JPH07195A - 火落菌の測定方法 - Google Patents
火落菌の測定方法Info
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- JPH07195A JPH07195A JP16986893A JP16986893A JPH07195A JP H07195 A JPH07195 A JP H07195A JP 16986893 A JP16986893 A JP 16986893A JP 16986893 A JP16986893 A JP 16986893A JP H07195 A JPH07195 A JP H07195A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 親水性ポリカーボネートメンブレンフィルタ
ーで日本酒中の火落菌を濾過し、ＴＭ培地を用いて該火
落菌を培養した後、ＡＴＰ抽出試薬を噴霧し、次に発光
試薬を噴霧した後、直ちに生物発光画像解析システム装
置にかけて火落菌の生菌数を測定する。 【効果】 日本酒の火落ちの原因になる火落菌が迅速、
簡便、高感度で測定でき、日本酒の火落ちの予知が容易
になった。
ーで日本酒中の火落菌を濾過し、ＴＭ培地を用いて該火
落菌を培養した後、ＡＴＰ抽出試薬を噴霧し、次に発光
試薬を噴霧した後、直ちに生物発光画像解析システム装
置にかけて火落菌の生菌数を測定する。 【効果】 日本酒の火落ちの原因になる火落菌が迅速、
簡便、高感度で測定でき、日本酒の火落ちの予知が容易
になった。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は日本酒の腐敗の原因にな
る火落菌の生菌数を迅速、簡便且つ高感度で測定する方
法に関する。
る火落菌の生菌数を迅速、簡便且つ高感度で測定する方
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】「火落ち」とは、日本酒が貯蔵中に腐敗
する現象のことをいうが、その原因は好アルコール性乳
酸菌の１種である火落菌にあることが従来より知られて
いる。この火落ちを防止するには、サリチル酸等の防腐
剤や保存料を使用する方法もあるが、これら添加剤はい
わゆる食品の安全性の点から問題があり、火落菌が熱に
弱いという特性を利用した「火入れ」という６０〜６５
℃程度で行われる低温加熱殺菌法が最も好ましいとされ
ている。しかし、この火入れ法にも、火入れして殺菌し
た後、その日本酒を貯蔵している中に何等かの原因でそ
の酒に火落菌が混入すると怱ち火落ちしてしまうという
泣き所がある。
する現象のことをいうが、その原因は好アルコール性乳
酸菌の１種である火落菌にあることが従来より知られて
いる。この火落ちを防止するには、サリチル酸等の防腐
剤や保存料を使用する方法もあるが、これら添加剤はい
わゆる食品の安全性の点から問題があり、火落菌が熱に
弱いという特性を利用した「火入れ」という６０〜６５
℃程度で行われる低温加熱殺菌法が最も好ましいとされ
ている。しかし、この火入れ法にも、火入れして殺菌し
た後、その日本酒を貯蔵している中に何等かの原因でそ
の酒に火落菌が混入すると怱ち火落ちしてしまうという
泣き所がある。
【０００３】それ故、貯酒工程では随時、火落菌の検査
を行い、火落ちの早期予知を行うことが極めて重要にな
ってくる。火落ちの早期予知ができれば、その都度火入
れを行い火落ちを防止できるからである。この火落菌の
検査法としては、日本醸造協会が定めるエタノールを１
０％添加した平板寒天培地（ＳＩ培地）を用いて日本酒
中の火落菌を培養しコロニーを検出する、いわゆるプレ
ート法がある。しかしこの方法には、測定に３〜１０日
間という長時間を要するという問題点があり、より簡
便、迅速な測定法が当業界で希求されていた。
を行い、火落ちの早期予知を行うことが極めて重要にな
ってくる。火落ちの早期予知ができれば、その都度火入
れを行い火落ちを防止できるからである。この火落菌の
検査法としては、日本醸造協会が定めるエタノールを１
０％添加した平板寒天培地（ＳＩ培地）を用いて日本酒
中の火落菌を培養しコロニーを検出する、いわゆるプレ
ート法がある。しかしこの方法には、測定に３〜１０日
