JPH0725897A - タンパク質の安定化法 - Google Patents
タンパク質の安定化法Info
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- JPH0725897A JPH0725897A JP5298670A JP29867093A JPH0725897A JP H0725897 A JPH0725897 A JP H0725897A JP 5298670 A JP5298670 A JP 5298670A JP 29867093 A JP29867093 A JP 29867093A JP H0725897 A JPH0725897 A JP H0725897A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
- C07K1/1133—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by redox-reactions involving cystein/cystin side chains
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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Abstract
(57)【要約】
【構成】水溶液中のタンパク質を安定化させるために、
小型熱ショックタンパク質 (小型 Hsp) ファミリーの1
種および数種のタンパク質を、タンパク質を含む水溶液
に添加する。 【効果】変性タンパク質のin vitro再生の促進するため
に、または試験溶液中のタンパク質成分の安定性が低い
ために干渉が生じ得るタンパク質含有溶液において光学
試験の感度を一定に維持するために使用できる。
小型熱ショックタンパク質 (小型 Hsp) ファミリーの1
種および数種のタンパク質を、タンパク質を含む水溶液
に添加する。 【効果】変性タンパク質のin vitro再生の促進するため
に、または試験溶液中のタンパク質成分の安定性が低い
ために干渉が生じ得るタンパク質含有溶液において光学
試験の感度を一定に維持するために使用できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は安定化剤として作用する
タンパク質成分の添加による、水溶液中のタンパク質の
安定化法に関する。
タンパク質成分の添加による、水溶液中のタンパク質の
安定化法に関する。
【０００２】
【従来の技術】小型熱ショックタンパク質ファミリー(
小型 Hsp) は、酵母(Hsp26) 、脊椎動物(Hsp24、Hsp2
8)、ショウジョウバエ(Hsp22、23、26、28) 、マウス(H
sp25) の1 種または数種のタンパク質および植物中の20
種以上のタンパク質を含む不均一群である(Nover & Sch
arf, Eur. J. Biochem. 139 (1984), 303-313; Lindqui
st& Craig, Ann. Rev. Genet. 2 (1988), 631-677) 。
その分子量は、生物に応じて15および40 kDaの間であ
り、ほとんどの細胞と組織で小型Hsp はストレスの非存
在下でも合成され、そして700 kDa 以上の分子量を持つ
細胞質ゾル凝集体は (熱ショック顆粒) として存在する
(Arrigo et al., Mol. Cell. Biol. 8 (1988),5059-507
1) 。熱ショックおよび化学ストレスが小型 Hspの合成
を誘導し、小型Hspは総細胞タンパク質の最高1%を占め
るまでになる(Osterreich et al., Bio-med. Biochim.
Acta 49 (1990), 219-226)。さらに前述のストレス因子
はタンパク質のリン酸化の程度と、その細胞内局在化に
変化をもたらす(Arrigo et al.上記; Zantema et al.,
J. Biol. Chem. 267 (1992), 12936-12941) 。その不均
一性にもかかわらず、種々の生物の小型Hsp は同じ疎水
性プロフィールと同一アミノ酸配列の小領域を有してい
る(Lindquist & Craig、上記) 。さらにそれらは、高分
子会合体を形成する脊椎動物由来のα- クリスタリンと
明らかな配列相同を有することが同様に立証されている
(Ingolia & Craig, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 79 (19
82), 2360-2364)。小型Hsp 間での配列相同はDNA レベ
ルで論じられてきた。
小型 Hsp) は、酵母(Hsp26) 、脊椎動物(Hsp24、Hsp2
8)、ショウジョウバエ(Hsp22、23、26、28) 、マウス(H
sp25) の1 種または数種のタンパク質および植物中の20
種以上のタンパク質を含む不均一群である(Nover & Sch
arf, Eur. J. Biochem. 139 (1984), 303-313; Lindqui
st& Craig, Ann. Rev. Genet. 2 (1988), 631-677) 。
その分子量は、生物に応じて15および40 kDaの間であ
り、ほとんどの細胞と組織で小型Hsp はストレスの非存
在下でも合成され、そして700 kDa 以上の分子量を持つ
細胞質ゾル凝集体は (熱ショック顆粒) として存在する
(Arrigo et al., Mol. Cell. Biol. 8 (1988),5059-507
1) 。熱ショックおよび化学ストレスが小型 Hspの合成
を誘導し、小型Hspは総細胞タンパク質の最高1%を占め
るまでになる(Osterreich et al., Bio-med. Biochim.
