JPH0743388B2 - 血液凝固に伴うゲル化反応の測定法，測定装置及び測定用素子 - Google Patents
血液凝固に伴うゲル化反応の測定法，測定装置及び測定用素子Info
- Publication number
- JPH0743388B2 JPH0743388B2 JP13902990A JP13902990A JPH0743388B2 JP H0743388 B2 JPH0743388 B2 JP H0743388B2 JP 13902990 A JP13902990 A JP 13902990A JP 13902990 A JP13902990 A JP 13902990A JP H0743388 B2 JPH0743388 B2 JP H0743388B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- measuring
- blood coagulation
- gelation reaction
- reaction associated
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は生化学の分野における血液凝固線溶検査での血
液凝固に伴うゲル化反応の測定法，測定装置及び測定用
素子に関し、詳しくは血液凝固に伴うゲル化反応の凝固
系、該凝固系に関与する反応物質，触媒，基質，酵素な
どの凝固因子の存在量、濃度又は活性量を測定する測定
法，測定装置及び測定用素子に関する。
液凝固に伴うゲル化反応の測定法，測定装置及び測定用
素子に関し、詳しくは血液凝固に伴うゲル化反応の凝固
系、該凝固系に関与する反応物質，触媒，基質，酵素な
どの凝固因子の存在量、濃度又は活性量を測定する測定
法，測定装置及び測定用素子に関する。
粘度変化を利用してゲル化反応を測定する方法、特に血
液凝固系の分析におけるゲル化反応の測定には、試料の
濁度を光学的に測定する方法，剛体球を入れ回転させ粘
度変化を測定する方法，機械的振動を与えゲル化による
粘度変化を検知する方法などがある。さらに圧電振動子
を用いる系では圧電振動子の一種である水晶振動子が液
体の粘度の変化により、発振周波数が変わることが発表
されている（Anal.Chim.Acta,175,99（1985））。さら
にエンドトキシンによるかぶと蟹血球抽出物のゲル化反
応を水晶振動子等価回路内のインピーダンス変化として
測定する方法（Anal.Chim.Acta.,215,（1988）91−9
8）、フイブリノージエン、トロンビン系のゲル化反応
を感度増幅剤としてアルミナ粒子を添加し、沈降させ素
子表面に堆積する質量変化を発振周波数の変化として測
定する方法（Anal.Chim.Acta,217,（1989）321−326）
が発表されている。
液凝固系の分析におけるゲル化反応の測定には、試料の
濁度を光学的に測定する方法，剛体球を入れ回転させ粘
度変化を測定する方法，機械的振動を与えゲル化による
粘度変化を検知する方法などがある。さらに圧電振動子
を用いる系では圧電振動子の一種である水晶振動子が液
体の粘度の変化により、発振周波数が変わることが発表
されている（Anal.Chim.Acta,175,99（1985））。さら
にエンドトキシンによるかぶと蟹血球抽出物のゲル化反
応を水晶振動子等価回路内のインピーダンス変化として
測定する方法（Anal.Chim.Acta.,215,（1988）91−9
8）、フイブリノージエン、トロンビン系のゲル化反応
を感度増幅剤としてアルミナ粒子を添加し、沈降させ素
子表面に堆積する質量変化を発振周波数の変化として測
定する方法（Anal.Chim.Acta,217,（1989）321−326）
が発表されている。
試料の濁度を光学的に測定する方法は、光を使うため血
液を用いた場合には使用できず、回転や機械的振動を与
えて測定する方法は、その振動がゲル化反応に影響を与
え、うまく測定できない。その点水晶振動子は不透明溶
液中でも測定可能であり、また大きな振動エネルギーを
水溶液に与えず、ゲル化反応に影響を与えないという特
徴を有する。しかし水晶振動子を用いて発振周波数の変
化を測定する場合は、増幅剤としてアルミナ粉を添加し
均一に分散させなければならず、煩雑であり、それでも
応答は最大で400Hz程度である。そのため再現性のある
測定結果を得るのが困難であつた。この原因の一つには
水晶振動子の表面の金属電極に対し、トロンビン溶液中
の牛血清アルブミン（BSA）などのタンパク質が付着し
やすく、それらの付着により水晶振動子表面が覆われゲ
ル化反応の測定感度が落ち、付着状態の変化により測定
値のばらつきも大きくなるためである。これは実際の血
液凝固線溶反応を測定する場合でも同様で血液中のタン
パク質等の血液構成成分が水晶振動子表面に付着し、測
定感度を落とし、測定値のばらつきを大きくしている。
さらにこのことは水晶振動子を用いて共振周波数を測定
する場合でも同様である。
液を用いた場合には使用できず、回転や機械的振動を与
えて測定する方法は、その振動がゲル化反応に影響を与
え、うまく測定できない。その点水晶振動子は不透明溶
液中でも測定可能であり、また大きな振動エネルギーを
水溶液に与えず、ゲル化反応に影響を与えないという特
徴を有する。しかし水晶振動子を用いて発振周波数の変
化を測定する場合は、増幅剤としてアルミナ粉を添加し
均一に分散させなければならず、煩雑であり、それでも
応答は最大で400Hz程度である。そのため再現性のある
測定結果を得るのが困難であつた。この原因の一つには
水晶振動子の表面の金属電極に対し、トロンビン溶液中
の牛血清アルブミン（BSA）などのタンパク質が付着し
やすく、それらの付着により水晶振動子表面が覆われゲ
ル化反応の測定感度が落ち、付着状態の変化により測定
値のばらつきも大きくなるためである。これは実際の血
液凝固線溶反応を測定する場合でも同様で血液中のタン
パク質等の血液構成成分が水晶振動子表面に付着し、測
