JPH07265099A - Ｒｎａの検出方法 - Google Patents
Ｒｎａの検出方法Info
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- JPH07265099A JPH07265099A JP6061466A JP6146694A JPH07265099A JP H07265099 A JPH07265099 A JP H07265099A JP 6061466 A JP6061466 A JP 6061466A JP 6146694 A JP6146694 A JP 6146694A JP H07265099 A JPH07265099 A JP H07265099A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 沈降性の金属塩を含む細菌培養液にキレート
形成化合物を添加し、次いでアルカリ溶菌し、中和処理
した後、ハイブリダイゼーション法により被検液中の核
酸の存在を検出することを特徴とする核酸の検出方法。 【効果】 溶菌後の金属塩の沈殿形成を阻止することが
でき、ハイブリダイゼーションが阻害されることなく迅
速・簡便に且つ高感度で核酸の検出ができる。
形成化合物を添加し、次いでアルカリ溶菌し、中和処理
した後、ハイブリダイゼーション法により被検液中の核
酸の存在を検出することを特徴とする核酸の検出方法。 【効果】 溶菌後の金属塩の沈殿形成を阻止することが
でき、ハイブリダイゼーションが阻害されることなく迅
速・簡便に且つ高感度で核酸の検出ができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は核酸の検出方法に関し、
さらに詳しくは、沈降性の金属塩を含む細菌培養液から
核酸を高感度で検出する方法に関する。
さらに詳しくは、沈降性の金属塩を含む細菌培養液から
核酸を高感度で検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】細菌の培養液には、通常は２価以上の金
属イオンは含まれていないが、例えば酸を生成する細菌
の場合、その酸を中和するために沈降性の炭酸カルシウ
ムなどを加える場合がある。この場合、菌の増殖ととも
に生成された酸の量に対応してカルシウムイオンは遊離
イオンとなって溶解する。一方、細菌の核酸を抽出する
ために、従来ドデシル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤
や水酸化ナトリウムなどのアルカリがよく使用される
が、上記のように酸によって溶解したカルシウムイオン
などが培養液中に存在する場合、これらの界面活性剤や
アルカリの添加によってカルシウムが再沈殿してしま
う。生じた沈殿は、例えば遠心分離操作といった手段で
除くことが可能であるが、往々にしてそのような沈殿に
核酸が吸着する傾向があり、よって沈殿の除去とともに
核酸の収量の低下を招いてしまう。本発明者らは先に、
ＲＮＡ上で隣接しているハイブリダイゼーションする２
種の核酸プローブを用いることにより、対象のＲＮＡを
安定且つ高感度に検出する方法を開発した。この方法
は、リボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）やメッセンジャーＲ
ＮＡ（ｍＲＮＡ）などを検出する場合に極めて有効な方
法である。しかしながら、沈降性の金属塩が存在してい
る細菌の培養液を使用する場合、アルカリなどによる溶
菌操作によって再び沈殿が形成され、この沈殿によって
ハイブリダイゼーションが阻害されてしまう。これを防
ぐために、遠心分離操作などによって予め培養液を分離
することが一般に行われるが、手間がかかり多量の検体
をこなす上で不都合であり、また、対象となる核酸を損
失する可能性がある。
属イオンは含まれていないが、例えば酸を生成する細菌
の場合、その酸を中和するために沈降性の炭酸カルシウ
ムなどを加える場合がある。この場合、菌の増殖ととも
に生成された酸の量に対応してカルシウムイオンは遊離
イオンとなって溶解する。一方、細菌の核酸を抽出する
ために、従来ドデシル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤
や水酸化ナトリウムなどのアルカリがよく使用される
が、上記のように酸によって溶解したカルシウムイオン
などが培養液中に存在する場合、これらの界面活性剤や
アルカリの添加によってカルシウムが再沈殿してしま
う。生じた沈殿は、例えば遠心分離操作といった手段で
除くことが可能であるが、往々にしてそのような沈殿に
核酸が吸着する傾向があり、よって沈殿の除去とともに
核酸の収量の低下を招いてしまう。本発明者らは先に、
ＲＮＡ上で隣接しているハイブリダイゼーションする２
種の核酸プローブを用いることにより、対象のＲＮＡを
安定且つ高感度に検出する方法を開発した。この方法
は、リボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）やメッセンジャーＲ
ＮＡ（ｍＲＮＡ）などを検出する場合に極めて有効な方
法である。しかしながら、沈降性の金属塩が存在してい
る細菌の培養液を使用する場合、アルカリなどによる溶
菌操作によって再び沈殿が形成され、この沈殿によって
ハイブリダイゼーションが阻害されてしまう。これを防
ぐために、遠心分離操作などによって予め培養液を分離
することが一般に行われるが、手間がかかり多量の検体
をこなす上で不都合であり、また、対象となる核酸を損
失する可能性がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、沈降
性の金属塩を含む細菌培養液から、溶菌操作によってそ
れらの金属塩が再び沈殿することを阻止し、ハイブリダ
