JPH07274976A

JPH07274976A - Ｔ−細胞レセプターα−サブユニット−抗原特異的ポリペプチド及び関連ポリヌクレオチド

Info

Publication number: JPH07274976A
Application number: JP7064678A
Authority: JP
Inventors: Mark M Davis; エム．デイビス，マーク; Stephen M Hedrick; エム．ヘドリック，スティーブン
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 1984-03-01
Filing date: 1995-02-28
Publication date: 1995-10-24
Also published as: ATE188251T1; EP0174366A1; JPH1067675A; DE570027T1; WO1985003947A1; JPH09121871A; EP0174366B1; US6180104B1; HK1013844A1; DE3588219T2; EP0174366A4; EP0570027B1; DE3584209D1; SG70553A1; EP0609901A1; US5316925A; HK1006855A1; JPH06225765A; DE3584209T2; JPH10114672A

Abstract

(57)【要約】【目的】Ｔ−細胞レセプターα−サブユニット関連遺
伝子を提供する。【構成】Ｔ−細胞レセプターα−サブユニット少なく
とも１つの断片をコードするＤＮＡ及びそれがコードす
るペプチド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】造血系は非常に複雑であり、この
ことは宿主の維持及び生存において血液細胞が演ずる中
枢的役割の観点から驚くべきことではない。非常に重要
な１つの観点は、宿主が種々の病原体に対して自らを保
護する態様である。２群の細胞すなわちＢ−細胞及びＴ
−細胞が、宿主の保護において顕著な役割を演ずる。

【０００２】Ｂ−細胞がいかにして非常に多様な免疫グ
ロブリンを生産することができるかというミステリーは
実質的な程度に説明されている。Ｂ−細胞が成熟するに
従って、ジャームライン（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）ＤＮＡが
組み替え（ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）られて種々の
エクソンが連結され、これによって可変領域が形成さ
れ、そしてこの領域が異る不変領域に連結されることが
今や知られている。ＤＮＡが組み替えられそしてこれに
続いて転写物がスプライスされて特異的な免疫グロブリ
ンをコードするメッセンジャーＲＮＡを生成する機構
は、分子生物学の発達によってもたらされる手段の可能
性を示す刺激的な冒険であった。

【０００３】宿主の免疫系にとって重要な他の群はＴ−
細胞である。この細胞は、類似する範囲の抗原特異性を
有するが免疫グロブリンを分泌しない点においてＢ−細
胞と異る。特に、Ｂ−細胞の増殖を刺激することに関与
するヘルパーＴ−細胞は、自己−主要組織適合性決定基
をも同時に認識しなければならないと言う追加の要求を
伴って、Ｂ−細胞の特異性に類似する特異性を有する。

【０００４】Ｔ−細胞の特異性は、広範囲の状況におい
て適用を見ることができる。外来性レセプター（受容
体）部位を導入することによってヘルパーＴ−細胞を改
変することができれば、外来性抗原に対する宿主の応答
を変化せしめることができるであろう。さらに、多くの
状況において、細胞がヘルパーＴ−細胞であるか他のタ
イプの細胞であるかを決定することに興味あることであ
る。さらに、宿主におけるモノクローン性を決定する機
会を有することは、Ｔ−細胞白血病の診断に有用であ
る。

【０００５】さらに、Ｔ−細胞抗原特異的レセプターの
部分をコードするＤＮＡ配列を有することは、レセプタ
ーとして機能することができる新規な蛋白質を生産する
ために天然Ｔ−細胞配列と外来性配列との組合せを含む
造成を可能にするであろう。さらに、合成ペプチドを使
用することにより、又は発現ベクターにおいて蛋白質を
生産することによって、蛋白質の特異的部分に対する抗
血清又はモノクローナル抗体を生成せしめることができ
るであろう。ＤＮＡ配列とのハイブリダイゼーションを
用いることにより、Ｔ−細胞のサブセットを、遺伝的差
異及び欠陥と共に決定することができよう。

【０００６】

【従来の技術】ＨＬＡ−ＤＣの第２ドメインが免疫グロ
ブリンと相同であることが示されている。アウフライ
等、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシス・オブ・ザ・ユナイテッド・ス
テイツ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ）（１９８２）７９，６３３７−６３４１。免疫グロ
ブリン可変領域中の鎖内ジスルフィド結合の近傍の配列
がカバット等、シーケンシス・オブ・イムノロジカル・
インテレスト（ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＩｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ）、米国、ヘルス
・アンド・ヒューマン・サービシス（Ｈｅａｌｔｈａ
ｎｄｈｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ）、ワシントン
Ｄ．Ｃ．（１９８３）に検討されている。

【０００７】Ｂ−細胞抗−イデオタイプ抗血清とＴ−細
胞との間の交差反応性が、アイヒマン及びラゼウスキ
ー、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー
（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）（１９７５）５：６
６１−６６６；ビンツ及びウイグツエル、ジャーナル・
オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ．Ｅｘｐ．
Ｍｅｄ．）１４２：１９７−２１１；及びアウグスチン
等、レギュラートリー・Ｔリンポサイト（Ｒｅｇｕｌａ
ｔｏｒｙＴＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）、ペルニス及び
フォゲル編、１７１−１８４、アカデミック・プレス、
ニューヨーク、１９８０に報告されている。Ｔ−細胞特
異的遺伝子と免疫グロブリンコード遺伝子との間のヌク
レオチド配列の類似性の欠落がクロネンベルグ等、ジャ
ーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ．
Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．）、前掲、（１９８３）１５８：２１
０−２２７により報告されている。

【０００８】ネズミＴ−細胞特異的蛋白質がカプラー
等、セル（Ｃｅｌｌ）（１９８３）３４，７２７−７３
７、及びマクインタイレ及びアリソン、前掲（１９８
３）３４，７３９−７４６に報告されている。アリソン
等、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．）（１９８２）１２９：２２９３−２３００；ハ
スキンス等、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・
メディシン（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．）（１９８３）１５
７：１１４９−１１６９；ミュール等、ネイチュアー
（Ｎａｔｕｒｅ）（１９８３）３０３：８０８−８１
０；及びサムエルソン等、プロシーディングス・オブ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシス・オブ・
ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）（１９８
３）８０１：６９７２−６９７６は、３７〜５０kdのサ
イズの２つの異る糖蛋白質から成るジスルフィド結合し
たヘテロダイマーのＴ−細胞からの免疫沈澱を報告して
いる。

【０００９】マクインタイル及びアリソン、前掲（１９
８３）；及びアクト等、セル（Ｃｅｌｌ）（１９８３）
３４：７１７−７２６は、ペプチドマップ分析により、
前記ヘテロダイマーが可変部分及び不変部分を有するら
しいことを報告している。ヘーベル−カッツ等、ジャー
ナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ．Ｅ
ｘｐ．Ｍｅｄ．）（１９８２）１５５：１０８６−１０
９９；及びヘドリック等、セル（Ｃｅｌｌ）（１９８
２）３０：１４１−１５２は、ＭＨＣ−制限Ｔ−ヘルパ
ーハイブリドーマの生成を報告している。この開示を引
用によりこの明細書に組み入れる。

【００１０】デービス等、ＢアンドＴセル・チュモアス
（ＢａｎｄＴＣｅｌｌＴｕｍｏｒｓ）、ＵＣＬ
ＡシンポジウムＶｏｌ２４（ビッテラ及びフオックス
編）２１５−２２０、アカデミックプレス、ニューヨー
ク、１９８２は、Ｔ及びＢリンパ球が、それらの遺伝子
発現の非常に小部分により異ることを報告している。サ
イトー、ネイチュアー（Ｎａｔｕｒｅ）（１９８４）３
０９：７５７−７６２は、細胞毒性Ｔ−細胞ＤＮＡ中に
組み替えられておりそして可変、不変及び連結領域に相
同な要素を有するＴ−細胞特異的ｃＤＮＡクローンを報
告している。シゥ等、セル（Ｃｅｌｌ）（１９８４）３
７：３９３−４０１及びカバラー（Ｋａｖａｌｅｒ）
等、ネイチュアー（Ｎａｔｕｒｅ）（１９８４）３１
０：４２１−４２３は、β鎖中の多様な要素の存在を報
告している。Ｔ−細胞レセプター分子のα−鎖はβ−鎖
と同様に多様であることが報告されている。〔カプラー
等セル（Ｃｅｌｌ）（１９８３）３５：２９５−３０
２〕。

【００１１】

【発明の概要】希少なメッセンジャーＲＮＡを単離する
方法が提供される。この方法により、Ｔ−細胞中の抗原
特異的レセプターをコードするＤＮＡ配列、及び他のＴ
−細胞特異的遺伝子生成物が得られる。このＤＮＡが、
多くの方法において、例えば、抗体と同様に使用するこ
とができる、外来性ＤＮＡ配列と組合わされて新規なＴ
−細胞レセプターを形成するヌクレオチドプローブとし
て使用することができ、あるいは、染色体外要素をもた
らすか又は宿主のゲノムに組込まれる造成物（ハイブリ
ド蛋白質が発現されそして膜に輸送される）を得ること
ができる。

【００１２】

【具体的な態様の記載】この発明に従えば、抗原特異的
Ｔ−細胞レセプターもしくはその断片のための全体的も
しくは部分的コード配列、特にジャームライン及び組み
替えられたＤＮＡ中の１又は複数のエクソン上に見出さ
れる機能的領域を含む新規なＤＮＡ配列、又は成熟メッ
センジャーＲＮＡからの全体的もしくは部分的ｃＤＮＡ
が提供される。

