴＧＣＣＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴＴＴＡＡＣＧＴＴＡＧＴＴＴＴＡＴＣＴＧＣＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＧＣＣＴＴＣＴＧＣＣＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴＣＣＣＴＣＣＧＣＣＧＡＡＡＧ−３’ＣＣ４９ＶＨは、鋳型として９４９ｇ＋−２，３（図５）を用い、プライマーとしてオリゴヌクレオチドのｌ０４Ｂ３と１０４Ｂ４（−）を用いてＰＣＨによって得た。Ｎｈｅ　ｌ酵素制限部位を、３′末端の終止コドンのすぐ後に（Ｂｃｌ　１部位の前）、オリゴヌクレオチド１０４８４（−）によって導入しｔこ。

１０４Ｂ３：５’　−ＧＴＴＡＡＡＧＣＡＧＣＡＴＧＧＧＧＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧＡＣＴＣＡＧＴＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＡＣＧＣ−３’１０４８４（−）・５’　−ＣＴＣＴＴＧＡＴＣＡＣＣＡＡＧＴＧＡＣＴＴＴＡＴＧＴＡＡＧＡＴＧＡＴＧＴＴＴＴＧＡＣＧＧＡＴＴＣＡＴＣＧ　ＣＴＡＧ　ＣＴＴＴＴＴＡＴＴＴＧ　ＣＣＡＴＡＡＴＡ　ＡＧＧＧ　ＧＡＧ　Ａ　ＣＧＧＴＧＡＣＴＧＡＧＧＴＴＣＣ−３’これら二つのフラグメントを、プライマーとしてオリゴヌクレオチドの１０４Ｂ旧と１０４Ｂ４（−）を用いて連結するＰＣＲにおいて、２２アミノ酸リンカ−のコーディング領域が生成した。

ｐｅｎＰ終止コドンを含有するフラグメントＣ（先に述べたのと同じ）を、Ｂａ１ｌおよび５ａｌｌで消化したｐＲＷ８３から単離した。

プラスミドｐｓｃｐｖ３３ｎ　（図２５参照）は、ベクター、フラグメントＣおよび上記の５ＣＦＶフラグメントの三つの部分を連結することによって創製した。

ｐｓｃＦＶ３３１（をＮｅｏ　ｌとＮｈｅ　Ｉて消化し、Ｃａｍ’遺伝子を含有するＤＮＡフラグメントをベクターとして単離した。

Ｈｕｍ４　Ｖｔは、鋳型としてｐＲＬｌｏｏｌ（図１８参照）を用い、プライマー　、！：　Ｌテ、ｔ　ＩＪ　コヌクレオチ）’ＵＮＩＨＩ　オヨヒＵＮＩＨ２（−）　ヲ用イＰｃＲＤＮＡ増幅法によって得た。ＰＣＨに用いたオリゴヌクレオチドは下記のとＮｅｏ　１部位は肉太文字で示し、ハイブリッド形成配列には下線を引い５’　−ＧＡＧＧＴＣＣＧＴＡＡＧＡＴＣＴＧＣＣＴＣＧＣＴＡＣＣＴＡＧＣＡＡＡＡＧＧＴＣＣＴＣＡＡＧＣＴＴＧＡＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴＣＣＣＴＣＣＧＣ−３’ＨｉｎｄＩ［［部位は肉太文字で示す。

ＣＣ４９Ｖ、は、鋳型としテｐ４９ｇｌ−２，３（図６参照）を用イ、プライマーとしてオリゴヌクレオチドのＵＨＩ３およびＵＨＩ４（−）を用いてＰＣＲによって得た。

ＵＨＩ３：Ｘｈｏ　１部位は肉太文字で示し、ハイブリッド形成配列には下線をひい５’　 −ＣＡＴＣＧＣＴＡＧＣＴＴＴＴＴＡＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＡＧＧＴＴＣＣ−３’Ｎｈｅ１部位は肉太文字で示しハイブリッド形成配列には下線をひいである。

オリゴヌクレオチドのＵＮＩＨＩとＵＨＩ４（−）をＰＣＲ−３Ｏ［！増幅ニ用い、Ｈｕｍ４　ＶＬとＣＣ４９Ｖｌ＋フラグメントを連結させて負に帯電した１５アミノ酸リンカ−のコーディング領域を形成させた。そのＤＮＡをＮｈｅｌとＮｅｏ　ｌで消化し、ｐｓｃＦＶ３３ＨをＮｃｏｌ−Ｎｈｅｌで消化して得たベクターフラグメントに連結した。得られたプラスミドはｐｓｃＦＶ　ＵＮＩＨと命名した（図２５に示す）。

ｐｓｃＦＶ　ＵＮＩＨを構築することによって、適正な位置にすべての所望の制限酵素部位を有する、あらゆる５ＣＦＶに用る普遍ベクターが創製された。

ｐｓｃＦＶ　ＵＮＩＨを旧ｎｄＩ［［／Ｘｈｏｌで消化して、Ｃａｍ　’遺伝子、Ｈｕｍ４　ＶＬおよびＣＣ４９Ｖ、を有する大きなりＮＡフラグメントを単離した。

２Ｓアミノ酸リンカ−をコードするフラグメントを、下記の二つのオリゴヌクレオチドをアニールすることによって製造した。このリンカ−ＵＮＩＨＯＰＥは２０５５ＣＡ（登録商標）リンカ−に基づいているが（Ｗｈ　ｉ　ｔ　Ｉ　ｏｗ（１９９０年）’Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｎｅｗ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ａｐ−ｐｌｉｃａＨｉｎｄＩｗ＋ｐｌｉｃａｌｉｏｎｓ ”、米国、マサチューセッツ州のＩＢＣＵＳＡ　Ｃｏ−ｎｆｅｒｅｎｃｅ　Ｉｎｃ、社を参照〕、最初のアミノ酸をセリンからロイシンに変えおよび２５番目のアミノ酸をグリシンからロイシンに変えて、ＨｉｎｄＩ［ＩとＸｈｏ　Ｉの制限部位に適応した。リンカ−ＵＮＩＨＯＰＦ！をコードするヌクレオチド配列は下記のとおりである。

