JPH07184659A - イネ病害抵抗性関連遺伝子 - Google Patents
イネ病害抵抗性関連遺伝子Info
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- JPH07184659A JPH07184659A JP5349043A JP34904393A JPH07184659A JP H07184659 A JPH07184659 A JP H07184659A JP 5349043 A JP5349043 A JP 5349043A JP 34904393 A JP34904393 A JP 34904393A JP H07184659 A JPH07184659 A JP H07184659A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 イネを病害抵抗性誘導物質であるプロベナゾ
ールで処理した際にイネ植物体中に発現し、かつ病原菌
の感染により発現する遺伝子のｃＤＮＡを提供する。ま
た、単離された該遺伝子によりコードされる蛋白質を提
供する。 【効果】 本発明のＤＮＡ をプローブとして用いるこ
とにより、病害抵抗性を誘導する物質のスクリーニング
に利用することが可能であり、イネのジェノミックライ
ブラリーから、該遺伝子の発現調節部位をクローニング
することもできる。また植物におけるプロベナゾール処
理や病原菌の感染の有無について調べることもできる。
さらには、適当なプロモーターに本発明ＤＮＡを連結し
たキメラ遺伝子を作成し、植物に導入することにより、
病害抵抗性の形質転換植物を作出することも可能であ
る。
ールで処理した際にイネ植物体中に発現し、かつ病原菌
の感染により発現する遺伝子のｃＤＮＡを提供する。ま
た、単離された該遺伝子によりコードされる蛋白質を提
供する。 【効果】 本発明のＤＮＡ をプローブとして用いるこ
とにより、病害抵抗性を誘導する物質のスクリーニング
に利用することが可能であり、イネのジェノミックライ
ブラリーから、該遺伝子の発現調節部位をクローニング
することもできる。また植物におけるプロベナゾール処
理や病原菌の感染の有無について調べることもできる。
さらには、適当なプロモーターに本発明ＤＮＡを連結し
たキメラ遺伝子を作成し、植物に導入することにより、
病害抵抗性の形質転換植物を作出することも可能であ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、イネの病害抵抗性に関
連する遺伝子のｃＤＮＡに関し、また該ｃＤＮＡがコー
ドする蛋白質に関する。
連する遺伝子のｃＤＮＡに関し、また該ｃＤＮＡがコー
ドする蛋白質に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】今日
では、植物の病害を防除するためには、病原菌に直接の
殺菌効果を有する化学薬剤が主に用いられている。これ
らの薬剤は、実用化された当初は非常に強い防除効果を
示すものの、病原菌の耐性菌株の出現により、その薬剤
の防除効果が次第に弱まることが問題になっている。
では、植物の病害を防除するためには、病原菌に直接の
殺菌効果を有する化学薬剤が主に用いられている。これ
らの薬剤は、実用化された当初は非常に強い防除効果を
示すものの、病原菌の耐性菌株の出現により、その薬剤
の防除効果が次第に弱まることが問題になっている。
【０００３】このような事情において、当社の開発した
イネいもち病防除剤であるオリゼメート粒剤は、その作
用成分であるプロベナゾールが直接の抗菌力をもたない
けれども植物の病害抵抗性を高めることにより病害を防
除することから（関沢ら；日本農薬学会誌，６，２４７
−２５５頁、１９８１年）、これまでのところ耐性菌の
出現が問題となっておらず、理想的な薬剤と言える。さ
らにプロベナゾールは、真菌の引き起こすイネいもち病
だけでなく、細菌の引き起こすキュウリ斑点細菌病やキ
ャベツ黒腐病などに対しても防除効果があり、この広い
作用スペクトラムも植物の病害抵抗性を誘導するといっ
た作用機構に付随したものであると考えられる。
イネいもち病防除剤であるオリゼメート粒剤は、その作
用成分であるプロベナゾールが直接の抗菌力をもたない
けれども植物の病害抵抗性を高めることにより病害を防
除することから（関沢ら；日本農薬学会誌，６，２４７
−２５５頁、１９８１年）、これまでのところ耐性菌の
出現が問題となっておらず、理想的な薬剤と言える。さ
らにプロベナゾールは、真菌の引き起こすイネいもち病
だけでなく、細菌の引き起こすキュウリ斑点細菌病やキ
ャベツ黒腐病などに対しても防除効果があり、この広い
作用スペクトラムも植物の病害抵抗性を誘導するといっ
た作用機構に付随したものであると考えられる。
【０００４】プロベナゾール以外の病害抵抗性を誘導す
る薬剤としては、Ｎ−シアノメチル−２−クロロ−イソ
ニコチン酸 (Seguchi, K. et al.；J. Pesticide Sci.,
１７，１０７−１１３頁，１９９２年）、２，６−ジク
ロロ−イソニコチン酸(Metraux, J. P. et al.；Advanc
es in Molecular Genetics of Plant-Microbe Interact
ions, Vol.１，４３２−４３９頁，１９９１年）などが
知られているが、これらは実用化には至っていない。
る薬剤としては、Ｎ−シアノメチル−２−クロロ−イソ
ニコチン酸 (Seguchi, K. et al.；J. Pesticide Sci.,
１７，１０７−１１３頁，１９９２年）、２，６−ジク
ロロ−イソニコチン酸(Metraux, J. P. et al.；Advanc
es in Molecular Genetics of Plant-Microbe Interact
ions, Vol.１，４３２−４３９頁，１９９１年）などが
知られているが、これらは実用化には至っていない。
【０００５】プロベナゾールは上記のように理想的な薬
剤ではあるが、イネいもち病菌以外の真菌が引き起こす
病害に対しては、病害抵抗性を誘導するといった前記の
作用機構から期待されるほどの防除効果を実際には示す
わけではない。プロベナゾールと類似の作用機構を持つ
が、異なる化学構造の化合物を効率的にスクリーニング
できる手段を入手することができれば、プロベナゾール
以上の薬剤を開発することが可能であると考えられる。
剤ではあるが、イネいもち病菌以外の真菌が引き起こす
病害に対しては、病害抵抗性を誘導するといった前記の
作用機構から期待されるほどの防除効果を実際には示す
わけではない。プロベナゾールと類似の作用機構を持つ
が、異なる化学構造の化合物を効率的にスクリーニング
できる手段を入手することができれば、プロベナゾール
以上の薬剤を開発することが可能であると考えられる。
【０００６】プロベナゾール処理された植物が病害抵抗
性を獲得する作用機構として、病害抵抗性に関与する一
群の遺伝子の発現が関わっていると考えられている。そ
の発現のためのこれらの遺伝子の一個またはそれ以上の
転写を先ず誘導できる物質は、プロベナゾール同様、病
害抵抗性誘導物質であることが期待される。これらの遺
伝子を単離してＤＮＡプローブとして用いることができ
れば、効率的な病害抵抗性誘導物質のスクリーニングを
行うことができると期待できる。しかし、プロベナゾー
ル処理により転写を誘導される遺伝子の存在は示唆され
ているものの（南ら；植物防疫，４６，３２−３５頁，
１９９２年）、その単離も、それのＤＮＡ配列も報告さ
れておらず、現在のところ上記の期待に利用できる遺伝
子はない。
性を獲得する作用機構として、病害抵抗性に関与する一
群の遺伝子の発現が関わっていると考えられている。そ
の発現のためのこれらの遺伝子の一個またはそれ以上の
転写を先ず誘導できる物質は、プロベナゾール同様、病
害抵抗性誘導物質であることが期待される。これらの遺
伝子を単離してＤＮＡプローブとして用いることができ
れば、効率的な病害抵抗性誘導物質のスクリーニングを
行うことができると期待できる。しかし、プロベナゾー
ル処理により転写を誘導される遺伝子の存在は示唆され
ているものの（南ら；植物防疫，４６，３２−３５頁，
１９９２年）、その単離も、それのＤＮＡ配列も報告さ
れておらず、現在のところ上記の期待に利用できる遺伝
子はない。
【０００７】このような遺伝子は、単離して採取できれ
ば、ＤＮＡプローブとして用いることにより、新たな病
害抵抗性誘導物質のスクリーニングに利用できる。その
上、このようなＤＮＡプローブを用いると、イネのジェ
ノミックライブラリーから、該遺伝子並びにそれの前方
に連結する転写調節部位のスクリーニングとクローニン
グをすることができる。また、植物体でのプロベナゾー
ル処理の有無を検出することもできる。さらにその遺伝
子を直接に植物体に導入して強く発現させることによ
り、病害抵抗性の形質転換された植物を作出することも
可能であると考えられる。
ば、ＤＮＡプローブとして用いることにより、新たな病
害抵抗性誘導物質のスクリーニングに利用できる。その
上、このようなＤＮＡプローブを用いると、イネのジェ
ノミックライブラリーから、該遺伝子並びにそれの前方
に連結する転写調節部位のスクリーニングとクローニン
グをすることができる。また、植物体でのプロベナゾー
ル処理の有無を検出することもできる。さらにその遺伝
子を直接に植物体に導入して強く発現させることによ
り、病害抵抗性の形質転換された植物を作出することも
可能であると考えられる。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、プロベナ
ゾール処理することにより病害抵抗性の誘導されたイネ
における、プロベナゾール処理により転写を誘導された
遺伝子をディファレンシセルスクリーニングにより同
定、選抜してクローニングする研究を行った。この研究
に当って、先ずプロベナゾール処理したイネの全ＲＮＡ
からｍＲＮＡを精製し、これからｃＤＮＡライブラリー
を作成した。他方、病害抵抗性をほとんど誘導しないプ
ロベナゾール類縁体であるＮ−ブチルサッカリンで処理
されて病害抵抗性を弱く誘導されたイネのＲＮＡを鋳型
としてＲＩラベルしたｃＤＮＡプローブを調製し、また
プロベナール処理されて病害抵抗性を強く得たイネの全
ＲＮＡを鋳型として用いて、ＲＩラベルしたｃＤＮＡプ
ローブをも調製し、これらプローブを用い、前記のｃＤ
ＮＡライブラリーから、後記の実施例１で詳述するよう
に操作して、目的とする遺伝子の選抜とクローニングに
成功した。また該遺伝子のＤＮＡ配列を決定して、新規
なｃＤＮＡの作製にも成功した。これらに基づいて、本
発明を完成するに至った。
ゾール処理することにより病害抵抗性の誘導されたイネ
における、プロベナゾール処理により転写を誘導された
遺伝子をディファレンシセルスクリーニングにより同
定、選抜してクローニングする研究を行った。この研究
に当って、先ずプロベナゾール処理したイネの全ＲＮＡ
からｍＲＮＡを精製し、これからｃＤＮＡライブラリー
を作成した。他方、病害抵抗性をほとんど誘導しないプ
ロベナゾール類縁体であるＮ−ブチルサッカリンで処理
されて病害抵抗性を弱く誘導されたイネのＲＮＡを鋳型
としてＲＩラベルしたｃＤＮＡプローブを調製し、また
プロベナール処理されて病害抵抗性を強く得たイネの全
ＲＮＡを鋳型として用いて、ＲＩラベルしたｃＤＮＡプ
ローブをも調製し、これらプローブを用い、前記のｃＤ
ＮＡライブラリーから、後記の実施例１で詳述するよう
に操作して、目的とする遺伝子の選抜とクローニングに
