ITRM980367A1 - Sequenza nucleotidiche del gene lrpkm1 di melo, sequenze amminoacidiche e loro usi - Google Patents

Description

DESCRIZIONE

a corredo di una domanda di brevetto per invenzione industriale a titolo: “Sequenze nucleotidiche del gene LRPKm1 di melo, sequenze amminoacidiche e loro usi”.

La presente invenzione concerne sequenze nucleotidiche del gene LRPKm1 di melo, sequenze amminoacidiche e loro usi.

Più in particolare l'invenzione concerne acidi nucleici, vettori e/o peptidi del gene LRPKm1 in grado di aumentare la resistenza di piante ai parassiti.

Il gene LRPKm1 di melo viene indotto in tessuti inoculati con il patogeno Venturia inaequalis e dopo trattamento con acido salicilico, segnale molecolare che fa parte della risposta di resistenza, suggerendo che il gene sia coinvolto nella interazione tra pianta e patogeno. La possibilità di creare piante transgeniche con costrutti portanti il gene LRPKm1, sotto il controllo di promotori costitutivi, come ad es. il promotore 35S del virus del mosaico del cavolfiore CaMV, renderebbe sempre attivo il meccanismo di difesa della pianta verso il patogeno.

Inoltre la sequenza promotore a monte del gene LRPKm1 può essere vantaggiosamente usata in costrutti chimerici come promotore di sequenze codificanti prodotti proteici in grado di inibire Venturia inaequalis. Il sistema permetterebbe di esprimere in melo geni eterologhi codificanti per attività fungostatiche al momento dell’invasione del patogeno.

Gli autori della presente invenzione hanno isolato da melo ( Malus x domestica cv. Fiorina) un clone di cDNA, denominato LRPKm1, con una sequenza a cornice di lettura aperta di 2997 nt, codificante una proteina di 999 amminoacidi ricca in leucina (leucinerich repeat, LRR) di struttura simile ad una protein chinasi.

L’isolamento del clone è stato effettuato usando come sonda eterologa, a bassa stringenza di ibridazione, il gene codificante per la proteina che inibisce la poligalatturonasi (PGIP) di fagiolo ( Phaseoius vulgaris L). E’ stato anche isolato un clone genomico contenente la regione regolatoria al 5' e una porzione 5’ codificante del gene LRPKm1. La proteina codificata dal clone isolato ha una struttura simile a recettori serina/treonina chinasici e comprende 23 LRR ed un presunto dominio di membrana. LRPKm1 mostra omologia con la protein chinasi simile a recettore RLK5 di A. thaliana e, in misura minore, a PGIP.

Un’analisi per Southern blot ha mostrato che LRPKm1 appartiene ad una famiglia multigene e che vi è polimorfismo dei frammenti di restrizione ibridizzanti tra diversi cultivar di M. domestica.

Un’analisi per Northern blot e esperimenti di RT-PCR sono stati effettuati con mRNA estratto da foglie del cv. Fiorina infettato con un ceppo avirulento del fungo patogeno Venturia inaequalis, e da tessuti trattati con acido salicilico. Un trascritto di 3500 nt ibridizzante ad alta stringenza con il cDNA LRPKm1 si accumula in risposta all’infezione o trattamento con acido salicilico.

Mafus x domestica Borkh. (melo), uno degli alberi da frutta più diffuso nel mondo, è suscettibile a diverse patologie fungine, tra cui la ticchiolatura ( Venturia inaequalis (Cooke) Aderii.) è quella più grave e di maggior rilievo economico. Sebbene i diversi cultivar esibiscano differenti gradi di suscettibilità, nessuno è immune. La resistenza ontagenica non cultivar specifica alla ticchiolatura è descritta in M. x domestica, in cui le foglie più vecchie, ma non quelle senescenti, sono resistenti (1).

Geni monogenici di resistenza dominanti sono stati introdotti in M. x domestica da diverse specie selvatiche di Mafus : il gene Vf da M. fforibunda (portato dalla maggior parte dei cultivar commerciali resistenti alla ticchiolatura), il gene Vm da M. micromalus, o il gene Vr da M. pumilia. Tuttavia l’esistenza di geni per la resistenza razzaspecifica a V. inaequalis è stata descritta in cultivar "suscettibili" di M. x domestica ; per esempio, un gene VS di resistenza è stato identificato nel cultivar Golden Delicious (2,3).