【００１３】哺乳動物Ｔ−細胞レセプターは、α−及び
β−サブユニットと称する約４０〜５０kd（キロダルト
ン）の２つの異る糖蛋白質から成りそしてジスルフィド
連結されている８０〜９０kdのヘテロダイマーのようで
ある。これらの２つの糖蛋白質は、ペプチドマップ分析
により、可変及び不変領域はドメインを有する。このヘ
テロダイマーの糖蛋白質をコードするＤＮＡ配列は、免
疫グロブリンと同様に可変、連結及び不変領域に分けら
れ、このことは免疫グロブリン配列と実質的な相同性を
有する配列により、及びＪ−様要素の独立の類別（ａｓ
ｓｏｒｔｍｅｎｔ）により明らかにされる。各サブユニ
ットは免疫グロブリンのヘビー鎖に匹敵する多様（ｄｉ
ｖｅｒｓｉｔｙ）（Ｄ）領域を有する様である。

【００１４】α−及びβ−サブユニットは、それら自身
間、他のＴ−細胞膜蛋白質及び免疫グロブリン又はＢ−
細胞レセプター蛋白質との間で多くの類似性を有する。
ほとんどの場合、全体的な相同性は低く、不変領域にお
いてアミノ酸配列又はヌクレオチド配列の少数の類似性
が存在する。（リーダー配列のメチオニンがアミノ酸配
列のための１として使用される。）システイン間隔が、
可変領域（α−６５；β−６９；Ｉｇλ又はκ−６５）
中のおよそ６５〜７０アミノ酸間に見出される。

【００１５】さらに、α−鎖の可変領域中およそ残基５
５における配列“WYRQ”は、β−鎖中“WYKQ”における
相同性、及び免疫グロブリン中の匹敵する位置における
類似の配列を見出す。可変領域において、およそ１００
−１１５の残基の領域中に１又は２個のアミノ酸の相違
を伴って配列“DSA-Y-CAV ”が見出される。Ｊ領域はα
−鎖の１６残基中７残基がβ−鎖と同一であり、そして
ネズミのヘビー及びライト鎖の共通配列との有意な相同
性を有し、最も高度に保存されている。

【００１６】さらに、Ｔ−細胞レセプター配列に特徴的
なのは、トランスメンブラン領域中に塩基性アミノ酸を
有する配列“ILLXK ”（ここでＸはＬ又はＧである）で
ある。Ｄ又は多様性領域中、およそ残基１１５−１２０
における“SGN ”配列への５′はヌクレオチド配列“Ｇ
₅ ”である。β−鎖推定上のＤ領域１４中の７におい
て、Ｃ′−側に“Ｇ_3-7 ”の列が見出され、これは免疫
グロブリンヘビー鎖Ｄ領域中に相同性を見出す。

【００１７】α−及びβ−鎖はジャームラインＤＮＡ中
でコードされ、これは組み替えにかけられて転写物がも
たらされ、これがさらにプロセスされる。後記の目的の
ためにゲノム性ＤＮＡ又は成熟転写物からのｃＤＮＡを
使用することができる。各鎖は３〜５個の、通常４〜５
個のＮ−グリコシル化部位を有し、それらの幾つか又は
すべてが用いられ得る。

【００１８】ヘテロダイマーの２本の鎖は異り、そして
異る遺伝子座に由来すると考えられる。β−鎖及びα−
鎖の配列がそれぞれ図２及び３、並びに図４及び５に示
される。これらの鎖は、免疫グロブリンと同様に特定の
エクソンと関連する領域に分けられる。一次領域はリー
ダー領域、可変領域（Ｖ）、多様領域（Ｄ）（これはＶ
の部分であることができる）、連結領域（Ｊ）、不変領
域（Ｃ）、トランスメンブラン領域（ＴＭ）、及び細胞
質領域（Ｃｙ）である。

【００１９】グリコシル化を伴わないα−鎖は約２５〜
３０kd（キロダルトン）であり、他方β−鎖はおよそ同
じか又はこれより大きく、約２５〜３５kdであろう。グ
リコシル化を伴えば、サブユニットはそれぞれ約３５〜
５０kdであり、８０〜９０kdのスルヒドリン連結された
ヘテロダイマーをもたらすであろう。各サブユニットに
ついて、イントロンを含むヘルパーＴ−細胞中組み替え
られたＤＮＡは一般に約６〜８kbp であり、個々のエク
ソンは実質的に一層小さく、そしてドメイン＋含まれる
なんらかのフランキング配列のためのｃＤＮＡ配列のサ
イズにおよそ等しいであろう。

【００２０】不変領域（トランスメンブラン及び細胞質
領域を含む）をコードするＤＮＡ配列は一般に約４００
〜６００nt（ヌクレオチド）＋約３００ntの３′非翻訳
領域である。これらの配列は、約１００〜２００nt、通
常約１００〜１５０nt離れて配置されるシステイン間の
分子内ジスルフィド連結をコードするコドンにより特徴
付けられる。

【００２１】主として疎水性アミノ酸を含みそして約４
５〜１０５ntを有する可能性あるトランスメンブラン配
列が不変領域と関連する。この配列は不変領域の３′−
端を定義し、そして細胞の細胞質に伸びるアミノ酸をコ
ードする約５〜１５コドン（１５〜４５nt）を含有する
であろう。機能的意義を有すると考えられる次の領域又
はドメインは免疫グロブリンのＪ領域に類似する領域で
ある。免疫グロブリンについて知られているように、与
えられた１個のＣ領域に隣接して約１〜６個、一層一般
的には４〜５個にわたる複数のＪ領域が存在する。Ｊ領
域は約１５〜２０アミノ酸をコードし、ヘビー鎖Ｊ領域
が典型的には１７アミノ酸であり、他方ライト鎖Ｊ領域
が典型的には１３アミノ酸である点において、１６アミ
ノ酸を有するβ−鎖は免疫グロブリンヘビー鎖Ｊ領域と
一層大きな類似性を有する。

【００２２】Ｊ領域は、他のＤＮＡ配列、例えば非−野
性配列に連結されるトランスメンブラン配列及び細胞質
配列を含む又は含まない不変領域と組み合わせて、Ｔ−
細胞上の新規なハイブリド蛋白質を可能にするハイブリ
ド配列を形成するために使用することができる。（“非
野性”なる語は、野性タイプ又は天然配列以外の配列を
意図し、他方“外来性”なる語は、Ｔ−細胞抗原レセプ
ターＤＮＡ配列源と遺伝情報を通常交換しない源からのものを意図する。）表
面に輸送されるハイブリド蛋白質を得るため、Ｔ−細胞
抗原レセプターと共に存在する第２リーダー配列が５′
−端として使用される。この配列は約１５〜２０アミノ
酸、一層普通には１８〜２４アミノ酸から成る。非−コ
ードフランキング領域を含むことができるＴ−細胞抗原
レセプターＤＮＡ配列の種々のドメインが非−野性タイ
プＤＮＡにより分離される場合に前記の造成物を製造す
ることができる。

【００２３】Ｔ−細胞抗原レセプター、個々のサブユニ
ット、その断片、又は断片と非−野性ＤＮＡ（外来性Ｄ
ＮＡを含む）との組み合わせをクローン化しそして／又
は発現せしめるために新規なＤＮＡ造成物を使用してハ
イブリド蛋白質を製造することができる。これらの断片
は少なくとも約１５nt、一般に少なくとも約５０ntであ
る。これらの造成物はほとんどの場合、次の式： (RS)_a-(M)_b-(tis)-(eis)-(T-AqR)-(ets)-(tts) を有するであろう。