定感度を落とし、測定値のばらつきを大きくしている。
さらにこのことは水晶振動子を用いて共振周波数を測定
する場合でも同様である。
本発明は、これらの問題点を解決するものであり、ゲル
化反応時に網目構造を形成する物質を前処理により圧電
振動子表面に付着させておくことでその他の物質の付着
を抑制し、網目構造の端部が圧電振動子表面から形成さ
れる事により感度をあげ、増幅剤を用いずに高感度で再
現性の高い血液凝固に伴うゲル化反応の測定法，測定装
置及び測定用素子を提供するものである。
化反応時に網目構造を形成する物質を前処理により圧電
振動子表面に付着させておくことでその他の物質の付着
を抑制し、網目構造の端部が圧電振動子表面から形成さ
れる事により感度をあげ、増幅剤を用いずに高感度で再
現性の高い血液凝固に伴うゲル化反応の測定法，測定装
置及び測定用素子を提供するものである。
本発明は、血液凝固に伴うゲル化反応の際に網目構造を
形成する物質を予め付着させた圧電振動子を測定用素子
とすることを特徴とする血液凝固に伴うゲル化反応の測
定法、該測定用素子を有する測定装置及び該測定用素子
に関する。
形成する物質を予め付着させた圧電振動子を測定用素子
とすることを特徴とする血液凝固に伴うゲル化反応の測
定法、該測定用素子を有する測定装置及び該測定用素子
に関する。
圧電振動子に予め付着させるゲル化反応の際に、網目構
造を形成する物質とは、血液凝固に関わる物質であり、
フイブリン、その派生物，トロンビンの作用を受けてフ
イブリンに分解されるフイブリノージエンおよびフイブ
リン中間体が好ましい。その付着方法は特に制限はない
がこれらの水溶液を作製し、あらかじめ圧電振動子がセ
ツトされている測定用セルにその水溶液を満たし物理吸
着により圧電振動子表面にこれらを付着させる方法が簡
便であり好ましい。この溶液濃度は特に制限はないが、
付着時間を短時間にするためには、1mg/ml以上が好まし
く、この場合、30分で付着は終了する。こうして得られ
た圧電振動子は、本発明の測定用素子とされる。
造を形成する物質とは、血液凝固に関わる物質であり、
フイブリン、その派生物，トロンビンの作用を受けてフ
イブリンに分解されるフイブリノージエンおよびフイブ
リン中間体が好ましい。その付着方法は特に制限はない
がこれらの水溶液を作製し、あらかじめ圧電振動子がセ
ツトされている測定用セルにその水溶液を満たし物理吸
着により圧電振動子表面にこれらを付着させる方法が簡
便であり好ましい。この溶液濃度は特に制限はないが、
付着時間を短時間にするためには、1mg/ml以上が好まし
く、この場合、30分で付着は終了する。こうして得られ
た圧電振動子は、本発明の測定用素子とされる。
本発明の測定方法においては、前記のような圧電振動子
を測定用素子として用い、血液凝固に伴うゲル化反応の
凝固系又は該凝固系に関与する因子、すなわち、触媒，
基質，酵素，酵素前駆体，阻害物質などの存在量，濃度
や活性量を測定する。実際には反応に伴う圧電振動子の
発振周波数変化を周波数カウンタを用いて測定する方
法、インピーダンスアナライザを用いて圧電振動子のイ
ンピーダンスを測定する共振法等を行なうことができる
が、装置が簡便で低コストであること等から、発振周波
数変化を測定する方法が好ましい。
を測定用素子として用い、血液凝固に伴うゲル化反応の
凝固系又は該凝固系に関与する因子、すなわち、触媒，
基質，酵素，酵素前駆体，阻害物質などの存在量，濃度
や活性量を測定する。実際には反応に伴う圧電振動子の
発振周波数変化を周波数カウンタを用いて測定する方
法、インピーダンスアナライザを用いて圧電振動子のイ
ンピーダンスを測定する共振法等を行なうことができる
が、装置が簡便で低コストであること等から、発振周波
数変化を測定する方法が好ましい。
存在量，濃度や活性量を測定する血液凝固に伴うゲル化
反応の凝固系、該凝固系に関与する因子としては例えば
次のものが挙げられる。
反応の凝固系、該凝固系に関与する因子としては例えば
次のものが挙げられる。
凝固系：部分トロンビン時間，活性化トロンボプラスチ
ン時間，トロンビン時間（ヘパプラスチンテスト）な
ど。
ン時間，トロンビン時間（ヘパプラスチンテスト）な
ど。
因子：フレツチヤー因子（カリクレイン），フイツツゲ
ラルド因子（HMW−キニノゲン），組織因子，スロボプ
ラスチン，第VI因子，第XII因子（ハーゲマン因子），
第XII a因子，第XI因子（クリスマス因子），第XI a因
子，第XIII因子，第XIII a因子，第IX因子，第IX a因
子，第Ｘ因子（スチユアート因子），第X a因子，第X
α因子，第X β因子、第X αβ因子、第VIII因子，第VI
II a因子，第VIII c因子，第Ｖ因子，第V a因子，第VII
因子，第VII a因子,des−Gla−第II因子,des−Gla−第V
II因子,des−Gla−第IX因子,des−Gla−第Ｘ因子，第II
因子，第II a因子（α−トロンビン），β−トロンビ
ン，第Ｉ因子（フイブリノージエン）,FDP−X,FDP−Y,A
T−III,C1INH,α2M,α2AT,α2PI,TAT,PF4,Protein C,活
性化Protein C,Protein S,活性化Protein S,Protein Z,
活性化Protein Z,Heparin,Heparin SCS,Ans,XC,Dmsな
ど。
ラルド因子（HMW−キニノゲン），組織因子，スロボプ
ラスチン，第VI因子，第XII因子（ハーゲマン因子），
第XII a因子，第XI因子（クリスマス因子），第XI a因
子，第XIII因子，第XIII a因子，第IX因子，第IX a因
子，第Ｘ因子（スチユアート因子），第X a因子，第X
α因子，第X β因子、第X αβ因子、第VIII因子，第VI
II a因子，第VIII c因子，第Ｖ因子，第V a因子，第VII
因子，第VII a因子,des−Gla−第II因子,des−Gla−第V
II因子,des−Gla−第IX因子,des−Gla−第Ｘ因子，第II