成功した。また該遺伝子のＤＮＡ配列を決定して、新規
なｃＤＮＡの作製にも成功した。これらに基づいて、本
発明を完成するに至った。
【０００９】すなわち、第１の本発明によると、後記の
配列表の配列番号１の塩基配列または該塩基配列の一部
からなるＤＮＡが提供される。
配列表の配列番号１の塩基配列または該塩基配列の一部
からなるＤＮＡが提供される。
【００１０】第１の本発明により提供されて後記の配列
表の配列番号１に示された塩基配列を有するＤＮＡは、
イネのプロベナゾール処理でイネ植物体中に誘導されて
病害抵抗性の発現に寄与するＰＲ蛋白質(Pathogenesis
Related Protein)またはこれの前駆体ポリペプチドをコ
ードする機能をもつと考えられる。
表の配列番号１に示された塩基配列を有するＤＮＡは、
イネのプロベナゾール処理でイネ植物体中に誘導されて
病害抵抗性の発現に寄与するＰＲ蛋白質(Pathogenesis
Related Protein)またはこれの前駆体ポリペプチドをコ
ードする機能をもつと考えられる。
【００１１】また、第１の本発明により提供されて、し
かも配列表の配列番号１に示された塩基配列の一部から
なるＤＮＡとは、該塩基配列の全体を縮重することによ
る改変体であって該塩基配列の全体と同じ機能をもつＤ
ＮＡ配列を意味することができる。また、該塩基配列の
全体のうちから一部分の塩基を欠失された残りの塩基配
列を意味することもできる。
かも配列表の配列番号１に示された塩基配列の一部から
なるＤＮＡとは、該塩基配列の全体を縮重することによ
る改変体であって該塩基配列の全体と同じ機能をもつＤ
ＮＡ配列を意味することができる。また、該塩基配列の
全体のうちから一部分の塩基を欠失された残りの塩基配
列を意味することもできる。
【００１２】更に、第１の本発明により提供されて配列
表の配列番号１に示された塩基配列を有するＤＮＡから
推測されて蛋白質のアミノ酸配列が本発明者らにより決
定された。
表の配列番号１に示された塩基配列を有するＤＮＡから
推測されて蛋白質のアミノ酸配列が本発明者らにより決
定された。
【００１３】従って、第２の本発明によると、配列表の
配列番号２のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の一部
からなる蛋白質が提供される。
配列番号２のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の一部
からなる蛋白質が提供される。
【００１４】この蛋白質は第１の本発明のｃＤＮＡによ
りコードされる蛋白質であり、ＰＲ蛋白質の一種または
それの前駆体である。
りコードされる蛋白質であり、ＰＲ蛋白質の一種または
それの前駆体である。
【００１５】
【実施例】以下に、本発明のcDNAの製造方法を実施例１
について詳述する。
について詳述する。
【００１６】実施例１ （Ａ）プロベナール処理で転写誘導される遺伝子の選抜
とクローニング １．全ＲＮＡの抽出 病害抵抗性をほとんど誘導しないプロベナゾール類縁体
であるＮ−ブチルサッカリンを対照として用い、播種後
２週間目のイネ(Oryza sativa L. cv Jikkoku)に、１０
０ｐｐｍ の濃度で温室内にてＮ−ブチルサッカリンの
水面施用を行った。
とクローニング １．全ＲＮＡの抽出 病害抵抗性をほとんど誘導しないプロベナゾール類縁体
であるＮ−ブチルサッカリンを対照として用い、播種後
２週間目のイネ(Oryza sativa L. cv Jikkoku)に、１０
０ｐｐｍ の濃度で温室内にてＮ−ブチルサッカリンの
水面施用を行った。
【００１７】処理後１０日目に茎葉部を収穫し、液体窒
素により凍らせた組織をワーリングブレンダーで破砕し
た。破砕組織に 2.5倍容のＧＴＣ溶液（４Ｍグアニジン
チオシアネート、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、１００
ｍＭβ−メルカプトエタノール、１６ｍＭラウロイルサ
ルコシン酸ナトリウム）を添加し、撹拌後ナイロンメッ
シュで濾過した。濾液を遠心（１５０００ｒｐｍ、１０
分間、２０℃）した後、上清２ｍｌに対して塩化セシウ
ム１ｇを添加して溶解し、 5.7Ｍ塩化セシウム2.5ｍｌ
を入れた遠心管に１０ｍｌずつ重層した。その後、遠心
（２５０００ｒｐｍ、２０時間、２０℃）した。
素により凍らせた組織をワーリングブレンダーで破砕し
た。破砕組織に 2.5倍容のＧＴＣ溶液（４Ｍグアニジン
チオシアネート、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、１００
ｍＭβ−メルカプトエタノール、１６ｍＭラウロイルサ
ルコシン酸ナトリウム）を添加し、撹拌後ナイロンメッ
シュで濾過した。濾液を遠心（１５０００ｒｐｍ、１０
分間、２０℃）した後、上清２ｍｌに対して塩化セシウ
ム１ｇを添加して溶解し、 5.7Ｍ塩化セシウム2.5ｍｌ
を入れた遠心管に１０ｍｌずつ重層した。その後、遠心
（２５０００ｒｐｍ、２０時間、２０℃）した。
【００１８】沈殿した全ＲＮＡをＴＥ（１０ｍＭ Tris
ＨＣｌ，ｐＨ8.0 、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し、
0.1倍容の３Ｍ酢酸ナトリウム溶液 (ｐＨ5.2)と 2.5倍
容のエタノールを加え、−８０℃に３０分間放置した。
その全ＲＮＡを遠心（１５０００ｒｐｍ、１０分間、４
℃）した後、７０％エタノールで洗浄し、適量のＴＥに
溶解した。こうしてＮ−ブチルサッカリン処理したイネ
由来の全ＲＮＡの溶液を得た。
ＨＣｌ，ｐＨ8.0 、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し、
0.1倍容の３Ｍ酢酸ナトリウム溶液 (ｐＨ5.2)と 2.5倍
容のエタノールを加え、−８０℃に３０分間放置した。
その全ＲＮＡを遠心（１５０００ｒｐｍ、１０分間、４
℃）した後、７０％エタノールで洗浄し、適量のＴＥに
溶解した。こうしてＮ−ブチルサッカリン処理したイネ
由来の全ＲＮＡの溶液を得た。
【００１９】他方、１００ｐｐｍの濃度のプロベナゾー
ルの水面施用で処理された播種後２週間目のイネから、
上記と同じ操作により、プロベナゾール処理したイネ由
来の全ＲＮＡの溶液を得た。
ルの水面施用で処理された播種後２週間目のイネから、
上記と同じ操作により、プロベナゾール処理したイネ由
来の全ＲＮＡの溶液を得た。
【００２０】２．プロベナゾール処理したイネのｃＤＮ
Ａライブラリーの作成 （イ）ｍＲＮＡの精製 Oligotex−ｄＴ３０ <Super>（日本ロッシュ社）を用
い、添付のマニュアルに従って、前記のようにプロベナ
ゾール処理イネから抽出した全ＲＮＡからｍＲＮＡを取
出して精製した。
Ａライブラリーの作成 （イ）ｍＲＮＡの精製 Oligotex−ｄＴ３０ <Super>（日本ロッシュ社）を用
い、添付のマニュアルに従って、前記のようにプロベナ
ゾール処理イネから抽出した全ＲＮＡからｍＲＮＡを取
出して精製した。
【００２１】（ロ）精製ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブ
ラリーの作成 上記の精製ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成することからな
るｃＤＮＡライブラリーの作成は、TimeSaver ｃＤＮＡ
Synthesis kit（ファルマシア社）を用いて行った。合
成したｃＤＮＡのクローニングのためには、λファージ
ベクターとして、λExcell（ファルマシア社）を用い、
合成したｃＤＮＡを添付のマニュアルに従ってベクター
に組み込み、そして組み換えλファージベクターを調製
した。次いで、この組み換えλファージベクターを大腸
菌に感染させ、プレートにて培養し、プラークを形成さ
せた。
ラリーの作成 上記の精製ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成することからな
るｃＤＮＡライブラリーの作成は、TimeSaver ｃＤＮＡ
Synthesis kit（ファルマシア社）を用いて行った。合
成したｃＤＮＡのクローニングのためには、λファージ
ベクターとして、λExcell（ファルマシア社）を用い、
合成したｃＤＮＡを添付のマニュアルに従ってベクター
に組み込み、そして組み換えλファージベクターを調製
した。次いで、この組み換えλファージベクターを大腸
菌に感染させ、プレートにて培養し、プラークを形成さ
せた。
【００２２】Hybond−Ｎ+ メンブレン（アマシャム社）
を、１枚目は１分間、２枚目は３分間プレート上にの
せ、形成されたプラークを付着させた。このようにして
同じプラークが付着したものを２枚ずつ調製した。これ
らメンブランを 0.5Ｍ水酸化ナトリウムにてアルカリ処
理し、メンブラン中の上記の組み換えλファージベクタ
ー由来のＤＮＡを１本鎖に変性、吸着させた。
を、１枚目は１分間、２枚目は３分間プレート上にの
せ、形成されたプラークを付着させた。このようにして
同じプラークが付着したものを２枚ずつ調製した。これ
らメンブランを 0.5Ｍ水酸化ナトリウムにてアルカリ処
理し、メンブラン中の上記の組み換えλファージベクタ
ー由来のＤＮＡを１本鎖に変性、吸着させた。
【００２３】３．ｃＤＮＡプローブの調製 上記のようにして得られた、Ｎ−ブチルサッカリン処理
したイネ由来の全ＲＮＡと、プロベナゾール処理したイ
ネ由来の全ＲＮＡを鋳型として使用し、オリゴ（ｄＴ）
をプライマーとして用い且つ〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰの存
在下、逆転写酵素により、ｃＤＮＡを夫々のプローブと
して合成した。この合成法の詳細を下記に示す。
したイネ由来の全ＲＮＡと、プロベナゾール処理したイ
ネ由来の全ＲＮＡを鋳型として使用し、オリゴ（ｄＴ）
をプライマーとして用い且つ〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰの存
在下、逆転写酵素により、ｃＤＮＡを夫々のプローブと
して合成した。この合成法の詳細を下記に示す。
【００２４】すなわち、プロベナゾールまたはＮ−ブチ
ルサッカリンで処理したイネ由来の全ＲＮＡ17.5μｌ
（２０μｇ）を６５℃で１０分間加熱し急冷した後、反
応液32.5μｌに加え（終濃度５０ｍＭ Tris ＨＣｌ,
ｐＨ8.3 、５０ｍＭ塩化カリウム、４ ｍＭジチオスレ
イトール、１０ｍＭ塩化マグネシウム、３ｍＭ ｄＡＴ
Ｐ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ、９０ＫＢｑ／μｌ〔α−
32Ｐ〕ｄＣＴＰ、１ unit／μｌリボヌクレアーゼイン
ヒビター、 0.1μｇ／μｌオリゴ（ｄＴ）１６、４ｍＭ
ピロリン酸ナトリウム、0.5 units ／μｌ ＡＭＶリバ
ーストランスクリプターゼ 0.4μｇ／μｌ全ＲＮＡ）、
４１℃で２時間反応させた。
ルサッカリンで処理したイネ由来の全ＲＮＡ17.5μｌ
（２０μｇ）を６５℃で１０分間加熱し急冷した後、反
応液32.5μｌに加え（終濃度５０ｍＭ Tris ＨＣｌ,
ｐＨ8.3 、５０ｍＭ塩化カリウム、４ ｍＭジチオスレ
イトール、１０ｍＭ塩化マグネシウム、３ｍＭ ｄＡＴ
Ｐ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ、９０ＫＢｑ／μｌ〔α−
32Ｐ〕ｄＣＴＰ、１ unit／μｌリボヌクレアーゼイン
ヒビター、 0.1μｇ／μｌオリゴ（ｄＴ）１６、４ｍＭ
