JPH07213288A - ヒト型結核菌検出用オリゴヌクレオチドおよびその用途 - Google Patents
ヒト型結核菌検出用オリゴヌクレオチドおよびその用途Info
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- JPH07213288A JPH07213288A JP6012724A JP1272494A JPH07213288A JP H07213288 A JPH07213288 A JP H07213288A JP 6012724 A JP6012724 A JP 6012724A JP 1272494 A JP1272494 A JP 1272494A JP H07213288 A JPH07213288 A JP H07213288A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】直接的で簡便、迅速かつ確実な結核菌の検出方
法と、それに用いる新規なオリゴヌクレオチドを提供す
る。 【構成】配列表・配列番号１、配列番号２、配列番号３
及び配列番号４に記載の核酸配列の一部または全部、ま
たは、その相補配列の一部または全部を含有することを
特徴とするヒト型結核菌検出用オリゴヌクレオチドおよ
び該オリゴヌクレオチドを標識化した標識オリゴヌクレ
オチド、および該オリゴヌクレオチドまたは該標識オリ
ゴヌクレオチドを使用するヒト型結核菌検出の方法およ
びその検出試薬キット。
法と、それに用いる新規なオリゴヌクレオチドを提供す
る。 【構成】配列表・配列番号１、配列番号２、配列番号３
及び配列番号４に記載の核酸配列の一部または全部、ま
たは、その相補配列の一部または全部を含有することを
特徴とするヒト型結核菌検出用オリゴヌクレオチドおよ
び該オリゴヌクレオチドを標識化した標識オリゴヌクレ
オチド、および該オリゴヌクレオチドまたは該標識オリ
ゴヌクレオチドを使用するヒト型結核菌検出の方法およ
びその検出試薬キット。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は臨床診断上、ヒト型結核
菌（Mycobacterium tuberculosis）を迅速、確実かつ簡
便に検出するオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチ
ドを使用する検出法およびその検出用試薬キットに関す
る。
菌（Mycobacterium tuberculosis）を迅速、確実かつ簡
便に検出するオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチ
ドを使用する検出法およびその検出用試薬キットに関す
る。
【０００２】
【従来の技術】抗酸菌属（Mycobacterium 属）は抗酸性
の性質を持つグラム陽性桿菌であり、結核菌やらい菌な
ど、重篤な病変を引き起こす病原菌が多い。一般に抗酸
菌は発育が遅く、培養にはかなりの時間を要する。この
中でもヒト型結核菌はヒトに結核を起こす病原体であ
り、その検査は臨床上極めて重要である。肺結核が圧倒
的に多いが、ほとんど全ての臓器に結核性病変を起こ
し、結核性胸膜炎、結核性髄膜炎、カリエス、腸結核、
腎結核、関節結核などを起こす。感染源は患者であり、
飛沫感染などによって経気道的に感染する。従来、結核
菌の検査は培養法によっていた。一般的には小川培地上
で分離培養し、培地上の性状（増殖速度・温度、コロニ
ーの形状や色素産生など）、ナイアシンテスト、硝酸還
元試験、耐熱カタラーゼ試験、ツイーン８０水解試験な
どの結果から菌種を同定する。しかしヒト型結核菌は増
殖が遅く、分離培養だけで３〜４週間を要し、その後の
各種試験でさらに２〜３週間を要する。そのため、ヒト
型結核菌の検出・同定検査はその臨床上の重要性・緊急
性にもかかわらず１カ月以上を要し、機動的な診断や投
薬に大きな制約となっていた。最近、ヒト型結核菌が産
生するタンパク質を抗原抗体反応で検出する方法などが
開発されているが、未だ十分な菌種同定を行うまでに至
っておらず、しかも感度的に問題があるため分離培養が
必要なことは変わりない。
の性質を持つグラム陽性桿菌であり、結核菌やらい菌な
ど、重篤な病変を引き起こす病原菌が多い。一般に抗酸
菌は発育が遅く、培養にはかなりの時間を要する。この
中でもヒト型結核菌はヒトに結核を起こす病原体であ
り、その検査は臨床上極めて重要である。肺結核が圧倒
的に多いが、ほとんど全ての臓器に結核性病変を起こ
し、結核性胸膜炎、結核性髄膜炎、カリエス、腸結核、
腎結核、関節結核などを起こす。感染源は患者であり、
飛沫感染などによって経気道的に感染する。従来、結核
菌の検査は培養法によっていた。一般的には小川培地上
で分離培養し、培地上の性状（増殖速度・温度、コロニ
ーの形状や色素産生など）、ナイアシンテスト、硝酸還
元試験、耐熱カタラーゼ試験、ツイーン８０水解試験な
どの結果から菌種を同定する。しかしヒト型結核菌は増
殖が遅く、分離培養だけで３〜４週間を要し、その後の
各種試験でさらに２〜３週間を要する。そのため、ヒト
型結核菌の検出・同定検査はその臨床上の重要性・緊急
性にもかかわらず１カ月以上を要し、機動的な診断や投
薬に大きな制約となっていた。最近、ヒト型結核菌が産
生するタンパク質を抗原抗体反応で検出する方法などが
開発されているが、未だ十分な菌種同定を行うまでに至
っておらず、しかも感度的に問題があるため分離培養が
必要なことは変わりない。
【０００３】ヒト型結核菌の他にも、トリ型結核菌（My
cobacterium avium)、マイコバクテリウム・イントラセ
ルラーレ（Mycobacterium intracellulare）、マイコバ
クテリウム・カンサシイ（Mycobacterium kansasii）、
マイコバクテリウム・スクロフラセウム（Mycobacteriu
m scrofulaceum）、マイコバクテリウム・フォーチュイ
タム（Mycobacterium fortuitum)などの非定型抗酸菌が
ヒトに病原性を示すことが知られている。症状は結核に
比べて軽く、感染力も弱いが、抗結核剤に耐性であり有
効な薬剤はない。これらは結核菌と同様にヒトの肺、リ
ンパ節、皮膚などを冒し、特に肺感染症が多い。肺結核
との鑑別は臨床症状、病理組織学的所見からは極めて困
難であるため、菌の同定によってなされなければならな
い。ヒト結核菌と同様、小川培地上で分離培養し、培地
上の性状（増殖速度・温度、コロニーの形状や色素産生
など）、ナイアシンテスト、硝酸還元試験、耐熱カタラ
ーゼ試験、ツイーン８０水解試験、光発光テストなどの
結果から菌種を同定する。これらも一般的に増殖が遅
く、菌種の同定までに１カ月以上要することが多い。
cobacterium avium)、マイコバクテリウム・イントラセ
ルラーレ（Mycobacterium intracellulare）、マイコバ
クテリウム・カンサシイ（Mycobacterium kansasii）、
マイコバクテリウム・スクロフラセウム（Mycobacteriu
m scrofulaceum）、マイコバクテリウム・フォーチュイ
タム（Mycobacterium fortuitum)などの非定型抗酸菌が
ヒトに病原性を示すことが知られている。症状は結核に
比べて軽く、感染力も弱いが、抗結核剤に耐性であり有
効な薬剤はない。これらは結核菌と同様にヒトの肺、リ
ンパ節、皮膚などを冒し、特に肺感染症が多い。肺結核
との鑑別は臨床症状、病理組織学的所見からは極めて困
難であるため、菌の同定によってなされなければならな
い。ヒト結核菌と同様、小川培地上で分離培養し、培地
上の性状（増殖速度・温度、コロニーの形状や色素産生
など）、ナイアシンテスト、硝酸還元試験、耐熱カタラ
ーゼ試験、ツイーン８０水解試験、光発光テストなどの
結果から菌種を同定する。これらも一般的に増殖が遅
く、菌種の同定までに１カ月以上要することが多い。
【０００４】ヒト型結核菌と非定型抗酸菌の同定は、臨