因子，第II a因子（α−トロンビン），β−トロンビ
ン，第Ｉ因子（フイブリノージエン）,FDP−X,FDP−Y,A
T−III,C1INH,α2M,α2AT,α2PI,TAT,PF4,Protein C,活
性化Protein C,Protein S,活性化Protein S,Protein Z,
活性化Protein Z,Heparin,Heparin SCS,Ans,XC,Dmsな
ど。
凝固系に関与する因子の測定は、測定しようとする因子
以外の他の因子の存在量を一定にしておき、測定しよう
とする因子の存在量，濃度または活性量だけを変化さ
せ、周波数変化を測定し、予め検量線を作つておくこと
が好ましい。
以外の他の因子の存在量を一定にしておき、測定しよう
とする因子の存在量，濃度または活性量だけを変化さ
せ、周波数変化を測定し、予め検量線を作つておくこと
が好ましい。
測定される周波数変化のデータ解析手段としては、公知
の様々の解析法が採用できる。例えば、反応前後での周
波数の差を周波数変化の曲線の傾き（Hz/秒,Hz/分
等），一定時間経過後の周波数の変化量，周波数変化の
曲線がある傾きに達する迄の時間（変曲点），一定の周
波数変化を得るまでに要する時間，周波数変化の曲線の
微分値，該微分値の一定値を得るまでに要した時間等を
求めることにより測定することができる。
の様々の解析法が採用できる。例えば、反応前後での周
波数の差を周波数変化の曲線の傾き（Hz/秒,Hz/分
等），一定時間経過後の周波数の変化量，周波数変化の
曲線がある傾きに達する迄の時間（変曲点），一定の周
波数変化を得るまでに要する時間，周波数変化の曲線の
微分値，該微分値の一定値を得るまでに要した時間等を
求めることにより測定することができる。
一例として反応前後での周波数の差を求める方法につい
て説明する。
て説明する。
まず、存在量，濃度または活性量を知りたい凝固系に関
わる因子を含有し、かつ該因子を活性化させる他の因子
を欠如させた、血液凝固に関わる溶液を前記圧電振動子
を設置した測定用セル内に圧電振動子が浸漬するまで入
れ、発振させ安定したところで、測定したい凝固系に関
わる因子を活性化させる他の因子を含む、血液凝固を開
始させる溶液を一定量添加し反応を生じさせ、安定化し
たときの発振周波数を測定するのが好ましい。そして両
者の発振周波数の差を算出し、発振周波数変化とする。
わる因子を含有し、かつ該因子を活性化させる他の因子
を欠如させた、血液凝固に関わる溶液を前記圧電振動子
を設置した測定用セル内に圧電振動子が浸漬するまで入
れ、発振させ安定したところで、測定したい凝固系に関
わる因子を活性化させる他の因子を含む、血液凝固を開
始させる溶液を一定量添加し反応を生じさせ、安定化し
たときの発振周波数を測定するのが好ましい。そして両
者の発振周波数の差を算出し、発振周波数変化とする。
本発明において使用する圧電振動子の種類は特に制限は
ないが、温度特性に優れた発振をするATカツトされた水
晶振動子を用いるのが好ましい。また、測定溶液の導電
率が高く、圧電振動子が安定に発振しない場合は圧電振
動子電極の片面だけを測定溶液に接するようにするのが
好ましい。その方法に特に制限はないが、圧電振動子と
同じ形状の板とシリコン樹脂で片面を封止した素子を用
いると、セル内での圧電振動子の配置の方向にまつたく
制限がなくなるので好ましい。
ないが、温度特性に優れた発振をするATカツトされた水
晶振動子を用いるのが好ましい。また、測定溶液の導電
率が高く、圧電振動子が安定に発振しない場合は圧電振
動子電極の片面だけを測定溶液に接するようにするのが
好ましい。その方法に特に制限はないが、圧電振動子と
同じ形状の板とシリコン樹脂で片面を封止した素子を用
いると、セル内での圧電振動子の配置の方向にまつたく
制限がなくなるので好ましい。
第１図は該圧電振動子（測定用素子）の一例を示す。第
１図の（ａ）は正面図、（ｂ）は（ａ）のａ−ａ′線断
面図である。水晶板１の両面には銀電極２が設けられリ
ード線６が支持台５を経て設けられている。水晶板１の
片面は、水晶薄板３がシリコン樹脂４によって接着さ
れ、封止されている。また、リード線の測定用セル内に
浸漬される部分もシリコン樹脂４によって封止されてい
る。
１図の（ａ）は正面図、（ｂ）は（ａ）のａ−ａ′線断
面図である。水晶板１の両面には銀電極２が設けられリ
ード線６が支持台５を経て設けられている。水晶板１の
片面は、水晶薄板３がシリコン樹脂４によって接着さ
れ、封止されている。また、リード線の測定用セル内に
浸漬される部分もシリコン樹脂４によって封止されてい
る。
以上のような本発明の測定方法に用いる装置としては、
第２図に示すように、圧電振動子（測定用素子），発振
回路，周波数カウンタ及びデータ演算装置を備えたもの
が好ましい。第２図において、圧電振動子（第２図では
水晶振動子８）は、測定用セル７内に設置される。そし
て該圧電振動子は、発振回路に接続され、発振回路は、
周波数カウンターへ、該カウンターは、データ演算装置
としてのマイクロコンピユータに接続される。
第２図に示すように、圧電振動子（測定用素子），発振
回路，周波数カウンタ及びデータ演算装置を備えたもの
が好ましい。第２図において、圧電振動子（第２図では
水晶振動子８）は、測定用セル７内に設置される。そし
て該圧電振動子は、発振回路に接続され、発振回路は、
周波数カウンターへ、該カウンターは、データ演算装置
としてのマイクロコンピユータに接続される。
圧電振動子に電圧を印加すると、微小であるが圧電振動
子自体形状を変形することによつて機械的に振動する。
圧電振動子は発振条件を検討すると、水溶液中でも振動
し、液体と接触することによりせん断応力が生じ、液体
から抵抗を受け発振周波数が変化する。また水溶液中で
物質が圧電振動子表面に付着することにより、質量が変
化しそれにともなつて発振周波数が変化する。血液凝固
に伴うゲル化反応を測定する場合、前もつて網目構造を
形成する物質を圧電振動子表面に付着させておくと、血
