JPH07501340A - 哺乳類の神経の増殖を促進する薬物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 呻乳類の神経の増殖を促進する薬物 発明の背景 本出願は、増殖因子を投与することによる神経の再生に関する。

増殖因子は標的細胞の一定の集団を刺激するポリペプチドホルモンである。増殖 因子の例には、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）　、インスリン様増殖因子（Ｉ Ｇｌ”ｓ）、ｈランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、及びアルフ ァ（ＴＧＦ−α）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）　、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦ ＧＦ）、塩基性ＦＧＦ　（ｂＦＧＦ）　、及び神経増殖因子がある。

ＰＤＧＦとＩＧＦ−１またはＰＤＧＦ（！：ＩＧＦ−１１の組み合わせの創傷治 癒への応用は既に報告されている（Ｌｙｎｃｈ　ａｔ　ａｌ、　１９８７．　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔ王＾ｃａｄ、　Ｓｅｔ。

ｔｌｓＡ　８４ニア６９６−７７００；　Ｌｙｎｃｈ　ａｔ　ａｔ、　１９ｇ９ ．　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　８４＋６４０−６S６．　Ｌｙｎｃｈ ｅｔ　ａｌ、　１９８９．　Ｊ、　ＣｌＩｎ、　ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ、　１ ６：５４５−５８８；　Ｌｙｎｃｈ　ａｔ　ａｌ、　１９９P．　Ｊ、　ｐｅ ｒｌｏｄｏｎｔｏｌ、　８２：４５８−４６７　米国特許第４，８６１，７５７ 号及び第５，０１９゜５５９号、本発明の参考文献に取り入れられている）。

ＩＧＦ　−ｓ、またはソマトメジンは、ヒトプロインスリンと強い相同性を有す る約７．５ＫＤのポリペプチドである（ｌＩｕｇ＋ｂｅｌ、　１９８４　／ｙｌ ｌｏｒｍｏｎａｌ　ＰｒｏＬｅｌｎｓ　ａｎｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　１２：ｐｐ ５７−７９　）。ｒＧＦ−１とＩＧＩ−１１は、６２％の相同性を示す。これら の作用は２つの異なる受容体により達成される。ＩＧＦ−１受容体はｌ型受容体 （ＩＧＦ−ＩＲ）と呼ばれ、ＩＧＦ−１１受容体は！■ｌ型受容体■ＧＦ−１１ Ｒ）と呼ばれている。ＩＧＦ−ＩＲは、構造的にインスリン受容体に関連してい る膜貫通蛋白質である（Ｕｌｍｃｈ　ａｔ　ａｌ、　１９８６　ＥＭＢＯＪ、　 ５：２５０３−２５１２　）。これには、２つα−サブユニットからなる細胞外 結合領域と、２つのβ−サブユニットからなる細胞内チロシンキナーゼ領域が含 まれる。ｌ型受容体はＩＧＦ−１に対して高い親和性を示し、ＩＧＦ−１１及び インスリンには低い親和性を示す。Ｉｔｌ型受容体ＩＧＦ−１及びインスリン受 容体とは異なる（Ｍｏｒｇａｎ　ｅｔ相性を示し、ＩＧＦ−１に対して低い親和 性を示し、インスリンには結合しない。

この受容体は大きな細胞外結合領域を有する膜貫通蛋白質であり、チロシンキナ ーゼ活性は示さないものと思われる。その−次配列は、陽イオン非依存性マンノ ース−６−リン酸受容体の一次配列と同一である（Ｍｏｒｇａｎ　ｅｔ　ａｌ、 　１９１１７１ｂｌｄ、）。

ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−１１に加えて、ＩＧＦ−１の短縮型受容体が脳から取得 アミノ酸残基が欠失したものであるが、ＩＧＦ−［と類似した機能的性質を保持 している。１ｊｙｉｌｔ−θでは、ＩＧＦは多様な代謝活性を示し、間葉起源の 細胞を含む多くの細胞に対して増殖因子として作用する（ＰｒｏｅｓｅＪ＋　ｅ ｔ　ａｔ、　１９８５　Ａｎｎ、　Ｒａｙ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　４７：４４３ −４６７；　Ｖａｎ　Ｗｙｋ、　（１９８４）　ｌ１ｏｒｖｏｎａｌ　ｐｒｏｔ ｅｉｎｓ　ａｎｄ@ｐｅｐｔｉｄｅｓ； １２：８１−１２５；　Ｄａｕｇｈｅｄａｙ　ａｎｄ　ＲｏＬｗｅｉｎ、Ｅｎｄ ｏｃｒｌｎｅ　Ｒｅｖ、１９１１９；　１０：６ｇ−９１；@Ｂａｘｔｅｒ ｅｔ　ａｌ　（１９８５）Ｃｏｍｐ、Ｂ！ｏｃｈｅｓ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、９１β ：２２９−２３５；　Ｂａ５ｋｌｎ　ｅｔ　ａｌ　（１９８■■| だ新生児ラットアストログリア細胞に対するマイトジェン（Ｉｌａｎ　ｅＬ　ａ ｌ、　Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｌ、　１９ｇ７；　７：５０１−５０６　）にもな ることも示されている。

胎児及び新生児の組織（脳を含む）における［ＧＦ−［及びＩＧＩ’−１１の高 発現が報告されている（Ｉｌａｎ　ａｔ　ａｌ、　Ｊ、　ＣｌＩｎ、　Ｅｎｄｏ ｃｒｌｎｏｌ　Ｍｅｔａｂ、　１９８８；６６：４２２−１７．８；　Ｒｅｃｉ ｏ−ｐｉｎｔｏ　ｅＬ　ａｔ、〕、Ｎｅｕｒｏｓｃ１　１９１１８；６：１２１ １−１２１９；　５ｂｅｅｅｒ　ａｔ@ａｌ、Ｊ、− Ｂｌｏｌ　Ｃｈｅｗ、　＋９１１７；２０２ニア６９３−７１３９９　）及び／ ／７　ｙｈｖ　（ｌｌａｎｓｓｏｎ　ａｔ　ａｌ、＾ｅｔａ@Ｐｈｙｓｌ。