床上極めて重要である。ヒト型結核菌は病状が重篤であ
るが、ストレプトマイシン、リファンピシン、エタンブ
トール、イソニコチン酸ヒドラジドなどの抗結核剤投与
が有効なため、早期に治療を開始する必要がある。一
方、非定型抗酸菌は一般にこれらの薬剤に対して耐性で
ある。菌種の同定はその後の治療方針を大きく左右する
のである。しかしながら前述したように、これらの菌は
増殖が遅く、菌種同定には数週間を要する。ヒト型結核
菌について迅速で確実な検出方法が望まれるのはこのた
めである。
床上極めて重要である。ヒト型結核菌は病状が重篤であ
るが、ストレプトマイシン、リファンピシン、エタンブ
トール、イソニコチン酸ヒドラジドなどの抗結核剤投与
が有効なため、早期に治療を開始する必要がある。一
方、非定型抗酸菌は一般にこれらの薬剤に対して耐性で
ある。菌種の同定はその後の治療方針を大きく左右する
のである。しかしながら前述したように、これらの菌は
増殖が遅く、菌種同定には数週間を要する。ヒト型結核
菌について迅速で確実な検出方法が望まれるのはこのた
めである。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、直接
的で簡便、迅速かつ確実なヒト型結核菌の検出方法と、
それに用いる新規なオリゴヌクレオチドならびにその検
出用試薬を提供することである。
的で簡便、迅速かつ確実なヒト型結核菌の検出方法と、
それに用いる新規なオリゴヌクレオチドならびにその検
出用試薬を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ヒト型結
核菌（Mycobacterium tuberculosis）の様々な遺伝子配
列に関して種々の検討を重ねた結果、ヒト型結核菌の検
出に適当な核酸配列を得、それを用いた検出方法を確立
し、本発明を完成させるに至った。
核菌（Mycobacterium tuberculosis）の様々な遺伝子配
列に関して種々の検討を重ねた結果、ヒト型結核菌の検
出に適当な核酸配列を得、それを用いた検出方法を確立
し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】すなわち本発明は、ヒト型結核菌（Mycoba
cterium tuberculosis）の３５ｋＤａタンパク質遺伝子
の核酸配列とハイブリダイズすることを特徴とするオリ
ゴヌクレオチドである。ヒト型結核菌の３５ｋＤａタン
パク質遺伝子は、Res.Microbiol.;141巻407 頁 1991
年）に記載される。
cterium tuberculosis）の３５ｋＤａタンパク質遺伝子
の核酸配列とハイブリダイズすることを特徴とするオリ
ゴヌクレオチドである。ヒト型結核菌の３５ｋＤａタン
パク質遺伝子は、Res.Microbiol.;141巻407 頁 1991
年）に記載される。
【０００８】本発明のオリゴヌクレオチドは、望ましく
は、配列表・配列番号１、配列番号２、配列番号３また
は配列番号４に記載の核酸配列（但し、Ａはアデニン、
Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表す。ま
た、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換されていて
もよい。）の一部または全部、またはその相補配列の一
部または全部を含有する、ヒト型結核菌の３５ｋＤａタ
ンパク質遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴ
ヌクレオチドである。
は、配列表・配列番号１、配列番号２、配列番号３また
は配列番号４に記載の核酸配列（但し、Ａはアデニン、
Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表す。ま
た、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換されていて
もよい。）の一部または全部、またはその相補配列の一
部または全部を含有する、ヒト型結核菌の３５ｋＤａタ
ンパク質遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴ
ヌクレオチドである。
【０００９】また本発明は上記オリゴヌクレオチドをプ
ローブまたはプライマーとして使用することを特徴とす
るヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）の検出
方法である。具体的には上記オリゴヌクレオチドを標識
化した標識核酸プローブを試料中のＤＮＡまたはＲＮＡ
と交雑させ、交雑した結合体の標識を測定する方法や上
記オリゴヌレオチドである核酸プライマー、または該オ
リゴヌクレオチドを標識化した標識核酸プライマーを試
料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、プライマー伸長
させ、得られたプライマー伸長物を測定する方法などが
ある。
ローブまたはプライマーとして使用することを特徴とす
るヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）の検出
方法である。具体的には上記オリゴヌクレオチドを標識
化した標識核酸プローブを試料中のＤＮＡまたはＲＮＡ
と交雑させ、交雑した結合体の標識を測定する方法や上
記オリゴヌレオチドである核酸プライマー、または該オ
リゴヌクレオチドを標識化した標識核酸プライマーを試
料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、プライマー伸長
させ、得られたプライマー伸長物を測定する方法などが
ある。
【００１０】さらに本発明は上記オリゴヌクレオチドを
標識化した標識核酸プローブを含有することを特徴とす
るヒト型結核菌検出用標識核酸プローブである。
標識化した標識核酸プローブを含有することを特徴とす
るヒト型結核菌検出用標識核酸プローブである。
【００１１】また本発明は上記オリゴヌクレオチドを含
有することを特徴とするヒト型結核菌検出用核酸核酸プ
ライマーである。
有することを特徴とするヒト型結核菌検出用核酸核酸プ
ライマーである。
【００１２】本発明は上記ヒト型結核菌検出用標識プロ
ーブを含むことを特徴とするヒト型結核菌（Mycobacter
ium tuberculosis）の検出用試薬キットである。
ーブを含むことを特徴とするヒト型結核菌（Mycobacter
ium tuberculosis）の検出用試薬キットである。
【００１３】また本発明は上記ヒト型結核菌検出用核酸
プライマーを含むことを特徴とするヒト型結核菌（Myco
bacterium tuberculosis）の検出用試薬キットである。
プライマーを含むことを特徴とするヒト型結核菌（Myco
bacterium tuberculosis）の検出用試薬キットである。
【００１４】本発明者らは、現在までに決定されたヒト
型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）とその他の生
物の各種遺伝子について、各種間の各遺伝子配列の相同
性の理論的検証と実験的検証を重ねた結果、ヒト型結核
菌の３５ｋＤａタンパク質遺伝子の特定領域が結核菌群
（ヒト型結核菌と、ヒト型結核菌と遺伝学的に極めて近
縁であるウシ型結核菌）に特異的であり、ヒト型結核菌
の検出に有用であることを見いだした。これらの知見を
もとにヒト型結核菌の検出に使用可能なオリゴヌクレオ
チド（配列表・配列番号１、配列番号２、配列番号３ま
たは配列番号４に記載の核酸配列）と、それらを利用し
たヒト型結核菌検出用核酸プライマー・標識プローブを
開発した。
型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）とその他の生
物の各種遺伝子について、各種間の各遺伝子配列の相同
性の理論的検証と実験的検証を重ねた結果、ヒト型結核
菌の３５ｋＤａタンパク質遺伝子の特定領域が結核菌群