イゼーションが阻害されることなく、対象となる核酸を
簡便・迅速に且つ高感度で検出する方法を提供すること
にある。
性の金属塩を含む細菌培養液から、溶菌操作によってそ
れらの金属塩が再び沈殿することを阻止し、ハイブリダ
イゼーションが阻害されることなく、対象となる核酸を
簡便・迅速に且つ高感度で検出する方法を提供すること
にある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成するために鋭意研究を行った結果、溶菌操作を
行う前にキレート形成化合物を添加しておくことで金属
塩の沈殿形成が阻止され、その後の被検核酸の検出が簡
便・迅速に且つ高感度で行われることを見出し、本発明
を完成させるに至った。従って本発明は、沈降性の金属
塩を含む細菌培養液にキレート形成化合物を添加し、次
いでアルカリ溶菌し、中和処理した後、ハイブリダイゼ
ーション法により被検液中の核酸の存在を検出すること
を特徴とする核酸の検出方法に関する。本発明の好まし
い実施態様によれば、上記キレート形成化合物はクエン
酸、酒石酸、アスコルビン酸、エチレンジアミン-N,N,
N',N'−四酢酸、ニトリロ三酢酸、trans-1,2-シクロヘ
キサンジアミン-N,N,N',N'−四酢酸、エチレングリコー
ル-O,O'-ビス（アミノエチル）-N,N,N',N'−四酢酸及び
それらの塩からなる群から選ばれる少なくとも１種であ
る。本発明の核酸の検出方法が利用される細菌の具体例
として、サルモネラ菌が挙げられる。本発明はまた、上
記の核酸がＲＮＡである検出方法を提供する。
的を達成するために鋭意研究を行った結果、溶菌操作を
行う前にキレート形成化合物を添加しておくことで金属
塩の沈殿形成が阻止され、その後の被検核酸の検出が簡
便・迅速に且つ高感度で行われることを見出し、本発明
を完成させるに至った。従って本発明は、沈降性の金属
塩を含む細菌培養液にキレート形成化合物を添加し、次
いでアルカリ溶菌し、中和処理した後、ハイブリダイゼ
ーション法により被検液中の核酸の存在を検出すること
を特徴とする核酸の検出方法に関する。本発明の好まし
い実施態様によれば、上記キレート形成化合物はクエン
酸、酒石酸、アスコルビン酸、エチレンジアミン-N,N,
N',N'−四酢酸、ニトリロ三酢酸、trans-1,2-シクロヘ
キサンジアミン-N,N,N',N'−四酢酸、エチレングリコー
ル-O,O'-ビス（アミノエチル）-N,N,N',N'−四酢酸及び
それらの塩からなる群から選ばれる少なくとも１種であ
る。本発明の核酸の検出方法が利用される細菌の具体例
として、サルモネラ菌が挙げられる。本発明はまた、上
記の核酸がＲＮＡである検出方法を提供する。
【０００５】本発明におけるキレート形成化合物の添加
は、細菌培養液にキレート形成化合物の水溶液を添加す
ることによって実施される。キレート形成化合物の添加
量は、その種類によって多少異なるが、被検液中におい
て一般に0.０２〜2.０Ｍ程度になるのが適当であり、さ
らに好ましくは0.０５〜1.０Ｍ程度が適当である。本発
明において、アルカリ溶菌は常法に従って実施すること
ができ、使用するアルカリとしては、ＮａＯＨ、ＫＯＨ
などが挙げられる。もしこのような方法だけで溶菌しに
くい場合には、細胞壁溶解酵素で前処理を行ってもよ
い。アルカリ溶菌に次ぐ中和処理も常法に従って実施す
ることができ、使用する中和液としては、リン酸バッフ
ァーやトリス塩酸バッファーなどの中性バッファーを含
む塩酸、硫酸、硝酸などが挙げられる。
は、細菌培養液にキレート形成化合物の水溶液を添加す
ることによって実施される。キレート形成化合物の添加
量は、その種類によって多少異なるが、被検液中におい
て一般に0.０２〜2.０Ｍ程度になるのが適当であり、さ
らに好ましくは0.０５〜1.０Ｍ程度が適当である。本発
明において、アルカリ溶菌は常法に従って実施すること
ができ、使用するアルカリとしては、ＮａＯＨ、ＫＯＨ
などが挙げられる。もしこのような方法だけで溶菌しに
くい場合には、細胞壁溶解酵素で前処理を行ってもよ
い。アルカリ溶菌に次ぐ中和処理も常法に従って実施す
ることができ、使用する中和液としては、リン酸バッフ
ァーやトリス塩酸バッファーなどの中性バッファーを含
む塩酸、硫酸、硝酸などが挙げられる。
【０００６】本発明の核酸の検出方法に使用されるハイ
ブリダイゼーション法の一具体例として、２種の核酸プ
ローブを用いるＲＮＡの検出方法（以下、隣接ハリブリ
ダイゼーション法という）を下記に説明する。この方法
は、被検ＲＮＡの塩基配列のうち、特異的な１０塩基以
上の部分配列（Ａ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡと、被
検ＲＮＡ上で部分配列（Ａ）の近傍に存在する１０塩基
以上の部分配列（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを用
意し、一方を捕捉プローブとして担体に固定し、他方を
標識物質で標識して標識プローブとし、被検ＲＮＡを含
む試料及び標識プローブを該担体に固定された捕捉プロ
ーブと接触させて被検ＲＮＡに捕捉プローブと標識プロ
ーブをハイブリダイズさせ、被検ＲＮＡに結合した標識
プローブの標識物質を検出することにより被検ＲＮＡの
存在を検出することを特徴とする。この検出方法では、
２種の核酸プローブを用いることでＲＮＡ分子の切断の
影響を極力防ぎ、またＲＮＡを迅速・簡便に検出するこ
とができる。被検ＲＮＡとしては、例えばリボゾームＲ
ＮＡ（ｒＲＮＡ）が挙げられる。
ブリダイゼーション法の一具体例として、２種の核酸プ
ローブを用いるＲＮＡの検出方法（以下、隣接ハリブリ
ダイゼーション法という）を下記に説明する。この方法
は、被検ＲＮＡの塩基配列のうち、特異的な１０塩基以
上の部分配列（Ａ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡと、被