液凝固に伴うゲル化反応が進行するとき、付着させてあ
る物質を網目構造の端部にして網目構造が成長し、圧電
振動子全体の質量が増加する。また圧電振動子表面から
水溶液側へ成長するため、振動の際水溶液から受けるせ
ん断応力は大きくなり周波数が大きく変化する。このと
き網目構造周辺の水溶液粘度が変化するとせん断応力は
さらに大きくなり、大きな発振周波数の変化となつて現
れる。一方、ゲル化反応に関わらない物質が圧電振動子
表面に付着した場合、質量の増加にともない若干周波数
は変化するが、その物質が水溶液からのせん断応力によ
る抵抗を緩和する役目をし、水溶液の状態の変化を直接
圧電振動子に伝達できなくなつてしまう。しかし本発明
のようにあらかじめ、ゲル化反応の際に網目構造を形成
する物質を圧電振動子表面に付着させておくと、他の物
質の付着を抑制する効果も有り、水溶液の状態の変化を
直接圧電振動子に伝達できる。従つて、高感度で再現性
よく血液凝固に伴うゲル化反応を測定できる。
子自体形状を変形することによつて機械的に振動する。
圧電振動子は発振条件を検討すると、水溶液中でも振動
し、液体と接触することによりせん断応力が生じ、液体
から抵抗を受け発振周波数が変化する。また水溶液中で
物質が圧電振動子表面に付着することにより、質量が変
化しそれにともなつて発振周波数が変化する。血液凝固
に伴うゲル化反応を測定する場合、前もつて網目構造を
形成する物質を圧電振動子表面に付着させておくと、血
液凝固に伴うゲル化反応が進行するとき、付着させてあ
る物質を網目構造の端部にして網目構造が成長し、圧電
振動子全体の質量が増加する。また圧電振動子表面から
水溶液側へ成長するため、振動の際水溶液から受けるせ
ん断応力は大きくなり周波数が大きく変化する。このと
き網目構造周辺の水溶液粘度が変化するとせん断応力は
さらに大きくなり、大きな発振周波数の変化となつて現
れる。一方、ゲル化反応に関わらない物質が圧電振動子
表面に付着した場合、質量の増加にともない若干周波数
は変化するが、その物質が水溶液からのせん断応力によ
る抵抗を緩和する役目をし、水溶液の状態の変化を直接
圧電振動子に伝達できなくなつてしまう。しかし本発明
のようにあらかじめ、ゲル化反応の際に網目構造を形成
する物質を圧電振動子表面に付着させておくと、他の物
質の付着を抑制する効果も有り、水溶液の状態の変化を
直接圧電振動子に伝達できる。従つて、高感度で再現性
よく血液凝固に伴うゲル化反応を測定できる。
以下に本発明の実施例を詳述するが、基本的な処理手順
等を前もつて説明する。
等を前もつて説明する。
測定装置 圧電振動子には水晶結晶より作製されたATカツト、9MHz
（八雲通信社製）の水晶振動子を用いている。第１図
（ａ）は、該水晶振動子の正面図であり、（ｂ）は
（ａ）のａ−ａ′線断面図である。図中水晶板１の両面
には銀電極２がとりつけられており、水晶振動子の片面
は同一形状の水晶薄板３でシリコン樹脂４（シリコンシ
ーラント45,信越化学工業（株）製）を用いて封止され
ている。さらにリード線６のうち指示台上部に出ている
部分は、同様のシリコン樹脂４で封止されている。
（八雲通信社製）の水晶振動子を用いている。第１図
（ａ）は、該水晶振動子の正面図であり、（ｂ）は
（ａ）のａ−ａ′線断面図である。図中水晶板１の両面
には銀電極２がとりつけられており、水晶振動子の片面
は同一形状の水晶薄板３でシリコン樹脂４（シリコンシ
ーラント45,信越化学工業（株）製）を用いて封止され
ている。さらにリード線６のうち指示台上部に出ている
部分は、同様のシリコン樹脂４で封止されている。
第２図に測定装置の概略図を示す。銀電極２から出たリ
ード線６は第２図で示すように支持台５を介して発振回
路に接続されている。そして第１図に示したように片面
封止された水晶振動子８は第２図のように測定用セル７
内にシリコン樹脂を用いてセツトされる。
ード線６は第２図で示すように支持台５を介して発振回
路に接続されている。そして第１図に示したように片面
封止された水晶振動子８は第２図のように測定用セル７
内にシリコン樹脂を用いてセツトされる。
水晶振動子表面へのフイブリノージエン，フイブリン等
の付着方法は以下の手順に従つた。まず、50mM,pH7.4の
トリス塩酸緩衝液を調製し、フイブリノージエン，フイ
ブリン等を所定量添加しフイブリノージエン，フイブリ
ン等の溶液を調製する。その溶液を水晶振動子８がセツ
トされた測定用セル７に水晶振動子８が全て浸漬される
程度入れ、室温で所定時間放温する。その後フイブリノ
ージエン，フイブリン等の溶液を抜き取り、洗浄として
トリス塩酸緩衝液を添加,1分間放置，抜き取る作業を３
回行い測定用素子として用いる。
の付着方法は以下の手順に従つた。まず、50mM,pH7.4の
トリス塩酸緩衝液を調製し、フイブリノージエン，フイ
ブリン等を所定量添加しフイブリノージエン，フイブリ
ン等の溶液を調製する。その溶液を水晶振動子８がセツ
トされた測定用セル７に水晶振動子８が全て浸漬される
程度入れ、室温で所定時間放温する。その後フイブリノ
ージエン，フイブリン等の溶液を抜き取り、洗浄として
トリス塩酸緩衝液を添加,1分間放置，抜き取る作業を３
回行い測定用素子として用いる。
測定方法 上記の前処理工程によつて作製された測定用素子（水晶
振動子）を用いて、本発明による血液凝固に伴うゲル化
反応の測定法を以下に説明する。フイブリノージエン，
フイブリン等の溶液の調製法は上記に示した通りであ
る。トロンビン溶液を調製する場合は、上記トリス塩酸
緩衝液にトロンビンを安定に保つ役目をする牛血清アル
ブミン（BSA）を0.5重量％添加し、この溶液にトロンビ
ンを所定量添加し調製した。第３図に測定手順の概略図
を示す。第３図に示すようにフイブリノージエン，フイ
ブリン等が付着された水晶振動子８が設置されたセル７
に、凝固が抑制され血液，フイブリノージエン，フイブ
リン溶液，トロンビン溶液などの凝固に関わる溶液を
700μ添加し水晶振動子８を発振させる。そしてその
溶液中にCaCl2溶液，トロンビン溶液，アクチンセフア
