JPH07316174A - 新規なビオチン標識化ヌクレオチド - Google Patents
新規なビオチン標識化ヌクレオチドInfo
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- JPH07316174A JPH07316174A JP13253494A JP13253494A JPH07316174A JP H07316174 A JPH07316174 A JP H07316174A JP 13253494 A JP13253494 A JP 13253494A JP 13253494 A JP13253494 A JP 13253494A JP H07316174 A JPH07316174 A JP H07316174A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 核酸の塩基配列決定に有用なピリミジン塩基
又はプリン塩基である、アデニン（Ａ）、シトシン
（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、及びチミン（Ｔ）の４種の塩
基に対応する新規なビオチン標識化ヌクレオチドおよび
標識化物を付ける前のヌクレオシドの中間体の調製が容
易な新規ビオチン標識化ヌクレオチドの提供。 【構成】 下記一般式 【化１】 （Ｑは、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、シ
トシンまたはウラシル残基であり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及び
Ｒ4は、それぞれ独立に、水素原子、ナトリウム原子、
又はリチウム原子を表す。ただし、ナトリウム原子とリ
チウム原子が同時に存在することはない。）で示される
新規なビオチン標識化ヌクレオチド。
又はプリン塩基である、アデニン（Ａ）、シトシン
（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、及びチミン（Ｔ）の４種の塩
基に対応する新規なビオチン標識化ヌクレオチドおよび
標識化物を付ける前のヌクレオシドの中間体の調製が容
易な新規ビオチン標識化ヌクレオチドの提供。 【構成】 下記一般式 【化１】 （Ｑは、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、シ
トシンまたはウラシル残基であり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及び
Ｒ4は、それぞれ独立に、水素原子、ナトリウム原子、
又はリチウム原子を表す。ただし、ナトリウム原子とリ
チウム原子が同時に存在することはない。）で示される
新規なビオチン標識化ヌクレオチド。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は新規なビオチン標識化ヌ
クレオチドに関するものであり、本発明化合物は核酸の
塩基配列決定方法、核酸の組み替え手法などにおいて有
用である。
クレオチドに関するものであり、本発明化合物は核酸の
塩基配列決定方法、核酸の組み替え手法などにおいて有
用である。
【０００２】
【従来技術】特公平３−７５５５９号公報ではビオチン
で標識化されたヌクレオチドが記載されており、その構
造において核酸の塩基とビオチンとを結合する基［以
下、結合基と略す］として、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−Ｎ
Ｈ−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）
−ＣＨ2−ＮＨ−などのα位に二重結合を有するものが
示されている。しかしながら、特公平３−７５５５９号
公報に記載されている化合物はピリミジンヌクレオチド
のみであり、プリンヌクレオチドは一切示されていな
い。また、前記公報に開示されているα位に二重結合を
有する結合基を持つヌクレオチドは、標識化物をつける
前のヌクレオシドの中間体を調整することが困難であっ
た。
で標識化されたヌクレオチドが記載されており、その構
造において核酸の塩基とビオチンとを結合する基［以
下、結合基と略す］として、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−Ｎ
Ｈ−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）
−ＣＨ2−ＮＨ−などのα位に二重結合を有するものが
示されている。しかしながら、特公平３−７５５５９号
公報に記載されている化合物はピリミジンヌクレオチド
のみであり、プリンヌクレオチドは一切示されていな
い。また、前記公報に開示されているα位に二重結合を
有する結合基を持つヌクレオチドは、標識化物をつける
前のヌクレオシドの中間体を調整することが困難であっ
た。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の第一の目的
は、核酸の塩基配列決定に有用なピリミジン塩基又はプ
リン塩基である、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グ
