JPH07500848A - １α，２４（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ↓２の調製及び使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １α、２４　（Ｓ）−ンヒトロキシビタミンＤ２の調製寿−及び使用方法本出願 は、１９９１年１月８日出願の米国出願第０７／６３７．８６７号及び１９９２ 年１月７日出願の米国を指定した国際出願第ＰＴＣ／ＵＳ９２１００３１３号の 一部継続出願である。

技術分野 本発明は、生物学的に活性なビタミンＤ２化合物に関する。更に詳細には、本発 明は、ホルモンによる活性自然代謝物１α、２４　（Ｓ）−ジヒドロキンビタミ ンＤ２ａびにその代謝物の調製方法及びその非生物学的エピマー】α、２４　（ Ｒ）〜ジヒドロキシビタミンＩ）２に関する。本発明は、また、１α、２４　（ Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ２の医薬的に有効な量を含む医薬組成物及び該化 合物の医薬的に有効な屯を投与することにより異常なカルシウム代謝を調節する 方法に関する。

発明の背景 動物及びヒトにおけるカルシウム代謝を調節するに当たり、ビタミンＤ及びその 活性代謝物が重要であることは既知である。動物及びヒトにおける天然生成型ビ タミンＤはビタミンＤ３である。ヒトを含む動物において、ビタミンＤ３は肝臓 で０２、位がヒドロキシル化され、次に腎臓でｌα位がヒドロキシル化されてホ ルモンＩα、２５〜ジヒドロキシビタミンＤ、［Ｉα、　２５　（ＯＨ）　２　 Ｄ　３”コを産生ずることにより活性化されることが知られている。米国特許第 ３．８８０．’８９４号参照。

ビタミンＤ３代謝物、２５−ヒドロキシビタミンＤ３及びＩα、２５−　（０１ −１）２Ｄｌの異化作用の主な生理的経路は、ＣＨＩ−酸化によって開始される 。１ｌｏｌｉｃｋ、　Ｍ、Ｆ。

、　Ｋｌｅｉｎｅｒ−Ｂｏｓｓａｌｌｉｅｒ、　Ａ、、　５ｃｈｎｏｅｓ、　ｔ ｌ、に、、　Ｋａｓｔｅｎ、　Ｐ、Ｍ、、　Ｂｏｙｌｅ、　P．Ｔ、、　ＤｅＬ ｕ ｃａ、　Ｈ，Ｆ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２４８．６６９１−６ ６！］６　（１９７３）。

ビタミンＤ２は植物に見られる主要な天然生成型ビタミンＤである。ビタミンＤ ２とビタミンＤ３は、ビタミンＤ、がＣ２１にメチル基を有しかっＣ１２とＣ２ Ｎとの間に二重結合を有する点て構造上界なっている。

これらが発見されてまもなく、ビタミンＤ、とビタミンＤ２は等価でないにして も類似の生物活性があるように思われていた。また一般に、ビタミンＤ２の代謝 （即ち、活性化及び異化）がビタミンＤ、ｌと同しであると考えられた。

１（ａｒｒｔｓａｎ’ｓ　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｉｒ＋４ｅｒｎａｌ　 Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：　Ｐａｒｔ　５ｅｖｅｎ、”Ｄｉｓｏｒр■窒刀@ｏｆ Ｂｏｎｅ　ａｎｄ　Ｍｉｎｅｒａｌ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：　Ｃｈａｐ、３５ ”　ｉｎ　Ｅ、Ｂｒａｕｎｗａｌｄ、Ｋ、Ｊ、　１ｓｓｅｌｂ≠モ■■秩B Ｒ，Ｇ、Ｐｅｔｅｒｓｄｏｒｆ、Ｊ、Ｄ、Ｗｉｌｓｏｎ、Ｊ、口、Ｍａｒｔｉｎ 、Ｈ，Ｓ、Ｆａｕｃｉ　（ｅｄｓ、）、Ｃａｌｃｉｕｍ、Ｐ■ ｏｓｐｈｏｒｕｓ　ａｎｄ　Ｂｏｎｅ　Ｍｅｔａｂｏｌ　ｉｓｍ：　Ｃａｌｃｉ ｕｍ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ　）ｌｏｒｍｏｎｅｓ、　Ｍｃfｒａｗ−Ｈｉｌｌ 。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐｐ、　１８６０−１８６５参照。これに関連して、活性 型ビタミンＤ２は、ｌα。

２５−ジヒドロキシビタミンＤ２［“１α、２５−　（ＯＨ）２Ｄ２”コである と考えられている。更に、２５−ジヒドロキシビタミンＤ２及びｌα、　２５　 （ＯＨ）　２　Ｄ　２の２４−ヒドロキシ誘導体、即ち、２４．２５−ジヒドロ キシビタミンＤ２及びｌα。

２４．２５−１−ジヒドロキシビタミンＤ２も既知であり、ビタミンＤ２の異化 がビタミンＤ、のように同じＣ１１酸化段階によって進行することが示された。

Ｊｏｎｅｓ、Ｇ、、Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ、Ｄ、、Ｓｅｇｅｖ、Ｄ、、Ｍａｚｕｒ 、Ｙ、、Ｆｒｏｌｏｗ、Ｆ、、Ｈａｌｆｏｎ、Ｙ、、Ｒｏｂｉｎａｖｉｃｈ、Ｄ 、、　５ｈａｋｋｅｄ、　Ｚ、、」神助ｅｍｉｓｔｒｙ、１８：ｌ０９４−１１ ０１　（１９７９）。

しかしながら、最近、ビタミンＤ２の活性類縁体、ｌα−ヒドロキシビタミンＤ ２［“ｌα−（ＯＨ）Ｄ２”］が、それに対応するビタミンＤ３、ｌα−ヒドロ キシビタミンＤ、［“１α−（ＯＨ）Ｄｌ”］によって示されるものと顕著に異 なった薬理学的性質を有することが判明した。米国特許第５．１０４．８６４号 には、１α−（ＯＨ）Ｄ、を２．０βｇ／日以上の用量で投与すると、ヒト骨粗 髪症患者の骨量減少が逆転することが開示されている。毒性のため、２．０βｇ ７日以上の投薬レベルは１α−（ＯＨ）Ｄ、ては安全に得られない。

このような薬理学的性質の相違は、ヒトに投与したｌα−（ＯＨ）Ｄ、の薬理学 的用量が生物学的に活性なｌα、２４　（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ＋［” ｌα。

２４　（Ｓ）−（ＯＨ）２Ｄ、”］に部分的に代謝されるという本発明者等の発 見によって完全にあるいは部分的に説明される。下記に詳細に説明されているよ うに、■−ヒドロキシル化ビタミンＤ２分子のＣ−２４位のヒドロキシル化は、 ビタミンＤ２分子に独特の活性化経路を示すものである。

ｌα、２４　（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ、及びｌα、２４　（Ｒ）−ジヒ ドロキンビタミンＤ、［“ｌａ、２４　（Ｒ／Ｓ）−（ＯＨ）２Ｄ、”］は化学 的に合成されている（米国特許第４．０２２．８９１号）が、どちらが生体系に 見られる天然化合物であることは示されていない。更に、本発明者等は、ｌａ、 ２４　（Ｓ）　（ＯＨ）２Ｄ２がｌａ、２４　（Ｒ／Ｓ）−（ＯＨ）２Ｄｓで示 されたものと顕著に異なった生物活性を有することを発見した。例えば、１ｓｈ ｊｚｕｋａ等は、ｌａ、２４　（Ｒ）　（ＯＨ）ｘＤ−の方が１．２５−　（Ｏ Ｈ）２Ｄｆｆよりもしっかりと１．２５　（Ｏ１’１）ｔＤａレセプター部位に 結合されることを見出している。ｌ５ｈｉｚｕｋａ、　Ｓ、、　Ｂａｎｎａｉ、 　Ｋ、、　Ｎａｒｕｃｈｉ。

Ｔ、、　ｌ（ａｓｈｉｍｏｔｏ、　Ｙ、、５ｔｅｒｏｉｄｓ、　３７：１，３３ −４２　（１９８１）；　ｌ５ｈｉｚｕｋａ、　Ｓ、、　Ｂ≠獅獅≠堰A　Ｋ、 。

Ｎａｒｕｃｈｉ、　Ｔ、、　）Ｉａｓｈｉｍｏｔｏ、　Ｙ、、５ｔｅｒｏｉｄｓ 、　３９：ｌ、５３−６２　（１９８２）。本発明者等は、同様のアッセイを用 いて、１．２５−　（ＯＨ）２Ｄ３　レセプター部位に結合するに当たり、ｌａ 、２４　（Ｓ）−（ＯＨ）、Ｄ、の方がｉ、２５−　（ＯＨ）２Ｄｉよりも２倍 競合的でないことを発見した。本発明者等は、また、Ｉα、２４　（Ｓ）−（Ｏ Ｈ）２ＤＺの方が相対的にビタミンＤ血清結合タンパク質に対する結合親和性が 悪く、毒性の低いことを示す半減期が幾分短いことが明らかであることも見出し た。

本発明者等は、ｌａ−（ＯＨ）Ｄ、を投与したヒトにおいて循環しているｌａ。

２４　（Ｓ）−（ＯＨ）、Ｄ２の存在を実証した。これは、動物及び人において ビタミンＤ２がｌａ、２５−　（ＯＨ）ｘＤ２及び１ａ、２４　（Ｓ）−（ＯＨ ）２Ｄ２の双方に自熱代謝されることを示している。２つのビタミンＤ２ホルモ ンの相対比率は、前駆体及びＣ２を経路に対して存在する前駆体の存在量によっ て異なると思われる。

即ち、ｌａ−（ＯＨ）Ｄ２の用量を増加するにつれて、ｌａ、２４　（Ｓ）−（ ＯＨ）２Ｄ２の１α、２５−　（ＯＨ）２Ｄ２に対する比率が増大すると思われ る。

下記に詳細に示されるこれらの結果は、■α、２４　（Ｓ）−（ＯＨ）２Ｄ２が 生物活性が高く毒性が低いという好ましい特性を有することを示している。薬理 学的レベルの１α−（ＯＨ）Ｄ２を投与すると、１α、２４　（Ｓ）−（ＯＨ） ２Ｄ２が有意な代謝物であるという事実は、ｌａ、２４　（Ｓ）−（ＯＨ）、Ｄ ２がｌａ−（０■］）Ｄ２の好ましい薬理作用を仲介しカリカルシウム代謝に関 与する種々の疾患を治療するのに有効な治療剤であることを示している。

発明の要約 本発明は、生物学的に生産した活性型ビタミンＤ２である合成ｌα、２４　（Ｓ ）（ＯＨ）　２Ｄｔを提供するものである。生物学的形態は、ｌａ、２４　（Ｓ ）−ジヒドロキシエルゴカルシフェロールとも呼ばれ、下記に示される構造によ って表される。該化合物の生物学的形態は、強力な生物活性を有しかつ体組織ク リアランスが速く、毒性が低い。

また、本発明は、出発物質としてエルゴステロールを用い、２４−ヒドロキシビ タミンＤＩを生成した後、その２４−ヒドロキシ化合物を１α−ヒドロキシル化 し、ｌａ、２４　（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ２エピマーをｌａ、２４　（ Ｒ）−ジヒドロキシビタミンＤ２エピマーから分離するｌａ、２４　（Ｓ）−ジ ヒドロキシビタミンＤ２の新規な製造方法を包含する。この合成過程において、 新規な中間体も製造される。

本発明の化合物は、ビタミンＤ欠乏を特徴とする種々の疾患及び種々の減骨性疾 患の治療、特に高カルシウム血症又は高カルシウム尿症を伴わない疾患の治療に 有効である。本発明の化合物は、ビタミンＤ欠乏症のための、骨量又は骨ミネラ ル含量の減少を生じやすい人においてそのような減少を逆転又は防止するための 及び腎性骨ジストロフィを罹患している人の青濃度を安定化するための医薬組成 物の有効成分として有利に用いられる。