Acta 49 (1990), 219-226)。さらに前述のストレス因子
はタンパク質のリン酸化の程度と、その細胞内局在化に
変化をもたらす(Arrigo et al.上記; Zantema et al.,
J. Biol. Chem. 267 (1992), 12936-12941) 。その不均
一性にもかかわらず、種々の生物の小型Hsp は同じ疎水
性プロフィールと同一アミノ酸配列の小領域を有してい
る(Lindquist & Craig、上記) 。さらにそれらは、高分
子会合体を形成する脊椎動物由来のα- クリスタリンと
明らかな配列相同を有することが同様に立証されている
(Ingolia & Craig, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 79 (19
82), 2360-2364)。小型Hsp 間での配列相同はDNA レベ
ルで論じられてきた。
【０００３】今日まで、生物界に広く存在する小型Hsp
の機能について有効なデータはほとんどない。最初の仮
説は耐熱性の仲介での役割について論じている。しかし
ながら、これはまだ明確に証明されていない(Landry et
al., J. Cell Biol. 109 (1989), 7-15) 。タンパク質
の強い保存、広範囲分布、ストレスによる誘導および総
細胞タンパク質に対して高い割合を占めるという事実か
ら、小型熱ショックタンパク質は細胞内で重要な一般的
機能を有していると仮定できる。
の機能について有効なデータはほとんどない。最初の仮
説は耐熱性の仲介での役割について論じている。しかし
ながら、これはまだ明確に証明されていない(Landry et
al., J. Cell Biol. 109 (1989), 7-15) 。タンパク質
の強い保存、広範囲分布、ストレスによる誘導および総
細胞タンパク質に対して高い割合を占めるという事実か
ら、小型熱ショックタンパク質は細胞内で重要な一般的
機能を有していると仮定できる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】安定化剤として作用す
る種々のタンパク質成分の添加によるタンパク質の安定
化が知られている。しかしながら、既知の安定化剤タン
パク質の欠点は、ATP の存在下でのみ活性であり、大分
子過剰で添加しなければならず、そして/ またはそれ自
身が複雑で不安定なオリゴマーである点にある。
る種々のタンパク質成分の添加によるタンパク質の安定
化が知られている。しかしながら、既知の安定化剤タン
パク質の欠点は、ATP の存在下でのみ活性であり、大分
子過剰で添加しなければならず、そして/ またはそれ自
身が複雑で不安定なオリゴマーである点にある。
【０００５】本発明の目的は、それ故、前述の欠点をで
きる限り除外する、水溶液中でのタンパク質の新しい安
定化法を提供することであった。
きる限り除外する、水溶液中でのタンパク質の新しい安
定化法を提供することであった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】この目的は、本発明によ
り、小型Hsp ファミリーの1 種または数種のタンパク質
を、タンパク質を含む水溶液に添加することからなる、
水溶液中のタンパク質の安定化法により達成される。小
型Hsp が水溶液中の他のタンパク質を安定化でき、この
安定化作用は特に、不溶性凝集体の形成の防止に基づい
ていることが意外にも見いだされた。
り、小型Hsp ファミリーの1 種または数種のタンパク質
を、タンパク質を含む水溶液に添加することからなる、
水溶液中のタンパク質の安定化法により達成される。小
型Hsp が水溶液中の他のタンパク質を安定化でき、この
安定化作用は特に、不溶性凝集体の形成の防止に基づい
ていることが意外にも見いだされた。
【０００７】本発明による方法では小型Hsp タンパク質
を、安定化させるタンパク質に対して0.0001:1〜10:1、
そして特には 0.001:1〜5:1 のモル比で添加する。本発
明による方法はいずれのタンパク質にも適用できるが、
その温度感受性または他の理由から溶解状態で容易に凝
集する傾向があるタンパク質に対して使用することが好
ましい。本発明による方法の重要な適用分野は、酵素的
に活性なタンパク質を含む溶液の安定化である。抗体ま
たは抗体からの誘導体( 例えばFabまたはF(ab)2断片)
の水溶液も同様に、本発明による方法を使用して有利に
安定化できる。
を、安定化させるタンパク質に対して0.0001:1〜10:1、
そして特には 0.001:1〜5:1 のモル比で添加する。本発
明による方法はいずれのタンパク質にも適用できるが、
その温度感受性または他の理由から溶解状態で容易に凝
集する傾向があるタンパク質に対して使用することが好
ましい。本発明による方法の重要な適用分野は、酵素的
に活性なタンパク質を含む溶液の安定化である。抗体ま
たは抗体からの誘導体( 例えばFabまたはF(ab)2断片)
の水溶液も同様に、本発明による方法を使用して有利に
安定化できる。
【０００８】本発明の特に好ましい実施態様では、小型
Hsp ファミリーのマウス由来のHsp25 を使用する。Hsp2
5 は32mer(Mr=800 KD)を形成するが(Behlke et al., FE
BS Letters, Vol. 288 No. 1,2 (1991), 119-122) 、し
かしながら、活性な構造( モノマー/ オリゴマー) は知