アニン（Ｇ）、及びチミン（Ｔ）の４種の塩基に対応す
る新規なビオチン標識化ヌクレオチドを提供する点にあ
る。本発明の第二の目的は、標識化物を付ける前のヌク
レオシドの中間体の調製が容易な新規ビオチン標識化ヌ
クレオチドを提供する点にある。
は、核酸の塩基配列決定に有用なピリミジン塩基又はプ
リン塩基である、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グ
アニン（Ｇ）、及びチミン（Ｔ）の４種の塩基に対応す
る新規なビオチン標識化ヌクレオチドを提供する点にあ
る。本発明の第二の目的は、標識化物を付ける前のヌク
レオシドの中間体の調製が容易な新規ビオチン標識化ヌ
クレオチドを提供する点にある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上述の問
題点を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ビオチン標識
化ヌクレオチドにおいて、核酸の塩基とビオチンとの結
合基としてα位に三重結合を有する−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ2−
ＮＨ−を用いることにより、核酸の塩基配列決定用のヌ
クレオチドに必要な機能を有する、ビオチンで標識化さ
れたＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ４種の塩基に対応するヌクレオチド
を容易に調製することができることを見いだし、本発明
を完成したものである。
題点を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ビオチン標識
化ヌクレオチドにおいて、核酸の塩基とビオチンとの結
合基としてα位に三重結合を有する−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ2−
ＮＨ−を用いることにより、核酸の塩基配列決定用のヌ
クレオチドに必要な機能を有する、ビオチンで標識化さ
れたＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ４種の塩基に対応するヌクレオチド
を容易に調製することができることを見いだし、本発明
を完成したものである。
【０００５】すなわち、本発明は、下記一般式
【化６】 （式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、及びＲ4は、それぞれ独立に、
水素原子、ナトリウム原子、又はリチウム原子を表す。
ただし、ナトリウム原子とリチウム原子が同時に存在す
ることはなく、Ａは、
水素原子、ナトリウム原子、又はリチウム原子を表す。
ただし、ナトリウム原子とリチウム原子が同時に存在す
ることはなく、Ａは、
【化７】
【化８】
【化９】 および、
【化１０】 よりなる群から選らばれた基である。）で示される新規
なビオチン標識化ヌクレオチドに関する。以下、本発明
を詳しく述べる。本発明化合物は以下のようにして調製
することができる。まず、文献記載の方法［ジャーナル
オブオーガニックケミストリー（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅ
ｍ．）、第５４巻、第３４２０頁、１９８９年］に基づ
き、下記式
なビオチン標識化ヌクレオチドに関する。以下、本発明
を詳しく述べる。本発明化合物は以下のようにして調製
することができる。まず、文献記載の方法［ジャーナル
オブオーガニックケミストリー（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅ
ｍ．）、第５４巻、第３４２０頁、１９８９年］に基づ
き、下記式
【化１１】 （式中、Ｑは、７−デアザアデニン、シトシン、７−デ
アザグアニンまたはウラシル残基を表す。）で示される
３−トリフルオロアセチルアミノ−１−プロピニル基が
核酸の塩基に結合したヌクレオシド［以下、ｄｄＮ−Ｐ
ＧＡＰと略す］を調製する。
アザグアニンまたはウラシル残基を表す。）で示される
３−トリフルオロアセチルアミノ−１−プロピニル基が
核酸の塩基に結合したヌクレオシド［以下、ｄｄＮ−Ｐ
ＧＡＰと略す］を調製する。
【０００６】すなわち、ヌクレオシドのピリミジン塩基
の５位又はデアザプリン塩基の７位をヨウ素化し、パラ
ジウム０価触媒の存在下にＮ−トリフルオロアセチルプ
ロパルギルアミンを反応させることにより、式（６）で
示される７−（３−トリフルオロアセチルアミノ−１−
プロピニル）−２′，３′−ジデオキシ−７−デアザア
デノシン、５−（３−トリフルオロアセチルアミノ−１
−プロピニル）−２′，３′−ジデオキシシチジン、７
−（３−トリフルオロアセチルアミノ−１−プロピニ
ル）−２′，３′−ジデオキシ−７−デアザグアノシ
ン、又は５−（３−トリフルオロアセチルアミノ−１−
プロピニル）−２′，３′−ジデオキシウリジンを調製
する。
の５位又はデアザプリン塩基の７位をヨウ素化し、パラ
ジウム０価触媒の存在下にＮ−トリフルオロアセチルプ
ロパルギルアミンを反応させることにより、式（６）で
示される７−（３−トリフルオロアセチルアミノ−１−
プロピニル）−２′，３′−ジデオキシ−７−デアザア
