JPH07289292A - 増殖活性付与能力の測定方法 - Google Patents
増殖活性付与能力の測定方法Info
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- JPH07289292A JPH07289292A JP6114387A JP11438794A JPH07289292A JP H07289292 A JPH07289292 A JP H07289292A JP 6114387 A JP6114387 A JP 6114387A JP 11438794 A JP11438794 A JP 11438794A JP H07289292 A JPH07289292 A JP H07289292A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 血清等の被検試料が免疫調節因子感受性培養
細胞に与える増殖活性付与能力を測定する方法を提供す
る。 【構成】 被検試料の存在下で免疫調節因子感受性培養
細胞を培養し、被検試料が前記培養細胞に与える増殖活
性付与能力を測定する。 【効果】 放射性同位元素を用いないで、感度及び再現
性の高い、免疫能の測定が可能であり、癌等の免疫疾患
患者の免疫能を測定し、免疫疾患の診断に利用できる。
細胞に与える増殖活性付与能力を測定する方法を提供す
る。 【構成】 被検試料の存在下で免疫調節因子感受性培養
細胞を培養し、被検試料が前記培養細胞に与える増殖活
性付与能力を測定する。 【効果】 放射性同位元素を用いないで、感度及び再現
性の高い、免疫能の測定が可能であり、癌等の免疫疾患
患者の免疫能を測定し、免疫疾患の診断に利用できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、血清等の被検試料が免
疫調節因子感受性培養細胞に与える増殖活性付与能力を
測定する方法に関する。本発明方法によって増殖活性付
与能力を測定することにより、患者の免疫能を測定し、
免疫疾患の診断に利用することができる。
疫調節因子感受性培養細胞に与える増殖活性付与能力を
測定する方法に関する。本発明方法によって増殖活性付
与能力を測定することにより、患者の免疫能を測定し、
免疫疾患の診断に利用することができる。
【０００２】
【従来の技術】疾病を有する患者の免疫能低下の指標と
して、従来から臨床的に利用されているものの代表例を
挙げれば、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）試験としてはＰＰ
Ｄ（精製タンパク質誘導体：ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｒｏ
ｔｅｉｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）皮内反応やＤＮＣ
Ｂ（２，４−ジニトロクロロベンゼン）皮膚反応などの
遅延型皮膚反応があり、生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）試験
としては末梢血中の白血球数の計数、モノクロナール抗
体による末梢血リンパ球サブセットの計数、植物性赤血
球凝集素（ＰＨＡ）に対する末梢血リンパ球の幼若化率
の測定、血清中のＩＡＰ（免疫抑制性酸性タンパク質：
Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ａｃｉｄｉｃ
ｐｒｏｔｅｉｎ）含量の測定、あるいはＳＩ（Ｓｔｉｍ
ｕｌａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ）の測定（血清中の抑制因
子をマウス脾細胞幼若化反応で測定）などがあった。
して、従来から臨床的に利用されているものの代表例を
挙げれば、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）試験としてはＰＰ
Ｄ（精製タンパク質誘導体：ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｒｏ
ｔｅｉｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）皮内反応やＤＮＣ
Ｂ（２，４−ジニトロクロロベンゼン）皮膚反応などの
遅延型皮膚反応があり、生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）試験
としては末梢血中の白血球数の計数、モノクロナール抗
体による末梢血リンパ球サブセットの計数、植物性赤血
球凝集素（ＰＨＡ）に対する末梢血リンパ球の幼若化率
の測定、血清中のＩＡＰ（免疫抑制性酸性タンパク質：
Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ａｃｉｄｉｃ