間という長時間を要するという問題点があり、より簡
便、迅速な測定法が当業界で希求されていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は上記要望に応
えるものであって、日本酒の火落ち予防に極めて有効な
迅速、簡便で、高感度な火落菌の測定法の提供を目的と
するものである。
えるものであって、日本酒の火落ち予防に極めて有効な
迅速、簡便で、高感度な火落菌の測定法の提供を目的と
するものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者は上記
課題を解決するため、火落菌の生菌数の測定に好適な測
定方法及びそれに適した培地について鋭意研究を行っ
た。その結果、測定法としては、本出願人が先に発明し
出願した方法（特願平３−４０６１５号、特願平５−２
３４２０号等）である、メンブレンフィルターで検体液
を濾過して生菌を捕捉し、その上から抽出試薬及び発光
試薬等の試薬を噴霧した後、その標本を高感度生物発光
画像解析システム装置にかけて生菌数を測定する方法を
利用するのが最も好ましいことがわかった。
課題を解決するため、火落菌の生菌数の測定に好適な測
定方法及びそれに適した培地について鋭意研究を行っ
た。その結果、測定法としては、本出願人が先に発明し
出願した方法（特願平３−４０６１５号、特願平５−２
３４２０号等）である、メンブレンフィルターで検体液
を濾過して生菌を捕捉し、その上から抽出試薬及び発光
試薬等の試薬を噴霧した後、その標本を高感度生物発光
画像解析システム装置にかけて生菌数を測定する方法を
利用するのが最も好ましいことがわかった。
【０００６】一方、火落菌は嫌気性菌であるため、好気
性菌に比べ菌体内のアデノシン−３−リン酸（以下ＡＴ
Ｐと略記する）含有量が少い。従って、検出感度を上げ
るにはＡＴＰの増量、即ち濾過後の菌体の培養が必要で
あることがわかった。そこで従来より使用されてきた培
地を用いて培養を試みたところ、火落菌は成育が極めて
遅く、対数期に入るまでに少くとも２〜３日間かかって
しまい、迅速な測定は不可能であった。
性菌に比べ菌体内のアデノシン−３−リン酸（以下ＡＴ
Ｐと略記する）含有量が少い。従って、検出感度を上げ
るにはＡＴＰの増量、即ち濾過後の菌体の培養が必要で
あることがわかった。そこで従来より使用されてきた培
地を用いて培養を試みたところ、火落菌は成育が極めて
遅く、対数期に入るまでに少くとも２〜３日間かかって
しまい、迅速な測定は不可能であった。
【０００７】さらに、火落菌の測定に好適な培地として
使用されているＳＩ培地〔（財）日本醸造協会の火落菌
検出用培地〕も、上記測定方法に用いた場合、その中に
ＡＴＰ関連物質が多く含まれているため、ルシフェリン
−ルシフェラーゼ発光試薬と接触した際、強い発光反応
が起こり、その発光が菌体から抽出されたＡＴＰの発光
と混同して前記の本発明で採用する測定方法では火落菌
数の正確な測定が全くできないという致命的な欠点があ
る。
使用されているＳＩ培地〔（財）日本醸造協会の火落菌
検出用培地〕も、上記測定方法に用いた場合、その中に
ＡＴＰ関連物質が多く含まれているため、ルシフェリン
−ルシフェラーゼ発光試薬と接触した際、強い発光反応
が起こり、その発光が菌体から抽出されたＡＴＰの発光
と混同して前記の本発明で採用する測定方法では火落菌
数の正確な測定が全くできないという致命的な欠点があ
る。
【０００８】本発明者は以上の問題点について、さらに
研究を重ねた結果、火落菌の成育を早める効果のあるメ
ンブレンフィルターとして親水性ポリカーボネートのメ
ンブレンフィルターがあることを見出し、さらに該フィ
ルターで捕捉した火落菌の培養に好適で且つ引き続いて
行われる生物発光画像解析システムにて測定を行う際発
光ノイズの極めて少い火落菌用培地（ＴＭ培地）を発明
することによって前記の問題点を解決し、本発明を完成
した。
研究を重ねた結果、火落菌の成育を早める効果のあるメ
ンブレンフィルターとして親水性ポリカーボネートのメ
ンブレンフィルターがあることを見出し、さらに該フィ
ルターで捕捉した火落菌の培養に好適で且つ引き続いて
行われる生物発光画像解析システムにて測定を行う際発
光ノイズの極めて少い火落菌用培地（ＴＭ培地）を発明