検ＲＮＡ上で部分配列（Ａ）の近傍に存在する１０塩基
以上の部分配列（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを用
意し、一方を捕捉プローブとして担体に固定し、他方を
標識物質で標識して標識プローブとし、被検ＲＮＡを含
む試料及び標識プローブを該担体に固定された捕捉プロ
ーブと接触させて被検ＲＮＡに捕捉プローブと標識プロ
ーブをハイブリダイズさせ、被検ＲＮＡに結合した標識
プローブの標識物質を検出することにより被検ＲＮＡの
存在を検出することを特徴とする。この検出方法では、
２種の核酸プローブを用いることでＲＮＡ分子の切断の
影響を極力防ぎ、またＲＮＡを迅速・簡便に検出するこ
とができる。被検ＲＮＡとしては、例えばリボゾームＲ
ＮＡ（ｒＲＮＡ）が挙げられる。
【０００７】上記隣接ハリブリダイゼーション法におい
て、特定の細菌、例えばサルモネラ菌のｒＲＮＡの塩基
配列のうち、特異的な１０塩基以上の部分配列（Ａ）の
逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡと、被検ｒＲＮＡ上で部分配
列（Ａ）の近傍に存在する１０塩基以上の部分配列
（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを用意し、一方を捕
捉プローブとして担体に固定し、他方を標識物質で標識
して標識プローブとし、被検ｒＲＮＡを含む試料及び標
識プローブを該担体に固定された捕捉プローブと接触さ
せて被検ＲＮＡに捕捉プローブと標識プローブをハイブ
リダイズさせ、被検ｒＲＮＡに結合した標識プローブの
標識物質を検出することにより、その特定の細菌の存在
を検出することができる。
て、特定の細菌、例えばサルモネラ菌のｒＲＮＡの塩基
配列のうち、特異的な１０塩基以上の部分配列（Ａ）の
逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡと、被検ｒＲＮＡ上で部分配
列（Ａ）の近傍に存在する１０塩基以上の部分配列
（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを用意し、一方を捕
捉プローブとして担体に固定し、他方を標識物質で標識
して標識プローブとし、被検ｒＲＮＡを含む試料及び標
識プローブを該担体に固定された捕捉プローブと接触さ
せて被検ＲＮＡに捕捉プローブと標識プローブをハイブ
リダイズさせ、被検ｒＲＮＡに結合した標識プローブの
標識物質を検出することにより、その特定の細菌の存在
を検出することができる。
【０００８】使用する第１の核酸プローブは、被検ＲＮ
Ａの塩基配列のうち、特異的な１０塩基以上の部分配列
（Ａ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡである。この第１の
核酸プローブは１０塩基以上、好ましくは１５〜５０塩
基のものが適当である。使用する第２の核酸プローブ
は、被検ＲＮＡ上で部分配列（Ａ）の近傍に存在する１
０塩基以上、好ましくは１５〜５０塩基の部分配列
（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡである。部分配列
（Ｂ）は部分配列（Ａ）の近傍に存在することが必要で
あって、部分配列（Ａ）の５’側、３’側のどちらに存
在してもよい。配列（Ｂ）の３’末端と配列（Ａ）の
５’末端が、あるいは配列（Ｂ）の５’末端と配列
（Ａ）の３’末端が完全に隣接していることが好まし
い。配列（Ｂ）の３’末端配列と配列（Ａ）の５’末端
配列、あるいは配列（Ｂ）の５’末端配列と配列（Ａ）
の３’末端配列が重複してもよいが、その場合、それら
の逆相補鎖核酸プローブがハイブリダイズする際に、そ
の重複部分で被検ＲＮＡに対して競合が起こり感度が低
下する確率が高まる。従って、そのような重複部分はで
きるだけ短い方がよく、５塩基未満が好ましく、全く重
複がないこと、すなわち完全に隣接していることがより
好ましい。一方、配列（Ａ）と配列（Ｂ）は重複も隣接
もせず、すなわち離れていてもよいが、それらの逆相補
鎖核酸プローブがハイブリダイズした結果、被検ＲＮＡ
上の配列（Ａ）と配列（Ｂ）の間に１本鎖部分が生じ、
この部分に切断が生じやすくなり、感度が低下する確率
が高まる。従って、配列（Ａ）と配列（Ｂ）が離れて存
在する場合、配列（Ｂ）の３’末端と配列（Ａ）の５’
末端、あるいは配列（Ｂ）の５’末端と配列（Ａ）の
３’末端の距離は、できるだけ短い方がよく、５塩基以
内が好ましく、離れていないこと、すなわち完全に隣接
していることが最も好ましい。
Ａの塩基配列のうち、特異的な１０塩基以上の部分配列
（Ａ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡである。この第１の
核酸プローブは１０塩基以上、好ましくは１５〜５０塩
基のものが適当である。使用する第２の核酸プローブ
は、被検ＲＮＡ上で部分配列（Ａ）の近傍に存在する１
０塩基以上、好ましくは１５〜５０塩基の部分配列
（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡである。部分配列
（Ｂ）は部分配列（Ａ）の近傍に存在することが必要で
あって、部分配列（Ａ）の５’側、３’側のどちらに存
在してもよい。配列（Ｂ）の３’末端と配列（Ａ）の
５’末端が、あるいは配列（Ｂ）の５’末端と配列
（Ａ）の３’末端が完全に隣接していることが好まし
い。配列（Ｂ）の３’末端配列と配列（Ａ）の５’末端
配列、あるいは配列（Ｂ）の５’末端配列と配列（Ａ）
の３’末端配列が重複してもよいが、その場合、それら
の逆相補鎖核酸プローブがハイブリダイズする際に、そ
の重複部分で被検ＲＮＡに対して競合が起こり感度が低