ｐｒｏｔｅｉｎ）含量の測定、あるいはＳＩ（Ｓｔｉｍ
ｕｌａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ）の測定（血清中の抑制因
子をマウス脾細胞幼若化反応で測定）などがあった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、生体の
免疫学的防御機構は複雑であり、単一の指標のみに患者
の免疫能を反映させることは極めて困難である。特に、
癌のような悪性疾患の場合には、宿主の免疫状態がその
臨床経過や予後に密接に係わっているが、従来、患者の
免疫能及び予後を的確に把握することのできる免疫学的
指標は知られておらず、その開発が切に望まれていた。
免疫学的防御機構は複雑であり、単一の指標のみに患者
の免疫能を反映させることは極めて困難である。特に、
癌のような悪性疾患の場合には、宿主の免疫状態がその
臨床経過や予後に密接に係わっているが、従来、患者の
免疫能及び予後を的確に把握することのできる免疫学的
指標は知られておらず、その開発が切に望まれていた。
【０００４】本発明者は、この課題を解決すべく鋭意研
究した結果、或る種の増殖因子依存性の免疫系培養細胞
株の増殖反応が、患者体液中の免疫調節因子に強く影響
されることを見出し、増殖反応速度の変化を調べること
により患者体液中の免疫能を判断し、更に患者の免疫疾
患の診断に利用することができることを見出した。本発
明は、こうした知見に基づくものである。
究した結果、或る種の増殖因子依存性の免疫系培養細胞
株の増殖反応が、患者体液中の免疫調節因子に強く影響
されることを見出し、増殖反応速度の変化を調べること
により患者体液中の免疫能を判断し、更に患者の免疫疾
患の診断に利用することができることを見出した。本発
明は、こうした知見に基づくものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】従って、本発明は、被検
試料の存在下で免疫調節因子感受性培養細胞を培養し、
被検試料が前記培養細胞に与える増殖活性付与能力を測
定する方法に関する。
試料の存在下で免疫調節因子感受性培養細胞を培養し、
被検試料が前記培養細胞に与える増殖活性付与能力を測
定する方法に関する。
【０００６】免疫機能の変化に伴う疾患では、多くの場
合、その患者体液中に免疫機能に影響を及ぼす各種の物
質、すなわち免疫調節因子が含まれている。例えば、免
疫機能の低下を伴う癌においては、患者血清中に免疫機
能を抑制する活性が認められる。しかしながら、免疫応
答には多くの反応が含まれ、免疫抑制因子に対する感受
性は、それぞれの免疫反応によって異なっている。本発
明者は、これら各種の免疫応答の過程で起こる種々の反
応に関与する免疫調節因子、例えば免疫抑制因子に対し
て、免疫調節因子感受性培養細胞（特にはＴ細胞系培養
細胞）が高い感受性を有しており、前記免疫調節因子の
存在下では前記免疫調節因子感受性培養細胞の増殖反応
（特にサイトカイン依存性の増殖反応）が顕著な影響を
受けることを見出し、更に、その増殖反応の変化を測定
することにより、逆に免疫調節因子の作用を判断するこ
とができることを見出した。
合、その患者体液中に免疫機能に影響を及ぼす各種の物
質、すなわち免疫調節因子が含まれている。例えば、免
疫機能の低下を伴う癌においては、患者血清中に免疫機
能を抑制する活性が認められる。しかしながら、免疫応
答には多くの反応が含まれ、免疫抑制因子に対する感受
性は、それぞれの免疫反応によって異なっている。本発
明者は、これら各種の免疫応答の過程で起こる種々の反
応に関与する免疫調節因子、例えば免疫抑制因子に対し
て、免疫調節因子感受性培養細胞（特にはＴ細胞系培養
細胞）が高い感受性を有しており、前記免疫調節因子の
存在下では前記免疫調節因子感受性培養細胞の増殖反応
（特にサイトカイン依存性の増殖反応）が顕著な影響を
受けることを見出し、更に、その増殖反応の変化を測定
することにより、逆に免疫調節因子の作用を判断するこ
とができることを見出した。
【０００７】本発明方法で用いる被検試料は、免疫能を
測定すべき試料であれば特に制限されるものではない
が、例えば、生物学的液体試料、特にはヒト等の血液、
血清、血漿、髄液、尿、腹水又は胸水等である。これら
の試料をそのまま又は場合により生理食塩水、緩衝液又
は培養液等で希釈して用いる。本発明方法では、これら
の被検試料の存在下で免疫調節因子感受性培養細胞を培
養し、被検試料が前記免疫調節因子感受性培養細胞に与
える増殖活性付与能力を測定する。サイトカイン依存性
の免疫調節因子感受性増殖性を示す培養細胞を用い、サ
イトカイン及び被検試料の存在下で増殖反応を実施する
と、増殖反応に対する被検試料の影響を高感度で測定す
ることができるので好ましい。また、ここで、増殖活性
付与能力とは、被検試料中に含まれる免疫調節因子が免