La resistenza alla ticchiolatura è spesso espressa come una risposta ipersensibile associata ad un rapido accumulo di composti fenolici e di fitoalexine (4,5,6). La risposta di ipersensibilità è razzaspecifica (2). Nella resistenza mediata da Vf, le differenze nella colonizzazione del patogeno in cultivar suscettibili e resistenti diventa apparente solo dopo la penetrazione. I primi stadi dell’ infezione fungina (germinazione dei conidi, formazione degli appressori e penetrazione del cuticolo) avvengono sulle foglie sia di piante resistenti che sensibili; solo nelle piante sensibili, tuttavia, il fungo si sviluppa tra la cuticola e le cellule dell'epidermide e forma uno stroma fungino (6).

Il riconoscimento specifico e la conseguente attivazione della catena di trasduzione del segnale che porta ad una rapida induzione delle risposte di difesa rappresentano i passaggi cruciali nella determinazione della resistenza a Venturia. I geni per la resistenza di molte piante (R) codificano per proteine ricche in leucina (LRR), recettori putativi in grado di indurre le risposte di difesa a seguito di riconoscimento dei prodotti avirulenti derivati dal patogeno.

Forma pertanto oggetto della presente invenzione un acido nucleico comprendente una sequenza nucleotidica dalla specie Màfus x domestica codificante per una proteina, o porzioni funzionali di essa, responsabile della resistenza a patogeni fungini per le piante, o una sequenza regolatrice di detta sequenza codificante. Preferibilmente il patogeno è Venturia inaequalis. Più preferibilmente la sequenza nucleotidica codifica per una proteina, o porzioni funzionali di essa, avente la sequenza di Fig. 1C. In una forma preferita di attuazione l’acido nucleico dell'invenzione comprende una sequenza in grado di ibridizzare a bassa stringenza con la sequenza nucleotidica dal nt. 1 al nt. 3000 o parti di essa. Le condizioni di ibridazione a bassa stringenza sono note agli esperti del settore e comprendono ibridazioni a temperature comprese tra 60°C e 68°C, in ambiente salino a media forza ionica, come in presenza del tampone 1.0-5.0 X SSC, e lavaggi a temperature comprese tra 60°C e 68°C, in ambiente salino a bassa forza ionica, come in presenza del tampone 0.1. -0.2 X SSC. In una forma di attuazione l'acido nucleico dell’invenzione comprende una sequenza nucleotidica regolatoria compresa nella Fig. 1C, preferibilmente compresa dal nt -1683 al nt -1. Alternativamente l'acido nucleico dell’invenzione comprende una sequenza nucleotidica dal nt. 1 al nt. 3000, o porzioni di essa. In una forma alternativa di attuazione l’acido nucleico comprende una sequenza nucleotidica complementare a quella di Fig. 1 C, o a porzioni di essa.

E’ ulteriore oggetto della presente invenzione un vettore di espressione comprendente, sotto il controllo di un promotore attivo e regolabile in piante, l’acido nucleico codificante dell'invenzione o parti di esso, o alternativamente un vettore di espressione comprendente le sequenze regolatone dell'invenzione.

Ulteriore oggetto dell’invenzione è l’uso del vettore dell’invenzione per la produzione di piante transgeniche resistenti a patogeni fungini. Preferibilmente le piante appartengono alla specie Malus x domestica.

Ulteriore oggetto dell’invenzione è una pianta transgenica ottenibile per trasformazione con il vettore dell’invenzione. Preferibilmente (a pianta appartiene alla specie Malus x domestica.

Costituisce ulteriore oggetto dell’invenzione una proteina, o porzioni funzionali di essa, responsabile della resistenza a patogeni fungini codificata dall’acido nucleico secondo l’invenzione. Preferibilmente la proteina comprende la sequenza amminoacidica di Fig. 1C o porzioni di essa.