本発明の化合物は、また、ある種皮膚疾患の治療の局所用薬剤としても有効であ る。本発明の化合物は、皮膚疾患を改善することができる他の薬剤を含んでもよ い局所用組成物の有効成分として有利に用いられる。

本発明の他の利点並びに具体的な適応、組成態様及び物理化学的性質の良好な評 価は、添付の図面を加えた本発明の下記の詳細な説明の試験で得られるであろう 。

図面の簡単な説明 本発明は、以後、添付の図面を加えて述べられ、同様の名称は図面の中でも同様 の成分を意味する： 図１は、２４−ヒドロキシビタミンＤ２合成の準備工程を示すものである；図２ は、２４−ヒドロキシビタミンＤ２で出発するｌａ、２４　（Ｓ）−ジヒドロキ ンビタミンＤ２合成の準備工程を示すものである；図３は、生物学的ｌα、２４ 　（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ２並びに合成ｌα。

２４（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ２のＲ及びＳエピマーの逆相高圧液体クロ マトグラフィープロファイルである。

図４は、ｌａ、２４　（Ｓ）−（ＯＨ）２Ｄ２及びｌａ、２４　（Ｒ）　−（Ｏ Ｈ）２Ｄ＊の相対的結合親和性を示すグラフである。

詳細な説明 本発明は、合成ｌα、２４　（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ２［１α、２４　 （Ｓ）−（ＯＨ）２−Ｄｚ］を提供するものである。

本明細嘗て用いられる語である“生物活性”、′生物学的活性”、“生体活性” 又は“生体効力のある”とは、代謝に影響する、例えば血清カルシウム濃度に影 響する又は適切なレセプタータンパク質、例えばビタミンＤレセプタータンパク 質に結合するような化合物の生化学的性質を意味するものである。化合物又は物 質について“実質的に純粋な”という語とは、少なくとも９０％の純度を意味す る。

本発明は、その態様の１つにおいては、下記式（Ｉ）の生物学的に活性な化合物 、即ち、ｌａ、２４　（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ２を包含する。

本発明は、もう１つの態様においては、Ｉα、２４　（Ｓ）−ジヒドロキシビタ ミンＤ２の調製を含んでいる。ｌａ、２４　（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ２ の合成は、図１及び２に示されている配列に従って達成される。以後、２４−ヒ ドロキシ化合物に言及される場合、特にことわらない限り、該化合物はＲ及びＳ 立体配置のエピマー混合物であると考えられる。図１に示されているように、合 成は出発物質としてエルゴステロールを使用する。エルゴステロールは、５段階 工程で２４−ヒドロキシエルゴステロール（５，７，２２エルゴスタトリエン− ３β、２４−ジオール（７））に変換される。次いで、２４−ヒドロキシエルゴ ステロールを当該技術において周知の方法によって照射及び熱的に変換して２４ −ヒドロキシビタミンＤ２を得る。図２に示されているように、次いで、Ｐａａ ｒｅｎ等、　Ｊ、　Ｏｒｇ。

Ｃｈｅａ、　ｖｏｌ、　４５．　ｐ、　３２５３　（１９８０）に記載されてい るものと同様の手順を用いて、２４−ヒドロキシビタミンＤ２を５段階工程でヒ ドロキシル化してＩα、２４−ジヒドロキシビタミンＤ２を得て、これからエピ マーが分離される。

詳細には、エルゴステロールをアセチル化して３β−アセテート（２）を生成す る。次いで、その３β−アセテートとトリアゾリンジオンとの反応により、付加 物（３）がエルゴステロール構造のＢ環とともに形成される。次いで、付加物（ ３）をオゾン化して側鎖を切り取り、Ｃ−２１アルデヒド（４）を生成する。

得られたアルデヒドと適切なケト化合物との反応により、側鎖を再び結合して２ ４−エノン（５）を得る。次いで、このエノンを２４−メチル、３β、２４−ジ ヒドロキシ付加物（６）に変換する。次いで、この付加物を水素化アルミニウム リチウムと反応させて付加物を脱保護し、２４−ヒドロキシエルゴステロール（ ７）を得る。次いて、この２４−ヒドロキシエルゴステロールが照射され、熱的 に処理されて２４−ヒドロキシビタミンＤ２を生成する。次いで、この２４−ヒ ドロキシビタミンＤ１をトシル化して２４−ヒドロキシビタミンＤ、の３β−ト シレートを得る。このトシレートを加溶媒分解で置換して６−メドキシー２４− ヒドロキシ−３，５−シクロビタミンＤ２を得る。このシクロビタミンＤ２をア リル酸化に供してｌａ、２４−ジヒドロキシシクロビタミン誘導体を生成する。

ごの１α、２４−ジヒドロキシシクロビタミン誘導体を連続的に加溶媒分解し、 ディールス−アルダ−（Ｄｉｅｔｓ−ａｌｄｅｒ　）型反応に供して６−メトキ シ基を除去し、５．６トランスｌα、２４−ンヒドロキシビタミンＤ２がらｌα 、２４−ジヒドロキシビタミンＤ２（５，６シス）を分離する。

このｌα、２４−　（ＯＨ）２Ｄ２を逆相高圧液体クロマトグラフィーにかけて ２種のエピマーを分離し、本発明のエピマー型である１α、２４　（Ｓ）−（Ｏ ）Ｉ）ｇＤ。

を回収する。

本発明の化合物は、種々の臨床薬及び動物薬分野に適用でき、カルシウム及びリ ンの代謝異常の治療に特に有効である。詳細には、ｌα、２４　（Ｓ）−ジヒド ロキンビタミンＤ２は、例えば、血清レベルのオステオカルシンで測定した骨芽 細胞活性を刺激するために用いられるように企図される。オステオカルシンは、 骨基質における主要タンパク質の１種である。１α、２４　（Ｓ）−ジヒドロキ シビタミンＤ２は、ビタミンＤ血清結合タンパク質に対する結合が１．２５　（ ＯＨ）２Ｄ３より弱く、その医薬特性を高める速いクリアランス及び低毒性を示 すものである。

本発明は、別の態様においては、肝不全、腎不全、胃腸不全等に起因するカルシ ウム代謝異常の治療のようなカルシウム代謝を調節する方法に関する。Ｉａ。

２４（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ２は、ビタミンＤ欠乏症及び関連疾患、例 えば、腎性骨ジストロフィ、脂肪性下痢、抗痙彎剤による骨軟化症、低リン血症 性ビタミンＤ抵抗性くる病、閉経後骨粗髭症、老人性骨粗鬆症、ステロイド骨粗 髭症のような骨粗ム症及び骨量減少に特有の他の疾患、ビタミンＤ欠乏性くる病 （ビタミンＤ依存症）、栄養性及び吸収不良性くる病、骨軟化症及び副甲状腺機 能低下症、術後副甲状腺機能低下症、特発性甲状腺機能低下症、偽性甲状腺機能 低下症及びアルコール依存症の二次的オステオカルシンを予防的又は治療的に治 療するために用いることができる。

ｌα、２４　（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ２は、また、乾癖、湿疹、皮膚の 適正な堅さの不足、皮膚の水和及び皮脂分泌のような過増殖皮膚疾患の治療にも 有効であり、乳がん及び結腸がんの治療にも有効である。

１α、２４　（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ２は、例えばカルシウムの代謝異 常によって誘発される疾患に適用した場合、活性型ビタミンＤ、の既知の類縁体 に比べて、副作用が少なく毒性の低い医薬組成物の活性化合物として有効である 。

これらの医薬組成物は、本発明のもう１つの態様を構成している。

本発明の薬理学的に活性な化合物は、患者、例えばヒトを含む哺乳動物に投与す るための治療剤を製造する調剤の慣用的な方法に従って処理することができる。

例えば、Ｉａ、２４　（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ２は、活性化合物と反応 することが有害でない腸内（例えば、経口）、非経口又は局所適用に適切な薬学 的に許容しうる担体物質のような慣用の賦形剤との混合物として用いることがで きる。

適切な薬学的に許容しうる担体としては、水、塩類溶液、アルコール、アラビア ゴム、植物油（例えば、アーモンド油、コーン油、綿実油、落花生油、オリーブ 油、やし油）、鉱油、魚肝油、ポリソルベート８０のような油性エステル、ポリ エチレングリコール、ゼラチン、炭水化物（例えば、ラクトース、アミロース又 はデンプン）、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、 脂肪酸モノグリセリド及びジグリセリド、ペンタエリスリトール脂肪酸エステル 、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が挙げられるが、これ らに限定されない。

医薬製剤は、滅菌され、場合によっては、補助剤、例えば、滑沢剤、防腐剤、安 定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響する塩類、緩衝剤、着色剤、香味剤及び／ 又は１種以上の他の活性化合物、例えば、ビタミンＤ、及びそのｌα−ヒドロキ シル化代謝物、混合エストロゲン又はその等飾物、抗エストロゲン、カルシトニ ン、ビホスホネート、カルシウム補強剤、コバラミン、百日咳毒素及びホウ素と 混合することができる。

非経口適用の場合、注射用無菌液剤、好ましくは油性又は水性溶液及び懸濁液剤 、乳剤又は坐薬のような挿入剤が特に適切である。非経口投与としては、皮下、 筋肉内又は静脈内注入、鼻咽頭又は粘膜吸収又は経皮吸収が適切である。アンプ ル剤は便利な単位剤形である。

腸内通用の場合、錠剤、糖衣錠、液剤、点滴剤、坐薬、ロゼンジ剤、散剤又はカ プセル剤が特に適切である。加糖賦形剤が所望される場合には、シロップ、エリ キシル等を用いることができる。

局所適用の場合、適切な噴霧てきない粘稠体、半固体又は固体を使用することが でき、局所適用と適合しかつ水より好ましくは大きい動的粘稠度を有する担体、 例えば、鉱油、アーモンド油、自己乳化みつろう、植物油、白色流動パラフィン 及びプロピレングリコールか挙げられる。適切な製剤としては、クリーム剤、軟 膏、ローノヨン剤、液剤、せ濁液剤、乳剤、散剤、リニメント剤、膏薬、エーロ ゾル剤、経皮用貼剤等が挙げられるが、これらに限定されず、場合によっては、 滅菌されるか又は補助剤、例えば、防腐剤、安定剤、解乳化剤、湿潤剤等と混合 される。本発明によるクリーム製剤は、例えば水、アーモンド油、鉱油及び自己 乳化みつろうの混合物を含むことが適切であり；軟膏製剤は、例えばアーモンド 油及び白色流動パラフィンを含むことが適切であり：ローノヨン製剤は、例えば 乾燥プロピレングリコールを含むことが適切である。

皮膚疾患の治療に有効な本発明による化合物の局所用製剤には、レチノイド（例 えば、ビタミンＡ）、ビタミンＥのようなりロマノール、イソプロテレノール又 は環状アデノンンモノホスフエート（ｃＡＭＰ）のようなβ−アゴニスト、コル チコステロイドのような抗炎症剤（例えば、ヒドロコルチゾンもしくはその酢酸 塩又はデキサメタシン）及びコールタール又はアントラリンのような角膜形成剤 のような上皮形成誘導剤も含められる。このような薬剤の有効」訳例えば、ビタ ミンΔが組成物の約０．００３〜約０．３重量％、ビタミンＥが約０．１〜約１ ０％、イソプロテレノールか約０．１〜約２％；ｃＡＭＰか約０．１〜約１％； ヒドロコルチゾンが約０２５〜約５％；コールタールが約０．１〜約２０％、及 びアントラリンが約０．０５〜約２！！６である。