ＵＮＩＨＯＰＥ（図２６）：５’　−ＴＡＴＡＡＡＧＣＴＴＡＧＴＧＣＧＧＡＣＧＡＴＧＣＧＡＡＡＡＡＧＧＡＴＧＣＴＧＣＧＡＡＧＡＡＧＧＡＴＧＡＣＧＣＴＡＡＧＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＣＴＡＡＡＡＡＧＧＡＣＣＴＣＧＡＧＴＣＴＡ−３’ＵＮＩ）ＩＯＰＥ（−）（図２６）：５’　ＴＡＧＡＣＴＣＧＡＧＧＴＣＣＴＴＴＴＴＡＧＣＡＴＣＧＴＣＴＴＴＣＴＴＡＧＣＧＴ　ＣＡＴＣＣＴＴＣＴＴＣＧ　ＣＡＧ　ＣＡＴＣＣＴＴＴＴＴＣＧ　ＣＡＴＣＧＴＣＣＧ　ＣＡＣＴＡＡＧＣＴＴＴＡＴＡ　−３’得られたストランドを旧ｎｄｌｌｌ／Ｘｈｏｌて消化し次いでベクターに連結してプラスミドｐｓｃＦＶ　ＵＨＨ（図２７に示す）を生成させた。プラスミドｐｓｃＦＶ　ＵＨＩ（は、Ｈｕｍ４　ＶＬとＣＣ４９ＶＨで構成された生物学的に活性なＴＡＧ− ７２結合５ＣＦＶを発現する。この発現プラスミドは、β−ラクタマーゼｐｅｎＰプロモーター、ペクチン酸すアーゼｐｅｌＢシグナル配列およびｐｅｎＰターミネータ−領域を利用する。異なる免疫グロブリンの軽鎖の可変領域をＮｃｏｌ −ｔｌｉｎｄＩ［Ｉ制限部位に挿入することができ、異なる５ＣＦＶリンカ−を旧ｎｄＩ［［−Ｘｈｏ１部位に挿入することができおよび異なる免疫グロブリンの重鎮の可変領域をＸｈｏ　Ｉ−Ｎｈｅ　１部位に挿入できる。

イー・コリ＾Ｇｌ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を連結ミックス（ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｍ１ｘ）で形質転換し、スクリーニングを行った後、正しい制限地図のＤＮＡを有する単一クロラムフェニコール耐性クローンをその後の試験に使用した。

得られたプラスミド中の５ＣＦＶ遺伝子のＤＮＡ配列と波峰アミノ酸配列を図２６に示す。

ｐｓｃＦｖ　０１（Ｈを含有するイー・コリＡＧＩを、２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール（ＣＡＭ　２０）を含有するＬＢブロス２−中で増殖させた。その培養物を音波処理し、競合ＥＬＩＳＡ法を用いて検定した。その細胞は抗−ＴＡＧ−７２結合物質を産生ずることが見出された。上記の競合検定法は以下のようにして実施した。９６ウエルプレートを、ＬＳＩ７４Ｔ細胞由来のＴＡＧ−７２の製剤で誘導体化した。そのプレートを、ＰＢＳ中１％ＢＳＡて３１℃で１時間ブロックし、次に３回洗浄し、ビオチニル化ＣＣ４９（１ｍｇ／　ｍＬ溶液の１　／２０．０００希釈液）２００μＬを上記ウェルに加えて、プレートを３１ ’Ｃにて３０分間インキュベートした。プレートに結合したＴＡＧ−７２の相対量、ビオチニル化ＣＣ４９、ストレブタビジンーアルカリ性ホスファターゼならびに着色回数は、抗原またはビオチニル化ＣＣ４９が過剰ではなく、しかも５ＣＦＶによる競合を検出する充分なシグナルをもつように経験的に決定した。正の対照は５μｇ／ｍＬのＣＣ４９とＩＯμＬ／ｍＬのＣＣ４９Ｆａｂであった。負の対称は、ＰＨ３中の１％ＢＳＡおよび／または濃縮ＬＢてあった。捕捉されなかったタンパり質は洗い流した。

アルカリ性ホスファターゼを接合させたストレプタビジン（米国、アラバマ州、バーミンガムの５ｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｉｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ。

Ｉｎｃ、社）の１　＋　１０００希釈液５０μＬを添加し、そのプレートを３１ ℃で３０分間インキュベートした。そのプレートをさらに３回洗浄した。

ｐ−ニトロフェニルホスフェート溶液５０μＬ（米国、メリーランド州、ガイサーズバーグのＫｉｒｋｅｇａａｒｄ　＆　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、社）を添加し、発色反応を最少限度の２０分間起こさせた。５ＣＦＶ結合の相対量はマイクロプレートリーダー（ｎ＋１ｃｒｏｐｌａｊｅ　ｒｅａｄｅｒ）（米国、カリフォルニア州、メンローパークのＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）を用いて４０５〜４５０ｎｍを走査し、光学濃度によって測定した。

５ＣＦＶの結合は、ビオチニル化ＣＣ４９の結合の減少および同時に起こる発色の減少を生成した。３個づつの試験試料の平均値を以下の表に示す。

イー・コリＡＧＩ／ｐｓｃＦＶＵｌｌｔ（０，０８５クローン１１の音波処理物５ｍｇ／ｍＬのＣＣ４９０，０７６１０ｍｇ／ｍＬのＣＣ４９Ｆａｂ　Ｏ，０７８１、Ｂ（負の対照）　０．３５９上記のデータは、イー・コリＡＧＩ／ｐｓｃＦＶＵｌｌｌｌクローンの音波処理物に抗−ＴＡＧ−７２活性があったことを示している。

実施例７ブラスミドｐｓｃＦＶＵＨ旧よ、以下に述べる方法にしたがって、Ｘｈｏｌ〜Ｎｈｅｌフラグメント上に他のＶ１１遺伝子を配置させて５ＣＦＶの構成を試験するのに利用できる。このプロセスの概略図を以下に示す。

既知の始原型ＴＡＧ結合抗体又は擬態と競合するＨｕｍ４　Ｖ　Ｌ　Ｖ　ｎの組合せの発見ｐｓｃＦＶＵＩＩｌｌ　Ｘｈｏｌ／ＮｈｅｌベクターＤＮＡフラグメント（ＣＣ４９Ｖ　Ｉ＋除去済み）又はＰＡＴＤＦＬＡＧ　Ｘｈｏｌ　／ＮｈｅｌベクターＤＮＡフラグメント ■ 免疫組織化学により正常組織：腫瘍組織の結合プロフィルを決定する。

正常な健康なトナーからの血液を３本の５ｍＬ入りの紫色フタ付きｖａｃｕｔａＩｎｅｒ管にひき込む。７ｍＬの血液を２本の１５ｍシ入りポリプロピレン管に付加する。同量のリンパ球調製物（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）（Ｃａｔ　＃　ＡＮ５５０１、　Ａｃｃｕｒａｔｅ）を付加し、逆転して溶液を混合する。２０分間１８℃１１０００ｒｐで両方の管を遠心分離する。液体の上部近くに結果として得られた白色部域（赤血球を含まない部域）を各試料から取出し、２本の無菌ポリプロピレン遠心分離管内に入れる。無菌Ｐ［１ＳＩＯｍｌ、を付加し、管を逆転して混合する。試料を１５００ｒｐｔｎ　、１８℃で２０分間遠心分離する。