La presente invenzione verrà ora descritta in suoi esempi non limitativi, facendo riferimento alle seguenti figure:

Figura 1A. Sequenza nucleotidica parziale del clone genomico Sma1,4.3 da M. x domestica cv. Fiorina. La sequenza di 2305 nt comprende una cornice di lettura aperta troncata di 619 nt (dal nt 1684 a) nt 2304), e una regione 5' regolatoria (dal nt 1 al nt 1683). La cornice di lettura aperta troncata codifica per un frammento proteico che comprende un peptide segnale per la secrezione e un dominio LRR. La sequenza amminoacidica è mostrata nel codice a una lettera sotto i corrispondenti codoni.

Figura 1B. Sequenza nucleotidica del clone di cDNA 13.3.1 da M. x domestica cv. Fiorina, e sequenza amminoacidica dedotta. Il clone non è intero. La sequenza amminoacidica è mostrata con il codice a una letera soto i codoni corrispondenti. Il nt 1 corrisponde al nt 1996 della sequenza del DNA genomico (Fig. 1A).

Figura 1C. Sequenza nucleotidica del gene LRPKm1 da M. domestica cv. Fiorina, regione 5', e sequenza amminoacidica dedotta. La sequenza amminoacidica è mostrata con il codice a una lettera sotto i codoni corrispondenti. La “A” del codone di inizio della traduzione corrisponde al nt 1. L'asterisco indica il codone di terminazione della traduzione. Il riquadro grigio indica il peptide segnale per la secrezione. I siti putativi di N-glicosilazione sono indicati dai triangoli neri. Il dominio ricco in leucina è sottolineato e i residui di leucina evidenziati. Le cisteine accoppiate che fiancheggiano la regione LRR sono poste in un riquadro. La sequenza transmembrana prevista è sottolineata con una doppia riga. La regione LRR è marcata da frecce. Il clone genomico Sma1 comprende la sequenza dal nt -1683 al nt 619. Il clone di cDNA 13.3.1 comprende le sequenze dal nt -2 al nt 3405.

Figura 2 Organizzazione genomica di LRPKm1. Analisi Southern del DNA genomico dal cultivar Fiorina dopo digestione con diversi enzimi di restrizione: 1, Eco RI; 2, Hind III; 3, Barn HI; 4, Sai I. B. Analisi Southern del DNA genomico da diversi cultivar di melo, resistenti o sensibili all'infezione di V. inaequaiis. 1-2, Cox's Grange Pippin (sensibile); 3-4, Idared (sensibile); 5-6, Fiesta (sensibile); 7-8, Malus floribunda (con Vf), 9-10, Nova Easygro (con Vf); 11-12, Starking (sensibile); 13-14, Jonafree (con Vf). 1,3,5,7,9,11,13, Hind III; 2,4,6,8,10,12,14, Barn HI.

Figura 3 Diagramma di idropatia, struttura a domini della proteina LRPKm1 e illustrazione schematica della similarità tra i domini di LRPKm1 e quelli di altri proteine vegetali con LRR simili a recettori. L’idropatia era dedotta con il metodo di Kyte and Doolittle (7), con una finestra di nove amminoacidi. Sotto, rappresentazione schematica della struttura a domini di LRPKm1. Identità a livello di amminoacidi, come determinate separatamente per i domini extracitoplasmici e chinasici con il programma FASTA di paragone per sequenze, con diverse proteine vegetali con LRR simili a recettori. Abbreviazioni: SP, peptide segnale; LRR, dominio LRR extracitoplasmatico; TM, dominio transmembrana; kinase, dominio chinasico. Il riquadro tratteggiato indica i) dominio intracitoplasmatico di Cf-2.1.

Figura 4 Carateristiche della regione LRR di LRPKm1. A. Allineamento delle 23 LRR di LRPKm1. I numeri a destra indicano il numero specifico LRR. La linea in basso indica la sequenza consensus per la LRR LRPKm1. Per x si intende qualsiasi amminoacido; L indica un residuo amminoacidico alifatico (L, I, F, V, M); nei casi in cui l’isoleucina è più rappresentata, è indicata I. S è S o T, D un residuo addico (D o E). Le lettere minuscole nella sequenza consensus indicano residui identici in almeno 11, ma in meno della metà delle sequenze ripetute. B. Paragone delle sequenze LRR consensus LRPKm1 con quelle di altre proteine.