直腸投与の場合、化合物はカカオ脂又は他のトリグリセリドのような生薬基剤を 含む医薬組成物に形成される。貯蔵寿命を延長するために、組成物はアスコルビ ン酸、ブチル化ヒドロキシ７′ニソール又はヒドロキノンのような抗酸化剤を含 むことか１′１利である。

カルシウム代謝疾患の治療の場合、本発明の医薬組成物の経口投与が好ましい。

一般的には、本発明の化合物は、弔位剤形当たり薬学的に許容しうる担体中約０ ．５〜約２５７１ｇを含むｍ佐剤形で調剤される。本発明による化合物の用量は 、通常的０．ＯＩ〜約１．０　ｔｔｇ／　ｋｇ／日、好ましくは約０．０４〜約 ０３μｇ／　ｋｇ／日である。

皮膚疾患の局所治療の場合、局所用組成物中本発明の化合物の用量は、通常組成 物１ｇ当たり約０．０１〜５０７１ｇである。

かんの治療の場合、局所適用された組成物中ｌα、２４　（Ｓ）−（ＯＨ）ＩＤ 、゛の用量は通常組成物１ｇ当たり約０．０１〜１００μｇである。

具体的な場合の活性化合物の実際の好ましい量は、用いられる具体的な化合物の 効能、処方される個々の組成、適用法並びに治療される個々の部位及び生体によ って異なる。例えば、個々の患者に対する具体的な投与量は、年齢、体重、全身 の健康状態及び性別、食事、投与の時間的調節と方法、排出速度並びに併用され る薬剤及び治療が適用される個々の疾患の重篤度に依存する。投与される宿主に 対する用量は、慣用的な考察を用いて、例えば、適切な慣用の薬理学的プロトコ ールによる本化合物と既知薬剤との示差活性の慣例的な比較により決定すること ができる。

また別の蝮様においては、本発明の化合物は、動物用組成物、例えば、低カルシ ウム血症を治療又は予防するための家畜の飼料組成物にも有利に用いられる。

通常、その飼料の標準的消費によって約０．Ｏ１〜約１．０μｇ／　ｋｇ／日が 動物に与えられるように、本発明の化合物が動物飼料中に調合される。

下記実施例は、単に具体的な説明であり、決して本発明の残りの開示を制限する ものと解釈されるべきてはない。下記実施例においては、内部標準としてＣｌＣ ｌ、を含むＣＤＣｌ、溶液中アスペクト３０００コンピユーターを倫えた８ｒｕ ｋｅｒ　ＡＭ−−４００（４００ＭＩＩｚ）を用いて、プロトン核磁気共鳴（’ ＩＩ　ＮＭＲ）スペクトルを記録した。ケミカルソフトはｐｐｍで報告される。

日立Ｕ−２０００分光光度計を用いて、紫外スペクトルを記録し、エタノール溶 液に対して報告される。

実施例ｊ：　１α−（ＯＨ）Ｄ、とインキュベートしたヒト肝細胞におけるｌα 。

２４　（？）−（ＯＨ）２Ｄ２の生成、精製及び同定実質的に純粋なＩａ−（Ｏ Ｈ）Ｄ２をＢｏｎｅ　Ｃａｒｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ、。

Ｍａｄｉｓｏｎ、　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎから入手した。このＩ　ａ　（ＯＨ）Ｄ ２をウシ胎児血清のない培地中ヒト肝がん、Ｈｅｐ３Ｂ由来細胞と当該技術にお いて既知の方法を用いて４８時間培養した。合わせた培地と細胞の脂質抽出液を 当該技術において既知の方法で生成し、ヘキサン／イソプロパツール／メタノー ル（９１：　７　：　２）で展開されるＺｏｒｂａｘ−３ＩＬの高圧液体クロマ トグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）にかけた。推定のｌａ、２４　（？）−（ＯＨ） ２Ｈ２代謝物は、親の１α−（０１−１）Ｄｔと標準のｌａ　、　２５　（ＯＨ ）　ｔ　Ｄ　ｔ　（これもＢｏｎｅ　Ｃａｒｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、 　Ｉｎｃｌ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓモ盾獅唐奄■ から入手）との間で溶離した。（本明細書で用いられる“ｌａ、２４　（？）− （ＯＨ）ｐＤ２”は、エピマー型が同定されていないことを示すものである。） ｌａ、２４（？）−（ＯＨ）、Ｄ２をこのＨＰＬＣ系で更に精製した後、質量分 析法を用いて代謝物の同定を行った。

精製した代謝物が出発物質、１α−（ＯＨ）Ｄａより極性が大きいので、ジヒド ロキシビタミンＤ２代謝物であると仮に結論された。この代謝物はビタミンＤ発 色団も有し、ビタミンＤのシス−トリエン系の保持を示した。代謝がｌａ−（Ｏ Ｈ）Ｄ、から誘導されたので、その構造はＩｃ、Ｘ−（ＯＨ）ｔＤ！　（“Ｘ” は第２ヒドロキシル基の位置を示す）であった。

１α、Ｘ−（ＯＨ）、Ｄ２のトリメチルシリル誘導体を当該技術において既知の 方法に従って調製し、ＴＭＳ誘導体及び未変性化合物について質量分析を行った 。

ＴＭＳ誘導体をＧＣ−ＭＳで解析し、主にピロ代謝物のフラグメンテーションパ ターンの解釈から同定した。分子イオンは、ジヒドロキシビタミンＤ２を示す６ ４４のｍ／ｚを有し、３つの７ＭＳ基の付加は追加の２１６質量単位とみなした 。

ｌａ−（ＯＨ）Ｄ２が３β及び１α基を有し、推定代謝物が更に１つのヒドロキ シルを有したので、全部で３つのヒドロキシルが誘導された。明瞭なフラグメン トが＋ｎ／ｚ　６０１．５１１．４２１．３３１で見られ、４３質量単位のフラ グメントだけか又は更にｌ、２又は３ＴＭＳ基の各々９０単位の消失を示した。

このパターンは、たぶんＣ−２４〜Ｃ−２５結合の開裂によるものと思われ、Ｃ ，Ｈ。

の消失は４３質量単位とみなした。これは、Ｃ２＠　Ｃ２Ｓ　Ｃ２７フラグメン トの消失を示している。更に、質量スペクトルはすべての２５−ヒドロキシル化 ビタミンＤ化合物に特有のｍ／ｚ　１３１フラグメントがなかった。

質量スペクトルは、ｍ／ｚ　５１３フラグメントを示し、Ａ環開裂のため１３１ 質量単位の消失を示し、ビタミンＤ化合物に特有のＣ２−Ｃ３−Ｃ，の消失も示 した。質量スペクトルは、たぶんＣ−２４〜Ｃ−２３開裂及びメチル基の消失か ら誘導されたｍ／ｚ　Ｉ　４３も含んだ。Ｃｔｘ　Ｃｒ＋開裂によるフラグメン トの消失と共にＣ２１−Ｃ２！の開裂を示す４３単位の特異な消失は、ｌａ、Ｘ −（ＯＨ）２Ｄ２に追加のヒドロキシルがＣ−２４にあることを示したものであ る。即ち、構造はｌａ、２４　（？）−（ＯＨ）２Ｄ２と同定された。

未変性代謝物を直接プローブ質量分析で解析した。この分析は２４位のヒドロキ シルと一致し、上記ＴＭＳ誘導体のＧＣ−ＭＳ解析とも一致した。未変性代謝物 はｍ／ｚ　４２８で予想された分子イオン、ｍ／ｚ　３６７で明瞭なフラグメン トを示し、１つの水と４３質量単位のＣ２Ｓ　Ｃｔｅ　Ｃ２？フラグメントの消 失を示した。

実施例２：　１α、２４　（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ２の合成（２２Ｅ） 　−５，７，２２−エルゴスタトリエン−３β−イルアセテート（２）３００ｍ ｌの無水ピリジン中５０ｇ（０，１３モル）のエルゴステロール（１）の溶液に ３３．３ｍｌ　（０，３５モル）の酢酸無水物を加えた。この混合液を室温で一 晩攪拌した後、６００ｍ１の水を加えた。沈澱をろ過し、２００ｍ１ずつのアセ トニトリルで３回洗浄した後、風乾して４２．０ｇ（７４％）の（２）を得た。

２２−オキソ−５α、８α−（４−フェニル−３，５−ジオキソ−１，２，４− トリアシリジン−１，２−ジイル）２３．２４−ジノル−６−コレン−３β−イ ルアセテート１０００ｍｌのクロロホルム中３３．０ｇ（０，０７５モル）のエ ルゴステロールアセテート（２）の溶液に１３．２ｇ（０，０７５モル）の４− フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオンを加えた。このようにし て生成した溶液（３）を室温で３０分間攪拌した後、５ｍｌのピリジンを加えた 。この溶液を一７８℃まで冷却し、−７８℃でオゾン−酸素混合物と２時間処理 した後、窒素で十分にパージした。次いで、５０ｍ１のジメチルスルホキシドを 加え、混合液を３００ｍ１の水、次に２００ｍ１の２ＮＨＣ１で２回、最後に３ ００ｍ１の水で洗浄した。有機層を分離し、無水Ｍｇ５Ｏ＋で乾燥し、減圧下で 濃縮乾固した。残留物をヘキサン中３０％酢酸エチルを用いてシリカゲルカラム で精製して１６．０ｇ（３９％）の標記化合物を発泡固形物として得た。

’ＨＮＭＲ：　（４００ＭＨｚ；　ＣＤＣｌ＊）＋　δｐｐｍ　０．８５（３ｔ ｌ、　ｓ、１８−Ｃ１（＊）、　１．１０（３１１，ｓ。

＋９−ＣＬ）、　１．１５（３１１，ｄ、　２ｌ−Ｃｌｌ、）、　１．９９（３ Ｈ，ｓ、　３β−ＣＩｌａＣＯ）、　５．４５（ＩＨ１Ｉ＋P，３α−１１）。

６．２６（ＩＨ，ｄ、　７−）１）、　６．４０（１）１．　ｄ、　６−Ｈ）、 　７．４２（５１１，亀Ｐｈ）、　９．５８（Ｉｌｌ、　ｄA　ｌＩｃ０）。

（２２Ｅ）５α、８α−（４−フェニル−３，５−ジオキソ−１，２，４−１− リアシリジン−１，２−ジイル）コレスタ−６，２２−ジエン−２４−オン−３ β−イルアセテート（５） 窒素下、ブチルリチウム（ヘキサン９１．６Ｍ溶液　８．９４ｍ１．Ｏ，０１４ モル）を乾燥テトラヒドロフラン（２０ｍｌ）中ジイソプロピルアミン（１，４ ５ｇ。

０、　Ｏｌ　４モル）の攪拌、冷却（０°Ｃ）溶液に加えた。乾燥テトラヒドロ フラン（６ｍｌ）中３−メチルブタンー２−オン（１，２３ｇ、　０．０１４モ ル）を０℃で１５分かけて滴下した。この溶液を０℃で更に１時間攪拌した後、 −７０℃まで冷却し、乾燥テトラヒドロフラン（６０ｍｌ）中アルデヒド（４０ ６，Ｏｇ。

０、０１１モル）の溶液を加えた。温度を一２０℃まで上昇させ、この温度で３ 時間維持した。次いて、氷酢酸（２０ｍｌ）を−２０℃で加え、この溶液を室温 に戻した。エーテル（８００ｍｌ）と水（４００ｍ１）を加え、有機層を分離し 、１０％塩酸（２Ｘ３００ｍｌＬ重炭酸ナトリウム飽和溶液（２Ｘ　３００ｍ１ ）及び水（２ｘ　３００ｗ＋ｌ）で洗浄した。濃縮して粗生成物（７，５ｇ）を 得、これを１．５Ｎ塩酸（１２ｍｌ）を含むテトラヒドロフラン（ｌｏｏ＋ｎｌ ）に溶解した。１．５時間還流し　−た後、混合液をエーテル（６００ｍ１）で 希釈し、５％炭酸ナトリウム溶液（２×２００ｍ１）及び水（２Ｘ　２００ｍ１ ）で洗浄し、乾燥（無水Ｍｇ５Ｏ，）した。減圧下で濃縮して粗生成物（７，０ ｇ）を得た。シリカゲル（ヘキサン中５０％酢酸エチル）でクロマトグラフィー 処理してエノン（５）４．０ｇ（５９％）を得た。

