JPH07227292A - ２−ケト−ｌ−グロン酸の改良製造法 - Google Patents
２−ケト−ｌ−グロン酸の改良製造法Info
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- JPH07227292A JPH07227292A JP31438394A JP31438394A JPH07227292A JP H07227292 A JPH07227292 A JP H07227292A JP 31438394 A JP31438394 A JP 31438394A JP 31438394 A JP31438394 A JP 31438394A JP H07227292 A JPH07227292 A JP H07227292A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】２−ケト−Ｌ−グロン酸（以下、２ＫＧＡと称
する）の微生物的製造法における、反応総時間の短縮、
培地原料の削減等の効率化。 【構成】（１）Ｌ−ソルボースから２ＫＧＡを生産する
能力を有する微生物を２ＫＧＡを生産するための基質を
含む液体培地中で培養し、（２）培養液中の生産された
２ＫＧＡを回収する一方、微生物も回収し、（３）回収
した微生物を次の培養のための新しい液体培地に接種
し、（４）この培養と回収を少なくとも１回くりかえす
ことを特徴とする２ＫＧＡの製造法。 【効果】主培養における菌の増殖に要する時間、種培
養、培地原料、培養廃棄物の削減等工業的に有利で、汎
用性の高い２ＫＧＡの製造法を提供する。
する）の微生物的製造法における、反応総時間の短縮、
培地原料の削減等の効率化。 【構成】（１）Ｌ−ソルボースから２ＫＧＡを生産する
能力を有する微生物を２ＫＧＡを生産するための基質を
含む液体培地中で培養し、（２）培養液中の生産された
２ＫＧＡを回収する一方、微生物も回収し、（３）回収
した微生物を次の培養のための新しい液体培地に接種
し、（４）この培養と回収を少なくとも１回くりかえす
ことを特徴とする２ＫＧＡの製造法。 【効果】主培養における菌の増殖に要する時間、種培
養、培地原料、培養廃棄物の削減等工業的に有利で、汎
用性の高い２ＫＧＡの製造法を提供する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、広い範囲の基質から２
−ケト−Ｌ−グロン酸（以下２ＫＧＡと称することがあ
る）を生産する為の、菌体反応を含む微生物の培養に適
用される。 本発明の方法は微生物を用いたＬ−アスコルビン酸合成
の中間体として有用な２−ケト−Ｌ−グロン酸の工業生
産に好都合に適用される改良製造法に関する。 さらに詳しくは、２ＫＧＡを最終生産物とする菌体反応
を含む培養を行うに際し培養液（含菌体反応液）から濾
過膜あるいは遠心分離機等分離装置を用いて培地固形分
を含む菌体部分と２ＫＧＡを含む水溶液部分に分離し、
得られた菌体部分を次の主培養に繰り返し使用すること
を特徴とする２ＫＧＡ製造法に関するものである。ま
た、「菌体を繰り返し使用する培養」を「リサイクル培
養」と称することもある。
−ケト−Ｌ−グロン酸（以下２ＫＧＡと称することがあ
る）を生産する為の、菌体反応を含む微生物の培養に適
用される。 本発明の方法は微生物を用いたＬ−アスコルビン酸合成
の中間体として有用な２−ケト−Ｌ−グロン酸の工業生
産に好都合に適用される改良製造法に関する。 さらに詳しくは、２ＫＧＡを最終生産物とする菌体反応
を含む培養を行うに際し培養液（含菌体反応液）から濾
過膜あるいは遠心分離機等分離装置を用いて培地固形分
を含む菌体部分と２ＫＧＡを含む水溶液部分に分離し、
得られた菌体部分を次の主培養に繰り返し使用すること
を特徴とする２ＫＧＡ製造法に関するものである。ま
た、「菌体を繰り返し使用する培養」を「リサイクル培
養」と称することもある。
【０００２】
【従来の技術】Ｌ−アスコルビン酸合成の中間体として
有用な２ＫＧＡは、工業的に確立されたいわゆるライヒ
シュタイン法（Helvetica Chimica Acta 第１７巻、
３１１頁、１９３４参照）によって生産されてきた。し
かし、この方法は工程も多く、多量の有機溶媒を必要と
し、現代の工業技術としては満足すべきものではない。 一方、ライヒシュタイン法に替わるものとしては、主に
微生物を用いた方法がいくつか提案されてきている。例
えば、Ｄ−グルコースを微生物的に酸化して２，５−ジ
ケト−グルコン酸にした後、これをさらに微生物的また
は化学的に２ＫＧＡへと還元する方法（特公昭３９−１
４４９３号、特公昭５３−２５０３３号、特公昭５６−
１５８７７号、特公昭５９−３５９２０号参照）、さら
に、ＤＮＡ組み替え技術によって、Corynebacterium の
２，５−ジケト−グルコン酸還元酵素遺伝子を２，５−
ジケト−グルコン酸を生産する Erwinia に導入し、一
段の醗酵プロセスでＤ−グルコースから２ＫＧＡを得る
方法（サイエンス第２３０巻、１４４頁、１９８５）、
Ｄ−ソルビトールまたはＬ−ソルボースを出発物質と
し、これをグルコノバクター属細菌を用いて酸化するこ
とによって２ＫＧＡを得る方法（特開平２−１５０２８
７号参照）が報告されている。また、土壌よりＬ−ソル
ボースを効率よく２ＫＧＡへと変換する能力を有する細
菌シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネスが分
離され（特開昭６２−２２８２８８号参照）、さらに、
ヨーロッパ特許出願公開第２２１７０７号（特開昭６４
−８５０８８号）には、培地に希土類元素を添加するこ
とにより該菌の２ＫＧＡ生成が著しく促進されるという
知見を利用し上記シュードグルコノバクター属の菌を用
いたより効率の良いＬ−ソルボースからの２ＫＧＡ製造
法が開示されている。一方、菌体反応により２ＫＧＡを
得る際の生産性を改良する方法が種々試みられている
が、簡便で汎用性ある設備を用いることにより、培地原
料、培養廃棄物を顕著に削減でき、かつ培養時間等を短
縮できる工業的に有利な菌体反応方法あるいは培養方法
はまだ見出されていない。
有用な２ＫＧＡは、工業的に確立されたいわゆるライヒ
シュタイン法（Helvetica Chimica Acta 第１７巻、
３１１頁、１９３４参照）によって生産されてきた。し
かし、この方法は工程も多く、多量の有機溶媒を必要と
し、現代の工業技術としては満足すべきものではない。 一方、ライヒシュタイン法に替わるものとしては、主に
微生物を用いた方法がいくつか提案されてきている。例
えば、Ｄ−グルコースを微生物的に酸化して２，５−ジ
ケト−グルコン酸にした後、これをさらに微生物的また
は化学的に２ＫＧＡへと還元する方法（特公昭３９−１
４４９３号、特公昭５３−２５０３３号、特公昭５６−
１５８７７号、特公昭５９−３５９２０号参照）、さら
に、ＤＮＡ組み替え技術によって、Corynebacterium の
２，５−ジケト−グルコン酸還元酵素遺伝子を２，５−
ジケト−グルコン酸を生産する Erwinia に導入し、一
段の醗酵プロセスでＤ−グルコースから２ＫＧＡを得る
方法（サイエンス第２３０巻、１４４頁、１９８５）、
Ｄ−ソルビトールまたはＬ−ソルボースを出発物質と
し、これをグルコノバクター属細菌を用いて酸化するこ
とによって２ＫＧＡを得る方法（特開平２−１５０２８
７号参照）が報告されている。また、土壌よりＬ−ソル
ボースを効率よく２ＫＧＡへと変換する能力を有する細
菌シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネスが分