リン組織液，トロンボプラスチン，フイブリノージエン
溶液などの凝固を開始させる溶液を300μ添加し、
血液凝固によるゲル化反応にともなう周波数変化を測定
する。なお、使用する血液，フイブリノージエン溶液は
測定前に37℃に、トロンビン溶液は23℃に保温されたも
のを使用した。
振動子）を用いて、本発明による血液凝固に伴うゲル化
反応の測定法を以下に説明する。フイブリノージエン，
フイブリン等の溶液の調製法は上記に示した通りであ
る。トロンビン溶液を調製する場合は、上記トリス塩酸
緩衝液にトロンビンを安定に保つ役目をする牛血清アル
ブミン（BSA）を0.5重量％添加し、この溶液にトロンビ
ンを所定量添加し調製した。第３図に測定手順の概略図
を示す。第３図に示すようにフイブリノージエン，フイ
ブリン等が付着された水晶振動子８が設置されたセル７
に、凝固が抑制され血液，フイブリノージエン，フイブ
リン溶液，トロンビン溶液などの凝固に関わる溶液を
700μ添加し水晶振動子８を発振させる。そしてその
溶液中にCaCl2溶液，トロンビン溶液，アクチンセフア
リン組織液，トロンボプラスチン，フイブリノージエン
溶液などの凝固を開始させる溶液を300μ添加し、
血液凝固によるゲル化反応にともなう周波数変化を測定
する。なお、使用する血液，フイブリノージエン溶液は
測定前に37℃に、トロンビン溶液は23℃に保温されたも
のを使用した。
以下に具体例を挙げて述べるが、特に記述のない場合は
上記の方法で行つた。
上記の方法で行つた。
（実施例１） （付着処理による効果） 付着処理による効果を測定するため、付着処理を行わな
い未処理の素子，フイブリノージエン10mg/ml溶液に１
時間浸漬した素子，フイブリン10mg/ml溶液に１時間浸
漬した素子を用意した。溶液として2NIHunits/mlのト
ロンビン溶液を700μ添加し発振させる。10分間放置
した後、溶液として8mg/mlのフイブリノージエン溶液
を300μ添加し凝固反応を開始させ発振周波数の変化
を記録する。第４図には（ａ）未処理の素子，（ｂ）フ
イブリノージエン，（ｃ）フイブリンをそれぞれ前処理
した素子の測定結果を示した。（ａ）の未処理の素子に
ついては、目視により他のふたつの素子と同様の凝固反
応が生じているが大きな周波数変化は得られない。これ
はトロンビン溶液のBSAが水晶振動子表面に付着してし
まい凝固反応の測定の妨げになつているためである。し
かしフイブリノージエン処理で3000Hz以上、フイブリン
処理で1400Hz以上変化し、前もつてゲル化の際に網目構
造を形成する物質を付着させておくと測定感度が増大す
ることが示される。
い未処理の素子，フイブリノージエン10mg/ml溶液に１
時間浸漬した素子，フイブリン10mg/ml溶液に１時間浸
漬した素子を用意した。溶液として2NIHunits/mlのト
ロンビン溶液を700μ添加し発振させる。10分間放置
した後、溶液として8mg/mlのフイブリノージエン溶液
を300μ添加し凝固反応を開始させ発振周波数の変化
を記録する。第４図には（ａ）未処理の素子，（ｂ）フ
イブリノージエン，（ｃ）フイブリンをそれぞれ前処理
した素子の測定結果を示した。（ａ）の未処理の素子に
ついては、目視により他のふたつの素子と同様の凝固反
応が生じているが大きな周波数変化は得られない。これ
はトロンビン溶液のBSAが水晶振動子表面に付着してし
まい凝固反応の測定の妨げになつているためである。し
かしフイブリノージエン処理で3000Hz以上、フイブリン
処理で1400Hz以上変化し、前もつてゲル化の際に網目構
造を形成する物質を付着させておくと測定感度が増大す
ることが示される。
（実施例２） （付着処理による測定値ばらつき抑制効果） 第３図の溶液としてフイブリノージエン溶液を用い、
溶液としてトロンビン溶液を用いた場合、未処理素子
においても測定時溶液をいれて10分間放置している間
にフイブリノージエンが付着し測定は可能である。そこ
で処理素子，未処理素子についつ測定値のばらつきを求
めた。10mg/mlのフイブリノージエン溶液に１時間浸漬
させ付着処理した素子10個、未処理素子10個を準備し
た。溶液として8mg/mlのフイブリノージエン溶液を70
0μを加え、溶液として2NIHunits/mlのトロンビン
溶液を300μを添加する系で周波数変化を測定した。
その結果を第１表に示した。処理素子は未処理素子に比
べ、周波数変化の平均値で85Hz増加し、CV（変動係数）
で求めたばらつきは25％から5.6％へ低減している。こ
のように前もつてゲル化に関わる物質を付着させておく
と測定感度の増加ばかりではなく、測定値ばらつきの低
減も計れる。
溶液としてトロンビン溶液を用いた場合、未処理素子
においても測定時溶液をいれて10分間放置している間
にフイブリノージエンが付着し測定は可能である。そこ
で処理素子，未処理素子についつ測定値のばらつきを求
めた。10mg/mlのフイブリノージエン溶液に１時間浸漬
させ付着処理した素子10個、未処理素子10個を準備し
た。溶液として8mg/mlのフイブリノージエン溶液を70
0μを加え、溶液として2NIHunits/mlのトロンビン
溶液を300μを添加する系で周波数変化を測定した。
その結果を第１表に示した。処理素子は未処理素子に比
べ、周波数変化の平均値で85Hz増加し、CV（変動係数）
で求めたばらつきは25％から5.6％へ低減している。こ
のように前もつてゲル化に関わる物質を付着させておく
と測定感度の増加ばかりではなく、測定値ばらつきの低
減も計れる。
（実施例３） （前処理溶液濃度） 前もつて付着させるフイブリノージエン溶液の濃度を1m
g/ml、浸漬時間30分として処理し、フイブリノージエン
を付着させた素子について、溶液として2NIHunits/ml
のトロンビン溶液を700μ、溶液として8mg/mlのフ
イブリノージエン溶液を300μ添加し発振周波数を測
定した。第５図にはその結果を示す。フイブリノージエ