（ヒト型結核菌と、ヒト型結核菌と遺伝学的に極めて近
縁であるウシ型結核菌）に特異的であり、ヒト型結核菌
の検出に有用であることを見いだした。これらの知見を
もとにヒト型結核菌の検出に使用可能なオリゴヌクレオ
チド（配列表・配列番号１、配列番号２、配列番号３ま
たは配列番号４に記載の核酸配列）と、それらを利用し
たヒト型結核菌検出用核酸プライマー・標識プローブを
開発した。
【００１５】本発明における検出とは、この３５ｋＤａ
タンパク質遺伝子の配列を検出することにより、喀痰、
血液などの各種臨床材料中のヒト型結核菌を検出するこ
とであるが、単離、培養された菌体の菌種を判定するこ
となども含まれることはいうまでもない。また、本発明
における試料には、上記の各種臨床材料や培養菌体の
他、これらより単離、精製された核酸なども含まれる。
また、増幅された核酸でもよい。
タンパク質遺伝子の配列を検出することにより、喀痰、
血液などの各種臨床材料中のヒト型結核菌を検出するこ
とであるが、単離、培養された菌体の菌種を判定するこ
となども含まれることはいうまでもない。また、本発明
における試料には、上記の各種臨床材料や培養菌体の
他、これらより単離、精製された核酸なども含まれる。
また、増幅された核酸でもよい。
【００１６】本発明における核酸プローブに使用するオ
リゴヌクレオチドは、配列表に記載の配列またはその相
補配列の全域を使用する必要はなく、使用する核酸ハイ
ブリダイゼーション条件に合わせて解離温度（Ｔｍ値）
などを計算し、適当な領域を適当な長さで使用すればよ
い。しかし、プローブに十分な特異性を持たせたいのな
らば、望ましくは１０塩基以上、さらに望ましくは２０
塩基以上の長さが必要となる。本発明における核酸プラ
イマーに使用するオリゴヌクレオチドも配列表の配列と
その相補配列から、適当な長さの配列を使用して作製す
ればよい。また使用する条件、目的などに応じて、オリ
ゴヌクレオチド中にある程度の置換を行ってもよい場合
があることは容易に予想できる。
リゴヌクレオチドは、配列表に記載の配列またはその相
補配列の全域を使用する必要はなく、使用する核酸ハイ
ブリダイゼーション条件に合わせて解離温度（Ｔｍ値）
などを計算し、適当な領域を適当な長さで使用すればよ
い。しかし、プローブに十分な特異性を持たせたいのな
らば、望ましくは１０塩基以上、さらに望ましくは２０
塩基以上の長さが必要となる。本発明における核酸プラ
イマーに使用するオリゴヌクレオチドも配列表の配列と
その相補配列から、適当な長さの配列を使用して作製す
ればよい。また使用する条件、目的などに応じて、オリ
ゴヌクレオチド中にある程度の置換を行ってもよい場合
があることは容易に予想できる。
【００１７】本発明のオリゴヌクレオチドは化学合成に
より調製できるので、クローン化したオリゴヌクレオチ
ドまたはポリヌクレオチドに比べ、容易、大量且つ安価
に一定品質のオリゴヌクレオチドを得ることが可能であ
る。本発明のオリゴヌクレオチドはデオキシリボ核酸
（ＤＮＡ）でもリボ核酸（ＲＮＡ）でもよい。リボ核酸
の場合はチミジン残基（Ｔ）をウリジン残基（Ｕ）と読
み替えることは言うまでもない。また合成に際して任意
の位置のＴをＵに変えて合成を行ない、ウリジン残基を
含むＤＮＡであってもよい。同様に任意の位置のＵをＴ
に変えたチミジン残基を含むＲＮＡであってもよい。ま
たオリゴヌクレオチド中に欠失、挿入あるいは置換とい
った点突然変異や、修飾ヌクレオチドがあってもよい。
より調製できるので、クローン化したオリゴヌクレオチ
ドまたはポリヌクレオチドに比べ、容易、大量且つ安価
に一定品質のオリゴヌクレオチドを得ることが可能であ
る。本発明のオリゴヌクレオチドはデオキシリボ核酸
（ＤＮＡ）でもリボ核酸（ＲＮＡ）でもよい。リボ核酸
の場合はチミジン残基（Ｔ）をウリジン残基（Ｕ）と読
み替えることは言うまでもない。また合成に際して任意
の位置のＴをＵに変えて合成を行ない、ウリジン残基を
含むＤＮＡであってもよい。同様に任意の位置のＵをＴ
に変えたチミジン残基を含むＲＮＡであってもよい。ま
たオリゴヌクレオチド中に欠失、挿入あるいは置換とい
った点突然変異や、修飾ヌクレオチドがあってもよい。
【００１８】標識物として放射性物質や酵素、蛍光物
質、発光物質など公知の標識をもちいることができる。
標識の仕方は末端標識でも、配列の途中に標識してもよ
い。また糖、リン酸基、塩基部分への標識であってもよ
い。例えば、リンカーアームを有するヌクレオチドを配
列のオリゴヌクレオチドの一員として置換することによ
り酵素標識化することができる（Nucleic Acids Res.;1
4 巻6115頁1986年）。その一例として５位にリンカーア
ームを有するウリジンを特開昭60-500717 号公報に開示
された合成法によりデオキシウリジンから化学合成し、
上記オリゴヌクレオチドに導入することもできる。
質、発光物質など公知の標識をもちいることができる。
標識の仕方は末端標識でも、配列の途中に標識してもよ
い。また糖、リン酸基、塩基部分への標識であってもよ
い。例えば、リンカーアームを有するヌクレオチドを配
列のオリゴヌクレオチドの一員として置換することによ
り酵素標識化することができる（Nucleic Acids Res.;1
4 巻6115頁1986年）。その一例として５位にリンカーア
ームを有するウリジンを特開昭60-500717 号公報に開示
された合成法によりデオキシウリジンから化学合成し、
上記オリゴヌクレオチドに導入することもできる。
【００１９】本発明のオリゴヌクレオチドを固相担体に
結合して、捕捉プローブとして用いることもできる。こ
の場合、捕捉プローブと標識プローブの組合せでサンド
イッチアッセイ（特開昭58-40099号公報参照）を行って
もよいし、標的核酸を標識して捕捉する方法（特開昭62
-265999 号公報参照）もある。またオリゴヌクレオチド
をビオチンで標識し、交雑後アビジン結合担体で捕捉す
る方法もある。
結合して、捕捉プローブとして用いることもできる。こ
の場合、捕捉プローブと標識プローブの組合せでサンド
イッチアッセイ（特開昭58-40099号公報参照）を行って
もよいし、標的核酸を標識して捕捉する方法（特開昭62
-265999 号公報参照）もある。またオリゴヌクレオチド
をビオチンで標識し、交雑後アビジン結合担体で捕捉す
る方法もある。
【００２０】オリゴヌクレオチドをプライマーとして使
用する場合、ＤＮＡポリメラーゼ等による核酸増幅（例
えばＰＣＲ；特開昭60-281号公報参照）を行うことによ
り、ヒト型結核菌について３５ｋＤａタンパク質遺伝子
の特定の領域の配列を増幅することができる。ＰＣＲに
際しては、反応時に放射性標識ヌクレオチドを取り込ま
せる方法や、増幅産物を電気泳動により分画して特異な
バンドを検出することで容易に３５ｋＤａタンパク質遺
伝子の配列を検出することができる。また前述の標識オ
リゴヌクレオチドをプライマーとして用いれば増幅産物
を直接検出することも可能である。
用する場合、ＤＮＡポリメラーゼ等による核酸増幅（例
えばＰＣＲ；特開昭60-281号公報参照）を行うことによ
り、ヒト型結核菌について３５ｋＤａタンパク質遺伝子
の特定の領域の配列を増幅することができる。ＰＣＲに
際しては、反応時に放射性標識ヌクレオチドを取り込ま
せる方法や、増幅産物を電気泳動により分画して特異な
バンドを検出することで容易に３５ｋＤａタンパク質遺
伝子の配列を検出することができる。また前述の標識オ
リゴヌクレオチドをプライマーとして用いれば増幅産物
を直接検出することも可能である。
【００２１】本発明のヒト型結核菌（Mycobacterium tu
berculosis）の検出用試薬キットは本発明の標識核酸プ
ローブおよび／またはプライマーを含む。さらに他の成
分として核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポ
リメラーゼ、逆転写酵素など）、酵素に応じた基質（ｄ
ＮＴＰ、ｒＮＴＰなど）を含む。また標識検出物質や緩