することによって前記の問題点を解決し、本発明を完成
した。
【０００９】即ち本発明は、日本酒を親水性ポリカーボ
ネートメンブレンフィルターで濾過し、その日本酒中に
含まれている火落菌を該フィルター上に捕捉し、次いで
火落菌用培地を用いてその火落菌を培養した後、該フィ
ルターの上からアデノシン−３−リン酸（ＡＴＰ）抽出
試薬を噴霧して火落菌中のＡＴＰを抽出し、さらにその
上にルシフェリン−ルシフェラーゼ発光試薬を噴霧して
該ＡＴＰを発光せしめた後、直ちに以上の処理をしたフ
ィルターを生物発光画像解析システム装置に装着してそ
の輝点を撮像し、生菌数を測定することを特徴とする日
本酒中の火落菌の測定方法を提供するものである。以下
本発明を詳細に説明する。
ネートメンブレンフィルターで濾過し、その日本酒中に
含まれている火落菌を該フィルター上に捕捉し、次いで
火落菌用培地を用いてその火落菌を培養した後、該フィ
ルターの上からアデノシン−３−リン酸（ＡＴＰ）抽出
試薬を噴霧して火落菌中のＡＴＰを抽出し、さらにその
上にルシフェリン−ルシフェラーゼ発光試薬を噴霧して
該ＡＴＰを発光せしめた後、直ちに以上の処理をしたフ
ィルターを生物発光画像解析システム装置に装着してそ
の輝点を撮像し、生菌数を測定することを特徴とする日
本酒中の火落菌の測定方法を提供するものである。以下
本発明を詳細に説明する。
【００１０】本発明で用いるメンブレンフィルターは、
ポリカーボネートを湿潤滑剤で処理して親水性にした親
水性ポリカーボネートを用いて製造したフィルム又はシ
ート状のフイルターであり、好ましくは孔径が０．２〜
０．４５μｍのものが使用される。このメンブレンフィ
ルターを用いて検体（日本酒）を濾過し、該検体中に含
まれている火落菌をフィルター上に捕捉する。そのフィ
ルター上に捕捉された火落菌を培養するには本発明者が
発明した窒素源としてトリプトン、酵母エキス、大豆ペ
プトンを有し、炭素源としてブドウ糖を、ミネラルとし
てマグネシウム、マンガンの硫酸塩を有し、メバロン
酸、パントテン酸ナトリウム、葉酸を添加し、寒天、エ
タノール、蒸留水を加えたＴＭ培地を用いる。
ポリカーボネートを湿潤滑剤で処理して親水性にした親
水性ポリカーボネートを用いて製造したフィルム又はシ
ート状のフイルターであり、好ましくは孔径が０．２〜
０．４５μｍのものが使用される。このメンブレンフィ
ルターを用いて検体（日本酒）を濾過し、該検体中に含
まれている火落菌をフィルター上に捕捉する。そのフィ
ルター上に捕捉された火落菌を培養するには本発明者が
発明した窒素源としてトリプトン、酵母エキス、大豆ペ
プトンを有し、炭素源としてブドウ糖を、ミネラルとし
てマグネシウム、マンガンの硫酸塩を有し、メバロン
酸、パントテン酸ナトリウム、葉酸を添加し、寒天、エ
タノール、蒸留水を加えたＴＭ培地を用いる。
【００１１】なお、パントテン酸の塩としては、従来は
カルシウム塩が多く用いられていたが、カルシウムはＡ
ＴＰの発光を阻害する傾向があるのでＴＭ培地ではナト
リウム塩を用いる。又、従来の培地でよく用いられてい
るＡＴＰ関連物質を多く含有する肉エキス類を添加せ
ず、且つ同様に酵母エキスの添加も最小限に止め、代り
にＮ源としてトリプトン、大豆ペプシンを通常使用量の
２〜３倍に増やしたのもＴＭ培地の特徴の１つである。
このＴＭ培地の具体的な組成及びｐＨは次の第１表に示
すとおりである。
カルシウム塩が多く用いられていたが、カルシウムはＡ
ＴＰの発光を阻害する傾向があるのでＴＭ培地ではナト
リウム塩を用いる。又、従来の培地でよく用いられてい
るＡＴＰ関連物質を多く含有する肉エキス類を添加せ
ず、且つ同様に酵母エキスの添加も最小限に止め、代り
にＮ源としてトリプトン、大豆ペプシンを通常使用量の
２〜３倍に増やしたのもＴＭ培地の特徴の１つである。
このＴＭ培地の具体的な組成及びｐＨは次の第１表に示
すとおりである。
【００１２】
【表１】
【００１３】上記の捕捉火落菌を該ＴＭ培地を用いて、
公知のプレート法により３０℃で１６時間嫌気培養した
後、メンブレンフィルターを取り外し、乾燥し、続いて
その上からＡＴＰ抽出試薬を噴霧する。ここで用いるＡ
ＴＰ抽出試薬としては、アルコール、エーテル、エステ