１、　５ｃａｎｄ、１９８６；１２６：６０９−６１４＋　Ａｎｄｃｒｓｏｎ　 ｅｔ　ａｌ、＾ｅｔａ　Ｐｈｙｓｌｏｌ、５ｃａｎｄ、１９W８；１３ ２：１６７−１７３；　Ｋａｎｊｅ　ｅｔ　ａｌ、Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、１９８ １１；４７５：２５４−２５８；　Ｓｊｏｂｅｒｇ　ａｎｄ@Ｋａｎｊｅ、 Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　１９８９；４１１５：１０２−１０８：　Ｎａｃｈｃｍ ｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ　１X９０；３：３０９ − ３Ｉ４）において神経栄養因子として作用することが示唆されており、また、未 開０２二１９４９−１９５４）。ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−ＴＩ単独、またはＮ ＧＦとの組み合わせを添加することにより、／＋１７　ｗｔｒθにおいてニュー ロン細胞の生存性が増大すると思われる（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｐａｔｅｎｔ　Ａ ｐｐＨｃａｖｌｏｎ　Ｎｏ、６３１９６５２４　）　ｏ負傷したラットの坐骨神 経にＩＧＦ−［を局所的に投与することにより神経の再生が促進されることが報 告されている（Ｉｌａｎｓｓｏｎ　ｅＬ　ａｌ、　１９８６；　Ｓｊｏｂｅｒｇ 　ａｎｄ　Ｋａｎｊｅ、　１９８９；　Ｎａｃｈｃｍｓｏｎ　ｅｔ　ａｔ、　１ ９９０　）　ｏ特異的な抗原特異的抗血清を用いた免疫組織化学的研究から、／ ’／７　ｙｈｖにおいて、負傷したラットの坐骨神経の神経内及びシュヴアン細 胞内の内在性ＩＧＦ−１の発現が増大することが示された（Ｈａｎｓｓｏｎ　ａ ｔ　ａｌ＋これまで、外来の血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）単独または他の生 物活性薬物との組み合わせが／／７　Ｊ／／Ｊυにおいて神経再生に影響を与え るという報告はない。

ｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼーシヨン及び抗原特異的抗血清を用いた組織の免 疫染色により、胚及び成体ラットのニューロン中でＰＤＧＦ−Ａ鎖のｍＲＮＡ及 び免疫反応性を存するＰＤＧＦ−Ａが高発現していることが示された（Ｙｅｈ　 ｅｔ　ａｔ、　Ｃｅ１１１９９１；６４：２０９−２１６　）。同一の研究にお いて、著しく微弱なＰＤＧＦ−Ａ鎖のシグナルがダリア細胞中に検出された。ｊ ｔｙ　Ｖ／ＩＩ’０　でシュヴアン細胞を短期間及び長期間培養すると、ＰＤＧ Ｆ細胞受容体が生産され、ＰＤＧＦに応答してＤＮＡが合成される。受容体の大 部分はβ型てあり、ＰＤＧＦ−ＢＢホモダイマー（すなわちＰＤＧＦ−２）はＰ ＤＧＦ−ＡＡホモダイマーよりも有効なマイトジェンであることが判明した。Ｐ ＤＧＦ−ＢＢは１當な発達の間、自己分泌的にシュヴアン細胞の増殖を刺激する 可能性があることが示唆された（Ｅｃｃｌｅｓｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｅｕｒ、 　Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｌ、　１９９０；２：９８５−９９２　）　。ＰＤＧＦ −β型受容体は、／’／７　ｙ／ｖｏにおいても／’ｔ７　ｙｉｌｒθにおいて も新生児ラットの脳ニューロン上に存在することが報告されている。ｌ′ｊＩ／ ／ｌｆθにおいて、ラット脳細胞の一次培養物にＰＤＧＦ−ＢＢを連続的に作用 させることにより神経突起が伸張し、生存期間が延長された（Ｓａｌｔｓ　ｅｔ 、　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃ１．　ＵＳＡ　１９９ １；８１１：８１５９−８１６３　）　A培養さ れたＩ型星状神経細胞及び周産期ラットの脳においてＰＤＧＦ−ＡのｍＲＮＡが ９−１０５６）。ＰＤＧＦは、ラット視神経０−２Ａ前駆細胞の増殖及び分化に も関連している（ＲａｆＴ　ｅｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ　１９８８；３３３： ５６０−５６２；　Ｎｏｂｌｅ　ｅｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ；　P９ｇ８ ：３３３：５６０−５８２）。ＰＤＧＦは中枢神経系においてダリア細胞の増殖 及び発達に関わっているものと思われる（ＲａｆＴ　Ｍ、　５ｃｉｅｎｃｅ　１ ９１１９；２４３：１４５０−１４５５に概説されている）。