ピロリン酸ナトリウム、0.5 units ／μｌ ＡＭＶリバ
ーストランスクリプターゼ 0.4μｇ／μｌ全ＲＮＡ）、
４１℃で２時間反応させた。
【００２５】次に、 0.5Ｍ ＥＤＴＡ (ｐＨ8.0)３μ
ｌ、 0.3Ｍ水酸化ナトリウム５０μｌを加え、１００℃
で５分間加熱した。１Ｍ Tris ＨＣｌ (ｐＨ8.0)１５
μｌ、Tris飽和フェノール５０μｌを加えよく混合した
後、遠心（１２０００ｒｐｍ、３分間、室温）し、上層
を別のチューブに移した。グリコーゲン１μｌ、 7.5Ｍ
酢酸アンモニウム６０μｌ、エタノール３６０μｌを加
え、ドライアイス上に１５分間放置した後、静かにチュ
ーブを混ぜながら室温にもどした。遠心後（１２０００
ｒｐｍ、１０分間、室温）、上清を捨てると、合成され
たＲＩラベルされたＤＮＡの沈殿が得られた。これをＴ
Ｅ ５０μｌに溶解し、 7.5Ｍ酢酸アンモニウム２５μ
ｌ、エタノール１５０μｌを加え、再度ドライアイス上
に１５分間放置し、静かにチューブを混ぜながら室温に
戻した。遠心後（１２０００ｒｐｍ、１０分間、室
温）、上清を捨て、合成されたＤＮＡの沈殿を７０％エ
タノールで洗浄した。沈殿を乾燥させた後、ＴＥ ２０
０μｌに溶解した。Ｎ−ブチルサッカリン処理イネ由来
の全ＲＮＡから合成されたＤＮＡプローブと、プロベナ
ゾル処理イネ由来の全ＲＮＡから合成されたＤＮＡプロ
ーブとの両方が得られた。液体シンチレーションカウン
ターでチェレンコフ光を測定し、ディファレンシャルス
クリーニングに用いる２種類のプローブの量を調整し
た。
ｌ、 0.3Ｍ水酸化ナトリウム５０μｌを加え、１００℃
で５分間加熱した。１Ｍ Tris ＨＣｌ (ｐＨ8.0)１５
μｌ、Tris飽和フェノール５０μｌを加えよく混合した
後、遠心（１２０００ｒｐｍ、３分間、室温）し、上層
を別のチューブに移した。グリコーゲン１μｌ、 7.5Ｍ
酢酸アンモニウム６０μｌ、エタノール３６０μｌを加
え、ドライアイス上に１５分間放置した後、静かにチュ
ーブを混ぜながら室温にもどした。遠心後（１２０００
ｒｐｍ、１０分間、室温）、上清を捨てると、合成され
たＲＩラベルされたＤＮＡの沈殿が得られた。これをＴ
Ｅ ５０μｌに溶解し、 7.5Ｍ酢酸アンモニウム２５μ
ｌ、エタノール１５０μｌを加え、再度ドライアイス上
に１５分間放置し、静かにチューブを混ぜながら室温に
戻した。遠心後（１２０００ｒｐｍ、１０分間、室
温）、上清を捨て、合成されたＤＮＡの沈殿を７０％エ
タノールで洗浄した。沈殿を乾燥させた後、ＴＥ ２０
０μｌに溶解した。Ｎ−ブチルサッカリン処理イネ由来
の全ＲＮＡから合成されたＤＮＡプローブと、プロベナ
ゾル処理イネ由来の全ＲＮＡから合成されたＤＮＡプロ
ーブとの両方が得られた。液体シンチレーションカウン
ターでチェレンコフ光を測定し、ディファレンシャルス
クリーニングに用いる２種類のプローブの量を調整し
た。
【００２６】４．ディファレンシャルスクリーニング 上記のプラークが付着して組み換えλファージベクター
由来の１本鎖ＤＮＡを吸着しているHybond−Ｎ+ メンブ
レンの２枚を、それぞれポリエチレン袋に入れ、Hybrid
ization Buffer Tablets（アマシャム社）で調製したバ
ッファーを添加し密封後、６５℃で１時間インキュベー
ションした。これらメンブランに、それぞれに、プロベ
ナゾール処理したイネの全ＲＮＡから調製したｃＤＮＡ
プローブと、Ｎ−ブチルサッカリン処理したイネの全Ｒ
ＮＡから調製したｃＤＮＡプローブとを加え、６５℃で
一晩ハイブリダイゼーションを行った。
由来の１本鎖ＤＮＡを吸着しているHybond−Ｎ+ メンブ
レンの２枚を、それぞれポリエチレン袋に入れ、Hybrid
ization Buffer Tablets（アマシャム社）で調製したバ
ッファーを添加し密封後、６５℃で１時間インキュベー
ションした。これらメンブランに、それぞれに、プロベ
ナゾール処理したイネの全ＲＮＡから調製したｃＤＮＡ
プローブと、Ｎ−ブチルサッカリン処理したイネの全Ｒ
ＮＡから調製したｃＤＮＡプローブとを加え、６５℃で
一晩ハイブリダイゼーションを行った。
【００２７】上記のようにハイブリダイゼーションした
夫々のメンブランに対して、次に、２×ＳＳＣ（１×Ｓ
ＳＣ：１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸）
−0.1％ＳＤＳを加えて室温で２回洗浄した後、１×Ｓ
ＳＣ− 0.1％ＳＤＳを用い、６５℃で１時間洗浄し、さ
らに 0.1×ＳＳＣ− 0.1％ＳＤＳを用い、６５℃で１時
間洗浄した。
夫々のメンブランに対して、次に、２×ＳＳＣ（１×Ｓ
ＳＣ：１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸）
−0.1％ＳＤＳを加えて室温で２回洗浄した後、１×Ｓ
ＳＣ− 0.1％ＳＤＳを用い、６５℃で１時間洗浄し、さ
らに 0.1×ＳＳＣ− 0.1％ＳＤＳを用い、６５℃で１時
間洗浄した。
【００２８】このようにハイブリダイズされてＲＩラベ
ルしたクローンは、オートラジオグラフィーにより検出
した。放射能レベルの比較により、Ｎ−ブチルサッカリ
ン処理イネ由来のｃＤＮＡプローブに比べて、プロベナ
ゾール処理イネ由来のｃＤＮＡプローブに強くハイブリ
ダイズしたスポットを選定し、そして選定されたスポッ
トに対応する寒天培地上のプラークを特定した。このよ
うにすると、培養されたプラークのうち、プロベナゾー
ル処理イネ由来のＤＮＡプローブにより強くハイブリダ
イズするクローンを陽性クローンとして選抜できた。こ
の陽性クローンは、プロベナゾール処理で転写誘導され
た遺伝子を組み入れたλファージベクターを含有すると
認められるので、この陽性クローンから、λExcellに添
付のマニュアルに従って、目的の遺伝子を含有するプラ
スミドベクターを得た。
ルしたクローンは、オートラジオグラフィーにより検出
した。放射能レベルの比較により、Ｎ−ブチルサッカリ
ン処理イネ由来のｃＤＮＡプローブに比べて、プロベナ
ゾール処理イネ由来のｃＤＮＡプローブに強くハイブリ
ダイズしたスポットを選定し、そして選定されたスポッ
トに対応する寒天培地上のプラークを特定した。このよ
うにすると、培養されたプラークのうち、プロベナゾー
ル処理イネ由来のＤＮＡプローブにより強くハイブリダ
イズするクローンを陽性クローンとして選抜できた。こ
の陽性クローンは、プロベナゾール処理で転写誘導され
た遺伝子を組み入れたλファージベクターを含有すると
認められるので、この陽性クローンから、λExcellに添
付のマニュアルに従って、目的の遺伝子を含有するプラ
スミドベクターを得た。
【００２９】（Ｂ）ｃＤＮＡの塩基配列の決定 上記のようにしてスクリーニングおよびクローニングし
たプラスミドベクター中のｃＤＮＡの塩基配列の決定
は、蛍光プライマーサイクルシーケンシングキット（ア
プライドバイオシステムズ社）を用い、添付のマニュア
ルに従って反応を行い、３７０Ａ ＤＮＡシーケンサー
（アプライドバイオシステムズ社）によって解析するこ
とにより行った。
たプラスミドベクター中のｃＤＮＡの塩基配列の決定
は、蛍光プライマーサイクルシーケンシングキット（ア
プライドバイオシステムズ社）を用い、添付のマニュア
ルに従って反応を行い、３７０Ａ ＤＮＡシーケンサー
（アプライドバイオシステムズ社）によって解析するこ
とにより行った。
【００３０】ここで得られたｃＤＮＡが、全長鎖ｃＤＮ
Ａか否かの決定は、該ｃＤＮＡを標識プローブとして用
い、当初の材料として用いたイネから全ＲＮＡ画分を調
製してノーザンブロッティングによる解析を行い、対応
するｍＲＮＡの分子量と該ｃＤＮＡの分子量を比較する
ことにより行った。
Ａか否かの決定は、該ｃＤＮＡを標識プローブとして用
い、当初の材料として用いたイネから全ＲＮＡ画分を調
製してノーザンブロッティングによる解析を行い、対応
するｍＲＮＡの分子量と該ｃＤＮＡの分子量を比較する
ことにより行った。
【００３１】このようにして決定したｃＤＮＡの塩基配
列を後記の配列表１に示した。また該ｃＤＮＡから推測
される蛋白質のアミノ酸配列を配列表２に示した。
列を後記の配列表１に示した。また該ｃＤＮＡから推測
される蛋白質のアミノ酸配列を配列表２に示した。
【００３２】実施例２ イネ処理時の各種薬剤における本発明遺伝子（ｃＤＮ
Ａ）の転写誘導活性を試験するために、次の実験を行っ
た。すなわち、下記の９種の各種薬剤で処理したイネか
ら全ＲＮＡを抽出し、本発明のｃＤＮＡをプローブとし
て用いノーザンハイブリダイゼーションを行った。
Ａ）の転写誘導活性を試験するために、次の実験を行っ
た。すなわち、下記の９種の各種薬剤で処理したイネか
ら全ＲＮＡを抽出し、本発明のｃＤＮＡをプローブとし
て用いノーザンハイブリダイゼーションを行った。
【００３３】試験に用いる全ＲＮＡの抽出は、上記の実
施例１の（Ａ）−１の方法に従って薬剤処理後６日目の
イネから行った。植物バイオテクノロジー実験マニュア
ル「クローニングとシークエンス」（農村文化社，１９
８９）に記載の方法に従って、１０μｇの全ＲＮＡをホ
ルムアルデヒドアガロースゲルを用いて電気泳動して分
画し、分画されたＲＮＡをHybond−Ｎ+ メンブレンにブ
ロッティングした後、ＵＶによりＲＮＡを固定した。
施例１の（Ａ）−１の方法に従って薬剤処理後６日目の
イネから行った。植物バイオテクノロジー実験マニュア
ル「クローニングとシークエンス」（農村文化社，１９
８９）に記載の方法に従って、１０μｇの全ＲＮＡをホ
ルムアルデヒドアガロースゲルを用いて電気泳動して分
画し、分画されたＲＮＡをHybond−Ｎ+ メンブレンにブ
ロッティングした後、ＵＶによりＲＮＡを固定した。
【００３４】本発明によりクローニングした新規なｃＤ
ＮＡに対応するブロッティングされたｍＲＮＡの検出
は、ECL direct nucleic acid labelling and detectio
n systems （アマシャム社）を用いて、添付のマニュア
ルに従って行った。この検出に際して用いられるＤＮＡ
プローブとしては、本発明の新規ｃＤＮＡを含有する実
施例１の〔Ａ〕−４で得られたプラスミドベクターから
EcoRI によりｃＤＮＡ断片を切り出し、Sephaglas Band
Prep Kit（ファルマシア社）を用い、添付のマニュアル
に従って該ｃＤＮＡ断片を精製したものを用いた。ノー
ザンハイブリダイゼーションの結果を図１、図２に示し
た。
ＮＡに対応するブロッティングされたｍＲＮＡの検出
は、ECL direct nucleic acid labelling and detectio
n systems （アマシャム社）を用いて、添付のマニュア
ルに従って行った。この検出に際して用いられるＤＮＡ
プローブとしては、本発明の新規ｃＤＮＡを含有する実
施例１の〔Ａ〕−４で得られたプラスミドベクターから
EcoRI によりｃＤＮＡ断片を切り出し、Sephaglas Band
Prep Kit（ファルマシア社）を用い、添付のマニュアル
に従って該ｃＤＮＡ断片を精製したものを用いた。ノー
ザンハイブリダイゼーションの結果を図１、図２に示し
た。
【００３５】図１は本例で示した種々の薬剤処理による
本発明遺伝子の転写誘導の有無と強弱を示すノーザンハ
イブリダイゼーションの結果を示す写真の複写図であ
る。
本発明遺伝子の転写誘導の有無と強弱を示すノーザンハ
イブリダイゼーションの結果を示す写真の複写図であ
る。
【００３６】図１でレーン１はコントロールの場合；レ
ーン２は１００ｐｐｍエテホン散布の場合；レーン３は