ン付着処理時の濃度が1mg/mlであつても1500Hz程度の周
波数変化を示し充分効果が現れているのが分かる。
g/ml、浸漬時間30分として処理し、フイブリノージエン
を付着させた素子について、溶液として2NIHunits/ml
のトロンビン溶液を700μ、溶液として8mg/mlのフ
イブリノージエン溶液を300μ添加し発振周波数を測
定した。第５図にはその結果を示す。フイブリノージエ
ン付着処理時の濃度が1mg/mlであつても1500Hz程度の周
波数変化を示し充分効果が現れているのが分かる。
（実施例４） （フイブリノージエン濃度測定） 10mg/mlフイブリノージエン溶液で１時間付着処理した
素子を用いてフイブリノージエン濃度の測定を行った。
溶液としてフイブリノージエン溶液濃度が8mg/ml,4mg
/ml,1mg/ml、および0.1mg/mlの溶液を準備し、各々を処
理済み測定用セルに700μ添加し、それらに溶液と
して20NIHunits/mlのトロンビン溶液を300μ添加し凝
固反応を開始させた。そしてその発振周波数の変化を測
定し第６図に○印で示した。さらに溶液として2NIHun
its/mlのトロンビン溶液を用い、処理済み測定用セル70
0μ添加し、それらに溶液のフイブリノージエン溶
液濃度が8mg/ml,4mg/ml,1mg/ml、0.1mg/mlの溶液を300
μ添加し発振周波数の変化を測定し第６図に△印で示
した。第６図から発振周波数の変化とフイブリノージエ
ン濃度との間には、どちらの場合においても、両対数を
とることにより直接関係があることが分かり、検量線を
作成することによりフイブリノージエン濃度を求めるこ
とができる。
素子を用いてフイブリノージエン濃度の測定を行った。
溶液としてフイブリノージエン溶液濃度が8mg/ml,4mg
/ml,1mg/ml、および0.1mg/mlの溶液を準備し、各々を処
理済み測定用セルに700μ添加し、それらに溶液と
して20NIHunits/mlのトロンビン溶液を300μ添加し凝
固反応を開始させた。そしてその発振周波数の変化を測
定し第６図に○印で示した。さらに溶液として2NIHun
its/mlのトロンビン溶液を用い、処理済み測定用セル70
0μ添加し、それらに溶液のフイブリノージエン溶
液濃度が8mg/ml,4mg/ml,1mg/ml、0.1mg/mlの溶液を300
μ添加し発振周波数の変化を測定し第６図に△印で示
した。第６図から発振周波数の変化とフイブリノージエ
ン濃度との間には、どちらの場合においても、両対数を
とることにより直接関係があることが分かり、検量線を
作成することによりフイブリノージエン濃度を求めるこ
とができる。
（実施例５） （血液凝固反応の測定） 兎血液を採取し、凝固抑制剤として3.2％クエン酸ナト
リウム溶液を血液：クエン酸ナトリウム＝9:1（重量
比）の割合で混合し、凝固系を抑制した血液を調製し
た。測定用素子を10mg/mlのフイブリノージエン溶液に
１時間浸漬させフイブリノージエンを付着させた。上記
の血液を測定セルへ700μ添加し10分間放置後、トロ
ンビンを活性化させる50mM CaCl2溶液を350μ添加
し、凝固反応を開始させ発振周波数を測定さした。第７
図にその結果を示したが、1300Hz以上の周波数変化を測
定でき、実際の血液を使用しても、血液凝固を伴うゲル
化反応の測定が可能であることが確認された。
リウム溶液を血液：クエン酸ナトリウム＝9:1（重量
比）の割合で混合し、凝固系を抑制した血液を調製し
た。測定用素子を10mg/mlのフイブリノージエン溶液に
１時間浸漬させフイブリノージエンを付着させた。上記
の血液を測定セルへ700μ添加し10分間放置後、トロ
ンビンを活性化させる50mM CaCl2溶液を350μ添加
し、凝固反応を開始させ発振周波数を測定さした。第７
図にその結果を示したが、1300Hz以上の周波数変化を測
定でき、実際の血液を使用しても、血液凝固を伴うゲル
化反応の測定が可能であることが確認された。
（実施例６） （血液中のフイブリノージエン濃度の測定） （実施例５）において調製した血液1mlに対し、フイブ
リノージエンを1mg,2mg,8mgをそれぞれ添加した。これ
らの血液を10mg/mlのフイブリノージエン溶液に１時間
浸漬させフイブリノージエンを付着させた測定用素子に
各々700μ添加した。そして10分間放置後、トロンビ
ンを活性化させる50mM CaCl2溶液350μ添加し、凝固
反応が開始させ発振周波数を測定した。第８図にその結
果を示したが、フイブリノージエンの添加量と周波数変
化の間には直線関係があり、検量線を作成することによ
り血液中のフイブリノージエンの濃度を求めることがで
きる。このように血液凝固を伴うゲル化反応に寄与する
反応物質であるフイブリノージエンの濃度が測定でき、
血液凝固を伴うゲル化反応に寄与する反応物質，触媒，
基質，酵素などの凝固線溶因子の存在量や濃度の測定が
可能であることが示される。
リノージエンを1mg,2mg,8mgをそれぞれ添加した。これ
らの血液を10mg/mlのフイブリノージエン溶液に１時間
浸漬させフイブリノージエンを付着させた測定用素子に
各々700μ添加した。そして10分間放置後、トロンビ
ンを活性化させる50mM CaCl2溶液350μ添加し、凝固
反応が開始させ発振周波数を測定した。第８図にその結
果を示したが、フイブリノージエンの添加量と周波数変
化の間には直線関係があり、検量線を作成することによ
り血液中のフイブリノージエンの濃度を求めることがで
きる。このように血液凝固を伴うゲル化反応に寄与する
反応物質であるフイブリノージエンの濃度が測定でき、
血液凝固を伴うゲル化反応に寄与する反応物質，触媒，
基質，酵素などの凝固線溶因子の存在量や濃度の測定が
可能であることが示される。
本発明の、血液凝固を伴うゲル化反応の測定用素子を用
いた測定法及び測定装置によればゲル化反応の測定の際
に高感度で測定値のばらつきの少ない凝固過程の測定が
可能となる。
いた測定法及び測定装置によればゲル化反応の測定の際