疫調節因子感受性培養細胞の増殖に影響を与える能力で
あり、具体的には増殖抑制能や増殖亢進能である。
測定すべき試料であれば特に制限されるものではない
が、例えば、生物学的液体試料、特にはヒト等の血液、
血清、血漿、髄液、尿、腹水又は胸水等である。これら
の試料をそのまま又は場合により生理食塩水、緩衝液又
は培養液等で希釈して用いる。本発明方法では、これら
の被検試料の存在下で免疫調節因子感受性培養細胞を培
養し、被検試料が前記免疫調節因子感受性培養細胞に与
える増殖活性付与能力を測定する。サイトカイン依存性
の免疫調節因子感受性増殖性を示す培養細胞を用い、サ
イトカイン及び被検試料の存在下で増殖反応を実施する
と、増殖反応に対する被検試料の影響を高感度で測定す
ることができるので好ましい。また、ここで、増殖活性
付与能力とは、被検試料中に含まれる免疫調節因子が免
疫調節因子感受性培養細胞の増殖に影響を与える能力で
あり、具体的には増殖抑制能や増殖亢進能である。
【０００８】本発明方法で用いることのできる免疫調節
因子感受性培養細胞は、その増殖反応が被検試料中の免
疫調節因子によって影響を受ける細胞であれば特に制限
されないが、サイトカイン依存性の増殖を示す免疫調節
因子感受性培養細胞は、生体内の免疫応答を反映してい
ること及び免疫調節因子に対する感受性が高いので好ま
しい。サイトカイン依存性の増殖を示す免疫調節因子感
受性培養細胞は、多くのものが知られている（蛋白質・
核酸・酵素、３５、８７５、１９９０）。なかでもイン
ターロイキン２（略称はＩＬ−２）依存性増殖を示す免
疫調節因子感受性培養細胞は、インターロイキン２が生
体内の多くの免疫反応において、極めて重要な役割を果
たしている点で好ましく、例えば、マウス由来のＣＴＬ
Ｌ−２若しくはＨＴ−２、ヒト由来のＩＬＴ−Ｍａｔ若
しくはＫＯＡ−１等を用いることができる。これらの培
養細胞は各種の微生物寄託機関等から簡単に入手するこ
とができ、例えば、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙ
ｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）や理化
学研究所細胞銀行からマウス由来のＣＴＬＬ−２〔ＡＴ
ＣＣ ＴＩＢ２１４〕〔ＲＣＢ６３７〕は分譲されてい
る。また、これらの性質を有する培養細胞を公知の方法
に従って新たに樹立することも可能である。
因子感受性培養細胞は、その増殖反応が被検試料中の免
疫調節因子によって影響を受ける細胞であれば特に制限
されないが、サイトカイン依存性の増殖を示す免疫調節
因子感受性培養細胞は、生体内の免疫応答を反映してい
ること及び免疫調節因子に対する感受性が高いので好ま
しい。サイトカイン依存性の増殖を示す免疫調節因子感
受性培養細胞は、多くのものが知られている（蛋白質・
核酸・酵素、３５、８７５、１９９０）。なかでもイン
ターロイキン２（略称はＩＬ−２）依存性増殖を示す免
疫調節因子感受性培養細胞は、インターロイキン２が生
体内の多くの免疫反応において、極めて重要な役割を果
たしている点で好ましく、例えば、マウス由来のＣＴＬ
Ｌ−２若しくはＨＴ−２、ヒト由来のＩＬＴ−Ｍａｔ若
しくはＫＯＡ−１等を用いることができる。これらの培
養細胞は各種の微生物寄託機関等から簡単に入手するこ
とができ、例えば、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙ
ｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）や理化
学研究所細胞銀行からマウス由来のＣＴＬＬ−２〔ＡＴ
ＣＣ ＴＩＢ２１４〕〔ＲＣＢ６３７〕は分譲されてい
る。また、これらの性質を有する培養細胞を公知の方法
に従って新たに樹立することも可能である。
【０００９】本発明方法における培養細胞の増殖過程
は、一般の試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）培養において
通常一般的に用いられる培養条件によって行うことがで
き、被検試料（又はコントロール用標準試料等）を加え
る点が異なるだけである。また、サイトカイン依存性培
養細胞を用いる場合には、そのサイトカイン又はそれと
同等の活性を有する成分を、通常の添加量で添加する。
例えば、ＣＴＬＬ−２を用いる場合にも、通常一般的に
用いられる培養条件によって行うことができ、培養液の
組成等を多少変更することも可能であるが、ヒト又はマ
ウスのＩＬ−２又はそれと同等の活性を有する成分を添
加する。被検試料の添加量は、予め予備試験を行い、被
検試料添加依存性を示す範囲を添加量とする。
は、一般の試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）培養において
通常一般的に用いられる培養条件によって行うことがで