衝液なども含んでもよい。
berculosis）の検出用試薬キットは本発明の標識核酸プ
ローブおよび／またはプライマーを含む。さらに他の成
分として核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポ
リメラーゼ、逆転写酵素など）、酵素に応じた基質（ｄ
ＮＴＰ、ｒＮＴＰなど）を含む。また標識検出物質や緩
衝液なども含んでもよい。
【００２２】
【実施例】以下に、本発明の実施例を例示することによ
って、本発明の効果をより一層明確なものとする。 実施例１ （１）ヒト型結核菌検出用ＰＣＲプライマーの合成 ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホス
ホアミダイト法にて、配列表・配列番号１に示される配
列を有するオリゴヌクレオチド（以下、プライマーＦと
呼ぶ）及び配列表・配列番号２に示される配列を有する
オリゴヌクレオチド（以下、プライマーＲと呼ぶ）を合
成した。手法はＡＢＩ社マニュアルに従い、各種オリゴ
ヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃一夜実施
した。精製はファルマシア社製ＦＰＬＣで陰イオン交換
カラムにて実施した。
って、本発明の効果をより一層明確なものとする。 実施例１ （１）ヒト型結核菌検出用ＰＣＲプライマーの合成 ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホス
ホアミダイト法にて、配列表・配列番号１に示される配
列を有するオリゴヌクレオチド（以下、プライマーＦと
呼ぶ）及び配列表・配列番号２に示される配列を有する
オリゴヌクレオチド（以下、プライマーＲと呼ぶ）を合
成した。手法はＡＢＩ社マニュアルに従い、各種オリゴ
ヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃一夜実施
した。精製はファルマシア社製ＦＰＬＣで陰イオン交換
カラムにて実施した。
【００２３】（２）試料の調製 以下に示すＤＮＡをＰＣＲの試料として使用した。細菌
はいずれも臨床分離株であり、培養後、コロニーの形状
や従来の各種生化学的試験などによって菌種がすでに鑑
別されているものである。抗酸菌属細菌は、小川培地上
のコロニーを水に懸濁し、オートクレーブ処理（１２０
℃・２気圧、２０分）した後、遠心分離した上清を適量
使用した。その他の細菌、生物試料についてはそれぞれ
のＤＮＡ抽出・精製の常法に従い調製したものを、ＰＣ
Ｒ反応液中、最終１ng／μl になるように使用した。 1．ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis） 2．ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis） 3．ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis） 4．ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis） 5．ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis） 6．ウシ型結核菌（Mycobacterium bovis) 7．トリ型結核菌（Mycobacterium avium) 8．マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobact
erium intracellulare) 9．マイコバクテリウム・カンサシイ（Mycobacterium k
ansasii） 10．マイコバクテリウム・セロネイ（Mycobacterium ch
elonei） 11．マイコバクテリウム・マリナム（Mycobacterium ma
rinum) 12．マイコバクテリウム・フォーチュイタム（Mycobact
erium fortuitum) 13．マイコバクテリウム・スクロフラセウム（Mycobact
erium scrofulaceum） 14．スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis) 15．枯草菌（Bacillus subtilis) 16．クロストリジウム・スティックランディ（Clostrid
ium sticklandii) 17．エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter a
erogenes） 18．エンテロコッカス・フェーカリス（Enterococcus f
aecalis) 19．大腸菌（Escherichia coli） 20．肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae) 21．緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa） 22．黄色ブドウ球菌（Staphyrococcus aureus) 23．ストレプトコッカス・フェシウム（Streptococcus
faecium) 24．腸炎ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus) 25．ヒト胎盤ＤＮＡ 26．ウシ胸腺ＤＮＡ 27．サケ精子ＤＮＡ 28．ニシン精子ＤＮＡ
はいずれも臨床分離株であり、培養後、コロニーの形状
や従来の各種生化学的試験などによって菌種がすでに鑑
別されているものである。抗酸菌属細菌は、小川培地上
のコロニーを水に懸濁し、オートクレーブ処理（１２０
℃・２気圧、２０分）した後、遠心分離した上清を適量
使用した。その他の細菌、生物試料についてはそれぞれ
のＤＮＡ抽出・精製の常法に従い調製したものを、ＰＣ
Ｒ反応液中、最終１ng／μl になるように使用した。 1．ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis） 2．ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis） 3．ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis） 4．ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis） 5．ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis） 6．ウシ型結核菌（Mycobacterium bovis) 7．トリ型結核菌（Mycobacterium avium) 8．マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobact
erium intracellulare) 9．マイコバクテリウム・カンサシイ（Mycobacterium k
ansasii） 10．マイコバクテリウム・セロネイ（Mycobacterium ch
elonei） 11．マイコバクテリウム・マリナム（Mycobacterium ma
rinum) 12．マイコバクテリウム・フォーチュイタム（Mycobact
erium fortuitum) 13．マイコバクテリウム・スクロフラセウム（Mycobact
erium scrofulaceum） 14．スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis) 15．枯草菌（Bacillus subtilis) 16．クロストリジウム・スティックランディ（Clostrid
ium sticklandii) 17．エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter a
erogenes） 18．エンテロコッカス・フェーカリス（Enterococcus f