に高感度で測定値のばらつきの少ない凝固過程の測定が
可能となる。
第１図（ａ）は、本発明の血液凝固を伴うゲル化反応の
測定に使用する測定用素子（水晶振動子）の正面図、第
１図（ｂ）は該測定用素子の断面図、第２図は測定装置
の概略図、第３図は測定方法の手順を示す図、第４図〜
第８図は本発明の測定方法により血液凝固を伴うゲル化
反応を測定した各実施例の周波数又は周波数変化と時間
又は濃度との関係を示すグラフである。 １……水晶板、２……銀電極、３……薄板、４……シリ
コン樹脂、５……支持台、６……リード線、７……測定
用セル、８……水晶振動子。
測定に使用する測定用素子（水晶振動子）の正面図、第
１図（ｂ）は該測定用素子の断面図、第２図は測定装置
の概略図、第３図は測定方法の手順を示す図、第４図〜
第８図は本発明の測定方法により血液凝固を伴うゲル化
反応を測定した各実施例の周波数又は周波数変化と時間
又は濃度との関係を示すグラフである。 １……水晶板、２……銀電極、３……薄板、４……シリ
コン樹脂、５……支持台、６……リード線、７……測定
用セル、８……水晶振動子。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 平２−285236（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−284757（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−243877（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−279839（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−5544（ＪＰ，Ａ) 特表 昭58−500085（ＪＰ，Ａ)
Claims (9)
- 【請求項１】血液凝固に伴うゲル化反応の際に網目構造
を形成する物質を予め付着させた圧電振動子を測定用素
子とすることを特徴とする血液凝固に伴うゲル化反応の
測定法。 - 【請求項２】網目構造を形成する物質が、フイブリノー
ジエン，フイブリン、その派生物またはフイブリン中間
体である請求項１記載の血液凝固に伴うゲル化反応の測
定法。 - 【請求項３】ゲル化反応に伴う圧電振動子の発振周波数
変化を測定する請求項１又は２記載の血液凝固に伴うゲ
ル化反応の測定法。 - 【請求項４】血液凝固に伴うゲル化反応の際に網目構造
を形成する物質を予め付着させた圧電振動子を、血液凝
固に関わる溶液に浸漬して発振させ、次いで血液凝固を
開始させる溶液を添加し、これにより生ずる発振周波数
の変化を測定することを特徴とする血液凝固に伴うゲル
化反応の測定法。 - 【請求項５】ゲル化反応の測定により、血液凝固に伴う
ゲル化反応の凝固系又は該凝固系に関与する因子の存在
量，濃度又は活性量を求めるものである請求項1,2,3又
は４記載の血液凝固に伴うゲル化反応の測定法。 - 【請求項６】血液凝固に伴うゲル化反応の際に網目構造
を形成する物質を表面に予め付着させた圧電振動子を測
定用素子として有する血液凝固に伴うゲル化反応の測定
装置。 - 【請求項７】圧電振動子，発振回路，周波数カウンタ及
びデータ演算装置を備えた請求項６記載の血液凝固に伴
うゲル化反応の測定装置。 - 【請求項８】圧電振動子が、ATカツトされた水晶結晶か
ら構成される水晶振動子である請求項６又は７記載の血
液凝固に伴うゲル化反応の測定装置。 - 【請求項９】血液凝固に伴うゲル化反応の際に網目構造
を形成する物質を表面に予め付着させた圧電振動子から
なる血液凝固に伴うゲル化反応の測定用素子。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13902990A JPH0743388B2 (ja) | 1990-05-29 | 1990-05-29 | 血液凝固に伴うゲル化反応の測定法，測定装置及び測定用素子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13902990A JPH0743388B2 (ja) | 1990-05-29 | 1990-05-29 | 血液凝固に伴うゲル化反応の測定法，測定装置及び測定用素子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0432767A JPH0432767A (ja) | 1992-02-04 |
| JPH0743388B2 true JPH0743388B2 (ja) | 1995-05-15 |
Family
ID=15235806
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13902990A Expired - Lifetime JPH0743388B2 (ja) | 1990-05-29 | 1990-05-29 | 血液凝固に伴うゲル化反応の測定法，測定装置及び測定用素子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0743388B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015159623A1 (ja) * | 2014-04-17 | 2015-10-22 | ソニー株式会社 | 血液状態解析装置、血液状態解析システム、血液状態解析方法及びプログラム |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6200532B1 (en) * | 1998-11-20 | 2001-03-13 | Akzo Nobel Nv | Devices and method for performing blood coagulation assays by piezoelectric sensing |