ル、ハロゲン化炭化水素、アセトニトリル、トリエチル
アミン等を挙げることができる。これらの中ではアルコ
ール、特にメタノール又はエタノールが好ましい。
公知のプレート法により３０℃で１６時間嫌気培養した
後、メンブレンフィルターを取り外し、乾燥し、続いて
その上からＡＴＰ抽出試薬を噴霧する。ここで用いるＡ
ＴＰ抽出試薬としては、アルコール、エーテル、エステ
ル、ハロゲン化炭化水素、アセトニトリル、トリエチル
アミン等を挙げることができる。これらの中ではアルコ
ール、特にメタノール又はエタノールが好ましい。
【００１４】又、上記のアルコール等に０．１〜５重量
％の水酸化アンモニウムを添加すると、さらによい抽出
効果が得られる。噴霧の方法は噴霧機、好ましくは超音
波式噴霧機を用いて微細で均一な噴霧を行う。これによ
り火落菌の捕捉点の極く近傍で、ＡＴＰ抽出、発光、測
定を行うことができるので、よりシャープな輝点が得ら
れる。
％の水酸化アンモニウムを添加すると、さらによい抽出
効果が得られる。噴霧の方法は噴霧機、好ましくは超音
波式噴霧機を用いて微細で均一な噴霧を行う。これによ
り火落菌の捕捉点の極く近傍で、ＡＴＰ抽出、発光、測
定を行うことができるので、よりシャープな輝点が得ら
れる。
【００１５】ＡＴＰ抽出試薬の噴霧後、室温〜６０℃、
好ましくは室温付近で該抽出試薬を揮発させ、次いで、
発光試薬を噴霧添加する。発光試薬はルシフェリン−ル
シフェラーゼ系発光試薬、例えばキッコーマン社製のル
シフェールＬＵ（商品名）等を用いるのがよく、噴霧は
上記抽出試薬と同様にして行うのがよい。
好ましくは室温付近で該抽出試薬を揮発させ、次いで、
発光試薬を噴霧添加する。発光試薬はルシフェリン−ル
シフェラーゼ系発光試薬、例えばキッコーマン社製のル
シフェールＬＵ（商品名）等を用いるのがよく、噴霧は
上記抽出試薬と同様にして行うのがよい。
【００１６】以上の処理方法によって検査すべき日本酒
に含まれている火落菌を捕捉し、そのＡＴＰを抽出し、
発光せしめたフィルター標本を生物発光画像解析システ
ム装置に装着し、該装置によって、その発光輝点を撮像
し、火落菌の菌数を測定する。
に含まれている火落菌を捕捉し、そのＡＴＰを抽出し、
発光せしめたフィルター標本を生物発光画像解析システ
ム装置に装着し、該装置によって、その発光輝点を撮像
し、火落菌の菌数を測定する。
【００１７】ここで用いる生物発光画像解析システム装
置は標本（フィルター）ホルダー、全反射板、遮光ハウ
ジング、リレーレンズの代りにテーパーファイバー、超
高感度ＣＣＤカメラ或いは超高感冷却型ＣＣＤカメラ、
コントローラー、イメージプロセッサ、データ解析装
置、及びテレビモニター等から構成されており、特にテ
ーパーファイバーを装着したＡＲＧＵＳ−５０／ＣＬ
（商品名；浜松ホトニクス社製）及びＲＭＤシステム
（商品名；日本ミリポア・リミテッド）装置が好まし
い。
置は標本（フィルター）ホルダー、全反射板、遮光ハウ
ジング、リレーレンズの代りにテーパーファイバー、超
高感度ＣＣＤカメラ或いは超高感冷却型ＣＣＤカメラ、
コントローラー、イメージプロセッサ、データ解析装
置、及びテレビモニター等から構成されており、特にテ
ーパーファイバーを装着したＡＲＧＵＳ−５０／ＣＬ
（商品名；浜松ホトニクス社製）及びＲＭＤシステム
（商品名；日本ミリポア・リミテッド）装置が好まし
い。
【００１８】
【作用】本発明で用いる親水性ポリカーボネートメンブ
レンフィルターには比較例で示すように他の親水性メン
ブレンフィルター、例えばポリフッ化ビニルフィルター
やセルロース混合エステルフィルターに比べ、火落菌の
存在を示す発光輝点がより鮮明に検出できるという特長
がある。
レンフィルターには比較例で示すように他の親水性メン
ブレンフィルター、例えばポリフッ化ビニルフィルター
やセルロース混合エステルフィルターに比べ、火落菌の
存在を示す発光輝点がより鮮明に検出できるという特長
がある。
【００１９】加えて、本発明においては、その良好なメ
ンブレンフィルター上で捕捉された火落菌に対して本発
明の好適なＡＴＰ抽出剤を噴霧して用いることにより、
そのままの位置でその中のＡＴＰが簡便・容易に抽出さ
れ、且つその溶媒を室温〜６０℃で速やかに揮散させら
れるので、その上から直接発光試薬を噴霧し発光させて