離され（特開昭６２−２２８２８８号参照）、さらに、
ヨーロッパ特許出願公開第２２１７０７号（特開昭６４
−８５０８８号）には、培地に希土類元素を添加するこ
とにより該菌の２ＫＧＡ生成が著しく促進されるという
知見を利用し上記シュードグルコノバクター属の菌を用
いたより効率の良いＬ−ソルボースからの２ＫＧＡ製造
法が開示されている。一方、菌体反応により２ＫＧＡを
得る際の生産性を改良する方法が種々試みられている
が、簡便で汎用性ある設備を用いることにより、培地原
料、培養廃棄物を顕著に削減でき、かつ培養時間等を短
縮できる工業的に有利な菌体反応方法あるいは培養方法
はまだ見出されていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】上記の公知２ＫＧＡの
製造方法は、いずれも用いる培養方法は基質の糖あるい
は糖アルコールを培養開始時に一括添加するかあるい
は、その一部もしくは全部を半連続的もしくは連続的に
添加して培養し、生成物である２ＫＧＡが充分量蓄積し
それ以上培養を続けても効率よく２ＫＧＡへの変換が起
こらなくなった時点で培養を止めて培養液を得るもので
ある。その後の工程において系外に除かれた菌体は通常
廃棄され、次の培養はまた種培養から開始されるいわゆ
るバッチ培養法と呼ばれるところの通常の培養法を採用
している。しかし、これらの方法は１回の培養にそれぞ
れ１回の種培養が必要であり、また主培養において菌を
増殖させる必要から濃厚な培地を用いるのが通常であ
る。これらは工業的に製造する上で、経済的に不利であ
る。また培養終了後、目的とする生産物を分離取得した
後の不要の培養残物が多量となるため、環境問題の点か
らも好ましくない。また種培養で得たシードを本培養の
為接種する量は少量であるため、本培養において所望の
菌体量まで増殖させるのに多大の時間がかかり、そのた
め本培養の終了までの時間が長くなる。これらを解決す
る方法として、なんらかの方法で菌体または目的の反応
に関与する酵素を担体に固定して行う固定化菌体法また
は固定化酵素法が知られている。しかし、これらは固定
化や菌体及び酵素の活性維持に多大な努力が必要なこと
が常である。又、近年醗酵槽と濾過膜を組み合わせて培
養を行うバイオリアクターも登場して来た。しかし、こ
れは装置自体が複雑なこと、一般に操作も煩雑なこと等
の欠点があり、装置の雑菌汚染を防ぐため多くの費用と
高度な技術が必要とされる。本発明の目的は２ＫＧＡ菌
体反応に幅広く適用できる方法であって、簡便で汎用性
ある設備を用いることにより、培地原料、培養廃棄物を
顕著に削減でき、かつ培養時間等を短縮できる工業的に
有利な方法を提供することにある。
製造方法は、いずれも用いる培養方法は基質の糖あるい
は糖アルコールを培養開始時に一括添加するかあるい
は、その一部もしくは全部を半連続的もしくは連続的に
添加して培養し、生成物である２ＫＧＡが充分量蓄積し
それ以上培養を続けても効率よく２ＫＧＡへの変換が起
こらなくなった時点で培養を止めて培養液を得るもので
ある。その後の工程において系外に除かれた菌体は通常
廃棄され、次の培養はまた種培養から開始されるいわゆ
るバッチ培養法と呼ばれるところの通常の培養法を採用
している。しかし、これらの方法は１回の培養にそれぞ
れ１回の種培養が必要であり、また主培養において菌を
増殖させる必要から濃厚な培地を用いるのが通常であ
る。これらは工業的に製造する上で、経済的に不利であ
る。また培養終了後、目的とする生産物を分離取得した
後の不要の培養残物が多量となるため、環境問題の点か
らも好ましくない。また種培養で得たシードを本培養の
為接種する量は少量であるため、本培養において所望の
菌体量まで増殖させるのに多大の時間がかかり、そのた
め本培養の終了までの時間が長くなる。これらを解決す
る方法として、なんらかの方法で菌体または目的の反応
に関与する酵素を担体に固定して行う固定化菌体法また
は固定化酵素法が知られている。しかし、これらは固定
化や菌体及び酵素の活性維持に多大な努力が必要なこと
が常である。又、近年醗酵槽と濾過膜を組み合わせて培
養を行うバイオリアクターも登場して来た。しかし、こ
れは装置自体が複雑なこと、一般に操作も煩雑なこと等
の欠点があり、装置の雑菌汚染を防ぐため多くの費用と
高度な技術が必要とされる。本発明の目的は２ＫＧＡ菌
体反応に幅広く適用できる方法であって、簡便で汎用性
ある設備を用いることにより、培地原料、培養廃棄物を
顕著に削減でき、かつ培養時間等を短縮できる工業的に
有利な方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らはこれらの事
情に鑑み、より有利な菌体反応方法を求めて種々の改良
を試みた。例えば２ＫＧＡ醗酵において１回の培養で増
殖させた菌体を培養液又は菌体反応液の水溶液部分に存
在する目的の生産物である２ＫＧＡを取得後、廃棄する
ことなく活性を維持させ繰り返し次の２ＫＧＡ醗酵に用
いる醗酵法を試みた。その結果、培養又は菌体反応終了
後濾過膜または遠心分離機等公知手段で菌体と水溶液部
分を分離し、得られた菌体の一部あるいは全部を好まし
くは活性維持補助物質とともに次の培養に使用するリサ
イクル培養により通常のバッチ培養に比べ、同一量の基
質を酸化する場合では醗酵時間の著しい短縮を可能と
し、また培地原料や培養廃棄物も顕著に削減することが
できることを見出し、さらに検討を重ね本発明を完成す
るに至った。すなわち本発明は、（１）Ｌ−ソルボース
から２−ケト−Ｌ−グロン酸（以後、２ＫＧＡと称す）
を生産する能力を有する微生物を２ＫＧＡを生産するた
めの基質を含む液体培地中で培養し、（２）培養液中の
生産された２ＫＧＡを回収する一方、微生物も回収し、
（３）回収した微生物を次の培養のための新しい液体培
地に接種し、（４）この培養と回収を少なくとも１回く
りかえすことを特徴とする２−ケト−Ｌ−グロン酸（以
後、２ＫＧＡと称す）の製造法に関する。
情に鑑み、より有利な菌体反応方法を求めて種々の改良
を試みた。例えば２ＫＧＡ醗酵において１回の培養で増
殖させた菌体を培養液又は菌体反応液の水溶液部分に存
在する目的の生産物である２ＫＧＡを取得後、廃棄する
ことなく活性を維持させ繰り返し次の２ＫＧＡ醗酵に用
いる醗酵法を試みた。その結果、培養又は菌体反応終了
後濾過膜または遠心分離機等公知手段で菌体と水溶液部
分を分離し、得られた菌体の一部あるいは全部を好まし
くは活性維持補助物質とともに次の培養に使用するリサ
イクル培養により通常のバッチ培養に比べ、同一量の基
質を酸化する場合では醗酵時間の著しい短縮を可能と
し、また培地原料や培養廃棄物も顕著に削減することが
できることを見出し、さらに検討を重ね本発明を完成す
るに至った。すなわち本発明は、（１）Ｌ−ソルボース
から２−ケト−Ｌ−グロン酸（以後、２ＫＧＡと称す）
を生産する能力を有する微生物を２ＫＧＡを生産するた
めの基質を含む液体培地中で培養し、（２）培養液中の
生産された２ＫＧＡを回収する一方、微生物も回収し、
（３）回収した微生物を次の培養のための新しい液体培
地に接種し、（４）この培養と回収を少なくとも１回く
りかえすことを特徴とする２−ケト−Ｌ−グロン酸（以
後、２ＫＧＡと称す）の製造法に関する。
【０００５】本発明は最初に２ＫＧＡを生産する能力を
持つ微生物を少なくとも一種以上培養し、生産された２
ＫＧＡを分離回収後、必要な活性を維持させたまま、２
回以上繰り返し使用する菌体反応を含む２ＫＧＡの改良
製造法に関する。ここで菌体反応とはあらかじめ所望の
生産能力を有する微生物を培養等で充分量得、基質と接