’ＨＮＭＲ：　（４００ＭＨｚ）：　δｐｐｍ　０．８３（３Ｈ，ｓ、　１８− Ｃｌ５）、　０．９９（３１１，ｓ、　１９−Ｃｔ（＋）、@１．０９ （６１１，ｄｄ、　２６及び２７−Ｃ１ｔ）、　１．１２（３Ｈ，ｄ、　２ｌ− Ｃ）＋３）、　２．０（３１＋、　ｓ、　３β−ＣＩｌ、Ｃn）。

２．８４（ＩＨ，−２５−Ｈ）、　５．４５（ＩＩｌ、　ＩＩＮ、３α−１（） 、　６．０６（ＩＦ（、ｄ、　２３−１１）、　６．２４（hｌｌ、　ｄ、　７ − Ｈ）、　６．３９（ＩＩＩ、　ｄ、　６−）１）、　６．７１（ＩＨ，ｄｄ、　 ２２−Ｈ）、　７．４２（５８，四Ｐｈ）。

（２２Ｅ）５α、８α−（４−フェニル−３，５−ジオキソ−１，２，４−トリ アシリジン−１，２−ジイル）　−６，２２−エルゴスタジエン−３β、２４− ジオール（６）乾燥エーテル（１００ｍｌ）中エノン（５）（３，５ｇ、　５． ７ミリモル）を０℃まで冷却し、メチルマグネシウムプロミド（エーテル中３． ０Ｍ溶液　６．８ｍ１．０．０２モル）を滴下した。０℃で１時間後、飽和塩化 アンモニウム（ｌｏｏｍｌ）を加えた。有機層を分離した。水層をエーテル（２ Ｘ　２００ｍ１）で抽出した。合わせたエーテル相を無水Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ＊で乾 燥し、減圧下で濃縮乾固して粗生成物３．０ｇ（９０％）の（６）を得た。

（２２Ｅ）−５，７，２２−エルゴスタトリエン−３β、２４−ジオール（７） 乾燥テトラヒドロフラン（２５０ｍ１）中３．０　ｇ　（５，１ミリモル）の（ ６）の溶液に３．６　ｇ　（０，０９モル）の水素化アルミニウムリチウムを加 えた。この混合液を３時間加熱還流し、氷水浴で冷却し、氷水（５ｍｌ）を注意 して滴下することにより反応混合液を分解した。混合液をろ過し、ろ液を減圧下 で濃縮してほとんどのテトラヒドロフランを除去した。残留物を２００ｍ１の酢 酸エチルに溶解し、ＮａＣ１飽和溶液（２Ｘ　２００ｍ１）で２回洗浄し、無水 Ｍｇ５Ｏｔで乾燥し、減圧下で濃縮した。残留物をヘキサン中３０％酢酸エチル を用いてシリカゲルカラムで精製して１．５ｇ（７１％）の（７）を得た。

１■ＮＭＲ：　（４００ＭＨｚ；　ＣＤＣｌ、）＋　δｐｐｍ　０．６４（３ｔ Ｌ　ｓ、　１８−Ｈ）、　０．８８（６Ｈ，ｄｄ、　２６及■ ２７−Ｃ１，）、　０．９３（３１１，ｓ、　＋９−ＣＩｌ３）、　１．０６（ ３Ｈ，ｄ、　２ｌ−ＣＩ（＊）、　１．１９（３Ｈ，ｓ、　Q８−ＣＬ）。

３．５５＜ＩＨ，ｍ、　３　α−Ｈ）、　５．３６（１８，ｄ、　７−Ｈ）、　 ５．４２（２８，ｍ、　２２及び２３−Ｈ）、　５．５２（h）ｌ。

ｄ、　６−Ｈ）　、　ＵＶ　（−Ｌタノール）λ６８、＋　２８２ｎｍ　。

２４−ヒドロキシビタミンＤ２　（ｓ）１　ｇ　（２，４ミリモル）の（７）を ２５０ｍ１のエーテルとベンゼン（４：　ｌ）に溶解し、水冷却石英浸漬ウェル 中窒素下で攪拌しながら１ｌａｎｏｖｉａ中圧ＵＶランプを用いて２時間照射し た。この溶液を減圧下で濃縮し、１００ｍ１のエタノールに再溶解し、−晩加熱 還流した。この溶液を減圧下で濃縮乾固し、ヘキサン中３０％酢酸エチルを用い てシリカゲルカラムで精製して０．５５ｇ（５５％）の（８）を得た。　゛ ’Ｉｔ　ＮＭＲ：　（４００ＭＨｚ；　ＣＤＣｌ、）：　δｐｐｍ　Ｏ，５７（ ３）１．　ｓ、　＋８−ＣＨｓ）、　０．９２（６ｔＬ　ｄпA　２６及 び２７−Ｃｔｌ、）、１．０６（３１１，ｄ、　２ｌ−Ｃ１１，）、　１．２０ （３１１，ｓ、　２Ｂ−Ｃｌｌ、）、　３．９３（ＩＩｌ、@ｍ、　３−ＩＩ） 。

４．７９（ＩＨ，ｍ（鋭い）、　１．９−１１）、　５．０１（ＩＩｌ、　ｍ、 （鋭い）、　１９−Ｉｔ）、　５．４３（２ｌｍ、　２２及■Q３ −１（）、　６．０２（Ｉｌｌ、　ｄ、　７−８）、　６．２２（ＩＩＩ、　ｄ 、６−Ｈ）。Ｉｆｆ（エタノール）　１ｍ−＊　：　２６５獅香@。

２４−ヒドロキシビタミンＤ２　トシレート（９）５ｍｌの無水ピリジンに溶解 した０、５５ｇ（＋、、３ミリモル）の（８）の溶液に０．６ｇ（３，２ミリモ ル）の塩化トシルを加えた。この混合液を窒素下５℃で２０時間攪拌した。この 反応混合液を１００ｍ１の冷ＮａＨＣＯ３飽和溶液に注ぎ入れ、エーテル（３Ｘ 　１００ｍ１）で抽出した。合わせた有機抽出液を５％ＭＣＩ溶液（２ｘ２００ ｍｌ）、重炭酸ナトリウム飽和溶液（２Ｘ　２００ｍ１）及びＮａＣ１飽和溶液 （２Ｘ　２００ｍ１）で洗浄し、無水Ｍｇ５Ｏｔで乾燥し、減圧下で濃縮して０ ゜６２ｇ（８４％）の（９）を得た。

’ＨＮＩＪＲ：　（４００！１ｌＨｚ；　ＣＤＣｈ）：　δｐｐｍ　０．５７（ ３ｔＬ　ｓ、　１８−ＣＩＬ、）、　０．９２（６Ｈ，ｄｄA　２６及 び２７−Ｃ０３）、１．０８（３１１，ｄ、　２ｌ−ＣＩｌ＋）、１．２４（３ １（、ｓ、　２８−Ｃ１１＋）、　２．４３（３１１，ｓ、@ＣＨｌ（ト シレート））、　４．６９（ＩＩＩ、　ｆｆ１．３−Ｉｔ）、　４．７７（ＩＨ ，ｍ、（鋭い）、１９−Ｉｔ）、　５．０（ＩＨ，ａ（鋭いj。

＋９−ｔＤ、　５．４２（２Ｈ，ｍ、　２２及び２３−ＩＩ）、　６．０３（１ −１１，ｄ、　７−ＩＩ）、　６．２５（ＩＩＩ、　ｄ、６|１１） ７．３１及び７．８３（４Ｈ，ｄ、芳香族）。

２４−ヒドロキシ−３，５−シクロビタミンＤ２　（１０）５０ｍｌの無水メタ ノールに溶解した０、６ｇ（１，０６ミリモル）の（９）の溶液に４．０　ｇ　 （０，０４７ミリモル）の重炭酸ナトリウムを加えた。この混合液を６時間加熱 還流した。この反応混合液を減圧下で濃縮した。水（１００ｍｌ）を加えた後、 エーテル（２ｘ２００ｍｌ）で抽出した。合わせたエーテル抽出液を無水Ｍｇ５ Ｏ１で乾燥し、減圧下で濃縮乾固して４５０ｍｇ（１００％）の（ｌＯ）を油状 物として得た。

ｌα、２４−ジヒドロキシ−３，５−シクロビタミンＤ＋（ＩＩ）ｔｅｒｔ−プ チルヒドロベルオキシド（８７０ｌ１ｌ（２，６１ミリモル）；トルエン中３Ｍ ）を５０ｍ１の無水ンクロロメタン中７３ｍｇ　（０，６６ミリモル）の二酸化 セレンの懸濁液に窒素下で加えた。この混合液を窒素下室温で３時間攪拌した。

次いで、０．１ｍｌの無水ピリジンを加えた後、１５ｍ１の無水ジクロロメタン に溶解した４５０ｍｇ（１，０６ミリモル）の（１０）の溶液を加えた。この混 合液を窒素下室温で１０分間攪拌した後、２５ｍ１の１０％ＮａＯＨ溶液を加え 、混合液をエーテル（３Ｘ　１００ｍ１）で抽出した。合わせたエーテル抽出液 を１０％ＮａＯＨ溶液（２ｘ１００ｍｌ）、水（２Ｘ１００ｎ＋ｌ）、塩化ナト リウム飽和溶液（２Ｘ１００ｍｌ）で洗浄し、無水Ｍｇ５Ｏ，て乾燥し、減圧下 で濃縮乾固した。残留物をヘキサン中３０％酢酸エチルの混合液を用いてシリカ ゲルカラムで精製して１１０ｎｇ（２４％）の（１１）を得た。

’ｔ＋　ＮＩＪＲ：　（４００Ｍｌｌｚ；　ＣＤＣｌ、）＋　δｐｐｍ　０．５ ５（３１１，ｓ、　１８−ＣＩＩ＋）、　０．９０（６Ｈ，рпA　２６及 び２７−ＣＨｉ）、１．０３（３８，ｄ、　２＋−ＣＨ，）、１．１９（３Ｈ， ｓ、　２８−ＣＤ５）、　３．２５（３１１，ｓ、　−０Ｃh−１，）。

４．１９（ＬＨ，ｄ、　６−Ｈ）、　４．１９（１ｔＬ　Ｋ　１−ｔ（）、　４ ．９２（２ｔＬ　ｄ、　７−ｔＱ、　５．１５（ＬＨ，亀（sい）。

＋９−Ｈ）、　５．２（１１（、乳（鋭し０．１９−Ｈ）、　５．４２（２＋１ ．亀２２及び２３−１１）。

５．６−ノス及び５．６−トランス−１α、２４−ジヒドロキシビタミンＤ２（ １２゜１　ａ、２４−ジヒドロキシ−３，５−シクロビタミンＤ、（１１）　ｌ 　ｌ　Ｏｍｇ（０，２５ミリモル）を２．ｆ）ｍｌのジメチルスルホキシドと１ ．５ｍｌの酢酸に溶解し、窒素下５０°Ｃて１時間加熱した。この溶液を水と５ ０ｍ１のＮａＨＣＯ，飽和溶液に注ぎ入れた。この混合液をエーテル（３Ｘ　Ｉ 　００ｍ１）で抽出した。合わせたエーテル抽出液をＮａＨＣＯ３飽和溶液（３ Ｘ１００ｍｌ）、水（２Ｘ　２００ｍ１）、ＮａＣｌ飽和溶液（２ｘ　２００ｍ １）で洗浄し、無水Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ＋で乾燥し、減圧下で濃縮して粗生成物１０ ０ｍｇ（９３％）の（１２）及び（１３）を得た。