【００２４】この式において、“RS”は、原核生物もし
くは真核生物、プラスミド、ファージ、又はウイルスに
由来することができる複製系を意図し、ここで、異る宿
主、例えば、単細胞微生物中での複製及び染色体外要素
としての維持を可能にする１又は複数の複製系が含まれ
ることができ；複製系又はベクターの例にはラムダ、シ
ミアンウイルス、パピローマウイルス、アデノウイル
ス、酵母２ｍμプラスミド、ＣｏｌＥＩ，ｐＲＫ２９
０，ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ６又はこれらに類似するもの
が含まれ、ここで複製系は完全であってもよく、又はヘ
ルパープラスミドともしくはゲノム中に存在する１もし
くは複数の遺伝子（例えばＣＯＳ細胞）と相互作用する
部分的複製系であってもよく；クローニングのために
は、単細胞宿主、例えば細菌、酵母等、特にＥ．コリ
（Ｅ．ｃｏｌｉ）により認識されるプラスミド又はウイ
ルス複製系のごとき複製系が使用され；“ａ”は０〜
３、普通１〜３の整数であり、染色体への組込みが望ま
しい場合には０であり（但し、組込みは天然の又は外来
性複製系が存在しても達成され得る）；“Ｍ”は、造成
物を含有する宿主細胞を選択するための手段を提供する
その転写及び翻訳制御シグナルと共にマーカーと称され
る構造遺伝子又はシストロンを意図し；マーカーは殺生
物耐性、例えば、抗生物質、例えばアンピシリン・クロ
ラムフェニコール、ネオマイシン、Ｇ４１８、又はこれ
らに類似するもの、毒素、重金属等に対する耐性；免疫
性；栄養要求性宿主に原栄養性を付与する補完、又はこ
れらに類似するものを包含し；“ｂ”は０〜３、一層普
通には０〜２、好ましくは１〜２の整数であり；“tis
”は転写開始を制御するための転写開始配列を意図
し、そして１又は複数のプロモーター（これには、それ
自体による又は他のプロモーター、例えばウイルスプロ
モーターもしくは外来性プロモーターと組み合わされた
天然プロモーターが含まれる）、該プロモーターに影響
を与える配列、例えばオペレーター、アクチベーター、
エンハンサー、キャッピング配列、TATA及びCAAT配列、
あるいはこれらに類似するものを含み、ここで、これら
の配列はそれらの機能を満たすことができるように造成
物中に組織化されており；“eis ”は、発現を制御する
ための発現開始配列を意図し、そしてリボゾーム結合部
位、適当であれば、開始コドン、リボゾーム結合部位と
開始コドンを分離するオリゴヌクレオチド（ここで、こ
れらの配列は発現に影響を与える）、及びこれらに類似
するものを含み；“T-AgR ”は、Ｔ−細胞抗原レセプタ
ー、又はＴ−細胞抗原レセプターの断片を含んで成るハ
イブリドＤＮＡ配列及びハイブリドＤＮＡ配列を意図
し、ここで、これらの配列は一緒になって抗原レセプタ
ー又はハイブリド蛋白質をコードするオープンリーディ
ングフレームをもたらし；“ets ”は、１又は複数の終
止コドン及び適当であれば他の配列を含むことができる
発現停止配列を意図し；そして“tts ”は、転写停止配
列を意図し、この配列は、通常は転写プロモーターと均
衡しておりそして１又は複数の終止コドンと組み合わさ
れた１又は複数のターミネーターであることができる転
写ターミネーター、ポリアデニル化シグナル配列、又は
これらに類似するものを含むことができる。

【００２５】Ｔ−細胞抗原レセプターサブユニット又は
ハイブリドＴ−細胞抗原レセプターは、ほとんどの場合
次の式： (S.L.)_C-(V-seq)-J-C-(TM) _d-(Cy) _e を有する。式中、“S.L.”は第２リーダー配列を意図
し、このものは約１５〜２５アミノ酸、さらに一般的に
は１７〜２４アミノ酸、そして好ましくは約１９〜２３
アミノ酸をコードし、４５〜７５nt、一般に５１〜７２
nt、好ましくは５７〜６９ntを有し；“ｃ”は０又は１
であり；“V-seq ”は、Ｔ−細胞抗原レセプターサブユ
ニットの可変領域をコードし又は異るポリペプチドをコ
ードする配列により置き換えられることができ、このＤ
ＮＡ配列は適当であれば第２リーダー配列（S.L.）とリ
ーディングフレームが合っており又は第２リーダー配列
の非存在下でそれ自体の開始コドンを有することがで
き；この可変配列は一般に少なくとも約６０ntでありそ
して約６００nt以下であり、一層通常には約４００nt以
下であり；この配列がＴ−細胞レセプター可変領域をコ
ードする場合、この配列は一般に約２７０〜３３０nt、
一層普通には約２８５〜３１２ntの範囲であり；“Ｊ”
は連結領域であり、そして一般に約４２nt〜約６０ntで
あり、一層普通には約４５nt〜５７ntであり、そしてし
ばしば約４８〜５４ntであり、ここでＪ領域は、Ｔ−細
胞抗原レセプターサブユニットの連結領域エクソンと関
連する限定された数の配列から選択され；“TM”は、約
５１〜９０nt、一層普通には約８４〜９６ntの疎水性配
列であるトランスメンブランインテグレーター配列を意
図し；“ｄ”は０又は１であり；“Cy”は膜から細胞質
内に延びる配列を意図し、これは一般に約１２〜２０nt
であり、一層普通には約１５〜２４ntであり、特に約１
５〜１８ntであり；そして“ｅ”は０〜１の整数であ
る。

【００２６】２つのサブユニットα−及びβ−のそれぞ
れは異る宿主中で又は同じ宿主中で独立して発現するこ
とができる。２つのサブユニットが同一宿主で発現され
る場合は、微生物宿主が使用されるから哺乳動物細胞が
使用されるかによって、サブユニットのプロセシング及
びサブユニットのＴ−細胞レセプターの集成に影響を与
えるであろう。

【００２７】プロセシングには折りたたみ、グリコシル
化、小胞体及びゴルジ体を介する輸送、第２リーダー配
列の除去を伴う開裂、及びアセチル化によるＮ−末端の
キャッピング又はブロッキングが含まれる。プロセシン
グの部分として又はプロセシングとは独立に、サブユニ
ットの折りたたみ及びサブユニットのＴ−細胞レセプタ
ーへの集成が生じなければならない。哺乳動物細胞につ
いては、生じた蛋白質はその化学的、物理的及び生物学
的性質において天然Ｔ−細胞レセプターと実質的に一致
することが予想される。

【００２８】しかしながら、下等真核生物及び原核生物
については、種々のプロセス段階が全体的に又は部分的
に異って生じ、あるいは全く生じない。従って、これら
の配列は野性タイプ第２リーダー配列を発現宿主により
認識される第２リーダー配列で置き換えることにより、
又は可変領域の始めに開始コドンを設けることにより変
形することができる。次に、サブユニットは細胞質中で
単離され、そして再生条件下でα−及びβ−サブユニッ
トを一緒に連結することにより受容体が形成される。

【００２９】生物学的活性を有する、例えば免疫的活性
を有するポリペプチドをもたらすために、レセプターサ
ブユニット断片をコードするＤＮＡは少なくとも８アミ
ノ酸、普通は少なくとも１５アミノ酸（それぞれ２４nt
及び４５nt）のポリペプチドをコードすべきである。示
されるように、造成物は、Ｔ−細胞レセプターサブユニ
ットの一部分のみをコードするＤＮＡを挿入することに
よって調製することができ（ここで、ベクターは１又は
複数の適切な制限部位を有する）、あるいは例えばアダ
プターにより変形することにより、プロモーター及び関
連制御配列、例えば転写のためのＲＮＡポリメラーゼ結
合部位及び適当な翻訳制御配列、例えばリボゾーム結合
部位に対して適切な部位に挿入を行うことができ、又は
リーダー配列にリーディングフレームを合わせることが
できる。

【００３０】Ｔ−細胞抗原レセプターのドメイン又は領
域は、個々的に又は組み合わせて使用することができ
る。ｃＤＮＡを用いることにより、プロセシング、例え
ば第２リーダーの除去、グリコシル化等の蛋白質である
プレ蛋白質をコードするオープンリーディングフレーム
内に遺伝子を得ることができる。ｃＤＮＡの制限地図を
作成することにより、上記の式中に示されている個々の
ドメイン間の境界に隣接する便利な制限部位の存在を決
定することができる。

【００３１】制限部位が境界に存在しない場合、適当な
場合には適切な制限酵素を用いて、境界の近傍において
さらに開裂せしめることができる。切除された配列を有
するようにヌクレオチドが除去されている場合、注目の
ドメインを適切なリーディングフレーム内に他のヌクレ
オチド配列と連結することを可能にする適当なアダプタ
ーを用いて、そのヌクレオチドを置き換えることができ
る。余分のヌクレオチドが存在する場合、例えばＢａｌ
３１を用いる制限処理、プライマー修復等によりそれら
を除去することができる。

【００３２】他の方法として、特定のアミノ酸のコドン
内に縮重が存在する場合、イン−ビトロ変異誘発を用い
て１又は複数個のヌクレオチドを変更し、こうして制限
酵素のための適切な認識配列を設けることができる。こ
れらの技法は広範囲に文献に記載されており、そしてこ
こで例示することを必要としない。使用されるＤＮＡ配
列は、この発明に従って単離される配列と同一でも異っ
ていてもよい。Ｊ又はＣドメイン配列をそれ自体として
又は他の配列例えばトランスメンブラン配列と組合わせ
て使用することにより、これらの配列を、同一の又は異
る種中の相同配列の存在を決定するための、及び、同等
な機能を有する配列を単離するためのプローブとして使
用することができる。こうして、Ｔ−細胞抗原レセプタ
ーからの断片の種々の組合わせを用いて、一緒に連結し
てＴ−細胞抗原レセプター又はハイブリド蛋白質をコー
ドする種々のシストロンをもたらすことができる配列の
集積を得ることができる。

【００３３】Ｔ−細胞抗原レセプターの第２リーダー配
列を非−野性ＤＮＡ配列に連結することにより、ハイブ
リド蛋白質の培地への分泌及びプロセシングを与えて哺
乳動物宿主からの成熟蛋白質生成物を得ることができ
る。蛋白質が真核生物蛋白質である場合、それを適切に
プロセスして天然真核生物蛋白質と同一か又は実質的に
同一な生成物を与えることができる。

【００３４】上記の方法に代えて、Ｔ−細胞表面又は異
る哺乳動物細胞の表面に特定の蛋白質をもたらすことを
望む場合には、第２リーダー配列とトランスメンブラン
配列との間に、Ｔ−細胞抗原レセプターサブユニットの
可変、Ｊ及び不変領域の代りに外来性蛋白質をコードす
る外来性配列を挿入することができる。こうして、細胞
表面に全体として異る表面膜蛋白質を与えて細胞の表面
特性を変化せしめることができる。