末梢神経の修復 末梢神経が負傷すると、神経細胞体、その作用及びその環境において大きな変化 が誘発される（Ｓｅｃｋｅｌ、　１９９０；　Ｍｕｓｃｌｅ　ｋ　Ｎｅｒｖｅ　 １３ニア１１５−１ｔ００に概説されている）。負傷に引き続いて、中枢神経細 胞体が増大し、ニンスル物質が散布され、核は末梢部に押しやられる。中枢細胞 体は新たなｍＲＮＡ″ａ、脂肪、及び細胞の骨される。ＧＡＰは増殖を開始する とは考えられていないが、これらの蛋白質は再生応答に必須の成分である。増殖 しやすい、より可塑的（ｐｌａｓｔｉｃ　）または狂的法曹への分化を示す電気 生理学的変化が細胞体中で起こる（Ｐｏｅｈｒｔｎｇ　ｅｔ　ａｌ、　（１神経 の負傷に引き続いて、近位の軸索部分は変化可能な度合いの外傷性破壊を起こす 。この破壊的工程の範囲は最低、次のランヴイエ絞偏に戻り、最大では細胞死に 至る。細胞死に至らない場合、創傷に近接した第一のランヴイエ絞輪領域：１９ ｇｇ　）。再生中の神経線維の先端では、移動のだめの特別な細胞構造である増 殖錐状体が必要である。この構造は、組織のマトリクスを劣化させる蛋白質を放 出することにより、組織中を神経フィラメントが通る経路を作る（Ｋｒｙｓｔｏ ｓｅｋ　ｅｔａｌ、　（１９１１１）　５ｃｉｅｎｃｅ　２１３：１５３２−１ ５３４　）　、増殖錐状体は、１ｌＩｌ／１Ｉ−０において例えばＮＧＦのよう な走化性分子に応答することができる（Ｇｕｎｄｅｓｏｎ　ｅｔ　ａｔ、　（１ ９８０）　Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｌｏｌ、　８７：５４６−５５４）　、軸索は 、神経支配の経路及び標的を明確がっ特異的に選択することができ、軸索の増殖 はランダムな工程ではないと思われる（Ｄｏｄｄ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８１１ ）　５ｃｉｅｎｃｅ　２４２：６２９−６９９）　、しかし、従来の神経修復に おいては、軸木の破片やシュヴアン細胞基底板の欠損といった特性を有する負傷 領域に妨害されて、増殖錐状体は遠位の神経断端に到達することができない。シ ュヴアン細胞基底板は、神経線維の再生を誘導するのに必要である。その結果、 機能シュヴアン細胞は末梢神経の再生に決定的な役割を果たす。負傷後の軸索の 初期破壊産物はシュヴアン細胞の増殖を刺激し、ファゴサイトーシスの準備を行 なう。シュヴアン細胞及びその基底板も、軸索の再生を促進する微小環境の整備 を助ける。次いで、再生中の軸索は、ンコヴアン細胞の分化及びシュヴアン細胞 による軸索の再軸輪形成のためのミニリンの生産に必要となる。このように、シ ュヴアン細胞と神経因子が力゛いに協調して再増殖及び分化することが、末梢神 経のｔＳ造及び機能の最適な回復に必要とされている。

ＮＧＦ、フィブロネクチン、フィブリン、ラミニン、酸性及び塩基性線維芽細胞 増殖因子（それぞれａＦＧＦ及びｂＦＧＦ）及びＩＧＦ−１など、／／７　ｙ／ ｌｒ。

及び／ｊｔ４ｒｔｙにおいて神経の再生を増大させる多くの薬物が報告されてい る（表１）。／／７　ｙ／ｙｏで評価されたこれらの因子の効果のみが真の神経 再生効果とされるべきである（再生とは、障害を受けた組織が元の構造及び機能 を回復することを指す）。

／’ｊｙ＃τにおける神経再生の増大 再生チャンバーモデル（すなわちｅｎｔｕｂｕｌａｔｌｏｎ）は、潜在的な神経 再生薬物をにおいては、障害を受けた神経の２つの末端をｐｓｃｕｄｏｍｅｓｏ ｔｔ＋ｃｌ　Ｉａｌ　ｌ　Ｉｎｅｄ　ｔｕｂｅ（例えば、シリコン製）（ステン レスの糸で開けである）に挿入し、縫合する：チューブは神経の２つの末端の増 殖の“ガイド”として作用する。この技術は単独で、従来の神経再生及び神経移 植技術に対しである種の治療的利点を有する（Ｓａｃｋｅｌ　ａｔ　ａｔ、　（ １９８Ｇ）　Ｐｌａｓｔ、　Ｒｅｃｏｎｓｔｒ、　Ｓｕｒｇ、　７８ニア９３− ８００）　ｏこの技術の■ も大きな利点の一つは、適切な神経のガイドが、障害を受けた神経に作用し再生 を増大させる部位に増殖促進因子を導入することができることであろう。５ｃｋ ｅ１１９９０、前出によれば： ゛・・・治療法において、ガイド内腔中の再生微小環境中に増殖促進薬物が導入 されるというコンセットが最も説得力のある点である０このように、このモデル において、ａ　Ｆ　Ｇ　Ｆ　％ラミニン、フィブリンマトリクス、ラミニン混合 物、テストステロン、ガングリオシドＧＭ−１及びカタラーゼ、及び［ＧＦｌを 用いた更なるデータが報告されている。

ａＦＧＦの添加により、ガイドを横断して増殖する軸索の数が顕著に増加し、ま た、原始の感覚ニューロン及び運動ニューロンの数が増大する（Ｃｏｒｄｅｌｒ ｏ　ｅｔａｔ、　（１９８９）　Ｐｌａｓｔ、　Ｒｅｃｏｎｓｔｒ、Ｓｕｒｇ、 　８３：１Ｏ１３−１０２０）　、ラミニンは、２週間はガイド中での増殖を増 大させるが、６週間の時点では神経１１ｆ生を阻害することが報告されている側 ａｄｌｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８５）　Ｅｘｐ、　Ｎｅｕｒｏｌ、　８８ ニア６アー７７２　）　ｏ無細胞フィブリンマトリクスの修正により、再生され る軸索の大きさ、再生工程の速度、Ｏ）。ラミニン、テストステロン、ＧＭ−１ 及びカタラーゼの混合物は１６週間神経の再生を増大させた（Ｍｉｌｌｅｒ　ｅ ｔ　ａｌ、　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　１９８７；４１３：３２０−３２８　）　 、ｒＧＦ−１をチャンバー内腔に連続的に注入すると、３１％ウシ血清アルブミ ンを添加した生理食塩水を注入した場合と比較して再生された軸索の長さが長く なった本発明は、神経を精製されたＰＤＧＦに接触させることにより哺乳類の神 経の増殖を促進させる方法に関する。ＰＤＧＦは、末梢神経の神経突起に接触さ せることが好ましい。ここでは、“増殖°とは、最も好ましくは機能的神経突起 、例えば軸索、の長さを増加させることをいう。増殖には、神経細胞またはシュ ヴアン細胞の増殖の誘導も含まれる。ＰＤＧＦは投与前、または目的の神経増殖 部位において、他の因子、最も好ましくはＩＧＦ−１、と混合されることが好ま しい。