ＲＮＡゾールＢ方法（Ｃｈｏｍｅｚｙｎｓｋｉ及び５ａｃｃｈ　ｉ　（＋９８７）、分析生化学、１６２：１５２−１５９）に従って結果として得られたペレットから全てのＲＮＡを分離する。簡単に言うと、細胞ペレットを０．４ｍｌ、のＲＮＡゾール溶液（Ｃａｔ　＃　Ｃ５−１０５，ｃｉｎｎａ　／Ｂｉｏｔｅｃｘ）の中で溶解させる。

ＲＮＡを、］ｍＬのピペットの先端を通して細胞ペレットを通過させることによって可溶化させる。６０μｍのクロロホルムを付加し、１５秒℃で＋２０００　ｘｇの遠心分離により相分離する。上部（水）相を、ＲＮアーゼを含まない新鮮なマイクロ遠心分離管に移す。１体積のイソプロパツールを付加し、試料を一時間−２０℃に置く。次に試料を５分間ドライアイス上に置き、最終的に、１４０００　ｘｇ、４℃で４０秒間遠心分離する。結果として得られた上清を各試料から除去し、　１４４μＬの無菌てＲＮアーゼを含まない水の中にペレットを溶解させる。最終的モル濃度を０．２ＭのＮａＣＬにする。２体積の１００％エタノールを付加し１０分間ドライアイス上に放置し、１５分間４℃、１４０００　ｒｐｍで遠心分離することにより、ＤＮ八を再度沈降させる。次に上清を除去し、７５％エタノールでペレットを洗浄し、＋２０００　ｘｇ、　４℃で８分間遠心分離する。次にエタノールを除去し、真空下でペレットを乾燥させる。次に結果として得られたＲＮＡを、ｌ　１１１のＩ’ｌＮアジン（Ｃａｔ　＃　Ｎ２５１１゜Ｐｒｏｍｅｇａ）を含む２０の無菌水の中に溶解させる。

ｃＤＮＡ合成：Ｇｅｎｅ　Ａ　ｍｐ　ＴＭＰＣＲキット（Ｃａｔ　Ｈ：　Ｎ８０８−００１７　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅ１ｕｓ）、ＲＮアジンＴ″’（Ｃａｔ　ｊｔ　：　Ｎ２５１１．　Ｐｒｏｍｅｇａ）、及びＡＭＶ逆転写酵素（Ｃａｔ　Ｈ：Ｍ９００４．　Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｃＤＮＡ合成を行なう。各々の試料について以下のプロトコールが使用される：成分　量ＭｇＣ１ｙ溶液　４μ１１０μｍのＰＣＲ緩衝液新液　２μ１３′プライマ（ランダムヘキサマー）　１ｕＩＲＮＡ試料　２μｍ試料を３分間８０℃に加熱し、次に４８℃までゆっくりと冷却する。

次に試料を１０秒間遠心分離する。へＭＶ逆転写酵素を試料に付加し、その後この酵素を３７℃で３０分間インキュベートする。インキュベーションの後、各々のｄＮＴＰを０．５μｍずっと、０．７５の逆転写酵素（Ｃａｔｉ　：　１０９１１８．　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、　Ｍａｎｈｅｉｍ）を付加する。３７℃でさらに１５分間試料をインキュベートする。

ＰＣＲ反応・ポリメラーゼ連鎖反応によりヒトのＶ１１遺伝子を増幅させるようオリゴヌクレオチドを設計する。５′のオリゴヌクレオチドは、以下のように規定される：）！Ｖ）Ｉ　１３５：５’　−ＴＡＴＴＣＴＣＧＡＧＧＴＧＣＡ（ＡＧ）ＣＴＧ（ＣＧ）ＴＧ（ＣＧ）ＡＧＴＣＴＧＧ−３’ＨＶＨ２Ａ：５’　−ＴＡＴＴＣＴＣＧＡＧＧＴＣＡ＾（ＣＧ）ＴＴ（ＡＧ）Ａ（ＡＧ）ＧＧＡＧＴＣＴＧＧ−３’ＨＶＩ（４６：５’　−ＴＡＴＴＣＴＣＧＡＧＧＴＡＣＡＧＣＴ（ＡＧ）ＣＡＧ（ＣＧ）（ＡＴ）ＧＴＣ（ＡＣＧ）ＣＧ−３’３′のオリゴヌクレオチドは、以下のように規定される；ＪＨ１２４５：５’　−ＴＴＡＴＧＣＴＡＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣ（ＡＧ）ＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧ−３’ＪＩＩ３：５’　−ＴＴＡＴＧＣＴＡＧＣＴＧＡＡＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＴＴＧＪＨ６：５’　−ＴＴＡＴＧＣＴＡＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧ−３ ’ＰＣＲ反応はＧｅｎｅＡｍｐ”ＰＣＲキット（Ｃａｔ　＃　：　Ｎ８０８−００１７．Ｐｒｅｋｉｎ　ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ）で行なわれる。成分は以下に列挙される通りである。

成分　量ｄｄ）１２０　７５μｍ１０ｘ緩衝液　１０μｍｄＡＴｌ’　２μｍ１９標的ＤＮＡ　１μｍ水　成分は、第１サイクルの９２℃で順番に付加されたもの。

ＰＣＲプログラム：第１段階＝９４℃で３０秒第２段階＝６０℃で１分間第３段階ニア２℃で４５秒間谷反応について約３５サイクルを完遂する。全てのＰＣＲ反応はＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　ＲＣＲＣメンム９６００サーマルサイクラ−を用いて行なわれる。

Ｘｈｏ　ｌ及びＮｈｅｌを用いたヒトＶｌ＋インサートの処理：ヒトＶ　Ｉ＋遺伝子をＸｈｏｌ（Ｃａｔ　＃　：　１３１Ｌ、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）及びＮｈｅｌ（Ｃａｔ　＃　：　１４６Ｌ、Ｎｃｗ　Ｅｎｇｉａｎｄ旧ｏ１ａｂｓ）を用いて消化する。各試料について以下のプロトコルを用いる：ＮＥＢ、緩衝液１２　４．５μ１３７℃で１時間試料をインキュベートする。このインキュベーションの後、付加的に１．５７１１のＮｈｅ　Ｉを加え、試料をさらに２時間３７℃制限酵素消化の後、ＤＮＡを５パーセントのポリアクリルアミドゲル（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、　（＋９８９）　、前出）上に走らせる。サイズが３９０〜４２０ｂｐのバンドをゲルから切除する。ｔｌＮＡを電気溶出し、標準的な手順に従いエタノール沈降させる。

オリゴヌクレオチドの組合わせの結果として得られるＰＣＲ産物を合わせてプールする：すなわちＪＩＩ＋２４５と）ＩＶＩ１１３５．　ＨＶＨ２ＡとＨｖＨ４６；ＪＩＩ３とＩＩＶＨＩ　３５．　ＩＩＶＩ（２ＡとＨＶＨ４６；Ｊｔ１６と１ＩＶＨＩ３５．　ＨＶＨ２Ａと１ｌＶＨ４６、結果として得られるプールの量を真空下で５０マイクロリツトルまで減少させる。