下する確率が高まる。従って、そのような重複部分はで
きるだけ短い方がよく、５塩基未満が好ましく、全く重
複がないこと、すなわち完全に隣接していることがより
好ましい。一方、配列（Ａ）と配列（Ｂ）は重複も隣接
もせず、すなわち離れていてもよいが、それらの逆相補
鎖核酸プローブがハイブリダイズした結果、被検ＲＮＡ
上の配列（Ａ）と配列（Ｂ）の間に１本鎖部分が生じ、
この部分に切断が生じやすくなり、感度が低下する確率
が高まる。従って、配列（Ａ）と配列（Ｂ）が離れて存
在する場合、配列（Ｂ）の３’末端と配列（Ａ）の５’
末端、あるいは配列（Ｂ）の５’末端と配列（Ａ）の
３’末端の距離は、できるだけ短い方がよく、５塩基以
内が好ましく、離れていないこと、すなわち完全に隣接
していることが最も好ましい。
【０００９】配列（Ａ）の逆相補鎖である特異配列ＤＮ
Ａ及び配列（Ａ）に隣接する配列（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮ
Ａである隣接配列ＤＮＡを化学的に合成し、いずれか一
方を捕捉プローブとして担体に固定し、他方を標識物質
で標識して標識プローブとする。特異配列と隣接配列は
いずれを捕捉プローブ（又は標識プローブ）としてもよ
い。標識物質としては、例えば、ジゴキシゲニン（Ｄｉ
ｇ）、ビオチン、臭化デオキシウリジン、フルオロエス
セイン等が挙げられる。この検出方法ではこの捕捉プロ
ーブを適当な担体に固定する。担体としては、例えば、
核酸との結合性が高い有機ポリマーを素材とするマイク
ロタイタープレートなどを用いることができる。捕捉プ
ローブの固定法は、特に限定されるものではないが、例
えば、上記のプレートに捕捉プローブＤＮＡ又はＲＮＡ
溶液を入れ、乾燥後、紫外線照射などにより固定する方
法や、あるいはグルタルアルデヒド法などの共有結合法
を用いてもよい。次に被検ＲＮＡを含む試料と標識プロ
ーブを該担体に固定された捕捉プローブと接触させて被
検ＲＮＡと捕捉プローブ及び標識プローブをハイブリダ
イズさせる。次いで、被検ＲＮＡと結合した標識プロー
ブの標識物質を検出することにより被検ＲＮＡを検出す
る。
Ａ及び配列（Ａ）に隣接する配列（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮ
Ａである隣接配列ＤＮＡを化学的に合成し、いずれか一
方を捕捉プローブとして担体に固定し、他方を標識物質
で標識して標識プローブとする。特異配列と隣接配列は
いずれを捕捉プローブ（又は標識プローブ）としてもよ
い。標識物質としては、例えば、ジゴキシゲニン（Ｄｉ
ｇ）、ビオチン、臭化デオキシウリジン、フルオロエス
セイン等が挙げられる。この検出方法ではこの捕捉プロ
ーブを適当な担体に固定する。担体としては、例えば、
核酸との結合性が高い有機ポリマーを素材とするマイク
ロタイタープレートなどを用いることができる。捕捉プ
ローブの固定法は、特に限定されるものではないが、例
えば、上記のプレートに捕捉プローブＤＮＡ又はＲＮＡ
溶液を入れ、乾燥後、紫外線照射などにより固定する方
法や、あるいはグルタルアルデヒド法などの共有結合法
を用いてもよい。次に被検ＲＮＡを含む試料と標識プロ
ーブを該担体に固定された捕捉プローブと接触させて被
検ＲＮＡと捕捉プローブ及び標識プローブをハイブリダ
イズさせる。次いで、被検ＲＮＡと結合した標識プロー
ブの標識物質を検出することにより被検ＲＮＡを検出す
る。
【００１０】被検ＲＮＡ溶液を、標識プローブとともに
捕捉プローブを固定した担体上に加え、１５〜６０℃で
３分〜１８時間ハイブリダイゼーションを行なう。適切
な溶液（洗浄液１）で洗浄し、標識化合物と結合する物
質に酵素を結合させたものを加え一定時間反応させる。
標識化合物と結合する物質は特定されるものではない
が、例えば標識プローブがビオチンで標識されている場
合にはビオチン結合西洋ワサビペルオキシダーゼとアビ
ジンの混合物、また、Ｄｉｇで標識されている場合には
抗Ｄｉｇ免疫グロブリンと西洋ワサビペルオキシダーゼ
の結合体を用いることができる。適切な溶液（洗浄液
２）で洗浄後、適切な酵素基質を加える。酵素基質は特
定されるものではないが、例えば西洋ワサビペルオキシ
ダーゼを用いた場合には、テトラメチルベンジジンと過
酸化水素を基質とすることによって青色の反応産物を得
ることができる。勿論、蛍光基質や発光基質などを用い
ることもでき、この場合にはより高い検出感度を得るこ
とができる。洗浄液１、２は、特定されるものではない
が、例えば0.05%程度の界面活性剤を含む生理食塩水等
を用いることができる。
捕捉プローブを固定した担体上に加え、１５〜６０℃で
３分〜１８時間ハイブリダイゼーションを行なう。適切
な溶液（洗浄液１）で洗浄し、標識化合物と結合する物
質に酵素を結合させたものを加え一定時間反応させる。
標識化合物と結合する物質は特定されるものではない
が、例えば標識プローブがビオチンで標識されている場
合にはビオチン結合西洋ワサビペルオキシダーゼとアビ
ジンの混合物、また、Ｄｉｇで標識されている場合には
抗Ｄｉｇ免疫グロブリンと西洋ワサビペルオキシダーゼ
の結合体を用いることができる。適切な溶液（洗浄液
２）で洗浄後、適切な酵素基質を加える。酵素基質は特
定されるものではないが、例えば西洋ワサビペルオキシ
ダーゼを用いた場合には、テトラメチルベンジジンと過
酸化水素を基質とすることによって青色の反応産物を得
ることができる。勿論、蛍光基質や発光基質などを用い
ることもでき、この場合にはより高い検出感度を得るこ
とができる。洗浄液１、２は、特定されるものではない
が、例えば0.05%程度の界面活性剤を含む生理食塩水等
を用いることができる。
【００１１】本発明の核酸の検出方法が特に有効である
サルモネラ菌は、最も重要な食中毒菌の１種であり、そ