１００ｐｐｍ１−ナフタレン酢酸散布の場合；レーン４
は５０００ｐｐｍサリチル酸ナトリウム散布の場合；レ
ーン５は１０００ｐｐｍ塩化ナトリウム水面施用の場
合；レーン６は１００ｐｐｍプロベナゾール水面施用の
場合；レーン７は１０００ｐｐｍマンニトール水面施用
の場合を示す。
ーン２は１００ｐｐｍエテホン散布の場合；レーン３は
１００ｐｐｍ１−ナフタレン酢酸散布の場合；レーン４
は５０００ｐｐｍサリチル酸ナトリウム散布の場合；レ
ーン５は１０００ｐｐｍ塩化ナトリウム水面施用の場
合；レーン６は１００ｐｐｍプロベナゾール水面施用の
場合；レーン７は１０００ｐｐｍマンニトール水面施用
の場合を示す。
【００３７】図２は本例における種々の薬剤処理による
本発明遺伝子の転写誘導の有無と強弱を示すノーザンハ
イブリダイゼーションの結果を表わす写真の複写図であ
る。
本発明遺伝子の転写誘導の有無と強弱を示すノーザンハ
イブリダイゼーションの結果を表わす写真の複写図であ
る。
【００３８】図２でレーン１はコントロールの場合；レ
ーン２は１００ｐｐｍアリル Ｏ−スルファモイルベン
ゾエート水面施用の場合；レーン３は１００ｐｐｍＮ−
エトキシカルボニルメチルサッカリン水面施用の場合；
レーン４は１００ｐｐｍＮ−ブチルサッカリン水面施用
の場合；レーン５は１００ｐｐｍＮ−シアノメチル−２
−クロロ−イソニコチンアミド水面施用の場合を示す。
ーン２は１００ｐｐｍアリル Ｏ−スルファモイルベン
ゾエート水面施用の場合；レーン３は１００ｐｐｍＮ−
エトキシカルボニルメチルサッカリン水面施用の場合；
レーン４は１００ｐｐｍＮ−ブチルサッカリン水面施用
の場合；レーン５は１００ｐｐｍＮ−シアノメチル−２
−クロロ−イソニコチンアミド水面施用の場合を示す。
【００３９】本発明遺伝子（ｃＤＮＡ）は、次の各種の
薬剤、すなわち、エテホン、１−ナフタレン酢酸、サリ
チル酸ナトリウム、塩化ナトリウム、マンニトール、Ｎ
−エトキシカルボニルメチルサッカリン（病害抵抗性を
誘導しないプロベナゾール類縁体）では転写を誘導され
ない。ディファレンシャルスクリーニングで対照として
用いたＮ−ブチルサッカリンではわずかに誘導された
が、プロベナゾールと同等の作用を示すＮ−シアノメチ
ル−２−クロロ−イソニコチンアミド、アリルＯ−スル
ファモイルベンゾエート（プロベナゾールの代謝物質）
では比較的強い誘導が見られた。
薬剤、すなわち、エテホン、１−ナフタレン酢酸、サリ
チル酸ナトリウム、塩化ナトリウム、マンニトール、Ｎ
−エトキシカルボニルメチルサッカリン（病害抵抗性を
誘導しないプロベナゾール類縁体）では転写を誘導され
ない。ディファレンシャルスクリーニングで対照として
用いたＮ−ブチルサッカリンではわずかに誘導された
が、プロベナゾールと同等の作用を示すＮ−シアノメチ
ル−２−クロロ−イソニコチンアミド、アリルＯ−スル
ファモイルベンゾエート（プロベナゾールの代謝物質）
では比較的強い誘導が見られた。
【００４０】エテホンや１−ナフタレン酢酸処理によっ
ても病害抵抗性は誘導されるものの、その抵抗性に至る
カスケードの中では、プロベナゾールよりも後方に位置
すると考えられており、本発明ｃＤＮＡは、カスケード
の中で比較的早期段階の反応に関わる遺伝子であると考
えられた。このことおよび上記の結果から、本発明ｃＤ
ＮＡは、プローブとして用いることにより、新たな病害
抵抗性誘導物質のスクリーニングに利用することが可能
である。また本発明ｃＤＮＡはイネのジェノミックライ
ブラリーから該遺伝子の転写調節部位のクローニングを
することができ、さらに植物体におけるプロベナゾール
処理の有無を検出することもできる。
ても病害抵抗性は誘導されるものの、その抵抗性に至る
カスケードの中では、プロベナゾールよりも後方に位置
すると考えられており、本発明ｃＤＮＡは、カスケード
の中で比較的早期段階の反応に関わる遺伝子であると考
えられた。このことおよび上記の結果から、本発明ｃＤ
ＮＡは、プローブとして用いることにより、新たな病害
抵抗性誘導物質のスクリーニングに利用することが可能
である。また本発明ｃＤＮＡはイネのジェノミックライ
ブラリーから該遺伝子の転写調節部位のクローニングを
することができ、さらに植物体におけるプロベナゾール
処理の有無を検出することもできる。
【００４１】実施例３ 傷害や病原菌接種による転写誘導 傷害や病原菌接種による本発明遺伝子（ｃＤＮＡ）の転
写誘導について調べるために、傷害または病原菌接種を
受けたイネから全ＲＮＡを抽出し、その全ＲＮＡについ
て実施例２に記載と同様の方法に従ってノーザンハイブ
リダイゼーションを行った。
写誘導について調べるために、傷害または病原菌接種を
受けたイネから全ＲＮＡを抽出し、その全ＲＮＡについ
て実施例２に記載と同様の方法に従ってノーザンハイブ
リダイゼーションを行った。
【００４２】ＲＮＡの抽出は、傷害形成後または病原菌
接種後３日目と６日目に行い、傷害の形成は、葉身およ
び葉鞘部をブラシで数十回たたくことにより行った。ま
た、病原菌接種はイネいもち病菌(Pyricularia oryzae)
の分生胞子を葉身部に散布し、湿度１００％の暗黒下に
２０時間放置することにより行った。このノーザンハイ
ブリダイゼーションの結果を図３に示した。
接種後３日目と６日目に行い、傷害の形成は、葉身およ
び葉鞘部をブラシで数十回たたくことにより行った。ま
た、病原菌接種はイネいもち病菌(Pyricularia oryzae)
の分生胞子を葉身部に散布し、湿度１００％の暗黒下に
２０時間放置することにより行った。このノーザンハイ
ブリダイゼーションの結果を図３に示した。
【００４３】図３は本例における傷害や病原菌接種によ
る本発明遺伝子の転写誘導の有無を示すノーザンブロッ
ティングの結果を表わす写真の複写図である。
る本発明遺伝子の転写誘導の有無を示すノーザンブロッ
ティングの結果を表わす写真の複写図である。
【００４４】図３でレーン１はコントロール（３日目）
の場合；レーン２はコントロール（６日目）の場合；レ
ーン３はいもち病菌接種（３日目）の場合；レーン４は
いもち病菌接種（６日目）の場合；レーン５は傷害（３
日目）；レーン６は傷害（６日目）の場合；レーン７は
１００ｐｐｍプロベナゾール水面施用（３日目）；レー
ン８は１００ｐｐｍプロベナゾール水面施用（６日目）
の場合を示す。
の場合；レーン２はコントロール（６日目）の場合；レ
ーン３はいもち病菌接種（３日目）の場合；レーン４は
いもち病菌接種（６日目）の場合；レーン５は傷害（３
日目）；レーン６は傷害（６日目）の場合；レーン７は
１００ｐｐｍプロベナゾール水面施用（３日目）；レー
ン８は１００ｐｐｍプロベナゾール水面施用（６日目）
の場合を示す。
【００４５】図３に示された結果から見ると、本発明の
ｃＤＮＡは、傷害では誘導されないものの、病原菌接種
により強く誘導され、いわゆるイネのＰＲ(Pathogenesi
s Related)蛋白質をコードしていると考えられた。ＰＲ
蛋白質は、病害抵抗性と密接に関連していると考えられ
ており、非親和性の組み合わせでは、親和性の組み合わ
せよりも早い時期に誘導され、病気に対して抵抗性を示
す働きがある。
ｃＤＮＡは、傷害では誘導されないものの、病原菌接種
により強く誘導され、いわゆるイネのＰＲ(Pathogenesi
s Related)蛋白質をコードしていると考えられた。ＰＲ
蛋白質は、病害抵抗性と密接に関連していると考えられ
ており、非親和性の組み合わせでは、親和性の組み合わ
せよりも早い時期に誘導され、病気に対して抵抗性を示
す働きがある。
【００４６】このことから、本ｃＤＮＡをプローブとし
て用いることにより、病原菌の感染の有無を検出するこ
とができ、さらには、適当なプロモーターにこの遺伝子
（ｃＤＮＡ）を連結したキメラ遺伝子を作成し、植物に
導入することにより、病害抵抗性の形質転換植物を作出
することも可能である。
て用いることにより、病原菌の感染の有無を検出するこ
とができ、さらには、適当なプロモーターにこの遺伝子
（ｃＤＮＡ）を連結したキメラ遺伝子を作成し、植物に
導入することにより、病害抵抗性の形質転換植物を作出
することも可能である。
【００４７】
【発明の効果】本発明の新規なＤＮＡは、プローブとし
て用いることにより、新たな病害抵抗性誘導物質のスク
リーニングに利用することが可能であり、またイネのジ
ェノミックライブラリーから該遺伝子の転写調節部位の
クローニングをすることができる。また、植物体におけ
るプロベナゾール処理や病原菌の感染の有無を検出する
こともできる。さらには、適当なプロモーターに本発明
ｃＤＮＡを連結したキメラ遺伝子を作り、植物に導入す
ることにより、病害抵抗性の形質転換植物を作出するこ
とも可能である。
て用いることにより、新たな病害抵抗性誘導物質のスク
リーニングに利用することが可能であり、またイネのジ
ェノミックライブラリーから該遺伝子の転写調節部位の
クローニングをすることができる。また、植物体におけ
るプロベナゾール処理や病原菌の感染の有無を検出する
こともできる。さらには、適当なプロモーターに本発明
ｃＤＮＡを連結したキメラ遺伝子を作り、植物に導入す
ることにより、病害抵抗性の形質転換植物を作出するこ
とも可能である。
【図１】実施例２で示した種々の場合における薬剤処理
による本発明遺伝子の転写誘導の有無と強弱を示すノー
ザンハイブリダイゼーションの結果を示す写真の複写図
である。
による本発明遺伝子の転写誘導の有無と強弱を示すノー
ザンハイブリダイゼーションの結果を示す写真の複写図
である。
【図２】実施例２で示した種々の場合における薬剤処理
による本発明遺伝子の転写誘導の有無と強弱を示すノー
ザンハイブリダイゼーションの結果を表わす写真の複写
図である。
による本発明遺伝子の転写誘導の有無と強弱を示すノー
ザンハイブリダイゼーションの結果を表わす写真の複写
図である。
【図３】実施例３で示した傷害や病原菌装置による本発
明遺伝子の転写誘導の有無を示すノーザンハイブリダイ
ゼーションの結果を表わす写真の複写図である。 〔配列表〕 配列番号：１ 配列の長さ：８３４ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源：イネ(Oryza sativa L. cv Jikkoku) 配列 配列番号：２ 配列の長さ：１５８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列
明遺伝子の転写誘導の有無を示すノーザンハイブリダイ
ゼーションの結果を表わす写真の複写図である。 〔配列表〕 配列番号：１ 配列の長さ：８３４ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源：イネ(Oryza sativa L. cv Jikkoku) 配列 配列番号：２ 配列の長さ：１５８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年７月１２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、イネの病害抵抗性に関
連する遺伝子のｃＤＮＡに関し、また該ｃＤＮＡがコー
ドする蛋白質に関する。
連する遺伝子のｃＤＮＡに関し、また該ｃＤＮＡがコー
ドする蛋白質に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】今日
では、植物の病害を防除するためには、病原菌に直接の
殺菌効果を有する化学薬剤が主に用いられている。これ
らの薬剤は、実用化された当初は非常に強い防除効果を