第二の因子は、例えば、ＮＧＦ、フィブロネクチン、フィブリン、ラミニン、酸 性または塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦまたは他のＩＧＦ、すなわちＩＧＦ−１ １またはＩＧＦ−１１１でもよい（適切な受容体に特異的に結合する活性分子の 活性を有する断片またはアナログも本発明に含まれる）。

特に、ＰＤＧＦとＩＧＦ−［の相乗作用は、負傷した末梢神経のｌｔｐ　ｙ／ｌ ｔｏにおける再生を刺激することが判明している。ＰＤＧＦとＩＧＦ−１の組み 合わせが％／７　ｙｅｔυにおける神経の再生に及ぼす効果は、精製されたＰＤ ＧＦのみ、または精製されたＩＧＦ−１のみを添加した場合よりも優れているこ とが知られている。

以下に記載するとおり、ＰＤＧＦとＩＧＦ−１の相乗作用により、再生された軸 輪形成軸索の長さは７．０倍になる。ＰＤＧＦとＩＧＦの組み合わせは、軸輪形 成された軸索の方向性のある再生とシュヴアン細胞の増殖の両方により、障害を 受けた神経の再生を、少なくとも部分的には援護する。シュヴアン細胞の増殖は 、軸索の軸輪形成的増殖を支えるにあたり、非常に重要である。このように、Ｐ ＤＧＦと［ＧＦ−１の相乗作用は、軸索の増殖、シュヴアン細胞の増殖、および ミニリン鞘の形成を誘発し、軸輪形成された神経の増殖に寄与する。以下に記載 するとおり、ＰＤＧＦとＩＧＦ−１の相乗作用により再生が誘導された神経は、 ／／７ｙ／ｙｏにおいて機能的な活性を保持している。これは、軽く麻酔した動 物に鋭利なビンセットで疼痛を与え、その反射を見る試験により判定する。本発 明の混成物を使用して再生を行なうと、治療を行なわない場合（すなわち、外来 物質を投与しない）、または精製されたＰＤＧＦのみ、もしくは精製されたＩＧ Ｆ−１のみを投与する場合よりも効果的である。

好適な実施例において、神経突起再生用混成物は、ＰＤＧＦおよび他のいずれか の活性成分を薬理学的に許容可能な担体物質、例えば、アルブミンまたはメチル セルロースゲルを添加した生理食塩水、と混合することにより調製する。最も好 マしくは、精製さｔ’したＰＤＧＦとＩＧＦ−１を１　：　５００〜１００　： 　１（７）間のｆ［ｌｌ比、好ましくは１　：　２５０〜５０：１の間、さらに 好ましくは１：１００〜２５：１の間で混合する。精製されたＰＤＧＦはヒト血 小板から取得することができ、精製されたＩＧＦ−１はヒト血液から取得するこ とができる。これらは共に組み換えＤＮＡ技術によっても取得することができる 。このように、ここでは“ＰＤＧＦ”と“ＩＧＦ”という用語は共に、哺乳類、 好ましくは霊長類起源の血小板及び血液由来と組み換え物質の両方を指す；霊長 類はヒトであることが最も好ましいが、チンパンジーまたは他の霊長類でもよい 。“ＰＤＧＦ”及び“夏ＧＦ”という用語には、それぞれＰＤＧＦまたはＩＧＦ 受容体に結合することにより生物活性を示すアナログも含まれる。組み換えＰＤ ＧＦは組み換えへテロダイマーでもよい。このヘテロダイマーは、Ａ及びＢサブ ユニットの両方をコードするＤＮＡ配列を原核生物または真核生物の培養細胞に 挿入し、次いで翻訳されたサブユニットを細胞により加工（プロセス）させるこ とによりヘテロダイマーを形成させたものである。その他の方法として、１つの サブユニットのみをコードするＤＮＡを細胞に挿入し、その細胞を培養してホモ ダイマーＰＤＧＦ　（ＰＤＧＦ−１（ＡＡ）またはＰＤＧＦ−２（ＢＢ）ホモダ イマー）を作製する。

ここで使用する“精製された°という用語はＰＤＧＦ、ｆＧＦ−１または他の因 子が（使用前または他の物質との組み合わせにおいて）、重量で９０％またはそ れ以上含有されている、すなわちその成分が天然では結合している他の蛋白質、 脂肪、及び炭水化物を実質的に含まないことを指す。

精製された蛋白質は一般的にポリアクリルアミドゲル上で単一な主要バンドとし て検出される。本発明の混成物において使用される精製された因子は、アミノ末 端配列解析により純度を検定していることが最も好ましい。

本発明の混成物は、負傷した神経を／’７７　ｔ４ｙθにおいて迅速かつ効果的 に再生する方法を提供する。特にＰＤＧＦ／［ＧＦ−１の組み合わせは、自然治 Ｉ！５（すなわち、外来薬物を投与しない）または精製されたＰＤＧＦもしくは ＩＣＦ−１単独を投与する場合よりも、神経の増殖を増大させる。混成物の相乗 効果により、新たな機能的神経の再生は約７．　０倍促進される。