５．６−ノスーｌα、２４−７ヒドロキシビタミンＤ２　（１２）５ｍｌの酢酸 エチル中（１２）及び（１３）の溶液に２０ｍｇ　（０，２ミリモル）のマレイ ン酸無水物を加え、この混合液を窒素下３５°Ｃで２４時間攪拌した。この溶液 を減圧下で濃縮乾固した。残留物をヘキサン中５０％酢酸エチルを用いてシリカ ゲルカラムで精製して２０ｍｇ（２２％）の（１２）を得た。

’Ｉｔ　ＮＭＲ：　（４００Ｍｌｌｚ；　ＣＤＣ１，）：　δＩ）ｌ）ｍ　０． ５７（３＋１．８．１８−Ｃ１１，）、　０．８９（６＋１D　ｄｄ、　２６及 び２７　Ｃ１（＋）、１．０４（３Ｈ，ｄ、　２ｌ−Ｃｌ１３）、１．２１（３ Ｈ，ｓ、　２８−ＣＩＩ＋）、　４．２３（ＩＩＩ、　ｍ、@３−ｔＤ。

４．４０（ＩＨ，ｍ、１．−Ｈ）、　５．０（ＩＨ，ｍ、（鋭い）、　１９−） １）、　５．３３（ＩＩＩ、　ｍ、（鋭い）、１９−）１）B ５．４４（２）１．　ｍ、　２２及び２３−ＩＩ）、　６．０１（Ｉｌｌ、　ｄ 、　７−Ｈ）、　６．３７（ＩＨ，ｄ、　６−１１）　。Ｕu　（ｆｆ−タノ ール）λ、Ｉ、、　＋　２６５ｎｍ。

ｌα、２４　（Ｓ）−ジヒドロキンビタミンＤ２　（１４）溶媒系、アセトニト リル　水、（ｉｏ　＋　４０．　Ｉ　Ｏｍｌ／分による逆相５ｕｐｃｌｃｏ　Ｃ −８分取カラム（２５αｍＸ２１．２αｍ＋　；粒子サイズ１２　μｍ）を用い てＷａｔｅｒｓ装置て行った高圧液体クロマトグラフィーにより、１α、２４− （０１（）２Ｄ、の２４エピマーを分離した。これらのエピマーをエピマー１及 びエピマー２と称した。これらの条件下、エピマー１の保持時間は６３分てあり 、エピマー２の保持時間Ｇよ７１分てあった。結晶Ｘ線回折を用いて、エピマー ２の立体化学がｌα、２４　（Ｒ）−（ＯＨ）、Ｄ、であることをめた。従って 、エピマー１の立体化学はｌα、２４（Ｓ）−（ＯＨ）２Ｄ、であることがわか った。

実施例３・　化学的に合成されたエピマーｌα、２４　（Ｓ）−（ＯＨ）、Ｃ２ 及び■α、２４　（Ｒ）−（Ｏｒ−（）２Ｄ＋との比較による生物学的に誘導さ れたｌα、２４　（？）−（ＯＨ）、１）、代謝物の立体化学の同定上記実施例 １て得られた生物学的に産生された代謝物の立体化学を上記実施例２て得られた 化学的に合成されたエピマーとを高圧液体クロマトグラフィー及びガスクロマト グラフィーによって比較した。これらの比較に基づいて、生物学的に産生された 代謝物が構造、Ｉα、２４　（Ｓ）　−（ＯＨ）２Ｄ＋を有することをめた。図 ３は、この比較を行う高圧液体クロマトグラフィー実験のプロファイルを示すも のである。図３において、エピマー■は化学的に合成されたｌα、２４　（Ｓ） （ＯＨ）２Ｄｌである。

（ａ）高圧液体クロマトグラフィーの比較は、２種類の異なるカラム及び溶媒系 を用いた。溶媒系、アセトニトリル：水、６０：４０，１ｍｌ／分を用いる逆相 カラムＺｏｒｂａｘ−ＯＤＳ　（Ｄｕｐｏｎｔ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ：　３ 　μ；６．２　ｍｍＸ８　ｃｍ）では、生体代謝物が１４．３分て溶出され、Ｉ α、２４　（Ｓ）　−（ＯＨ）、Ｃ２は１４．２分て溶出されたが、Ｉα、２４ 　（Ｒ）　−（０１１）、Ｄ、は１５．７分て溶出された。

溶媒系、ヘキサン：イソプロパツール　メタノール、９４　：５　：　ｌ、１ｍ ｌ／分を用いる直接相カラムＺｏｒｂａｘ−３ＩＬ　（Ｄｕｐｏｎｔ　Ｉｎｓｔ ｒｕｍｅｎｔｓ；　３７ｚ；　６．２　ｍｍｘ８　ｃｍ）では、生物代謝物が２ ２．４分て溶出され、Ｉα、２４　（Ｓ）−（ＯＨ）２Ｄ、は２２．４分て溶出 されたか、１α、２４　（Ｒ）　−（ＯＨ）２Ｄ２は２２．８分で溶出された。

（ｂ）カスクロマトグラフィーに関しては、１α、２４　（Ｓ）−（ＯＨ）ｌＣ ２は生物学的に産生された化合物と同時に移動したが、１α、２４　（Ｒ）−（ ＯＨ）２Ｄ２の保持時間は全く異なった（表１）。

表１．　ピローｌα、２５　（ＯＨ）＋Ｄ＋に相対するピロ誘導体のガスクロマ トグラフィー保持時間 化合物　相対保持時間＊ Ｉα、２４（Ｓ）−（ＯＨ）２Ｄ２１．０１６５１α、２４（Ｒ）−（０）１） 、Ｃ２１，００９８生体代謝物　１．０１６３ ＊保持時間は、内部標準ｌα、２５−　（ＯＨ）２Ｄ＊に相対して示され、ピロ 誘導体が比較される。

実施例４　：　ｌａ、２４　（Ｓ）　（ＯＨ）ｔＤａとｌａ、２４　（Ｒ）−（ ＯＨ）ｔＤｔ　（７）生物活性の比較 ビタミンＤレセプター（ｖＤＲ）発現プラスミドｐＳＧ５−ｈＶＤＲＩ／３及び 成長ホルモン（ＧＨ）遺伝子を含むプラスミドｐ　（ＣＴ４）”ＴＫＧＨをミド リザルのＣ０８−１腎細胞に同時移入したビタミンＤ依存性転写活性化モデル系 を用いて、化学的に合成された１（Ｚ、２４　（Ｓ）　（ＯＨ）ＩＣ２と１α、 ２４　（Ｒ）−（ＯＨ）２Ｄ２の生体外生物活性を測定した。これら２種類のベ クターのＤＮＡは、Ｄｒ、　Ｍａｒｋ　Ｈａｕｓｓｌｅｒ、　Ｄｅｐａｒｔｍｅ ｎｔ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ａｒ Pｚｏｎａ。

Ｔｕｃｓｏｎ、＾ｒｉｚｏｎａから入手した。

移入細胞をビタミンＤ代謝物とインキュベートし、成長ホルモンの生産を測定し た。表２に示されているように、この系においては、ｌａ、２４　（Ｓ）　−（ ＯＨ）２Ｄ、がｌａ、２４　（Ｒ）−（ＯＨ）、Ｃ２より著しい活性を有した。

表２　：　ＣＯ３−１移入細胞におけるビタミンＤ誘導成長ホルモンの生産ビタ ミンＤ誘導成長ホルモンの生産 全ＧＨ生産９　正味のビタミンＤ 誘導物質　モル濃度　（ｎｇ／ｍ＋）　誘導ＧＨ生産（ｎｇ／ｎｌ）エタノール 　４４　０ ２５−ＯＨ−Ｄ、　１０−’　２４５　２０１１０”　７７５　７３１ １α、２５−（０）１）ｚＤｓ　ｔｏ−”　７４　３０１０゛’　９２５　８８ １ ｔｏ−＠１４７５　１４４１ １α、２４（Ｓ）−（０１１）２１）２　５ＸＩＯ”　４２５　３８１５ＸＩＯ −’　１３５０　１３０６ ５ＸＩＯ”　＋１８２　１１３８ １α、２４（Ｒ）−（０１１）２Ｄ！　１０”’　８０　３６１０ｓ１＋００　 １０５６ １０−’　１３００　１２５６ ′″２回定量の平均 実施例５：　１α、２４　（Ｓ）−（ＯＨ）２Ｄ、のビタミンＤレセプターに対 する親和性 ｌｎｃｓｔａｒ（Ｓｔｉｌｌｗａｔｅｒ、　Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）製の市販のウ シ胸腺ＶＤＲ及び１．２５−（ＯＨ）？　Ｄｓ標準溶液のキットを用いて、ｌａ 、２４　（Ｓ）　（ＯＨ）２Ｄ２の哺乳動物ビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）に 対する親和性を評価した。精製ｌα、２４（Ｓ　）　（ＯＨ）　２　Ｄ　２をホ トダイオードアレー分光光度法によって定量し、ラジオレセプターアッセイで測 定した。１α、２４　（Ｓ）−（ＯＨ）２Ｄ、の半最大結合は約１５０　ｐｇ／ ｍｌであったが、ｌ　α。２５　（ＯＨ）ＩＤ２は８０　ｐｇ／ｍｌであった。

即ち、１α、２４　（Ｓ）−（ＯＨ）２Ｄ２のウシ胸腺ＶＤＲに対する親和性は Ｉα。

２５−　（ＯＨ）２Ｄ、より２倍低く、ｌａ、２４　（Ｓ）−（ＯＨ）２Ｄ、が 強力な生物活性を有することを示した。

実施例６　：　ｌ　α、２４　（Ｓ）　（ＯＨ）２Ｄ２　及ヒ１　α。２４　（ Ｒ）　（ＯＨ）２Ｄ２のビタミンＤレセプターに対する相対親和性Ｉｎｃｓｔａ ｒ（Ｓｔｉｌｌｗａｔｅｒ、　Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）製のウシ胸腺ＶＤＲ及びｌ ａ、２５　（ＯＨ）２Ｄ、標準溶液の市販の試薬を用いて、ｌａ、２４　（Ｒ） −（ＯＨ）２Ｄ２及び１α。

２４　（Ｓ）−（ＯＨ）２Ｄ２のビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）に対する相対 親和性を評価した。精製１　ａ、２４　（Ｒ）　（ＯＨ）２Ｄｚ及びＩα、２４ 　（Ｓ）−（ＯＨ）ｌＣ２エピマーを紫外線分光法で定量した。図４に示されて いるように、レセプターから’ＨＩ　α。２５　（ＯＮ）ｚＤｓ　トレーサーを 同様に置換させるのに要するＩα、２４　（Ｒ）−（０１（）、Ｃ２の濃度は、 １α、２４　（Ｓ）　−（ＯＨ）２Ｄ。

に要するものの２０〜３０倍であった。これらのデータは、Ｉα、２４　（Ｓ） −（ＯＨ）２Ｄ２エピマーの活性がｌａ、２４　（Ｒ）　＝（０１−（）ｌＣ２ エピマーより著しく大きいことを示すものである。

