JP3598127B2 - Rnaの検出方法 - Google Patents
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Description
【産業上の利用分野】
本発明は核酸の検出方法に関し、さらに詳しくは、沈降性の金属塩を含む細菌培養液から核酸を高感度で検出する方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
細菌の培養液には、通常は2価以上の金属イオンは含まれていないが、例えば酸を生成する細菌の場合、その酸を中和するために沈降性の炭酸カルシウムなどを加える場合がある。この場合、菌の増殖とともに生成された酸の量に対応してカルシウムイオンは遊離イオンとなって溶解する。一方、細菌の核酸を抽出するために、従来ドデシル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤や水酸化ナトリウムなどのアルカリがよく使用されるが、上記のように酸によって溶解したカルシウムイオンなどが培養液中に存在する場合、これらの界面活性剤やアルカリの添加によってカルシウムが再沈殿してしまう。生じた沈殿は、例えば遠心分離操作といった手段で除くことが可能であるが、往々にしてそのような沈殿に核酸が吸着する傾向があり、よって沈殿の除去とともに核酸の収量の低下を招いてしまう。
本発明者らは先に、RNA上で隣接しているハイブリダイゼーションする2種の核酸プローブを用いることにより、対象のRNAを安定且つ高感度に検出する方法を開発した。この方法は、リボゾームRNA(rRNA)やメッセンジャーRNA(mRNA)などを検出する場合に極めて有効な方法である。しかしながら、沈降性の金属塩が存在している細菌の培養液を使用する場合、アルカリなどによる溶菌操作によって再び沈殿が形成され、この沈殿によってハイブリダイゼーションが阻害されてしまう。これを防ぐために、遠心分離操作などによって予め培養液を分離することが一般に行われるが、手間がかかり多量の検体をこなす上で不都合であり、また、対象となる核酸を損失する可能性がある。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、沈降性の金属塩を含む細菌培養液から、溶菌操作によってそれらの金属塩が再び沈殿することを阻止し、ハイブリダイゼーションが阻害されることなく、対象となる核酸を簡便・迅速に且つ高感度で検出する方法を提供することにある。
【0004】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の目的を達成するために鋭意研究を行った結果、溶菌操作を行う前にキレート形成化合物を添加しておくことで金属塩の沈殿形成が阻止され、その後の被検核酸の検出が簡便・迅速に且つ高感度で行われることを見出し、本発明を完成させるに至った。
従って本発明は、沈降性の金属塩を含む細菌培養液にキレート形成化合物を添加し、次いでアルカリ溶菌し、中和処理した後、ハイブリダイゼーション法により被検液中の核酸の存在を検出することを特徴とする核酸の検出方法に関する。
本発明の好ましい実施態様によれば、上記キレート形成化合物はクエン酸、酒石酸、アスコルビン酸、エチレンジアミン−N,N,N’,N’−四酢酸、ニトリロ三酢酸、trans−1,2−シクロヘキサンジアミン−N,N,N’,N’−四酢酸、エチレングリコール−O,O’−ビス(アミノエチル)−N,N,N’,N’−四酢酸及びそれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも1種である。
本発明の核酸の検出方法が利用される細菌の具体例として、サルモネラ菌が挙げられる。
本発明はまた、上記の核酸がRNAである検出方法を提供する。
【0005】
本発明におけるキレート形成化合物の添加は、細菌培養液にキレート形成化合物の水溶液を添加することによって実施される。
キレート形成化合物の添加量は、その種類によって多少異なるが、被検液中において一般に0.02〜2.0M程度になるのが適当であり、さらに好ましくは0.05〜1.0M程度が適当である。
本発明において、アルカリ溶菌は常法に従って実施することができ、使用するアルカリとしては、NaOH、KOHなどが挙げられる。もしこのような方法だけで溶菌しにくい場合には、細胞壁溶解酵素で前処理を行ってもよい。
アルカリ溶菌に次ぐ中和処理も常法に従って実施することができ、使用する中和液としては、リン酸バッファーやトリス塩酸バッファーなどの中性バッファーを含む塩酸、硫酸、硝酸などが挙げられる。
【0006】
本発明の核酸の検出方法に使用されるハイブリダイゼーション法の一具体例として、2種の核酸プローブを用いるRNAの検出方法(以下、隣接ハリブリダイゼーション法という)を下記に説明する。