の迅速で確実な同定法は広く求められている。サルモネ
ラ菌はわずかな数でも問題となるので、通常ＥＭＭブイ
ヨンなどの培地でいったん増殖培養した後、ハーナテト
ラチオン酸塩基礎培地などで選択増殖培養する。サルモ
ネラ菌は多量の酸を生成することから、上記の培地には
炭酸カルシウムが多く含まれている。このような培養液
で溶菌操作を直接実施し、これを検体として隣接ハイブ
リダイゼーション法による検出操作を行うと、ほとんど
検出されなくなる。ここで、溶菌操作を行う前にキレー
ト形成化合物を添加しておくことによって、通常と同等
の感度で検出が可能となる。以下、実施例を挙げて本発
明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定され
るものではない。
サルモネラ菌は、最も重要な食中毒菌の１種であり、そ
の迅速で確実な同定法は広く求められている。サルモネ
ラ菌はわずかな数でも問題となるので、通常ＥＭＭブイ
ヨンなどの培地でいったん増殖培養した後、ハーナテト
ラチオン酸塩基礎培地などで選択増殖培養する。サルモ
ネラ菌は多量の酸を生成することから、上記の培地には
炭酸カルシウムが多く含まれている。このような培養液
で溶菌操作を直接実施し、これを検体として隣接ハイブ
リダイゼーション法による検出操作を行うと、ほとんど
検出されなくなる。ここで、溶菌操作を行う前にキレー
ト形成化合物を添加しておくことによって、通常と同等
の感度で検出が可能となる。以下、実施例を挙げて本発
明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定され
るものではない。
【００１２】
【実施例１】サルモネラ菌のｒＲＮＡの検出 〔隣接ハイブリダイゼーション法に使用する捕捉プロー
ブ及び標識プローブの調製〕サルモネラ菌の２３ＳｒＲ
ＮＡ塩基配列から４つの部分配列を選択し、それぞれ配
列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４で表
される４本の逆相補鎖ＤＮＡを合成した。配列番号１と
配列番号２、及び配列番号３と配列番号４のＤＮＡはそ
れぞれ隣接してサルモネラ菌２３ＳｒＲＮＡにハイブリ
ダイズする。標識プローブには配列番号１と配列番号
３、捕捉プローブには配列番号２と配列番号４のＤＮＡ
を用いた。各ＤＮＡの合成にはＤＮＡ合成装置（ＰＣＲ
−ＭＡＴＥ モデル３９１、ＡＢＩ社）を用いた。な
お、配列番号１と２を用いた系をセットＡ、配列番号３
と４を用いた系をセットＢと記す。 配列番号１： 5'-CTTCA CCTAC GTGTC AGC 配列番号２： 5'-CTTCA GCTCC ATGAG TAAAT CA 配列番号３： 5'-CCTGG AACAC ACACC TACAC G 配列番号４： 5'-GTGTT AAAGT GAACC GGATT TA
ブ及び標識プローブの調製〕サルモネラ菌の２３ＳｒＲ
ＮＡ塩基配列から４つの部分配列を選択し、それぞれ配
列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４で表
される４本の逆相補鎖ＤＮＡを合成した。配列番号１と
配列番号２、及び配列番号３と配列番号４のＤＮＡはそ
れぞれ隣接してサルモネラ菌２３ＳｒＲＮＡにハイブリ
ダイズする。標識プローブには配列番号１と配列番号
３、捕捉プローブには配列番号２と配列番号４のＤＮＡ
を用いた。各ＤＮＡの合成にはＤＮＡ合成装置（ＰＣＲ
−ＭＡＴＥ モデル３９１、ＡＢＩ社）を用いた。な
お、配列番号１と２を用いた系をセットＡ、配列番号３
と４を用いた系をセットＢと記す。 配列番号１： 5'-CTTCA CCTAC GTGTC AGC 配列番号２： 5'-CTTCA GCTCC ATGAG TAAAT CA 配列番号３： 5'-CCTGG AACAC ACACC TACAC G 配列番号４： 5'-GTGTT AAAGT GAACC GGATT TA
【００１３】捕捉プローブを0.02μg/μl になるように
50mMリン酸ナトリウムバッファー,pH8.0に溶解した。こ
れをマイクロタイタープレート（住友ベークライト製、
MS-3608FA）の各ウエルに50μl 加え、80℃で乾燥させ
た。紫外線を120mJ/cm2 照射した後、30mMクエン酸ナト
リウム／300mM 塩化ナトリウム（２ｘＳＳＣ） 200μl
で３、４回洗浄し乾燥させた。得られた捕捉プローブ固
定プレートは４℃で半年以上安定である。標識プローブ
は表１の組成の反応液でＤｉｇ標識を行なった。
50mMリン酸ナトリウムバッファー,pH8.0に溶解した。こ
れをマイクロタイタープレート（住友ベークライト製、
MS-3608FA）の各ウエルに50μl 加え、80℃で乾燥させ
た。紫外線を120mJ/cm2 照射した後、30mMクエン酸ナト
リウム／300mM 塩化ナトリウム（２ｘＳＳＣ） 200μl
で３、４回洗浄し乾燥させた。得られた捕捉プローブ固
定プレートは４℃で半年以上安定である。標識プローブ
は表１の組成の反応液でＤｉｇ標識を行なった。
【００１４】
【表１】 ──────────────────────────────── カコジル酸カリウム 0.1M 塩化コバルト 2mM ジチオスレイトール 0.2mM dATP 1mM ジゴキシゲニン-dUTP 0.2mM プローブ用DNA 1μg ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ 50-100U 反応液量 20μl ────────────────────────────────
【００１５】標識反応後、1/10容の0.2M EDTA、1/10容
の4M LiCl 、3 μg のグリコーゲン及び2.5倍容のエタ
ノールを加え-80 ℃で、一晩放置した。遠心分離により
沈殿を集め、70%エタノールで洗浄し乾燥させた後、0.
