JPH07501696A

JPH07501696A - トウモロコシアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをエンコードするＤＮＡクローン

Info

Publication number: JPH07501696A
Application number: JP5509946A
Authority: JP
Inventors: アシユトン，アントニー，リチヤード; ジエンキンス，コリン，レスルシー，ダウ; ホイツトフエルド，ポール，レイモンド
Original assignee: アイシイアイ・オーストラリア・オペレイシヨンズ・プロプライアタリイ・リミテツド; ゼネカ・リミテッド
Priority date: 1991-11-28
Filing date: 1992-11-27
Publication date: 1995-02-23
Anticipated expiration: 2018-08-04
Also published as: AU678759B2; EP0615547A1; GB9125330D0; JP3434294B2; WO1993011243A1; CA2123908C; AU2953092A; CA2123908A1; US5854420A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】トウモロコシアセチルＣｏＡ　カルボキシラーゼをエンコードするＤＮＡクローン本発明は新規なりＮＡクローン及び植物を形質転換するための使用を包含するその使用及びかく得られる遺伝的に変性された植物に関する。

本発明によるクローンは、異型ＤＮＡ（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　ＤＮＡ）によって隣接されている（ｆｌａｎｋ）、トウモロコシアセチルＣｏ八　カルボキシラーゼをエンコードする遺伝子のＤＮＡ配列又はこれと実質的な相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を示す配列の少なくとも一部を含有する。

アセチルＣｏＡ　カルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）、即ち、ビオチン含有酵素は脂肪酸生合成経路（ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｐａｔｈ）の第一工程、即ち、アセチルＣｏ＾のカルボキシル化（ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｉｏｎ）によりマロニルＣｏ＾（ｍａｌｏｎｙｌ　ＣｏＡ）を生成させる工程を触媒する。従って、本発明のクローンはその適格な性質に従って多数の用途を有する。

例えば、ＡＣＣａｓｅ遺伝子の部分コード配列（ｐａｒｔｉａｌ　ｃｏｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含有する本発明のクローンは、植物ＤＮＡ　（例えば、ゲノムＤＮＡ又はメツセンジャーＲＮＡから調製されたｃＤＮＡライブラリー）をプローブして、本発明の他のクローンを得るのに使用し得る。

これらの他のクローンは異なるものであるか又はより長いものであり得る；これらはトウモロコシＡＣＣａｓｅの実質的に完全なりローンであるか又はトウモロコシ又は他の植物（単子葉植物又は双子葉植物）中の対応する又は類似する酵素をコードする遺伝子の一部又は全部であり得る。本発明による部分配列は発現カセットを構築するために、通常（但し、逆配向（ｒｅｖｅｒｓｅ　ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）においては必ずしも必要ではない）、植物内で機能する調節配列（ｒｅｇｕｌａｔｏｒ５ｅｑｕｅｎｃｅ）と組合せて使用し得る。ついで、この発現カセットを植物を形質転換するのに使用して、ＡＣＣａｓｅ酵素の産生をダウンレギュレート（低減）させ得る。このことによって、種子又は植物の他の部分の組成を変化させて、例えば、より低い或いは変性された油含有量を有する油担持植物（ｏｉｌ−ｂｅａｒｉｎｇ　ｐｌａｎｔ）　（アブラナ、ヒマワリ、油ヤシ）を製造し得る。

＾ＣＣａ５ｅ遺伝子のより長い又は実質的に完全な配列を含有するクローンも同様な発現カセットを形成させるのに使用し得る。かかるコーディング配列（ｃｏｄｉｎｇ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）を植物内で使用することにより、（より強力なプロモーターを使用することにより或いは遺伝子のエキストラコピー（ｅｘｔｒａ　ｃｏｐｙ）を挿入することにより）　、ＡＣＣａｓｅの発現又はオーバーエクスプレッション（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を促進すること、例えば、油含有量の多い植物を得ることができる。

本発明の部分クローン（ｐａｒｔｉａｌ　ｃｌｏｎｅ）はＡＣＣａｓｅ遺伝子のプロモーターを再生する（ｒｅｃｏｖｅｒ）ために植物ＤＮＡをプローブするのに使用し得る。ついでこのプロモーターを使用して組織特異的な（ｔｉｓｓｕｅ −ｓｐｅｃｉｆｉｃ）方法又は発生を制御する（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）方法でＲＮＡを生成させ得る。かく生成したＲＮＡはＡＣＣａｓｅ又は他の遺伝子の発現を抑制するか、又は、ＡＣＣａｓｅ又は他の蛋白質を生成させるｍＲＮＡであり得る。

単子葉植物においては、＾ＣＣａ５ｅ酵素はある種の草−雑草（ｇｒａｓｓ−冑ｅｅｄ）用除草剤（フルアジフオプのごときアリールオキシフェノキシプロピオネート、アルキルケトン）によって抑制され、これに対して、双子葉植物においては、＾ＣＣａ５ｅ酵素はこれらの除草剤に対して比較的耐性である。従って、本発明の別の特徴によれば、脂肪酸合成経路を阻害することにより除草剤の活性に対して耐性を示す単子葉植物であって、ＡＣＣａｓｅ酵素を発現させるのに適した本発明による構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を使用して形質転換させることにより得られたものである単子葉植物が提供される。かかる植物は種々の方法により耐性にせしめ得る：例えば、１、例えば強力なプロモーター又は多重遺伝子挿入物（ｍｕｌｔｉｐｌｅｇｅｎｅ　１ｎｓｅｒｔｉｏｎ）を使用することによる、単子葉植物ＡＣＣａｓｅのオーバーエクスプレッション；２、双子葉植物＾ＣＣａ５ｅの発現；３、場合により、耐性型のトウモロコシＡＣＣａｓｅの発現。耐性型トウモロコシＡＣＣａｓｅは適当な宿主中での突然変異誘発と選択又は適当な除草剤の存在下での植物の組織培養によって取得し得る。