触させる反応でもよく、基質と接触させる際には菌体の
増殖を伴わなくてもよい。又通常の培養方法すなわち、
主培養培地に少量の種培養で得たシードを移植し、菌体
の増殖を伴って目的物を生成する方法であってもよい。
さらに詳しくは、醗酵を含む菌体反応を行うに際し培養
液もしくは菌体反応液から膜あるいは遠心分離機等の分
離手段を用いて培地固形分を含む菌体部分と２ＫＧＡ等
最終目的物を含む水溶液部分に分離し、得られた菌体部
分を次の新しい培地を用いる醗酵もしくは菌体反応に繰
り返し使用する培養法に関するものである。この場合、
いったん反応を終わった反応液中から分離して得られた
生菌体を次の培地に接種するにあたっては、慣用法に従
って、生菌体と培地を接触させればよい。なお、本発明
において、「２ＫＧＡを最終生産物とする醗酵」を「２
ＫＧＡ醗酵」と称することもあり「菌体反応」も含めて
「醗酵」又は「培養」と称することもあり、また、「菌
体反応液」も含めて「培養液」と称することもある。ま
た、「菌体を繰り返し使用する培養」を「リサイクル培
養」と称することもある。
持つ微生物を少なくとも一種以上培養し、生産された２
ＫＧＡを分離回収後、必要な活性を維持させたまま、２
回以上繰り返し使用する菌体反応を含む２ＫＧＡの改良
製造法に関する。ここで菌体反応とはあらかじめ所望の
生産能力を有する微生物を培養等で充分量得、基質と接
触させる反応でもよく、基質と接触させる際には菌体の
増殖を伴わなくてもよい。又通常の培養方法すなわち、
主培養培地に少量の種培養で得たシードを移植し、菌体
の増殖を伴って目的物を生成する方法であってもよい。
さらに詳しくは、醗酵を含む菌体反応を行うに際し培養
液もしくは菌体反応液から膜あるいは遠心分離機等の分
離手段を用いて培地固形分を含む菌体部分と２ＫＧＡ等
最終目的物を含む水溶液部分に分離し、得られた菌体部
分を次の新しい培地を用いる醗酵もしくは菌体反応に繰
り返し使用する培養法に関するものである。この場合、
いったん反応を終わった反応液中から分離して得られた
生菌体を次の培地に接種するにあたっては、慣用法に従
って、生菌体と培地を接触させればよい。なお、本発明
において、「２ＫＧＡを最終生産物とする醗酵」を「２
ＫＧＡ醗酵」と称することもあり「菌体反応」も含めて
「醗酵」又は「培養」と称することもあり、また、「菌
体反応液」も含めて「培養液」と称することもある。ま
た、「菌体を繰り返し使用する培養」を「リサイクル培
養」と称することもある。
【０００６】本発明の方法は、幅広い基質と菌に適用で
きる。本方法の基質としては、糖又は糖アルコールが好
ましい。基質の例としてはＬ−ソルボース、Ｄ−グルコ
ース、Ｄ−ソルビトールがあげられる。Ｌ−ソルボース
がいくつかの菌を用いる本法の最も好ましい基質であ
る。本発明に用いる微生物は細菌が好ましい。さらに詳
しくはシュードグルコノバクター属、グルコノバクター
属、シュドモナス属、コリネバクテリウム属、アセトバ
クター属、エルビニア属細菌等が好ましい微生物として
挙げられる。本発明をさらに詳しく以下に説明する。本
発明において用いられるＬ−ソルボースから２ＫＧＡを
生産する能力を有する微生物としては、例えば公知のシ
ュードグルコノバクター属、グルコノバクター属、シュ
ドモナス属、コリネバクテリウム属、アセトバクター
属、２、５ージケトーＤ−グルコン酸還元酵素遺伝子を
組み込んだエルビニア属の微生物がある。勿論これらの
微生物に限らず、２ＫＧＡを生産する能力を有する微生
物であればどの様な微生物でも本発明に用いることがで
きる。Ｌ−ソルボースを基質とする醗酵では、シュード
グルコノバクター属とグルコノバクター属の菌が好まし
く用いられる。とりわけシュードグルコノバクター属の
菌がより好ましい。シュードグルコノバクター属の菌と
しては、例えばＫ５９１ｓ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３
０）、１２−５（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２９）、ＴＨ１
４−８６（ＦＥＲＭＢＰ−１１２８）、１２−１５（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−１１３２）、１２−４（ＦＥＲＭ ＢＰ
−１１３１）、２２−３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３３）
等の菌株があげられる。
きる。本方法の基質としては、糖又は糖アルコールが好
ましい。基質の例としてはＬ−ソルボース、Ｄ−グルコ
ース、Ｄ−ソルビトールがあげられる。Ｌ−ソルボース
がいくつかの菌を用いる本法の最も好ましい基質であ
る。本発明に用いる微生物は細菌が好ましい。さらに詳
しくはシュードグルコノバクター属、グルコノバクター
属、シュドモナス属、コリネバクテリウム属、アセトバ
クター属、エルビニア属細菌等が好ましい微生物として
挙げられる。本発明をさらに詳しく以下に説明する。本
発明において用いられるＬ−ソルボースから２ＫＧＡを
生産する能力を有する微生物としては、例えば公知のシ
ュードグルコノバクター属、グルコノバクター属、シュ
ドモナス属、コリネバクテリウム属、アセトバクター
属、２、５ージケトーＤ−グルコン酸還元酵素遺伝子を
組み込んだエルビニア属の微生物がある。勿論これらの
微生物に限らず、２ＫＧＡを生産する能力を有する微生
物であればどの様な微生物でも本発明に用いることがで
きる。Ｌ−ソルボースを基質とする醗酵では、シュード
グルコノバクター属とグルコノバクター属の菌が好まし
く用いられる。とりわけシュードグルコノバクター属の
菌がより好ましい。シュードグルコノバクター属の菌と
しては、例えばＫ５９１ｓ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３
０）、１２−５（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２９）、ＴＨ１
４−８６（ＦＥＲＭＢＰ−１１２８）、１２−１５（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−１１３２）、１２−４（ＦＥＲＭ ＢＰ
−１１３１）、２２−３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３３）
等の菌株があげられる。
【０００７】また培地組成、培養温度などの醗酵条件
は、云うまでもなく用いる菌株に適するように調製すれ
ば良い。例えばシュードグルコノバクター属細菌を用い
る２ＫＧＡ醗酵の例では、特開昭６２ー２２８２８８号
に記載の培養法、培地組成、培養条件を用いることもで
きる。同特許出願に記載されているように、２ＫＧＡ生
産能を持つ菌に対しその生育促進物質を供給する能力を
持つ別種の微生物の共存下で２ＫＧＡ生産能を持つ微生
物の培養を行う場合（以後これを混合培養と称すことも
ある）に特に好適に本発明を適用することができる。混
合培養に用いられる共存別種微生物の例としてはバチラ
ス属、シュドモナス属、プロテウス属、シトロバクター
属、エンテロバクター属、エルウィニア属、キサントモ
ナス属、及びフラボバクテリウム属の微生物があげられ
る。
は、云うまでもなく用いる菌株に適するように調製すれ
ば良い。例えばシュードグルコノバクター属細菌を用い
る２ＫＧＡ醗酵の例では、特開昭６２ー２２８２８８号
に記載の培養法、培地組成、培養条件を用いることもで
きる。同特許出願に記載されているように、２ＫＧＡ生