デノシン、５−（３−トリフルオロアセチルアミノ−１
−プロピニル）−２′，３′−ジデオキシシチジン、７
−（３−トリフルオロアセチルアミノ−１−プロピニ
ル）−２′，３′−ジデオキシ−７−デアザグアノシ
ン、又は５−（３−トリフルオロアセチルアミノ−１−
プロピニル）−２′，３′−ジデオキシウリジンを調製
する。
【０００７】次に、ｄｄＮ−ＰＧＡＰの５′末端の水酸
基のトリホスフェート化は、ヌクレオシド又は２′−ヌ
クレオシドの５′−トリホスフェート化方法であるエク
シュタインらの方法［ジャーナルオブオーガニックケミ
ストリー（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）、第５４巻、第６
３１頁、１９８９年］を利用することにより、下記式
基のトリホスフェート化は、ヌクレオシド又は２′−ヌ
クレオシドの５′−トリホスフェート化方法であるエク
シュタインらの方法［ジャーナルオブオーガニックケミ
ストリー（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）、第５４巻、第６
３１頁、１９８９年］を利用することにより、下記式
【化１２】 （式中、Ｑは前記と同一である。）で示される３−アミ
ノ−１−プロピニル基が核酸の塩基に結合したヌクレオ
チド［以下、ｄｄＮＴＰ−ＰＧＡと略す］を調製するこ
とができる。二官能性のリン酸化剤によってｄｄＮ−Ｐ
ＧＡＰを活性化したモノホスファイトとした後に、ピロ
リン酸と反応させ、酸化、脱保護することにより、式
（７）で示される本発明化合物の前駆物質である７−
（３−アミノ−１−プロピニル）−２′，３′−ジデオ
キシ−７−デアザアデノシン−５′−トリホスフェー
ト、５−（３−アミノ−１−プロピニル）−２′，３′
−ジデオキシシチジン−５′−トリホスフェート、７−
（３−アミノ−１−プロピニル）−２′，３′−ジデオ
キシ−７−デアザグアノシン−５′−トリホスフェー
ト、又は５−（３−アミノ−１−プロピニル）−２′，
３′−ジデオキシウリジン−５′−トリホスフェートを
調製する。
ノ−１−プロピニル基が核酸の塩基に結合したヌクレオ
チド［以下、ｄｄＮＴＰ−ＰＧＡと略す］を調製するこ
とができる。二官能性のリン酸化剤によってｄｄＮ−Ｐ
ＧＡＰを活性化したモノホスファイトとした後に、ピロ
リン酸と反応させ、酸化、脱保護することにより、式
（７）で示される本発明化合物の前駆物質である７−
（３−アミノ−１−プロピニル）−２′，３′−ジデオ
キシ−７−デアザアデノシン−５′−トリホスフェー
ト、５−（３−アミノ−１−プロピニル）−２′，３′
−ジデオキシシチジン−５′−トリホスフェート、７−
（３−アミノ−１−プロピニル）−２′，３′−ジデオ
キシ−７−デアザグアノシン−５′−トリホスフェー
ト、又は５−（３−アミノ−１−プロピニル）−２′，
３′−ジデオキシウリジン−５′−トリホスフェートを
調製する。
【０００８】次いで、ｄｄＮＴＰ−ＰＧＡとビオチニル
−Ｎ−スクシンイミドエステルとを反応させることによ
り、Ｎ−ビオチニル−３−アミノ−１−プロピニル基が
核酸の塩基に結合した式（１）で示される本発明の新規
なビオチン標識化ヌクレオチドを調製することができ
る。このときに調製される本発明化合物としては、７−
（Ｎ−ビオチニル−３−アミノ−１−プロピニル）−
２′，３′−ジデオキシ−７−デアザアデノシン−５′
−トリホスフェート［式（１）のＡが式（２）のも
の］、５−（Ｎ−ビオチニル−３−アミノ−１−プロピ
ニル）−２′，３′−ジデオキシシチジン−５′−トリ
ホスフェート［式（１）のＡが式（３）のもの］、７−
（Ｎ−ビオチニル−３−アミノ−１−プロピニル）−
２′，３′−ジデオキシ−７−デアザグアノシン−５′
−トリホスフェート［式（１）のＡが式（４）のも
の］、又は５−（Ｎ−ビオチニル−３−アミノ−１−プ
ロピニル）−２′，３′−ジデオキシウリジン−５′−
トリホスフェート［式（１）のＡが式（５）のもの］で
ある。
−Ｎ−スクシンイミドエステルとを反応させることによ
り、Ｎ−ビオチニル−３−アミノ−１−プロピニル基が
核酸の塩基に結合した式（１）で示される本発明の新規
なビオチン標識化ヌクレオチドを調製することができ
る。このときに調製される本発明化合物としては、７−
（Ｎ−ビオチニル−３−アミノ−１−プロピニル）−
２′，３′−ジデオキシ−７−デアザアデノシン−５′
−トリホスフェート［式（１）のＡが式（２）のも
の］、５−（Ｎ−ビオチニル−３−アミノ−１−プロピ
ニル）−２′，３′−ジデオキシシチジン−５′−トリ
ホスフェート［式（１）のＡが式（３）のもの］、７−
（Ｎ−ビオチニル−３−アミノ−１−プロピニル）−
２′，３′−ジデオキシ−７−デアザグアノシン−５′
−トリホスフェート［式（１）のＡが式（４）のも
の］、又は５−（Ｎ−ビオチニル−３−アミノ−１−プ
ロピニル）−２′，３′−ジデオキシウリジン−５′−
トリホスフェート［式（１）のＡが式（５）のもの］で
ある。
【０００９】前記、ｄｄＮＴＰ−ＰＧＡとビオチニル−
Ｎ−スクシンイミドエステルとの反応に使用される反応
溶媒は、例えば、アセトニトリル、テトラヒドロフラ
ン、ジオキサン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスル
ホキシド、トリメチルホスフェートなどが挙げられる
が、好ましい溶媒はジメチルホルムアミドである。反応
ｐＨは７〜９の範囲が好ましく、更に好ましいｐＨは
８．５であるので、ｐＨ７以上の緩衝作用を有するもの
を使用することが良く、例えば、５０ｍＭ〜０．２Ｍの
ホウ酸緩衝液を用いる。反応温度は４〜５０℃であれば
容易に進行するが、好ましい温度は２０〜２５℃であ
る。反応は２時間以内に終了する。
Ｎ−スクシンイミドエステルとの反応に使用される反応
溶媒は、例えば、アセトニトリル、テトラヒドロフラ
ン、ジオキサン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスル
ホキシド、トリメチルホスフェートなどが挙げられる
が、好ましい溶媒はジメチルホルムアミドである。反応
ｐＨは７〜９の範囲が好ましく、更に好ましいｐＨは
８．５であるので、ｐＨ７以上の緩衝作用を有するもの
を使用することが良く、例えば、５０ｍＭ〜０．２Ｍの
ホウ酸緩衝液を用いる。反応温度は４〜５０℃であれば
容易に進行するが、好ましい温度は２０〜２５℃であ
る。反応は２時間以内に終了する。
【００１０】なお、本発明化合物を使用する際には、
５′末端のトリホスフェートの水素原子をナトリウム原
子又はリチウム原子で置換したものを必要に応じて常法
により調製して用いる。
５′末端のトリホスフェートの水素原子をナトリウム原
子又はリチウム原子で置換したものを必要に応じて常法
により調製して用いる。
【００１１】
【実施例】次に、実験例及び実施例にて本発明を更に説
明する。
明する。
【００１２】実験例１ 下記式
【化１３】 で示される７−（３−トリフルオロアセチルアミノ−１
−プロピニル）−２′，３′−ジデオキシ−７−デアザ
アデノシン１００ｍｇ［２７７μｍｏｌ］を３０ｍｌ容
のナスフラスコに秤取り、乾燥ピリジン１０ｍｌで３回
共沸脱水して、更に室温で１時間減圧乾燥しフラスコ内
をアルゴンガスで常圧に戻した。残渣を乾燥ピリジン１
ｍｌで溶解し、１Ｍ ２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−
ベンゾジオキサホスホリン−４−オンのジオキサン溶液
０．３１ｍｌを加え、アルゴンガス雰囲気下室温で撹拌
した。１０分後、０．５Ｍ ビス（トリ−ｎ−ブチルア
ンモニウム）ピロホスフェートのジメチルホルムアミド
溶液０．８３ｍｌ及びトリ−ｎ−ブチルアミン２７７μ
ｌ［１．２ｍｍｏｌ］を加え、アルゴン雰囲気下、室温
で撹拌した。１０分後、１％ヨウ素のピリジン溶液／精
製水［９８／２］の混液５．５ｍｌを加えて室温で１５
分撹拌し、更に５％亜硫酸水素ナトリウム溶液０．２８
ｍｌを加えて５分間撹拌した。反応混合液を減圧下濃縮
乾固し、残渣を０．１Ｍ−炭酸水素トリエチルアンモニ
ウム緩衝液［ｐＨ７．６］１０ｍｌに溶解し、０〜４℃
で一晩静置した後、減圧下濃縮乾固し、残渣を濃アンモ
ニア水１０ｍｌに溶解し室温で４時間静置した。これを
更に減圧下濃縮乾固し、残渣を精製水１０ｍｌで溶解
し、エッペンドルフ中に同量のｎ−ブタノールで振と
う、分液し、ブタノール層を除去した。この操作を５回
繰り返すことにより、下層の水層を約１ｍｌまで濃縮し
た。残渣を弱アニオン交換樹脂［ＤＥＡＥセファデック
スＡ−２５、直径２ｃｍ、長さ１０ｃｍ］のカラム上部
に吸着させた。１０％エタノール含有する炭酸水素トリ
エチルアンモニウム緩衝液の塩濃度を０ｍＭ、５０ｍ
Ｍ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ
［各２００ｍｌ］と段階的に上げて通液した。塩濃度３
００ｍＭで溶出した留分を減圧下濃縮乾固し、残渣を５
０％エタノール水溶液４０ｍｌに溶解し濃縮乾固し、こ
の操作をトリエチルアミン臭がなくなるまで繰り返すこ
とにより、下記式
−プロピニル）−２′，３′−ジデオキシ−７−デアザ
アデノシン１００ｍｇ［２７７μｍｏｌ］を３０ｍｌ容
のナスフラスコに秤取り、乾燥ピリジン１０ｍｌで３回
共沸脱水して、更に室温で１時間減圧乾燥しフラスコ内
をアルゴンガスで常圧に戻した。残渣を乾燥ピリジン１
ｍｌで溶解し、１Ｍ ２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−
ベンゾジオキサホスホリン−４−オンのジオキサン溶液
０．３１ｍｌを加え、アルゴンガス雰囲気下室温で撹拌
した。１０分後、０．５Ｍ ビス（トリ−ｎ−ブチルア
ンモニウム）ピロホスフェートのジメチルホルムアミド
溶液０．８３ｍｌ及びトリ−ｎ−ブチルアミン２７７μ
ｌ［１．２ｍｍｏｌ］を加え、アルゴン雰囲気下、室温
で撹拌した。１０分後、１％ヨウ素のピリジン溶液／精
製水［９８／２］の混液５．５ｍｌを加えて室温で１５
分撹拌し、更に５％亜硫酸水素ナトリウム溶液０．２８
ｍｌを加えて５分間撹拌した。反応混合液を減圧下濃縮
乾固し、残渣を０．１Ｍ−炭酸水素トリエチルアンモニ
ウム緩衝液［ｐＨ７．６］１０ｍｌに溶解し、０〜４℃
で一晩静置した後、減圧下濃縮乾固し、残渣を濃アンモ
ニア水１０ｍｌに溶解し室温で４時間静置した。これを
更に減圧下濃縮乾固し、残渣を精製水１０ｍｌで溶解
し、エッペンドルフ中に同量のｎ−ブタノールで振と
う、分液し、ブタノール層を除去した。この操作を５回