除草剤の作用に耐性を示す作物植物を提供する目的は、正常な状態、即ち、除草剤感受性の状態の作物植物を破壊する除草剤を除草に有効な濃度で全体的に適用することにより、作物植物の間にある雑草の破壊を促進することにある。かかる耐性植物も除草剤が以前の植物から移行する期間が短い場合には有用である。新規な形式の除草剤耐性を有する作物の開発は作物学的に有用であり、現在利用し得る手段よりも安全で、安価で又はより効果的な手段により改善された収穫量を得るための追加的な選択を農家に与える。本発明の場合には、トウモロコシ又は小粒作物、例えば小麦又は大麦を除草剤のフルアジフォプに耐性にせしめることにより、この除草剤を上記の作物中の野生カラスムギを撲滅するのに使用することが可能である−このことは現在利用し得る方法に比較して、非常に効果的な前進である。

本発明によるクローンは、植物材料からＡＣＣａｓｅを抽出し、このＡＣＣａｓｅを精製し、ＡＣＣａｓｅにより哺乳動物の免疫系を攻撃する（ｃｈａ　ｌ　Ｉｅｎｇｅ）ことによってＡＣＣａｓｅに対する抗体を調製し、この抗体を免疫精製しくｉｍｍｕｎｏ−ｐｕｒｉｆｙ）ついで抗体を使用して植物ＤＮＡライブラリーからクローンを選択することにより調製される。この方法によって調製されたクローンＡ３及びＡ４　（それぞれ、＾３＾ＣＣｃＤＮＡ及び＾４＾ＣＣｃＤＮＡと命名されている）は、ピンプル（Ｐｙｍｂｌｅ）、Ｎ５Ｗ２０７３　、スアキンストリート（Ｓｕａｋｉｎ　５ｔｒｅｅｔ）　１所在の＾ｕｓｔｒａｌｉａｎ　Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに１９９１年１１月１３日に寄託された。

従って、本発明によるクローンを調製するためのより簡単な方法は、＾ｕｓｔｒａｌｉａｎ　Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手されるＡ３　ＡＣＣｃＤＮＡ及びＡ４　ＡＣＣｃＤＮＡと命名されているクローン又はかかるクローンの関連物（ｒｅｌａｔｉｖｅｓ）又は後代（ｄｅｓｃｅｎｄａｎｔ）を増殖させることからなる。

以下の実施例及び図面を参照して本発明を更に説明する。

第１図は部分的に精製されたトウモロコシ＾ＣＣａ５ｅの５ＤＳ−ＰＡＧＥタイアゲラムである：第１図において、レーン（ｌａｎｅ）　Ａはクーマシーブルー染色ゲルであり、レーンＢはビオチン含有ポリペプチドの存在を示すＡＣＣａｓｅのストレプタビジンーホスファタアーゼ（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）処理エレクトロプロット（ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔ）である：第２図では多数の異なる制限酵素を用いて切断したＡ４状ｃＤＮ＾（Ａ４−１ｉｋｅ　ｃＤＮＡＸＡ１２）と＾３状ｃＤＮＡ　（Ａ３４）の消化パターンが比較されている；第３図はＡ３　ＡＣＣｃＤＮＡ　トウモロコシクローンのヌクレオチド及び推定（ｄｅｄｕｃｅｄ）アミノ酸配列である；第４図はＡ３状クローンＡｌ０（ａ）及びＡ３４　（ｂ）の５°末端のヌクレオチド配列である。

第５図はＡ４状クローンＡ１２（ａ）　、Ａ４（ｂ）の５°末端及びＡ１２（Ｃ）の３゛末端のヌクレオチド配列である。

実施例においては、トウモロコシｃＤＮＡ発現ライブラリーからクローンを選択するために、トウモロコシＡＣＣａｓｅに対するアフィニティー精製（ａｆｉｎｉｔｙ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ）抗体を使用することが記載されている。そして、得られた３種のクローンがトウモロコシＡＣＣａｓｅをエンコードすることが示されている。クローンの同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）の確認の証拠は下記の通りである：（ｉ）クローンの一つのＤＮＡ塩基配列決定（ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）から推定されたアミノ酸配列は、ラット及びニワトリＡＣＣａｓｅの配列の一部と５０％まで同一であることが認められた。

（ｉｉ）最も長いクローンされたｃＤＮＡインサート（４，５ｋｂ）は、ＡＣＣａｓｅをエンコードするｍＲＮＡ以外の、植物中の既知のビオチン含有酵素をエンコードするｍＲＮＡの予想された長さくｐｒｅｄｉｃｔｅｄｌｅｎｇｔｈ）よりかなり長い。