実施例７：　１α、２４　（Ｓ）　（０１１）２Ｄ２のビタミンＤ血清結合タン パク質に対する親和性 １α、２４　（Ｓ）〜（０１−Ｃ２Ｄ２のビタミンＤ血清結合タンパク質（Ｄ　 Ｂ　Ｐ）に対する親和性を、ビタミンＤ欠乏ラット血清を用いて当該技術におい て既知の方法に従って評価した。データは、ＤＢＰの１α、２４　（Ｓ）−（Ｏ Ｈ）２Ｃ２結合が２５−０Ｈ−Ｄ、の場合より少なくとも１０００倍弱いことを 示した。１α、２４（Ｓ）−（ＯＨ）ＩＤ、のＶＤＲに対する結合か強くかつＤ 　Ｂ’Ｐに対する結合が弱ければ、本化合物は標的細胞によって吸収される傾向 があるので、強力な生物活性を有する。更に、ＤＢＰによる結合が弱いことは、 クリアランスが速いことを示し、毒性の低いことか認められた。

従って、前記アッセイにより、新規なｌａ、２４　（Ｓ）−（ＯＨ）２Ｄ２が活 性の明瞭かつユニークなスペクトル、即ち、従来技術の化合物及び２４（Ｒ）エ ピマーの化合物と明らかに区別される高い生物学的効力と低い毒性を示すことが 証明された。

実施例８．１α、２４　（Ｓ）−（ＯＨ）２Ｄ２のビタミンＤ２及び２４　０Ｈ Ｃ２からの生成 ビタミンＤ２又は２４−ＯＨＣ２をビタミンＤ欠乏ラットに投与した（経口又は 腹腔的投与）。血漿の脂質抽出液を調製し、生物学的標準ｌα、２４−（Ｏ）（ ）　２Ｄ　２を合成する下記Ｈｏｒｓｔ等の方法（１イｏｒｓｔ、　Ｒ，Ｉ、、 、　Ｋｏｓｚｅｗｓｋｉ、　Ｎ、　Ｊ、。

Ｒｅ１ｎｈａｒｄｔ、　Ｔ、＾、、　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｎ、、　２９：５７８−８ ２　（１９９０））により、代謝物を精製した。

ビタミンＤ欠乏ニワトリから調製した５ｍｌの２０％腎ホモジエネートを含むフ ラスコ中で１０μｇの２４　００　Ｃ２をインキュベートすることにより、生物 学的標準ｌα、２ｔ−（ＯＨ）２Ｄ２を２４−０Ｈ−Ｃ２から生体外で合成した 。この反応の生成物を１−Ｊ　Ｐ　Ｌ　Ｃて単離し、質量分析で同定した。ビタ ミンＤ２又は２４　０ＨＤ＋を投与したビタミンＤ欠乏ラットの血漿の脂質抽出 液においては、単離した代謝物が標準ｌα、２４−　（ＯＨ）２Ｄ２とＩ−Ｉ　 Ｐ　Ｌ　Ｃて同時移動し、Ｉα、２４−　（ＯＨ）ｌＣ２がビタミンＤ、の自然 代謝物であることが示された。対照的に、ビタミンＤ、を投与した比較ラットは 、検出できる２４　０ＨＤａを有しなかった。

実施例９：　生体外における高基質濃度による１α、２４−（ＯＨ）ｒＤｒの優 先的生産 １−１ｅｐ３Ｂ細胞を上記したように１ａ　ＯＨＣ２と１．１０又は１００ｎ閘 （実験１）及びｌ又はＩＯμＭ（実験２）の最終濃度でインキュベートし、ｌａ 、２４（Ｓ）−（ＯＨ）２Ｄ２を抽出及び精製した。Ｉα、２４　（Ｓ）−（Ｏ Ｈ）２Ｄ２及びｌａ、２５−　（０１４）２Ｃ２代謝物を放射能標識の回収（実 験１）又はホトダイオードアレー分光光度法（実験２）で定量した。表３に示さ れているように、基質濃度を高めると、Ｉα、２４　（Ｓ）−（ＯＨ）２Ｄ２の 量は１α、２５−（０Ｈ）２Ｄ、の量に相対して増加した。これは、この系にお いて、ｌａ、２４　（Ｓ）　−（０１（）２Ｄ２か高基質濃度におけるＩα−０ Ｈ−Ｃ２の優先的自然活性代謝物であったことを示している。

実施例１０：　ｌα−（ＯＨ）２Ｄ、を投与した骨粗鬆症の女性における１α、 ２４（Ｓ）　−（ＯＨ）ＩＤＩの生産 骨相ｒ症の治療用薬剤の実験の一部として、ｌα−０１（Ｄ＋を投与したヒト女 性において、ｌα、２５　（ＯＨ）２Ｄ２に相対する１α、２４　（Ｓ）−（Ｏ Ｈ）２Ｄ２の生産増加も本発明者等によって認められた。２μｇの【α−０Ｈ− Ｄ２を１回投与するかあるいはＢ１１ｇ１日を１週間毎日投与した後、血液を採 取し、代謝物１α、２４　（Ｓ）−（ＯＨ）、Ｄ２及びｌα、２５　（ＯＨ）２ Ｄ２を分析した。血液から脂質を抽出し、標準法を用いたＨ　Ｐ　Ｌ　Ｃて代謝 物を精製し、ｌｎｃｓＬａｒ（Ｓｔｉｌｌｗａｔｅｒ。

Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）製のラジオレセプターアッセイて定１した。２μｇを１回 投与した１日後、Ｉα、２４　（Ｓ）−（ＯＨ）２Ｄ２のレベルは検出できす、 １α、２５−（＋］−１）２Ｄ２レベルは約１１　ｐｇ／＋ｎｌてあった。対照 的に、８ａｇを最後に投与した１日後、１ａ、２４　（Ｓ）−（ＯＨ）２Ｄ２の レベルは平均９　ｐｇ／ｍｌであり、ｌα、２５−（ＯＨ）、Ｄ、レベルは平均 ３０　ｐｇ／ｒｎｌであった。

実施例１１：　閉経後の骨粗黙症女性における投与量範囲の実験２０人の閉経後 の骨粗髭症女性をオープンラベル実験に登録する。選ばれた患者は、年齢５５〜 ７５才であり、ＬＵＮＡＲボーンデンシトメータ（ＬｕｎａｒＣｏｒｐｏｒａｔ ｉｏｎ、　Ｍａｄｉｓｏｎ、　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）による測定でめた場合、Ｌ ２−Ｌ３を推動物置ミネラル濃度０．７〜１．０５　ｇ／ｃｍ２を示している。

実験に入る際、患者は全員４００〜６００ｍｇのカルシウムを含有する食事を毎 日摂取することが指導される。この食事に従っていることは、２４時間の食品の 記録と各患者との面接により１週間毎に確認される。

患者は全員１週間の基準期間、５週間の治療期間及び１週間の後治療観察期間を 終える。治療期間中、患者はｌα、２４　（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ２を 最初の１週間に０．５μｇ／日の開始投与量で、次の４週間に各々１．０．２． ０．４．０及び８．０ａｇ７日の連続的に増やした投与量で経口的に自己投与す る。投与量はすべて朝食前に投与される。

実験期間中１週毎に血液と尿検査がモニターされる。鍵となる血液検査としては 、カルシウム、リン、オステオカルシン、クレアチニン及び血中尿素窒素の空腹 時血清レベルが挙げられる。鍵となる尿検査としては、カルシウム、リン及びク レアチニンの２４時間排出が挙げられる。

この臨床実験の血液及び尿のデータは、本化合物がクレアチニンクリアランスと 尿素窒素の血中レベルでめた場合、腎機能に悪影響を及ぼさず：ヒドロキジプロ リンの尿排出を増加しないことも示しており、骨吸収の刺激作用のないことを意 味する。本化合物は、通常モニターされる血清パラメーターに影響せず、代謝に 不利な影響のないことを意味する。

カルシウムホメオスタシスに関する１α、２４　（Ｓ）−ジヒドロキシビタミン Ｄ。

の正の効果は、２４時間尿カルシウムレベルの適度な増大から明らかであり、化 合物が腸内カルシウム吸収を高めることが確認され、また血清オステオカルシン レベルの増大からも明らかであり、化合物が骨芽細胞を刺激することが示される 。

実施例１２：　閉経後の骨粗に症女性における骨量減少の予防的治療臨床実験は 、年齢５５〜７５才の閉経後の骨粗髭症外来患者で行われる。実験は、１２０人 までの患者が３つの治療グループに無作為に分けられ、２４〜３６カ月続ける。

治療グループの２つには１α、２４　（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ２の一定 量（ｕ、　ｉ、　ｄ、　；　１．　Ｏμｇ／日以上の２種類の投与量レベル）が 投与され、他のグループにはマッチングプラセポが投与される。患者は全員規定 のカルシウム食＜５００〜８００ｍｇＺ日）を摂取し、カルシウム補強剤の使用 を控える。薬効は、（ａ）全体内カルシウム貯留及び（ｂ）二重光子吸収法（Ｄ ＰＡ）又は二重エネルギーＸ線吸収法（ＤＥＸＡ）でめられる撓骨及びを推骨の 骨ミネラル濃度について治療前後の比較により評価される。安全性は、尿ヒドロ キシプロリン排出、血清及び尿カルシウムレベル、クレアチニンクリアランス、 血中尿素窒素及び他の通常の分析の比較により評価される。

結果は、Ｉα、２４　（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ２で治療した患者の全体 内カルシウム並びに撓骨及びを椎骨の骨ミネラル濃度がプラセボで治療した患者 に比べて著しく高いことを示している。モニターされた安全性のパラメーターか らは、高カルシウム血症もしくは高カルシウム尿症又はｌα、２４　（Ｓ）−ジ ヒドロキノビタミンＤ２治療による他の代謝障害をはとんと出現しないことが確 認される。

実施例１３：　閉経後の骨喪失の予防 臨床実験は、年齢５５〜６０才の健康な閉経後女性で行われる。実験は、８０人 までの患者が２つの治療グループに無作為に分けられ、２４〜３６カ月続ける。

一方の治療グループには、Ｉα、２４　（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ、の一 定量（ｕ、　ｉ、　ｄ、　；　１．０ａｇ／日以上の投与量レベル）が投与され 、もう一方にはマッチングプラセボが投与される。実験は、上記実施例２て示さ れているように行われる。

結果は、ｌα、２４　（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ２で治療した患者の全体 内カルシウム及び撓骨及びを椎骨の骨ミネラル濃度の減少が基準値に比べて低下 したことを示している。対照的に、プラセボで治療した患者は、これらのパラメ ーターが基準値に比べて著しく減少している。モニターされた安全性のパラメー ターからは、ｌα、２４　（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ２のこの投与量レベ ルでの長期投与の安全性が確認される。

実施例１４：　慢性血液透析患者における低カルシウム血症及びそれに伴う代謝 性骨疾患の治療 １２力月、二重盲検、プラセボ対照臨床実験は、慢性血液透析を受けている腎疾 患に罹っている３０人の男性及び女性で行われる。患者は全員８週間の調節期間 に入り、その間ビタミンＤ、（４００１Ｕ／日）の維持投与量が投与される。こ の調節期間の後、患者は２つの治療グループに無作為に分けられ、一方のグルー プにはＩ７！、２４　（Ｓ）−ジヒドロキソビタミンＤ２の一定量（ｕ、　ｉ、 　ｄ、　；　３．　Ｏｔｔｇ１日より多い用量）が投与され、もう一方にはマッ チングブラセポが投与される。

両治療グループともビタミンＤ、の維持用量を投与し、規定のカルシウム食の摂 取を維持し、カルシウム補強剤を用いることを控える。薬効は、（ａ）腸内カル シウム吸収の直接測定、（ｂ）全体内カルシウム貯留、（ｃ）撓骨及びを椎骨の 骨ミネラル濃度又は（ｄ）血清カルシウムの定量について２つの患者グループの 治療前後の比較により評価される。安全性は、血清カルシウムを規則的にモニタ ーすることによって評価される。