本発明の他の特徴及び利点は、以下に記載する好適な実施例及び請求の範囲から 明白である。

まず始めに図面の簡単な説明する。

層面 図は、ＰＤＧＦ単独またはＰＤＧＦとＩＧＦ−１の混成物の神経再生効果を示し た棒グラフである。

ＰＤＧＦ及びＩＣＦ−１ 精製されたＰＤＧＦ及びＩＧＦを混合して調製したＰＤＧＦ／ＩＧＦ混合物を用 いて、障害を受けた、または負傷した神経を処理し、再生させる。組み換えヒト ＩＧＦ−１はＩｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ 、　Ｉｎｃ、　（Ｂｏｓｔｏｎ、　ＨＡ）がら入手可能であり、また、Ｒａｎｄ 　Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ、、（に１ｎｎｅａｐｏｌｌｓ、　ＭＮ、）　、 ＵＢＩ（Ｌａｋｅ　Ｐｌａｃｉｄ、　ＮＹ）、及びＫａｂｌ　（Ｓｗｅｄｅｎ） から購入することもできる。精製されたヒトＰＤＧＦはＩｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏ ｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｉｎｃ、　（Ｂｏｓｔｏｎ、　Ｈ Ａ）から入手可能であり、また、Ｒａｎｄ　Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ、、（ Ｍｌｎｎｃａｐｏｌｌｓ、　ＭＮ、）　、ＵＢＩ（Ｌａｋｅ　Ｐｌａｃｉｄ、　 ＮＹ）A及 びＧｅｎｚｙｗｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｏｓｔｏｎ、　ＨＡ）から購入 することもできる。

ＰＤＧＦは組み換えＤＮＡ技術を用いて以下の通りに作製することができる。

ヒト血小板由来の、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）は２つのポリペプチド配列 を含む（ＰＤＧＦ−１（Ａ）及びＰＤＧＦ−２（Ｂ）ポリペプチド；　Ａｎｔｏ ｎｌａｄ８６−６１１８）上に位置するＰＤＧＦ−２はｓｔｓ腫瘍遺伝子により コードされている（Ｄｏｏｌｌｔｔｌｅ、　Ｒ，ｅｔ　ａｌ、　（１９８３）　 ５ｃｉｅｎｃｅ　２２１：２７５−２７７：　ＷａＬｅｒ４１ｅｌｄ　ａｔ　≠ 戟A　（１９ ８３）　Ｎａｔｕｒｅ　３０４：３５−３９）　、　ｓ　ｔ　ｓ遺伝子は、ＰＤ ＧＦ−２ポリペプチドと深く関わっているシミアン肉腫ウィルス（ＳＳＶ）のト ランスフォーミング蛋白質をコードしている。ヒト細胞ｃ−ｓｉｓもＰＤＧＦ− ２鎖をコードしている（Ｊｏｈｎｓｓｏｎ　ｅＬ　ａｔ、　（１９８４）　ＥＭ ＢＯＪ　３：２９６３：　Ｒａｏ、　ＣＤ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８６）　Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａ１１D　Ａｃａｄ。

Ｓｃ［、ＵＳ＾８３：２３９２−２３９６）。ＰＤＧＦの２つのペプチド鎖が別 個の染色体上に位置する２つの異なる遺伝子によりコートされているため、ヒト ＰＤＧＦはＰＤＧＦ−１とＰＤＧＦ−２がジスルフィド結合したヘテロダイマー であるが、２つのホモダイマー（ＰＤＧＦ−１ホモダイマー及びＰＤＧＦ−２ホ モダイマー）の混合物であるか、またはヘテロダイマーと２つのホモダイマーの 混合物である可能性がある。生物活性を有するＰＤＧＦ−１、ＰＤＧＦ−２及び ＰＤＧＦ−１／ＰＤＧＦ−２ダイマー、及びこれらのアナログの組み換え体は、 ｃ−ｓｉｓ／ＰＤＧＦ−２、ＰＤＧＦ−１をコードするｃＤＮＡクローンまたは ＰＤＧＦ−１及びＰＤＧＦ−２遺伝子を適切な発現系を用いて真核生物細胞に導 入することにより調製する（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　 Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｉｎｃ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ　）　；米国特許第９９： 　Ｃ１ａｒｋｅ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ　３０８：４６４ ；　Ｇａｚｌｔ　ａｔ　ａｌ、　Ｃａ１ｌ　３９：８X−９７　）。

ｓｓｖに感染したＮＲＫ細胞中での、生物活性を有するｖ−ｓｉｓダイマー蛋白 質産物の発現はすでに報告されている（Ｏｖｅｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９ｇ４） 　５ｃｉｅｎｃｅ　２２５：５４−５６）。原核生物中で発現させると生物活性 を示さない一本鎖産物が生産された（Ｄｅｖａｒｅ　ｅｔ　ａｔ、　（１９８４ ）　Ｃｅ１ｌ　３６：４３−４９：　Ｗａｎｇ　ａｎｄ　Ｗｌｌｌｌａｓｓ　（ １９８４）　Ｊ、　Ｂｌｏ戟A　Ｃｈｅｗ。

２５９：１０６４５−１０６４１１　’）。原核生物中で生産された一本鎖をダ イマー型に折りたたむＰＤＧＦ−２鎖をコードする遺伝子を有するシミアン肉腫 ウィルスに感染しだ哺乳類細胞培養物は、ＰＤＧＦ−２ポリペプチドを合成し、 これを分子量約３５゜０００と２４，０００のジスルフィド結合したホモダイマ ーへとプロセスした（Ｒｏｂｂｉｎｓ、　Ｋ、　ｅｔ　ａｔ、　（１９１１３） 　Ｎａｔｕｒｅ　３０５：６０５−６０８）　、さらに、ＰＤＧＦ−２ホモダイ マーは、ヒトＰＤＧＦに対する抗血清と反応する。また、分泌されたＰＤＧＦ− ２ホモダイマーの機能的性質は、血小板由来のＰＤＧＦのものと類似している。