られていない。マウスのHsp25 は熱ショックプロモータ
ーによる制御下にあるので、タンパク質の発現が熱スト
レスにより誘導される。マウス由来のHsp25 の大腸菌
(E. coli) でのクローニング、配列決定、発現および生
産が、Gaestel らによりEur. J. Biochem. 179 (1989),
209-213, J. Biol. Chem., Vol. 266, No. 22 (1991),
p. 14721-14724 において、およびDD-A1273 071 に記
載されている。Hsp 25は特に有利である。なぜならば、
32mer に関してモル基準で著しい不足が有る場合に( 最
適量はタンパク質1 モル当たり約0.5 モルのHsp25 であ
る) タンパク質安定化作用を前もって予測でき、さらに
例えばクエン酸シンターゼのような酵素的に活性なタン
パク質の作用が、Hsp25 とクエン酸シンターゼとの結合
条件下でHsp25 の存在により影響されず、Hsp25 が強い
耐熱性で、Hsp のみを100 ℃で15分以上インキュベート
しその後冷却した後も初期の活性を回復するからであ
る。それ故、Hsp25 は本発明による方法の特に有利な候
補であろう。組換え体の生産の可能性により十分量の入
手もできる。
Hsp ファミリーのマウス由来のHsp25 を使用する。Hsp2
5 は32mer(Mr=800 KD)を形成するが(Behlke et al., FE
BS Letters, Vol. 288 No. 1,2 (1991), 119-122) 、し
かしながら、活性な構造( モノマー/ オリゴマー) は知
られていない。マウスのHsp25 は熱ショックプロモータ
ーによる制御下にあるので、タンパク質の発現が熱スト
レスにより誘導される。マウス由来のHsp25 の大腸菌
(E. coli) でのクローニング、配列決定、発現および生
産が、Gaestel らによりEur. J. Biochem. 179 (1989),
209-213, J. Biol. Chem., Vol. 266, No. 22 (1991),
p. 14721-14724 において、およびDD-A1273 071 に記
載されている。Hsp 25は特に有利である。なぜならば、
32mer に関してモル基準で著しい不足が有る場合に( 最
適量はタンパク質1 モル当たり約0.5 モルのHsp25 であ
る) タンパク質安定化作用を前もって予測でき、さらに
例えばクエン酸シンターゼのような酵素的に活性なタン
パク質の作用が、Hsp25 とクエン酸シンターゼとの結合
条件下でHsp25 の存在により影響されず、Hsp25 が強い
耐熱性で、Hsp のみを100 ℃で15分以上インキュベート
しその後冷却した後も初期の活性を回復するからであ
る。それ故、Hsp25 は本発明による方法の特に有利な候
補であろう。組換え体の生産の可能性により十分量の入
手もできる。
【０００９】本発明方法の好ましい適用は、次に本発明
のもう１つの主題でもある、変性タンパク質のin vitro
折りたたみまたは再生の促進である。この適用は好まし
くは、異種発現により原核生物で合成され、一般にこの
過程において不溶性封入体の形態で蓄積する変性タンパ
ク質に対して実施される。異種発現されたタンパク質は
好ましくは真核生物のタンパク質である。用語“異種発
現”は、ここでは外来( 異種) 生物からのタンパク質
が、および／または外来( 異種) プロモーターの制御下
にあるタンパク質が、細胞、特に原核細胞で発現され、
そしてその後、細胞または培地から単離されることを意
味する。このタンパク質の異種発現は、ここでさらに詳
細に説明する必要のない、分子生物学の分野で習熟した
者にはよく知られている標準方法である。これに関して
は、例えば、Sambrookら(MolecularCloning. A Laborat
ory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1
989), chapters 16 and 17)のクローン化遺伝子の発現
の記載を参照されたい。
のもう１つの主題でもある、変性タンパク質のin vitro
折りたたみまたは再生の促進である。この適用は好まし
くは、異種発現により原核生物で合成され、一般にこの
過程において不溶性封入体の形態で蓄積する変性タンパ
ク質に対して実施される。異種発現されたタンパク質は
好ましくは真核生物のタンパク質である。用語“異種発
現”は、ここでは外来( 異種) 生物からのタンパク質
が、および／または外来( 異種) プロモーターの制御下
にあるタンパク質が、細胞、特に原核細胞で発現され、
そしてその後、細胞または培地から単離されることを意
味する。このタンパク質の異種発現は、ここでさらに詳
細に説明する必要のない、分子生物学の分野で習熟した
者にはよく知られている標準方法である。これに関して
は、例えば、Sambrookら(MolecularCloning. A Laborat
ory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1
989), chapters 16 and 17)のクローン化遺伝子の発現
の記載を参照されたい。
【００１０】本発明のもう 1つの主題は、溶解状態での
天然タンパク質を安定化させる小型Hsp の能力に基づい
ている。それ故例えば、小型Hsp タンパク質の添加によ
り、試験溶液中に存在するタンパク質成分の安定性が低