火落菌を測定できる。
ンブレンフィルター上で捕捉された火落菌に対して本発
明の好適なＡＴＰ抽出剤を噴霧して用いることにより、
そのままの位置でその中のＡＴＰが簡便・容易に抽出さ
れ、且つその溶媒を室温〜６０℃で速やかに揮散させら
れるので、その上から直接発光試薬を噴霧し発光させて
火落菌を測定できる。
【００２０】すなわち、従来用いられる界面活性剤水溶
液を主剤とする抽出剤を使用した場合のように溶剤が蒸
発した後に蒸発残分が残ることはなく、又、トリクロル
酢酸（ＴＣＡ）を用いる場合のように中和の必要がな
く、本発明の好適な前記のＡＴＰ抽出剤を用い、それを
揮散することにより、メンブレンフィルター上に抽出剤
が実質的に残存しないので、抽出剤による発光阻害がな
く、又、ＡＴＰ分解酵素の活性を阻害するので発光減衰
もなく、さらにＡＴＰの拡散もないため火落菌の生菌の
存在局所付近の輝点がシャープになるのである。
液を主剤とする抽出剤を使用した場合のように溶剤が蒸
発した後に蒸発残分が残ることはなく、又、トリクロル
酢酸（ＴＣＡ）を用いる場合のように中和の必要がな
く、本発明の好適な前記のＡＴＰ抽出剤を用い、それを
揮散することにより、メンブレンフィルター上に抽出剤
が実質的に残存しないので、抽出剤による発光阻害がな
く、又、ＡＴＰ分解酵素の活性を阻害するので発光減衰
もなく、さらにＡＴＰの拡散もないため火落菌の生菌の
存在局所付近の輝点がシャープになるのである。
【００２１】又、本発明においては、生物画像解析シス
テムを用いるので、従来の測定方法に比べ、微弱な発光
を高感度で検出することができ、データの処理及び解析
も早いので、上記した本発明のフィルター及び抽出試薬
及びそのスプレー添加の効果と相乗して、極めて簡便・
迅速・高感度な火落菌測定法を実現することができた。
テムを用いるので、従来の測定方法に比べ、微弱な発光
を高感度で検出することができ、データの処理及び解析
も早いので、上記した本発明のフィルター及び抽出試薬
及びそのスプレー添加の効果と相乗して、極めて簡便・
迅速・高感度な火落菌測定法を実現することができた。
【００２２】
【実施例】以下、実施例、比較例で本発明を具体的に説
明する。
明する。
【００２３】実施例１ 真性火落菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔ
ｉｖｏｒａｎｓ ＩＦＯ １３１１８）を除菌ＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液（ｐＨ４．８）で生菌約２０個／mlになるよう
に希釈し検体液とした。その１mlを除菌日本酒に３５０
ml添加し、親水性ポリカーボネートメンブレンフイルタ
ー（日本ミリポアリミテッド製、孔径０．４μｍ、直径
４７mm）を用いて濾過した後、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ
４．８）１００mlで３回洗浄濾過した。
ｉｖｏｒａｎｓ ＩＦＯ １３１１８）を除菌ＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液（ｐＨ４．８）で生菌約２０個／mlになるよう
に希釈し検体液とした。その１mlを除菌日本酒に３５０
ml添加し、親水性ポリカーボネートメンブレンフイルタ
ー（日本ミリポアリミテッド製、孔径０．４μｍ、直径
４７mm）を用いて濾過した後、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ
４．８）１００mlで３回洗浄濾過した。
【００２４】次にそのフイルターを濾過器から取り外
し、前記の第１表に示したＴＭ培地上に置き、３０±１
℃、１６時間、嫌気培養をした。その後、上記のフイル
ターを培地から取り出し、クリーンベンチの中で数分間
放置して乾燥した。続いて、乾燥したフイルターの上か
ら、エチルアルコール９０ｗｔ％とアンモニア水１ｗｔ
％を含有するＡＴＰ抽出試薬を例えば松下電工社製の超
音波式噴霧機により噴霧した。
し、前記の第１表に示したＴＭ培地上に置き、３０±１
℃、１６時間、嫌気培養をした。その後、上記のフイル
ターを培地から取り出し、クリーンベンチの中で数分間