【００３５】この造成物の発現生成物を用いて発現生成
物に対する抗体を得ることができ、次にこれを用いて、
Ｊ又はＣ領域に対するイデオタイプ決定基又は共通決定
基の共有に基いて、Ｔ−細胞抗原レセプター又は個々の
サブユニットの存在を検出することができる。特にＣ領
域の５′−末端から細胞質領域の３′−末端に延びる配
列のクローン化ＤＮＡ配列をプローブとして用いること
ができる。通常、プローブは相同配列の少なくとも約１
５nt、一層普通には少なくとも約３０ntであり、そして
一般に約１０００ntを超えず、好ましくは約５００ntを
超えない。さらに、５knt 又はそれより大である非−相
同フランキング配列が存在することができる。

【００３６】プローブとして使用されるヌクレオチド配
列はＲＮＡ又はＤＮＡであってよく、そして種々の方法
でラベルされていてもよい。一般に、プローブは³²Ｐに
よりラベルされ、そしてオートラジオグラフィーにより
検出することができる。別法として、ビオチン、新規な
糖類、又は他の任意の分子を、オリゴヌクレオチドを調
製するための合成技法を用いて含めることができる。

【００３７】こうして、任意の末端基を導入して、検出
可能なシグナル源として機能せしめることができる。こ
れらの基は直接的に又は間接的に、すなわち共有結合、
リガンド−受容体結合、例えばハプテン及び抗体、又は
これらに類似するものにより導入することができる。検
出可能なシグナルをもたらすラベルの例には、螢光物
質、化学発光物質、酵素、放射性ラベル、磁性粒子、及
びこれらに類似するものが含まれる。

【００３８】Ｔ−細胞抗原レセプターサブユニットと関
連する希少なメッセンジャーＲＮＡを単離するために、
希少なメッセンジャーＲＮＡを得るための種々の方法が
用いられた。β−サブユニットのために用いられた方法
は、非−膜結合ＲＮＡからの膜結合ポリゾーム性ＲＮＡ
の単離を含む。次に、ＲＮＡの膜結合ポリゾーム画分を
逆転写して単鎖（ｓｓ）ｃＤＮＡを生成せしめた。

【００３９】次にこのｃＤＮＡを³²Ｐによりラベルし、
そして反復してβ−細胞ｍＲＮＡとハイブリダイズせし
め、そしてヒドロキシアパタイト上で分画した。カラム
を通過した残りのｓｓｃＤＮＡを単離した。次に、第２
のＴ−ヘルパーハイブリドーマを用いてｃＤＮＡライブ
ラリーを調製し、そして第１Ｔ−ヘルパーハイブリドー
マから調製されたｃＤＮＡプローブを用いてスクリーニ
ングした。これが、Ｔ−細胞特異的膜関連配列の実質的
な濃縮（約２００倍）をもたらした。

【００４０】減少した数の選択されたクローンを、最初
に調製したプローブを用いて再スクリーニングした。次
に陽性クローンをニックトランスレートし、そしてノー
サンブロッティング条件下でＢ−細胞ｍＲＮＡにハイブ
リダイズせしめた。Ｂ−細胞ｍＲＮＡにハイブリダイズ
しなかったクローンをＴ−細胞特異的であるとして選択
した。

【００４１】次に、これらのクローンを用いて、次のよ
うにして体細胞組み替えを研究した。１０００ntより大
きいＲＮＡにハイブリダイズするそれらを、ヘルパーＴ
−細胞ハイブリドーマ及び胸腺腫を含む分離源からのゲ
ノム性ＤＮＡのサザンブロットにハイブリダイズせしめ
た。ＤＮＡを標準的方法により調製し、特定の制限酵
素、この場合ＰｖｕII、により消化し、０．９％アガロ
ースを通して電気泳動し、そしてニトロセルロース上に
ブロットした。穏和な〜激しい厳格さが用いられ、そし
て胸腺腫及びハイブリドーマの両者が、他の非Ｔ−細胞
ＤＮＡとは実質的に異るパターンを与えることが見出さ
れた。α−サブユニットのために用いられた方法は、異
る特異性のＴ−細胞間の可変領域特異的な削減された
（ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ）ｃＤＮＡプローブを用いた。
ヘルパーハイブリドーマのｍＲＮＡからランダムプライ
ムされたラベル化ｃＤＮＡを合成した。約３００〜４０
０ntの平均サイズに断片化した後、２本鎖核酸から単離
を分離するためにヒドロキシアパタイトを用いながら、
少なくとも２つの異るＴ−ヘルパーハイブリドーマ又は
Ｔ−ヘルパー様リンパ腫系からのｍＲＮＡにより削減し
た。

【００４２】次に、残りの単鎖ｃＤＮＡを、もとのｃＤ
ＮＡを与えるセルラインから調製されたｃＤＮＡライブ
ラリーにハイブリダイズせしめた。同じＴ−ヘルパーハ
イブリドーマからのオリゴ−ｄＴブライムｃＤＮＡ（こ
こで、ｃＤＮＡは、マクロファージ又は他のリンパ球系
からのｍＲＮＡにより削減された膜結合ポリゾームｍＲ
ＮＡから逆転写される）により陽性クローンを再スクリ
ーニングすることにより関連のない配列の追加の除去を
達成することができる。得られるハイブリダイズするク
ローンはＴ−細胞レセプターの可変領域に関連すること
が見出される。

【００４３】ハイブリドＤＮＡ技法を用いることによ
り、α−及びβ−サブユニットを別々に調製することが
でき、あるいは有機分子、例えばポリペプチド、ポリサ
ッカライド、リピド、ハプテン及びこれらの組合わせの
特定の配置に対する高い特異性及び親和性を有するレセ
プターとして組み合わせることができる。レセプターの
一群が実質上同様の方法で使用され得る免疫グロブリン
に類似してもたらされるが、免疫グロブリンに関連する
性質、例えばＦｃ決定基、補体関連細胞毒性、又は免疫
グロブリンと特に関連する他の特性を欠いている。この
発明のレセプターは、血液中イン−ビボで表面膜結合Ｔ
−細胞レセプターと競争して類似抗原により活性化され
たヘルパー細胞の増殖を阻害することができる。

【００４４】Ｔ−細胞レセプターは、免疫グロブリンが
使用されるほとんどの状況において、例えば診断測定、
アフィニティークロマトグラフィー、部位特性療法又は
診断において使用することができ、この場合Ｔ−細胞レ
セプターは放射性核種、ｎｍｒ活性化合物、螢光物質、
毒素、例えばアブリン、リシン等、又はこれらに類似す
るものに直接的又は間接的に接合され得る。

【００４５】α−及びβ−鎖のために用いられる遺伝子
を手にすることにより、鎖、及びそれ故にレセプター
を、ヒト細胞に比べて増殖要件が厳格でないヒト細胞以
外の細胞から多量に製造することができる。Ｔ−細胞レ
セプターは細菌、例えばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、
Ｂ．ズブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等、真核生
物、例えば酵母、糸状菌類、ネズミ細胞等において製造
することができる。

【００４６】次の例は、限定のためではなく例示のため
に与えられる。

【００４７】

【実験】ヘルパーＴ−細胞抗原特異的レセプターサブユ
ニットα−及びβ−（Ｔ_H−Ａｇレセプター、α−又は
β−サブユニット）をコードする遺伝子の遺伝子単離法
は次の通りである。まず、β−サブユニットの単離が考
慮されよう。膜結合Ｔ−ヘルパー細胞ｃＤＮＡプローブ
が、Ｂ−細胞メッセンジャーＲＮＡを用いて削減され、
そして他のＴ_H−Ｂ−細胞リンパ腫組合せ生成物である
ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用
された。

【００４８】ライブラリーは、Ｂ−細胞特異的ライブラ
リー〔デービス等、プロシーディング・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシス・オブ・ザ・
ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）（印刷中）〕に
ついて下記するようにして、そしてアフリカツメガエル
胚段階特異的ライブラリー〔サーゼント及びダウィド、
サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）（１９８３）２２２：１
３５−１３９〕についての方法と同様の方法により、Ｔ
_H−ハイブリドーマＭ１２又は２Ｂ４〔ヘドリック等、
セル（Ｃｅｌｌ）（１９８２）３０：１４１−１５２〕
を用いて造成された。

【００４９】Ｂ−細胞リンパ腫Ｌ１０Ａ及びＢａｌ１７
〔キム等、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．）（１９７９）１２２：５４９−５５４〕
からＢ−細胞ｍＲＮＡを得た。ｃＤＮＡは検出のために
³²Ｐ−ラベルされた。Ｔ_H−Ｂライブラリーは、ヒドロ
シキアパタイト段階における削減において９５％のｃＤ
ＮＡが除去されたことに基いて、Ｔ−細胞特異的配列に
ついて２０倍濃縮された。

【００５０】Ｂ−細胞ライブラリーについての例示的方
法は次の通りである。セルラインＢａｌ１７，Ｂ−細胞
リンパ腫（ＩｇＭ⁺ＩｇＤ⁺Ｉａ⁺）〔キム等、ジャー
ナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）
（１９７９）１２２：５４９−５５４〕、及びＢａｌ
４，Ｔ−細胞胸腺腫（Ｔｈｙｌ⁺Ｌｙｔｌ^-Ｌｙｔ２⁺
ＴＬ⁺）〔キム等、前掲（１９７８）１２１：３３９−
３４４〕をＲＰＭＩ、グルタミン、７０％ウシ胎児血清
及び５×１０^-5Ｍ β−メルカプトエタノール中で５％
ＣＯ₂ 雰囲気下で増殖せしめた。高濃度（１〜２×１０
^-6／ml）に増殖した後新培地により２〜４時間レフレッ
シュし、細胞をＰＢＳと共に冷却し、そして収得した。