次にプールを４パーセントのポリアクリルアミド（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、。

（１９８９）、前出）から精製してＤＮＡフラグメントを分離する。３９０〜　。

４２０ｂｐての結果として得たバンドをゲルから切除する。切除したゲル切片からのＤＮＡをＳａｍｂｒｏｏｋ　（前出）が規定している標準的プロトコルに従って電気溶出する。

ｐｓｃＦＶＵｔｌｌｌ　Ｘｈｏ　Ｉ／　Ｎｈｅ　ｌベクターフラグメントの分離１５μＬ中約５　Ｉｔ　ｇのｐｓｃＦＶＵ曲プラスミドを、Ｍａｇｉｃ　Ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ　ＴＭシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて分離する、これに５．４μＬのＩＯＸ緩衝液新液２　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）、４５ユニツトのＸｈｏｌ（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）、ｌ　５　：Ｌ　ニー　ットのＮｈｅ　ｌ及び２４μＬのｄｄｌｌｚｏを付加する。反応を３７℃で１時間進行させる。４％のポリアクリルアミドゲル上に試料を装てんし、電気泳動させ、前述のとおり電気溶出により精製する。２０μＬのｄｄｌ１２０中でＤＮＡベレットを溶解させる。

Ｘｈｏｌ／Ｎｈｅｌて消化したｐｓｃＦＶＵＨＨ１００ナノグラムを、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてＸｈｏ　ｌ及びＮｈｅ　ｌで消化された１対１のモル比の精製ヒトｖ、、インサートと連結させる。供給業者の指示に従って、コンビ−テントＥ、ｃｏｌｉ＾６１細胞（Ｓ　ｔ　ｒａ　ｌａｇｅｎｅ）を形質転換するのにアリコートを用いる。

ＧｖｗＰ親水性膜（Ｃａｔ　＃　ＧＶＷＰ１４２５０．Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）をＣＡＭ２０１Ｂ寒天平板上に置＜　（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、　＋９８９）。各々の平板に１枚の膜を加える。

以上からのＥ、ｃｏｌｉ　ＡＧＩ形質転換懸濁液を４００マイクロリツトル、各膜の表面全体にわたり均等に伸展させる。平板を１６時間３７℃の周囲温度でインキュベートする。

ＴＡＧ−７２でコーティングされた膜の調製：ＬＳ１７４Ｔ−細胞内て産生された部分的に精製された１％希釈の腫瘍関連糖タンパク質−７２（ＴＡＵ−７２）をＴＢＳ（Ｃａｔ　＃　２８３７６、Ｐｉｅｒｃｅ）内で調製する。ＴＡＧ希釈物ｌＯミリリットルを今後の使用のためのペトリ皿（Ｃａｔ　ｔｉ　８−７５７ −１４　Ｆｉｓｈｅｒ）の中に置く。Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ　ＰＶＤＦ　トランスファ膜（Ｃａｔ　＃　５Ｅ１５１１０３．Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）をメタノール内に浸漬する。次に膜を３回熱１１１１２重精製水の中で洗う。最終洗浄の後、余分な水を排出させる。各々の膜をＩＯミリリットルの希釈ＴＡＧ−７２内に入れる。

穏やかに振とうさせながら一時間周回部麿で膜をインキュベートさせる。インキュベーションの後、膜を約１時間周回部度で、ウェスタン遮断溶液（２５ｍＭノドリス、０．１５Ｍ）ＮａＣ１，ｐＨ７，６；　１％（７）ＢＳＡ）を用いて遮断する。

遮断溶液をＴＡＧ膜から排出させる。ＴＡＧ−７２にさらされた側面が上に向いている状態で、膜を新鮮なＣＡＭ２０平板上に置く。結果として発生したエアポケットを除去する。次に細菌膜を、コロニー側を上にしてＴＡＧ膜に付加する。

寒天平板を２４〜９６時間周囲温度で回部キュベートする。

ＴＡＧ−７２及び細菌膜の方向性は、不変色インキで印づけされている。

寒天表面から両方の膜を取り出す。０．２ｉｇのＣＣ４９−ビオチンプローブ抗体を含む２０−のウェスタン抗体緩衝液（０，０５％のＴｗｅｅｎ−２０中のＴＢＳ、Ｃａｔ　＃　ｐｉ３７９．Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　１％のＢＳＡ、Ｃａｔ　＃　３２０３．Ｂｉｏ−ｃｅｌｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の中にＴＡＧ−７２膜を置く。細胞膜をその当初の方向性で寒天表面上に再度置き、取り置きしておく。ＣＣ４９−ビオチンを、穏やかに振とうさせながら３１℃で１時間ＴＡＧ膜に結合させる。

次に膜を３回ＴＴＢＳ（ＴＢＳ、　０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）を用いて３００　ｒｐｍで軌道振とう装置上で５分間洗浄する。ウェスタン抗体緩衝液にストレプトアビジンアルカリホスファターゼ（Ｃａｔ　＃　７１００−０４．Ｓｏｕ４ｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ）を付加して０．１％の溶液を生成する。

ＴＡＧ−７２膜を各々１５ミリリツトルのストレプトアビジン溶液の中に浸漬させ、穏やかに振とうしながら３７℃で３０分間インキュベートさせる。

インキュベーションの後、膜を前述のとおりに洗浄する。ウェスタンアルカリ性リン酸緩衝液（８，４ｇ、　ＮａＣ０＋　、０．２０３　ｇ（７）ＭｇＣＩｔ− ｔｌ＋ｏ。

ｐＨ９，８）を用いて周囲温度、２００　ｒｐｍで２分間、最終的洗浄を行なう。

膜を発達させるため、各膜表面にウェスタンブル−安定化基１ｉ（Ｃａｔ＃　５３８４　Ｂ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を付加する。周囲温度で３０分間、ｄｄｌ＋２０で３回膜をすすぐことにより、膜の発達を停止させる。次に膜を写真撮影する。

次に膜を写真撮影し、透明なゾーンを、以前に取り置きした親水性膜上のコロニーと相関させる。培養中の成長のためコロニー（単数又は複数）を分離し、特異性及び親和力を評価するためのタンパク質の調製及び配列決定のためプラスミドＤＮＡを調製するのに使用する。

ｐＡＴＤＦＬＡＧを用いたＨｕｍ４　Ｖｔ、−ヒトＶｌ＋の組合せの同定第２の検定システムにおいては、検定段階でＴＡＧ−７２でコーティングした疎水膜に結合したあらゆるＩｌｕｍ４　Ｖｔ　−Ｖｏ　５ＣＦＶ組合せを検出するためのプローブとしてＩＯＩ　Ｍｌ＋抗体が使用されるという点を除いて、前出の概要に従ってＴＡＧ−７２に結合するｌＩｕｍ４　Ｖｔ、−ヒトＶｌ＋組合せが発見される。