繰り返すことにより、下層の水層を約１ｍｌまで濃縮し
た。残渣を弱アニオン交換樹脂［ＤＥＡＥセファデック
スＡ−２５、直径２ｃｍ、長さ１０ｃｍ］のカラム上部
に吸着させた。１０％エタノール含有する炭酸水素トリ
エチルアンモニウム緩衝液の塩濃度を０ｍＭ、５０ｍ
Ｍ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ
［各２００ｍｌ］と段階的に上げて通液した。塩濃度３
００ｍＭで溶出した留分を減圧下濃縮乾固し、残渣を５
０％エタノール水溶液４０ｍｌに溶解し濃縮乾固し、こ
の操作をトリエチルアミン臭がなくなるまで繰り返すこ
とにより、下記式
【化１４】 で示される７−（３−アミノ−１−プロピニル）−
２′，３′−ジデオキシ−７−デアザアデノシン−５′
−トリホスフェート８８ｍｇ［１０５μｍｏｌ］を得
た。収率は４０％であった。
２′，３′−ジデオキシ−７−デアザアデノシン−５′
−トリホスフェート８８ｍｇ［１０５μｍｏｌ］を得
た。収率は４０％であった。
【００１３】1Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）、δ
ｐｐｍ ７．８８（１Ｈ，ｓ，２−Ｈ）、７．６７（１Ｈ，ｓ，
８−Ｈ）、６．３１（１Ｈ，ｍ，１′−Ｈ）、４．３９
（１Ｈ，ｍ，４′−Ｈ）、４．３−３．８（２Ｈ，ｍ，
５′−Ｈ）、３．９２（２Ｈ，ｂｒｏｒｄ ｓ，Ｃ≡Ｃ
−ＣＨ2）、２．６−１．９（４Ｈ，ｍ，２′−Ｈ ａ
ｎｄ ３′−Ｈ）
ｐｐｍ ７．８８（１Ｈ，ｓ，２−Ｈ）、７．６７（１Ｈ，ｓ，
８−Ｈ）、６．３１（１Ｈ，ｍ，１′−Ｈ）、４．３９
（１Ｈ，ｍ，４′−Ｈ）、４．３−３．８（２Ｈ，ｍ，
５′−Ｈ）、３．９２（２Ｈ，ｂｒｏｒｄ ｓ，Ｃ≡Ｃ
−ＣＨ2）、２．６−１．９（４Ｈ，ｍ，２′−Ｈ ａ
ｎｄ ３′−Ｈ）
【００１４】実験例２ 下記式
【化１５】 で示される５−（３−トリフルオロアセチルアミノ−１
−プロピニル）−２′，３′−ジデオキシシチジン１０
０ｍｇ［２７８μｍｏｌ］から、実験例１と同様の操作
により、下記式
−プロピニル）−２′，３′−ジデオキシシチジン１０
０ｍｇ［２７８μｍｏｌ］から、実験例１と同様の操作
により、下記式
【化１６】 で示される５−（３−アミノ−１−プロピニル）−
２′，３′−ジデオキシシチジン−５′−トリホスフェ
ート２８ｍｇ［３６μｍｏｌ］を得た。収率は１３％で
あった。
２′，３′−ジデオキシシチジン−５′−トリホスフェ
ート２８ｍｇ［３６μｍｏｌ］を得た。収率は１３％で
あった。
【００１５】1Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）、δ
ｐｐｍ ８．４８（１Ｈ，ｓ，６−Ｈ）、５．９３（１Ｈ，ｄ，
Ｊ＝５．９Ｈｚ，１′−Ｈ）、４．４−４．０（３Ｈ，
ｍ，４′−Ｈ ａｎｄ ５′−Ｈ）、３．９６（２Ｈ，
ｓ，Ｃ≡Ｃ−ＣＨ2）、２．５−１．８（４Ｈ，ｍ，
２′−Ｈ ａｎｄ３′−Ｈ）
ｐｐｍ ８．４８（１Ｈ，ｓ，６−Ｈ）、５．９３（１Ｈ，ｄ，
Ｊ＝５．９Ｈｚ，１′−Ｈ）、４．４−４．０（３Ｈ，
ｍ，４′−Ｈ ａｎｄ ５′−Ｈ）、３．９６（２Ｈ，
ｓ，Ｃ≡Ｃ−ＣＨ2）、２．５−１．８（４Ｈ，ｍ，
２′−Ｈ ａｎｄ３′−Ｈ）
【００１６】実験例３ 下記式
【化１７】 で示される７−（３−トリフルオロアセチルアミノ−１
−プロピニル）−２′，３′−ジデオキシ−７−デアザ
グアノシン１００ｍｇ［２５４μｍｏｌ］から、実験例
１と同様の操作により、下記式
−プロピニル）−２′，３′−ジデオキシ−７−デアザ
グアノシン１００ｍｇ［２５４μｍｏｌ］から、実験例
１と同様の操作により、下記式
【化１８】 で示される７−（３−アミノ−１−プロピニル）−
２′，３′−ジデオキシ−７−デアザグアノシン−５′
−トリホスフェート２８ｍｇ［３３μｍｏｌ］を得た。
収率は１４％であった。
２′，３′−ジデオキシ−７−デアザグアノシン−５′
−トリホスフェート２８ｍｇ［３３μｍｏｌ］を得た。
収率は１４％であった。
【００１７】1Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）、δ
ｐｐｍ ７．４３（１Ｈ，ｓ，８−Ｈ）、６．１５（１Ｈ，ｍ，
１′−Ｈ）、４．４−３．８（５Ｈ，ｍ，４′−Ｈ，
５′−Ｈ ａｎｄ Ｃ≡Ｃ−ＣＨ2）、２．５−２．０
（４Ｈ，ｍ，２′−Ｈ ａｎｄ ３′−Ｈ）
ｐｐｍ ７．４３（１Ｈ，ｓ，８−Ｈ）、６．１５（１Ｈ，ｍ，
１′−Ｈ）、４．４−３．８（５Ｈ，ｍ，４′−Ｈ，
５′−Ｈ ａｎｄ Ｃ≡Ｃ−ＣＨ2）、２．５−２．０
（４Ｈ，ｍ，２′−Ｈ ａｎｄ ３′−Ｈ）
【００１８】実験例４ 下記式
【化１９】 で示される５−（３−トリフルオロアセチルアミノ−１
−プロピニル）−２′，３′−ジデオキシウリジン１０
０ｍｇ［２７７μｍｏｌ］から、実験例１と同様の操作
により、下記式
−プロピニル）−２′，３′−ジデオキシウリジン１０
０ｍｇ［２７７μｍｏｌ］から、実験例１と同様の操作
により、下記式
【化２０】 で示される５−（３−アミノ−１−プロピニル）−
２′，３′−ジデオキシウリジン−５′−トリホスフェ
ート５０ｍｇ［６４μｍｏｌ］を得た。収率は２３％で
あった。
２′，３′−ジデオキシウリジン−５′−トリホスフェ
ート５０ｍｇ［６４μｍｏｌ］を得た。収率は２３％で
あった。