【００５１】この細胞を冷ＰＢＳ中で数回洗浄し、そし
て０．１４ＭＫＣｌ，０．０２ＭＴｒｉｓ，pH８．
０，０．００１５ＭＭｇＣｌ₂ 中に再懸濁し、ＮＰ−
４０を１％に加えることによって細胞溶解し、そして核
をペレット化した。細胞質画分を０．５％ＳＤＳ，５mM
ＥＤＴＡとし、そして飽和フェノールで２〜３回、Ｓ
ｅｖａｇ（ＣＨＣｌ₃ ：イソアミルアルコール２４：
１）で１回抽出し、エタノールで沈澱せしめ〔ムシンス
キ等、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンシス・オブ・ザ・ユナイテッ
ド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）（１９８０）７７：７４０
５−７４０９〕、そしてポリＡ⁺ＲＮＡをオリゴ−ｄＴ
セルロース上で選択した（１〜２回）。

【００５２】Ｂ−細胞リンパ腫からのｃＤＮＡを、５０
mM Ｔｒｉｓ，pH８．３，６mM Ｍｇｃｌ₂ ，７０mM
ＫＣｌ，１mMの各ｄＮＴＰ、第１鎖に１０⁵ cpm ／μｇ
の比活性を得る³²Ｐ−ｄＣＴＰ，１０μｇ／mlオリゴ−
ｄＴ，２０mMジチオスレイトール、１００μｇ／mlアク
チノマイシン“Ｄ”を含む１００μｌの反応混合物中で
１〜５μｇの鋳型ポリＡ⁺ＲＮＡから合成した。１μｇ
のポリＡ⁺ＲＮＡ当り１０ユニットのＡＭＶ逆転写酵素
を加え、そして４２℃にて２時間インキュベートした。

【００５３】同容積の０．２ＭＮａＯＨを添加した
後、混合物を７０℃にて２０分間インキュベートし、氷
上で冷却し、１ＭＨＣｌにより中和し、そして酢酸ナ
トリウム（pH６．５）及びＳＤＳをそれぞれ０．２Ｍ及
び０．１％に添加した。室温において、１００mM Ｎａ
ｃｌ，５０mM Ｔｒｉｓ，pH７．５，１mM ＥＤＴＡ及
び０．０２％ＳＤＳのランニング緩衝液により、パスツ
ールピペットカラム中のＧ−５０Ｆセファデックスから
ｃＤＮＡを排除した。１５μｇのｔＲＮＡを担体として
加え、そしてｃＤＮＡをシラン処理されたエッペンドル
フチューブ（１．５ml）中で沈澱せしめた。

【００５４】沈澱を７０％エタノールで１回洗浄し、乾
燥し、そして０．５Ｍリン酸緩衝液、５mM ＥＤＴＡ，
０．１％ＳＤＳ中に再懸濁し、そしてシールしたガラス
毛細管中でＴ−細胞胸腺ＲＮＡと、１０倍過剰１〜１．
５mg／mlにてハイブリダイズせしめた。反復配列を吸着
するために、剪断されたマウスゲノム性ＤＮＡ（１．２
mg／ml，１０μｇ／反応）を含めた。６０秒間煮沸した
後、混合物を１６〜２０時間６０℃にてインキュベート
した。次に、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー
を用いて、０．１２Ｍリン酸緩衝液、０．１％ＳＤＳ中
で６０℃にて材料を画分した。

【００５５】単鎖画分をＤＮＡポリメラーゼＩ（チレノ
ウ断片）を用いて２本鎖にし、ＳＩヌクレアーゼにより
切り取り、そしてｐＢＲ３２２のＰｓｔＩ部位にＧ−Ｃ
テイル化した。次に、プラスミドをＥ．コリ中に高効率
（５０〜４００×１０³ μｇ／挿入）で、平均挿入部サ
イズ約５００ntでクローン化した。５０００の選択され
たクローンのライブラリーをスクリーニングし、そして
標準的方法〔マニアチル等、モレキュラー・クローニン
グ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）、コールド・
スプリング・ハーバー・プレス、コールド・スプリング
・ハーバー，１９８２〕により、Ｔ−ハイブリドーマ２
Ｂ４からの膜結合Ｔ−ヘルパー細胞ｃＤＮＡプローブ
（これから、Ｂ−細胞Ｌ１０ＡからのＢ−細胞メッセン
ジャーに共通な配列が削減されている）（ＭＢＴ_2B4 −
Ｂ_LIOA）を用いて再スクリーニングした。

【００５６】３５の明確な陽性が得られ、これはライブ
ラリーの約１０％であった。どれが同じ遺伝子に由来し
そしてどれが異るかを決定するため、及び間違ったにす
ぎない陽性を除去するため、これらのプラスミドクロー
ンのそれぞれをニックトランスレートし、そして代表的
ナサンブロットとハイブリダイズせしめた。５個がＢ−
細胞ｍＲＮＡと反応性であり、そして残りの３０個がｍ
ＲＮＡサイズの１０種類の異るパターンの１つに属し、
そして表現を次の表に示した。

【００５７】

【表１】

【００５８】ＴＭ８はラットｔｈｙ−１ｃＤＮＡクロー
ンと強く交差ハイブリダイズした。ｔｈｙ−１は古典的
なＴ−細胞膜抗原である。今や、ｃＤＮＡライブラリー
がハイブリドーマ３．３Ｔ（ヘーベル−カッツ等、前
掲）から調製された。

【００５９】１０００nt以上のメッセンジャーにハイブ
リダイズする７つのクローンのそれぞれをラベルし、そ
して胸腺腫ＢＷ５１４７（マウス系ＡＫＲから、ヘーベ
ル−カッツ等、前掲）、ＡＫＲ肝、抗原特異的Ｔ−細胞
２Ｂ４（Ｂ１０．ＡマウスからのＴ−細胞とＢＷ５１４
７との融合）、及びＢ１０．Ａ肝からのＤＮＡから成る
サザンブロットにハイブリダイズせしめた。

【００６０】ＤＮＡは標準的方法（マニアチス等、前
掲）により調製し、制限酵素ＰｖｕIIで消化し、０．９
％アガロースを通して電気泳動し、そしてニトロセルロ
ース上にプロットした。サザンブロットからのオートラ
ジオグラムは、ＴＭ８（ｔｈｙ−１）と共に見られるＡ
ＫＲ及びＢ１０．Ａの間の制限多形性を除き、各クロー
ンとのハイブリダイゼーションのパターンはＴＭ８６の
場合を除くＤＮＡ源のすべてについて同一であった。

【００６１】親株のいずれかからの肝ＤＮＡに比べて、
ＢＷ５１４７又は２Ｂ４のいずれかのクローンにハイブ
リダイズするＰｖｕII断片の非常に異るパターンが存在
した。検査されたクローンはまた、ゲノム性ＤＮＡのＥ
ｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ III消化物にハイブリダイズせ
しめ、そして各場合においてＴＭ８６のみがＴ−細胞Ｄ
ＮＡと肝ＤＮＡとの間の有意の相異を示した。ＴＭ８６
クローンはｐＢＲ３２２からＰｓｔＩにより切出し可能
である。

【００６２】レセプター遺伝子のゲノム性組み替えが異
る抗原特異性のＴ−細胞についてユニークであるか否か
を試験するため、５種類の抗原特異的Ｔ−細胞ハイブリ
ドーマからのＤＮＡから成るゲノム性ブロットをクロー
ンＴＭ８６からのニックトランスレートされた挿入部と
ハイブリダイズせしめた。その結果は、抗原特異的Ｔ−
細胞のそれぞれからのＤＮＡはユニークパターンをもた
らすということであった。３種類の異るＢ−細胞リンパ
腫瘍ＤＮＡは肝臓のそれと同じパターンを与え、組み替
えがＴ−細胞にユニークであるらしいことが示された。

【００６３】さらに、一連の細胞毒性ラインがＴヘルパ
ー細胞のそれと類似するメッセンジャーＲＮＡを発現し
（ここに記載される遺伝子との交差反応により）、そし
てさらにこれらのゲノム性ＤＮＡの組み替えを示す。異
るＴ−リンパ球において独立して生ずる他のｃＤＮＡク
ローンを得るため、ラムダベクターｇｔ１０（ロナルド
・デービス、スタンフォード大学、スタンフォード、カ
リホルニアから一般に入手可能である）を用いて胸腺細
胞ｃＤＮＡライブラリーを調製した。このライブラリー
を、標準的条件〔マニアチス等、モレキュラー・クロー
ニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）（コー
ルド・スプリング・ハーバー・プレス）コールド・スプ
リング・ハーバー、ニューヨーク（１９８２）〕を用い
てＴＭ８６クローンによりスクリーニングした。