Ｈｕｍ４　■＋　と隣接して発現されるべきあらゆるヒトＶＨ遺伝子の３′にフラグコーティング配列を内含するため、ｐｓｃＦＶＵＨＨ（図２９参照）からプラスミドｐＡＴＤＦＬＡＧを生成した。Ｘｈｏ　Ｉ及びＮｈｅｌで消化され精製された時点で、プラスミドｐＡＴＤＦＬＡＧは、この５ＣＦＶフオーマツト中にＨｕｍ４　ＶＬを含むヒト６１１発見プラスミドとなる。プラスミドｐＡＴＤＦＬＡＧは以下のように生成された。アニールされたＦＬＡＧ及びＦＬＡＧＮＣオリゴヌクレオチドとの連結反応においては、Ｘｈｏ　ｌ及びＮｈｅｌて処理されたプラスミドｐｓｃＦＵＶＨＨ（分離した上述のとおりのもの）を使用した。

ＦＬＡＧＣ：５’　−ＴＣＧＡＧＡＣＡＡＴＧＴＣＧＣＴＡＧＣＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＴＧＡＴＧＡＣＡＡＡＴＡＡＡＡＡＣ−３’ＦＬＡＧＮＣ：５’　−ＣＴＡＧＧＴＴＴＴＴＡＴＴＴＧＴＣＡＴＣＡＴＣＧＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＣＧＣＧＣＧＡＣＡＴＴＧＴＣ−３’連結緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて等モル量（各々Ｉ　Ｘｌ０−”モル）のオリゴヌクレオチドＦＬＡＧＣとＦＬＡＧＮＣを混合した。試料を９４℃に加熱し、以下の連結反応において使用する前に３５℃以下にまで冷却させる。

ｐｓｃＦＶＵＨＨＸｈｏｌ／Ｎｈｅｌベクター　１．５μ＋アニールされたＦＬＡＧＣ／ＦＬＡＧＮＣＯ，８５μ１１０ｘ連結緩衝液　２μｌＴ４　ＤＮＡリガーゼ　１μｍ１０ＭＭ　ＡＴＰ　２μｍｄｄｌ＋、０　１２．６５μＩ以上で開示した連結プロトコルに従って以下の成分及び量を用いて反応を実施する。３μｍの上述の連結反応を用いてＥ、ｃｏｌｉ　ＡＧＩ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換し、ＣＡＭ２０プレートを用いてコロニーを選択する。適切なＮｈｅｌ、　Ｘｈｏｌ及びＮｈｅｌ／Ｘｈｏｌ制限パターンをもつクローンをＤＮＡ配列決定のために選択する。

ＰＡＴＤＦＬＡＧ中のフラグリンカ−の配列を確認するために用いられるオリゴヌクレオチド（図２８参照）はＰＥＮＰＴＳＥＱ：５’　−ＣＴＴＴＡＴＧＴＡＡＧＡＡＧＡＴＧＡＴＧＴＴＴＴＧ−３と呼ばれる。このオリゴヌクレオチドはｐｅｎＰターミネータ−領域の非コーティング鎖から誘導される。ＤＮＡ配列決定は、メーカーの指示事項に従って５ｅｑｕｅｎａｓｅＴ″配列決定キット（Ｕ、Ｓ、　Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｃａｌ、　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、　ＯＨ）を用いて行なわれる。Ｈｕｍ４　Ｖ　Ｌ　ｔｌＮ　ＩＨＯＰ　Ｅリンカー−ＦＬＡＧペプチドのＤＮＡ及び波峰されたアミノ酸配列は、図２８に示されている。

ｐＳＣ４９ＦＬＡＧの生成ＣＣ４９ＶＨをＸｈｏｌ−Ｎｈｅｌ　ｐＡＴＤＦＬＡＧの部位内に挿入しく図２９参照）、ＴＡＧ−７２に対する結合を検出するためのＦＬＡＧ検定システムのための正の対照として用いる目的で生物学的活性について評価する。ｐＳＣ４９ＦＬＡＧ　（図２９参照）と呼ばれる新しいプラスミドを次のように生成する。

Ｘｈｏ　ｌ及びＮｈｅ　Ｉを用いてプラスミドｐＡＴＤＦＬＡＧ　（Ｍａｇｉｃ　ＭｉｎｉｐｒｅｐＴＭシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）により２．５４の培養から精製されたもの、５　ｍｇ）を処理し、ｐｓｃＦＶＵＨＨについて上述したように大きいベクターフラグメントを精製する。オリゴヌクレオチドＵＮＩ３を５′ 末端オリゴヌクレオチドとして５Ｃ４９ＦＡＧを３′末端オリゴヌクレオチドとして、ｐｓｃＦＶＵｌ（ＨからＰＣＲ増幅によりＣＣ４９Ｖ　ｕ　イ：／　サートＤＮＡ７ラグメントを得る。Ｃ末端にＦＬＡＧペプチドを伴う、結果として得られたこの５ＣＦＶ抗体のＤＮＡ及びアミノ酸配列は図３０に示されている。ｌｏｏｐｍｏｌの各々のオリゴヌクレオチド、Ｏ，ｌｎｇのｐｓｃＦＶＵＨＩＩｌｌｌ的ＤＮＡ（未切断）及びＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓから提供された標準プロトコルの末端試薬を用いてＰＣＲ反応を行なう。ＤＮＡをまずゲル精製し、次にＸｈｏ　ｌ及びＮｈｅｌて処理して付着末端を生成し、４％のポリアクリルアミドゲルから精製して、前述のとおり電気溶出する。メーカーの指示事項に従って、＋００　ｎｇのベクターＤＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅキット）を用いてＩ：ｌのモル比でＤＮＡベクター（Ｘｈｏｌ及びＮｈｅｌで処理されたｐＡＴＤＦＬＡＧ）及びインサート（Ｘｈｏｌ及びＮｈｅｌテ処理されたｐｓｃＦＶＵｌから）ｃｃ４９ＶｕＰＣＲ産物、を連結し、Ｅ、Ｃ０１ｉ　ＡＧＩコンピーテント細胞を形質転換するのに用いる。ｐｓｃ４９ＦＬＡＧクローンとして、適切なプラスミドＤＮＡを伴うコロニーを選びとる。