この方法は、被検RNAの塩基配列のうち、特異的な10塩基以上の部分配列(A)の逆相補鎖DNA又はRNAと、被検RNA上で部分配列(A)の近傍に存在する10塩基以上の部分配列(B)の逆相補鎖DNA又はRNAを用意し、一方を捕捉プローブとして担体に固定し、他方を標識物質で標識して標識プローブとし、被検RNAを含む試料及び標識プローブを該担体に固定された捕捉プローブと接触させて被検RNAに捕捉プローブと標識プローブをハイブリダイズさせ、被検RNAに結合した標識プローブの標識物質を検出することにより被検RNAの存在を検出することを特徴とする。
この検出方法では、2種の核酸プローブを用いることでRNA分子の切断の影響を極力防ぎ、またRNAを迅速・簡便に検出することができる。
被検RNAとしては、例えばリボゾームRNA(rRNA)が挙げられる。
【0007】
上記隣接ハリブリダイゼーション法において、特定の細菌、例えばサルモネラ菌のrRNAの塩基配列のうち、特異的な10塩基以上の部分配列(A)の逆相補鎖DNA又はRNAと、被検rRNA上で部分配列(A)の近傍に存在する10塩基以上の部分配列(B)の逆相補鎖DNA又はRNAを用意し、一方を捕捉プローブとして担体に固定し、他方を標識物質で標識して標識プローブとし、被検rRNAを含む試料及び標識プローブを該担体に固定された捕捉プローブと接触させて被検RNAに捕捉プローブと標識プローブをハイブリダイズさせ、被検rRNAに結合した標識プローブの標識物質を検出することにより、その特定の細菌の存在を検出することができる。
【0008】
使用する第1の核酸プローブは、被検RNAの塩基配列のうち、特異的な10塩基以上の部分配列(A)の逆相補鎖DNA又はRNAである。この第1の核酸プローブは10塩基以上、好ましくは15〜50塩基のものが適当である。
使用する第2の核酸プローブは、被検RNA上で部分配列(A)の近傍に存在する10塩基以上、好ましくは15〜50塩基の部分配列(B)の逆相補鎖DNA又はRNAである。
部分配列(B)は部分配列(A)の近傍に存在することが必要であって、部分配列(A)の5’側、3’側のどちらに存在してもよい。配列(B)の3’末端と配列(A)の5’末端が、あるいは配列(B)の5’末端と配列(A)の3’末端が完全に隣接していることが好ましい。
配列(B)の3’末端配列と配列(A)の5’末端配列、あるいは配列(B)の5’末端配列と配列(A)の3’末端配列が重複してもよいが、その場合、それらの逆相補鎖核酸プローブがハイブリダイズする際に、その重複部分で被検RNAに対して競合が起こり感度が低下する確率が高まる。従って、そのような重複部分はできるだけ短い方がよく、5塩基未満が好ましく、全く重複がないこと、すなわち完全に隣接していることがより好ましい。
一方、配列(A)と配列(B)は重複も隣接もせず、すなわち離れていてもよいが、それらの逆相補鎖核酸プローブがハイブリダイズした結果、被検RNA上の配列(A)と配列(B)の間に1本鎖部分が生じ、この部分に切断が生じやすくなり、感度が低下する確率が高まる。従って、配列(A)と配列(B)が離れて存在する場合、配列(B)の3’末端と配列(A)の5’末端、あるいは配列(B)の5’末端と配列(A)の3’末端の距離は、できるだけ短い方がよく、5塩基以内が好ましく、離れていないこと、すなわち完全に隣接していることが最も好ましい。
【0009】
配列(A)の逆相補鎖である特異配列DNA及び配列(A)に隣接する配列(B)の逆相補鎖DNAである隣接配列DNAを化学的に合成し、いずれか一方を捕捉プローブとして担体に固定し、他方を標識物質で標識して標識プローブとする。特異配列と隣接配列はいずれを捕捉プローブ(又は標識プローブ)としてもよい。標識物質としては、例えば、ジゴキシゲニン(Dig)、ビオチン、臭化デオキシウリジン、フルオロエスセイン等が挙げられる。
この検出方法ではこの捕捉プローブを適当な担体に固定する。担体としては、例えば、核酸との結合性が高い有機ポリマーを素材とするマイクロタイタープレートなどを用いることができる。捕捉プローブの固定法は、特に限定されるものではないが、例えば、上記のプレートに捕捉プローブDNA又はRNA溶液を入れ、乾燥後、紫外線照射などにより固定する方法や、あるいはグルタルアルデヒド法などの共有結合法を用いてもよい。
次に被検RNAを含む試料と標識プローブを該担体に固定された捕捉プローブと接触させて被検RNAと捕捉プローブ及び標識プローブをハイブリダイズさせる。次いで、被検RNAと結合した標識プローブの標識物質を検出することにより被検RNAを検出する。
【0010】