【００６４】このライブラリーは、若いＢａｌｂ／Ｃ系
マウスの全胸腺ポリＡ⁺ＲＮＡから造成した。ＡＭＶ逆
転写酵素（アマーシャム）を用いてｃＤＮＡを調製し
た。ｃＤＮＡがメチル化されず、これが３′−側上ｍＲ
ＮＡ配列内での開裂を説明した。ＤＮＡポリメラーゼＩ
によりフィルインした後、各端にＥｃｏＲＩリンカー
を連結した。次に、生じた断片を所望のサイズ範囲に画
分し、そしてラムダベクターｇｔ１０のファージレプレ
ッサー遺伝子中に位置する１個のＥｃｏＲＩ制限部位
に挿入した。

【００６５】レプレッサー遺伝子へのＤＮＡ断片の挿入
はｃＩ^-ファージを生成し、このファージは透明なプラ
ークを形成する。ｃＩ⁺ファージは濁ったファージを形
成し、ハイブリドファージの選択が可能となる。ｇｔ１
０ライブラリーから親ファージを除去するため、使用さ
れた細菌宿主はＣ₆₀₀ ｒｋ^-ｍｋ⁺ｈｆＩであった。
この宿主に対して、親ファージは非常に低頻度でプラー
クを形成する。ｃＩ⁺親ファージは抑制され、他方ｃＩ
^-ハイブリドファージは正常にプレート増殖する。

【００６６】陽性にハイブリダイズする組換体をｐＵＣ
９〔ビエラ及びメッシング、ジーン（Ｇｅｎｅ）（１９
８２）１９：２５９−２６８〕のＥｃｏＲＩ部位にサ
ブクローン化した。３個の胸腺由来クローンを得、８６
Ｔ１，８６Ｔ３，８６Ｔ５と命名した。部分制限地図を
図１に示す。８６Ｔシリーズの分子はすべて同じ３′位
置で終り、これはコード配列の３′末端の近位の内部Ｅ
ｃｏＲＩ認識部位のためである。５′末端の変化はお
そらくライブラリーの造成中のランダムは鎖停止のため
である。

【００６７】ナサンブロット中に見られる最大のｍＲＮ
Ａが１３００ntである事実に基いて、ポリＡテイルの１
５０〜２５０ヌクルオチドの削減が１０５０〜１１５０
ntの予想されるクローンサイズを与える。従って、８６
Ｔ１の９３８ヌクルオチドサイズは胸腺細胞分子のため
のコード領域配列のほとんどを含有するはずであること
か結論づけられる。図２及び図３に示すように、８６Ｔ
１を完全に配列決定し、そして他のクローンの部分配列
と比較した。

【００６８】この比較に基いて、多くの結論を導くこと
ができる：（１）４個のｃＤＮＡクローン中２個の５′末端は同一
でなく、しかし図１において注目されるような例外はあ
るがすべては同一の３′末端を有する。８６Ｔ３の完全
な不変領域が配列決定され、そして１個のヌクレオチド
を除き８６Ｔ１について示されたそれと同一であること
が見出された。この５′可変及び不変領域構造は免疫グ
ロブリンｃＤＮＡクローンに類似する。

【００６９】（２）メチオニン開始コドンにすぐ続い
て、予想されるリーダーポリペプチドに対応する疎水性
アミノ酸のストレッチが存在する。特に、配列Leu-Leu-
Leu はカッパーライト鎖リーダーポリペプチド間で共通
である。（３）可変及び不変領域間の１６アミノ酸要素は８６Ｔ
１及び８６Ｔ５間でヌクレオチドレベルにおいて共有さ
れるが、しかし８６Ｔ３又はＴＭ８６とはそうでなく、
独立に調和するＪ−様領域が示唆される。

【００７０】（４）システイン及び他の残基の配置は免
疫グロブリン及び関連分子との有意な構造的類似性を示
唆する。（５）８６Ｔ３の見かけ上の可変領域は、そうではなけ
れば正常な不変領域とフレームが整合する多く（５個）
の終止コドンのため、機能的でないようであり、そして
事実、このクローンはリーディングフレーム内に終止コ
ドンを有し、この遺伝子のすべての転写物が、少なくと
も胸腺において、活性な分子を生成するのに有効とは限
らないことが示される。

【００７１】既知蛋白質との進化的関連性についてこの
ｃＤＮＡクローンの配列を分析するため、誘導されたア
ミノ酸配列を、ウイルブル及びリプマン、プロシーディ
ングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンシス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・ア
メリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ）（１９８３）８０：７２６−７３０の迅速比較プロ
グラムを用いてデイホフの蛋白質配列データバンクと比
較した。

【００７２】デイホフバンクの約２３００の配列から、
２５の配列の相同性が、該データバンクの平均相同性か
らの５標準偏差より大又は同じであった。これらの２５
の配列の内、２４個が免疫グロブリン不変又は領域配列
であり、そして１つがクラスIIヒト組織適合性分子であ
った。さらに、８６Ｔ１の可変部分は免疫グロブリンの
可変部分と一致し、他方不変部分は免疫グロブリン不変
領域と一致する。マウス−カッパー可変領域（カバト
等、前掲）中の１８個の不変残基の内１３個が８６Ｔ１
の配列中に存在し、そしてヘビー鎖可変領域の１０個の
不変残基中６個が８６Ｔ１中に存在する。

【００７３】免疫グロブリン可変領域のジスルフィドル
ープを形成するシステイン残基間の間隔はカッパー及び
ラムダーライト鎖の両者については典型的には６５アミ
ノ酸であり、そしてヘビー鎖のそれについてはクロアミ
ノ酸である。８６Ｔ１可変領域の最も外側の２個のシス
テイン間の距離は中間６８アミノ酸である。異る免疫グ
ロブリンＶ領域の整列は、８６Ｔ１のリーダーペプチド
が位置２０のアスパラギンのすぐ前で開裂されることを
予言する。

【００７４】おそらく第１不変領域ドメイン、特に位置
１６４の近傍にわたって、免疫グロブリンとの顕著な相
同性が観察された。この領域において、システインへの
直接５′の配列はライト鎖に相同であり、そして配列
３′はヘビー鎖に相同であることに注目することは興味
あることであった。８６Ｔ１配列の最終システイン（位
置２６０）の近傍においても、カッパー及びラムダライ
ト鎖の両者の実質的な相同性が観察された。

【００７５】４種のクローンの内、８６Ｔ１と８６Ｔ５
の間で１６アミノ酸が共有されたが、しかし配列決定さ
れた他の２個のクローン８６Ｔ３及びＴＭ８６とは共有
されなかった。この相同性は正確に、免疫グロブリン中
の連結（Ｊ）領域要素により占められる領域に属す。８
６Ｔ１及びＴＭ８６の両者の推定上のＪ領域は、すべて
の免疫グロブリンＪ領域との実質的な相同性を示す。サ
イズに関して、推定的Ｊ領域は、ライト鎖（１３アミノ
酸）よりもヘビー鎖（平均１７アミノ酸）と一層関連す
る。

【００７６】Ｊ要素に加えて、アミノ酸１０３−１１５
間の隣接５′領域は８６Ｔ５及びＴＭ８６の間に実質的
な相同性を有する。特に、これらの２つのｃＤＮＡクロ
ーン間の１７ヌクレオチド及び９ヌクレオチドの同一性
は、ヘビー鎖免疫グロブリンのＤ領域におそらく類似す
るであろう他の可能性ある“ミニ−遺伝子”要素を示唆
する。他方、これらの相同性は、関連可変領域遺伝子の
幾つかの高度に保存された領域を代表するであろう。

【００７７】ヒドロパティシティー（ｈｙｄｒｏｐａｔ
ｈｉｃｉｔｙ）プロット〔カイト及びドーリットル、ジ
ャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ）（１９８２）１５７：１０５−１３
２〕が行われ、そして次のことが示された：８６Ｔ１分
子は球状蛋白質に特徴的な交互に現われる疎水性−親水
性ストレッチを有し；予想されるリーダーポリペプチド
が疎水性環境中に存在し；トランスメンブラン延長領域
が８６Ｔ１配列の末端に示され、これに続いて、多数の
リンパ球細胞膜マーカーの細胞質部分に特徴的な正電荷
（Lys-arg-lys ）の連鎖が存在する。

【００７８】結論において、８６Ｔ１の構造は１９アミ
ノ酸リーダーポリペプチド、９８アミノ酸可変領域、１
６アミノ酸Ｊ領域並びに１個の球状不変領域ドメインと
これに続くトランスメンブラン及び細胞質蛋白質から成
るそれである。免疫グロブリンとの類似性により、各球
状ドメイン中の２個の最外側システインは連結されてお
り、そして位置２６０の最終システインは受容体ヘテロ
ダイマーの他の鎖に結合するであろう。

【００７９】さらに、８６Ｔ１の合成ペプチド断片に対
して生じた抗血清は、Ｔ−ヘルパーハイブリドーマによ
るＩＬ−２の抗原依存性放出を有意に阻害することが見
出された。従って、上記の座はＴ−リンパ球の少なくと
も幾つかのサブセット中で特異的に組み替えられそして
発現される免疫グロブリン遺伝子の１つのタイプを代理
すること、及びこれはＴ−細胞による抗原の認識におい
て役割を演ずることが結論される。