ＰＣＲ増殖されたＨｕｍ４　Ｖ　ｏインサートの連結連結反応のためのプロトコルは以下のとおりである。

（上　！ＯＮ＾ベクター：　ｐＡＴＤＦＬＡＧＸｈｏ　Ｉ／　Ｎｈｅ　ｌ　２．５　μＬ１０＋ｎＭのＡＴＰ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）　２　μＬ１０ｘ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）　２　μＬＴ４　ＤＮＡリガーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）　ｌ　μＬｄｄＨ，ｏ　６．５μＬＤＮＡベクター、ＡＴＰ　、　１０ｘ緩衝液及びｄｄＨｇｏを組合わせる。ＤＮＡインサート及びＴ４　ＤＮＡリガーゼを次に付加する。連結反応を次（こ、１８℃で旧０を含む４Ｌのビーカー内に置く。４℃で一晩冷蔵することによって水の温度を漸進的に降下させる。この連結反応（よ、ｐＨｕｍ４Ｖ　ｔ　Ｈｕｍ　Ｖ　＋＋　（Ｘ）を生成する。

山粍茎、ｊ艶５土わ１呈１区μ匹咀瓜厚亙１槽コンビーテントＥ、ｃｏｌｉ　ＡＧＩ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ）内への’　ｐＡＴＤＦＬＡＧの形質転換は、以下の供給業者のプロ６３１１に従って達成最初の３つの段階すなわち、ＴＡＧコーティングされｔこ膜の調製、細菌膜の平板培養、及びＴＡＧ及び細菌膜の組立て番よ、ＣＣ４９−ビオチン競合平板検定に記述されているものと同じである。

周囲温度で２４時間のインキュベージコンの後、４分間２５０　ｒｐｍでＴＴＢＳを用いて三回膜を洗う。Ｍｌ＋抗体（Ｃａｔ　＃　ｌＢ１３０１０．　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏ−ｎａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ）を次にＴＢＳで希釈して、１０．８５　μｇ／ｍｌから０．０３μｇ／−の濃度にする。

各々の膜に希釈した抗体をｌＯミ＋Ｊリットル加える。その後、膜を１時間周囲温度でインキュベートし、７０ｒｐｍで回転振とう装置上で振とうさせる。インキュベーションの後、Ｍ１１抗体を除去し、５分間周囲温度で２５０　ｒｐＩｌｌで三回膜を洗う。

最終洗液を除去し、ヒツジ抗マウスペルオキシダーゼ結合した全抗体（Ｃａｔ　＃　ＮＡ　９３１．Ａｍｅｒｓｈａｍ）のｌ：２０００希釈を２０ミリリツトル、ＴＢＳを用いて調製ｉ７、各々の膜に加える。膜を１時間周囲温度、７０ｒｐａ＋で再びインキュベートする。インキュベーションに続いて、膜を３回、各々２５０　ｒｐｍ　、周囲温度で５分間洗浄する。メーカーの指示事項に従ッテ膜を発達させるのに、Ｅｎｚｙｇｒａｐｈｉｃ　ｗｅｂｓ（Ｃａｔ　＃　ＩＢ８２１７０５１゜Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　Ｉｎｃ、　）を使用する。

次に膜を写真撮影する。

ＴＡＧ−７２に結合する５ＣＦＶを産生する陽性Ｈｕｍ４　ＶＬ　−ＶＨ（ｘ）クローンについて、発達した膜上の透明なゾーンを見る代りに（競合スクリーニング検定で見られるように）、この直接ＦＬＡＧ検出検定では、青−紫色のスポットが、ＴＡＧ−７２でコーティングされた膜に結合した５ＣＦＶを産生ずるコロニーを表わしている。ＦＬＡＧシステムを用いることの利点は、ＴＡＧ−７２に結合したあらゆるＨｕｍ４　Ｖ　−Ｖ　Ｈ３ＣＦＶ組合せが検出されることになるという点にある。親和力は、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ（１９４９）、前出）により測定でき、又特異性は免疫組織化学により測定できる。次にこれらの候補を、競合検定（前出）を用いて特異的エピトープに、及び望ましくは競合抗体又は擬態に対する結合についてチェックする。

寄託された実施態様は本発明の１態様の（２つの）例示として意図されたものであることから、本発明は、寄託された細胞系統によってその範囲が限定れるべきものではなく、機能的に等価な全ての細胞系統が本発明の範囲内に入る。実際、本発明はその特定の実施態様を基準にして詳述されてきたものの、当業者にとっては、添付のクレームの精神及び範囲から逸脱することなくさまざまな変更及び修正を行なうことができるということは明白であろう。