２mlの10mMTris-HCl,pH8/1mMEDTA に溶解した。得られ
た標識プローブの４μl を表２に示すハイブリダイゼー
ションバッファーと混合した（標識プローブ液）。な
お、標識プローブ液は４℃で１ヶ月以上の保存が可能で
ある。
の4M LiCl 、3 μg のグリコーゲン及び2.5倍容のエタ
ノールを加え-80 ℃で、一晩放置した。遠心分離により
沈殿を集め、70%エタノールで洗浄し乾燥させた後、0.
２mlの10mMTris-HCl,pH8/1mMEDTA に溶解した。得られ
た標識プローブの４μl を表２に示すハイブリダイゼー
ションバッファーと混合した（標識プローブ液）。な
お、標識プローブ液は４℃で１ヶ月以上の保存が可能で
ある。
【００１６】
【表２】 ハイブリダイゼーションバッファー SSC(*) 2x ホルムアミド 30% ブロッキング剤(ベーリンガーマンハイム) 1% ドデシル硫酸ナトリウム 0.2% イーストtRNA 100μg/ml 鮭精子 DNA(**) 100μg/ml標識プローブ 適量 * 0.15M 塩化ナトリウム/0.015M クエン酸ナトリウム ** あらかじめ100 ℃、10分の変性処理を行なう。
【００１７】〔サルモネラ菌培養液からの被検液の調
製〕平板培地上のサルモネラ菌２種（S. Typhimurium,
S. Enteritidis) のコロニーを１０mlのハーナテトラチ
オン酸塩基礎培地（下記表３）に植菌し３７℃で一晩培
養した。培養液を１０分放置し、上澄み液を0.８ml取
り、下記表４に示される各種キレート形成化合物の水溶
液0.４mlを加えた。1.８N ＮａＯＨを0.１５ml加え、３
７℃、１０分放置後、中和液（1.８N ＨＣｌ／0.２M リ
ン酸バッファーpH7.2）0.１５mlを加えて、これを被検
液とした。なお、菌濃度測定のため、１０分放置した後
の培養液を一部を取り、適当に希釈して普通寒天培地に
塗抹し、37℃で一晩培養し、得られたコロニーをカウン
トし、生菌数を計算した。
製〕平板培地上のサルモネラ菌２種（S. Typhimurium,
S. Enteritidis) のコロニーを１０mlのハーナテトラチ
オン酸塩基礎培地（下記表３）に植菌し３７℃で一晩培
養した。培養液を１０分放置し、上澄み液を0.８ml取
り、下記表４に示される各種キレート形成化合物の水溶
液0.４mlを加えた。1.８N ＮａＯＨを0.１５ml加え、３
７℃、１０分放置後、中和液（1.８N ＨＣｌ／0.２M リ
ン酸バッファーpH7.2）0.１５mlを加えて、これを被検
液とした。なお、菌濃度測定のため、１０分放置した後
の培養液を一部を取り、適当に希釈して普通寒天培地に
塗抹し、37℃で一晩培養し、得られたコロニーをカウン
トし、生菌数を計算した。
【００１８】下記の操作に従って、サルモネラ菌の２３
ＳｒＲＮＡを検出した。被検液50μl と標識プローブ液
50μl を捕捉プローブが固定されたマイクロタイタープ
レートに入れ、37℃、１時間振盪した。なお、ここでの
振盪はわずかでも液が揺れていればよい。0.05%Tween20
を含む生理食塩水（洗浄液）で３回洗浄した後、1%ブロ
ッキング剤(20mM Tris-HCl,pH7.5/0.15M NaCl)で10000
倍に希釈した抗Ｄｉｇヒツジ抗体−西洋ワサビペルオキ
シダーゼ（ＨＲＰ、ベーリンガー・マンハイム社）を加
え30分放置後、洗浄液で３回洗浄し、発色基質液（Ａ
液：0.12% 3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン/0.1M 酢
酸ナトリウム,pH5/30%ジメチルホルムアミド、Ｂ液：0.
03% 過酸化水素/0.2% リン酸、使用時にＡ液とＢ液を
１：１で混合）100 μlを加え5-15分放置する。得られ
た青色液の吸光度を655nm の波長で測定した。表４にそ
の結果を示す。
ＳｒＲＮＡを検出した。被検液50μl と標識プローブ液
50μl を捕捉プローブが固定されたマイクロタイタープ
レートに入れ、37℃、１時間振盪した。なお、ここでの
振盪はわずかでも液が揺れていればよい。0.05%Tween20
を含む生理食塩水（洗浄液）で３回洗浄した後、1%ブロ
ッキング剤(20mM Tris-HCl,pH7.5/0.15M NaCl)で10000
倍に希釈した抗Ｄｉｇヒツジ抗体−西洋ワサビペルオキ
シダーゼ（ＨＲＰ、ベーリンガー・マンハイム社）を加
え30分放置後、洗浄液で３回洗浄し、発色基質液（Ａ
液：0.12% 3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン/0.1M 酢
酸ナトリウム,pH5/30%ジメチルホルムアミド、Ｂ液：0.