放置して乾燥した。続いて、乾燥したフイルターの上か
ら、エチルアルコール９０ｗｔ％とアンモニア水１ｗｔ
％を含有するＡＴＰ抽出試薬を例えば松下電工社製の超
音波式噴霧機により噴霧した。
【００２５】このＡＴＰ抽出試薬の噴霧によりフイルタ
ー上に捕捉されている火落菌からＡＴＰが抽出される。
そのまま数分間放置して該抽出試薬を揮散せしめた後、
そのフィルターの上から（株）キッコーマンから市販さ
れているルシフェリン−ルシフェラーゼ発光試薬を上記
した噴霧機により噴霧添加する。
ー上に捕捉されている火落菌からＡＴＰが抽出される。
そのまま数分間放置して該抽出試薬を揮散せしめた後、
そのフィルターの上から（株）キッコーマンから市販さ
れているルシフェリン−ルシフェラーゼ発光試薬を上記
した噴霧機により噴霧添加する。
【００２６】次に、その発光試薬を噴霧したフイルター
（標本）を直ちに前記の発光画像解析システム装置に装
着し、その発光揮点を撮像し、該装置によって自動的に
検体中の火落菌の生菌数を測定した。その結果を第２表
に示す。又、比較のために実施例の検体液の１部を常法
のメンブレンフイルター法（ＭＦ法と略記する）によっ
て４日間培養し、膜あたりのコロニー数（ＣＦＵ／膜）
を目視で計数した結果も第２表に示す。第２表より火落
菌の生菌数をＭＦ法で測定した測定結果と本発明の方法
で得た測定結果との間に有意差がないことがわかる。
（標本）を直ちに前記の発光画像解析システム装置に装
着し、その発光揮点を撮像し、該装置によって自動的に
検体中の火落菌の生菌数を測定した。その結果を第２表
に示す。又、比較のために実施例の検体液の１部を常法
のメンブレンフイルター法（ＭＦ法と略記する）によっ
て４日間培養し、膜あたりのコロニー数（ＣＦＵ／膜）
を目視で計数した結果も第２表に示す。第２表より火落
菌の生菌数をＭＦ法で測定した測定結果と本発明の方法
で得た測定結果との間に有意差がないことがわかる。
【００２７】
【表２】
【００２８】実施例２〜８ 火落菌を第３表（１），（２）に示すように変えた他は
実施例１と同様にして測定した。結果を第３表（１），
（２）に示す。また、比較のため夫々の検体液につき公
定のＭＦ法で測定した結果も第３表（１），（２）に示
す。第３表（１），（２）にみるように両方法の結果に
有意差はなかった。
実施例１と同様にして測定した。結果を第３表（１），
（２）に示す。また、比較のため夫々の検体液につき公
定のＭＦ法で測定した結果も第３表（１），（２）に示
す。第３表（１），（２）にみるように両方法の結果に
有意差はなかった。
【００２９】
【表３】
【００３０】
【表４】
【００３１】比較例１ 前培養の培地をＳＩ培地（日本醸造協会）に変えた他は
実施例１と同様にして測定したところ、フィルター（標
本）のバックグラウンドが強烈な発光をしてしまい、火
落菌から抽出されたＡＴＰの発光輝点との区別が不可能
になり、火落菌の生菌数の測定ができなかった。
実施例１と同様にして測定したところ、フィルター（標
本）のバックグラウンドが強烈な発光をしてしまい、火
落菌から抽出されたＡＴＰの発光輝点との区別が不可能
になり、火落菌の生菌数の測定ができなかった。
【００３２】比較例２，３ メンブレンフィルターを親水性ポリフッ化ビニルメンブ
レンフィルター（比較例２）と親水性セルロース混合エ
ステルメンブレンフィルター（比較例３）に変えた他は
実施例１と同様の処理をし、発光試薬を噴霧してフィル
ター（標本）を調製した。両者の標本の輝点を目視によ
り観察したところ、本発明の標本にはっきり輝点がある
のに対し、比較例２及び３の標本には輝点が全く見出せ
なかった。又、ＭＦ法で５日間培養した標本に於ても、
本発明のフィルター標本のコロニーに比べ、引用例２、
３の標本のコロニーの大きさが小さいことが確認され
た。
レンフィルター（比較例２）と親水性セルロース混合エ
ステルメンブレンフィルター（比較例３）に変えた他は
実施例１と同様の処理をし、発光試薬を噴霧してフィル
ター（標本）を調製した。両者の標本の輝点を目視によ
り観察したところ、本発明の標本にはっきり輝点がある
のに対し、比較例２及び３の標本には輝点が全く見出せ
なかった。又、ＭＦ法で５日間培養した標本に於ても、
本発明のフィルター標本のコロニーに比べ、引用例２、