Figura 5 Allineamento del dominio chinasico di LRPKm1, RLK5 (8) e CLAVATA1 (CLV1) (9). I 12 domini chinasici proteici conservati sono indicati con numeri Romani, secondo la nomenclatura di Hanks e Quinn (10). I residui che sono conservati tra almeno due delle sequenze sono in riquadro. I 15 amminoacidi che non variano in tutte le protein chinasi sono indicati con asterischi.

Figura 6 Analisi dei livelli di trascritti di LRPKm1 in foglie di Fiorina a seguito di infezione con V. inaequalis e con trattamento con acido salicilico. A. Accumulo di mRNA di LRPKm1 in foglie dopo inoculo con una sospensione di conidi di V. inaequalis. Accumulo di mRNA di LRPKm1 in foglie dopo tratamento con 2 mM acido salicilico, pH 5.5. RNA poli(A)+ è stato isolato a tempi diversi dopo i trattamenti. Per verificare che in ogni campione si fossero caricate le stesse quantità di mRNA, si sono normalizzati i filtri reibridandoli con una sonda specifica per il gene costitutivo codificante per la subunità piccola della rubisco di melo (11).

MATERIALI E METODI

Materiale vegetale

Malus x domestica cultivar Fiorina, con il gene Vj per la resistenza a V. inaequalis (12), è stato usato. Piante di un anno del portainnesto M9 sono cresciute in serra. Malus floribunda e i cultivar M. x domestica Cox s Orange Pippin, Idared, Fiesta, Nova Easygro, Starking e Jonafree sono stati usati per un’analisi Southern del DNA genomico.

Manipolazione degli acidi nucleici

Tutte le manipolazioni del DNA (digestione con endonucleasi di restrizione, modificazioni del DNA, ligazione e elettroforesi su gel di agarosio) sono state effettuate secondo Sambrook et al. (13).

Per l'analisi Southern, il DNA genomico è stato estratto da foglie di cultivar di melo come descritto da Dellaporta et al. (14). Dopo digestione con enzimi di restrizione, il DNA era separato per elettroforesi su 0.8 % gel di agarosio e trasferito con 20X SSC.

Le ibridazioni sono state effettuate in condizioni di alta stringenza: i filtri sono stati preibridizzati per 16 ore a 65°C con una soluzione contenente 5x SSC, 5x soluzione Denhart (15), 0.5% sodiododecilsolfato (SDS) e 100 μg/ml di DNA di sperma di salmone denaturato. La soluzione di ibridazione è stata la stessa ad eccezione dell'aggiunta della sonda, un frammento di DNA marcato per PCR corrispondente al cDNA di LRPKm1. I filtri sono stati poi lavati tre volte con 0.1x SSC e 0.1% SDS a 65°C, essiccati e esposti a pellicole raggi X.

Per la purificazione dell’RNA, 9.6 mi di tampone di estrazione (100mM TRIS pH 8.0, 50mM EDTA, 500mM NaCI; 1% 2-mercaptoetanolo, 1.3% SDS) erano aggiunti a tessuti fogliari congelati e ridotti ad una polvere fine (2-4 g) in presenza di azoto liquido, e il campione era incubato per 10 min a 65°C. Dopo aggiunta di 3 mi di 5 M acetato di potassio freddo, il campione era incubato su ghiaccio per 10 min, poi estratto con un volume uguale di fenolo-cloroformio-alcol isoamilico (25:24:1) (due volte), e cloroformio (una volta). Gli acidi nucleici erano precipitati per aggiunta di 0.6 volumi di alcol isopropilico, seguito da incubazione a temperatura ambiente per 1 h, e recuperata per centrifugazione. Il pellet era risospeso in 2M cloruro di litio e incubato in ghiaccio per 16 ore. L’RNA era recuperato per centrifugazione e disciolto in acqua trattata con DEPC. L’mRNA poliadenilato era purificato con due cicli di cromatografia su oligo(dT)-cellulosa (13). L'RNA poliadenilato era frazionato su 1.5% gel formaldeide agarosio (16) e trasferito su filtri di nitrocellulosa (Hybond-N+, Amersham) in presenza di 10x SSC. I filtri erano preibridati, ibridati e lavati come descritto per le analisi Southern usando il cDNA di LRPKm1 come sonda. Per la normalizzazione, i filtri erano deibridati, e reibridati con una sonda specifica per la piccola subunità di melo di Rubisco (11).