すなわち、線維芽細胞培養中のＤＮＡ合成を刺激し、１８５Ｋｄの細胞膜蛋白質 のチロシン残基のリン酸化を誘導し、特異的な細胞表面ＰＤＧＦ受容体への結合 においてヒト（１２５１）ＰＤＧＦと競合することができる（Ｏｖｅｎ、＾、ｅ ｔａｌ、　（１９８４）　５ｃｉｅｎｃｅ　２２５：５４−５６）。ｓｉｓ／Ｐ ＤＧＦ−２遺伝子を発現する正常なヒト細胞培養物（例えば、ヒト動脈内皮細胞 ）またはヒト悪性細胞由来のｓｔｓ　／　Ｐ　Ｄ　Ｇ　Ｆ　−２遺伝子産物も同 様の性質を示した（＾ｎｔｏｎｌａｄｅｓ、　Ｉｌ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８ ５）　Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅ１ｌｓ　３：１４５−１５１　）。

ＰＤＧＦ−１鎖をコードする遺伝子を同定及びクローニングした結果（口ｅｔｓ ｈ。

Ｉｔ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８Ｂ）　Ｎａｔｕｒｅ　３２０：６９５−６９９ ）　、生物活性を有するホモダイマーが発現し、このホモダイマーの機能的活性 はヒトＰＤＧＦのものと類似していることが示された。受容体結合実験から、Ｐ ＤＧＦ−２ホモダイマーは高い親和性で、また、ヒトＰＤＧＦへテロダイマーは それよりも低い親和性でＰＤＧＦ受容体べＰＤＧＦ−ＲβはＰＤＧＦ−１ホモダ イマーを認識しなかった：後者は第二の受容体、ＰＤＧＦ受容体アルファ（ＰＤ ＧＦ−Ｒａ）に結合する。この受容体は、他の２つのアイソフオーム（ヒトＰＤ ＧＦ及びＰＤＧＦ−２ホモダイマー）にも高い親和性で結合した（ｌｌｅｌｄｌ ｎ　ｅｔ　ａｌ、　１９８８．１ｂｌｄ）　。ＰＤＧＦ−Ｒａは、胞外結合領域 及び細胞内キナーゼ領域を有するなどβ受容体と構造的に類似し、末梢神経のｉ ｎ　ｖｉｖｏ再生の促進におけるＰＤＧＦ及びＩＧＦ−１の有効性を決定するた めに以下の実験を行なった。

これらの実験に用いた手法は、１ｌａｎｓｓｏｎと共同研究者により記載された 系に修正を加えたものである（Ｎａｃｈｅｓｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９０ ）　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ　３：３０９−３１４）。

雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｙ　ｌ　ｅｙクラット２００〜２３０　ｇ）を、生理 食塩水、ベントパルビタールナトリウム（６０ｍｇ／ｍｌ）及びジアゼパム（５ ｍｇ／ｍｌ）を１：１：２の容量比で含有する溶液を腹腔内注射することにより 麻酔した。

実験的モデル 内径１．５ｍｍの”Ｔ”ｕシリコンチューブコミュニケーテイングシステムを用 意した。“Ｔ“の左側の突出部の長さは通常１５ｍｍとしたが、実験によっては ３０〜９０ｍｍの範囲で変化させた。“Ｔ”の右側の突出部の長さは約１５ｍｍ とし、開いたままにした。Ｔ′の垂直部分（４０ｍｍ）はｍ　Ｌ　ｎ−０６ｍ□ ｔｉｃ　Ａｌｚｅｔ２００２ポンプ（Ａｌｚａ、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、Ｃ＾） に接続し、最大２１３μｌの容量を毎時１５μ】でラットの背に皮下注入するよ うにした。

外科手術法 麻酔したラットの坐骨神経を、大腿部中央で切開した。近位断端をチャネットの １つに２ｍｍ導入し、２本の９−０工チロン縫合糸で縫合した。以下の処置は、 ５群について行なった。

実験１・無処置 この群は、坐骨神経の近位断端を“Ｔ”型チャネルの左突出部に導入しただけの 対照群である。他の２つのチャネルは空のままにした。

実験２：担体供給 この対照群においては坐骨神経の近位断端を“Ｔ°型チャンノく−の左突出部（ こ導入し、“Ｔ“チャンバーの垂直部分をＡ１ｚｅｔ２００２ポンプに接続した 。

３番目のチャネルは空のままにした。ポンプとチャネルを１％ウシ血清アルブミ ン（Ｂ　ＳＡ）　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｓ、　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｔｓ、 　Ｎｏ＞を含有する生理食塩水で満たした。ポンプにより、担体を毎時０．　５ μｌの速度で２週間供給した。

実験３・ＩＧＦ−Ｉのみの供給 この実験は、Ａｌｚｅｔポンプに、１μｌにつき１００ナノグラムのＩＧＦ−■ を含有する生理食塩水／１％ＢＳＡを満たす以外は実験２と同様の方法で行なっ た。ポンプにより、毎時０．５μｍ又は５０ナノグラムのＩＧＦ−１を２週間供 給した。

実験４　：　ＰＤＧＦのみの供給 この実験は、Ａｌｚｅｔポンプに、１μｌにつき２．０ナノグラムのＰＤＧＦ− ２（Ｂ）を含有する生理食塩水／１％ＢＳＡを満たす以外は実験２と同様の方法 で行なった一ポンプにより、毎時０．５μｍ又は１．０ナノグラムのＰＤＧＦを ２週間供給した。

実験５　：　ＰＤＧＦとＩＧＦ−１の組み合わせの供給この実験は、Ａｌｚｅｔ ポンプに１μｌにつき２．０ナノグラムのＰＤＧＦ−２（Ｂ）及び１μｌにつき １００ナノグラムのＩＧＦ−１を含有する生理食塩水／１％ＢＳＡを満たす以外 は実験２と同様の方法で行なった。ポンプにより、毎時０．５μｌすなわち１． ０ナノグラムのＰＤＧＦ、及び毎時５０ナノグラムのＩＧＦ、Ｉを２週間供給し た。