示すものの、病原菌の耐性菌株の出現により、その薬剤
の防除効果が次第に弱まることが問題になっている。
では、植物の病害を防除するためには、病原菌に直接の
殺菌効果を有する化学薬剤が主に用いられている。これ
らの薬剤は、実用化された当初は非常に強い防除効果を
示すものの、病原菌の耐性菌株の出現により、その薬剤
の防除効果が次第に弱まることが問題になっている。
【０００３】このような事情において、当社の開発した
イネいもち病防除剤であるオリゼメート粒剤は、その作
用成分であるプロベナゾールが直接の抗菌力をもたない
けれども植物の病害抵抗性を高めることにより病害を防
除することから（関沢ら；日本農薬学会誌，６，２４７
−２５５頁、１９８１年）、これまでのところ耐性菌の
出現が問題となっておらず、理想的な薬剤と言える。さ
らにプロベナゾールは、真菌の引き起こすイネいもち病
だけでなく、細菌の引き起こすキュウリ斑点細菌病やキ
ャベツ黒腐病などに対しても防除効果があり、この広い
作用スペクトラムも植物の病害抵抗性を誘導するといっ
た作用機構に付随したものであると考えられる。
イネいもち病防除剤であるオリゼメート粒剤は、その作
用成分であるプロベナゾールが直接の抗菌力をもたない
けれども植物の病害抵抗性を高めることにより病害を防
除することから（関沢ら；日本農薬学会誌，６，２４７
−２５５頁、１９８１年）、これまでのところ耐性菌の
出現が問題となっておらず、理想的な薬剤と言える。さ
らにプロベナゾールは、真菌の引き起こすイネいもち病
だけでなく、細菌の引き起こすキュウリ斑点細菌病やキ
ャベツ黒腐病などに対しても防除効果があり、この広い
作用スペクトラムも植物の病害抵抗性を誘導するといっ
た作用機構に付随したものであると考えられる。
【０００４】プロベナゾール以外の病害抵抗性を誘導す
る薬剤としては、Ｎ−シアノメチル−２−クロロ−イソ
ニコチン酸 (Seguchi, K. et al.；J. Pesticide Sci.,
１７，１０７−１１３頁，１９９２年）、２，６−ジク
ロロ−イソニコチン酸(Metraux, J. P. et al.；Advanc
es in Molecular Genetics of Plant-Microbe Interact
ions, Vol.１，４３２−４３９頁，１９９１年）などが
知られているが、これらは実用化には至っていない。
る薬剤としては、Ｎ−シアノメチル−２−クロロ−イソ
ニコチン酸 (Seguchi, K. et al.；J. Pesticide Sci.,
１７，１０７−１１３頁，１９９２年）、２，６−ジク
ロロ−イソニコチン酸(Metraux, J. P. et al.；Advanc
es in Molecular Genetics of Plant-Microbe Interact
ions, Vol.１，４３２−４３９頁，１９９１年）などが
知られているが、これらは実用化には至っていない。
【０００５】プロベナゾールは上記のように理想的な薬
剤ではあるが、イネいもち病菌以外の真菌が引き起こす
病害に対しては、病害抵抗性を誘導するといった前記の
作用機構から期待されるほどの防除効果を実際には示す
わけではない。プロベナゾールと類似の作用機構を持つ
が、異なる化学構造の化合物を効率的にスクリーニング
できる手段を入手することができれば、プロベナゾール
以上の薬剤を開発することが可能であると考えられる。
剤ではあるが、イネいもち病菌以外の真菌が引き起こす
病害に対しては、病害抵抗性を誘導するといった前記の
作用機構から期待されるほどの防除効果を実際には示す
わけではない。プロベナゾールと類似の作用機構を持つ
が、異なる化学構造の化合物を効率的にスクリーニング
できる手段を入手することができれば、プロベナゾール
以上の薬剤を開発することが可能であると考えられる。
【０００６】プロベナゾール処理された植物が病害抵抗
性を獲得する作用機構として、病害抵抗性に関与する一
群の遺伝子の発現が関わっていると考えられている。そ
の発現のためのこれらの遺伝子の一個またはそれ以上の
転写を先ず誘導できる物質は、プロベナゾール同様、病
害抵抗性誘導物質であることが期待される。これらの遺
伝子を単離してＤＮＡプローブとして用いることができ
れば、効率的な病害抵抗性誘導物質のスクリーニングを
行うことができると期待できる。しかし、プロベナゾー
ル処理により転写を誘導される遺伝子の存在は示唆され
ているものの（南ら；植物防疫，４６，３２−３５頁，
１９９２年）、その単離も、それのＤＮＡ配列も報告さ
れておらず、現在のところ上記の期待に利用できる遺伝
子はない。
性を獲得する作用機構として、病害抵抗性に関与する一
群の遺伝子の発現が関わっていると考えられている。そ
の発現のためのこれらの遺伝子の一個またはそれ以上の
転写を先ず誘導できる物質は、プロベナゾール同様、病
害抵抗性誘導物質であることが期待される。これらの遺
伝子を単離してＤＮＡプローブとして用いることができ
れば、効率的な病害抵抗性誘導物質のスクリーニングを
行うことができると期待できる。しかし、プロベナゾー
ル処理により転写を誘導される遺伝子の存在は示唆され
ているものの（南ら；植物防疫，４６，３２−３５頁，
１９９２年）、その単離も、それのＤＮＡ配列も報告さ
れておらず、現在のところ上記の期待に利用できる遺伝
子はない。
【０００７】このような遺伝子は、単離して採取できれ
ば、ＤＮＡプローブとして用いることにより、新たな病
害抵抗性誘導物質のスクリーニングに利用できる。その
上、このようなＤＮＡプローブを用いると、イネのジェ
ノミックライブラリーから、該遺伝子並びにそれの前方
に連結する転写調節部位のスクリーニングとクローニン
グをすることができる。また、植物体でのプロベナゾー
ル処理の有無を検出することもできる。さらにその遺伝
子を直接に植物体に導入して強く発現させることによ
り、病害抵抗性の形質転換された植物を作出することも
可能であると考えられる。
ば、ＤＮＡプローブとして用いることにより、新たな病
害抵抗性誘導物質のスクリーニングに利用できる。その
上、このようなＤＮＡプローブを用いると、イネのジェ
ノミックライブラリーから、該遺伝子並びにそれの前方
に連結する転写調節部位のスクリーニングとクローニン
グをすることができる。また、植物体でのプロベナゾー
ル処理の有無を検出することもできる。さらにその遺伝
子を直接に植物体に導入して強く発現させることによ
り、病害抵抗性の形質転換された植物を作出することも
可能であると考えられる。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、プロベナ
ゾール処理することにより病害抵抗性の誘導されたイネ
における、プロベナゾール処理により転写を誘導された
遺伝子をディファレンシセルスクリーニングにより同
定、選抜してクローニングする研究を行った。この研究
に当って、先ずプロベナゾール処理したイネの全ＲＮＡ
からｍＲＮＡを精製し、これからｃＤＮＡライブラリー
を作成した。他方、病害抵抗性をほとんど誘導しないプ
ロベナゾール類縁体であるＮ−ブチルサッカリンで処理
されて病害抵抗性を弱く誘導されたイネのＲＮＡを鋳型
としてＲＩラベルしたｃＤＮＡプローブを調製し、また
プロベナール処理されて病害抵抗性を強く得たイネの全
ＲＮＡを鋳型として用いて、ＲＩラベルしたｃＤＮＡプ
ローブをも調製し、これらプローブを用い、前記のｃＤ
ＮＡライブラリーから、後記の実施例１で詳述するよう
に操作して、目的とする遺伝子の選抜とクローニングに
成功した。また該遺伝子のＤＮＡ配列を決定して、新規
なｃＤＮＡの作製にも成功した。これらに基づいて、本
発明を完成するに至った。
ゾール処理することにより病害抵抗性の誘導されたイネ
における、プロベナゾール処理により転写を誘導された
遺伝子をディファレンシセルスクリーニングにより同
定、選抜してクローニングする研究を行った。この研究
に当って、先ずプロベナゾール処理したイネの全ＲＮＡ
からｍＲＮＡを精製し、これからｃＤＮＡライブラリー
を作成した。他方、病害抵抗性をほとんど誘導しないプ
ロベナゾール類縁体であるＮ−ブチルサッカリンで処理
されて病害抵抗性を弱く誘導されたイネのＲＮＡを鋳型
としてＲＩラベルしたｃＤＮＡプローブを調製し、また
プロベナール処理されて病害抵抗性を強く得たイネの全
ＲＮＡを鋳型として用いて、ＲＩラベルしたｃＤＮＡプ
ローブをも調製し、これらプローブを用い、前記のｃＤ
ＮＡライブラリーから、後記の実施例１で詳述するよう
に操作して、目的とする遺伝子の選抜とクローニングに
成功した。また該遺伝子のＤＮＡ配列を決定して、新規
なｃＤＮＡの作製にも成功した。これらに基づいて、本
発明を完成するに至った。
【０００９】すなわち、第１の本発明によると、後記の
配列表の配列番号１の塩基配列または該塩基配列の一部
からなるＤＮＡが提供される。
配列表の配列番号１の塩基配列または該塩基配列の一部
からなるＤＮＡが提供される。
【００１０】第１の本発明により提供されて後記の配列
表の配列番号１に示された塩基配列を有するＤＮＡは、
イネのプロベナゾール処理でイネ植物体中に誘導されて
病害抵抗性の発現に寄与するＰＲ蛋白質(Pathogenesis
Related Protein)またはこれの前駆体ポリペプチドをコ
ードする機能をもつと考えられる。
表の配列番号１に示された塩基配列を有するＤＮＡは、
イネのプロベナゾール処理でイネ植物体中に誘導されて
病害抵抗性の発現に寄与するＰＲ蛋白質(Pathogenesis
Related Protein)またはこれの前駆体ポリペプチドをコ
ードする機能をもつと考えられる。
【００１１】また、第１の本発明により提供されて、し
かも配列表の配列番号１に示された塩基配列の一部から
なるＤＮＡとは、該塩基配列の全体を縮重することによ
る改変体であって該塩基配列の全体と同じ機能をもつＤ
ＮＡ配列を意味することができる。また、該塩基配列の
全体のうちから一部分の塩基を欠失された残りの塩基配
列を意味することもできる。
かも配列表の配列番号１に示された塩基配列の一部から
なるＤＮＡとは、該塩基配列の全体を縮重することによ
る改変体であって該塩基配列の全体と同じ機能をもつＤ
ＮＡ配列を意味することができる。また、該塩基配列の
全体のうちから一部分の塩基を欠失された残りの塩基配
列を意味することもできる。
【００１２】更に、第１の本発明により提供されて配列
表の配列番号１に示された塩基配列を有するＤＮＡから
推測されて蛋白質のアミノ酸配列が本発明者らにより決
定された。
表の配列番号１に示された塩基配列を有するＤＮＡから
推測されて蛋白質のアミノ酸配列が本発明者らにより決
定された。
【００１３】従って、第２の本発明によると、配列表の
配列番号２のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の一部
からなる蛋白質が提供される。
配列番号２のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の一部
からなる蛋白質が提供される。
【００１４】この蛋白質は第１の本発明のｃＤＮＡによ
りコードされる蛋白質であり、ＰＲ蛋白質の一種または
それの前駆体である。
りコードされる蛋白質であり、ＰＲ蛋白質の一種または
それの前駆体である。
【００１５】
【実施例】以下に、本発明のcDNAの製造方法を実施例１
について詳述する。
について詳述する。
【００１６】実施例１ （Ａ）プロベナール処理で転写誘導される遺伝子の選抜
とクローニング １．全ＲＮＡの抽出 病害抵抗性をほとんど誘導しないプロベナゾール類縁体