産能を持つ菌に対しその生育促進物質を供給する能力を
持つ別種の微生物の共存下で２ＫＧＡ生産能を持つ微生
物の培養を行う場合（以後これを混合培養と称すことも
ある）に特に好適に本発明を適用することができる。混
合培養に用いられる共存別種微生物の例としてはバチラ
ス属、シュドモナス属、プロテウス属、シトロバクター
属、エンテロバクター属、エルウィニア属、キサントモ
ナス属、及びフラボバクテリウム属の微生物があげられ
る。
【０００８】混合培養に用いられる共存別種微生物とし
ては、より具体的には、例えば以下のものがあげられ
る。 バチラス セレウス ＩＦＯ ３１３１ バチラス リケニフォルミス ＩＦＯ １２２０１ バチラス メガテリウム ＩＦＯ １２１０８ バチラス プミルス ＩＦＯ １２０９０ バチラス アミロリケファシエンス ＩＦＯ ３０２２ バチラス サブチラス ＩＦＯ １３７１９ バチラス サーキュランス ＩＦＯ ３９６７ シュードモナス トリホリ ＩＦＯ １２０５６ シュードモナス マルトフィリア ＩＦＯ １２６９２ プロテウス インコスタンス ＩＦＯ １２９３０ シトロバクター フレンディ ＩＦＯ １３５４４ エンテロバクター クロアカエ ＩＦＯ ３３２０ エルウィニア ハービコーラ ＩＦＯ １２６８６ キサントモナス プシ ＩＦＯ １３５５６ キサントモナス シトリ ＩＦＯ ３８３５ フラボバクテリウム メニゴセプチィカム ＩＦＯ １
２５３５ この様な混合培養においては、バチラス属の菌を用いる
のがとりわけ好ましい。上記の微生物の共存下での混合
培養はグルコノバクター属の菌を用いた製造法にもまた
行われる。シュードグルコノバクター属の菌を使用する
場合、蔗糖、及び硫安／又は尿素を含む液体培地を用い
るのが好ましい。
ては、より具体的には、例えば以下のものがあげられ
る。 バチラス セレウス ＩＦＯ ３１３１ バチラス リケニフォルミス ＩＦＯ １２２０１ バチラス メガテリウム ＩＦＯ １２１０８ バチラス プミルス ＩＦＯ １２０９０ バチラス アミロリケファシエンス ＩＦＯ ３０２２ バチラス サブチラス ＩＦＯ １３７１９ バチラス サーキュランス ＩＦＯ ３９６７ シュードモナス トリホリ ＩＦＯ １２０５６ シュードモナス マルトフィリア ＩＦＯ １２６９２ プロテウス インコスタンス ＩＦＯ １２９３０ シトロバクター フレンディ ＩＦＯ １３５４４ エンテロバクター クロアカエ ＩＦＯ ３３２０ エルウィニア ハービコーラ ＩＦＯ １２６８６ キサントモナス プシ ＩＦＯ １３５５６ キサントモナス シトリ ＩＦＯ ３８３５ フラボバクテリウム メニゴセプチィカム ＩＦＯ １
２５３５ この様な混合培養においては、バチラス属の菌を用いる
のがとりわけ好ましい。上記の微生物の共存下での混合
培養はグルコノバクター属の菌を用いた製造法にもまた
行われる。シュードグルコノバクター属の菌を使用する
場合、蔗糖、及び硫安／又は尿素を含む液体培地を用い
るのが好ましい。
【０００９】本発明の培養手法は、使用する微生物、培
養目的に応じて適宜選択できるが例えば振盪培養、静置
培養あるいは通気撹拌培養法等の公知培養手段を採用す
ることができる。菌体回収の方法としては醗酵液中の菌
体を分離するために通常使用される装置を用いることが
でき、例えば中空糸膜濾過器、セラミック膜濾過器、遠
心分離機等が使用出来る。これらの装置は単数あるいは
複数でもよいし、２種類以上の装置の組合せでもよい。
遠心分離機を用いる場合は培養液を連続的に処理できる
いわゆる連続遠心分離機が好ましい。又、装置の一部又
は全部を無菌的に使用できるものが望ましい。これらの
装置は通常市販されているものをそのまま使用してもよ
いし、必要ならば一部改造して使用することもできる。
これらの装置の選択は培養液中の菌体量、固形分によっ
て適当なタイプのものが選ばれる。装置の能力と機数は
主に培養の液量によって決定される。菌体は２５％以
上、好ましくは５０から１００％回収する。また、菌体
回収時の温度は通常、０℃から５０℃、好ましくは５か
ら４０℃で行うのがよい。菌体の繰り返し利用の回数は
菌体が２ＫＧＡ生産の能力を有する限り何回も使用でき
る。シュードグルコノバクター属の菌を用いての２ＫＧ
Ａ生産の場合は少なくても２回、通常４から５回以上繰
り返して使用することができる。
養目的に応じて適宜選択できるが例えば振盪培養、静置
培養あるいは通気撹拌培養法等の公知培養手段を採用す
ることができる。菌体回収の方法としては醗酵液中の菌
体を分離するために通常使用される装置を用いることが
でき、例えば中空糸膜濾過器、セラミック膜濾過器、遠
心分離機等が使用出来る。これらの装置は単数あるいは
複数でもよいし、２種類以上の装置の組合せでもよい。
遠心分離機を用いる場合は培養液を連続的に処理できる
いわゆる連続遠心分離機が好ましい。又、装置の一部又
は全部を無菌的に使用できるものが望ましい。これらの
装置は通常市販されているものをそのまま使用してもよ
いし、必要ならば一部改造して使用することもできる。
これらの装置の選択は培養液中の菌体量、固形分によっ
て適当なタイプのものが選ばれる。装置の能力と機数は
主に培養の液量によって決定される。菌体は２５％以
上、好ましくは５０から１００％回収する。また、菌体
回収時の温度は通常、０℃から５０℃、好ましくは５か
ら４０℃で行うのがよい。菌体の繰り返し利用の回数は
菌体が２ＫＧＡ生産の能力を有する限り何回も使用でき
る。シュードグルコノバクター属の菌を用いての２ＫＧ
Ａ生産の場合は少なくても２回、通常４から５回以上繰
り返して使用することができる。
【００１０】本発明の菌体反応を含む培養方法におい
て、生菌体の菌体反応活性、すなわち、目的物の生産活
性を長時間持続させるため、主培養培地に菌体反応の活
性維持補助物質を添加するのが好ましい。このような活
性維持補助物質として酵母エキス、乾燥酵母、および／
またはコーンスティープリカー（以下、ＣＳＬと称する
こともある。）などのような天然有機栄養物質を用いる
のが有効である。一方、１回目の主培養及び２回目以降
のリサイクル培養後の培養液中または反応液中に生成し
蓄積した目的生産物は、その性状を利用したそれ自体公
知の手段で分離精製することができる。例えば、ナトリ
ウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム等の塩とし
て分離してもよい。分離の方法としては目的を阻害しな
い限り、いかなるものでもよいが、例えば必要に応じて
反応液から濾過、遠心分離あるいは活性炭処理等を行っ
て、菌体と分離した後、この溶液をそのまま濃縮、析出
する結晶を濾取し、さらに再結晶させて目的物を取り出
す方法、樹脂吸着法、クロマトグラフィー法、塩析法な
どを単独で、あるいは適宜組み合わせ、また反復して利
用することもできる。生産物が遊離型でえられる場合は
これを適宜の方法によって、例えば、ナトリウム、カリ
ウム、カルシウム、アンモニウム等の塩にしてもよく、
また塩として得られる場合は、これを適当な方法によっ
て遊離型あるいは他の塩にかえてもよい。
て、生菌体の菌体反応活性、すなわち、目的物の生産活
性を長時間持続させるため、主培養培地に菌体反応の活
性維持補助物質を添加するのが好ましい。このような活
性維持補助物質として酵母エキス、乾燥酵母、および／
またはコーンスティープリカー（以下、ＣＳＬと称する
こともある。）などのような天然有機栄養物質を用いる
のが有効である。一方、１回目の主培養及び２回目以降
のリサイクル培養後の培養液中または反応液中に生成し