| US7261861B2 (en) * | 2003-04-24 | 2007-08-28 | Haemoscope Corporation | Hemostasis analyzer and method |
| US8448499B2 (en) | 2008-12-23 | 2013-05-28 | C A Casyso Ag | Cartridge device for a measuring system for measuring viscoelastic characteristics of a sample liquid, a corresponding measuring system, and a corresponding method |
| DE102009040879B4 (de) | 2009-09-09 | 2012-12-06 | Andreas Hettich Gmbh & Co. Kg | Verfahren zur Bestimmung der Gerinnungszeit |
| PE20121723A1 (es) * | 2009-12-18 | 2012-12-11 | Entegrion Inc | Dispositivo portatil de monitorizacion de la coagulacion y metodo de evaluacion de la respuesta de coagulacion |
| US10175225B2 (en) | 2014-09-29 | 2019-01-08 | C A Casyso Ag | Blood testing system and method |
| WO2017096284A1 (en) * | 2015-12-03 | 2017-06-08 | Ca Casyso Ag | Blood testing system and method |
-
1990
- 1990-05-29 JP JP13902990A patent/JPH0743388B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015159623A1 (ja) * | 2014-04-17 | 2015-10-22 | ソニー株式会社 | 血液状態解析装置、血液状態解析システム、血液状態解析方法及びプログラム |
| JPWO2015159623A1 (ja) * | 2014-04-17 | 2017-04-13 | ソニー株式会社 | 血液状態解析装置、血液状態解析システム、血液状態解析方法及びプログラム |
| JP2020076766A (ja) * | 2014-04-17 | 2020-05-21 | ソニー株式会社 | 血液状態解析装置、血液状態解析システム、血液状態解析方法及びプログラム |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0432767A (ja) | 1992-02-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4072576A (en) | Method for studying enzymatic and other biochemical reactions | |
| JP3056221B2 (ja) | 酵素電極およびその製造方法 | |
| JP4662596B2 (ja) | 血液凝固時間を測定するための電気化学的システム | |
| Barnes et al. | A concanavalin A-coated piezoelectric crystal biosensor | |
| JPH01219661A (ja) | 酵素電極型のセンサーを用いての分析方法及び装置 | |
| JPH08511942A (ja) | 診断用試薬安定剤 | |
| JP2000509488A (ja) | バイオセンサー | |
| JPH0743388B2 (ja) | 血液凝固に伴うゲル化反応の測定法，測定装置及び測定用素子 | |
| EP0276782B1 (en) | Process for preparing enzyme electrodes | |
| EP0367432A1 (en) | Biosensor device | |
| JP3933340B2 (ja) | マルチチャンネルｑｃｍセンサデバイス | |
| JPH09189701A (ja) | 質量感受性バイオセンサー | |
| JP2001153777A (ja) | 水晶発振子 | |
| Hoshi et al. | Electrochemical deposition of avidin on the surface of a platinum electrode for enzyme sensor applications | |
| JPH05164671A (ja) | 血液線溶反応の測定法及び測定装置 | |
| JP2569404B2 (ja) | 生体機能物質の固定化法及びそれを用いた電極 | |
| Grande et al. | Detection of galactosyltransferase using chemically modified piezoelectric quartz | |
| JP2690849B2 (ja) | 水晶振動子式バイオセンサの製法及び水晶振動子式バイオセンサ | |
| JPS6117948A (ja) | 酵素電極用固定化酵素膜 | |
| JPS61231419A (ja) | 有機物質の微量測定法 | |
| JPH10274654A (ja) | バイオセンサ | |
| JPS63111453A (ja) | 酵素電極 | |
| JPS63298051A (ja) | 酵素電極の製造方法 | |
| JPH03115947A (ja) | 水晶振動子アルブミンバイオセンサ | |
| JPS58216947A (ja) | スクロ−ス濃度測定用酵素電極 |