03% 過酸化水素/0.2% リン酸、使用時にＡ液とＢ液を
１：１で混合）100 μlを加え5-15分放置する。得られ
た青色液の吸光度を655nm の波長で測定した。表４にそ
の結果を示す。
【００１９】
【表３】 ハーナテトラチオン酸塩基礎培地の組成（１
リットル中、単位ｇ） ペプトン １８ 粉末酵母エキス ２ ブドウ糖 0.５ Ｄ−マンニット 2.５ 塩化ナトリウム ５ デオキシコール酸ナトリウム 0.５ 沈降炭酸カルシウム ２５ 無水チオ硫酸ナトリウム ２６ ブリリアントグリーン 0.０１ ヨウ素 ５ ヨウ化カリウム ８
リットル中、単位ｇ） ペプトン １８ 粉末酵母エキス ２ ブドウ糖 0.５ Ｄ−マンニット 2.５ 塩化ナトリウム ５ デオキシコール酸ナトリウム 0.５ 沈降炭酸カルシウム ２５ 無水チオ硫酸ナトリウム ２６ ブリリアントグリーン 0.０１ ヨウ素 ５ ヨウ化カリウム ８
【００２０】
【表４】 サルモネラ菌検出試験における各種キレート
形成化合物の効果 ──────────────────────────────────── 添加した 沈殿 S. Typhimurium S. Enteritidis キレート形成化合物水溶液1) 形成2) (菌濃度 1x107/ml) (1x108/ml) セット A セット B セット A セット B ──────────────────────────────────── 水（比較） 多 0.032 0.056 0.025 0.045 0.5M EDTA3) (pH8.0) なし >3 >3 >3 >3 1Mクエン酸(pH8.0) 少 0.092 0.136 0.155 0.197 1M酒石酸カリウムナトリウム(pH8.2) 少 0.097 0.136 0.114 0.134 2Mアスコルビン酸ナトリウム(pH7.6) 少 >3 >3 >3 >3 0.5M NTA4)(pH8.0) 痕跡 >3 >3 >3 >3 0.5M CYDTA5)(pH8.0) なし >3 >3 >3 >3 0.5M GEDTA6)(pH8.0) なし >3 >3 >3 >3 ──────────────────────────────────── 1) pHの調整は水酸化ナトリウムで行った。 2) アルカリ液を加えたときの沈殿形成量 3) エチレンジアミン-N,N,N',N'−四酢酸二ナトリウム 4) ニトリロ三酢酸 5) trans-1,2-シクロヘキサンジアミン-N,N,N',N'−四
酢酸 6) エチレングリコール-O,O'-ビス（アミノエチル）-
N,N,N',N'−四酢酸
形成化合物の効果 ──────────────────────────────────── 添加した 沈殿 S. Typhimurium S. Enteritidis キレート形成化合物水溶液1) 形成2) (菌濃度 1x107/ml) (1x108/ml) セット A セット B セット A セット B ──────────────────────────────────── 水（比較） 多 0.032 0.056 0.025 0.045 0.5M EDTA3) (pH8.0) なし >3 >3 >3 >3 1Mクエン酸(pH8.0) 少 0.092 0.136 0.155 0.197 1M酒石酸カリウムナトリウム(pH8.2) 少 0.097 0.136 0.114 0.134 2Mアスコルビン酸ナトリウム(pH7.6) 少 >3 >3 >3 >3 0.5M NTA4)(pH8.0) 痕跡 >3 >3 >3 >3 0.5M CYDTA5)(pH8.0) なし >3 >3 >3 >3 0.5M GEDTA6)(pH8.0) なし >3 >3 >3 >3 ──────────────────────────────────── 1) pHの調整は水酸化ナトリウムで行った。 2) アルカリ液を加えたときの沈殿形成量 3) エチレンジアミン-N,N,N',N'−四酢酸二ナトリウム 4) ニトリロ三酢酸 5) trans-1,2-シクロヘキサンジアミン-N,N,N',N'−四
酢酸 6) エチレングリコール-O,O'-ビス（アミノエチル）-
N,N,N',N'−四酢酸
【００２１】上記表４からわかるように、各種キレート
形成化合物によってカルシウムの沈殿形成が阻止され、
ハイブリダイゼーションがよく達成されている。また、
沈殿形成量が少ないほど、検出値が高くなっている。
形成化合物によってカルシウムの沈殿形成が阻止され、
ハイブリダイゼーションがよく達成されている。また、
沈殿形成量が少ないほど、検出値が高くなっている。
【００２２】
【実施例２】実施例１と同様の方法を用い、上記プロー
ブセットＢを用いてS. Typhimurium検出試験を行った。
ただし、被検液の調製において、エチレンジアミン-N,
N,N',N'−四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）添加濃度を
変化させて、検出値への影響を調べた。結果を表５に示
す。
ブセットＢを用いてS. Typhimurium検出試験を行った。
ただし、被検液の調製において、エチレンジアミン-N,
N,N',N'−四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）添加濃度を
変化させて、検出値への影響を調べた。結果を表５に示
す。
【００２３】
【表５】 ────────────────────────── 添加したEDTA溶液の濃度（Ｍ） 吸光度（655nm) ────────────────────────── 0 0.041 0.05 0.038 0.125 2.740 0.25 >3 0.375 >3 0.5 >3 ────────────────────────── （菌濃度は１×107/ml）
【００２４】
【発明の効果】溶菌後の金属塩の沈殿形成を阻止するこ
とができ、さらにハイブリダイゼーションが阻害される
ことなく迅速・簡便に且つ高感度で核酸の検出ができ
る。
とができ、さらにハイブリダイゼーションが阻害される
ことなく迅速・簡便に且つ高感度で核酸の検出ができ
る。
【００２５】
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTTCA CCTAC GTGTC AGC 18
【００２６】配列番号：２ 配列の長さ：２2 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTTCA GCTCC ATGAG TAAAT CA 22