蓄積した目的生産物は、その性状を利用したそれ自体公
知の手段で分離精製することができる。例えば、ナトリ
ウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム等の塩とし
て分離してもよい。分離の方法としては目的を阻害しな
い限り、いかなるものでもよいが、例えば必要に応じて
反応液から濾過、遠心分離あるいは活性炭処理等を行っ
て、菌体と分離した後、この溶液をそのまま濃縮、析出
する結晶を濾取し、さらに再結晶させて目的物を取り出
す方法、樹脂吸着法、クロマトグラフィー法、塩析法な
どを単独で、あるいは適宜組み合わせ、また反復して利
用することもできる。生産物が遊離型でえられる場合は
これを適宜の方法によって、例えば、ナトリウム、カリ
ウム、カルシウム、アンモニウム等の塩にしてもよく、
また塩として得られる場合は、これを適当な方法によっ
て遊離型あるいは他の塩にかえてもよい。
【００１１】
【発明の効果】本発明によれば、菌体反応において菌体
をリサイクル使用するため１回毎の培養に種培養を必要
とせず、また主培養における菌の増殖に要する時間の短
縮、培地原料、培養廃棄物の削減がはかれる等、２ＫＧ
Ａを工業的に製造する上でより経済的、効率的で有利な
方法が提供される。
をリサイクル使用するため１回毎の培養に種培養を必要
とせず、また主培養における菌の増殖に要する時間の短
縮、培地原料、培養廃棄物の削減がはかれる等、２ＫＧ
Ａを工業的に製造する上でより経済的、効率的で有利な
方法が提供される。
【００１２】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に
説明するが、云うまでもなくこれらの実施例は本発明を
限定するものではない。なお、２ＫＧＡの定量は、下記
に示す条件下で高速液体クロマトグラフィー法によって
行った。 高速液体クロマトグラフィー測定条件； カラム：ＳＣＲ１０１Ｈ、７.９×３００mm（島津製作
所製） 移動相：４mＭ硫酸 検出器：ＲＩ検出器 実施例１
説明するが、云うまでもなくこれらの実施例は本発明を
限定するものではない。なお、２ＫＧＡの定量は、下記
に示す条件下で高速液体クロマトグラフィー法によって
行った。 高速液体クロマトグラフィー測定条件； カラム：ＳＣＲ１０１Ｈ、７.９×３００mm（島津製作
所製） 移動相：４mＭ硫酸 検出器：ＲＩ検出器 実施例１
【表１】
【表２】 種培地Ａ （ｇ／ｌ） ───────────────────────── ラクトース １０ 酵母エキス １０ コーンスティープリカー（ＣＳＬ） ３０ 硫安 ３ ───────────────────────── ｐＨ７．０
【００１３】
【表３】
【表４】 醗酵培地 （ｇ／ｌ） ───────────────────────── ＣＳＬ ２０ 硫酸第一鉄 １ 硫安 ３ ショ糖 ０．５ リボフラビン ０．００１ アクトコール（武田薬品工業製） ０．１５ 粗塩化希土（三菱化成社製） ０．１ ───────────────────────── ｐＨ７．０
【００１４】
【表５】 リサイクル培地 （ｇ／ｌ） Ａ Ｂ Ｃ Ｄ ────────────────────────────────── ショ糖 ０.５ ０.５ ０.５ ０.５ 硫安 ３ ３ ３ ０.３ ＣＳＬ（王子コーンスターチ社製） ４ ４ ３ 尿素 １ 乾燥酵母（仏ベル社製） ５ 酵母エキス（独オーリー社製） １ ────────────────────────────────── 〔表２〕に示す組成の種培地Ａ２０mlを２００ml容三角
フラスコに入れ１２０℃、２０分間滅菌した。これに
〔表１〕で示す組成の斜面培地で３０℃、３日間生育さ
せたシュードグルコノバクター・サッカロケトゲネスＫ
５９１ｓ株（ＩＦＯ １４４６４、ＦＥＲＭ ＢＰ−１
１３０；以下、単に酸化菌と称することもある）の菌体
を一白金耳植菌し、２８℃で１日間振盪培養することに
よって第１種培養液を得た。同じく種培地Ａ２０mlを２
００ml容の三角フラスコ入れ滅菌した。これに第１種培
養液を１ml植菌し２８℃、２日間振盪培養して第２種培
養液を得た。また〔表３〕に示す組成の種培地Ｂ２０ml
を２００ml容三角フラスコに入れ滅菌したものに〔表
１〕に示す組成の斜面培地で生育させたバチラス・メガ
テリウム（ＩＦＯ １２１０８）の菌体を１白金耳植菌
して２８℃、２日間振盪培養してバチラス・メガテリウ
ム（以下、単に混合菌と称することもある）の種培養液
を得た。
フラスコに入れ１２０℃、２０分間滅菌した。これに
〔表１〕で示す組成の斜面培地で３０℃、３日間生育さ
せたシュードグルコノバクター・サッカロケトゲネスＫ
５９１ｓ株（ＩＦＯ １４４６４、ＦＥＲＭ ＢＰ−１
１３０；以下、単に酸化菌と称することもある）の菌体
を一白金耳植菌し、２８℃で１日間振盪培養することに
よって第１種培養液を得た。同じく種培地Ａ２０mlを２
００ml容の三角フラスコ入れ滅菌した。これに第１種培
養液を１ml植菌し２８℃、２日間振盪培養して第２種培
養液を得た。また〔表３〕に示す組成の種培地Ｂ２０ml
を２００ml容三角フラスコに入れ滅菌したものに〔表
１〕に示す組成の斜面培地で生育させたバチラス・メガ
テリウム（ＩＦＯ １２１０８）の菌体を１白金耳植菌
して２８℃、２日間振盪培養してバチラス・メガテリウ
ム（以下、単に混合菌と称することもある）の種培養液
を得た。
【００１５】〔表４〕の成分からなる培地を２倍濃縮し
て調製し、この１０mlを２００ml容の三角フラスコに分
注し、１２０℃，２０分間蒸気滅菌した。これにそれぞ
れ別滅菌した炭酸カルシウム（白石カルシュウム社製）
０.８ｇ（５ml）、およびＬ−ソルボース２ｇ（５ml）
を加え醗酵培地とした。これに上記した酸化菌の第二種
培養液２mlと混合菌の種培養液１mlを移植し３０℃で振
盪培養した。醗酵開始後、２８時間でＬ−ソルボースは
完全に消費された。この培養液中には１.７６ｇの２Ｋ
ＧＡが蓄積していた。この培養液を予め滅菌しておいた
遠沈管に無菌的に全量移し、冷却装置付ローター型小型
遠心分離機を用いて２０℃で、３０００rpm で１０分間
遠心した。一方、上記〔表５〕のＡからＤの培地（以
下、リサイクル培地と称すこともある）１０mlを２００
ml容三角フラスコに入れて滅菌した。これに別滅菌した
Ｌ−ソルボース２ｇ（５ml）と炭酸カルシュウム０.８
ｇ（５ml）を加えた。これに遠心分離操作で得た菌体
（他の固形分も含む）を無菌的に全量接種した。これを
１回目と同じ条件で振盪培養した。（以下この培養をリ
サイクル培養と称す。） このようにしてリサイクル培養を３回繰り返し行った。
醗酵の終点はＬ−ソルボースがほぼ２ＫＧＡに変換され
た時点とした。各リサイクル培養の終了から次回の培養
開始までの時間は約１時間であった。各培養終了液中に
は１.７から１.８ｇの２ＫＧＡが含まれていた。各醗酵
に要した時間を〔表６〕に示した。
て調製し、この１０mlを２００ml容の三角フラスコに分
注し、１２０℃，２０分間蒸気滅菌した。これにそれぞ
れ別滅菌した炭酸カルシウム（白石カルシュウム社製）
０.８ｇ（５ml）、およびＬ−ソルボース２ｇ（５ml）
を加え醗酵培地とした。これに上記した酸化菌の第二種
培養液２mlと混合菌の種培養液１mlを移植し３０℃で振
盪培養した。醗酵開始後、２８時間でＬ−ソルボースは
完全に消費された。この培養液中には１.７６ｇの２Ｋ
ＧＡが蓄積していた。この培養液を予め滅菌しておいた
遠沈管に無菌的に全量移し、冷却装置付ローター型小型
遠心分離機を用いて２０℃で、３０００rpm で１０分間
遠心した。一方、上記〔表５〕のＡからＤの培地（以