いために干渉が生じ得る、タンパク質含有溶液の光学試
験おいて、一定の感度を維持することができる。このよ
うな光学試験は好ましくは、酵素反応、特に好ましくは
ATP が補助基質として存在する酵素反応を含む。小型Hs
p によるタンパク質の安定化はATP の非存在下で達成で
きるので、酵素試験に対して干渉作用を及ぼすことな
く、補助基質としてATP を使用する酵素試験のためのタ
ンパク質溶液を安定化させることも困難ではない。
天然タンパク質を安定化させる小型Hsp の能力に基づい
ている。それ故例えば、小型Hsp タンパク質の添加によ
り、試験溶液中に存在するタンパク質成分の安定性が低
いために干渉が生じ得る、タンパク質含有溶液の光学試
験おいて、一定の感度を維持することができる。このよ
うな光学試験は好ましくは、酵素反応、特に好ましくは
ATP が補助基質として存在する酵素反応を含む。小型Hs
p によるタンパク質の安定化はATP の非存在下で達成で
きるので、酵素試験に対して干渉作用を及ぼすことな
く、補助基質としてATP を使用する酵素試験のためのタ
ンパク質溶液を安定化させることも困難ではない。
【００１１】本発明の意味における光学試験とは、光学
パラメーターまたは光学パラメーターの変化、例えば吸
光度、透過率、散乱光などを測定する測定法のことであ
る。本発明は好ましくは、例えば濁度法、比濁法および
蛍光法で散乱光を測定する方法に使用する。本発明方法
の、タンパク質含有溶液の安定化のための、このような
適用は、それ故本発明のもう 1つの主題である。光学試
験において一定の感度を維持するために、安定化される
タンパク質成分は、特に好ましくはα- グルコシダーゼ
PI である。
パラメーターまたは光学パラメーターの変化、例えば吸
光度、透過率、散乱光などを測定する測定法のことであ
る。本発明は好ましくは、例えば濁度法、比濁法および
蛍光法で散乱光を測定する方法に使用する。本発明方法
の、タンパク質含有溶液の安定化のための、このような
適用は、それ故本発明のもう 1つの主題である。光学試
験において一定の感度を維持するために、安定化される
タンパク質成分は、特に好ましくはα- グルコシダーゼ
PI である。
【００１２】本発明はさらに、好ましくは可溶性および
/ または凍結乾燥形態である、小型熱ショックタンパク
質ファミリーの1 種または数種のタンパク質を含む、水
溶液中のタンパク質の安定化のための試薬に関する。試
薬は特に好ましくは、マウスの組換えHsp25 を含む。図
面と共に以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明
する。
/ または凍結乾燥形態である、小型熱ショックタンパク
質ファミリーの1 種または数種のタンパク質を含む、水
溶液中のタンパク質の安定化のための試薬に関する。試
薬は特に好ましくは、マウスの組換えHsp25 を含む。図
面と共に以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明
する。
【００１３】
【実施例】マウスの組換えHsp25 を大腸菌BL21 (DE3)で
T7プロモーターの制御下で発現させた(Gaestel et al.,
Eur. J. Biochem. 179 (1989), 209-213)。大腸菌細胞
を溶菌後、Hsp25 を初めに35% 硫酸アンモニウムで沈殿
させ、そして上記Gaestelにより記載されているようにD
EAEアニオン交換クロマトグラフィー(50-200 mmol/l Na
Cl のNaCl勾配) で精製した。その後ゲル濾過をスペロ
ース(Superose) 6 HR 10/30 を用いて実施し、Hsp25 凝
集物が排除ボリュームのすぐ後に溶出した。このために
カラムを緩衝液 A 50 ml( 20 mM トリス/ HCl 、pH7.6
、0.05 mM NaN3、2 μM PMSF、0.5 mM DTE、10 mM Mg
Cl2、30 mM NH4Cl)で平衡にし、Hsp25(緩衝液 A 200μl
中に最大2 mg) を注入し、そしてカラムの排除ボリュ
ームの直後の画分を集めた(Hsp25はこれらの緩衝条件下
では約800 kDa の分子量のマルチマーとして存在する)
。
T7プロモーターの制御下で発現させた(Gaestel et al.,
Eur. J. Biochem. 179 (1989), 209-213)。大腸菌細胞
を溶菌後、Hsp25 を初めに35% 硫酸アンモニウムで沈殿
させ、そして上記Gaestelにより記載されているようにD
EAEアニオン交換クロマトグラフィー(50-200 mmol/l Na
Cl のNaCl勾配) で精製した。その後ゲル濾過をスペロ
ース(Superose) 6 HR 10/30 を用いて実施し、Hsp25 凝
集物が排除ボリュームのすぐ後に溶出した。このために
カラムを緩衝液 A 50 ml( 20 mM トリス/ HCl 、pH7.6
、0.05 mM NaN3、2 μM PMSF、0.5 mM DTE、10 mM Mg
Cl2、30 mM NH4Cl)で平衡にし、Hsp25(緩衝液 A 200μl
中に最大2 mg) を注入し、そしてカラムの排除ボリュ
ームの直後の画分を集めた(Hsp25はこれらの緩衝条件下
では約800 kDa の分子量のマルチマーとして存在する)
。
【００１４】ベーリンガー マンハイム社製(Boehringe
r Mannheim GbmH)のブタ心臓由来のクエン酸シンターゼ