Ａ３及びＡ４クローンは２種の異なるトウモロコシＡＣＣａｓｅ遺伝子ＤＮＡから、他の植物−単子葉植物及び双子葉植物の両者−からＡＣＣ型コーディング配列及び遺伝子を単離するのに適当なプローブを得゛ることか可能である。

照射下、殺菌土壌中で生長させた。２〜４週令の植物の葉を酵素の調製に使用した。

精製。抽出及び精製操作は０〜４℃で行った。

抽出。葉材料（１６０ｇ）を０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＪ緩衝液（ｐＨ８，０）、１０ｍＭのＭｇＣＡ’　２．１　ｍＭのＥＤＴＡ　、　２０　ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭのＰＭＳＦ　、　２　ｍＭのベンズアミジン（ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ）塩酸塩及び２％（Ｗ／ｖ）のポリビニルピロリドンからなる媒体３００　ｒｎｌと共にワーリングブレンダー（ｆａｒｉｎｇ　ｂｌｅｎｄｅｒ）中でホモジナイズした。ホモジネートを２層のモスリン及び２層のミラクロス（Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ）を通して濾過しついで濾液（３８０ｍ７りを１３０００ｇで３０分間遠心分離した。

硫酸アンモニウム及びエチレングリコール分別工程。遠心分離した抽出物（３６５ｍＡ！　）に攪拌しながら、混合物を４０％飽和度にするのに十分な固体硫酸アンモニウムを添加した。４０分分間中かに攪拌した後、混合物を１３０００ｇで３０分間遠心分離し、上澄液を廃棄した。

蛋白質ペレットを２０　ｍＭのＴｒｉｓ−Ｈ（Ｊ緩衝液（ｐＦ１８．０）、１０ｍＭのＭｇＣ１２，１ｍＭ（７）ＥＤＴＡ、　１０　ｍＭのジチオトレイトール、０．２ｍＭのＰＭＳＦ及び１０％（ｖ／ｖ）のグリセロールからなる媒体中に再度溶解させた。

この溶液（２０４ｍＡ）に攪拌しながら、固体ＰＥＧ（１００ｍＡ当り、８　ｇ）を添加した。４０分分間中かに攪拌した後、懸濁液を前記と同様に遠心分離しついでベレットを廃棄した。上澄液にＰＥＧ　（１００ｍｌ当り、１２ｇ）を更に添加し、４０分間攪拌した後、混合物を再度遠心分離し、ペレットを保持した。

マトリックス　ゲル　オレンジＡ（Ｍａｔｒｉｘ　ｇｅｌ　Ｏｒａｎｇｅ　Ａ）上でのアフィニテイクロマトグラフィー。沈殿した蛋白質を２０　ｍＭのへペス（Ｈｅｐｅｓ）　ＫＯＨ（ｐＨ６，８）、１０ｍＭのＭｇＣＡ’　２．１　ｍＭのＥＤＴＡ、　１０　ｍＭのＤＴＴ及び１０％（ｖ／ｖ）のグリセロールからなる緩衝液中に再度溶解させついで１００００　ｇで２０分間清澄化させた。上澄液（１００ｍＡ’　）を４０　ｒａｌのオレンジスカラム（上記の溶解媒体（ｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ）からなるが、ＤＴＴの代わりに２０　ｍＭの２−メルカプトエタノールを含有するカラム緩衝液（ｃｏｌｕｍｎ　ｂｕｆｆｅｒ）で予め平衡化）を１分当り約０，４１１［ｌｌの流率で通過させた。ついでカラムを１分当り約１ｍｌのカラム緩衝液８００　ｒｎｌｌで洗浄して非結合蛋白質を除去した。ついでアセチルＣｏＡカルボキシラーゼを０．５ｍＭのＣｏＡを含有する溶解緩衝液（ｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ）　１００ｍ１及び追加の溶解緩衝液を使用してカラムから溶離させた。アセチルＣｏＡ　カルボキシラーゼ活性を含有するフラクションをプールしく１００　ｍｌ）　、ＰＩＩ３０膜（ＰＭ３０　ｍｅｍｂｒａｎｅ）（Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上での限外濾過により５．８ｔｎｌの容量になるまで濃縮した。酵素溶液を複数のアリコートに分割し、急速に冷凍しく液体窒素中）ついで−８０℃ で貯蔵した。

酵素活性の測定アセチルＣｏＡ　カルボキシラーゼ活性の測定は、公表されている方法に基づいて、酸安定性生成物（ａｃｉｄ−ｓｔａｂｌｅ　ｐｒｏｄｕｃｔ）中にＮａ　Ｅｌ　”ＣＯ３からの放射能（ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ）を酵素及び基体（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）に応じて包含させる（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅ）ことにより３０℃で行った。反応混合物は下記のものを含有していた（２００μｌの全容量中）：１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｊ！緩衝液（ｐＨ８，０）、５０　ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣ１，５ｍＭのＤＴＴ、　２　ｍＭの＾ＴＰ　、　１５１１１１のＮａＨ１４ＣＯ３（１モル当り、約０．２５Ｃｉ）、０．７５ｍＭのアセチルＣｏＡ（）リリチウム塩）及び酵素（２〜１０　ｍｔｌ）。反応を酵素により開始させ、６分後、５０μｌの６Ｍ　ＨＣＩを添加することにより停止させた。反応混合物の一部により濾紙円盤上に斑点を付け、ついで濾紙を乾燥させついで酸安定性１４Ｃ反応生成物の量をシンチレーション計数（ｓｃｉｎｔｉ　ｌ　ｌａｔｉｏｎｃｏｕｎｔｉｎｇ）により測定した。１分当り、１μｍｏｌの基体の転化を触媒する酵素の量を１ユニツトとした。