臨床データを分析すると、二重同位体法を用いて直接測定することによりめたｌ α、２４　（Ｓ）−ジヒドロキ／ビタミンＤ、が腸内カルシウム吸収を著しく増 大させることを示している。本化合物で治療した患者は、基準値に比べて血清カ ルシウムレベルが基準化され、全体内カルシウム値が安定であり、撓骨及びを椎 骨の骨濃度が安定である。対照的に、プラセボで治療した患者は、頻繁に低カル シウム血症を示し、全体内カルシウム並びに撓骨及びを椎骨の骨濃度が著しく低 下する。治療グループには、高カルシウム血症がほとんど見られない。

実施例１５：　薬剤の調製 １．０ｍｇのｌα、２４　（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ２をＩｇのアーモン ド油に溶解することにより、局所用クリームを調製する。この溶液に４０ｇの鉱 油と２０ｇの自己乳化みつろうを加える。この混合液を加熱して液化する。４０ ｍ１の熱湯を加えた後、混合液を十分に混合する。得られたクリームは、クリー ムＩｇ当たり約１０μｇのｌα、２４　（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ、を含 有する。

実施例１６＋ １．０＋ｎｇのｌα、２４　（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ、を３０ｇのアー モンド油に溶解することにより、軟膏を調製する。この溶液に温めてちょうど液 化した７０＋ｎｇの白色流動パラフィンを加える。軟膏を十分に混合し、冷却す る。この軟膏は、軟膏１μ当たり約１０μｇの！α、２４　（Ｓ’）−ジヒドロ キシビタミンＤ。

を含有する。

実施例１７： 実施例１４の軟膏に、最少量のジメチルスルホキシドに溶解した０、　５　ｇの アデノシンと２．０ｇのパラベリン基剤を共に加え、十分に混合する。添加成分 は、約０．５重量％（アデノシン）と２重量％（パラベリン基剤）の程度まで存 在させる。

実施例１８： 実施例１４の軟膏に、最少量の植物油に溶解したｌｏ、０００ＵのビタミンＡを 加え、十分に混合する。得られた軟膏は、軟膏１μ当たり約１０００のビタミン Ａを含有する。

実施例Ｉ９・ １．０ｍｇの１α、２４　（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ２を１００ｇの乾燥 プロピレングリコールに溶解することにより、皮膚科用ローションを調製する。

ローションは褐色びんに冷蔵庫で保存され、ローションＩｇ当たり約１０μｇの ｌα。

２４（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ２を含有する。

実施例２０゜ ０．２＋ｎｇのｌα、２４　（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ！をＩｇのアーモ ンド油に溶解する。この溶液に４０ｇの鉱油と２０ｇの自己乳化みつろうを加え 、次に４０ｍ１の熱湯を加える。この混合液を十分に混合してクリームＩｇ当た り約２．０μｇのｌα、２４　（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ、を含有する化 粧用クリームを製造する。

実施例２Ｉ： 実施例１Ｂに従って調製した化粧用クリームに１００ｍｇのアデノシンを加える 。

このクリームは十分に混合され、アデノシン約０．１重量％を含有する。

実施例２２： １００μｇのｌα、２４　（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ、を３０ｇのアーモ ンド油に溶解することにより、軟膏を調製する。このように製造した溶液に温め てちょうど液化した７０ｇの白色流動パラフィンを加える。軟膏を十分に混合し 、冷却する。このように製造した軟膏は、軟膏１μ当たり約１．０μｇの１α、 ２４−ジヒドロキシビタミンＤ２を含有する。

実施例２３： 実施例１８の化粧用軟膏に最少量の植物油に溶解した２　００　Ｕ／ｇのビタミ ン八を加え、十分に混合する。

実施例２４： ３００μｇのｌα、２４−ジヒドロキシビタミンＤ２を１００ｇの乾燥プロピレ ングリコールに溶解することにより、化粧用ローションを調製する。ローション は褐色びんに冷蔵庫で保存され、ローションＩｇ当たり約３．０μｇのｌα、２ ４（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ２を含有する。

実施例２５：　皮膚試験 ｌα、２４　（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤｔを含有する組成物を、皮膚炎（ 接触及び異所性）の局所治療における組成物の治療効果について評価する。評価 された組成物は、ワセリン−アーモンド油基剤に軟膏１μ当たりＩＯμｇのｌα 。

２４−ジヒドロキシビタミンＤ２を含有する軟膏である。対照組成物は、活性薬 剤１α、２４　（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ２を含有しない以外同一である 。患者は外来て治療される。１日２回製剤を使用するように指示される。

軟膏は、１つの発疹あるいは患部にできるだけ広く塗布される。治療を始める前 に、軟膏とその容器の重量をはかり、治療の終わりに再び重量をはかるために未 使用の内容物が戻される。

治療される発疹の面積を算出し、記録し、必要とされる発疹と適切な“対照”発 疹との写真をとる。後者は、治療される発疹の近傍あるいは対称的対側における サイズ及び進行段階が同じ発疹が好ましい。適切な写真手順の詳細は、次の発疹 の写真をとる際に再現される（距離、口径、角度、背景等）。軟膏を１日２回塗 布し、好ましくはむきだしにしておく。′対照”発疹は治療されないが、これが 可能でない場合にはそれに用いた治療が記される。

紅斑、落屑及び肥大の評価は、１週間毎に医師によって行われ、発疹の程度が０ 〜３に評点される。最後の評価は、通常、４〜６週間の治療の終わりに行われる 。１α、２４　（Ｓ）−（ＯＨ）２Ｄ２て治療した発疹は、対照の発疹より評点 が低い。高カルシウム血症の出現もほとんど見られなかった。

実施例２６二　表皮細胞の分化及び増殖試験Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ、　Ｇｒｅｅｎ 　（Ｃｅｌｌ、　ｖｏｌ、　６．　ｐ、　３３１　（１９７５））に最初に記載 された系の既知の変法に従って、ヒトケラチン細胞を培養する。エタノールに溶 解した１α。

２４（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ２を細胞に加え、０．０５〜５μｇ／ｍｌ の種々の濃度を得るが、エタノール濃度は０．５％Ｖ／Ｖを超えない。対照培養 物は、エタノールで０．５％Ｖ／Ｖの最終濃度に補足される。

培養物中表皮細胞の分化と増殖は、下記によって試験される：１、不溶性膜を定 量する； ２、円板に付着した細胞の細胞密度を定量する：３、トランスグルタミナーゼ活 性をモニターする；又は４、ＤＮＡ合成を３Ｈ−チミジンの取込みによりモニタ ーする。

１α、２４　（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ２とインキコベートした培養物は 、対照培養物より不溶性膜が多く、付着した細胞が少なく、トランスグルタミナ ーゼ活性が高く、ＤＮＡ合成が低い。

ここては本発明を具体的に説明及び例示してきたが、当業者は記載してきたもの に変更、追加及び省略のような種々の態様が行われることを理解するであろう。

従って、これらの態様も本発明によって包含され、本発明の範囲は前記特許請求 の範囲に合法的に一致することができる最も広い解釈によってのみ限定されるも のである。

実施例２７：　ＨＬ−６０細胞分化アッセイにおける１α、２４　（Ｓ）−（Ｏ Ｈ）。

Ｄ２の活性 用量一応答実験は、ＤｅＬｕｃａ、　Ｏｓｔｒｏｍ　（ＤｅＬｕｃａ、　Ｈ，Ｆ 、、　Ｏｓｔｒｏｍ、　Ｖ、　Ｋ、、　Ｐｒｏｇ。

Ｃｌ１ｎ、　Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｓ、、　ｖｏｌ、　２５９．　ｐｐ、　４１−５ ５　（１９８８））に記載されているＨＬ−６０細胞分化アッセイにおいて１α 、２４　（Ｓ）−（ＯＨ）２Ｄｔを用いて行なわれる。

本実験においては、ｌα、２５　（ＯＨ）２Ｄ＋を正の対照として用い、適切な 溶媒を負の対照として用いる。次の可変量：非特異的酸エステラーゼ活性、ニト ロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）還元及びチミジン取込みが評価される。結果 は、ｌα、２４　（Ｓ）−（ＯＨ）２Ｄ２がＨＬ−６０全骨髄球の単球への分化 を促進するに当たり強力な活性を有することを示している。

実施例２８．　ヒトがん細胞株における１α、２４　（Ｓ）−（ＯＨ）２Ｄ２の 抗増殖活性 用量一応答実験は、１組のヒトがん細胞株において１α、２４　（Ｓ）　（ＯＨ ）ｇＤ２を用いて行われる。これらの細胞株としては、５ｈｉｅｈ、　１．　ｌ １１等Ｃｈｅａ　Ｂｉｏｌ。

Ｉｎｔｅｒａｃｔ、、　ｖａｔ、　８１．　ｐｐ、　３５−５５　（＋９８２） に記載されている次のもの：ＢＣＡ−１又はＺＲ−７５−１（乳がん）及びＣ０ Ｌ−１（結腸がん）が挙げられるが、これらに限定されない。本実験においては 、適切な溶媒を負の対照として用いる。