Preparazione e sondaggio di librerie di cDNA e qenomiche

Una libreria genomica, costruita per ligazione di DNA separato per dimensioni parzialmente digerito con Mbo I, dal cultivar Fiorina con le braccia piccole e grandi di lambda EMBL3 digerito con Barn HI, era ottenuta da Clontech (CA, USA). La libreria era piastrata sul ceppo di E. coli LE392 e sondata per ibridazione su placca. Circa 3x105 fagi ricombinanti erano piastrati e le placche trasferite su filtri Hybond-N (Amersham). Le ibridazioni erano effettuate in condizioni di alta stringenza come descritto per l’analisi Southern, usando un frammento di DNA generato per PCR corrispondente alla regione dal nt 328 al nt 705 del gene PGIP di P. vulgaris (17). I tre lavaggi finali erano 2X SSC, 0.1% SDS.

Una libreria di cDNA era costruita usando RNA poli(A+) estratto da foglie di Florina 48 ore dopo infezione con V. inaequalis. Il cDNA era sintetizzato e ligato con le braccia EcoRI-Notl del vettore gt22 (SuperScript Lambda System, Life Technologies, Inc.), impaccato in vitro, e piastrato su E. coli Y1090. Circa 200,000 fagi ricombinanti erano sondati per PCR, come descritto in (17) e ibridati su filtro. Per il sondaggio con PCR, erano usati i seguenti inneschi oligonucleotidici: (diretto) omkl3 5'-ATTGGCTTGGCGTCACAT-3', corrispondente alla sequenza dal nt 1846 al nt 1864, e (inverso) omkl5 5'-CCTCGAGTTTCTGGAAGCGG-3', complementare alla sequenza dal nt 2188 al nt 2168 (Fig.lA). Le placche sui filtri erano preibridate, ibridate e lavate come descritto per l’analisi Southern, ad eccezione che era usato come sonda un frammento dal nt 1559 al nt 2303 (Fig.

1A). Gli inserti dai cloni positivi erano subclonati nei siti Notl-EcoRI di pBlueScript KS(+) per ulteriore analisi.

Infezione e trattamento con acido salicilico

L’inoculo consisteva di una sospensione di conidi da un ceppo aggressivo di V. inaequalis. I conidi erano raccolti in acqua distillata e la sospensione portata a 2.5 x 105 conidi/ml. La sospensione di conidi era spruzzata su quattro foglie in quantità sufficienti a formare delle piccole gocce sulla superficie della foglia. Le piante inoculate erano incubate a 20°C e 99% umidità relativa. I tessuti per l'estrazione del RNA erano raccolti dopo 0, 24, 48 e 72 ore.

Una soluzione di acido salicilico 2 mM, pH 5.5, era spruzzata su quattro foglie di piante cresciute in serra. I tessuti per l’estrazione del RNA erano raccolti dopo 0, 6, 24, e 48 ore.

Analisi per PCR

Per l’analisi RT-PCR, la prima elica di cDNA era preparata da poli(A)+ RNA preparato da foglie di Fiorina infettate con V. inaequalis, usando un kit Gene Amp RNA PCR (Perkin Elmer).

Le amplificazioni da entrambe le RT-PCR e il sondaggio della libreria di cDNA erano effettuate con un “thermal cycler” modello 9600 (Perkin Elmer/Cetus, Norwalk, CT) come segue: a) 1 ciclo di 1.5 min a 96°C (denaturazione), 1.5 min a 60°C (ibridazione) e 1.5 min a 72°C (estensione); b) 30 cicli di 3 min a 94°C, 1.5 min a 60°C e 3 min a 72°C, seguiti da c) 7 min di estensione finale a 70°C. La miscela di reazione standard PCR conteneva 0.2 mmol di ciascun innesco (diretto: omk13 e inverso: omk15 come già descritti), 1.5 mM MgCI2 e 1U di AmpliTaq Gold (Perkin Elmer).