(E.C.4.1.3.7) を使用した。クエン酸シンターゼは、ア
セチル-CoAとオキサロ酢酸が縮合してクエン酸を形成す
る反応を触媒する。この過程でSH-CoAが放出され、クエ
ン酸シンターゼの酵素活性を、遊離のSH基とチオール検
出試薬ジチオニトロ安息香酸(DTNB)の反応により412 nm
での吸光度を測定することにより間接的にモニターする
(Srere et al., Acta Chem. Scand. 17 (1963), 129-13
4)。
r Mannheim GbmH)のブタ心臓由来のクエン酸シンターゼ
(E.C.4.1.3.7) を使用した。クエン酸シンターゼは、ア
セチル-CoAとオキサロ酢酸が縮合してクエン酸を形成す
る反応を触媒する。この過程でSH-CoAが放出され、クエ
ン酸シンターゼの酵素活性を、遊離のSH基とチオール検
出試薬ジチオニトロ安息香酸(DTNB)の反応により412 nm
での吸光度を測定することにより間接的にモニターする
(Srere et al., Acta Chem. Scand. 17 (1963), 129-13
4)。
【００１５】130 U/mg以上の比活性を持つ酵母からのα
- グルコシダーゼ PI(マルターゼ、E.C.3.2.1.20)ベー
リンガー マンハイム社製を使用した。α- グルコシダ
ーゼの酵素活性は、p-NPG からのp-ニトロフェノールの
放出を405 nmでの吸光度の変化により測定した。以下の
緩衝液を使用した: 緩衝液 A: 50 mmol/l HEPES-KOH 、pH 7.5 緩衝液 B: 50 mmol/l HEPES-KOH 50 mmol/l KCl 、pH 7.0 Lo緩衝液: 40 mmol/l HEPES-KOH 、pH 7.8 20 mmol/l KCl 10 mmol/l (NH4)2SO4 2 mmol/l 酢酸カリウム実施例 1 42℃でのクエン酸シンターゼの凝集に対するHsp25 の効
果 42℃でインキュベーション中の天然クエン酸シンターゼ
の凝集の時間経過: 天然クエン酸シンターゼ(30 μmol/
l)を、次第に増加する濃度のHsp25 を含む又は含まない
42℃でプレインキュベートしたLo緩衝液に、攪拌しなが
ら1:200 に希釈し、そして凝集を、一定温度42℃で最初
の30分間、λem=500 nm で光散乱を測定することにより
モニターした。誘導時間は約3 秒であった。図 1は、以
下の反応混合物を使用した凝集の時間経過を示す:(総体
積: 1500μl): 0. Lo- 緩衝液 1. Lo- 緩衝液、0.6 nmol/l Hsp25 2. Lo- 緩衝液、3.0 nmol/l Hsp25 3. Lo- 緩衝液、3.9 nmol/l Hsp25 4. Lo- 緩衝液、6.0 nmol/l Hsp25 5. Lo- 緩衝液、60 nmol/l Hsp25実施例 2 47.6℃でのα- グルコシダーゼの凝集に対するHsp25 の
効果 47℃でインキュベーション中の天然α- グルコシダーゼ
の凝集の時間経過: 天然α- グルコシダーゼ(4.1μmol/
l)を、Hsp25(1.25 nmol/l)を含む又は含まない47.6℃で
プレインキュベートした緩衝液B に攪拌しながら1:75に
希釈し、そして凝集を一定温度47.6℃で最初の30分間、
λex=360 nm 、λem=360 nm で光散乱を測定することに
よりモニターした。誘導時間は約3 秒であった。図2
は、以下の反応混合物(1500 μl)の凝集時間経過を示
す: 0. 緩衝液 B 1. 緩衝液 B、1.25 nM Hsp25実施例 3 変性α- グルコシダーゼの再活性化に対するHsp25 の効
果 α- グルコシダーゼ9.4 μmol/l を、8 mol/l 尿素、50
mmol/lリン酸カリウム、2 mmol/l EDTA 、20 mmol/l
DTE 、pH 7.5中で20℃で2 時間インキュベートすること
によりα- グルコシダーゼを変性させた。その後α- グ
ルコシダーゼをHsp25 の存在下または非存在下で再生し
た。このために、変性α- グルコシダーゼを、攪拌しな
がら再活性化混合物に1:100 の割合で希釈し( 最終濃
度: 0.094μmol/l)、そして20℃でインキュベートし
た。所定の時間に、アリコートを反応混合物から取り出
し、そしてα- グルコシダーゼ活性試験での活性の測定
に使用した。
- グルコシダーゼ PI(マルターゼ、E.C.3.2.1.20)ベー
リンガー マンハイム社製を使用した。α- グルコシダ
ーゼの酵素活性は、p-NPG からのp-ニトロフェノールの
放出を405 nmでの吸光度の変化により測定した。以下の
緩衝液を使用した: 緩衝液 A: 50 mmol/l HEPES-KOH 、pH 7.5 緩衝液 B: 50 mmol/l HEPES-KOH 50 mmol/l KCl 、pH 7.0 Lo緩衝液: 40 mmol/l HEPES-KOH 、pH 7.8 20 mmol/l KCl 10 mmol/l (NH4)2SO4 2 mmol/l 酢酸カリウム実施例 1 42℃でのクエン酸シンターゼの凝集に対するHsp25 の効
果 42℃でインキュベーション中の天然クエン酸シンターゼ
の凝集の時間経過: 天然クエン酸シンターゼ(30 μmol/
l)を、次第に増加する濃度のHsp25 を含む又は含まない
42℃でプレインキュベートしたLo緩衝液に、攪拌しなが
ら1:200 に希釈し、そして凝集を、一定温度42℃で最初