aecalis) 19．大腸菌（Escherichia coli） 20．肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae) 21．緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa） 22．黄色ブドウ球菌（Staphyrococcus aureus) 23．ストレプトコッカス・フェシウム（Streptococcus
faecium) 24．腸炎ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus) 25．ヒト胎盤ＤＮＡ 26．ウシ胸腺ＤＮＡ 27．サケ精子ＤＮＡ 28．ニシン精子ＤＮＡ
【００２４】（３）ＰＣＲ 反応液組成はプライマーＦ・プライマーＲを各１μM 、
10mM Tris-HCl(pH8.9)、1.5mM MgCl2 、80mM KCl、500
μg/ml BSA、 0.1% コール酸ナトリウム、0.1%TritonX-
100、それぞれ0.2mM のdATP、dCTP、dGTP、dTTPおよびT
th DNA ポリメラーゼ（東洋紡製）40単位/ml である。
反応条件は次の通りである。 熱変性： ９４℃、０．５分 アニーリング：５５℃、１分 重合反応： ７５℃、０．５分 を３０回行った。これらの操作はパーキン・エルマー／
シータス（Perkin-Elmer/Cetus）社のＤＮＡサーマルサ
イクラーを用いて行った。
10mM Tris-HCl(pH8.9)、1.5mM MgCl2 、80mM KCl、500
μg/ml BSA、 0.1% コール酸ナトリウム、0.1%TritonX-
100、それぞれ0.2mM のdATP、dCTP、dGTP、dTTPおよびT
th DNA ポリメラーゼ（東洋紡製）40単位/ml である。
反応条件は次の通りである。 熱変性： ９４℃、０．５分 アニーリング：５５℃、１分 重合反応： ７５℃、０．５分 を３０回行った。これらの操作はパーキン・エルマー／
シータス（Perkin-Elmer/Cetus）社のＤＮＡサーマルサ
イクラーを用いて行った。
【００２５】（４）検出 ５μｌの反応液を１．５％アガロースゲル電気泳動し、
エチジウムブロマイド染色した後、紫外線での蛍光を検
出した。泳動の電気的条件は、定電圧１００Ｖ、時間は
３０分行った。操作方法並びに他の条件はManiatisらの
Molecular Cloning （1982年）に記載の方法に従った。
反応液の他に分子量マーカーも同時に泳動し、相対泳動
度の比較により、検出されたＤＮＡ断片の長さを算出し
た。
エチジウムブロマイド染色した後、紫外線での蛍光を検
出した。泳動の電気的条件は、定電圧１００Ｖ、時間は
３０分行った。操作方法並びに他の条件はManiatisらの
Molecular Cloning （1982年）に記載の方法に従った。
反応液の他に分子量マーカーも同時に泳動し、相対泳動
度の比較により、検出されたＤＮＡ断片の長さを算出し
た。
【００２６】（５）結果 アガロースゲル電気泳動し、エチジウムブロマイド染色
した後、紫外線で２０４塩基対の蛍光バンドが確認され
たものを陽性とする。この結果、ヒト型結核菌（Mycoba
cterium tuberculosis）の試料（１〜５）と分類学的に
ヒト型結核菌に極めて近縁であるウシ型結核菌（Mycoba
cterium bovis)の試料（６）で２０４塩基対の蛍光バン
ドが確認でき、陽性と判定できたのに対して、その他の
抗酸菌属細菌や他の属の細菌、生物の試料（７〜２８）
はいずれにも該当する蛍光バンドがみられず、陰性と判
断できた。
した後、紫外線で２０４塩基対の蛍光バンドが確認され
たものを陽性とする。この結果、ヒト型結核菌（Mycoba
cterium tuberculosis）の試料（１〜５）と分類学的に
ヒト型結核菌に極めて近縁であるウシ型結核菌（Mycoba
cterium bovis)の試料（６）で２０４塩基対の蛍光バン
ドが確認でき、陽性と判定できたのに対して、その他の
抗酸菌属細菌や他の属の細菌、生物の試料（７〜２８）
はいずれにも該当する蛍光バンドがみられず、陰性と判
断できた。
【００２７】以上のことから、本発明によるオリゴヌク
レオチドをプライマーとしてＰＣＲに用いることによ
り、結核菌群細菌（ヒト型結核菌、ウシ型結核菌）を特
異的に検出することが出来ると判明し、臨床上、ヒト型
結核菌の迅速な検出が可能であることが示された。ま
た、ＰＣＲなどの核酸増幅による検出は高感度が期待で
きるため、細菌を単離する前の臨床材料などからの直接
検出が可能であり、従来の培養に要していた時間（数週
間）が不要になることが考えられる。この方法ならば、
従来、培養などで数週間かかっていたヒト型結核菌の検
出を、１日以内に終わらせることができる。
レオチドをプライマーとしてＰＣＲに用いることによ
り、結核菌群細菌（ヒト型結核菌、ウシ型結核菌）を特
異的に検出することが出来ると判明し、臨床上、ヒト型
結核菌の迅速な検出が可能であることが示された。ま
た、ＰＣＲなどの核酸増幅による検出は高感度が期待で
きるため、細菌を単離する前の臨床材料などからの直接
検出が可能であり、従来の培養に要していた時間（数週
間）が不要になることが考えられる。この方法ならば、
従来、培養などで数週間かかっていたヒト型結核菌の検
出を、１日以内に終わらせることができる。
【００２８】実施例２ （１）リンカーアームを有するヒト型結核菌検出用オリ
ゴヌクレオチドの合成 ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホス
ホアミダイト法にて、配列表・配列番号３に示される配
列を有するオリゴヌクレオチド（以下、プローブ１と呼
ぶ）及び配列表・配列番号４に示される配列を有するオ
リゴヌクレオチド（以下、プローブ２と呼ぶ）を合成し
た。この際、特表昭60-500717 号公報に開示された合成
法によりデオキシウリジンから化学合成により調製し
た、５位にリンカーアームを有するウリジンを、上記オ
リゴヌクレオチドに導入した。このウリジンはオリゴヌ
クレオチド内の任意のＴを置換しうるが、今回はいずれ
も５’末端のＴを置換した。合成されたリンカーオリゴ
ヌクレオチドはアンモニア水で５０℃、一夜脱保護処理
を施した後、ファルマシア社製ＦＰＬＣで陰イオン交換
カラムを用いて精製した。
ゴヌクレオチドの合成 ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホス
ホアミダイト法にて、配列表・配列番号３に示される配
列を有するオリゴヌクレオチド（以下、プローブ１と呼
ぶ）及び配列表・配列番号４に示される配列を有するオ
リゴヌクレオチド（以下、プローブ２と呼ぶ）を合成し
た。この際、特表昭60-500717 号公報に開示された合成
法によりデオキシウリジンから化学合成により調製し
た、５位にリンカーアームを有するウリジンを、上記オ
リゴヌクレオチドに導入した。このウリジンはオリゴヌ
クレオチド内の任意のＴを置換しうるが、今回はいずれ
も５’末端のＴを置換した。合成されたリンカーオリゴ
ヌクレオチドはアンモニア水で５０℃、一夜脱保護処理
を施した後、ファルマシア社製ＦＰＬＣで陰イオン交換
カラムを用いて精製した。
【００２９】（２）リンカーオリゴヌクレオチドの酵素
・アルカリ性ホスファターゼによる標識化 上記リンカーオリゴヌクレオチドと、そのリンカーアー
ムを介してのアルカリ性ホスファターゼとの結合を、文
献（Nucleic Acids Res.;14 巻6115頁1986年）に従って
行なった。リンカーオリゴヌクレオチド1.5 A260を 0.2
M NaHCO3 12.5 μl に溶解し、ここへ10mg/ml スベリン
酸ジスクシニミジル（ＤＳＳ）25μl を加えて室温、２
分間反応させた。反応液を1mM CH3COONa（pH5.0)で平衡
化したSephadex G-25 （ファルマシア社）カラム（1cm