被検RNA溶液を、標識プローブとともに捕捉プローブを固定した担体上に加え、15〜60℃で3分〜18時間ハイブリダイゼーションを行なう。適切な溶液(洗浄液1)で洗浄し、標識化合物と結合する物質に酵素を結合させたものを加え一定時間反応させる。標識化合物と結合する物質は特定されるものではないが、例えば標識プローブがビオチンで標識されている場合にはビオチン結合西洋ワサビペルオキシダーゼとアビジンの混合物、また、Digで標識されている場合には抗Dig免疫グロブリンと西洋ワサビペルオキシダーゼの結合体を用いることができる。
適切な溶液(洗浄液2)で洗浄後、適切な酵素基質を加える。酵素基質は特定されるものではないが、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼを用いた場合には、テトラメチルベンジジンと過酸化水素を基質とすることによって青色の反応産物を得ることができる。勿論、蛍光基質や発光基質などを用いることもでき、この場合にはより高い検出感度を得ることができる。
洗浄液1、2は、特定されるものではないが、例えば0.05%程度の界面活性剤を含む生理食塩水等を用いることができる。
【0011】
本発明の核酸の検出方法が特に有効であるサルモネラ菌は、最も重要な食中毒菌の1種であり、その迅速で確実な同定法は広く求められている。サルモネラ菌はわずかな数でも問題となるので、通常EMMブイヨンなどの培地でいったん増殖培養した後、ハーナテトラチオン酸塩基礎培地などで選択増殖培養する。サルモネラ菌は多量の酸を生成することから、上記の培地には炭酸カルシウムが多く含まれている。このような培養液で溶菌操作を直接実施し、これを検体として隣接ハイブリダイゼーション法による検出操作を行うと、ほとんど検出されなくなる。ここで、溶菌操作を行う前にキレート形成化合物を添加しておくことによって、通常と同等の感度で検出が可能となる。
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【0012】
【実施例1】
サルモネラ菌のrRNAの検出
〔隣接ハイブリダイゼーション法に使用する捕捉プローブ及び標識プローブの調製〕
サルモネラ菌の23SrRNA塩基配列から4つの部分配列を選択し、それぞれ配列番号1、配列番号2、配列番号3及び配列番号4で表される4本の逆相補鎖DNAを合成した。配列番号1と配列番号2、及び配列番号3と配列番号4のDNAはそれぞれ隣接してサルモネラ菌23SrRNAにハイブリダイズする。標識プローブには配列番号1と配列番号3、捕捉プローブには配列番号2と配列番号4のDNAを用いた。各DNAの合成にはDNA合成装置(PCR−MATE モデル391、ABI社)を用いた。なお、配列番号1と2を用いた系をセットA、配列番号3と4を用いた系をセットBと記す。
【0013】
捕捉プローブを0.02μg/μl になるように50mMリン酸ナトリウムバッファー,pH8.0に溶解した。これをマイクロタイタープレート(住友ベークライト製、MS−3608FA)の各ウエルに50μl 加え、80℃で乾燥させた。紫外線を120mJ/cm2 照射した後、30mMクエン酸ナトリウム/300mM 塩化ナトリウム(2xSSC) 200μl で3、4回洗浄し乾燥させた。得られた捕捉プローブ固定プレートは4℃で半年以上安定である。
標識プローブは表1の組成の反応液でDig標識を行なった。
【0014】
【表1】
【0015】
標識反応後、1/10容の0.2M EDTA、1/10容の4M LiCl 、3 μg のグリコーゲン及び2.5倍容のエタノールを加え−80 ℃で、一晩放置した。遠心分離により沈殿を集め、70%エタノールで洗浄し乾燥させた後、0.2mlの10mMTris−HCl,pH8/1mM EDTA に溶解した。
得られた標識プローブの4μl を表2に示すハイブリダイゼーションバッファーと混合した(標識プローブ液)。なお、標識プローブ液は4℃で1ヶ月以上の保存が可能である。
【0016】
【表2】
【0017】
〔サルモネラ菌培養液からの被検液の調製〕
平板培地上のサルモネラ菌2種(S. Typhimurium, S. Enteritidis) のコロニーを10mlのハーナテトラチオン酸塩基礎培地(下記表3)に植菌し37℃で一晩培養した。培養液を10分放置し、上澄み液を0.8ml取り、下記表4に示される各種キレート形成化合物の水溶液0.4mlを加えた。1.8N NaOHを0.15ml加え、37℃、10分放置後、中和液(1.8N HCl/0.2M リン酸バッファー pH7.2)0.15mlを加えて、これを被検液とした。なお、菌濃度測定のため、10分放置した後の培養液を一部を取り、適当に希釈して普通寒天培地に塗抹し、37℃で一晩培養し、得られたコロニーをカウントし、生菌数を計算した。