３の標本のコロニーの大きさが小さいことが確認され
た。
【００３３】
【発明の効果】本発明によれば、従来３〜１０日間とい
う長時間を要していた日本酒中の火落菌の検査が僅か１
日以内に、しかも簡便で迅速且つ高感度で行うことがで
きる。したがって、本発明の測定法により日本酒の火落
ちが簡便・迅速・高感度で予知できるようになり、日本
酒貯蔵中の火落ち防止対策が的確にとれるようになった
効果は当業界において極めて大きいといえる。
う長時間を要していた日本酒中の火落菌の検査が僅か１
日以内に、しかも簡便で迅速且つ高感度で行うことがで
きる。したがって、本発明の測定法により日本酒の火落
ちが簡便・迅速・高感度で予知できるようになり、日本
酒貯蔵中の火落ち防止対策が的確にとれるようになった
効果は当業界において極めて大きいといえる。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年８月３０日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１２】
【表１】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２３】実施例１ 真性火落菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔ
ｉｖｏｒａｎｓ ＩＦＯ １３１１８）を除菌ＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液（ｐＨ４．８）で生菌約２０個／mlになるよう
に希釈し検体液とした。その１mlを除菌日本酒３５０ml
に添加し、親水性ポリカーボネートメンブレンフイルタ
ー（日本ミリポアリミテッド製、孔径０．４μｍ、直径
４７mm）を用いて濾過した後、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ
４．８）１００mlで３回洗浄濾過した。
ｉｖｏｒａｎｓ ＩＦＯ １３１１８）を除菌ＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液（ｐＨ４．８）で生菌約２０個／mlになるよう
に希釈し検体液とした。その１mlを除菌日本酒３５０ml
に添加し、親水性ポリカーボネートメンブレンフイルタ
ー（日本ミリポアリミテッド製、孔径０．４μｍ、直径
４７mm）を用いて濾過した後、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ
４．８）１００mlで３回洗浄濾過した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２８】実施例２〜８ 火落菌を第３表（１），（２）に示すように変えた他は
実施例１と同様にして測定した。結果を第３表（１），
（２）に示す。また、比較のため夫々の検体液につき常
法のＭＦ法で測定した結果も第３表（１），（２）に示
す。なお、ＭＦ法は培養時間を８日間にて行った。第３
表（１），（２）にみるように両方法の結果に有意差は
なかった。
実施例１と同様にして測定した。結果を第３表（１），
（２）に示す。また、比較のため夫々の検体液につき常
法のＭＦ法で測定した結果も第３表（１），（２）に示
す。なお、ＭＦ法は培養時間を８日間にて行った。第３
表（１），（２）にみるように両方法の結果に有意差は
なかった。
Claims (6)
- 【請求項１】 日本酒を親水性ポリカーボネートメンブ
レンフィルターで濾過し、その日本酒中に含まれている
火落菌を該フィルター上に捕捉し、次いで火落菌用培地
を用いてその火落菌を該フィルター上で培養した後、そ
のフィルターの上からアデノシン−３−リン酸（ＡＴ
Ｐ）抽出試薬を噴霧して火落菌中のＡＴＰを抽出し、続
いてその上にルシフェリン−ルシフェラーゼ発光試薬を
噴霧して該ＡＴＰを発光せしめた後、直ちに以上の処理
をしたフィルターを生物発光画像解析システム装置に装
着してその輝点を撮像し、生菌数を測定することを特徴
とする日本酒中の火落菌の測定方法。 - 【請求項２】 火落菌の培地がトリプトン、酵母エキ
ス、大豆ペプトン（窒素源）、及びブドウ糖（炭素
源）、及びマグネシウムとマンガンの硫酸塩（ミネラ