下、リサイクル培地と称すこともある）１０mlを２００
ml容三角フラスコに入れて滅菌した。これに別滅菌した
Ｌ−ソルボース２ｇ（５ml）と炭酸カルシュウム０.８
ｇ（５ml）を加えた。これに遠心分離操作で得た菌体
（他の固形分も含む）を無菌的に全量接種した。これを
１回目と同じ条件で振盪培養した。（以下この培養をリ
サイクル培養と称す。） このようにしてリサイクル培養を３回繰り返し行った。
醗酵の終点はＬ−ソルボースがほぼ２ＫＧＡに変換され
た時点とした。各リサイクル培養の終了から次回の培養
開始までの時間は約１時間であった。各培養終了液中に
は１.７から１.８ｇの２ＫＧＡが含まれていた。各醗酵
に要した時間を〔表６〕に示した。
【表６】 時間（hr） 醗酵回数 Ａ Ｂ Ｃ Ｄ １回目 ２８ ２８ ２８ ２８ ２回目 １３ １２ １２ １２ ３回目 １３ １３ １２ １３ ４回目 １４ １３ １３ １３
【００１６】実施例２ 混合菌を用いずに第１回目の醗酵を純粋培養で行った。
醗酵培地は第４表の成分に乾燥酵母５ｇ／ｌを加えた。
他は実施例１と同様に実施した。第２回目以降は実施例
１と同様のリサイクル培地を用いてリサイクル培養を行
った。各醗酵に要した時間を〔表７〕に示した。各培養
終了液中には１.７から１.８ｇの２ＫＧＡが含まれてい
た。
醗酵培地は第４表の成分に乾燥酵母５ｇ／ｌを加えた。
他は実施例１と同様に実施した。第２回目以降は実施例
１と同様のリサイクル培地を用いてリサイクル培養を行
った。各醗酵に要した時間を〔表７〕に示した。各培養
終了液中には１.７から１.８ｇの２ＫＧＡが含まれてい
た。
【表７】 時間（hr） 醗酵回数 Ａ Ｂ Ｃ Ｄ １回目 ３０ ３０ ３０ ３０ ２回目 １５ １３ １２ １３ ３回目 １６ １３ １３ １２ ４回目 １６ １４ １３ １３ 実施例３ 〔表２〕に示す組成の種培地Ａ２０mlを２００ml容三角
フラスコに入れ１２０℃、２０分間滅菌した。これに
〔表１〕で示す組成の斜面培地で３０℃、３日間生育さ
せたシュードグルコノバクター・サッカロケトゲネスＴ
Ｈ１４−８６株（ＩＦＯ １４４６６、ＦＥＲＭ ＢＰ
−１１２８）の菌体を一白金耳植菌し、２８℃で１日間
振盪培養することによって第一種培養液を得た。同じく
種培地Ａ２００mlを１ｌ容の三角フラスコに入れ滅菌し
たものを２本用意し、これに第１種培養液を１０mlずつ
植菌し２８℃、２日間振盪培養して第２種培養液を得
た。〔表３〕の種培地Ｂ２０mlを２００ml容三角フラス
コに入れ滅菌したものに〔表１〕に示す組成の斜面培地
で生育させた混合菌の菌体を１白金耳植菌して２８℃、
２日間振盪培養して混合菌の種培養液を得た。
フラスコに入れ１２０℃、２０分間滅菌した。これに
〔表１〕で示す組成の斜面培地で３０℃、３日間生育さ
せたシュードグルコノバクター・サッカロケトゲネスＴ
Ｈ１４−８６株（ＩＦＯ １４４６６、ＦＥＲＭ ＢＰ
−１１２８）の菌体を一白金耳植菌し、２８℃で１日間
振盪培養することによって第一種培養液を得た。同じく
種培地Ａ２００mlを１ｌ容の三角フラスコに入れ滅菌し
たものを２本用意し、これに第１種培養液を１０mlずつ
植菌し２８℃、２日間振盪培養して第２種培養液を得
た。〔表３〕の種培地Ｂ２０mlを２００ml容三角フラス
コに入れ滅菌したものに〔表１〕に示す組成の斜面培地
で生育させた混合菌の菌体を１白金耳植菌して２８℃、
２日間振盪培養して混合菌の種培養液を得た。
【００１７】ＣＳＬ ６０ｇ、ＦｅＳＯ4 ３ｇ、硫安９
ｇ、ビタミンＢ2 ３mg、ショ糖１.５ｇ、アクトコール
０.５ｇ（武田薬品工業社製）を水道水で１６６０mlに
して、ＮａＯＨでｐＨを７に調整した後、滅菌して主醗
酵培地を得た。これに酸化菌の第２種培養液３００mlと
混合菌の種培養液４mlを加え、さらに０.３ｇの塩化ラ
ンタンを１０mlの水にとかして滅菌したものと別に無菌
的に調製したＬ−ソルボース３０ｇ（液量８４ml）を加
えた。予め薬剤滅菌した中空糸膜濾過器（マイクローザ
ＰＭＰ−１０２、旭化成社製）とペリスタリックポンプ
を、滅菌した５ｌジャーファーメンターに組み付けた。
これに上記の培地を入れ、温度３２℃、撹拌８００rp
m、通気０.５vvm の条件で醗酵を開始した。ｐＨセンサ
ーと連動したペリスタルティックポンプによって、１０
Ｎ−ＮａＯＨ水溶液を自動的に添加することによって培
養液のｐＨを６.２に維持した。さらに２７０ｇのＬ−
ソルボースを水道水にとかして７６０mlにしたものを無
菌的に調製し、培養液中のＬ−ソルボース濃度が１０〜
３０mg／ml前後になるようにこれを連続的に添加した。
その結果、合計３００ｇのＬ−ソルボースが１８時間で
全て酸化され、２８３.４ｇの２ＫＧＡが培養液中に蓄
積した。Ｌ−ソルボースが完全に消費された時点で醗酵
を止め、直ちに上記の濾過器の運転を開始した。２ＫＧ
Ａを含む濾過液２７００mlは系外に除かれ、醗酵槽内の
菌体部分の液量が３００mlになった時点で運転を終了し
た。予め滅菌されたリサイクル培地Ｄ３０００ml分（液
量１６８０ml）と、別に滅菌されたＬ−ソルボース３０
ｇ（液量８４ml）を上記醗酵槽に入れた。１回目の醗酵
と同じ条件で２回目の醗酵を開始した。１回目と同様に
２７０ｇのＬ−ソルボースを７６０mlの水道水に溶解、
無菌的に調製したものを１回目と同様に添加した。この
ようにして醗酵を１０回まで繰り返した。濾過操作時間
を含む培養終了から次の培養開始までの所要時間はいず
れも１時間以内であった。各醗酵の所要時間と２ＫＧＡ
蓄積量をまとめて〔表８〕に示す。
ｇ、ビタミンＢ2 ３mg、ショ糖１.５ｇ、アクトコール
０.５ｇ（武田薬品工業社製）を水道水で１６６０mlに
して、ＮａＯＨでｐＨを７に調整した後、滅菌して主醗
酵培地を得た。これに酸化菌の第２種培養液３００mlと
混合菌の種培養液４mlを加え、さらに０.３ｇの塩化ラ
ンタンを１０mlの水にとかして滅菌したものと別に無菌
的に調製したＬ−ソルボース３０ｇ（液量８４ml）を加
えた。予め薬剤滅菌した中空糸膜濾過器（マイクローザ
ＰＭＰ−１０２、旭化成社製）とペリスタリックポンプ
を、滅菌した５ｌジャーファーメンターに組み付けた。
これに上記の培地を入れ、温度３２℃、撹拌８００rp
m、通気０.５vvm の条件で醗酵を開始した。ｐＨセンサ
ーと連動したペリスタルティックポンプによって、１０
Ｎ−ＮａＯＨ水溶液を自動的に添加することによって培
養液のｐＨを６.２に維持した。さらに２７０ｇのＬ−
ソルボースを水道水にとかして７６０mlにしたものを無
菌的に調製し、培養液中のＬ−ソルボース濃度が１０〜
３０mg／ml前後になるようにこれを連続的に添加した。
その結果、合計３００ｇのＬ−ソルボースが１８時間で
全て酸化され、２８３.４ｇの２ＫＧＡが培養液中に蓄
積した。Ｌ−ソルボースが完全に消費された時点で醗酵
を止め、直ちに上記の濾過器の運転を開始した。２ＫＧ
Ａを含む濾過液２７００mlは系外に除かれ、醗酵槽内の
菌体部分の液量が３００mlになった時点で運転を終了し
た。予め滅菌されたリサイクル培地Ｄ３０００ml分（液
量１６８０ml）と、別に滅菌されたＬ−ソルボース３０
ｇ（液量８４ml）を上記醗酵槽に入れた。１回目の醗酵
と同じ条件で２回目の醗酵を開始した。１回目と同様に
２７０ｇのＬ−ソルボースを７６０mlの水道水に溶解、
無菌的に調製したものを１回目と同様に添加した。この
ようにして醗酵を１０回まで繰り返した。濾過操作時間
を含む培養終了から次の培養開始までの所要時間はいず
れも１時間以内であった。各醗酵の所要時間と２ＫＧＡ
蓄積量をまとめて〔表８〕に示す。
【００１８】