蛋白質の測定蛋白質濃度は公表されている方法に従ってかつ標準としてウシ血清アルブミンを使用してクーマシーブルー染料の結合により測定した。

ニトロセルロース膜又はＰＶＤＦ膜に対する５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びエレクトロブロッティングは公表されている方法に従って行った。

＾ＣＣａ５ｅサブユニットの電気泳動的単離的６８０　ｔｔ　ｇの蛋白質を含有する＾ＣＣａ５ｅの製剤（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）　（実質的に前記の方法で部分的に精製したもの）３．７ｍＭを遠心フィルター（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ　ｆｉｌｔｅｒ）（Ａｍｉｃｏｎ　Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ　１００）を使用して１００μｌに濃縮した。濃縮蛋白質溶液を１２５−のＴｒｉｓ−ＨｆＪ　（ｐＨ６，７）、２％（Ｗ／Ｖ）のＳＤＳ、１０％（Ｗ／Ｖ）のグリセロール及び０．０１％（Ｗ／Ｖ）のブロムフェノールブルーを含有する消化混合物ｇＯμｌに添加し、溶液を９８℃で５分間加熱した。消化物（ｄｉｇｅｓｔ）を７．５％ポリアクリルアミドゲルの複数のトラックに適用し、蛋白質サブユニットを５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。その後、ゲルを５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＡ’　（ｐＨ６，７）で洗浄し、ついでクーマシープルーＧ（水中、１　ｗ／ｖ％）で染色した後、水で脱染した（ｄｅｓｔａｉｎ）。ＡＣＣａｓｅサブユニットを含有する染色ゲルのセグメントを切取った。

＾ＣＣａ５ｅサブユニットの化学的切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）及びフラグメントの単離＾ＣＣａ５ｅサブユニットを含有するゲルセグメントを４　ｍｌの聞Ａ（尿素：水：酢酸２５ｇ＋　２５　ｍｌ＋　２５　ｍｌ　）中で８０分間、溶液を一回交換して穏やかに攪拌した。ついで、このセグメントをＵＨＡ中の０．２％（Ｗ／Ｖ）のＮ−クロロスクシンイミドの溶液で６０分間処理してＡＣＣａｓｅサブユニットをトリプトファン残基の位置で切断し、ついで、５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ７！（ｐＨ６，７）で洗浄した（３０分間）。ついて、ゲルセグメントを１２５　ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐｉ（６，７）、５％（Ｗ／Ｖ）のＰＥＧ。

２０　ｍＭのＤＴＴ、　１％（Ｗ／Ｖ）のＳＤＳを含有する溶液で平衡化し、最後に、溶解しているセグメントを９５℃で６分間加熱した。＾ＣＣａ５ｅサブユニットの切断フラグメントを含有するゲルセグメントを１６％アクリルアミドゲルの複数のトラック上に添加し、フラグメントを５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。分離後、ポリペプチドフラグメントを公表されている方法に従ってＰＶＤＦ膜上にエレクトロプロットし、膜をアミドブラックで染色した。主要なポリペプチドフラグメントを含有する膜の部分を切取り、１０　ｍＭのＴｒｉｓ塩基により完全に脱染しついで水で洗浄した後、Ｎ−末端アミノ酸配列決定を行った。

Ｎ−末端アミノ酸配列決定Ｎ−末端アミノ酸配列決定はオーストラリア国立大学、生体分子資源機関（ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　Ｆａｃｉｌｉｔｙ）において確立されている技術に従って行った。

トウモロコシ＾ＣＣａ５ｅに対する抗体の生産オレンジへ−精製トウモロコシＡＣＣａｓｅ　［１ｍ／の完全フロインドアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’　ｓ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊｖａｎｔ）中に〜５０μｇの蛋白質］をウサギの後足の筋肉に注射した。４週間後、不完全フロインドアジュバント中の５０ｇｇのトウモロコシＡＣＣａｓｅを同様に注射した。ウサギを２〜３週間の間隔で出血させ（ｂｌｅｅｄ）　、血清を捕集した。

５ＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫プロッティング（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）の後のトウモロコシＡＣＣａｓｅへの結合又はトウモロコシＡＣＣａｓｅ活性の抑制によって判定されるごとく、最初の血清は検出可能なトウモロコシ＾ＣＣａ５ｅに対する抗体を含有していなかった。第２及びその後の出血においては上記した２つの基準によって判定されるごとくトウモロコシＡＣＣａｓｅに結合する抗血清が得られた。この抗血清をアフィニティー精製抗体の精製のための原料として使用した。

トウモロコシＡＣＣａｓｅに対する抗体のアフィニティー精製部分的に精製したトウモロコシＡＣＣａｓｅ（５００μｌ　）　ヲ調製（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により不純物から分離した。膜をアミドブラックで染色し、〜２００　ｋＤａにおける＾ＣＣａ５ｅバンドを切取った。膜を５％（Ｗ／Ｖ）の粉末ミルクを含有するＴＢＳ　（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ− ＨＣＩ　、　ｐＨ７，５，１５０ｍＭ　ＮａＣ１）中でインキユベーツションすることにより、膜上の残留吸着部位（ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　５ｉｔｅ）をブロックした。