精製されたヒト組み換えＩＧＦ−Ｉ及び精製されたヒト組み換えＰＤＧＦ−２（ Ｂ）ホモダイマーはＩｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｌｏｌ ｏｇＦ、　Ｉｎｃ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　Ｍ＾から入手した。

神経再生の機能的評価 各実験開始から２週間後及び４週間後（後者は試験物質の供給を終了してから２ 週間後）に、ラットを軽く麻酔した。再生された神経の機能状態は、チューブに 沿って鋭利なビンセントで軽くつまむ試験により評価した。麻酔したラットにお ける疼痛反射から機能している軸索の位置を判定した。

神経再生の組織学的評価 再生神経の機能的活性の評価に引き続いてラットを層殺し、ｍｉｎｔ−ｏｓｍｏ ｔｉｃポンプが接続しているシリコンチューブを取り外し、写真撮影した。ｍｉ ｎｉ−ｏｓｍｏｔｉｃポンプ及びチャネルの上部を切り取った。０．１Ｍカコジ ル酸塩緩衝液（ｐＨ７，１５）中に２．５％の精製グルタルアルデヒドを含有す る溶液に、チャンバーを少なくとも２４時間浸漬した。１％四酸化オスミウム中 でポスト固定し、脱水した後、チャネル内の組織を小さな切片に分割し、寒天樹 脂１００中に包埋した。チャネル内の特定の高さく部分）の横断切片（厚さ１μ ｍ）を調製した。メチレンブルー及びアズールＩＩを用いて切片を染色し、光学 顕ｌ！＆鏡下で観察した。再生された神経の長さ及び方向は、各高さにおける軸 輪形成された軸木の存在により決定した。この実験においては、軸輪形成されて いない軸索またはシュヴアン細胞は再生の評価の対象としなかった。電子顕微鏡 用に選択した試料をＬＫＢ　Ｕｌｔｒａｔｏｍｅ　Ｖ上で調製し、ウラニル酢酸 及びクエン酸鉛によりコントラストをつけた後ジエオール１．００　ＣＸ電子顕 微鏡で観察した。

結果は表中に記載されている。

１、対照群１−無処置（ｎ　＝　１８）この対照群ではいずれの試料においても 顕著な増殖は認められなかったが、障害を受けた神経の大部分が約１　ｍｍ１Ｊ ｌ化していた。これらのラット中では機能の回復は見られなかった。神経フィラ メントの存在を確認するために行なった、ホルマリン固定した坐骨神経の免疫組 織化学的解析から、軸索は神経中に神杆腫様構造を形成したがシリコンチューブ 内にはほとんど入っていないことが判明した。

シュヴアン細胞マーカー蛋白質Ｓ−１００の存在を確認するような実験を行なっ た場合、ンユヴアン細胞はシリコンチューブ内にほとんど入らず、チューブはフ ィブリンと炎症細胞及び液体で充満していた。

２、対照群２−担体による処理（ｎ　ｔ　２２）切断した坐骨神経に担体のみを 与えても顕著な増殖は認められなかったが、種々の程度の退化が見られた。これ らのラット中では機能の回復は見られなかった。

神経フィラメントの存在を確認するために行なった、坐骨神経の免疫組織化学的 解析から、軸索はシリコンチューブ内にほとんど入っておらず、チューブ内には シュヴアングリア細胞がわずかに見られるだけであった。

３、対照群’：３−　ＩＧＦ−１のみによる処理（ｎ−１７）ミニオスモチック ポンプ（ｍｉｎｉｏｓｍｏｔｉｃ　ｐｏｍｐ）を用いてＩＧＦ−１を供給するこ とにより、２週間測定期間中、再生坐骨神経は１［コあたり０゜６±０．３ｍｍ 増殖した。ピンチ試験の結果、軸索の長さは神経に増殖にほぼ対応していること が判明した。４週間後、上述の増殖速度に見合った距離の部分に多くの軸輪形成 された軸索が観察された。軸索に沿って多くのシュヴアン細胞の存在が確認され た。

４、群４−ＰＤＧＦのみによる処理（ｎ−７；４匹は上記に記載した体重のもの 、３匹は体重４５０〜４９０ｇのもの） ミニオスモチックポンプ（ｍｉｎｉｏｓｍｏｔｉｃ　ｐｏｍｐ）を用いてＰＤＧ Ｆのみを供給することにより、再生坐骨神経は１日あたり０．２〜０．　７ｍｍ 増殖した。最低１０本の軸索が観察されたが、これらにより形成された明確な微 小神経束は同定されなかった。しかし、わずかにＳ−１００陽性を示すンユヴア ン細胞が多く見られたことから、これらの細胞の増殖がＰＤＧＦにより刺激され たものであることが示された。機能回復は確認できなかった。

５、群５−ＰＤＧＦとＩＣＦ−１の組み合わせによる処理（ｎ　−７）この群に おいては、機能を有する神経線維の顕著な増殖が認められた。２週間測定期間中 の平均増殖速度は１日あたり４．２±０．７ｍｍであった。

４４間後、この群においては、大きな、軸輪形成された軸索が、上述の他のいず れの処理を施した群よりも大量に認められた。多（のシュヴアン細胞が軸索に付 随していた。チューブシステムに沿ってビンセットで軽くつまむピンチ試験（軽 く麻酔したラットの足を゛つねる°ことによる疼痛反射及び疼痛伝達反射を見る 試験）を行なった結果、軸索東の長さに対応して機能の回復が確認された。