【表８】 醗酵回数 所要時間（hr） ２ＫＧＡ蓄積量（ｇ） １ １８ ２７４．５ ２ １１．５ ２９０．７ ３ １０．５ ２９８．２ ４ １０．５ ２９１．９ ５ １１ ２９７．６ ６ １２．５ ２８８．９ ７ １４ ２７２．６ ８ １５ ２８６．８ ９ １６ ２８５．０ １０ １６ ２７１．８
【００１９】実施例４ 〔表１〕の斜面培地に２８℃、２日間生育させたバチル
ス・メガテリウム（ＩＦＯ １２１０８）の菌体を１０
mlの滅菌水に懸濁し、その全量を〔表３〕の種培地５０
０mlを含む２ｌ容の坂口フラスコに植菌し、２８℃で２
日間振盪培養して混合菌の種培養液とした。〔表３〕に
示した培地（ｐＨ７.０）３０Ｌを５０Ｌ容醗酵槽に仕
込み１２５℃で２０分間蒸気滅菌した。この醗酵槽にバ
チルス・メガテリウムの種培養液５００mlを移植し、撹
拌２００rpm、通気２４Ｎ−ｌ／min、内圧 １.０kg／c
m2Ｇ、２８℃の条件下で４日間培養した。得られた培養
液を１２０℃，２０分間蒸気滅菌して冷所に保存し、バ
チルス・メガテリウムの滅菌培養物（これをメガブロス
と称することもある）として、培地の一成分として使用
した。〔表２〕の種培養培地５００mlを２ｌ容の坂口フ
ラスコに分注し、１２０℃、２０分間蒸気滅菌した。
〔表１〕に示す斜面培地に２８℃で３日間生育させたシ
ュードグルコノバクター・サッカロケトゲネスＴＨ１４
−８６株の菌体１斜面分を上記坂口フラスコに植菌し、
３０℃で２日間振盪培養した。得られた培養液を、Ｄ−
グルコース２.０％，メガブロス３.０（Ｖ／Ｖ）％，Ｃ
ＳＬ １.０％，酵母エキス ０.５％，ペプトン ０.１
％，硫安 ０.３％，および炭酸カルシウム（白石カルシ
ウム社製）２.０％からなる種培地３０ｌを入れて滅菌
した５０Ｌ容醗酵槽に移植し、３２℃、攪拌１５０rp
m、通気１５Ｎ−ｌ／min、内圧 １.０kg／cm2Ｇの条件
で４８時間培養してＴＨ１４−８６株の第２種培養液を
得た。一方、〔表３〕の種培地５００mlを２ｌ容坂口フ
ラスコに分注し１２０℃、２０分蒸気滅菌した。〔表
１〕の斜面培地で生育させた混合菌バチルス・メガテリ
ウム（ＩＦＯ １２１０８）の菌体をこれに移植した。
これを２８℃で４８時間振盪培養して混合菌の種培養液
を得た。〔表４〕に示した醗酵培地１４０ L分（液量８
０ L）を水にとかして２００ L容醗酵槽に仕込み１２５
℃、２０分蒸気滅菌した後、別に無菌的に調整したＬ−
ソルボース２kg（液量５ L）と上記で得られた酸化菌の
第２種培養液１４ L、混合菌の種培養液５００mLを醗酵
槽に仕込み液量を１００ Lとした。
ス・メガテリウム（ＩＦＯ １２１０８）の菌体を１０
mlの滅菌水に懸濁し、その全量を〔表３〕の種培地５０
０mlを含む２ｌ容の坂口フラスコに植菌し、２８℃で２
日間振盪培養して混合菌の種培養液とした。〔表３〕に
示した培地（ｐＨ７.０）３０Ｌを５０Ｌ容醗酵槽に仕
込み１２５℃で２０分間蒸気滅菌した。この醗酵槽にバ
チルス・メガテリウムの種培養液５００mlを移植し、撹
拌２００rpm、通気２４Ｎ−ｌ／min、内圧 １.０kg／c
m2Ｇ、２８℃の条件下で４日間培養した。得られた培養
液を１２０℃，２０分間蒸気滅菌して冷所に保存し、バ
チルス・メガテリウムの滅菌培養物（これをメガブロス
と称することもある）として、培地の一成分として使用
した。〔表２〕の種培養培地５００mlを２ｌ容の坂口フ
ラスコに分注し、１２０℃、２０分間蒸気滅菌した。
〔表１〕に示す斜面培地に２８℃で３日間生育させたシ
ュードグルコノバクター・サッカロケトゲネスＴＨ１４
−８６株の菌体１斜面分を上記坂口フラスコに植菌し、
３０℃で２日間振盪培養した。得られた培養液を、Ｄ−
グルコース２.０％，メガブロス３.０（Ｖ／Ｖ）％，Ｃ
ＳＬ １.０％，酵母エキス ０.５％，ペプトン ０.１
％，硫安 ０.３％，および炭酸カルシウム（白石カルシ
ウム社製）２.０％からなる種培地３０ｌを入れて滅菌
した５０Ｌ容醗酵槽に移植し、３２℃、攪拌１５０rp
m、通気１５Ｎ−ｌ／min、内圧 １.０kg／cm2Ｇの条件
で４８時間培養してＴＨ１４−８６株の第２種培養液を
得た。一方、〔表３〕の種培地５００mlを２ｌ容坂口フ
ラスコに分注し１２０℃、２０分蒸気滅菌した。〔表
１〕の斜面培地で生育させた混合菌バチルス・メガテリ
ウム（ＩＦＯ １２１０８）の菌体をこれに移植した。
これを２８℃で４８時間振盪培養して混合菌の種培養液
を得た。〔表４〕に示した醗酵培地１４０ L分（液量８
０ L）を水にとかして２００ L容醗酵槽に仕込み１２５
℃、２０分蒸気滅菌した後、別に無菌的に調整したＬ−
ソルボース２kg（液量５ L）と上記で得られた酸化菌の
第２種培養液１４ L、混合菌の種培養液５００mLを醗酵
槽に仕込み液量を１００ Lとした。
【００２０】攪拌１２０rpm，通気７０Ｎ− L／min，内
圧 １.０kg／ｃｍ2Ｇ，３２℃の条件で醗酵を開始し
た。別に無菌的に調製したＬ−ソルボース１２kgを含む
水溶液３０ Lを６時間目から醗酵槽内の培養液中のＬ−
ソルボース濃度が１０から３０mg／mlの範囲になるよう
に連続的に添加した。また、３０％ＮａＯＨ水溶液を添
加して培養液のｐＨを６.２に制御した。醗酵開始後、
１６時間でＬ−ソルボースが完全に消費され１３.０９k
gの２ＫＧＡが蓄積された。醗酵を停止後、醗酵槽に予
め薬剤滅菌して設置しておいた中空糸膜濾過器ＰＭＶ−
３０２（旭化成社製）で培養液を濾過し、菌体部分を１
４ Lまで濃縮した。２ＫＧＡを含む濾過液は系外へ除か
れ、濃縮された菌体は再び醗酵槽へ戻された。別に滅菌
されたリサイクル培地Ａ１４０ L分（液量８０ L）と別
に滅菌調製されたＬ−ソルボース５Lが醗酵槽に仕込ま
れ、１回目の醗酵と同じ条件下で２回目の醗酵が開始さ
れた。１２kgのＬ−ソルボース２ｋｇ（液量５ L）の水
溶液３０ Lが醗酵開始時から連続添加された。このこの
ようにして醗酵が４回繰り返された。それぞれの醗酵所
要時間と蓄積した２ＫＧＡ量を〔表９〕に示した。
圧 １.０kg／ｃｍ2Ｇ，３２℃の条件で醗酵を開始し
た。別に無菌的に調製したＬ−ソルボース１２kgを含む
水溶液３０ Lを６時間目から醗酵槽内の培養液中のＬ−
ソルボース濃度が１０から３０mg／mlの範囲になるよう
に連続的に添加した。また、３０％ＮａＯＨ水溶液を添
加して培養液のｐＨを６.２に制御した。醗酵開始後、
１６時間でＬ−ソルボースが完全に消費され１３.０９k
gの２ＫＧＡが蓄積された。醗酵を停止後、醗酵槽に予
め薬剤滅菌して設置しておいた中空糸膜濾過器ＰＭＶ−
３０２（旭化成社製）で培養液を濾過し、菌体部分を１
４ Lまで濃縮した。２ＫＧＡを含む濾過液は系外へ除か
れ、濃縮された菌体は再び醗酵槽へ戻された。別に滅菌
されたリサイクル培地Ａ１４０ L分（液量８０ L）と別
に滅菌調製されたＬ−ソルボース５Lが醗酵槽に仕込ま
れ、１回目の醗酵と同じ条件下で２回目の醗酵が開始さ
れた。１２kgのＬ−ソルボース２ｋｇ（液量５ L）の水
溶液３０ Lが醗酵開始時から連続添加された。このこの
ようにして醗酵が４回繰り返された。それぞれの醗酵所
要時間と蓄積した２ＫＧＡ量を〔表９〕に示した。
【表９】 醗酵回数 時間（hr） ２ＫＧＡ（kg） １回目 １６ １３．０ ２回目 １２ １３．８ ３回目 １０ １３．７ ４回目 １１ １４．０
【００２１】実施例５ 実施例４のリサイクル培地をＣ培地にし、濾過器をセラ
ミック膜モノリス型（日本碍子社製）に替えて同様に醗
酵を行った。各醗酵の所要時間２ＫＧＡ蓄積量を〔表１
０〕に示す。
ミック膜モノリス型（日本碍子社製）に替えて同様に醗
酵を行った。各醗酵の所要時間２ＫＧＡ蓄積量を〔表１