φx30cm)でゲル濾過して過剰のＤＳＳを除去した。末端
のアミノ基が活性化されたリンカーオリゴヌクレオチド
を、更にモル比で２倍量のアルカリ性ホスファターゼ
（ベーリンガーマンハイム社、100mM NaHCO3、3M NaCl
に溶解したもの) と室温、１６時間反応させることでア
ルカリ性ホスファターゼ標識核酸プローブを得た。得ら
れた標識プローブは、ファルマシア社製ＦＰＬＣで陰イ
オン交換カラムを用いて精製した。標識プローブを含む
画分を集め、セントリコン３０Ｋ（アミコン社）を用い
て限外濾過法により濃縮した。
・アルカリ性ホスファターゼによる標識化 上記リンカーオリゴヌクレオチドと、そのリンカーアー
ムを介してのアルカリ性ホスファターゼとの結合を、文
献（Nucleic Acids Res.;14 巻6115頁1986年）に従って
行なった。リンカーオリゴヌクレオチド1.5 A260を 0.2
M NaHCO3 12.5 μl に溶解し、ここへ10mg/ml スベリン
酸ジスクシニミジル（ＤＳＳ）25μl を加えて室温、２
分間反応させた。反応液を1mM CH3COONa（pH5.0)で平衡
化したSephadex G-25 （ファルマシア社）カラム（1cm
φx30cm)でゲル濾過して過剰のＤＳＳを除去した。末端
のアミノ基が活性化されたリンカーオリゴヌクレオチド
を、更にモル比で２倍量のアルカリ性ホスファターゼ
（ベーリンガーマンハイム社、100mM NaHCO3、3M NaCl
に溶解したもの) と室温、１６時間反応させることでア
ルカリ性ホスファターゼ標識核酸プローブを得た。得ら
れた標識プローブは、ファルマシア社製ＦＰＬＣで陰イ
オン交換カラムを用いて精製した。標識プローブを含む
画分を集め、セントリコン３０Ｋ（アミコン社）を用い
て限外濾過法により濃縮した。
【００３０】（３）試料の調製 実施例１の（１）〜（３）の操作で得られたＰＣＲ反応
液（プライマーＦとプライマーＲによるＰＣＲ産物）を
使用した。
液（プライマーＦとプライマーＲによるＰＣＲ産物）を
使用した。
【００３１】（４）ドットブロットハイブリダイゼーシ
ョン 実施例１の（１）〜（３）の操作で得られたＰＣＲ反応
液をそのままナイロン膜（Hybond N+ 、アマシャム社）
に滴下し、0.4N NaOH で核酸を変性、ナイロン膜に固定
した。この膜を中和後ハイブリダイゼーションバック(B
RL社）に移し、上記アルカリ性ホスファターゼ標識核酸
プローブ液（プローブ１またはプローブ２）をそれぞれ
含むハイブリダイゼーションバッファー（5xSSC 、0.5%
ウシ血清アルブミン、0.5%ポリビニールピロリドン、1%
ドデシル硫酸ナトリウム）を加えてポリシーラーでシー
ルし５０℃１５分間ハイブリダイゼーションを行なっ
た。それぞれの膜をポリバッグから取り出し、洗浄液１
（2xSSC 、1%ドデシル硫酸ナトリウム）で５０℃、１０
分間振とう洗浄した。更に洗浄液２（1xSSC 、0.5%Trit
onX-100）で室温、１０分間振とう洗浄した。最後に洗
浄液３（1xSSC)で室温５分間振とう洗浄した。膜を新し
いハイブリダイゼーションバッグに移し、基質液（0.1M
Tris-HCl 、0.1M NaCl 、0.1M MgCl2、0.3mg/mlニトロ
ブルーテトラゾリウム、0.3mg/mlブロムクロロインドフ
ェリールホスフェート(pH7.5))を入れポリシーラーでシ
ールし３７℃で１時間インキュベートした。
ョン 実施例１の（１）〜（３）の操作で得られたＰＣＲ反応
液をそのままナイロン膜（Hybond N+ 、アマシャム社）
に滴下し、0.4N NaOH で核酸を変性、ナイロン膜に固定
した。この膜を中和後ハイブリダイゼーションバック(B
RL社）に移し、上記アルカリ性ホスファターゼ標識核酸
プローブ液（プローブ１またはプローブ２）をそれぞれ
含むハイブリダイゼーションバッファー（5xSSC 、0.5%
ウシ血清アルブミン、0.5%ポリビニールピロリドン、1%
ドデシル硫酸ナトリウム）を加えてポリシーラーでシー
ルし５０℃１５分間ハイブリダイゼーションを行なっ
た。それぞれの膜をポリバッグから取り出し、洗浄液１
（2xSSC 、1%ドデシル硫酸ナトリウム）で５０℃、１０
分間振とう洗浄した。更に洗浄液２（1xSSC 、0.5%Trit
onX-100）で室温、１０分間振とう洗浄した。最後に洗
浄液３（1xSSC)で室温５分間振とう洗浄した。膜を新し
いハイブリダイゼーションバッグに移し、基質液（0.1M
Tris-HCl 、0.1M NaCl 、0.1M MgCl2、0.3mg/mlニトロ
ブルーテトラゾリウム、0.3mg/mlブロムクロロインドフ
ェリールホスフェート(pH7.5))を入れポリシーラーでシ
ールし３７℃で１時間インキュベートした。
【００３２】（４）結果 アルカリ性ホスファターゼにより生じる紫色色素のスポ
ットを目視により判定した。スポットの確認できたもの
を陽性とした。この結果、プローブ１、プローブ２とも
ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）の試料
（１〜５）と、分類学的にヒト型結核菌に極めて近縁で
あるウシ型結核菌（Mycobacterium bovis)の試料（６）
でのみ紫色色素のスポットが確認でき、陽性と判定でき
たのに対して、その他の抗酸菌属細菌や他の属の細菌、
生物の試料（７〜２８）はいずれにもスポットがみられ
ず、陰性と判断できた。
ットを目視により判定した。スポットの確認できたもの
を陽性とした。この結果、プローブ１、プローブ２とも
ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）の試料
（１〜５）と、分類学的にヒト型結核菌に極めて近縁で
あるウシ型結核菌（Mycobacterium bovis)の試料（６）
でのみ紫色色素のスポットが確認でき、陽性と判定でき
たのに対して、その他の抗酸菌属細菌や他の属の細菌、
生物の試料（７〜２８）はいずれにもスポットがみられ
ず、陰性と判断できた。
【００３３】以上のことから、本発明によるオリゴヌク
レオチドを核酸プライマーと標識プローブに用いること
により、結核菌群細菌（ヒト型結核菌、ウシ型結核菌）
を特異的に検出することが出来ると判明し、臨床上、ヒ
ト型結核菌の迅速な検出が可能であることが示された。
この方法はプローブの特異性を加味するので、アガロー
スゲル電気泳動だけで判定する実施例１よりもさらに確
実で厳密な検出方法である。この方法ならば、従来、培
養などで数週間かかっていたヒト型結核菌の検出を、１
日以内に終わらせることができる。
レオチドを核酸プライマーと標識プローブに用いること
により、結核菌群細菌（ヒト型結核菌、ウシ型結核菌）
を特異的に検出することが出来ると判明し、臨床上、ヒ
ト型結核菌の迅速な検出が可能であることが示された。
この方法はプローブの特異性を加味するので、アガロー
スゲル電気泳動だけで判定する実施例１よりもさらに確
実で厳密な検出方法である。この方法ならば、従来、培
養などで数週間かかっていたヒト型結核菌の検出を、１
日以内に終わらせることができる。
【００３４】実施例３ （１）リンカーアームを有するヒト型結核菌検出用オリ
ゴヌクレオチドの合成 実施例２の（１）と全く同様に、配列表・配列番号３に
示される配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、プロ
ーブ１と呼ぶ）及び配列表・配列番号４に示される配列
を有するオリゴヌクレオチド（以下、プローブ２と呼
ぶ）を合成した。
ゴヌクレオチドの合成 実施例２の（１）と全く同様に、配列表・配列番号３に
示される配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、プロ
ーブ１と呼ぶ）及び配列表・配列番号４に示される配列
を有するオリゴヌクレオチド（以下、プローブ２と呼
ぶ）を合成した。
【００３５】（２）リンカーオリゴヌクレオチドの酵素
・アルカリ性ホスファターゼによる標識 上記（１）のプローブ１について、そのリンカーアーム