このように、神経再生におけるＰＤＧＦ／ＩＧＦ−１の組み合わせの効果は相加 的ではなく相乗的なものである。なぜなら、ＰＤＧＦのみでは軸索増殖に顕著な 効果はなく、また、ＩＧＦ−１による増殖の刺激も小さなものであったがらであ る。ＰＤＧＦ／ＩＧＦ−１による誘導にょν軸輪形成された神経の増殖は、１Ｃ Ｆ−１のみに誘導された場合の約７倍であった。ＰＤＧＦがシュヴアン細胞の増 殖を刺激することが強く示唆され、これによりＭＳのような脱髄疾患の治療に特 に有効である可能性が示された。

医療的使用法 これらの実験結果から本発明の化合物により、多発性硬化症（ＭＳ）　、筋萎縮 性側索硬化症（ＡＬＳ）、または神経突起の損傷または萎縮症に起因する他の神 経変性疾患のような疾患を治療することができることが示唆された。さらに、本 発明に記載した化合物により、外傷により障害を受けた神経を治療することもで きる。

本発明の組成物は、非経口投与により全身に分布させることができ、また、負傷 または障害を受けた神経の部位に局所的に投与することもできる。本発明により 提供される化合物は、薬理学的に許容可能ないかなる賦形剤または担体中で調製 することもできる。

化合物を脳または他の領域（例えば網膜）のＣＮＳのＣＮＳ疾患（例えば、虚血 、外傷及び腫瘍）に使用する場合、こねら化合物を天然でＣＮＳ中に浸潤するこ とのできる分子と結合させ、生物活性を有する部位を保持しつつポリペプチド鎖 の全長を短くすることにより、または、化合物の脂質親和性を高める（例えば、 適切なアミノ酸置換により）ことにより、ＣＮＳまたは脳を髄液中に直接浸透さ せてＣＮＳの組織に化合物を接触させる。

ＩＧＦに対するＰＤＧＦの効果的な分子量比は、１．：５００〜１０〇二〕、好 ましくは１　：　２５０〜５０：１の間、さらに好ま（、＜は１：１００〜２５ ：１の間であるとＴ−ｉｌｌされる。効果的な用量は、負傷または障害を受けた 神経、または萎縮した神経に対ｌ、て、１．　Ｆｌあたり活性化合物０．００１ μｇ〜１．，０００μｇであると予測される。

他の実施例は請求の範囲に含まれる。

表１ 神経再生を増大させることが報告されている因子神経増殖因子（ＮＧＦ）　ｎｅ ｕｒｏｎｏｔｒｏｐｈｌｃ　ｆａｃｔｏｒ　（ＮＴＦ）線毛ｎｅｕｒｏｎｏｔｒ ｏｐｈｌｃｆａｃｔｏｒ　（ＣＮＴＦ）　ＮＴＦ運動神経増殖因子（ＭＮＧＦ） 　ＮＴＦフィブロネクチン　軸索促進因子（ＮＰＦ）ラミニン　ＮＰＦ 神経細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）　（？）ＮＰＦＮ−カドヘリン　（？）ＮＰＦ フィブリン　マトリクス因子（ＭＦ） フィブロネクチン　ＭＦ（前駆体） ホルモンン エストロゲン　代謝性（？）蛋白質合成の増加テストステロン　代謝性（？）蛋 白質合成の増加チロイドホルモン　代謝性（？）蛋白質合成の増加コルチコトロ ピン　代謝性（？）蛋白質合成の増加Ｏｒｇ２７６６　代謝性（？）蛋白質合成 の増加インスリン　代謝性（？）蛋白質合成の増加カタラーゼ　過酸化水素障害 に対する防御酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）　（？）ＮＴＦ塩基性線維芽 細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）　（？）ＮＴＦフナルスコリン　蛋白質合成の増加 ダリア由来プロテアーゼインヒビタ（ＧｄＮＰＦ）　、（？）ＮＴＦＧＭＩガン グリオシド　（？） インスリン様増殖因子　（？）ＮＴＦ イサクソニン　軸索輸送の増加によるチューブリン重合の増加ロイペプチン　外 傷性変性の阻害 筋肉基底ラミナ　（？）ＮＰＦ　（？）ＮＴＦビロニン　ウォラー変性の促進 検査用（ｃｏｎｄ［ｔｌｏｎｌｎｇ）外傷　初期（ｅａｒｌｉｅｒ　）ウォラー 変性電気的刺激　（？） ｄｅ　Ｍｃｄｌｎａｃｅｌｌ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　最小限の外傷性変性Ｎ、Ｔ 、−無処理 ｐｗＰＤＧＦ−８ Ｐ＋１−ＰＤＧＦ−Ｂ＋ｌＧＦ−１ フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ （ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ， ＳＮ、　ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　 ＣＨ，Ｃ３゜ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、 　ＬＵ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＰＬ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ 、ＳＥ、ＵＡ （７２）発明者　アシドニアデス　バリー　エヌアメリカ合衆国　マサチューセ ッツ州　ニュートン　マグノリア　アベニュー　２１

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．哺乳類の神経の増殖促進のための薬物生産における、精製されたＰＤＧＦの 使用法。
2. ２．前記薬物がＰＤＧＦ以外の第二の神経増殖促進因子を使用して生産されるこ とを特徴とする請求項１に記載の使用法。
3. ３．前記第二の因子が増殖因子であることを特徴とする請求項２に記載の使用法 。
4. ４．前記増殖因子がＩＧＦであることを特徴とする請求項３に記載の使用法。
5. ５．前記ＩＧＦがＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、またはＩＧＦ−ＩＩＩであること を特徴とする請求項４に記載の使用法。
6. ６．前記ＩＧＦがＩＧＦ−Ｉであることを特徴とする請求項５に記載の使用法。
7. ７．前記ＩＧＦ−Ｉ及びＰＤＧＦが薬理学的に許容可能な担体中で混合されてい ることを特徴とする請求項６に記載の使用法。