【００１９】1Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）、δ
ｐｐｍ ８．４９（１Ｈ，ｓ，６−Ｈ）、５．９６（１Ｈ，ｄ，
Ｊ＝５．０Ｈｚ，１′−Ｈ）、４．４−４．０（３Ｈ，
ｍ，４′−Ｈ ａｎｄ ５′−Ｈ）、３．９１（２Ｈ，
ｓ，Ｃ≡Ｃ−ＣＨ2）、２．５−１．９（４Ｈ，ｍ，
２′−Ｈ ａｎｄ３′−Ｈ）
ｐｐｍ ８．４９（１Ｈ，ｓ，６−Ｈ）、５．９６（１Ｈ，ｄ，
Ｊ＝５．０Ｈｚ，１′−Ｈ）、４．４−４．０（３Ｈ，
ｍ，４′−Ｈ ａｎｄ ５′−Ｈ）、３．９１（２Ｈ，
ｓ，Ｃ≡Ｃ−ＣＨ2）、２．５−１．９（４Ｈ，ｍ，
２′−Ｈ ａｎｄ３′−Ｈ）
【００２０】実施例１ 実験例１で得た式（９）で示される７−（３−アミノ−
１−プロピニル）−２′，３′−ジデオキシ−７−デア
ザアデノシン−５′−トリホスフェート４ｍｇ［５μｍ
ｏｌ］を０．１Ｍ−ホウ酸ナトリウム緩衝液［ｐＨ８．
５］１４０μｌに溶解し、更に４％ビオチニル−Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミドエステルのジメチルホルムアミ
ド溶液１４０μｌを加え、遮光し、１．５ｍｌ容のエッ
ペンドルフ中に静置して室温で２時間反応させた。反応
混合液を精製水１ｍｌで希釈し同量のｎ−ブタノールを
加え、振とう、分液し、ブタノール層を除去した。この
操作を５回繰り返すことにより、下層の水層を約０．１
ｍｌまで濃縮した。残渣を弱アニオン交換樹脂［ＤＥＡ
ＥセファデックスＡ−２５、直径２ｃｍ、長さ１０ｃ
ｍ］のカラム上部に吸着させた。１０％エタノール含有
する炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液の塩濃度を
０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ［各２００
ｍｌ］と段階的に上げて通液した。塩濃度２００ｍＭで
溶出した留分を濃縮乾固し、残渣を５０％エタノール水
溶液に再溶解、濃縮、乾固を繰り返して溶媒を除去する
ことにより、目的物の下記式
１−プロピニル）−２′，３′−ジデオキシ−７−デア
ザアデノシン−５′−トリホスフェート４ｍｇ［５μｍ
ｏｌ］を０．１Ｍ−ホウ酸ナトリウム緩衝液［ｐＨ８．
５］１４０μｌに溶解し、更に４％ビオチニル−Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミドエステルのジメチルホルムアミ
ド溶液１４０μｌを加え、遮光し、１．５ｍｌ容のエッ
ペンドルフ中に静置して室温で２時間反応させた。反応
混合液を精製水１ｍｌで希釈し同量のｎ−ブタノールを
加え、振とう、分液し、ブタノール層を除去した。この
操作を５回繰り返すことにより、下層の水層を約０．１
ｍｌまで濃縮した。残渣を弱アニオン交換樹脂［ＤＥＡ
ＥセファデックスＡ−２５、直径２ｃｍ、長さ１０ｃ
ｍ］のカラム上部に吸着させた。１０％エタノール含有
する炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液の塩濃度を
０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ［各２００
ｍｌ］と段階的に上げて通液した。塩濃度２００ｍＭで
溶出した留分を濃縮乾固し、残渣を５０％エタノール水
溶液に再溶解、濃縮、乾固を繰り返して溶媒を除去する
ことにより、目的物の下記式
【化２１】 で示される７−（Ｎ−ビオチニル−３−アミノ−１−プ
ロピニル）−２′，３′−ジデオキシ−７−デアザアデ
ノシン−５′−トリホスフェート２．３ｍｇ［２．２μ
ｍｏｌ］を得た。収率は４４％であった。
ロピニル）−２′，３′−ジデオキシ−７−デアザアデ
ノシン−５′−トリホスフェート２．３ｍｇ［２．２μ
ｍｏｌ］を得た。収率は４４％であった。
【００２１】1Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）、δ
ｐｐｍ ８．０４（１Ｈ，ｂｒｏｒｄ ｓ，２−Ｈ）、７．６０
（１Ｈ，ｓ，８−Ｈ）、６．３３（１Ｈ，ｂｒｏｒｄ
ｓ，１′−Ｈ）、４．５２（１Ｈ，ｍ，ＣＨ−ＮＨ）、
４．５−４．３（２Ｈ，ｍ，４′−Ｈ ａｎｄ ＣＨ−
ＮＨ）、４．３−３．８（４Ｈ，ｍ，５′−Ｈ ａｎｄ
Ｃ≡Ｃ−ＣＨ2）、３．２８（１Ｈ，ｍ，ＣＨＳ）、
２．９２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２ ａｎｄ ４．６Ｈ
ｚ，ＣＨ2Ｓ）、２．６９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２Ｈｚ，
ＣＨ2Ｓ）、２．６−１．９（６Ｈ，ｍ，２′−Ｈ，
３′−Ｈ ａｎｄ ＣＨ2ＣＯ）、１．８−１．２（６
Ｈ，ｍ，ＣＨ2）
ｐｐｍ ８．０４（１Ｈ，ｂｒｏｒｄ ｓ，２−Ｈ）、７．６０
（１Ｈ，ｓ，８−Ｈ）、６．３３（１Ｈ，ｂｒｏｒｄ
ｓ，１′−Ｈ）、４．５２（１Ｈ，ｍ，ＣＨ−ＮＨ）、
４．５−４．３（２Ｈ，ｍ，４′−Ｈ ａｎｄ ＣＨ−
ＮＨ）、４．３−３．８（４Ｈ，ｍ，５′−Ｈ ａｎｄ
Ｃ≡Ｃ−ＣＨ2）、３．２８（１Ｈ，ｍ，ＣＨＳ）、
２．９２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２ ａｎｄ ４．６Ｈ