結果は、チミジン取込みの阻害によって判定されるように、ｌα、２４　（Ｓ） −（ＯＨ）２Ｄ　２が強力な（及び可逆的な）抗増殖活性を有することを示して いる。

フロントページの続き （７２）発明者　ジョーンズ　グレンヴイルカナダ　オンタリオ　ケイ７エム　 ６エヌ７　キックストン　ウェストモアランドロード　１１２ （７２）発明者　コゼウスキー　ニコラス　ジェイアメリカ合衆国　ケンタラキ ー州　４０５１３レキシントン　フォート　ハーロッズ ドライブ　２１０Ｓ （７２）発明者　ナットシン　ジョイス　シーアメリカ合衆国　ウィスコンシン 州 ５３７０５　マディラン　ノース　プロスペクアメリカ合衆国　イリノイ州　６ ０３０２　オーク　パーク　イアター　ストリート （７２）発明者　ラインハード　ティモジ−エイアメリカ合衆国　アイオワ州　 ５００１０　エイムズ　ノースウッド　ドライヴ　２６１４（７２）発明者　ペ ンマスタ　ラージュアメリカ合衆国　イリノイ州　６０１２６　エルムハースト 　ウェスト　ストリート　チャールズ４９３ （７２）発明者　ストラッグネル　スティーヴンアメリカ合衆国　ウィスコンシ ン州 ５３５６２　ミドルトン　センチユリ−アベニュー　５３２５　アパートメント 　３（７２）発明者　グオ　ターアン アメリカ合衆国　イリノイ州　６０４４０　ポーリングブルーフ　グリーン　マ ウンテンドライヴ　２２１ （７２）発明者　シンガル　サンジェイ　ケイアメリカ合衆国　イリノイ州　６ ００５３　モートン　グローブ　ノース　グロスポイント　ロード　８０１０ （７２）発明者　ザオ　レイ アメリカ合衆国　イリノイ州　６０５４０　ネイパーヴイル　アープ　レーン　 １３１９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．１α．２４（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ２。 ２．ビタミンＤ欠乏による疾患の予防又は治療方法であって、１α，２４（Ｓ） −ジヒドロキシビタミンＤ２の有効量を投与することを含む方法。 ３．皮膚疾患の治療方法であって、１α．２４（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ ２の有効量を局所投与することを含む方法。 ４．ビタミンＤ欠乏症の予防又は治療用医薬組成物であって、生理的に許容しう る賦形剤及び１α，２４（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ２の有効量を含む医薬 組成物。 ５．医薬組成物であって、１α，２４（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ２の減骨 性疾患に罹っている又は罹りやすいヒトにおける骨量又は骨ミネラル含量の減少 を予防又は治療するのに有効な量及び生理的に許容しうる賦形剤を含む医薬組成 物。 ６．医薬組成物であって、１α，２４（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ２の腎性 骨ジストロフィに罹っているヒトにおける橈骨及び脊椎骨の骨濃度を安定化する のに有効な量及び生理的に許容しうる賦形剤を含む医薬組成物。 ７．骨量又は骨ミネラル含量の減少に罹っている又は罹りやすいヒトにおいて骨 量又は骨ミネラル含量の減少を予防又は治療する方法であって、高カルシウム血 症又は高カルシウム尿症を引き起こさずに骨量又は骨ミネラル含量の減少を予防 するのに十分な量の１α，２４（Ｓ）−リヒドロキシピタミンＤ２を該ヒトに投 与することを含む方法。 ８．腎性骨ジストロフィに罹っているヒトにおいて骨量を安定化又は増加させる 方法であって、高カルシウム血症又は高カルシウム尿症を引き起こさずに骨量を 安定化又は増加させるのに十分な量の１α，２４（Ｓ）−ジヒドロキシビタミン Ｄ２を該ヒトに投与することを含む方法。 ９．皮膚疾患の局所治療に有用な組成物であって、局所適用に適した担体及び１ α，２４（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ２を含む組成物。 １０．１α，２４（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ２の量が組成物１ｇ当たり０ ．０１〜５０μｇである請求項９記載の組成物。 １１．上皮形成誘導剤、クロマノール、β−アゴニスト、抗炎症剤及び角膜形成 剤からなる群からの薬剤を更に含む請求項９記載の組成物。 １２．１α，２４（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ２の調製方法であって、（ａ ）エルゴステロールをアセチル化してその３β−アセテートを生成し；（ｂ）ト リアゾリンジオンと反応させ、オゾン化して２２−オキソ−５α，８α−（４− フェニル−３，５−ジオキソ−１，２，４−トリアゾリジン−１，２−ジイル） ２３，２４−ジノル−６−コレン−３β−イルアセテートを生成し；（ｃ）３− メチルブタン−２−オンを２２−オキソ−５α，８α−（４−フェニル−３，５ −ジオキソ−１，２，４−トリアゾリジン−１，２−ジイル）２３，２４−ジノ ル−６−コレン−３β−イルアセテートに加えて（２２Ｅ）５α，８α−（４− フェニル−３，５−ジオキソ−１，２，４−トリアゾリジン−１，２−ジイル） コレスタ−６，２２−ジエン−２４−オン−３β−イルアセテートを生成し；（ ｄ）メチルマグネシウムブロミドを（２２Ｅ）５α，８α−（４−フェニル−３ ，５−ジオキソ−１，２，４−トリアゾリジン−１，２−ジイル）コレスタ−６ ，２２−ジエン−２４−オン−３β−イルアセテートに加えて（２２Ｅ）−５α ，８α−（４−フェニル−３，５−ジオキソ−１，２，４−トリアゾリジン−１ ，２−ジイル）−６，２２−エルゴスタジエン−３β，２４−ジオールを生成し ；（ｅ）（２２Ｅ）−５α，８α−（４−フェニル−３，５−ジオキソ−１，２ ，４−トリアゾリジン−１，２−ジイル）−６，２２−エルゴスタジエン−３β ，２４−ジオールを還元して２４−ヒドロキシエルゴステロールを生成し；（ｇ ）２４−ヒドロキシエルゴステロールに照射して２４−ヒドロキシビタミンＤ２ を生成し； （ｈ）２４−ヒドロキシビクミンＤ２を乾燥ピリジンの存在下にトシル化して２ ４−ヒドロキシビタミンＤ２３β−トシレートを生成し；（ｉ）２４−ヒドロキ シビタミンＤ２トシレートを加溶媒分解して２４−ヒドロキシ−３，５シクロビ タミンＤ２を生成し；（ｊ）２４−ヒドロキシ−３，５シクロビタミンＤ２を二 酸化セレンでアリル酸化して１α，２４−ジヒドロキシシクロビタミンＤ２を生 成し；（ｋ）１α，２４−ジヒドロキシ３，５シクロビタミンＤ２をジメチルス ルホキシドと有機酸との混合液で加水分解して５，６シス１α，２４−ジヒドロ キシ及び５，６トランス１α，２４−ジヒドロキシビタミンＤ２の混合物を生成 し、５，６トランス１α−ヒドロキシビタミンＤ２のティールスーアルクー付加 物を生成し、精製して１α，２４（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ２を得ること を含む方法。 １３．該精製工程（ｋ）が１α，２４−ジヒドロキシビタミンＤ２をクロマトグ ラフィー分離して１α，２４（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ２を得ることを含 む請求項１２記載の方法。 １４．１α，２４（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ２の調製方法であって、（ａ ）２４−ヒドロキシビタミンＤ２をトシル化して２４−ヒドロキシビタミンＤ２ トシレートを生成し； （ｂ）２４−ヒドロキシビタミンＤ２トシレートをメタノール溶媒分解して２４ −ヒドロキシ３，５シクロビタミンＤ２を生成し；（ｃ）２４−ヒドロキシ３， ５シクロビタミンＤ２を酸化して１α，２４−ジヒドロキシ−３，５−シクロビ タミンＤ２を生成し；（ｄ）１α，２４−ジヒドロキシ−３，５シクロビタミン Ｄ２を連続的に加水分解、ティールスーアルダー反応及び精製して１α，２４（ Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ２を生成することを含む方法。 １５．２２−オキソ−５α，８α−（４−フェニル−３，５−ジオキソ−１，２ ，４−トリアゾリジン−１，２−ジイル）２３，２４−ジノル−６−コレン−３ β−イルアセテートの製造方法であって、２２−オキソ−５α，８α−（４−フ ェニル−３，５−ジオキソ−１，２，４−トリアゾリジン−１，２−ジイル）２ ３，２４−ジノル−６−コレン−３β−イルアセテートを３−メチルブタン−２ −オンとブチルリチウム及び乾燥テトラヒドロフランの存在下に反応させること を含む方法。 １６．（２２Ｅ）−５α，８α−（４−フェニル−３，５−ジオキソ−１，２， ４−トリアゾリジン−１，２−ジイル）−６，２２−エルゴスタジエン−３β・ ２４−ジオールの製造方法であって、２２−キソ−５α，８α−（４−フェニル −３，５−ジオキソ−１，２，４−トリアゾリジン−１，２−ジイル）２３，２ ４−ジノル−６−コレン−３β−イルアセテートをグリニャール試薬と反応させ ることを含む方法。 １７．２４−ヒドロキシエルゴステロールの製造方法であって、（２２Ｅ）−５ α，８α−（４−フェニル−３，５−ジオキソ−１，２，４−トリアゾリジン− １，２−ジイル）−６，２２−エルゴスタジエン−３β，２４−ジオールを水素 化アルミニウムリチウムと乾燥テトラヒドロフランの存在下に反応させることを 含む方法。 １８．２４−ヒドロキシビタミンＤ２トシレートの製造方法であって、２４−ヒ ドロキシビタミンＤ２をトルエンスルホニルクロライドと乾燥ピリジンの存在下 に反応させることを含む方法。 １９．６−メトキシ−２４−ヒドロキシ−３，５−シクロビタミ．ンＤ２の製造 方法であって、２４−ヒドロキシビタミンＤ２トシレートをメタノール中で加溶 媒分解することを含む方法。 ２０．６−メトキシ−１α，２４−ジヒドロキシ−３，５−シクロビタミンＤ２ の製造方法であって、６−メトキシ−２４−ヒドロキシ−３，５−シクロビタミ ンＤ２を二酸化セレンでアリル酸化することを含む方法。 ２１．ビタミンＤ欠乏による減骨性疾患の治療方法であって、（ａ）エルゴステ ロールをかかる条件及び十分な量で還元して２４−ヒドロキシエルゴステロール を製造し； （ｂ）その２４−ヒドロキシエルゴステロールに照射して２４−ヒドロキシビタ ミンＤ２を製造し； （ｃ）そのビタミンＤ２をかかる条件及び十分な量でヒドロキシル化して１α， ２４（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ２を製造し；（ｄ）その１α，２４（Ｓ） −ジヒドロキシビタミンＤ２を精製し；（ｅ）１α，２４（Ｓ）−ジヒドロキシ ビタミンＤ２の骨量又は骨ミネラル含量の減少を予防又は逆転するのに有効な量 を薬学的に許容しうる賦形剤との混合物として減骨性疾患に罹っている哺乳動物 に投与することを含む方法。 ２２．（２２Ｅ）５α，８α−（４−フェニル−３，５−ジオキソ−１，２，４ −トリアゾリジン−１，２−ジイル）コレスタ−６，２２−ジエン−２４−オン −３β−イルァセテート。 ２３．（２２Ｅ）−５α．８α−（４−フェニル−３，５−ジオキソ−１，２， ４−トリアゾリジン−１，２−ジイル）−６，２２−エルゴスタジエン−３β， ２４−ジオール。 ２４．（２２Ｅ）−５，７，２２−エルゴスタトリエン−３β，２４−ジオール 。 ２５．２４−ヒドロキシエルゴステロール。 ２６．２４−ヒドロキシビタミンＤ２トシレート。 ２７．６−メトキシ−２４−ヒドロキシ−３，５−シクロビタミンＤ２。 ２８．２４−ヒドロキシビタミンＤ２の調製方法であって、（ａ）エルゴステロ ルをアセチル化してその３β−アセテートを生成し；（ｂ）トリアゾリンジオン と反応させ、オゾン化して２２−オキソ−５α，８α−（４−フェニル−３，５ −ジオキソ−１，２，４−トリアゾリジン−１，２−ジイル）２３，２４−ジノ ル−６−コレン−３β−イルアセテートを生成し；（ｃ）３−メチルブタン−２ −オンを２２−オキソ−５α，８α−（４−フェニル−３，５−ジオキソ−１， ２，４−トリアゾリジン−１，２−ジイル）２３，２４−ジノル−６−コレン− ３β−イルアセテートに加えて（２２Ｅ）５α，８α−（４−フェニル−３，５ −ジオキソ−１，２，４−トリアゾリジン−１，２−ジイル）コレスタ−６，２ ２−ジエン−２４−オン−３β−イルアセテートを生成し；（ｄ）メチルマグネ シウムブロミドを（２２Ｅ）５α，８α−（４−フェニル−３，５−ジオキソ− １，２，４−トリアゾリジン−１，２−ジイル）コレスタ−６，２２−ジエン− ２４−オン−３β−イルアセテートに加えて（２２Ｅ）−５α，８α−（４−フ ェニル−３，５−ジオキソ−１，２，４−トリアゾリジン−１，２−ジイル）− ６，２２−エルゴスタジエン−３β，２４−ジオールを生成し；（ｅ）（２２Ｅ ）−５α，８α−（４−フェニル−３，５−ジオキソ−１，２，４−トリアゾリ ジン−１，２−ジイル）−６，２２−エルゴスタジエン−３β，２４−ジオール を還元して２４−ヒドロキシエルゴステロールを生成し；（ｇ）２４−ヒドロキ シエルゴステロールに照射して２４−ヒドロキシビタミンＤ２を生成することを 含む方法２９．１α，２４（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ２を含む哺乳動物用 飼料であって、該飼料の哺乳動物による標準的消費によって約０．０１〜約１． ０μｇ／ｋｇ／日の１α，２４（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ２が与えられる 飼料。 ３０．乳がんの治療方法であって、１α，２４（Ｓ）−ジヒドロキシビタミンＤ ２の有効量を投与することを含む方法。 ３１．結腸がんの治療方法であって、１α，２４（Ｓ）−ジヒドロキシビタミン Ｄ２の有効量を投与することを含む方法。 ３２．２４（Ｓ）−ヒドロキシビタミンＤ２及び２４（Ｒ）−ヒドロキシビタミ ンＤ２のラセミ混合物。 ３３．１α，２４（Ｓ）−ヒドロキシビタミンＤ２及び１α，２４（Ｒ）−ヒド ロキシビタミンＤ２のラセミ混合物。