き、被検試料（又はコントロール用標準試料等）を加え
る点が異なるだけである。また、サイトカイン依存性培
養細胞を用いる場合には、そのサイトカイン又はそれと
同等の活性を有する成分を、通常の添加量で添加する。
例えば、ＣＴＬＬ−２を用いる場合にも、通常一般的に
用いられる培養条件によって行うことができ、培養液の
組成等を多少変更することも可能であるが、ヒト又はマ
ウスのＩＬ−２又はそれと同等の活性を有する成分を添
加する。被検試料の添加量は、予め予備試験を行い、被
検試料添加依存性を示す範囲を添加量とする。
【００１０】測定に用いる細胞としては、継代後２〜１
０日目の細胞が増殖能が高く、安定した結果を得ること
ができる点で好ましく、２〜５日目のものが増殖能力が
とりわけ高い点で特に好ましい。測定を行う場合には、
使用する免疫調節因子感受性培養細胞の濃度が培養期間
中に過度の増殖によって増殖が低下しないようにするの
が好ましく、例えば、ＣＴＬＬ−２細胞の場合には、培
養期間中におよそ１×１０6 ｃｅｌｌｓ／ｍｌを越えな
いことが望ましい。一方、測定時の細胞数が少ないと測
定感度が低下するので、一定の範囲内となるように培養
開始時の細胞濃度を調節する必要がある。測定時の培養
期間は、有意な差が生じる点で２〜４日が好ましく、例
えばＣＴＬＬ−２細胞を用いて２日間の培養で測定を行
う場合には、細胞の初濃度を１×１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍ
ｌ前後とするのがよい。ＣＴＬＬ−２細胞ではＩＬ−２
の添加量に依存して細胞数の増加が見られる。従って、
ＩＬ−２添加量も測定の目的に合わせて調節する必要が
ある。一般的にＣＴＬＬ−２の十分な増殖が見られ、か
つＩＬ−２が過剰となって測定の感度が低下しない範囲
とするのがよい。
０日目の細胞が増殖能が高く、安定した結果を得ること
ができる点で好ましく、２〜５日目のものが増殖能力が
とりわけ高い点で特に好ましい。測定を行う場合には、
使用する免疫調節因子感受性培養細胞の濃度が培養期間
中に過度の増殖によって増殖が低下しないようにするの
が好ましく、例えば、ＣＴＬＬ−２細胞の場合には、培
養期間中におよそ１×１０6 ｃｅｌｌｓ／ｍｌを越えな
いことが望ましい。一方、測定時の細胞数が少ないと測
定感度が低下するので、一定の範囲内となるように培養
開始時の細胞濃度を調節する必要がある。測定時の培養
期間は、有意な差が生じる点で２〜４日が好ましく、例
えばＣＴＬＬ−２細胞を用いて２日間の培養で測定を行
う場合には、細胞の初濃度を１×１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍ
ｌ前後とするのがよい。ＣＴＬＬ−２細胞ではＩＬ−２
の添加量に依存して細胞数の増加が見られる。従って、
ＩＬ−２添加量も測定の目的に合わせて調節する必要が
ある。一般的にＣＴＬＬ−２の十分な増殖が見られ、か
つＩＬ−２が過剰となって測定の感度が低下しない範囲
とするのがよい。
【００１１】培養後に、被検試料の増殖活性付与能力、
すなわち細胞増殖速度に与える影響を測定する。具体的
には、細胞数の計測、 3Ｈーチミジン取り込み量の測
定、又はＭＴＴ〔３−（４，５−ジメチルチアゾール−
２−イル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムブロ
マイド〕アッセイ等を用いることができる。測定効率が
優れているので、 3Ｈ−チミジン取り込み量の測定及び
ＭＴＴアッセイが好ましい。ＭＴＴアッセイの種々の改
良法、例えば、ＸＴＴ〔２，３−ビス（２−メトキシ−
４−ニトロ−５−スルホフェニル）−５−〔（フェニル
アミノ）カルボニル〕−２Ｈ−テトラゾリウムヒドロキ
シド〕や、ＷＳＴ−１〔４−〔３−（４−ヨウドフェニ
ル−２−（４−ニトロフェニル）−２Ｈ−５−テトラゾ
リオ〕−１，３−ベンゼンジスルフォネートのナトリウ
ム塩〕等を用いる測定方法のいずれも使用することがで
きる。
すなわち細胞増殖速度に与える影響を測定する。具体的
には、細胞数の計測、 3Ｈーチミジン取り込み量の測
定、又はＭＴＴ〔３−（４，５−ジメチルチアゾール−
２−イル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムブロ
マイド〕アッセイ等を用いることができる。測定効率が
優れているので、 3Ｈ−チミジン取り込み量の測定及び
ＭＴＴアッセイが好ましい。ＭＴＴアッセイの種々の改
良法、例えば、ＸＴＴ〔２，３−ビス（２−メトキシ−
４−ニトロ−５−スルホフェニル）−５−〔（フェニル
アミノ）カルボニル〕−２Ｈ−テトラゾリウムヒドロキ
シド〕や、ＷＳＴ−１〔４−〔３−（４−ヨウドフェニ
ル−２−（４−ニトロフェニル）−２Ｈ−５−テトラゾ
リオ〕−１，３−ベンゼンジスルフォネートのナトリウ
ム塩〕等を用いる測定方法のいずれも使用することがで