の30分間、λem=500 nm で光散乱を測定することにより
モニターした。誘導時間は約3 秒であった。図 1は、以
下の反応混合物を使用した凝集の時間経過を示す:(総体
積: 1500μl): 0. Lo- 緩衝液 1. Lo- 緩衝液、0.6 nmol/l Hsp25 2. Lo- 緩衝液、3.0 nmol/l Hsp25 3. Lo- 緩衝液、3.9 nmol/l Hsp25 4. Lo- 緩衝液、6.0 nmol/l Hsp25 5. Lo- 緩衝液、60 nmol/l Hsp25実施例 2 47.6℃でのα- グルコシダーゼの凝集に対するHsp25 の
効果 47℃でインキュベーション中の天然α- グルコシダーゼ
の凝集の時間経過: 天然α- グルコシダーゼ(4.1μmol/
l)を、Hsp25(1.25 nmol/l)を含む又は含まない47.6℃で
プレインキュベートした緩衝液B に攪拌しながら1:75に
希釈し、そして凝集を一定温度47.6℃で最初の30分間、
λex=360 nm 、λem=360 nm で光散乱を測定することに
よりモニターした。誘導時間は約3 秒であった。図2
は、以下の反応混合物(1500 μl)の凝集時間経過を示
す: 0. 緩衝液 B 1. 緩衝液 B、1.25 nM Hsp25実施例 3 変性α- グルコシダーゼの再活性化に対するHsp25 の効
果 α- グルコシダーゼ9.4 μmol/l を、8 mol/l 尿素、50
mmol/lリン酸カリウム、2 mmol/l EDTA 、20 mmol/l
DTE 、pH 7.5中で20℃で2 時間インキュベートすること
によりα- グルコシダーゼを変性させた。その後α- グ
ルコシダーゼをHsp25 の存在下または非存在下で再生し
た。このために、変性α- グルコシダーゼを、攪拌しな
がら再活性化混合物に1:100 の割合で希釈し( 最終濃
度: 0.094μmol/l)、そして20℃でインキュベートし
た。所定の時間に、アリコートを反応混合物から取り出
し、そしてα- グルコシダーゼ活性試験での活性の測定
に使用した。
【００１６】20℃で2 時間インキュベーション後の天然
α- グルコシダーゼの活性を100%と設定した。図3 はHs
p25 の存在下と非存在下での再活性化の結果を示す。 再活性化混合物( 総体積: 300 μl): 0. 緩衝液 A 1. 緩衝液 A、0.05 μmol/l Hsp25実施例 4 濃度を次第に増加させたHsp25 の、変性α- グルコシダ
ーゼの再活性化に対する効果 α- ゴルコシダーゼを実施例3 に記載のように変性させ
た。その後、濃度を増加させたHsp25 の存在下と非存在
下でα- グルコシダーゼを再生した。このために変性α
- グルコシダーゼを攪拌しながら再活性化混合物中に1:
100 の割合で希釈し( 最終濃度: 0.094 μmol/l)、そし
て20℃でインキュベートした。
α- グルコシダーゼの活性を100%と設定した。図3 はHs
p25 の存在下と非存在下での再活性化の結果を示す。 再活性化混合物( 総体積: 300 μl): 0. 緩衝液 A 1. 緩衝液 A、0.05 μmol/l Hsp25実施例 4 濃度を次第に増加させたHsp25 の、変性α- グルコシダ
ーゼの再活性化に対する効果 α- ゴルコシダーゼを実施例3 に記載のように変性させ
た。その後、濃度を増加させたHsp25 の存在下と非存在
下でα- グルコシダーゼを再生した。このために変性α
- グルコシダーゼを攪拌しながら再活性化混合物中に1:
100 の割合で希釈し( 最終濃度: 0.094 μmol/l)、そし
て20℃でインキュベートした。
【００１７】2 時間後、アリコートをそれぞれの反応混
合物から取り出し、そしてα- グルコシダーゼ活性試験
での活性の測定に使用した。20℃で2 時間インキュベー
ション後の天然α- グルコシダーゼの活性を100%として
設定した。図4 は、以下の再活性化混合物( 総体積: 30
0 μl)の結果を示す:濃度を次第に増加させたHsp25 の
存在下と非存在下での緩衝液 A実施例 5 46℃でインキュベーション中の熱不活性化に対するHsp2
5 の効果 46℃でインキュベーション中の、天然α- グルコシダー
ゼの熱不活性化: 天然α- グルコシダーゼ( 4.1 μM)
を、Hsp25 を含む又は含まない46℃でプレインキュベー
トした緩衝液 Bに、攪拌しながら1:28に希釈し( 最終濃
度: α- グルコシダーゼ 0.15 μM)、そして一定温度46
℃でさらにインキュベートした。所定の時間に各反応混
合物からアリコートを取り出し、そしてα- グルコシダ
ーゼ活性試験での活性の測定に使用した。20℃での天然
α- グルコシダーゼの活性を100%として設定した。
合物から取り出し、そしてα- グルコシダーゼ活性試験
での活性の測定に使用した。20℃で2 時間インキュベー
ション後の天然α- グルコシダーゼの活性を100%として
設定した。図4 は、以下の再活性化混合物( 総体積: 30
0 μl)の結果を示す:濃度を次第に増加させたHsp25 の
存在下と非存在下での緩衝液 A実施例 5 46℃でインキュベーション中の熱不活性化に対するHsp2
5 の効果 46℃でインキュベーション中の、天然α- グルコシダー
ゼの熱不活性化: 天然α- グルコシダーゼ( 4.1 μM)
を、Hsp25 を含む又は含まない46℃でプレインキュベー
トした緩衝液 Bに、攪拌しながら1:28に希釈し( 最終濃