【0018】
下記の操作に従って、サルモネラ菌の23SrRNAを検出した。
被検液50μl と標識プローブ液50μl を捕捉プローブが固定されたマイクロタイタープレートに入れ、37℃、1時間振盪した。なお、ここでの振盪はわずかでも液が揺れていればよい。
0.05%Tween20を含む生理食塩水(洗浄液)で3回洗浄した後、1%ブロッキング剤(20mM Tris−HCl,pH7.5/0.15M NaCl)で10000 倍に希釈した抗Digヒツジ抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP、ベーリンガー・マンハイム社)を加え30分放置後、洗浄液で3回洗浄し、発色基質液(A液:0.12% 3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン/0.1M 酢酸ナトリウム,pH5/30%ジメチルホルムアミド、B液:0.03% 過酸化水素/0.2% リン酸、使用時にA液とB液を1:1で混合)100 μl を加え5−15分放置する。得られた青色液の吸光度を655nm の波長で測定した。表4にその結果を示す。
【0019】
【0020】
【0021】
上記表4からわかるように、各種キレート形成化合物によってカルシウムの沈殿形成が阻止され、ハイブリダイゼーションがよく達成されている。また、沈殿形成量が少ないほど、検出値が高くなっている。
【0022】
【実施例2】
実施例1と同様の方法を用い、上記プローブセットBを用いてS. Typhimurium検出試験を行った。ただし、被検液の調製において、エチレンジアミン−N,N,N’,N’−四酢酸二ナトリウム(EDTA)添加濃度を変化させて、検出値への影響を調べた。結果を表5に示す。
【0023】
【表5】
【0024】
【発明の効果】
溶菌後の金属塩の沈殿形成を阻止することができ、さらにハイブリダイゼーションが阻害されることなく迅速・簡便に且つ高感度で核酸の検出ができる。
【0025】
【配列表】
【0026】
【0027】
【0028】
Claims (7)
- 沈降性の金属塩を含む細菌培養液に、アスコルビン酸、エチレンジアミン -N,N,N',N' −四酢酸、ニトリロ三酢酸、 trans-1,2- シクロヘキサンジアミン -N,N,N',N' −四酢酸、エチレングリコール -O,O'- ビス(アミノエチル) -N,N,N',N' −四酢酸及びそれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも1種のキレート形成化合物を添加し、次いでアルカリ溶菌し、中和処理した後、これを被検液として、ハイブリダイゼーション法により該被検液中のサルモネラ菌RNAの存在を検出することを含む核酸の検出方法であって、該ハイブリダイゼーション法が2種の核酸プローブを用いる方法であって、サルモネラ菌RNAの塩基配列のうち、特異的な10塩基以上の部分配列(A)の逆相補鎖DNA又はRNAと、サルモネラ菌RNA上で部分配列(A)の近傍に存在する10塩基以上の部分配列(B)の逆相補鎖DNA又はRNAを用意し、一方を捕捉プローブとして担体に固定し、他方を標識物質で標識して標識プローブとし、被検RNAを含む試料及び標識プローブを該担体に固定された捕捉プローブと接触させて被検RNAに捕捉プローブと標識プローブをハイブリダイズさせ、被検RNAに結合した標識プローブの標識物質を検出することによりサルモネラ菌RNAの存在を検出することを特徴とするハイブリダイゼーション法である、核酸の検出方法。
- 部分配列(B)の3’末端と部分配列(A)の5’末端が、あるいは部分配列(B)の5’末端と部分配列(A)の3’末端が完全に隣接していることを特徴とする、請求項1記載の核酸の検出方法。
- 部分配列(A)と(B)が離れていて、部分配列(B)の3’末端と部分配列(A)の5’末端、あるいは部分配列(B)の5’末端と部分配列(A)の3’末端の距離が5塩基以内であることを特徴とする、請求項1記載の核酸の検出方法。
- 部分配列(B)の3’末端配列と部分配列(A)の5’末端配列、あるいは部分配列(B)の5’末端配列と部分配列(A)の3’末端配列が重複していて、該重複部分が5塩基未満であることを特徴とする、請求項1記載の核酸の検出方法。
- 標識物質が、ジゴキシゲニン又はビオチンである請求項1記載の核酸の検出方法。
- ジゴキシゲニン又はビオチンを、抗ジゴキシゲニン抗体−酵素複合体又はビオチン−アビジン−酵素複合体を用いて検出する請求項5記載の核酸の検出方法。
- 被検RNAがリボゾームRNAである請求項1記載の核酸の検出方法。
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