きる。
【００１２】本発明では均一な免疫調節因子感受性培養
細胞を使用するので、 3Ｈ−チミジン取り込み量測定法
及びＭＴＴアッセイ等によって高い測定感度が得られ
る。ＭＴＴアッセイの場合、通常Ａ570 −Ａ630 の測定
値を用いて結果を評価するが、測定回により反応性が若
干変動するので、常に同一の陽性対照を同時に測定して
補正し、この変動の影響を少なくすることができる。本
発明に類似する免疫診断法として、マウス脾細胞を用い
る方法（Ｈａｔｔｏｒｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ；Ｊｐｎ．
Ｊ．Ｓｕｒｇ．，２０、１２７ー１３６、１９９０）が
報告されているが、この従来法と比較した場合、本発明
方法は、以下の点で優れている。 （１）免疫調節因子に対する感受性が高いので、精度及
び感度が良い。 （２）培養細胞を用いるので、均一な応答性の細胞集団
が得られ、再現性が良い。 （３）動物を使用しないので、飼育施設がなくても実施
することができ、汎用性がある。
細胞を使用するので、 3Ｈ−チミジン取り込み量測定法
及びＭＴＴアッセイ等によって高い測定感度が得られ
る。ＭＴＴアッセイの場合、通常Ａ570 −Ａ630 の測定
値を用いて結果を評価するが、測定回により反応性が若
干変動するので、常に同一の陽性対照を同時に測定して
補正し、この変動の影響を少なくすることができる。本
発明に類似する免疫診断法として、マウス脾細胞を用い
る方法（Ｈａｔｔｏｒｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ；Ｊｐｎ．
Ｊ．Ｓｕｒｇ．，２０、１２７ー１３６、１９９０）が
報告されているが、この従来法と比較した場合、本発明
方法は、以下の点で優れている。 （１）免疫調節因子に対する感受性が高いので、精度及
び感度が良い。 （２）培養細胞を用いるので、均一な応答性の細胞集団
が得られ、再現性が良い。 （３）動物を使用しないので、飼育施設がなくても実施
することができ、汎用性がある。
【００１３】
【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。実施例１ （１）ＣＴＬＬ−２細胞の継代 ＲＰＭＩ１６４０培地に、牛胎児血清を１０％、２−メ
ルカプトエタノールを５×１０-5Ｍ、ゲンタマイシンを
５０μｇ／ｍｌ、マウスｒＩＬ−２（Ｇｅｎｚｙｍｅ
社）を２０ｕｎｉｔｓ／ｍｌとなるように加えて調製し
た培養液を用い、３７℃のＣＯ2 インキュベーター（Ｃ
Ｏ2 ５％；空気９５％）中でＣＴＬＬ−２（ＲＣＢ６３
７：理化学研究所細胞銀行から分譲を受けた）を培養し
た。継代は３〜４日間隔で行い、細胞数が１×１０6 ｃ
ｅｌｌｓ／ｍｌを越えないよう、継代時の細胞数を調整
した。
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。実施例１ （１）ＣＴＬＬ−２細胞の継代 ＲＰＭＩ１６４０培地に、牛胎児血清を１０％、２−メ
ルカプトエタノールを５×１０-5Ｍ、ゲンタマイシンを
５０μｇ／ｍｌ、マウスｒＩＬ−２（Ｇｅｎｚｙｍｅ
社）を２０ｕｎｉｔｓ／ｍｌとなるように加えて調製し
た培養液を用い、３７℃のＣＯ2 インキュベーター（Ｃ
Ｏ2 ５％；空気９５％）中でＣＴＬＬ−２（ＲＣＢ６３
７：理化学研究所細胞銀行から分譲を受けた）を培養し
た。継代は３〜４日間隔で行い、細胞数が１×１０6 ｃ
ｅｌｌｓ／ｍｌを越えないよう、継代時の細胞数を調整
した。
【００１４】（２）ヒト血清がＣＴＬＬ−２増殖に及ぼ
す影響の測定 癌患者（２４例）若しくは健常人（２１例）からの血清
又は牛胎児血清を培養液（ＲＰＭＩ１６４０培地に２−
メルカプトエタノールを５×１０-5Ｍ及びゲンタマイシ
ンを５０μｇ／ｍｌとなるように加えて調製：以下培養
液と略す）で希釈して得た各種の稀釈液を９６穴平底マ
イクロプレートの各穴に入れ、ＣＴＬＬ−２細胞浮遊
液、さらにマウスｒＩＬ−２を加えて、３７℃のＣＯ2
インキュベーター中にて培養した。細胞濃度は１×１０
5 ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、マウスｒＩＬ−２濃度は１０ｕｎ
ｉｔｓ／ｍｌとし、各穴の液量が１００μｌとなるよう
調整した。なお、ＣＴＬＬ−２細胞としては、前記
（１）の方法で維持継代している細胞を１×１０5 ｃｅ
ｌｌｓ／ｍｌの濃度にして培養を行い、２日目に回収し
て、培養液にて３回遠心洗浄した細胞を用いた。
す影響の測定 癌患者（２４例）若しくは健常人（２１例）からの血清
又は牛胎児血清を培養液（ＲＰＭＩ１６４０培地に２−
メルカプトエタノールを５×１０-5Ｍ及びゲンタマイシ
ンを５０μｇ／ｍｌとなるように加えて調製：以下培養
液と略す）で希釈して得た各種の稀釈液を９６穴平底マ
イクロプレートの各穴に入れ、ＣＴＬＬ−２細胞浮遊