であるＮ−ブチルサッカリンを対照として用い、播種後
２週間目のイネ(Oryza sativa L. cv Jikkoku)に、１０
０ｐｐｍ の濃度で温室内にてＮ−ブチルサッカリンの
水面施用を行った。
とクローニング １．全ＲＮＡの抽出 病害抵抗性をほとんど誘導しないプロベナゾール類縁体
であるＮ−ブチルサッカリンを対照として用い、播種後
２週間目のイネ(Oryza sativa L. cv Jikkoku)に、１０
０ｐｐｍ の濃度で温室内にてＮ−ブチルサッカリンの
水面施用を行った。
【００１７】処理後１０日目に茎葉部を収穫し、液体窒
素により凍らせた組織をワーリングブレンダーで破砕し
た。破砕組織に 2.5倍容のＧＴＣ溶液（４Ｍグアニジン
チオシアネート、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、１００
ｍＭβ−メルカプトエタノール、１６ｍＭラウロイルサ
ルコシン酸ナトリウム）を添加し、撹拌後ナイロンメッ
シュで濾過した。濾液を遠心（１５０００ｒｐｍ、１０
分間、２０℃）した後、上清２ｍｌに対して塩化セシウ
ム１ｇを添加して溶解し、 5.7Ｍ塩化セシウム2.5ｍｌ
を入れた遠心管に１０ｍｌずつ重層した。その後、遠心
（２５０００ｒｐｍ、２０時間、２０℃）した。
素により凍らせた組織をワーリングブレンダーで破砕し
た。破砕組織に 2.5倍容のＧＴＣ溶液（４Ｍグアニジン
チオシアネート、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、１００
ｍＭβ−メルカプトエタノール、１６ｍＭラウロイルサ
ルコシン酸ナトリウム）を添加し、撹拌後ナイロンメッ
シュで濾過した。濾液を遠心（１５０００ｒｐｍ、１０
分間、２０℃）した後、上清２ｍｌに対して塩化セシウ
ム１ｇを添加して溶解し、 5.7Ｍ塩化セシウム2.5ｍｌ
を入れた遠心管に１０ｍｌずつ重層した。その後、遠心
（２５０００ｒｐｍ、２０時間、２０℃）した。
【００１８】沈殿した全ＲＮＡをＴＥ（１０ｍＭ Tris
ＨＣｌ，ｐＨ8.0 、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し、
0.1倍容の３Ｍ酢酸ナトリウム溶液 (ｐＨ5.2)と 2.5倍
容のエタノールを加え、−８０℃に３０分間放置した。
その全ＲＮＡを遠心（１５０００ｒｐｍ、１０分間、４
℃）した後、７０％エタノールで洗浄し、適量のＴＥに
溶解した。こうしてＮ−ブチルサッカリン処理したイネ
由来の全ＲＮＡの溶液を得た。
ＨＣｌ，ｐＨ8.0 、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し、
0.1倍容の３Ｍ酢酸ナトリウム溶液 (ｐＨ5.2)と 2.5倍
容のエタノールを加え、−８０℃に３０分間放置した。
その全ＲＮＡを遠心（１５０００ｒｐｍ、１０分間、４
℃）した後、７０％エタノールで洗浄し、適量のＴＥに
溶解した。こうしてＮ−ブチルサッカリン処理したイネ
由来の全ＲＮＡの溶液を得た。
【００１９】他方、１００ｐｐｍの濃度のプロベナゾー
ルの水面施用で処理された播種後２週間目のイネから、
上記と同じ操作により、プロベナゾール処理したイネ由
来の全ＲＮＡの溶液を得た。
ルの水面施用で処理された播種後２週間目のイネから、
上記と同じ操作により、プロベナゾール処理したイネ由
来の全ＲＮＡの溶液を得た。
【００２０】２．プロベナゾール処理したイネのｃＤＮ
Ａライブラリーの作成 （イ）ｍＲＮＡの精製 Oligotex−ｄＴ３０ <Super>（日本ロッシュ社）を用
い、添付のマニュアルに従って、前記のようにプロベナ
ゾール処理イネから抽出した全ＲＮＡからｍＲＮＡを取
出して精製した。
Ａライブラリーの作成 （イ）ｍＲＮＡの精製 Oligotex−ｄＴ３０ <Super>（日本ロッシュ社）を用
い、添付のマニュアルに従って、前記のようにプロベナ
ゾール処理イネから抽出した全ＲＮＡからｍＲＮＡを取
出して精製した。
【００２１】（ロ）精製ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブ
ラリーの作成 上記の精製ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成することからな
るｃＤＮＡライブラリーの作成は、TimeSaver ｃＤＮＡ
Synthesis kit（ファルマシア社）を用いて行った。合
成したｃＤＮＡのクローニングのためには、λファージ
ベクターとして、λExcell（ファルマシア社）を用い、
合成したｃＤＮＡを添付のマニュアルに従ってベクター
に組み込み、そして組み換えλファージベクターを調製
した。次いで、この組み換えλファージベクターを大腸
菌に感染させ、プレートにて培養し、プラークを形成さ
せた。
ラリーの作成 上記の精製ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成することからな
るｃＤＮＡライブラリーの作成は、TimeSaver ｃＤＮＡ
Synthesis kit（ファルマシア社）を用いて行った。合
成したｃＤＮＡのクローニングのためには、λファージ
ベクターとして、λExcell（ファルマシア社）を用い、
合成したｃＤＮＡを添付のマニュアルに従ってベクター
に組み込み、そして組み換えλファージベクターを調製
した。次いで、この組み換えλファージベクターを大腸
菌に感染させ、プレートにて培養し、プラークを形成さ
せた。
【００２２】Hybond−Ｎ+ メンブレン（アマシャム社）
を、１枚目は１分間、２枚目は３分間プレート上にの
せ、形成されたプラークを付着させた。このようにして
同じプラークが付着したものを２枚ずつ調製した。これ
らメンブランを 0.5Ｍ水酸化ナトリウムにてアルカリ処
理し、メンブラン中の上記の組み換えλファージベクタ
ー由来のＤＮＡを１本鎖に変性、吸着させた。
を、１枚目は１分間、２枚目は３分間プレート上にの
せ、形成されたプラークを付着させた。このようにして
同じプラークが付着したものを２枚ずつ調製した。これ
らメンブランを 0.5Ｍ水酸化ナトリウムにてアルカリ処
理し、メンブラン中の上記の組み換えλファージベクタ
ー由来のＤＮＡを１本鎖に変性、吸着させた。
【００２３】３．ｃＤＮＡプローブの調製 上記のようにして得られた、Ｎ−ブチルサッカリン処理
したイネ由来の全ＲＮＡと、プロベナゾール処理したイ
ネ由来の全ＲＮＡを鋳型として使用し、オリゴ（ｄＴ）
をプライマーとして用い且つ〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰの存
在下、逆転写酵素により、ｃＤＮＡを夫々のプローブと
して合成した。この合成法の詳細を下記に示す。
したイネ由来の全ＲＮＡと、プロベナゾール処理したイ
ネ由来の全ＲＮＡを鋳型として使用し、オリゴ（ｄＴ）
をプライマーとして用い且つ〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰの存
在下、逆転写酵素により、ｃＤＮＡを夫々のプローブと
して合成した。この合成法の詳細を下記に示す。
【００２４】すなわち、プロベナゾールまたはＮ−ブチ
ルサッカリンで処理したイネ由来の全ＲＮＡ17.5μｌ
（２０μｇ）を６５℃で１０分間加熱し急冷した後、反
応液32.5μｌに加え（終濃度５０ｍＭ Tris ＨＣｌ,
ｐＨ8.3 、５０ｍＭ塩化カリウム、４ ｍＭジチオスレ
イトール、１０ｍＭ塩化マグネシウム、３ｍＭ ｄＡＴ
Ｐ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ、９０ＫＢｑ／μｌ〔α−
32Ｐ〕ｄＣＴＰ、１ unit／μｌリボヌクレアーゼイン
ヒビター、 0.1μｇ／μｌオリゴ（ｄＴ）１６、４ｍＭ
ピロリン酸ナトリウム、0.5 units ／μｌ ＡＭＶリバ
ーストランスクリプターゼ 0.4μｇ／μｌ全ＲＮＡ）、
４１℃で２時間反応させた。
ルサッカリンで処理したイネ由来の全ＲＮＡ17.5μｌ
（２０μｇ）を６５℃で１０分間加熱し急冷した後、反
応液32.5μｌに加え（終濃度５０ｍＭ Tris ＨＣｌ,
ｐＨ8.3 、５０ｍＭ塩化カリウム、４ ｍＭジチオスレ
イトール、１０ｍＭ塩化マグネシウム、３ｍＭ ｄＡＴ
Ｐ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ、９０ＫＢｑ／μｌ〔α−
32Ｐ〕ｄＣＴＰ、１ unit／μｌリボヌクレアーゼイン
ヒビター、 0.1μｇ／μｌオリゴ（ｄＴ）１６、４ｍＭ
ピロリン酸ナトリウム、0.5 units ／μｌ ＡＭＶリバ
ーストランスクリプターゼ 0.4μｇ／μｌ全ＲＮＡ）、
４１℃で２時間反応させた。
【００２５】次に、 0.5Ｍ ＥＤＴＡ (ｐＨ8.0)３μ
ｌ、 0.3Ｍ水酸化ナトリウム５０μｌを加え、１００℃
で５分間加熱した。１Ｍ Tris ＨＣｌ (ｐＨ8.0)１５
μｌ、Tris飽和フェノール５０μｌを加えよく混合した
後、遠心（１２０００ｒｐｍ、３分間、室温）し、上層
を別のチューブに移した。グリコーゲン１μｌ、 7.5Ｍ
酢酸アンモニウム６０μｌ、エタノール３６０μｌを加
え、ドライアイス上に１５分間放置した後、静かにチュ
ーブを混ぜながら室温にもどした。遠心後（１２０００
ｒｐｍ、１０分間、室温）、上清を捨てると、合成され
たＲＩラベルされたＤＮＡの沈殿が得られた。これをＴ
Ｅ ５０μｌに溶解し、 7.5Ｍ酢酸アンモニウム２５μ
ｌ、エタノール１５０μｌを加え、再度ドライアイス上
に１５分間放置し、静かにチューブを混ぜながら室温に
戻した。遠心後（１２０００ｒｐｍ、１０分間、室
温）、上清を捨て、合成されたＤＮＡの沈殿を７０％エ
タノールで洗浄した。沈殿を乾燥させた後、ＴＥ ２０
０μｌに溶解した。Ｎ−ブチルサッカリン処理イネ由来
の全ＲＮＡから合成されたＤＮＡプローブと、プロベナ
ゾル処理イネ由来の全ＲＮＡから合成されたＤＮＡプロ
ーブとの両方が得られた。液体シンチレーションカウン
ターでチェレンコフ光を測定し、ディファレンシャルス
クリーニングに用いる２種類のプローブの量を調整し
た。
ｌ、 0.3Ｍ水酸化ナトリウム５０μｌを加え、１００℃
で５分間加熱した。１Ｍ Tris ＨＣｌ (ｐＨ8.0)１５
μｌ、Tris飽和フェノール５０μｌを加えよく混合した
後、遠心（１２０００ｒｐｍ、３分間、室温）し、上層
を別のチューブに移した。グリコーゲン１μｌ、 7.5Ｍ
酢酸アンモニウム６０μｌ、エタノール３６０μｌを加
え、ドライアイス上に１５分間放置した後、静かにチュ
ーブを混ぜながら室温にもどした。遠心後（１２０００
ｒｐｍ、１０分間、室温）、上清を捨てると、合成され
たＲＩラベルされたＤＮＡの沈殿が得られた。これをＴ
Ｅ ５０μｌに溶解し、 7.5Ｍ酢酸アンモニウム２５μ
ｌ、エタノール１５０μｌを加え、再度ドライアイス上
に１５分間放置し、静かにチューブを混ぜながら室温に
戻した。遠心後（１２０００ｒｐｍ、１０分間、室
温）、上清を捨て、合成されたＤＮＡの沈殿を７０％エ
タノールで洗浄した。沈殿を乾燥させた後、ＴＥ ２０
０μｌに溶解した。Ｎ−ブチルサッカリン処理イネ由来
の全ＲＮＡから合成されたＤＮＡプローブと、プロベナ
ゾル処理イネ由来の全ＲＮＡから合成されたＤＮＡプロ
ーブとの両方が得られた。液体シンチレーションカウン
ターでチェレンコフ光を測定し、ディファレンシャルス
クリーニングに用いる２種類のプローブの量を調整し
た。
【００２６】４．ディファレンシャルスクリーニング 上記のプラークが付着して組み換えλファージベクター