ｚ，ＣＨ2Ｓ）、２．６９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２Ｈｚ，
ＣＨ2Ｓ）、２．６−１．９（６Ｈ，ｍ，２′−Ｈ，
３′−Ｈ ａｎｄ ＣＨ2ＣＯ）、１．８−１．２（６
Ｈ，ｍ，ＣＨ2）
【００２２】実施例２ 実験例２で得た式（１１）で示される５−（３−アミノ
−１−プロピニル）−２′，３′−ジデオキシシチジン
−５′−トリホスフェート５ｍｇ［６．４μｍｏｌ］か
ら、実施例１と同様の操作により、目的物の下記式
−１−プロピニル）−２′，３′−ジデオキシシチジン
−５′−トリホスフェート５ｍｇ［６．４μｍｏｌ］か
ら、実施例１と同様の操作により、目的物の下記式
【化２２】 で示される５−（Ｎ−ビオチニル−３−アミノ−１−プ
ロピニル）−２′，３′−ジデオキシシチジン−５′−
トリホスフェート２．６ｍｇ［２．６μｍｏｌ］を得
た。収率は４１％であった。
ロピニル）−２′，３′−ジデオキシシチジン−５′−
トリホスフェート２．６ｍｇ［２．６μｍｏｌ］を得
た。収率は４１％であった。
【００２３】1Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）、δ
ｐｐｍ ８．１０（１Ｈ，ｓ，６−Ｈ）、５．９６（１Ｈ，ｄ
ｄ，Ｊ＝６．５ ａｎｄ２．４Ｈｚ，１′−Ｈ）、６．
３３（１Ｈ，ｍ，１′−Ｈ）、４．４３（１Ｈ，ｄｄ，
Ｊ＝９．２ ａｎｄ ４．７Ｈｚ，ＣＨ−ＮＨ）、４．
４−４．０（６Ｈ，ｍ，４′−Ｈ，５′−Ｈ，ＣＨ−Ｎ
Ｈ ａｎｄ Ｃ≡Ｃ−ＣＨ2）、３．１５（１Ｈ，ｍ，
ＣＨＳ）、２．８１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．１ ａｎ
ｄ ４．９Ｈｚ，ＣＨ2Ｓ）、２．５９（１Ｈ，ｄ，Ｊ
＝１１Ｈｚ，ＣＨ2Ｓ）、２．５−１．９（６Ｈ，ｍ，
２′−Ｈ，３′−Ｈ ａｎｄ ＣＨ2ＣＯ）、１．９−
１．２（６Ｈ，ｍ，ＣＨ2）
ｐｐｍ ８．１０（１Ｈ，ｓ，６−Ｈ）、５．９６（１Ｈ，ｄ
ｄ，Ｊ＝６．５ ａｎｄ２．４Ｈｚ，１′−Ｈ）、６．
３３（１Ｈ，ｍ，１′−Ｈ）、４．４３（１Ｈ，ｄｄ，
Ｊ＝９．２ ａｎｄ ４．７Ｈｚ，ＣＨ−ＮＨ）、４．
４−４．０（６Ｈ，ｍ，４′−Ｈ，５′−Ｈ，ＣＨ−Ｎ
Ｈ ａｎｄ Ｃ≡Ｃ−ＣＨ2）、３．１５（１Ｈ，ｍ，
ＣＨＳ）、２．８１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．１ ａｎ
ｄ ４．９Ｈｚ，ＣＨ2Ｓ）、２．５９（１Ｈ，ｄ，Ｊ
＝１１Ｈｚ，ＣＨ2Ｓ）、２．５−１．９（６Ｈ，ｍ，
２′−Ｈ，３′−Ｈ ａｎｄ ＣＨ2ＣＯ）、１．９−
１．２（６Ｈ，ｍ，ＣＨ2）
【００２４】実施例３ 実験例３で得た式（１３）で示される７−（３−アミノ
−１−プロピニル）−２′，３′−ジデオキシ−７−デ
アザグアノシン−５′−トリホスフェート５ｇ［５．９
μｍｏｌ］から、実施例１と同様の操作により、目的物
の下記式
−１−プロピニル）−２′，３′−ジデオキシ−７−デ
アザグアノシン−５′−トリホスフェート５ｇ［５．９
μｍｏｌ］から、実施例１と同様の操作により、目的物
の下記式
【化２３】 で示される７−（Ｎ−ビオチニル−３−アミノ−１−プ
ロピニル）−２′，３′−ジデオキシ−７−デアザグア
ノシン−５′−トリホスフェート２ｇ［１．８μｍｏ
ｌ］を得た。収率は３１％であった。
ロピニル）−２′，３′−ジデオキシ−７−デアザグア
ノシン−５′−トリホスフェート２ｇ［１．８μｍｏ
ｌ］を得た。収率は３１％であった。
【００２５】1Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）、δ
ｐｐｍ ７．２７（１Ｈ，ｓ，８−Ｈ）、６．１５（１Ｈ，ｄ
ｄ，Ｊ＝６．０ ａｎｄ４．０Ｈｚ，１′−Ｈ）、４．
５−３．８（７Ｈ，ｍ，４′−Ｈ，５′−Ｈ，Ｃ≡Ｃ−
ＣＨ2，２ＣＨ−ＮＨ）、３．０９（１Ｈ，ｍ，ＣＨ
Ｓ）、２．７０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．６ ａｎｄ
５．１Ｈｚ，ＣＨ2Ｓ）、２．７−１．９（７Ｈ，ｍ，
ＣＨ2Ｓ，２′−Ｈ，３′−Ｈ ａｎｄ ＣＨ2ＣＯ）、
１．８−１．２（６Ｈ，ｍ，ＣＨ2）
ｐｐｍ ７．２７（１Ｈ，ｓ，８−Ｈ）、６．１５（１Ｈ，ｄ
ｄ，Ｊ＝６．０ ａｎｄ４．０Ｈｚ，１′−Ｈ）、４．
５−３．８（７Ｈ，ｍ，４′−Ｈ，５′−Ｈ，Ｃ≡Ｃ−
ＣＨ2，２ＣＨ−ＮＨ）、３．０９（１Ｈ，ｍ，ＣＨ
Ｓ）、２．７０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．６ ａｎｄ
５．１Ｈｚ，ＣＨ2Ｓ）、２．７−１．９（７Ｈ，ｍ，
ＣＨ2Ｓ，２′−Ｈ，３′−Ｈ ａｎｄ ＣＨ2ＣＯ）、
１．８−１．２（６Ｈ，ｍ，ＣＨ2）
【００２６】実施例４ 実験例４で得た式（１５）で示される５−（３−アミノ
−１−プロピニル）−２′，３′−ジデオキシウリジン
−５′−トリホスフェート５ｍｇ［６．４μｍｏｌ］か
ら、実施例１と同様の操作により、目的物の下記式
−１−プロピニル）−２′，３′−ジデオキシウリジン
−５′−トリホスフェート５ｍｇ［６．４μｍｏｌ］か
ら、実施例１と同様の操作により、目的物の下記式
【化２４】 で示される５−（Ｎ−ビオチニル−３−アミノ−１−プ