Ｆ工Ｇ、４Ｍｅｔ：　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ｐｈｅｌ　５　’　−ＧＡＡ　ＴＴＣＡＴＧ　ＧＡＡ　ＡＡＡ　ＣＴＴ　ＴＧＧ　ＴＴＣＦ工Ｇ、４　（ＣＯＮＴ、）Ｆ工Ｇ、４Ｆ工Ｇ、５Ｆ工Ｇ、５　（ＣＯＮＴ、）Ｆ工Ｇ、７Ｆ工Ｇ、８ＨＵＭＶＬ（−）、９Ｂ−ＨＥＲ：ＧＡＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴＣＣＣＴＣＣＧＣＣＧＡＡＡＧＴＦ工Ｇ、９ＴＴＴＣＣＴＭＦ工Ｇ、　１１Ｆ工Ｇ、１２Ｆ工Ｇ、　１５（ｐＳＶＺｎｅｏのＤＮＡ配列の部分）Ｅｃｏ　Ｒ１部位５′の方向−ＧＡＧＧＡＧＧＴＴＡΩにニエｍ込ＱＡＣＡＧＡＧ　ＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＡＧＴＴＴＧＧＡＣＡ　ＡＡＣＣＡＣＭＣＴ　ＡＧＡ−３’Ｆ工Ｇ、　１６ＡＣＧＴ　ＡＣ，ＧＴＦ工Ｇ、　１７ＴＯＷＡＲＤＳＴＡＡＧＡＴＡＴＡＴ　ＴＣＧＴＧＡＣＣ−３’　Ｂａｍ　Ｈ工　３６２１Ｆ工Ｇ、　１８Ｆ工Ｇ、　１９ＣＣ４９Ｃｈ４４　及びＣｈ４４１１間の相互競争ＴＡＧ−７２への１−１２５　Ｃｈ、’１９の結合の阻害ＴＡＧ−７２への１−１２５　Ｃｈ４９の結合の阻害ＣＣ４９Ｃｈ４４　及びＣｈ４４Ｈ間の相互競争Ｊ　）濃度ｘ　ｌ／３ＡＮＦ工Ｇ、　２１Ｆ工Ｇ、　２２Ｆ工Ｇ、２２　（ＣＯＮＴ、）Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　５ｅｒＡＣＣＴＣＡ　ＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＡＧ　ＴＧＡＡＧＣＴＴＧＧＡＡＣＡＣＣＡＣＡＣＡＡＡ　ＣＣＡＴＡＴＣＣＡＡ　ＡＦ工Ｇ、　２６ＴＣＣＡＴＣＡＣＴＴ　ＣＣＣＴＣＣＧＴＴＣＡＴＴＴＧＴＣＣＣＣＦ工Ｇ、２６　＜続き）Ｆ工Ｇ、２６　に○ＮＴ、）Ｆ工Ｇ、２６　（ＣＯＮＴ、）Ｎｈｅ　工Ｆ工Ｇ、２８Ｆ工Ｇ・　２８　（続き）Ｆ工Ｇ、２８　（続ッ、ＡＡＧＴＣＡＣＴＴ　ＧＧＴＧＡ’Ｌ’ＣＡＡＧ　ＣＴＣＡＴＡＴＣＡＴＴＧＴＣＣＧＧＣＡ　ＡＴＧＧＴＧＴＧＧＧ　ＣＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＣＡＴＣＴＴ　ＴＡＡＡＧＡＴＣＡＴ　ＧＴＧＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＣＧＧＧＡＡ　ＡＡＴＣＧＧＴＣＴＧ　ＣＧＧＧＡＡＡＧＧＡＧＧＧＴＴＧＧＡＴ　ＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡ　ＴＴＣＧＧＡ’Ｉ’ＣＣＴＴＧ、　３０ＴＣＣＡＴＣＡＣＴＴ　ＣＣＣＴＣＣＧＴＴＣＡＴＴＴＧＴＣＣＣＣＶａｌ　Ｍｅｔ：　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　ＡｌａＧＴＧ　ＡＴＧ　ＡＣＣＣＡＧ　ＴＣＴ　ＣＣＡ　ＧＡＣＴＣＣＣＴＧ　ＧＣＴＶａｌ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　入１ａ　Ｔｈｒ　工１ｅ　ＡｓｎＧＴＧ　ＴＣＴ　ＣＴＧ　ＧＧＣＧＡＧ　ＡＧＧ　ＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＡＣＦ工Ｇ、３０　＜続き〉ＴＴＧ、３０　に○ＮＴ、）Ｇｌｎ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　ＧｌｙＣＡＧ　ＣＡＧ　ＴＣＴ　ＧＣＴ　ＧＡＧ　ＴＴＧ　ＧＴＧ　ＡＡＡ　ＣＣＴ　ＧＧＧＡｌａ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　工１ｅ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　５ｅｒＧＣＴ　ＴＣＡ　ＧＴＧ　ＡＡＧ　ＡＴＴ　ＴＣＣＴＧＣＡＡＧ　ＧＣＴ　ＴＣＴＴｒｐ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇ：Ｌｕ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　ＬｅｕＴＧＧ　ＧＴＧ　ＡＡＡ　ＣＡＧ　ＡＡＣＣＣＴ　ＧＡＡ　ＣＡＧ　ＧＧＣＣＴＧＧｌｕ　Ｔｒｐ　工１ｅ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　ＡｓｎＧＭ　ＴＧＧ　ＡＴＴ　ＧＧＡ　ＴＡＴ　ＴＴＴ　ＴＣＴ　ＣＣＣＧＧＡ　ＭＴＡｓｐ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　ＬｙｓＧＡＴ　ＧＡＴ　ＴＴＴ　ＭＡ　ＴＡＣＭＴ　ＧＡＧ　ＡＧＧ　ＴＴＣＭＧＧｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　５ｅｒＧＧＣＡＡＧ　ＧＣＣＡＣＡ　ＣＴＧ　ＡＣＴ　ＧＣＡ　ＧＡＣＡＡＡ　ＴＣＣＬｅｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　’Ｉ’ｙｒ　ＰｈｅＣＴＧ　ＡＣＡ　ＴＣＴ　ＧＡＧ　ＧＡＴ　ＴＣＴ　ＧＣＡ　ＧＴＧ　ＴＡＴ　ＴＴＣＦ工Ｇ、３０　（続き）ｗ、ｓｓｗ＋　Ａ＃７１ｉｅ、　ＮゴＩＡＬＩ　＠１ｍＥＮＴＡフロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　４７／４８　Ｚ　７４３３−４ＣＣＯ７Ｋ　１６／１８１６／３０　８３１８−４ＨＣ１２Ｎ　１／２１　７２３６−４８１５１０９　ＺＮＡＧＯＩＮ　３３１５３　Ｖ　８３１０−２Ｊ３３１５３１　Ａ　８３１０−２Ｊ３３１５７４　Ｂ　９０１５−２Ｊ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０８Ｃ１２Ｒ１：１９）（Ｃ１２Ｎ　１／２１Ｃ１２Ｒ１：１９）（７２）発明者　リチャード、ラス　ニー。