由来の１本鎖ＤＮＡを吸着しているHybond−Ｎ+ メンブ
レンの２枚を、それぞれポリエチレン袋に入れ、Hybrid
ization Buffer Tablets（アマシャム社）で調製したバ
ッファーを添加し密封後、６５℃で１時間インキュベー
ションした。これらメンブランに、それぞれに、プロベ
ナゾール処理したイネの全ＲＮＡから調製したｃＤＮＡ
プローブと、Ｎ−ブチルサッカリン処理したイネの全Ｒ
ＮＡから調製したｃＤＮＡプローブとを加え、６５℃で
一晩ハイブリダイゼーションを行った。
由来の１本鎖ＤＮＡを吸着しているHybond−Ｎ+ メンブ
レンの２枚を、それぞれポリエチレン袋に入れ、Hybrid
ization Buffer Tablets（アマシャム社）で調製したバ
ッファーを添加し密封後、６５℃で１時間インキュベー
ションした。これらメンブランに、それぞれに、プロベ
ナゾール処理したイネの全ＲＮＡから調製したｃＤＮＡ
プローブと、Ｎ−ブチルサッカリン処理したイネの全Ｒ
ＮＡから調製したｃＤＮＡプローブとを加え、６５℃で
一晩ハイブリダイゼーションを行った。
【００２７】上記のようにハイブリダイゼーションした
夫々のメンブランに対して、次に、２×ＳＳＣ（１×Ｓ
ＳＣ：１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸）
−0.1％ＳＤＳを加えて室温で２回洗浄した後、１×Ｓ
ＳＣ− 0.1％ＳＤＳを用い、６５℃で１時間洗浄し、さ
らに 0.1×ＳＳＣ− 0.1％ＳＤＳを用い、６５℃で１時
間洗浄した。
夫々のメンブランに対して、次に、２×ＳＳＣ（１×Ｓ
ＳＣ：１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸）
−0.1％ＳＤＳを加えて室温で２回洗浄した後、１×Ｓ
ＳＣ− 0.1％ＳＤＳを用い、６５℃で１時間洗浄し、さ
らに 0.1×ＳＳＣ− 0.1％ＳＤＳを用い、６５℃で１時
間洗浄した。
【００２８】このようにハイブリダイズされてＲＩラベ
ルしたクローンは、オートラジオグラフィーにより検出
した。放射能レベルの比較により、Ｎ−ブチルサッカリ
ン処理イネ由来のｃＤＮＡプローブに比べて、プロベナ
ゾール処理イネ由来のｃＤＮＡプローブに強くハイブリ
ダイズしたスポットを選定し、そして選定されたスポッ
トに対応する寒天培地上のプラークを特定した。このよ
うにすると、培養されたプラークのうち、プロベナゾー
ル処理イネ由来のＤＮＡプローブにより強くハイブリダ
イズするクローンを陽性クローンとして選抜できた。こ
の陽性クローンは、プロベナゾール処理で転写誘導され
た遺伝子を組み入れたλファージベクターを含有すると
認められるので、この陽性クローンから、λExcellに添
付のマニュアルに従って、目的の遺伝子を含有するプラ
スミドベクターを得た。
ルしたクローンは、オートラジオグラフィーにより検出
した。放射能レベルの比較により、Ｎ−ブチルサッカリ
ン処理イネ由来のｃＤＮＡプローブに比べて、プロベナ
ゾール処理イネ由来のｃＤＮＡプローブに強くハイブリ
ダイズしたスポットを選定し、そして選定されたスポッ
トに対応する寒天培地上のプラークを特定した。このよ
うにすると、培養されたプラークのうち、プロベナゾー
ル処理イネ由来のＤＮＡプローブにより強くハイブリダ
イズするクローンを陽性クローンとして選抜できた。こ
の陽性クローンは、プロベナゾール処理で転写誘導され
た遺伝子を組み入れたλファージベクターを含有すると
認められるので、この陽性クローンから、λExcellに添
付のマニュアルに従って、目的の遺伝子を含有するプラ
スミドベクターを得た。
【００２９】（Ｂ）ｃＤＮＡの塩基配列の決定 上記のようにしてスクリーニングおよびクローニングし
たプラスミドベクター中のｃＤＮＡの塩基配列の決定
は、蛍光プライマーサイクルシーケンシングキット（ア
プライドバイオシステムズ社）を用い、添付のマニュア
ルに従って反応を行い、３７０Ａ ＤＮＡシーケンサー
（アプライドバイオシステムズ社）によって解析するこ
とにより行った。
たプラスミドベクター中のｃＤＮＡの塩基配列の決定
は、蛍光プライマーサイクルシーケンシングキット（ア
プライドバイオシステムズ社）を用い、添付のマニュア
ルに従って反応を行い、３７０Ａ ＤＮＡシーケンサー
（アプライドバイオシステムズ社）によって解析するこ
とにより行った。
【００３０】ここで得られたｃＤＮＡが、全長鎖ｃＤＮ
Ａか否かの決定は、該ｃＤＮＡを標識プローブとして用
い、当初の材料として用いたイネから全ＲＮＡ画分を調
製してノーザンブロッティングによる解析を行い、対応
するｍＲＮＡの分子量と該ｃＤＮＡの分子量を比較する
ことにより行った。
Ａか否かの決定は、該ｃＤＮＡを標識プローブとして用
い、当初の材料として用いたイネから全ＲＮＡ画分を調
製してノーザンブロッティングによる解析を行い、対応
するｍＲＮＡの分子量と該ｃＤＮＡの分子量を比較する
ことにより行った。
【００３１】このようにして決定したｃＤＮＡの塩基配
列を後記の配列表１に示した。また該ｃＤＮＡから推測
される蛋白質のアミノ酸配列を配列表２に示した。
列を後記の配列表１に示した。また該ｃＤＮＡから推測
される蛋白質のアミノ酸配列を配列表２に示した。
【００３２】実施例２ イネ処理時の各種薬剤における本発明遺伝子（ｃＤＮ
Ａ）の転写誘導活性を試験するために、次の実験を行っ
た。すなわち、下記の９種の各種薬剤で処理したイネか
ら全ＲＮＡを抽出し、本発明のｃＤＮＡをプローブとし
て用いノーザンハイブリダイゼーションを行った。
Ａ）の転写誘導活性を試験するために、次の実験を行っ
た。すなわち、下記の９種の各種薬剤で処理したイネか
ら全ＲＮＡを抽出し、本発明のｃＤＮＡをプローブとし
て用いノーザンハイブリダイゼーションを行った。
【００３３】試験に用いる全ＲＮＡの抽出は、上記の実
施例１の（Ａ）−１の方法に従って薬剤処理後６日目の
イネから行った。植物バイオテクノロジー実験マニュア
ル「クローニングとシークエンス」（農村文化社，１９
８９）に記載の方法に従って、１０μｇの全ＲＮＡをホ
ルムアルデヒドアガロースゲルを用いて電気泳動して分
画し、分画されたＲＮＡをHybond−Ｎ+ メンブレンにブ
ロッティングした後、ＵＶによりＲＮＡを固定した。
施例１の（Ａ）−１の方法に従って薬剤処理後６日目の
イネから行った。植物バイオテクノロジー実験マニュア
ル「クローニングとシークエンス」（農村文化社，１９
８９）に記載の方法に従って、１０μｇの全ＲＮＡをホ
ルムアルデヒドアガロースゲルを用いて電気泳動して分
画し、分画されたＲＮＡをHybond−Ｎ+ メンブレンにブ
ロッティングした後、ＵＶによりＲＮＡを固定した。
【００３４】本発明によりクローニングした新規なｃＤ
ＮＡに対応するブロッティングされたｍＲＮＡの検出
は、ECL direct nucleic acid labelling and detectio
n systems （アマシャム社）を用いて、添付のマニュア
ルに従って行った。この検出に際して用いられるＤＮＡ
プローブとしては、本発明の新規ｃＤＮＡを含有する実
施例１の〔Ａ〕−４で得られたプラスミドベクターから
EcoRI によりｃＤＮＡ断片を切り出し、Sephaglas Band
Prep Kit（ファルマシア社）を用い、添付のマニュアル
に従って該ｃＤＮＡ断片を精製したものを用いた。ノー
ザンハイブリダイゼーションの結果を図１、図２に示し
た。
ＮＡに対応するブロッティングされたｍＲＮＡの検出
は、ECL direct nucleic acid labelling and detectio
n systems （アマシャム社）を用いて、添付のマニュア
ルに従って行った。この検出に際して用いられるＤＮＡ
プローブとしては、本発明の新規ｃＤＮＡを含有する実
施例１の〔Ａ〕−４で得られたプラスミドベクターから
EcoRI によりｃＤＮＡ断片を切り出し、Sephaglas Band
Prep Kit（ファルマシア社）を用い、添付のマニュアル
に従って該ｃＤＮＡ断片を精製したものを用いた。ノー
ザンハイブリダイゼーションの結果を図１、図２に示し
た。
【００３５】図１は本例で示した種々の薬剤処理による
本発明遺伝子の転写誘導の有無と強弱を示すノーザンハ
イブリダイゼーションの結果を示す写真の模写図であ
る。
本発明遺伝子の転写誘導の有無と強弱を示すノーザンハ
イブリダイゼーションの結果を示す写真の模写図であ
る。
【００３６】図１でレーン１はコントロールの場合；レ
ーン２は１００ｐｐｍエテホン散布の場合；レーン３は
１００ｐｐｍ１−ナフタレン酢酸散布の場合；レーン４
は５０００ｐｐｍサリチル酸ナトリウム散布の場合；レ
ーン５は１０００ｐｐｍ塩化ナトリウム水面施用の場
合；レーン６は１００ｐｐｍプロベナゾール水面施用の
場合；レーン７は１０００ｐｐｍマンニトール水面施用
の場合を示す。
ーン２は１００ｐｐｍエテホン散布の場合；レーン３は
１００ｐｐｍ１−ナフタレン酢酸散布の場合；レーン４
は５０００ｐｐｍサリチル酸ナトリウム散布の場合；レ
ーン５は１０００ｐｐｍ塩化ナトリウム水面施用の場
合；レーン６は１００ｐｐｍプロベナゾール水面施用の
場合；レーン７は１０００ｐｐｍマンニトール水面施用
の場合を示す。
【００３７】図２は本例における種々の薬剤処理による
本発明遺伝子の転写誘導の有無と強弱を示すノーザンハ
イブリダイゼーションの結果を表わす写真の模写図であ
る。
本発明遺伝子の転写誘導の有無と強弱を示すノーザンハ
イブリダイゼーションの結果を表わす写真の模写図であ
る。
【００３８】図２でレーン１はコントロールの場合；レ
ーン２は１００ｐｐｍアリル Ｏ−スルファモイルベン
ゾエート水面施用の場合；レーン３は１００ｐｐｍＮ−
エトキシカルボニルメチルサッカリン水面施用の場合；
レーン４は１００ｐｐｍＮ−ブチルサッカリン水面施用
の場合；レーン５は１００ｐｐｍＮ−シアノメチル−２
−クロロ−イソニコチンアミド水面施用の場合を示す。
ーン２は１００ｐｐｍアリル Ｏ−スルファモイルベン
ゾエート水面施用の場合；レーン３は１００ｐｐｍＮ−
エトキシカルボニルメチルサッカリン水面施用の場合；
レーン４は１００ｐｐｍＮ−ブチルサッカリン水面施用
の場合；レーン５は１００ｐｐｍＮ−シアノメチル−２
−クロロ−イソニコチンアミド水面施用の場合を示す。
【００３９】本発明遺伝子（ｃＤＮＡ）は、次の各種の
薬剤、すなわち、エテホン、１−ナフタレン酢酸、サリ
チル酸ナトリウム、塩化ナトリウム、マンニトール、Ｎ
−エトキシカルボニルメチルサッカリン（病害抵抗性を
誘導しないプロベナゾール類縁体）では転写を誘導され
ない。ディファレンシャルスクリーニングで対照として
用いたＮ−ブチルサッカリンではわずかに誘導された
が、プロベナゾールと同等の作用を示すＮ−シアノメチ
ル−２−クロロ−イソニコチンアミド、アリルＯ−スル
ファモイルベンゾエート（プロベナゾールの代謝物質）
では比較的強い誘導が見られた。
薬剤、すなわち、エテホン、１−ナフタレン酢酸、サリ
チル酸ナトリウム、塩化ナトリウム、マンニトール、Ｎ
−エトキシカルボニルメチルサッカリン（病害抵抗性を
誘導しないプロベナゾール類縁体）では転写を誘導され
ない。ディファレンシャルスクリーニングで対照として
用いたＮ−ブチルサッカリンではわずかに誘導された
が、プロベナゾールと同等の作用を示すＮ−シアノメチ
ル−２−クロロ−イソニコチンアミド、アリルＯ−スル
ファモイルベンゾエート（プロベナゾールの代謝物質）
では比較的強い誘導が見られた。