ロピニル）−２′，３′−ジデオキシウリジン−５′−
トリホスフェート１．３ｍｇ［１．３μｍｏｌ］を得
た。収率は２１％であった。
ロピニル）−２′，３′−ジデオキシウリジン−５′−
トリホスフェート１．３ｍｇ［１．３μｍｏｌ］を得
た。収率は２１％であった。
【００２７】1Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）、δ
ｐｐｍ ８．１０（１Ｈ，ｓ，６−Ｈ）、６．０２（１Ｈ，ｍ，
１′−Ｈ）、４．５１（１Ｈ，ｍ，ＣＨＮＨ）、４．４
−４．０（５Ｈ，ｍ，４′−Ｈ，５′−Ｈ，ＣＨ−ＮＨ
ａｎｄ Ｃ≡Ｃ−ＣＨ2）、３．２５（１Ｈ，ｍ，Ｃ
ＨＳ）、２．９０（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１４．０，６．
０ ａｎｄ ２Ｈｚ，ＣＨ2Ｓ）、２．６５（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝１４Ｈｚ，ＣＨ2Ｓ）、２．５−１．８（６
Ｈ，ｍ，２′−Ｈ，３′−Ｈ ａｎｄ ＣＨ2ＣＯ）、
１．８−１．２（６Ｈ，ｍ，ＣＨ2）
ｐｐｍ ８．１０（１Ｈ，ｓ，６−Ｈ）、６．０２（１Ｈ，ｍ，
１′−Ｈ）、４．５１（１Ｈ，ｍ，ＣＨＮＨ）、４．４
−４．０（５Ｈ，ｍ，４′−Ｈ，５′−Ｈ，ＣＨ−ＮＨ
ａｎｄ Ｃ≡Ｃ−ＣＨ2）、３．２５（１Ｈ，ｍ，Ｃ
ＨＳ）、２．９０（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１４．０，６．
０ ａｎｄ ２Ｈｚ，ＣＨ2Ｓ）、２．６５（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝１４Ｈｚ，ＣＨ2Ｓ）、２．５−１．８（６
Ｈ，ｍ，２′−Ｈ，３′−Ｈ ａｎｄ ＣＨ2ＣＯ）、
１．８−１．２（６Ｈ，ｍ，ＣＨ2）
【００２８】
【発明の効果】本発明によって、核酸の塩基とビオチン
との結合基としてα位に三重結合を有する−Ｃ≡Ｃ−Ｃ
Ｈ2−ＮＨ−を用いることにより、核酸の塩基配列決定
用のヌクレオチドに必要な機能を有する、ビオチンで標
識化されたアデニン、シトシン、グアニン、チミン４種
の塩基に対応するヌクレオチドを容易に調製することが
可能となる。
との結合基としてα位に三重結合を有する−Ｃ≡Ｃ−Ｃ
Ｈ2−ＮＨ−を用いることにより、核酸の塩基配列決定
用のヌクレオチドに必要な機能を有する、ビオチンで標
識化されたアデニン、シトシン、グアニン、チミン４種
の塩基に対応するヌクレオチドを容易に調製することが
可能となる。
Claims (1)
- 【請求項１】 下記一般式 【化１】 （式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、及びＲ4は、それぞれ独立に、
水素原子、ナトリウム原子、又はリチウム原子を表す。
ただし、ナトリウム原子とリチウム原子が同時に存在す
ることはなく、 Ａは、 【化２】 【化３】 【化４】 および、 【化５】 よりなる群から選らばれた基である。）で示される新規
なビオチン標識化ヌクレオチド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13253494A JPH07316174A (ja) | 1994-05-23 | 1994-05-23 | 新規なビオチン標識化ヌクレオチド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13253494A JPH07316174A (ja) | 1994-05-23 | 1994-05-23 | 新規なビオチン標識化ヌクレオチド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07316174A true JPH07316174A (ja) | 1995-12-05 |
Family
ID=15083531
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13253494A Pending JPH07316174A (ja) | 1994-05-23 | 1994-05-23 | 新規なビオチン標識化ヌクレオチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07316174A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2018123773A1 (ja) * | 2016-12-26 | 2019-10-31 | 東レ株式会社 | 感光性樹脂組成物、およびそれを含む感光性樹脂印刷版原版 |
-
1994
- 1994-05-23 JP JP13253494A patent/JPH07316174A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2018123773A1 (ja) * | 2016-12-26 | 2019-10-31 | 東レ株式会社 | 感光性樹脂組成物、およびそれを含む感光性樹脂印刷版原版 |
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