を介してのアルカリ性ホスファターゼとの結合を、実施
例２の（２）と全く同様に行った。
・アルカリ性ホスファターゼによる標識 上記（１）のプローブ１について、そのリンカーアーム
を介してのアルカリ性ホスファターゼとの結合を、実施
例２の（２）と全く同様に行った。
【００３６】（３）リンカーオリゴヌクレオチドのマイ
クロタイタープレートへの結合 上記（１）のプローブ２について、50mMホウ酸バッファ
ー（pH10）および100mM MgCl2 を含む溶液に、0.05pmol
/ μl になるように添加し、マイクロタイタープレート
（マイクロライト２、ダイナテック社）に各100 μl ず
つ分注し、１５時間程度室温に放置することでプローブ
２のリンカーオリゴヌクレオチドをマイクロタイタープ
レート内面に結合させた。その後、ブロッキングバッフ
ァー（0.1pmol dNTP，0.5% PVP，5xSSC)に置換して、非
特異反応を抑えるためのブロッキングを室温で２時間程
度行った。最後に洗浄液（1xSSC)で洗浄して乾燥させ
た。
クロタイタープレートへの結合 上記（１）のプローブ２について、50mMホウ酸バッファ
ー（pH10）および100mM MgCl2 を含む溶液に、0.05pmol
/ μl になるように添加し、マイクロタイタープレート
（マイクロライト２、ダイナテック社）に各100 μl ず
つ分注し、１５時間程度室温に放置することでプローブ
２のリンカーオリゴヌクレオチドをマイクロタイタープ
レート内面に結合させた。その後、ブロッキングバッフ
ァー（0.1pmol dNTP，0.5% PVP，5xSSC)に置換して、非
特異反応を抑えるためのブロッキングを室温で２時間程
度行った。最後に洗浄液（1xSSC)で洗浄して乾燥させ
た。
【００３７】（４）試料の調製 実施例１の（１）〜（３）の操作で得られたＰＣＲ反応
液（プライマーＦとプライマーＲによるＰＣＲ産物）を
使用した。
液（プライマーＦとプライマーＲによるＰＣＲ産物）を
使用した。
【００３８】（５）マイクロタイタープレート中でのサ
ンドイッチハイブリダイゼーション 実施例１の（１）〜（３）の操作で得られたＰＣＲ反応
液を0.3N NaOH 中で変性させ、20μl をハイブリダイゼ
ーションバッファー１(200mMクエン酸リン酸バッファー
（pH6.0)，2%スクラーフＡＧ（日本精化株式会社），75
0mM NaCl,0.1%NaN3の溶液）100 μl に加えて、上記
（３）のプローブ２が結合したマイクロタイタープレー
トに投入した。蒸発を防ぐため流動パラフィンを重層
し、５０℃で１時間振盪させた。これによって、サンプ
ルＤＮＡが固定化されたプローブ２によって特異的にマ
イクロタイタープレートに捕捉された。次に、上記
（２）のアルカリ性ホスファターゼ標識したプローブ１
を2fmol/μlの濃度で含むハイブリダイゼーションバッ
ファー２（5xSSC （pH7.0), 0.1%スクラーフＡＧ，0.5%
PVP，10mM MgCl2, 1mM ZnCl2, 0.1% NaN3 の溶液)100
μlと置換し、同様に蒸発を防ぐため流動パラフィンを
重層し、５０℃で１時間振盪させる。これによって、捕
捉されたサンプルＤＮＡにアルカリ性ホスファターゼ標
識したプローブ１が特異的に結合した。その後、洗浄液
１(2xSSC（pH7.0), 0.1%スクラーフＡＧ) に置換し、５
０℃で１０分保温、さらに洗浄液２(1xSSC) に置換し洗
浄した。洗浄液排出後、アルカリ性ホスファターゼの発
光基質である1,2-ジオキセタン化合物（Lumiphos 480，
Lumigen 社）100 μl を注入し、３７℃で１５分保温後
に暗室中でホトンカウンター（浜松ホトニクス社）で発
光量を測定した。
ンドイッチハイブリダイゼーション 実施例１の（１）〜（３）の操作で得られたＰＣＲ反応
液を0.3N NaOH 中で変性させ、20μl をハイブリダイゼ
ーションバッファー１(200mMクエン酸リン酸バッファー
（pH6.0)，2%スクラーフＡＧ（日本精化株式会社），75
0mM NaCl,0.1%NaN3の溶液）100 μl に加えて、上記
（３）のプローブ２が結合したマイクロタイタープレー
トに投入した。蒸発を防ぐため流動パラフィンを重層
し、５０℃で１時間振盪させた。これによって、サンプ
ルＤＮＡが固定化されたプローブ２によって特異的にマ
イクロタイタープレートに捕捉された。次に、上記
（２）のアルカリ性ホスファターゼ標識したプローブ１
を2fmol/μlの濃度で含むハイブリダイゼーションバッ
ファー２（5xSSC （pH7.0), 0.1%スクラーフＡＧ，0.5%
PVP，10mM MgCl2, 1mM ZnCl2, 0.1% NaN3 の溶液)100
μlと置換し、同様に蒸発を防ぐため流動パラフィンを
重層し、５０℃で１時間振盪させる。これによって、捕
捉されたサンプルＤＮＡにアルカリ性ホスファターゼ標
識したプローブ１が特異的に結合した。その後、洗浄液
１(2xSSC（pH7.0), 0.1%スクラーフＡＧ) に置換し、５
０℃で１０分保温、さらに洗浄液２(1xSSC) に置換し洗
浄した。洗浄液排出後、アルカリ性ホスファターゼの発
光基質である1,2-ジオキセタン化合物（Lumiphos 480，
Lumigen 社）100 μl を注入し、３７℃で１５分保温後
に暗室中でホトンカウンター（浜松ホトニクス社）で発
光量を測定した。
【００３９】（６）結果 ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）の試料
（１〜５）と、分類学的にヒト型結核菌に極めて近縁で
あるウシ型結核菌（Mycobacterium bovis)の試料（６）
では、4000〜15000 cps の発光量が測定され、明らかに
陽性と判断できた。それに対し、その他の抗酸菌属細菌
や他の属の細菌、生物の試料（７〜２８）はいずれも10
00 cps未満の発光量しか測定されなかった。蒸留水を用
いたブランクは約800cpsであったから、これらの試料は
陰性と判断できた。
（１〜５）と、分類学的にヒト型結核菌に極めて近縁で
あるウシ型結核菌（Mycobacterium bovis)の試料（６）
では、4000〜15000 cps の発光量が測定され、明らかに
陽性と判断できた。それに対し、その他の抗酸菌属細菌
や他の属の細菌、生物の試料（７〜２８）はいずれも10
00 cps未満の発光量しか測定されなかった。蒸留水を用
いたブランクは約800cpsであったから、これらの試料は
陰性と判断できた。
【００４０】以上のことから、本発明によるオリゴヌク
レオチドを核酸プライマーと固定化及び標識プローブに
用いることにより、結核菌群細菌（ヒト型結核菌、ウシ
型結核菌）を特異的に検出することが出来ると判明し、
臨床上、ヒト型結核菌の迅速な検出が可能であることが
示された。この方法は、プローブの特異性を加味する実
施例２の特徴とともに、検出の自動化システムに対応し
たものであり、検査の迅速化、自動化及び省力化に有力
な手段を与えるものである。
レオチドを核酸プライマーと固定化及び標識プローブに
用いることにより、結核菌群細菌（ヒト型結核菌、ウシ
型結核菌）を特異的に検出することが出来ると判明し、
臨床上、ヒト型結核菌の迅速な検出が可能であることが
示された。この方法は、プローブの特異性を加味する実
施例２の特徴とともに、検出の自動化システムに対応し
たものであり、検査の迅速化、自動化及び省力化に有力
な手段を与えるものである。
【００４１】
【発明の効果】本発明のオリゴヌクレオチドを使用する
ことにより、直接的で簡便、迅速かつ確実なヒト型結核
菌の検出が可能となった。本発明のオリゴヌクレオチド
の配列またはその相補配列の、一部または全部を有する
オリゴヌクレオチドはＤＮＡ増幅反応のプライマーとし
ても、直接検出用のプローブとしても、またはその組合
せとしても用いることが可能であり、従来、数週間もか
かった培養とその後の生化学的試験などに比べて、時間