液、さらにマウスｒＩＬ−２を加えて、３７℃のＣＯ2
インキュベーター中にて培養した。細胞濃度は１×１０
5 ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、マウスｒＩＬ−２濃度は１０ｕｎ
ｉｔｓ／ｍｌとし、各穴の液量が１００μｌとなるよう
調整した。なお、ＣＴＬＬ−２細胞としては、前記
（１）の方法で維持継代している細胞を１×１０5 ｃｅ
ｌｌｓ／ｍｌの濃度にして培養を行い、２日目に回収し
て、培養液にて３回遠心洗浄した細胞を用いた。
【００１５】４４時間培養後、ＭＴＴ〔３−（４，５−
ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル
−テトラゾリウムブロマイド〕を５ｍｇ／ｍｌの濃度と
なるようにリン酸緩衝生理食塩水に溶解して調製した液
１５μｌずつを各穴に加え、さらに４時間培養した。培
養終了後、各穴に４０ｍＭ塩酸酸性イソプロパノール２
００μｌを加え、生成したフォルマザンをピペッティン
グして溶解し、各穴の吸光度（Ａ570 −Ａ630 ）を分光
光度計（Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ＲｅａｄｅｒＭｏｄｅ
ｌ ３５５０；ＢＩＯ−ＲＡＤ）で測定した。牛胎児血
清を最終濃度が１０％となるように加えて稀釈液を調製
した標準群の吸光度を１００とし、それに対する百分率
によって各実験群の吸光度を求め、その結果を図１に示
した。図１の実線は癌患者血清の結果、破線は健常人血
清の結果を示す。なお、図１の横軸は対数目盛りであ
る。
ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル
−テトラゾリウムブロマイド〕を５ｍｇ／ｍｌの濃度と
なるようにリン酸緩衝生理食塩水に溶解して調製した液
１５μｌずつを各穴に加え、さらに４時間培養した。培
養終了後、各穴に４０ｍＭ塩酸酸性イソプロパノール２
００μｌを加え、生成したフォルマザンをピペッティン
グして溶解し、各穴の吸光度（Ａ570 −Ａ630 ）を分光
光度計（Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ＲｅａｄｅｒＭｏｄｅ
ｌ ３５５０；ＢＩＯ−ＲＡＤ）で測定した。牛胎児血
清を最終濃度が１０％となるように加えて稀釈液を調製
した標準群の吸光度を１００とし、それに対する百分率
によって各実験群の吸光度を求め、その結果を図１に示
した。図１の実線は癌患者血清の結果、破線は健常人血
清の結果を示す。なお、図１の横軸は対数目盛りであ
る。
【００１６】図１から明らかなように、血清添加量０．
３〜１．２５％の範囲で、癌患者血清には健常人に比べ
有意のＣＴＬＬ−２増殖の抑制がみられた。すなわち、
癌患者血清中の免疫抑制活性を本発明の測定法により評
価することができる。
３〜１．２５％の範囲で、癌患者血清には健常人に比べ
有意のＣＴＬＬ−２増殖の抑制がみられた。すなわち、
癌患者血清中の免疫抑制活性を本発明の測定法により評
価することができる。
【００１７】実施例２ （１）ＫＯＡ−１細胞の継代 ＲＰＭＩ１６４０培地に、牛胎児血清を１０％、２−メ
ルカプトエタノールを５×１０-5Ｍ、ゲンタマイシンを
５０μｇ／ｍｌ、そしてヒトｒＩＬ−２（Ｇｅｎｚｙｍ
ｅ社）を３００ｕｎｉｔｓ／ｍｌとなるように加えて調
製した培養液を用い、３７℃のＣＯ2 インキュベーター
（ＣＯ2 ５％，空気９５％）中で、ヒト末梢血リンパ球
より樹立したＩＬ−２依存性細胞株ＫＯＡ−１細胞（Ｆ
ＥＲＭＢＰ−４６３１）を培養した。継代は３〜７日間
隔で行い、細胞数が常に１〜１５×１０5 ｃｅｌｌｓ／
ｍｌの範囲となるように、継代時の細胞数を調整した。
ルカプトエタノールを５×１０-5Ｍ、ゲンタマイシンを
５０μｇ／ｍｌ、そしてヒトｒＩＬ−２（Ｇｅｎｚｙｍ
ｅ社）を３００ｕｎｉｔｓ／ｍｌとなるように加えて調
製した培養液を用い、３７℃のＣＯ2 インキュベーター
（ＣＯ2 ５％，空気９５％）中で、ヒト末梢血リンパ球
より樹立したＩＬ−２依存性細胞株ＫＯＡ−１細胞（Ｆ
ＥＲＭＢＰ−４６３１）を培養した。継代は３〜７日間
隔で行い、細胞数が常に１〜１５×１０5 ｃｅｌｌｓ／
ｍｌの範囲となるように、継代時の細胞数を調整した。
【００１８】（２）ヒト血清がＫＯＡ−１細胞増殖に及
ぼす影響の測定 予め実施例１の方法に従って測定を行い、免疫抑制活性
を示すことが判明していた癌患者血清（検体Ａ）と、健
常人の血清（検体Ｂ）を、培養液（ＲＰＭＩ１６４０培
地に２−メルカプトエタノールを５×１０-5Ｍ及びゲン
タマイシンを５０μｇ／ｍｌとなるように加えて調製：
以下、培養液と略す）で希釈して得た各種の希釈液を、
９６穴平底マイクロプレートの各穴に入れ、ＫＯＡ−１
細胞浮遊液、更にヒトｒＩＬ−２を加えて、３７℃のＣ