ＡＣＣａｓｅ被覆膜を１　ｒｎｌの稀釈抗血清（０，５ｎＪの抗血清、０．５ｒｎｌのＴＢＳ）中で室温で１時間インキュベートすることにより、トウモロコシＡＣＣａｓｅに対する抗体を膜に吸着させた。膜を取出し、１０　ｍｌ　ＴＢＳ＋０．０５％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）　２０中で５分間、ついで１０　ｍｌのＴＢＳ中で２回（各々、５分間）洗浄した。膜結合抗体を１　ｒｎｌの０．１Ｍ　グリシン／　ＨＣＩ　、ｐＨ２，６と共に３分間インキュベートすることにより、溶離しついで中和した。この吸着と溶離のサイクルを同一の膜と抗血清を使用して更に２回繰返した。

使用前、アフィニティー精製抗体をＴＢＳにより２０倍に稀釈した。

Ｅ、Ｃｏ１１λフアージ溶菌液（ｌｙｓａｔｅ）で被覆したニトロセルロースと共にインキュベートすることにより、この抗体製剤から非特異的な抗体を減少させた（ｄｅｐｌｅｔｅ）。最後に、アフィニティー精製抗体をウマ血清アルブミンに関して１０％として、非特異的な結合を更に最少化した。

ウサギ抗血清によるＡＣＣａｓｅの免疫沈降対照及びＡＣＣａｓｅ免疫感作ウサギからの血清の一連の稀釈物を調製した。０．０２％（ｖ／ｖ）のトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ−１００を補充した酵素抽出物（５０μＩ）を稀釈血清（５０ μＩ）と混合腰３０℃でインキュベートした。トウモロコシについては、酵素はオレンジ＾精製されたものであり、一方、アマランサス　エジュリス（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ　ｅｄｕｌｉｓ）については、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８，０）、ＩＱ　ｍＭのＭｇＣｌ２．１　ｍＭのＥＤＴ＾、１０ｍＭのＤＴＴ及び０．０２％（ｖ／ｖ）のトリトンＸ−１００を含有する溶液　２　ｍｌ中の１ｇの組織から調製されたＧ−２５処理粗製葉抽出物を使用した。トウモロコシ酵素による血清のインキュベーションを５０分間行った後、プロティンＡ−セファロース（ＰｒｏｔｅｉｎＡ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ）の懸濁液２０　ｔ”　（０ −ＬＭ　ＫＨ２ＰＯ４緩衝液ｐＨ７，０中、Ｉ　ｌｌ１ｌ当り０．２ｇ）を添加しついで室温で更に６０分後、遠心分離することにより免疫複合体を取出した。

上澄液中に残留する酵素活性を測定した。血清を使用するアマランサス　エジュリスのインキュベーションを１６０分間行い、ついでプロティンＡと共に免疫沈降物（ｉ市ｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）を取出し、遠心分離にかけた（５分間、１１５００　ｇ）。Ａ、エジュリス混合物を更に１６時間４℃で放置した後、遠心分離しついで上澄液の残留酵素活性を測定した。

トウモロコシ葉ｃＤＮＡライブラリーこれはカルフォルニア州、バークレー、カルフォルニア大学、植物学部（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｂｏｔａｎｙ　）のＡ　Ｂａｒｋａｎ博士からの寄贈品であった。２週令の一１？７　＃、（（Ｂ７３）の若木の葉からメツセンジャー　ＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡはＺＡＰ　ｃＤＮ＾合成キット（ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｋｉｔ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して合成した。このｃＤＮＡをラムダ発現ベクターλＺＡＰ　（７）ＥｃｏＲＩ部位（ｃＤＮＡ（７）５′末端）とＸｈｏＩ部位（ｃＤＮＡ（７）３°末端）とに連結した。ライブラリーは８　ｘ　１０５個の組換え体を含有していた。

トウモロコシ葉ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングトウモトコシλＺＡＰ　ｃＤＮＡを、精製トウモトコシＡＣＣａｓｅへの吸着によって精製された抗体と結合する融合蛋白質（ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を産生ずるクローンについてスクリーンした。

約１００プラークＣｍ２の密度で平板培養した（ｐｌａｔｅｄ）、ＬＢ中の０．８％アガｏ　−７，／　１０　ｍＭ　ＭｇＳＯ４／　０．０２％マルトースと混合したＥ、Ｃｏ１１　Ｙ１０９細胞にファージを吸着させた。プレート（ｐｌａｔｅ）を３７℃で約４時間インキュベートした；ついで、ＩＰＴＧを含浸させたニトロセルロースフィルターをアガロース表面に載せ、３７℃で一夜インキュベーションを行った。フィルターを取出し、５％（Ｗ／Ｖ）の粉末ミルクを含有するＴＢＳ緩衝液で洗浄してニトロセルロースの表面をブロックしついでアフィニテイ精製抗体を用いてスクリーニングした。フィルター（直径６　ｘ　１３７　ｍｍ　）を２０　ｍｌのアフィニティ精製抗体中で室温で２時間インキュベートした。フィルターを０．０５％のツイーン２０を含有するＴＢＳ中で３回洗浄し、ついて、ヤギの抗ウサギ免疫グロブリン（ＴＴＢＳ中、１　：　７５００、ＴＢＳ中の０．２％ツイーン）中でアルカリホスファターゼと室温で１時間カップルさせた。ＴＴＢＳ中で２回、ついてＴＢＳ中で１回洗浄することによりフィルターから未結合の第２抗体を除去した。ＢＣＰＩＰとＮＢＴを含有するアルカリホスファターゼ反応生成物（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ＳｐＨ９，５中の１５０μｌ／　ｍ１ＢＣＰＩＰ、　１５０　ｕｌ／　ｍ１ＮＢＴ、　１００ｍＭＮａＣｊ！、１ｍＭクリーニングをプレート上の全てのプラークが正のシグナルを与えるまで反復することにより、正の反応を与えるプラークを更に精製した。