０〕に示す。
【表１０】 醗酵回数 時間（hr） ２ＫＧＡ（kg） １回目 １６ １２．７ ２回目 １１ １３．７ ３回目 １２ １４．１ ４回目 １３ １４．０ 実施例６ 実施例４のリサイクル培地をＤにし、濾過器を連続遠心
機ＢＴＰＸ２０５（アルファラバル社製）に替えて醗酵
を行った。醗酵所要時間と蓄積した２ＫＧＡ量を〔表１
１〕に示した。
機ＢＴＰＸ２０５（アルファラバル社製）に替えて醗酵
を行った。醗酵所要時間と蓄積した２ＫＧＡ量を〔表１
１〕に示した。
【表１１】 醗酵回数 時間（hr） ２ＫＧＡ（kg） １回目 １６ １３．１ ２回目 １１ １４．４ ３回目 １０ １４．０ ４回目 １２ １４．３
【００２２】実施例７ 実施例１の第１回目の培養液の２５％、５０％、７５
％、１００％の液量を遠心分離しリサイクル培養に用い
た。リサイクル培地はＤ培地を用いた。その他は実施例
１と同様に行った。醗酵を４回目まで繰り返し、醗酵終
了時間の結果を〔表１２〕に示した。
％、１００％の液量を遠心分離しリサイクル培養に用い
た。リサイクル培地はＤ培地を用いた。その他は実施例
１と同様に行った。醗酵を４回目まで繰り返し、醗酵終
了時間の結果を〔表１２〕に示した。
【表１２】 終了時間（hr） 醗酵回数 ２５％ ５０％ ７５％ １００％ １回目 ２８ ２８ ２８ ２８ ２回目 ２２ １６ １２ １３ ３回目 ２２ １６ １２ １２ ４回目 ２３ １８ １３ １２
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01 1:11）
Claims (8)
- 【請求項１】（１）Ｌ−ソルボースから２−ケト−Ｌ−
グロン酸（以後、２ＫＧＡと称す）を生産する能力を有
する微生物を２ＫＧＡを生産するための基質を含む液体
培地中で培養し、（２）培養液中の生産された２ＫＧＡ
を回収する一方、微生物も回収し、（３）回収した微生
物を次の培養のための新しい液体培地に接種し、（４）
この培養と回収を少なくとも１回くりかえすことを特徴
とする２ＫＧＡの製造法。 - 【請求項２】Ｌ−ソルボースから２ＫＧＡを生産する能
力を有する微生物がシュードグルコノバクター属、グル
コノバクター属、シュードモナス属、コリネバクテリウ
ム属、アセトバクター属、またはエルビニア属の微生物
である請求項１記載の製造法。 - 【請求項３】Ｌ−ソルボースから２ＫＧＡを生産する能
力を有する微生物がシュードグルコノバクター属、また
はグルコノバクター属の微生物である請求項１記載の製
造法。 - 【請求項４】Ｌ−ソルボースから２ＫＧＡを生産する能
力を有する微生物がシュードグルコノバクター属の微生
物である請求項１記載の製造法。 - 【請求項５】Ｌ−ソルボースから２ＫＧＡを生産する能
力を有する微生物がシュードグルコノバクター サッカ
ロケトゲネス Ｋ５９１ｓ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３
０），シュードグルコノバクター サッカロケトゲネス
ＴＨ１４ー８６（ＦＥＲＭ ＢＰー１１２８），シュ
ードグルコノバクター サッカロケトゲネス１２−５
（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２９），シュードグルコノバク
ター サッカロケトゲネス １２−１５（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−１１３２），シュードグルコノバクター サッカロ
ケトゲネス １２−４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３1 ），
及びシュードグルコノバクター サッカロケトゲネス
２２−３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３３）から選ばれる請
求項４記載の製造法。 - 【請求項６】Ｌ−ソルボースから２ＫＧＡを生産する能
力を有する微生物に、その生育促進物質を供給する能力
を持つ別種の微生物の共存下で培養する請求項３記載の
製造法。 - 【請求項７】Ｌ−ソルボースから２ＫＧＡを生産する能
力を有する微生物に、その生育促進物質を供給する能力
を持つ共存別種微生物がバチラス属、シュドモナス属、
プロテウス属、シトロバクター属、エンテロバクター
属、エルウィニア属、キサントモナス属、又はフラボバ
クテリウム属の微生物である請求項３記載の製造法。 - 【請求項８】Ｌ−ソルボースから２ＫＧＡを生産する能
力を有する微生物に、その生育促進物質を供給する能力
を持つ共存別種微生物がバチラス セレウス ＩＦＯ
３１３１，バチラス リケニフォルミス ＩＦＯ １２
２０１，バチラスメガテリウム ＩＦＯ １２１０８，
バチラス プミルス ＩＦＯ １２０９０，バチラス
アミロリケファシエンス ＩＦＯ ３０２２，バチラス
サブチラス ＩＦＯ １３７１９，バチラス サーキ
ュランス ＩＦＯ ３９６７，シュードモナス トリホ
リ ＩＦＯ １２０５６，シュードモナス マルトフィ
リア ＩＦＯ １２６９２，プロテウス インコスタン
ス ＩＦＯ １２９３０，シトロバクター フレンディ
ＩＦＯ １３５４４，エンテロバクター クロアカエ
ＩＦＯ ３３２０，エルウィニア ハービコーラ Ｉ
ＦＯ １２６８６，キサントモナス ピシ ＩＦＯ １
３５５６，キサントモナス シトリ ＩＦＯ ３８３５
又はフラボバクテリウム メニゴセプチィカム ＩＦＯ
１２５３５である請求項３記載の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31438394A JPH07227292A (ja) | 1993-12-24 | 1994-12-19 | ２−ケト−ｌ−グロン酸の改良製造法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32839293 | 1993-12-24 | ||
| JP5-328392 | 1993-12-24 | ||
| JP31438394A JPH07227292A (ja) | 1993-12-24 | 1994-12-19 | ２−ケト−ｌ−グロン酸の改良製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07227292A true JPH07227292A (ja) | 1995-08-29 |
Family
ID=26567922
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31438394A Pending JPH07227292A (ja) | 1993-12-24 | 1994-12-19 | ２−ケト−ｌ−グロン酸の改良製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07227292A (ja) |
-
1994
- 1994-12-19 JP JP31438394A patent/JPH07227292A/ja active Pending
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Effective date: 20040511 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Effective date: 20041019 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 |