を大幅に短縮することができ、簡便で、且つ再現性のあ
る確実な結果が得られる。しかも核酸増幅などにより、
喀痰や血液などの臨床材料から直接検出することが可能
となるので、その臨床的意義は大きい。
ことにより、直接的で簡便、迅速かつ確実なヒト型結核
菌の検出が可能となった。本発明のオリゴヌクレオチド
の配列またはその相補配列の、一部または全部を有する
オリゴヌクレオチドはＤＮＡ増幅反応のプライマーとし
ても、直接検出用のプローブとしても、またはその組合
せとしても用いることが可能であり、従来、数週間もか
かった培養とその後の生化学的試験などに比べて、時間
を大幅に短縮することができ、簡便で、且つ再現性のあ
る確実な結果が得られる。しかも核酸増幅などにより、
喀痰や血液などの臨床材料から直接検出することが可能
となるので、その臨床的意義は大きい。
【００４２】
配列番号：１ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..20 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosi
s）３５ｋＤａタンパク質遺伝子の配列と相補的な配列
を有する。 配列 CGTCAATTGG AGATGCGACT 20
s）３５ｋＤａタンパク質遺伝子の配列と相補的な配列
を有する。 配列 CGTCAATTGG AGATGCGACT 20
【００４３】配列番号：２ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..20 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosi
s）３５ｋＤａタンパク質遺伝子の配列と相補的な配列
を有する。 配列 ATGCAGCGTC TTGAGGTCTT 20
s）３５ｋＤａタンパク質遺伝子の配列と相補的な配列
を有する。 配列 ATGCAGCGTC TTGAGGTCTT 20
【００４４】配列番号：３ 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..23 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosi
s）３５ｋＤａタンパク質遺伝子の配列と相補的な配列
を有する。 配列 TTGACCTGAA GCTTTTCGAT GTC 23
s）３５ｋＤａタンパク質遺伝子の配列と相補的な配列
を有する。 配列 TTGACCTGAA GCTTTTCGAT GTC 23
【００４５】配列番号：４ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..21 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosi
s）３５ｋＤａタンパク質遺伝子の配列と相補的な配列
を有する。 配列 TTGTTGTATT CGGTGGCCTT G 21
s）３５ｋＤａタンパク質遺伝子の配列と相補的な配列
を有する。 配列 TTGTTGTATT CGGTGGCCTT G 21
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:32） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:32） Ｃ１２Ｒ 1:32）
Claims (11)
- 【請求項１】 ヒト型結核菌（Mycobacterium tubercul
osis）の３５ｋＤａタンパク質遺伝子の核酸配列とハイ
ブリダイズすることを特徴とするオリゴヌクレオチド。 - 【請求項２】 ヒト型結核菌（Mycobacterium tubercul
osis）の３５ｋＤａタンパク質遺伝子の核酸配列とハイ
ブリダイズするオリゴヌクレオチドが、配列表・配列番
号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４に記載
の核酸配列（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇは
グアニン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴは
ウラシル（Ｕ）と置換されていてもよい。）の一部また
は全部、またはその相補配列の一部または全部を含有す
ることを特徴とする請求項１記載のオリゴヌクレオチ
ド。 - 【請求項３】 請求項１または２に記載されるオリゴヌ
クレオチドをプローブまたはプライマーとして使用する
ことを特徴とするヒト型結核菌の検出方法。 - 【請求項４】 請求項１または２に記載されるオリゴヌ
クレオチドを標識化した標識核酸プローブを試料中のＤ
ＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、交雑した結合体の標識を
測定することを特徴とする請求項３記載のヒト型結核菌
の検出方法。 - 【請求項５】 請求項１または２に記載されるオリゴヌ
レオチドである核酸プライマー、または該オリゴヌクレ
オチドを標識化した標識核酸プライマーを試料中のＤＮ
ＡまたはＲＮＡと交雑させ、プライマー伸長させ、得ら
れたプライマー伸長物を測定することを特徴とする請求
項３記載のヒト型結核菌の検出方法。 - 【請求項６】 請求項１または２に記載されるオリゴヌ
クレオチドを標識化した標識核酸プローブを含有するこ
とを特徴とするヒト型結核菌検出用標識核酸プローブ。 - 【請求項７】 請求項１または２に記載されるオリゴヌ
クレオチドを含有することを特徴とするヒト型結核菌検
出用核酸プライマー。 - 【請求項８】 請求項６に記載されるヒト型結核菌検出
用標識核酸プローブを含むことを特徴とするヒト型結核
菌の検出用試薬キット。 - 【請求項９】 請求項７に記載されるヒト型結核菌検出
用核酸プライマーを含むことを特徴とするヒト型結核菌
の検出用試薬キット。 - 【請求項１０】 請求項６に記載されるヒト型結核菌検
出用標識核酸プローブおよび請求項７に記載されるヒト
型結核菌検出用核酸プライマーを含むことを特徴とする
ヒト型結核菌の検出用試薬キット。 - 【請求項１１】 さらに核酸合成酵素およびｄＮＴＰお
よび／またはｒＮＴＰおよび緩衝液を含有することを特
徴とする請求項８〜１０記載のヒト型結核菌の検出用試
薬キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6012724A JPH07213288A (ja) | 1994-02-04 | 1994-02-04 | ヒト型結核菌検出用オリゴヌクレオチドおよびその用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6012724A JPH07213288A (ja) | 1994-02-04 | 1994-02-04 | ヒト型結核菌検出用オリゴヌクレオチドおよびその用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07213288A true JPH07213288A (ja) | 1995-08-15 |
Family
ID=11813387
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6012724A Pending JPH07213288A (ja) | 1994-02-04 | 1994-02-04 | ヒト型結核菌検出用オリゴヌクレオチドおよびその用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07213288A (ja) |
-
1994
- 1994-02-04 JP JP6012724A patent/JPH07213288A/ja active Pending
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