度: α- グルコシダーゼ 0.15 μM)、そして一定温度46
℃でさらにインキュベートした。所定の時間に各反応混
合物からアリコートを取り出し、そしてα- グルコシダ
ーゼ活性試験での活性の測定に使用した。20℃での天然
α- グルコシダーゼの活性を100%として設定した。
【００１８】図5 は、以下のインキュベーション混合物
( 総体積: 300 μl)の結果を示す: 0. 緩衝液 B 1. 緩衝液 B、0.093 μmol/l実施例 6 α- グルコシダーゼの再活性化に対するHsp25 の効果 α- グルコシダーゼを実施例3 に記載のように変性させ
た。その後α- グルコシダーゼをHsp25 の存在下または
非存在下で再生した。このために、Hsp25 を、再生混合
物に添加する前に20℃または90℃のいずれかで15分間プ
レインキュベートした。変性α- グルコシダーゼを攪拌
しながら再活性化混合物に1:100 の割合で希釈し( 最終
濃度: 0.094 μmol/l)、そして20℃でインキュベートし
た。所定の時間にそれぞれの再生混合物からアリコート
を取り出し、そして活性試験に使用した。20℃で2 時間
インキュベーション後の天然α- グルコシダーゼの活性
を100%と設定する。
( 総体積: 300 μl)の結果を示す: 0. 緩衝液 B 1. 緩衝液 B、0.093 μmol/l実施例 6 α- グルコシダーゼの再活性化に対するHsp25 の効果 α- グルコシダーゼを実施例3 に記載のように変性させ
た。その後α- グルコシダーゼをHsp25 の存在下または
非存在下で再生した。このために、Hsp25 を、再生混合
物に添加する前に20℃または90℃のいずれかで15分間プ
レインキュベートした。変性α- グルコシダーゼを攪拌
しながら再活性化混合物に1:100 の割合で希釈し( 最終
濃度: 0.094 μmol/l)、そして20℃でインキュベートし
た。所定の時間にそれぞれの再生混合物からアリコート
を取り出し、そして活性試験に使用した。20℃で2 時間
インキュベーション後の天然α- グルコシダーゼの活性
を100%と設定する。
【００１９】図6 は、以下の再活性化混合物( 総体積:
300 μl)の結果を示す 1. 緩衝液 A 2. 緩衝液 A＋0.06 μM Hsp25(20℃で15分インキュベ
ート) 3. 緩衝液 A＋0.06 μM Hsp25(90℃で15分インキュベ
ート)
300 μl)の結果を示す 1. 緩衝液 A 2. 緩衝液 A＋0.06 μM Hsp25(20℃で15分インキュベ
ート) 3. 緩衝液 A＋0.06 μM Hsp25(90℃で15分インキュベ
ート)
【図 1】42℃で活性Hsp25 の存在下および非存在下での
クエン酸シンターゼの凝集を示す図である。
クエン酸シンターゼの凝集を示す図である。
【図 2】47.6℃で活性Hsp25 の存在下および非存在下で
のα- グルコシダーゼの凝集を示す図である。
のα- グルコシダーゼの凝集を示す図である。
【図 3】活性Hsp25 の存在下および非存在下での変性α
- グルコシダーゼの再活性化速度を示す図である。
- グルコシダーゼの再活性化速度を示す図である。
【図 4】活性Hsp25 の存在下および非存在下での再活性
化α- グルコシダーゼの収率を示す図である。
化α- グルコシダーゼの収率を示す図である。
【図 5】活性Hsp25 の存在下および非存在下で46℃でイ
ンキュベーション中の天然α-グルコシダーゼ PI の熱
不活性化を示す図である。
ンキュベーション中の天然α-グルコシダーゼ PI の熱
不活性化を示す図である。
【図 6】Hsp25 の90℃で15分のインキュベーションが変
性α- グルコシダーゼを再生する作用機構におよぼす効
果を示す図である。
性α- グルコシダーゼを再生する作用機構におよぼす効
果を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ゲステル マティアス ドイツ連邦共和国 10365 ベルリン フ ランクフルテル アレー 154 (72)発明者 アムブロシウス ドロティー ドイツ連邦共和国 82393 イッフェルド ルフ スタルターハーシュトラーセ ５ (72)発明者 ルドルフ ライナー ドイツ連邦共和国 82362 ヴァイルハイ ム フェルベルガッセ 17
Claims (5)
- 【請求項 1】 “小型熱ショックタンパク質”( 小型 H
sp) ファミリーの1種または数種のタンパク質を、タン
パク質を含有する水溶液に添加することから成る、水溶
液中のタンパク質の安定化法。 - 【請求項 2】 Hsp タンパク質を、安定化させるタンパ
ク質に対して0.0001:1〜10:1の、特に 0.001:1〜5:1 の
モル比で添加する、請求項1 の方法。 - 【請求項 3】 変性タンパク質のin vitro再生を支持す
るための、請求項1または2 の方法の使用。 - 【請求項 4】 変性タンパク質は原核生物で異種発現に
より合成されるタンパク質である、請求項3 の使用。 - 【請求項 5】 異種発現タンパク質は、真核生物のタン
パク質である、請求項4 の使用。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4239969A DE4239969A1 (de) | 1992-11-27 | 1992-11-27 | Verfahren zur Stabilisierung von Proteinen |