【００４０】エテホンや１−ナフタレン酢酸処理によっ
ても病害抵抗性は誘導されるものの、その抵抗性に至る
カスケードの中では、プロベナゾールよりも後方に位置
すると考えられており、本発明ｃＤＮＡは、カスケード
の中で比較的早期段階の反応に関わる遺伝子であると考
えられた。このことおよび上記の結果から、本発明ｃＤ
ＮＡは、プローブとして用いることにより、新たな病害
抵抗性誘導物質のスクリーニングに利用することが可能
である。また本発明ｃＤＮＡはイネのジェノミックライ
ブラリーから該遺伝子の転写調節部位のクローニングを
することができ、さらに植物体におけるプロベナゾール
処理の有無を検出することもできる。
ても病害抵抗性は誘導されるものの、その抵抗性に至る
カスケードの中では、プロベナゾールよりも後方に位置
すると考えられており、本発明ｃＤＮＡは、カスケード
の中で比較的早期段階の反応に関わる遺伝子であると考
えられた。このことおよび上記の結果から、本発明ｃＤ
ＮＡは、プローブとして用いることにより、新たな病害
抵抗性誘導物質のスクリーニングに利用することが可能
である。また本発明ｃＤＮＡはイネのジェノミックライ
ブラリーから該遺伝子の転写調節部位のクローニングを
することができ、さらに植物体におけるプロベナゾール
処理の有無を検出することもできる。
【００４１】実施例３ 傷害や病原菌接種による転写誘導 傷害や病原菌接種による本発明遺伝子（ｃＤＮＡ）の転
写誘導について調べるために、傷害または病原菌接種を
受けたイネから全ＲＮＡを抽出し、その全ＲＮＡについ
て実施例２に記載と同様の方法に従ってノーザンハイブ
リダイゼーションを行った。
写誘導について調べるために、傷害または病原菌接種を
受けたイネから全ＲＮＡを抽出し、その全ＲＮＡについ
て実施例２に記載と同様の方法に従ってノーザンハイブ
リダイゼーションを行った。
【００４２】ＲＮＡの抽出は、傷害形成後または病原菌
接種後３日目と６日目に行い、傷害の形成は、葉身およ
び葉鞘部をブラシで数十回たたくことにより行った。ま
た、病原菌接種はイネいもち病菌(Pyricularia oryzae)
の分生胞子を葉身部に散布し、湿度１００％の暗黒下に
２０時間放置することにより行った。このノーザンハイ
ブリダイゼーションの結果を図３に示した。
接種後３日目と６日目に行い、傷害の形成は、葉身およ
び葉鞘部をブラシで数十回たたくことにより行った。ま
た、病原菌接種はイネいもち病菌(Pyricularia oryzae)
の分生胞子を葉身部に散布し、湿度１００％の暗黒下に
２０時間放置することにより行った。このノーザンハイ
ブリダイゼーションの結果を図３に示した。
【００４３】図３は本例における傷害や病原菌接種によ
る本発明遺伝子の転写誘導の有無を示すノーザンブロッ
ティングの結果を表わす写真の模写図である。
る本発明遺伝子の転写誘導の有無を示すノーザンブロッ
ティングの結果を表わす写真の模写図である。
【００４４】図３でレーン１はコントロール（３日目）
の場合；レーン２はコントロール（６日目）の場合；レ
ーン３はいもち病菌接種（３日目）の場合；レーン４は
いもち病菌接種（６日目）の場合；レーン５は傷害（３
日目）；レーン６は傷害（６日目）の場合；レーン７は
１００ｐｐｍプロベナゾール水面施用（３日目）；レー
ン８は１００ｐｐｍプロベナゾール水面施用（６日目）
の場合を示す。
の場合；レーン２はコントロール（６日目）の場合；レ
ーン３はいもち病菌接種（３日目）の場合；レーン４は
いもち病菌接種（６日目）の場合；レーン５は傷害（３
日目）；レーン６は傷害（６日目）の場合；レーン７は
１００ｐｐｍプロベナゾール水面施用（３日目）；レー
ン８は１００ｐｐｍプロベナゾール水面施用（６日目）
の場合を示す。
【００４５】図３に示された結果から見ると、本発明の
ｃＤＮＡは、傷害では誘導されないものの、病原菌接種
により強く誘導され、いわゆるイネのＰＲ(Pathogenesi
s Related)蛋白質をコードしていると考えられた。ＰＲ
蛋白質は、病害抵抗性と密接に関連していると考えられ
ており、非親和性の組み合わせでは、親和性の組み合わ
せよりも早い時期に誘導され、病気に対して抵抗性を示
す働きがある。
ｃＤＮＡは、傷害では誘導されないものの、病原菌接種
により強く誘導され、いわゆるイネのＰＲ(Pathogenesi
s Related)蛋白質をコードしていると考えられた。ＰＲ
蛋白質は、病害抵抗性と密接に関連していると考えられ
ており、非親和性の組み合わせでは、親和性の組み合わ
せよりも早い時期に誘導され、病気に対して抵抗性を示
す働きがある。
【００４６】このことから、本ｃＤＮＡをプローブとし
て用いることにより、病原菌の感染の有無を検出するこ
とができ、さらには、適当なプロモーターにこの遺伝子
（ｃＤＮＡ）を連結したキメラ遺伝子を作成し、植物に
導入することにより、病害抵抗性の形質転換植物を作出
することも可能である。
て用いることにより、病原菌の感染の有無を検出するこ
とができ、さらには、適当なプロモーターにこの遺伝子
（ｃＤＮＡ）を連結したキメラ遺伝子を作成し、植物に
導入することにより、病害抵抗性の形質転換植物を作出
することも可能である。
【００４７】
【発明の効果】本発明の新規なＤＮＡは、プローブとし
て用いることにより、新たな病害抵抗性誘導物質のスク
リーニングに利用することが可能であり、またイネのジ
ェノミックライブラリーから該遺伝子の転写調節部位の
クローニングをすることができる。また、植物体におけ
るプロベナゾール処理や病原菌の感染の有無を検出する
こともできる。さらには、適当なプロモーターに本発明
ｃＤＮＡを連結したキメラ遺伝子を作り、植物に導入す
ることにより、病害抵抗性の形質転換植物を作出するこ
とも可能である。
て用いることにより、新たな病害抵抗性誘導物質のスク
リーニングに利用することが可能であり、またイネのジ
ェノミックライブラリーから該遺伝子の転写調節部位の
クローニングをすることができる。また、植物体におけ
るプロベナゾール処理や病原菌の感染の有無を検出する
こともできる。さらには、適当なプロモーターに本発明
ｃＤＮＡを連結したキメラ遺伝子を作り、植物に導入す
ることにより、病害抵抗性の形質転換植物を作出するこ
とも可能である。
【００４８】〔配列表〕 配列番号：１ 配列の長さ：８３４ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源：イネ(Oryza sativa L. cv Jikkoku) 配列
【００４９】配列番号：２ 配列の長さ：１５８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例２で示した種々の場合における薬剤処理
による本発明遺伝子の転写誘導の有無と強弱を示すノー
ザンハイブリダイゼーションの結果を示す写真の模写図
である。
による本発明遺伝子の転写誘導の有無と強弱を示すノー
ザンハイブリダイゼーションの結果を示す写真の模写図
である。
【図２】実施例２で示した種々の場合における薬剤処理
による本発明遺伝子の転写誘導の有無と強弱を示すノー
ザンハイブリダイゼーションの結果を表わす写真の模写
図である。
による本発明遺伝子の転写誘導の有無と強弱を示すノー
ザンハイブリダイゼーションの結果を表わす写真の模写
図である。
【図３】実施例３で示した傷害や病原菌装置による本発
明遺伝子の転写誘導の有無を示すノーザンハイブリダイ
ゼーションの結果を表わす写真の模写図である。
明遺伝子の転写誘導の有無を示すノーザンハイブリダイ
ゼーションの結果を表わす写真の模写図である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図２】
【図３】
Claims (2)
- 【請求項１】 配列表の配列番号１の塩基配列または該
塩基配列の一部からなるＤＮＡ。 - 【請求項２】 配列表の配列番号２のアミノ酸配列また
は該アミノ酸配列の一部からなる蛋白質。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34904393A JP3485342B2 (ja) | 1993-12-28 | 1993-12-28 | イネ病害抵抗性関連遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34904393A JP3485342B2 (ja) | 1993-12-28 | 1993-12-28 | イネ病害抵抗性関連遺伝子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07184659A true JPH07184659A (ja) | 1995-07-25 |
| JP3485342B2 JP3485342B2 (ja) | 2004-01-13 |
Family
ID=18401110
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP34904393A Expired - Fee Related JP3485342B2 (ja) | 1993-12-28 | 1993-12-28 | イネ病害抵抗性関連遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3485342B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003097837A1 (fr) * | 2002-05-20 | 2003-11-27 | National Institute Of Agrobiological Sciences | Gene reagissant au stress specifique de racines |
-
1993
- 1993-12-28 JP JP34904393A patent/JP3485342B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003097837A1 (fr) * | 2002-05-20 | 2003-11-27 | National Institute Of Agrobiological Sciences | Gene reagissant au stress specifique de racines |
| AU2003234937B2 (en) * | 2002-05-20 | 2006-11-09 | National Institute Of Agrobiological Sciences | Stress-Responsive Root-Specific Genes |
| AU2003234937B9 (en) * | 2002-05-20 | 2006-11-16 | National Institute Of Agrobiological Sciences | Stress-Responsive Root-Specific Genes |
| US7605303B2 (en) | 2002-05-20 | 2009-10-20 | National Institute Of Agrobiological Sciences | Stress-responsive root-specific genes |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3485342B2 (ja) | 2004-01-13 |
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