【００２７】配列番号：３ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCTGG AACAC ACACC TACAC G 21
【００２８】配列番号：４ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTGTT AAAGT GAACC GGATT TA 22
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 三瀬 静男 神奈川県厚木市森の里４−25−８ (72)発明者 種田 貴至 千葉県山武郡山武町椎崎968−18 (72)発明者 並松 孝憲 千葉県市川市若宮２−11−11 全農中山寮
Claims (11)
- 【請求項１】 沈降性の金属塩を含む細菌培養液にキレ
ート形成化合物を添加し、次いでアルカリ溶菌し、中和
処理した後、ハイブリダイゼーション法により被検液中
の核酸の存在を検出することを特徴とする核酸の検出方
法。 - 【請求項２】 キレート形成化合物がクエン酸、酒石
酸、アスコルビン酸、エチレンジアミン-N,N,N',N'−四
酢酸、ニトリロ三酢酸、trans-1,2-シクロヘキサンジア
ミン-N,N,N',N'−四酢酸、エチレングリコール-O,O'-ビ
ス（アミノエチル）-N,N,N',N'−四酢酸及びそれらの塩
からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１
記載の核酸の検出方法。 - 【請求項３】 細菌がサルモネラ菌である請求項１また
は２に記載の核酸の検出方法。 - 【請求項４】 核酸がＲＮＡである請求項１〜３のいず
れか１項に記載の核酸の検出方法。 - 【請求項５】 ハイブリダイゼーション法が２種の核酸
プローブを用いる方法であって、被検ＲＮＡの塩基配列
のうち、特異的な１０塩基以上の部分配列（Ａ）の逆相
補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡと、被検ＲＮＡ上で部分配列
（Ａ）の近傍に存在する１０塩基以上の部分配列（Ｂ）
の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを用意し、一方を捕捉プロ
ーブとして担体に固定し、他方を標識物質で標識して標
識プローブとし、被検ＲＮＡを含む試料及び標識プロー
ブを該担体に固定された捕捉プローブと接触させて被検
ＲＮＡに捕捉プローブと標識プローブをハイブリダイズ
させ、被検ＲＮＡに結合した標識プローブの標識物質を
検出することにより被検ＲＮＡの存在を検出することを
特徴とするハイブリダイゼーション法である、請求項４
項記載の核酸の検出方法。 - 【請求項６】 部分配列（Ｂ）の３’末端と部分配列
（Ａ）の５’末端が、あるいは部分配列（Ｂ）の５’末
端と部分配列（Ａ）の３’末端が完全に隣接しているこ
とを特徴とする、請求項５記載の核酸の検出方法。 - 【請求項７】 部分配列（Ａ）と（Ｂ）が離れていて、
部分配列（Ｂ）の３’末端と部分配列（Ａ）の５’末
端、あるいは部分配列（Ｂ）の５’末端と部分配列
（Ａ）の３’末端の距離が５塩基以内であることを特徴
とする、請求項５記載の核酸の検出方法。 - 【請求項８】 部分配列（Ｂ）の３’末端配列と部分配
列（Ａ）の５’末端配列、あるいは部分配列（Ｂ）の
５’末端配列と部分配列（Ａ）の３’末端配列が重複し
ていて、該重複部分が５塩基未満であることを特徴とす
る、請求項５記載の核酸の検出方法。 - 【請求項９】 標識物質が、ジゴキシゲニン又はビオチ
ンである請求項５記載の核酸の検出方法。 - 【請求項１０】 ジゴキシゲニン又はビオチンを、抗ジ
ゴキシゲニン抗体−酵素複合体又はビオチン−アビジン
−酵素複合体を用いて検出する請求項９記載の核酸の検
出方法。 - 【請求項１１】 被検ＲＮＡがリボゾームＲＮＡである
請求項５記載の核酸の検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6146694A JP3598127B2 (ja) | 1994-03-30 | 1994-03-30 | Ｒｎａの検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6146694A JP3598127B2 (ja) | 1994-03-30 | 1994-03-30 | Ｒｎａの検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07265099A true JPH07265099A (ja) | 1995-10-17 |
| JP3598127B2 JP3598127B2 (ja) | 2004-12-08 |
Family
ID=13171856
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6146694A Expired - Lifetime JP3598127B2 (ja) | 1994-03-30 | 1994-03-30 | Ｒｎａの検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3598127B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2116617A3 (en) * | 2000-09-26 | 2010-01-20 | Boston Probes, Inc. | Probes, probe sets, methods and kits pertaining to the detection, identification and/or enumeration of bacteria |
-
1994
- 1994-03-30 JP JP6146694A patent/JP3598127B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2116617A3 (en) * | 2000-09-26 | 2010-01-20 | Boston Probes, Inc. | Probes, probe sets, methods and kits pertaining to the detection, identification and/or enumeration of bacteria |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3598127B2 (ja) | 2004-12-08 |
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