| DE4239969:6 | 1992-11-27 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0725897A true JPH0725897A (ja) | 1995-01-27 |
| JP2517839B2 JP2517839B2 (ja) | 1996-07-24 |
Family
ID=6473841
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5298670A Expired - Lifetime JP2517839B2 (ja) | 1992-11-27 | 1993-11-29 | タンパク質の安定化法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0599344B1 (ja) |
| JP (1) | JP2517839B2 (ja) |
| AT (1) | ATE158586T1 (ja) |
| DE (2) | DE4239969A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH1084954A (ja) * | 1996-07-25 | 1998-04-07 | Rikagaku Kenkyusho | 酵素を熱活性化する方法 |
| US8987359B2 (en) | 2013-03-13 | 2015-03-24 | Cheil Industries Inc. | Flame retardant polyamide resin composition and molded article using same |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19502386A1 (de) * | 1995-01-26 | 1996-08-01 | Boehringer Mannheim Gmbh | Stabilisierung von Peptiden und Polypeptiden in immunologischen Tests durch Zusatz von kleinen Hitzeschockproteinen |
| JPH09173078A (ja) * | 1995-09-14 | 1997-07-08 | Tadayuki Imanaka | 分子シャペロンを用いる蛋白質の製造方法 |
| US6013488A (en) * | 1996-07-25 | 2000-01-11 | The Institute Of Physical And Chemical Research | Method for reverse transcription |
| KR100516389B1 (ko) * | 2003-09-08 | 2005-09-23 | 한국과학기술원 | 작은 열 충격 단백질을 함유하는 단백질 분해 방지용조성물 및 이를 이용한 이차원 전기영동법 |
| US20050214882A1 (en) * | 2004-03-25 | 2005-09-29 | Ez Bio Inc. | Reagents, methods and kits for the universal rapid immuno-detection |
-
1992
- 1992-11-27 DE DE4239969A patent/DE4239969A1/de not_active Withdrawn
-
1993
- 1993-11-26 EP EP93119120A patent/EP0599344B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-11-26 DE DE59307429T patent/DE59307429D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1993-11-26 AT AT93119120T patent/ATE158586T1/de active
- 1993-11-29 JP JP5298670A patent/JP2517839B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH1084954A (ja) * | 1996-07-25 | 1998-04-07 | Rikagaku Kenkyusho | 酵素を熱活性化する方法 |
| US8987359B2 (en) | 2013-03-13 | 2015-03-24 | Cheil Industries Inc. | Flame retardant polyamide resin composition and molded article using same |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE158586T1 (de) | 1997-10-15 |
| DE59307429D1 (de) | 1997-10-30 |
| JP2517839B2 (ja) | 1996-07-24 |
| DE4239969A1 (de) | 1994-06-01 |
| EP0599344A1 (de) | 1994-06-01 |
| EP0599344B1 (de) | 1997-09-24 |
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