【００８０】今や、Ｔ_H−Ａｇレセプターα−ユニット
の単離及び特徴付けが記載されよう。β−サブユニット
の単離及び特徴付けにおいて前に記載された方法は反復
されないであろう。ウシ胸腺ＤＮＡを用いて、標準的方
法（マニアチス等、前掲）により、ポリＡ⁺細胞質２Ｂ
４ｍＲＮＡからランダムプライム³²Ｐ−ラベルｃＤＮＡ
を合成した。ｃＤＮＡは最初７００ntの平均長さであ
り、そして２週間にわたりオートラジオリシス（ａｕｔ
ｏｒａｄｉｏ−ｌｙｓｉｓ）により約３００〜４００nt
に断片化された。Ｔ_HハイブリドーマＣ１０ｍＲＮＡそ
して次にＴ_H−様リンパ腫セルラインＥＬ−４からのｍ
ＲＮＡによるハイブリダイゼーション及びヒドロキシア
パタイト選択を用いて削減ハイブリダイゼーションを行
った。

【００８１】次に、２回削減されたプローブをベクター
λｇｔ１０中２Ｂ４ｃＤＮＡライブラリーのフィルタ
ーにハイブリダイズせしめた。約２０，０００のプラー
クをスクリーニングした。７個の陽性を拾い上げ、そし
てＰ３８８Ｄ１マクロファージラインからｍＲＮＡによ
り削減された、２Ｂ４からの膜結合ポリゾーム性ｍＲＮ
Ａからの調製されたオリゴ−ｄＴ−プライムｃＤＮＡの
プローブ（ＭＢＴ_H ^*−Ｍａｃ）により再スクリーニン
グした。

【００８２】７個の陽性の内３個がＭＢＴ_H ^*−Ｍａｃ
について陽性であり、そしてこれら３個の内２個は相互
に交差ハイブリダイズした。交差ハイブリダイズするプ
ローブの１つをＴＴ１１と命名し、そしてさらに研究す
るために選択した。ＴＴ１１ｃＤＮＡクローンをニック
トランスレーションによりラベルし、そして次のｍＲＮ
Ａのパネルを含むナサンブロットにハイブリダイズせし
めた：ａ）Ｂａｌ１７，Ｂ−細胞リンパ腫；ｂ）Ｍ
１０４ｅ形質細胞腫；ｃ）３Ｔ３線維芽細胞系；
ｄ）Ｐ３３８Ｄ₁ 、マクロファージ系；ｅ）２Ｂ４；
ｆ）ＥＬ−４；ｇ）ＢＷ５１４７。

【００８３】すべては標準的方法により調製されたポリ
Ａ⁺細胞質ＲＮＡである。２Ｂ４について約１．８kbに
単一バンドが観察された。他方ＥＬ−４について２個の
バンド、すなわちＥＬ−４レーン中１．８kbにおける一
層弱いバンド及び１．３kbにおける第２バンドが観察さ
れた。ＴＴ１１の配列をコードする遺伝子が組み替えの
結果としてであることを証明するため、異るマウス系の
肝臓からのゲノムＤＮＡ、種々のＴ−細胞系及びＢ−細
胞リンパ腫Ｌ１０Ａのハイブリドを、ａ）Ｈｉｎｄ II
I ；ｂ）ＥｃｏＲＶ；ｃ）ＸｂａＩ；ｄ）Ｂ
ｇｌ IIで消化し、そして０．７％アガロースを通して
電気泳動し、ニトロセルロース上にブロットし、そして
標準的方法によりＴＴ１１の５′半分からのプローブ
（ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶ、第３図）にハイブリダ
イズせしめた。

【００８４】ＦＮ１及びＦＮ１３と命名される２つのレ
ーンはＢＡＬＢ／ｃＸＣ５７Ｂ／６系マウス由来のＫ
ＬＨ反応性Ｔ_Hハイブリドーマ及びＡＫＲ系胸腺系ＢＷ
５１４７からのものであった。親ＤＮＡに対してＦＮ１
のＨｉｎｄ III 消化物中に親バンドが現われ、他方Ａ
ＫＲ肝臓ＤＮＡのＥｃｏＲＶ消化物中の１つのバンド
がＢＷ５１４７中で消失し、そしてＥｃｏＲＩ消化物
は親肝臓ＤＮＡに対してＢＷ５１４７中に現われる親バ
ンドを示す。Ｃ５７Ｂ／６ＤＮＡのＸｂａＩ消化物につ
いて多形性である２つのバンドが観察される。

【００８５】これらのバンドの両者がＦＮ１ハイブリド
中に存在し、しかしＦＮ１３中には１個のみが存在し、
これは単に染色体の組み替え又は部分的欠失の結果かも
しれない。親に対するＦＮ１中の新バンドがＢｇｌ II
消化物中に観察される。１つの消化物は、すべてのＴ−
細胞ＤＮＡ中の組み替えの証拠を示さないが、ＴＴ１１
がＴ−細胞レセプター様遺伝子であることを信ずるのに
十分なそのような事象徴候が存在する。

【００８６】マキサム及びジルバート、メソズ・イン・
エンチモロジー（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．）（１９８
０）６５：４９９−５６０の方法により、図４に示すス
トラテジーを用いてＴＴ１１ｃＤＮＡクローンを部分配
列決定し、そして配列を図４及び図５に示した。クロー
ンは３′−末端においてポリＡのストレッチ（約１５０
nt）により方向付けられ、そして５′側半分の配列決定
が最初の１２nt内に開始コドン（ＡＴＧ）を伴う８１０
ntの長いオープンリーディングフレームを示した。

【００８７】この配列は、ちょうどＴ−細胞レセプター
β−鎖及びサイトウ等、ネイチュアー（Ｎａｔｕｒｅ）
（１９８４）３０９：７５７−７６２のＨＤＳ４クロー
ンがそうであるように、Ｉｇリーダーに類似する領域、
可変領域、連結（Ｊ）領域、及び不変領域を示した。こ
の配列の特徴は、不変領域中の推定上のドメイン内シス
テイン（後者の２種のＴ−細胞特異的遺伝子に共通）の
外側の余分のシステイン、前記領域に続くトランスメン
ブラン領域及び細胞質領域であり、これらのすべてはβ
−鎖遺伝子中の分離されたエクソンとしてコードされ
る。異るβ−鎖配列中に見出される４個又は５個と同様
に、４個の可能性あるＮ−リンクグリコシル化部位が存
在する。ほとんどのカルボキシ末端部位はトランスメン
ブラン領域に埋め込まれるので、これらの４個の可能性
ある部位の内３個のみがグリコシル化のために利用可能
のようである。

【００８８】Ｔ−細胞レセプターα−サブユニットのプ
ロセッシングの正確な位置は確定されていないが、免疫
グロブリンタイプに対する類推により、第３図に示す＋
１のグルタミンのすぐ前であろう。他方、ＲＥＸＴ−
細胞からのヒトβ−鎖のＮ−末端アミノ酸配列〔アクト
等、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシス・オブ・ザ・ユナイテッド
・ステイツ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ）（１９８４）８１：３８５１−３８５５に基い
て、プロセシング点は＋３のアスパラギンのすぐ前かも
しれない。

【００８９】第１の場所においては、分子量２７．８kd
であって、これはアリソン等により観察された分子量と
一致する（彼らは、エンドＦと共にＮ−リンク糖が除去
されたネズミα−鎖から２７kdの分子量を得た）。Ｉｇ
対応物のＶ及びＣ領域との全体的相同性は相対的に低い
（１０〜２６％）。しかしながら、５種類の既知のＩｇ
様遺伝子中に見出される保存された残基の多くが、特に
Ｖ領域及びＪ領域要素中に存在する。ＴＴ１１可変領域
中のシステインの間隔は６５アミノ酸であり、これはラ
イト鎖のそれと同一であり、そして残基３５で始まる配
列“WYRQ”及び残基８３−９１における“DSA-Y-CAV ”
もほとんどのＩ−，Ｇ−，Ｔ−細胞レセプターＶ領域に
おいて高度に保存される。

【００９０】β−鎖及びＨＤＳ４、ほとんどの高度に保
存された部分中Ｊ領域のように、β−鎖共通配列〔ガス
コイグネ等、ネイチュア（Ｎａｔｕｒｅ）（１９８４）
３１０：３８７−８９１〕に相同な７／１６残基及びＪ
_T３（ガスコイグネ等、前掲）と同じ９／１６。ＴＴ１
１はトランスメンブラン領域にＴ−細胞レセプター配列
に特異的な配列“ILLLK ”を有し、免疫グロブリンスー
パーファミリーの他の構成員中には荷電アミノ酸（リジ
ン又はアルギニン）の保存は一般的ではなくそして見出
されない。

【００９１】確立されてはいないが、α−サブユニット
中にＤ領域が存在するという強い支持が存在するようで
ある。特に、Ｊ領域の“SGN ”アミノ酸配列のすぐ５′
（β遺伝子コンプレックス中のＪ_T３の５′境界を標示
する）に、ヌクルオチド配列“GGGG”が存在する。これ
はβ−サブユニットの遺伝子Ｄ領域に特徴的であり、１
４の内７はそれらの３′側の３−７Ｇ間の列を含む〔ト
ネガワ、ネイチュアー（Ｎａｔｕｒｅ）（１９８３）３
０２：５７５−５８１〕。