アメリカ合衆国、ミシガン　４８６４２．ミツドランド、プレーンフィールド　ストリート　５１１１ＩＡ６１Ｋ　４９１０２　Ｂ（７２）発明者　ジョンソン、キム　ニス。

アメリカ合衆国、ミシガン　４９６４２．ミツドランド、フリーダム　コート３７６５

Claims

【特許請求の範囲】

１．ＴＡＧ−７２のための結合親和性を有する複合Ｈｕｍ４ＶＬ，ＶＨ抗体であって：Ａ．可変領域を有するＩ鎖（ＶＬ）、前記ＶＬはヒトサブグループＩＶ生殖系遺伝子に対して効果的に相同であるＬ鎖可変領域（Ｈｕｍ４ＶＬ）の少なくとも一部をコードてるＤＮＡ配列によりコードされ：及びＢ．可変領域を有するＨ鎖（ＶＨ）、前記ＶＨはＴＡＧ−７２を結合する能力を有する立体構造を形成するためにＶＬと結合できるＨ鎖可変領域（ＶＨ）の少なくとも一部をコードするＤＮＡ配列セグメントによりコードされる、を含んで成る抗体。
２．前記ＶＬがヒトＪ遺伝子セグメントによりさらにコードされる請求の範囲第１項記載の複合Ｈｕｍ４ＶＬ，ＶＨ抗体。
３．前記ＶＨがＶＨαＴＡＧ生殖系遺伝子（ＶＨαＴＡＧ）に対して効果的に相同なサブセグメントを含んで成るＤＮＡ配列によりコードされる請求の範囲第１項記載の複合Ｈｕｍ４ＶＬ，ＶＨ抗体。
４．前記ＶＨが動物Ｄ遺伝子セグメント及び動物Ｊ遺伝子セグメントによりさらにコードされる請求の範囲第１項記載の複合Ｈｕｍ４ＶＬ，ＶＨ抗体。
５．前記可変領域がＣＣ４６，ＣＣ４９，ＣＣ８３又はＣＣ９２の可変領域に由来する請求の範囲第１項記載の複合Ｈｕｍ４ＶＬ，ＶＨ抗体。
６．前記ＶＨが、（１）ＶＨαＴＡＧに由来する遺伝子によりコードされる相補的多様性領域（ＣＤＲ）及び（２）ヒト遺伝子によりコードされる、ＣＤＲセグメントに隣接する骨格セグメントを含んで成る請求の範囲第１項記載の複合Ｈｕｍ４ＶＬ，ＶＨ抗体。
７．前記Ｌ鎖がヒトＬ鎖（ＣＬ）の少なくとも一部をさらに含んで成り、そして前記Ｈ鎖が動物不変領域（ＣＨ）の少なくとも一部をさらに含んで成る請求の範囲第１項記載の複合Ｈｕｍ４ＶＬ，ＶＨ抗体。
８．前記ＣＨがＩｇＧ１−４，ＩｇＭ，ＩｇＡ１，ＩｇＡ２，ＩｇＤ又はＩｇＥである請求の範囲第６項記載の複合Ｈｕｍ４ＶＬ，ＶＨ抗体。
９．前記ＣＬがカッパ又はラムダである請求の範囲第７項記載の複合Ｈｕｍ４ＶＬ，ＶＨ抗体。
１０．（ａ）可変領域を有するＬ鎖（ＶＬ）、前記ＶＬはヒトサブグループＩＶ生殖系遺伝子（Ｈｕｍ４ＶＬ）に対して効果的に相同なＬ鎖可変領域（ＶＬ）の少なくとも一部をコードするＤＮＡ配列によりコードされ；（ｂ）前記ＶＨはＨ鎖可変領域（ＶＨ）の可変領域を有するＨ鎖（ＶＨ）、少なくとも一部をコードするＤＮＡ配列セグメントによりコードされ；及び（ｃ）ＶＨ及びＶＬを連結するリンカー、ここで前記ポリペプチドリンカーは、ＴＡＧ−７２を結合する能力を有する立体構造を形成できる一本鎖抗体に前記ＶＨ及びＶＬを適切に折りたたむ、を含んで成る複合Ｈｕｍ４ＶＬ，ＶＨ一本鎖抗体又はその免疫反応性フラグメント。
１１．イメージングマーカー又は治療剤に接合される請求の範囲第１〜１０のいづれか１項記載の複合Ｈｕｍ４ＶＬ，ＶＨ抗体を含んで成る複合Ｈｕｍ４ＶＬ，ＶＨ抗体接合体。
１２．前記イメージングマーカーが、【配列があります】【配列があります】及び９９ｍＴｃから成る群から選択される請求の範囲第１１項記載の複合Ｈｕｍ４ＶＬ，ＶＨ抗体接合体。
１３．前記治療剤が薬物又は生物学的応答変性剤、放射性核種又はトキシンである請求の範囲第１１項記載の複合Ｈｕｍ４ＶＬ，ＶＨ抗体接合体。
１４．前記薬物がメトトレキセート、アドリアマイシン又はインターフェロンである請求の範囲第１３項記載の複合Ｈｕｍ４ＶＬ，ＶＨ抗体接合体。
１５．前記放射性核種が【配列があります】【配列があります】又は１１１Ｉｎである請求の範囲第１３項記載の複合Ｈｕｍ４ＶＬ，ＶＨ抗体接合体。
１６．医薬的に許容できる非毒性無菌キャリヤーに請求の範囲第１項記載の複合Ｈｕｍ４ＶＬ，ＶＨ抗体を含んで成る組成物。
１７．医薬的に許容できる非毒性無菌キャリヤーに請求の範囲第１２項記載の複合Ｈｕｍ４ＶＬ，ＶＨ抗体を含んで成る組成物。
１８．医薬的に許容できる非毒性無菌キャリヤーに請求の範囲第１３項記載の複合Ｈｕｍ４ＶＬ，ＶＨ抗体を含んで成る組成物。
１９．癌病変の現場検出のために医薬的に有効な量の請求の範囲第１６項記載の組成物を動物に投与することを含んで成る、癌のインビボ検出のための方法。
２０．前記動物がヒトである請求の範囲第１９項記載の方法。
２１．医薬的に有効な量の請求の範囲第１８項記載の組成物を動物に投与することを含んで成る、癌のインビボ処理のための方法。
２２．前記動物がヒトである請求の範囲第２０項記載の方法。
２３．内部手術治療のための方法であって、（ａ）医薬的に有効な量の請求の範囲第１６項記載の組成物を、少なくとも１つの腫瘍を有する動物に投与し、それによって、前記腫瘍が局在化され、そして（ｂ）前記腫瘍を切除することを含んで成る方法。
２４．前記動物がヒトである請求の範囲第２３項記載の方法。
２５．請求の範囲第１項記載の複合Ｈｕｍ４ＶＬ，ＶＨ抗体又はその免疫反応性フラグメントを発現できる細胞であって、（Ａ）ヒトサブグループＩＶ生殖系遺伝子（Ｈｕｍ４ＶＬ）に対して効果的に相同なＬ鎖可変領域（ＶＬ）の少なくとも一部をコードする第１ＤＮＡ配列；及び（Ｂ）ＴＡＧ−７２を結合する能力を有する立体構造を形成するためにＶＬと結合できるＨ鎖可変領域（ＶＨ）の少なくとも一部をコードする第２ＤＮＡ配列により形質転換される細胞。
２６．前記第１及び第２ＤＮＡ配列が少なくとも１種の生物学的に機能する発現ベクター内に含まれる請求の範囲第２５項記載の細胞。
２７．単一宿主細胞において、抗体Ｈ及びＬ鎖の可変ドメインを少なくとも含んで成る複合Ｈｕｍ４ＶＬ，ＶＨ抗体を生成するための方法であって：Ａ．ｉ）ヒトサブグループＩｇ生殖系遺伝子（Ｈｕｍ４ＶＬ）に対して効果的に相同なし鎖可変領域（ＶＬ）の少なくとも一部をコードする第１ＤＮＡ配列、及びｉｉ）ＴＡＧ−７２に結合する能力を有する立体構造を形成するためにＶＬと結合できるＨ鎖可変領域（ＶＨ）の少なくとも一部をコードする第２ＤＮＡ配列により少なくとも１種の宿主細胞を形質転換し、そしてＢ．前記形質転換された単一宿主細胞において前記第１ＤＮＡ配列及び前記第２ＤＮＡ配列を独立して発現する段階を含んで成る方法。
２８．前記第１及び第２ＤＮＡ配列が少なくとも１種のベクターに存在する請求の範囲第２７項記載の方法。
２９．前記複合Ｈｕｍ４ＶＬ，ＶＨ抗体の抗体Ｈ鎖及びＬ鎖が宿主細胞に発現され、免疫学的に機能する抗体分子又は抗体フラグメントとしてそれから分泌される請求の範囲第２８項記載の方法。
３０．前記第２ＤＮＡ配列が、ＣＣ４６，ＣＣ４９，ＣＣ８３又はＣＣ９２のＶＨをコードする請求の範囲第２７項記載の方法。