Ｏ2 インキュベーター中にて培養した。細胞濃度は２×
１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、ヒトｒＩＬ−２濃度は３００
ｕｎｉｔｓ／ｍｌとし、各穴の液量が１００μｌとなる
ように調整した。なお、ＫＯＡ−１細胞としては、前記
実施例２（１）の方法で維持継代し、継代細胞を培養液
にて遠心洗浄した細胞を用いた。
ぼす影響の測定 予め実施例１の方法に従って測定を行い、免疫抑制活性
を示すことが判明していた癌患者血清（検体Ａ）と、健
常人の血清（検体Ｂ）を、培養液（ＲＰＭＩ１６４０培
地に２−メルカプトエタノールを５×１０-5Ｍ及びゲン
タマイシンを５０μｇ／ｍｌとなるように加えて調製：
以下、培養液と略す）で希釈して得た各種の希釈液を、
９６穴平底マイクロプレートの各穴に入れ、ＫＯＡ−１
細胞浮遊液、更にヒトｒＩＬ−２を加えて、３７℃のＣ
Ｏ2 インキュベーター中にて培養した。細胞濃度は２×
１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、ヒトｒＩＬ−２濃度は３００
ｕｎｉｔｓ／ｍｌとし、各穴の液量が１００μｌとなる
ように調整した。なお、ＫＯＡ−１細胞としては、前記
実施例２（１）の方法で維持継代し、継代細胞を培養液
にて遠心洗浄した細胞を用いた。
【００１９】３日間培養した後、〔６− 3Ｈ〕チミジン
（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を７４０ＫＢｑ／ｍｌの濃度と
なるように培養液にて希釈した溶液２５μｌずつを各穴
に加え、更に１日培養した。培養終了後、セルハーベス
ター（ケンブリッジテクノロジー社製）を用い、常法に
従って細胞をグラスファイバーフィルター上に回収し、
シンチレーター（ＮＥＮ社製；Ａｑｕａｓｏｌ II ）を
加えた液体シンチレーションカウンターにて放射活性を
測定した。結果は図２に示すとおりであった。図２から
明らかなように、血清添加量０．３〜５．０％の範囲で
検体Ａ（図２の○）と検体Ｂ（図２の●）との間に有意
な差が認められた。すなわち、本実施例の方法によって
も、実施例１の場合と同様に、癌患者血清中の免疫抑制
活性を評価することができる。
（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を７４０ＫＢｑ／ｍｌの濃度と
なるように培養液にて希釈した溶液２５μｌずつを各穴
に加え、更に１日培養した。培養終了後、セルハーベス
ター（ケンブリッジテクノロジー社製）を用い、常法に
従って細胞をグラスファイバーフィルター上に回収し、
シンチレーター（ＮＥＮ社製；Ａｑｕａｓｏｌ II ）を
加えた液体シンチレーションカウンターにて放射活性を
測定した。結果は図２に示すとおりであった。図２から
明らかなように、血清添加量０．３〜５．０％の範囲で
検体Ａ（図２の○）と検体Ｂ（図２の●）との間に有意
な差が認められた。すなわち、本実施例の方法によって
も、実施例１の場合と同様に、癌患者血清中の免疫抑制
活性を評価することができる。
【００２０】
【発明の効果】本発明方法によれば、感度及び再現性の
高い、免疫能の測定が可能であり 癌、感染症、自己免
疫疾患等の免疫疾患患者の免疫能を測定し、免疫疾患の
診断に利用することができる。
高い、免疫能の測定が可能であり 癌、感染症、自己免
疫疾患等の免疫疾患患者の免疫能を測定し、免疫疾患の
診断に利用することができる。
【図１】癌患者血清がＣＴＬＬ−２細胞の増殖を抑制す
る結果を示すグラフである。
る結果を示すグラフである。
【図２】癌患者血清がＫＯＡ−１細胞の増殖を抑制する
結果を示すグラフである。
結果を示すグラフである。
Claims (6)
- 【請求項１】 被検試料の存在下で免疫調節因子感受性
培養細胞を培養し、被検試料が前記培養細胞に与える増
殖活性付与能力を測定する方法。 - 【請求項２】 免疫調節因子感受性培養細胞がサイトカ
イン依存性増殖を示す培養細胞である請求項１に記載の
方法。 - 【請求項３】 サイトカイン依存性増殖を示す免疫調節
因子感受性培養細胞がインターロイキン２依存性増殖を
示す培養細胞である請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 インターロイキン２依存性増殖を示す免
疫調節因子感受性培養細胞がマウス由来ＣＴＬＬ−２で
ある請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 インターロイキン２依存性増殖を示す免
疫調節因子感受性培養細胞がヒト由来ＫＯＡ−１である
請求項３に記載の方法。 - 【請求項６】 増殖活性付与能力を、細胞数計数、放射
性同位元素取り込み、又は酵素反応により定量する請求