【００９２】前に記載したナサンブロットデータもＤ領
域の存在を支持する。ＥＬ−４レーン中に明瞭に見られ
そして他のＴ_H系中に観察される２つのバンドは、ＶＤ
ＪＣ転写物〔カバレル等、ネイチュアー（Ｎａｔｕｒ
ｅ）（１９８４）３１０：４２１−４２３〕より３００
nt短いβ−鎖のＤＪＣ転写物に特徴的である。α−及び
β−サブユニットのｍＲＮＡの比率を確立するため、胸
腺細胞、ｃｏｎＡ（コンカナバリンＡ）で刺激された脾
臓及び２Ｂ４ｃＤＮＡライブラリーを、ＴＴ１１，ＨＤ
Ｓ４及びＧβプローブより試験した。ＴＴ１１及びＣ_T
βはそれぞれ２Ｂ４及びｃｏｎＡ脾臓ライブラリー中に
非常によく似た頻度１：１〜１：３で存在するが、ＨＤ
Ｓ４は非常にまれである。未成熟Ｔ−細胞対成熟Ｔ−細
胞におけるＴＴ１１：β−鎖の比率の実質的な変化が観
察され、Ｂ−細胞においてライト鎖免疫グロブリンの発
現がヘビー鎖のそれに続くのと同様に、ＴＴ１１遺伝子
の発現がβ−鎖の発現の後に生ずることが示唆された。

【００９３】上記の結果から、Ｔ−細胞抗原レセプター
サブユニット及びその断片の発現をもたらす新規なＤＮ
Ａ配列及び造成物が提供されることが明らかである。こ
のＤＮＡ配列は、表面膜蛋白質として保持され得るハイ
ブリド蛋白質を製造するための種々の方法において使用
することができ、リンパ球の由来又はタイプを決定する
ため、Ｔ−細胞からＤＮＡ配列を単離するため、Ｔ−細
胞レセプターサブユニットをコードするＤＮＡ配列を製
造するためのプライマーとして使用するため、又は哺乳
動物宿主からの外来性蛋白質の分泌のために使用するた
めのプローブを得るためにラベルすることができる。

【００９４】ペプチドは、Ｔ−細胞抗原レセプターの単
離のため、細胞混合物からのＴ−細胞の除去のため、又
はＴ−細胞イン−ビボ又はイン−ヒドロで細胞してそれ
らの生存性、増殖、因子の分泌等に影響を与えるための
抗体を製造するために使用することができる。前記の発
明は理解を明確にする目的で説明及び例により幾分詳細
に記載されたが、添付された請求の範囲内において幾つ
かの変化及び変法を実施することができることは自明で
あろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、Ｔ−細胞抗原レセプター断片の制限地
図であり、陰を付した部分は異るｃＤＮＡクローン間の
主要相同性を示す。配列決定はマリサム及びジルバー
ト、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシス・オブ・ザ・ユナイテッド
・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）（１９７７）７４：５６０の
方法により行われた。太い矢印は３′−末端ラベル（ク
レノウ）を示し、そして矢印は５′−末端ラベル（ポリ
ヌクレオチドキナーゼ）を示す。

【図２】図２は、８６ＴＩの完全ヌクレオチド配列及び
他のｃＤＮＡクローンの部分配列を示し、５′−非翻訳
領域（ＵＴ）、リーダーポリペプチド及び可変を示し、
番号付与は８６ＴＩのアミノ酸配列に従い、そして可能
性ある炭水化物結合部位（ＣＨＯ）（Ｎ−Ｘ−Ｓ又はＮ
Ｘ−Ｔ）が示されている。

【図３】図３は、８６ＴＩの完全ヌクレオチド配列及び
他のｃＤＮＡクローンの部分配列を示し、連結及び不変
領域を示し、番号付与は８６ＴＩのアミノ酸配列に従
い、そして可能性ある炭水化物結合部位（ＣＨＯ）（Ｎ
−Ｘ−Ｓ又はＮＸ−Ｔ）が示されている。

【図４】図４は、ＴＴ１１ｃＤＮＡクローンの配列決定
ストラテジーを示し、細線はポリヌクレオチドキナーゼ
による５′−末端ラベリングを示し、そして太い線はＤ
ＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片による３′−末端ラ
ベリングを示す。これはさらに、ヌクレオチド配列、推
定されるアミノ酸を示し、そして一般に個々の領域を示
す。“CHO ”はＮ−リンクグリコシル化のための潜在的
なシグナル配列を示す。

【図５】図５は、ＴＴ１１ｃＤＮＡクローンのヌクレオ
チド配列、推定されるアミノ酸を示し、そして一般に個
々の領域を示す。“CHO ”はＮ−リンクグリコシル化の
ための潜在的なシグナル配列を示す。

【手続補正書】

【提出日】平成７年３月３０日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ０７Ｈ 21/04 ＢＣ１２Ｎ 5/10 15/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9453−4ＢＧ０１Ｎ 33/566 // Ａ６１Ｋ 39/395 ＤＵＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ 7729−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ 9281−4Ｂ 15/00 Ｂ (72)発明者デイビス，マークエム. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94041, マウンテンビュー，フォックスボラフドライブ 422 (72)発明者ヘドリック，スティーブンエム. アメリカ合衆国，カリフォルニア 92075, ソラナビーチ，サンタケタ 1031

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｔ−細胞抗原レセプターの少なくとも１
つの断片をコードする約５０nt〜２knt のｃＤＮＡ配
列。
【請求項２】Ｔ−細胞抗原レセプター又はその断片を
コードする約２０knt 以下のＤＮＡ配列。
【請求項３】前記コードがα−サブユニットのための
ものである請求の範囲第２項記載のＤＮＡ配列。
【請求項４】非野性タイプＤＮＡに連結されており、
微生物により認識される複製系を含むハイブリドＤＮＡ
を形成する請求の範囲第２項記載のＤＮＡ配列。
【請求項５】検出可能なシグナルをもたらすためにラ
ベルされている請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ配列。
【請求項６】少なくとも１５ntの、そしてＴ−細胞抗
原レセプターサブユニットの不変領域の少なくとも部分
をコードするＤＮＡ配列。
【請求項７】前記サブユニットがα−サブユニットで
ある請求の範囲第５項に記載のＤＮＡ配列。
【請求項８】非野性タイプＤＮＡに結合した請求の範
囲第６項記載のＤＮＡ配列。
【請求項９】前記不変領域コードＤＮＡ及び前記非野
性タイプＤＮＡがＪ領域をコードする配列により分離さ
れている請求の範囲第８項に記載のＤＮＡ配列。
【請求項１０】Ｔ−細胞抗原レセプターサブユニット
の少なくとも１つの特異的ドメインをコードする約１５
〜２０００ntのｃＤＮＡ配列。
【請求項１１】発現のための転写及び翻訳制御シグナ
ルに連結された請求の範囲第１０項記載のｃＤＮＡ配
列。
【請求項１２】請求の範囲第１０項記載のｃＤＮＡ配
列及び選択のためのマーカーを含む、原核性宿主中での
クローニングのためのクローニングベクター。
【請求項１３】転写及び翻訳シグナル並びにこのシグ
ナルの転写及び翻訳制御のもとにある請求の範囲第１０
項記載のｃＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項１４】第２図中の８６Ｔ１の配列中に存在し
そして非野性タイプＤＮＡに連結されている少なくとも
約１５ntのＤＮＡ配列。
【請求項１５】第３図中のＴＴ１１の配列中に存在し
そして非野性タイプＤＮＡに連結されている少なくとも
約１５ntのＤＮＡ配列。
【請求項１６】Ｔ−細胞抗原レセプターサブユニット
の少なくとも部分をコードするｃＤＮＡを得る方法であ
って：Ｔ−細胞から膜結合ポリＡ⁺ＲＮＡを単離し；こ
の膜結合ＲＮＡからｃＤＮＡを調製し；このｃＤＮＡを
Ｂ−細胞からのメッセンジャーＲＮＡとハイブリダイズ
せしめ；ハイブリドデュプレックスｃＤＮＡ／ＲＮＡか
ら単鎖ｃＤＮＡを分離し；この単鎖ｃＤＮＡをクローン
化してＴ−細胞特異的ｃＤＮＡを得；このクローン化さ
れたＴ−細胞特異的ｃＤＮＡをゲノム性Ｔ−細胞ＤＮＡ
及びゲノム性非Ｔ−細胞ＤＮＡの制限断片とハイブリダ
イズせしめ；そしてＴ−細胞断片とハイブリダイズする
が非Ｔ−細胞断片とはハイブリダイズしないクローン化
ｃＤＮＡを単離する；ことを含んで成る方法。
【請求項１７】Ｔ−細胞抗原レセプターサブユニット
の少なくとも部分をコードするｃＤＮＡを得る方法であ
って；第１のＴ−ヘルパー細胞からのポリＡ⁺細胞質性
ｍＲＮＡからランダムプライムｃＤＮＡを調製し；該ｃ
ＤＮＡを約３００〜４００ntの平均サイズに断片化し；
少なくとも２種類のＴ−ヘルパー細胞又はＴ−ヘルパー
様細胞からのｍＲＮＡとの削減ハイブリダイゼーション
を行ってＴ−細胞レセプター可変領域ＤＮＡについて濃
縮されたプローブ混合物を得る；そしてこのプローブ混
合物を前記第１Ｔ−ヘルパー細胞から作られたｃＤＮＡ
ライブラリーとハイブリダイズせしめ、ハイブリダイズ
するクローンを推定上のＴ−ヘルパー細胞受容体サブユ
ニット遺伝子として選択する；ことを含んで成る方法。