この方法により３つの正のプラーク（ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｐｌａｑｕｅ）が得上記の方法を行った後、蛋白質１　ｍｇ当り３−４単位の比活性（ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）になるまで、トウモロコシの葉から１０倍以上にＡＣＣａｓｅを精製した（表１）。異なる精製段階での酵素の５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分析は、ＡＣＣａｓｅは約２００−２２０　ｋＤａのポリペプチドサブユニ・シトからなりそして最終段階においては約７０％の純度であることを示した（第１図）。ＡＣＣａｓｅサブユニ・シト中のビオチンの存在＋ｔｓＤｓ−ポリアクリルアミドゲルのウェスターンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）とストレプタビジンホスファターゼを用いる評価にり示された。多数のＡＣＣａｓｅの分解生成物もこの鋭敏な方法により示された。

Ｎ−末端アミノ酸配列を決定するための試みは、恐らく、それがブロックされていることのために成功しなかった。しかしながら、Ｎ−クロロスクシンイミドによる電気泳動的に精製されたサブユニットの切断、その生成物の再電気泳動及びＮ−末端配列分析のためのＰＶＤＦ膜に対するエレクトロブロッティングにより、限定された配列データーは存在した。得られた３つの配列は長さ８，４及び８のアミノ酸であり、ニワトリＡＣＣａｓｅの配列に６２．５％、１００％及び７５％類似していた（表２）。

オレンジ−Ａ精製＾ＣＣａ５ｅをウサギに注射し、２種の補助注射（ｂｏｏｓｔｅｒ　１ｎｊｅｃｔｉｏｎ）を行った後、ウサギ血清はトウモロコシ＾ＣＣａ５ｅ活性を有する免疫複合体を形成することが認められた。７７ランサスからのＡＣＣａｓｅ活性も同様の濃度の抗血清により免疫沈降させた。

ＡＣＣａｓｅ抗体を電気泳動的に精製したＡＣＣａｓｅサブユニットを含有するＰＶＤＦ膜への吸着とこの膜からの溶離によりアフイニテイ精製した。

この精製抗体製剤をトウモロコシｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーンするのに使用した。

トウモロコシ＾ＣＣａ５ｅ　ｃＤＮＡクローンの単離ベクターλＺＡＰ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）中に構築されたトウモロコシｃＤＮＡ発現ライブラリーの約９０．０００個のプラークをアフイニテイ精製ＡＣＣａｓｅ抗体を使用してスクリーンした。−次スクリーニングにお（１て採取された７個の内、３個は更に２回精製を行う間、正（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）のままであった。これらの内の２個（Ａ１及びＡ３）は第３のもの（Ａ４）よりはるかに強いシグナルを与えた。

λＺＡＰクローンから放出されたブルースクリプトファージミド（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ｐｈａｇｅｍｉｄ）の分析は、これらが４．０（Ａｌ）　、４．４（Ａ３）及び４．４（Ａ４）　ｋｂのＤＮＡインサートを担持していることを示した。制限地図はＡ１及びＡ３の４．０及び４．４ｋｂインサートは、５°末端のエキストラ４００　ｂｐについて以外、殆ど同一であることを示した。Ａ４の制限地図は異なっているが、Ａ４インサートはＡ１／Ａ３とクロスフ１イブリダイズした。

Ａ３インサートを使用するλＺＡＰライブラリーの再スクリーニングにより更に６個の正にハイブリダイズするクローンが得られた。制限地図から、これらの内の４個はＡＩ／Ａ３に似ており、２個はＡ４に似ていることが確認された。第２図は多数の異なる制限酵素を使用して切断したＡ４状ｃＤＮ＾（Ａ１２）及び＾３状ｃＤＮＡ（Ａ３４）についての消化パターンを示している。これらの結果はトウモロコシ中のＡＣＣａｓｅについて少なくとも２種の遺伝子が存在することを示している。

Ａ３　ＡＣＣｃＤＮ＾ＤＮＡンのＤＮＡ配列を測定した（第３図）。推定アミノ酸配列はラット／ニワトリ＾ＣＣａ５ｅ配列と３７％同一（５８％類似）であり、１００残基の一つのストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）に亘って、配列は６０％以上同一であった。

ＡＩ　ＡＣＣｃＤＮＡの大部分の配列を測定し、Ａ３配列と同一であることが認められた。より長いＡ３状クローンの追加の配列情報は第４図（ａ、　ｂ）に示されている。クローン＾１０／＾４９の場合、配列はＡＣＣａｓｅの保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）ビオチン結合部位、ｍｅｔ−１ｙｓ−ｍｅｔ　（第４ｂ図）をエンコードするモチーフを包含している。