ル）、及びメバロン酸、パントテン酸、葉酸、寒天、エ
タノール、蒸留水からなるＴＭ培地である請求項１記載
の火落菌の測定方法。 - 【請求項３】 ＴＭ培地が夫々に、大凡トリプトン１５
ｇ、酵母エキス５ｇ、大豆ペプトン１０ｇ、ブドウ糖２
５ｇ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０１ｇ、ＭｎＳＯ4
・４〜５Ｈ2 Ｏ ０．０１ｇ、メバロン酸０．０５〜
０．１ｇ、パントテン酸ナトリウム０．００１ｇ、寒天
１３ｇ、エタノール（９９．５％）９０ml、蒸留水９０
０ml、ｐＨ４．８〜４．９の組成及びｐＨである請求項
２記載の火落菌の測定方法。 - 【請求項４】 ＡＴＰ抽出試薬がアルコールである請求
項１記載の火落菌の測定方法。 - 【請求項５】 アルコールがエタノール又はメタノール
である請求項４記載の火落菌の測定方法。 - 【請求項６】 生物発光画像解析システム装置がテーパ
ーファイバー付のものであり、且つ超高感度冷却型ＣＣ
Ｄカメラを構成要素として有するものである請求項１記
載の火落菌の測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16986893A JP3453168B2 (ja) | 1993-06-17 | 1993-06-17 | 火落菌の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16986893A JP3453168B2 (ja) | 1993-06-17 | 1993-06-17 | 火落菌の測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07195A true JPH07195A (ja) | 1995-01-06 |
| JP3453168B2 JP3453168B2 (ja) | 2003-10-06 |
Family
ID=15894443
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16986893A Expired - Fee Related JP3453168B2 (ja) | 1993-06-17 | 1993-06-17 | 火落菌の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3453168B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020003120A1 (en) * | 2018-06-29 | 2020-01-02 | 3M Innovative Properties Company | Culture and/or enumeration of hiochi and hiochi-natured bacteria and kits useful for the same |
-
1993
- 1993-06-17 JP JP16986893A patent/JP3453168B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020003120A1 (en) * | 2018-06-29 | 2020-01-02 | 3M Innovative Properties Company | Culture and/or enumeration of hiochi and hiochi-natured bacteria and kits useful for the same |
| JP2021529521A (ja) * | 2018-06-29 | 2021-11-04 | スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー | 火落菌及び火落性菌の培養及び／又は計数並びにそれに有用なキット |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3453168B2 (ja) | 2003-10-06 |
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