項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6114387A JP2837093B2 (ja) | 1994-04-28 | 1994-04-28 | 増殖活性付与能力の測定方法 |
| CA002147801A CA2147801A1 (en) | 1994-04-28 | 1995-04-25 | Method for determining capability of imparting growth activity |
| AU17633/95A AU673486B2 (en) | 1994-04-28 | 1995-04-26 | Method for determining capability of imparting growth activity |
| EP95106191A EP0679888A3 (en) | 1994-04-28 | 1995-04-26 | Method for determining the ability to generate growth activity. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6114387A JP2837093B2 (ja) | 1994-04-28 | 1994-04-28 | 増殖活性付与能力の測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07289292A true JPH07289292A (ja) | 1995-11-07 |
| JP2837093B2 JP2837093B2 (ja) | 1998-12-14 |
Family
ID=14636407
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6114387A Expired - Fee Related JP2837093B2 (ja) | 1994-04-28 | 1994-04-28 | 増殖活性付与能力の測定方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0679888A3 (ja) |
| JP (1) | JP2837093B2 (ja) |
| AU (1) | AU673486B2 (ja) |
| CA (1) | CA2147801A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3760250B2 (ja) * | 1995-12-21 | 2006-03-29 | マルキンバイオ株式会社 | 硫酸抱合型胆汁酸の定量法及びそのキット |
| GB0704515D0 (en) * | 2007-03-08 | 2007-04-18 | Cambridge Entpr Ltd | Diagnosing psychotic disorders |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0246298A (ja) * | 1988-06-23 | 1990-02-15 | Atomic Energy Canada Ltd | 潜在的毒性の試剤に対する有機体の感性の決定法 |
| JP3040451B2 (ja) * | 1990-10-31 | 2000-05-15 | 昌之 宮坂 | モノクローナル抗体 |
| JPH06116290A (ja) * | 1991-04-18 | 1994-04-26 | Bio Material Kenkyusho:Kk | 造血調節因子 |
-
1994
- 1994-04-28 JP JP6114387A patent/JP2837093B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-04-25 CA CA002147801A patent/CA2147801A1/en not_active Abandoned
- 1995-04-26 AU AU17633/95A patent/AU673486B2/en not_active Ceased
- 1995-04-26 EP EP95106191A patent/EP0679888A3/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU1763395A (en) | 1996-01-04 |
| EP0679888A2 (en) | 1995-11-02 |
| AU673486B2 (en) | 1996-11-07 |
| JP2837093B2 (ja) | 1998-12-14 |
| CA2147801A1 (en) | 1995-10-29 |
| EP0679888A3 (en) | 1996-02-28 |
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