２個のＡ４状クローン、Ａ１２及び＾４＾ＣＣｃＤＮＡの５°末端（第５ａ、ｂ図）及びＡ１２の３゛末端（第５Ｃ図）の分析は、Ａ３状及び＾４状ｃＤＮ＾配列の間に多数の相違があることを示した。このことはトウモロコシ中には少なくとも２種のへＣＣａ５ｅ遺伝子が存在しなければならないという、制限消化パターンから導かれる結論を支持している。

Ａ３　ｃＤＮＡの、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨ１消化トウモロコシＤＮＡのサザーンプロットへのハイブリダイゼーションは、それぞれ、３個及び２個のバンドを与えた。従って、トウモロコシ中には２個以上の遺伝子は存在しないと考えられる。トウモロコシｃＤＮＡも低い緊縮条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）下でアラビドプシスＤＮＡにハイブリダイズした。

Ａ３　ｃＤＮＡインサートの、トウモロコシＲＮ＾のノーザンプロットへのハイブリダイゼーションは、８．０−８．５　ｋｂのサイズのバンドを１個だけ与えた。

檜… トウモロコシＡＣＣａｓｅサブユニットのサイズ（〜２２０　ｋＤａ）はラット及びニワトリからの酵素のサイズに類似している。かかる蛋白質についてのｍＲＮＡは少なくとも６．５ｋｂであると推定されており、事実、本発明者の測定によればトウモロコシについては８．０−８．５　ｋｂであった。これはここで記載されている最も長いｃＤＮＡ　（Ａ３状クローンについての５．５ｋｂ及びＡ４状クローンについての５．７ｋｂ）よりかなり長い。しかしながら、これらのｃＤＮＡは全長（ｆｕｌｌ−１ｅｎｇｔｈ）　ｃＤＮＡを単離するための手段を提供するであろう。このｃＤＮＡはトウモロコシ遺伝子ライブラリーからの遺伝子を単離するための鋳型又はプローブとしての、トウモロコシｍＲＮＡに対しての５°　エクステンション（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）についてのプライマーとして使用し得る。

トウモロコシ＾ＣＣａ５ｅ　ｃＤＮＡはアラビドプシスＤＮＡとクロスハイブリダイズし、従って、アラビドプシス遺伝子ライブラリーから０遺伝子を単離するための手段を提供する。同一の異型プローブ（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　ｐｒｏｂｅ）を単子葉植物及び双子葉植物を包含するある範囲の植物、例えば、アブラナ（ｏｉｌ−ｓｅｅｄ　ｒａｐｅ）から＾ＣＣａ５ｅ遺伝子を単離するために使用し得る。

トウモロコシ中には明らかに２種のＡＣＣａｓｅ遺伝子が存在する。トウモロコシ葉ＲＮＡのノーザンプロットをＡ３　ｃＤＮＡとハイブリダイズした場合には１個しかバンドが認められないので、２種の遺伝子についてのメツセンジャーＲＮＡは同一のサイズであると考えられる。

トウモロコシ葉ｃＤＮＡライブラリーからはＡ４状クローンより多いＡ３状クローンが選択されるので、Ａ３　ｍＲＮＡがより豊富でなければならない。トウモロコシＡＣＣａｓｅに対する抗体との反応によりトウモロコシ発現ライブラリーから当初に選択された３種のｃＤＮＡクローンの内、Ａ１及びＡ３は抗体により最も強いシグナルを与え、Ａ４は最も弱いシグナルを与えた。このことはＡ３状ｃＤＮ＾は草−雑草用除草剤感受性型のＡＣＣａｓｅをエンコードすることを示し得る。Ａ４状ｃＤＮ＾によってエンコードされる酵素が除草剤感受性であるか除草剤耐久性であるかは明らかではない。

全長トウモロコシｃＤＮ＾の５°末端を定めることにより、トウモロコシ遺伝子クローンからプロモーター配列を単離することが可能であろう。同様に、アラビドプシス遺伝子についてのプロモーター配列を単離することが可能であり、そして、相互構築（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）により、除草剤感受性単子葉植物種（例えば、トウモロコシ、小麦、大麦等）において除草剤耐久性アラビドプシス酵素を発現させることが可能であろう。これによって、脂肪酸生合成経路を阻害することにより活性を示す除草剤（例えば、フルアジフォプ）に対して耐性である単子葉作物植物を製造する方法が提供される。

最後に、本発明はＥ、Ｃｏ１１又は酵母系のごとき形質転換微生物菌株中で活性なＡＣＣａｓｅを合成するために全長ｃＤＮＡクローンを使用することを可能にする。かかる系は除草剤耐久性型のＡＣＣａｓｅ酵素の選択及び新規な化合物の除草活性についての試験において有用であろう。

本発明は、更１獣除草剤結合部位の種類の検討及び草−雑草用除草剤に対する耐性の原因である少なくとも一つのメカニズムの検討を可能にするであろう。

注：第２図はＡ４状（ＡＣＣ１２）及びＡ３状（ＡＣＣ３４）　トウモロコシＡＣＣａｓｅｃＤＮ人クローンの制限消化を示す。奇数レーンはＡＣＣ１２を示し、偶数レーンはＡＣＣ３４を示す。使用した酵素はＰｓｔｌ（１，２）　、ＢａｍＨ１＋ＢｇｌＩＩ（３，４）　、ＨｉｎｄＩＩＩ（５，６）、ＨｉｎｃＩＩ（７，８）　、ＥｃｏＲｌ（９，１０）、ＡｃｃＩ（１１，１２）　、ＰｖｕＩＩ（１３，１４）、ＰｖｕＩＩ＋ＨｉｎｃＩＩ（１５，１６）、ＰｖｕＩＩ＋ＥｃｏＲＶ（１７，１８）である。マーカーレーン（Ｍ）はＨｉｎｄＩＩＩで消化したλＤＮＡである。

・き国際調査報告フロントページの続き（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ，ＳＮ、　ＴＤ。

ＴＧ）、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＣＡ、Ｃ５，ＦＩ。

ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＯ，ＰＬ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、ＵＳ（７２）発明者　ジエンキンス、コリン、レスルシー、ダウオーストラリア連邦共和国、アクト・２６１７、スペイン・プレス、１３（７２）発明者　ホイットフエルド、ポール、レイモンドオーストラリア連邦共和国、アクト・２６０２・ヘケット、マツケンジー・ストリート、１０３

Claims

【特許請求の範囲】

１．異型ＤＮＡによって隣接されている、植物アセチルＣｏＡカルボキシラーゼをエンコードする遺伝子のＤＮＡ配列又はこれと実質的な相同性を示す配列の少なくとも一部を含有するＤＮＡクローン。
２．植物は単子葉植物、例えば、トウモロコシ又は大麦である、請求の範囲１に記載のクローン。
３．植物は双子葉植物、例えば、アラビドプシスである、請求の範囲１に記載のクローン。
４．植物アセチルＣｏＡカルボキシラーゼをエンコードするＤＮＡ配列は実質的に完全である、請求の範囲１〜３のいずれかに記載のクローン。
５．ＤＮＡ配列からＲＮＡを発現させるために植物内で機能的であるプロモーター配列を更に含有する、請求の範囲１〜４のいずれかに記載のクローン。
６．プロモーター配列は誘導性である、請求の範囲５に記載のクローン。
７．植物アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子についてのプロモーターを含有する、請求の範囲１〜４のいずれかに記載のクローン。
８．プロモーターは双子葉植物のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子からのものである、請求の範囲６又は７に記載のクローン。
９．植物アセチルＣｏＡカルボキシラーゼをエンコードするＤＮＡ配列の一部だけを含有する、請求の範囲１〜３又は５〜８のいずれかに記載のクローン。
１０．植物アセチルＣｏＡカルボキシラーゼのＤＮＡ配列は、酵素ＡＣＣａｓｅについてのｍＲＮＡと相補的なＲＮＡを植物内で生成するために、プロモーターについて逆転されている、請求の範囲５〜９に記載のクローン。
１１．請求の範囲５〜８又は１０のいずれかに記載のクローンを使用して植物細胞を形質転換することからなる新規植物の製造方法。
１２．請求の範囲１１に記載の方法によって製造された植物。
１３．酵素ＡＣＣａｓｅをアンダーエクスプレスすることの結果としての、変性された油生成特性を有する、請求の範囲１２に記載の植物。
１４．組換え体ＡＣＣａｓｅを発現する、請求の範囲１２に記載の植物。
１５．脂肪酸合成経路を阻害する除草剤に対して増大した耐性を示す、請求の範囲１４に記載の単子葉植物。
１６．組換え体双子棄植物ＡＣＣａｓｅを発現する、請求の範囲１５に記載の植物。
１７．植物材料からＡＣＣａｓｅを抽出し、ＡＣＣａｓｅを精製し、ＡＣＣａｓｅにより哺乳動物の免疫系を攻撃することによってＡＣＣａｓｅに対する抗体を調製し、この抗体を免疫精製しついでこの抗体を使用して植物ＤＮＡライブラリーからクローンを選択することからなる、請求の範囲１に記載のクローンの単離方法。
１８．請求の範囲１７に記載の方法によって調製された、かつ、ＡｕｓｔｒａｌｉａｎＧｏｖｅｒｎｍｅｎｔＡｎａｌｙｔｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙに、それぞれ、トウモロコシＡ３ＡＣＣｃＤＮＡプラスミド及びトウモロコシＡ４ＡＣＣｃＤＮＡプラスミドの名称で寄託されている、クローンＡ３及びＡ４。
１９．請求の範囲１に記載のクローン、その関連物又はその後代を増殖させることからなる、請求の範囲１に記載のクローンの製造方法。
２０．請求の範囲２に記載のクローンを使用して双子葉植物ＤＮＡライブラリーをプローブすることからなる、請求の範囲３に記載のクローンの取得方法。
２１．ＤＮＡ配列からＲＮＡを発現させるために微生物内で機能するプロモーター配列を更に含有する、請求の範囲４に記載のクローン。
２２．請求の範囲２１に記載のクローンに対する宿主である微生物。
２３．請求の範囲２２に記載の微生物をＡＣＣａｓｅを生成することのできる条件下で培養し、菌株をスクリーンすべき化合物で処理しついで、後に生成したＡＣＣａｓｅの量又は活性と、同様の非処理菌株から得られたＡＣＣａｓｅの量又は活性とを比較することからなる、化合物を除草活性についてスクリーニングする方法。
２４．請求の範囲２２に記載の微生物の培養によって産生されるＡＣＣａｓｅ。