Sequenza e analisi del DNA

Per la sequenza del DNA era usato il kit DNA Sequencing Dye terminators Cycle Sequencing con la AmpliTaq DNA polimerasi, FS, Perkin Elmer. Le reazioni della sequenza erano separate e analizzate usando un ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). RISULTATI

Isolamento e caratterizzazione del gene LRPKm1 di Malus x domestica Una libreria genomica dal cultivar di melo Fiorina è stata costruita nel vettore λ EMBL-3 e sondata usando, come sonda eterologa, un frammento di DNA pgip-specifico da P. vulgaris (17). Da un totale di 1.5 x10e fagi ricombinanti, era isolato il clone positivo Smal, da cui era subclonato il frammento di 4300 bp Sali-Sali nel plasmide Bluescript KS(+), per ottenere il plasmide pSmal-4.3. La sequenza nucleotidica di questo frammento era parzialmente determinata, e mostra una cornice di lettura aperta troncata di 619 nt (Fig. 1A, dal nt 1684 al nt 2304), e una regione regolativa al 5‘, di cui 1683 nt erano sequenziati (Fig. 1A, nt 1-1683). La regione con la cornice di lettura aperta troncata codifica per un frammento proteico che comprende un peptide segnale per la secrezione e un dominio LRR. La sequenza nucleotidica corrispondente alla regione codificante LRR mostra il 60% di identità con la sequenza del gene pgip di fagiolo. Poiché il clone genomico isolato non contiene il gene intero, si è cercato il clone di cDNA corrispondente. Esperimenti di RT-PCR mostravano che i trascritti contenenti la regione LRR del gene si accumulavano in foglie in risposta all'infezione con Venturia inaequalis ; pertanto è stata costruita una libreria di cDNA poli(A)+ mRNA da foglie infette. Un clone positivo, 13.3.1, è stato isolato e caratterizzato per contenere un inserto di 3123 bp (Fig. 1 B). L’inserto comprendeva una cornice di lettura parziale, una regione al 3' di 405 bp non tradotta, e una coda di 30 bp poli(A). La porzione al 5’ della sequenza di cDNA (dal nt 1 al nt 316 di Fig. 1B) si sovrappone completamente alla sequenza del DNA genomico (1684-2304 di Fig. 1A).

La sequenza completa del gene e della sua regione regolativa al 5‘ è presentata in Fig. 10. Per [e caratteristiche del prodotto codificato, il gene era denominato LRPKm1 (Leucine-rich-repeat Receptor-like Protein Kinase m1 ).

L’analisi della sequenza nucleotidica della regione di 1683 nt immediatamente al 5’ della regione codificante del gene LRPKm1 (Fig. 1C) rivelava la presenza, alla posizione -73, di una regione “TATA box", e, in posizione -1583 e -1087, delle sequenze TGATTTTCTT e TCTTATTCTT, rispettivamente, simili alle TCA di diversi geni vegetali indotti da stress (18).

Sono stati effettuati esperimenti di trasferimento di DNA per stimare la complessità dei geni LRPKm1 nel genoma di M. domestica, usando come sonda il cDNA di LRPKm1. Sono state evidenziate diverse bande da DNA genomico del cv. Florina digerito con EcoRI, Hind III e BamHI, indicando che il gene LRPKm1 è un membro di una famiglia multigenica (Fig. 2A). E’ stata anche effettuata un’analisi per Southern blot del DNA estratto da diversi cultivar di melo, resistenti o sensibili a V. inaequalis. E’ stato anche osservato un polimorfismo di lunghezza dei frammenti di restrizioni ibridizzanti (Fig. 2B).

Caratteristiche del prodotto del oene LRPKm1

La cornice di lettura aperta del gene LRPKm1 codifica un prodotto amminoacidico di 999 aa., comprendente due domini idrofobici, come mostrato dal plot di idropatia (Fig. 3). Il dominio idrofobico ai terminale amminico è indicativo di un peptide segnale per la traslocazione della proteina nel ER; secondo von Hejine (19), un sito di taglio può essere assegnato alla posizione 21/22 (TLS-LN) (Fig.lC). La regione altamente idrofobica tra gli aa. 628 e 650 ha la caratteristica di un segmento che attraversa la membrana, che divide la proteina in una porzione extracitoplasmica ed una citoplasmica. Il polipeptide maturo di 978 aa. ha una massa molecolare stimata di 107.787,57 Da ed un pi di 5.34; comprende domini distinti: un motivo a cerniera ricco in leucina, un dominio extracitoplasmico LRR, seguito da un dominio transmembrana e da un dominio per una chinasi citoplasmatica (Fig. 1 C e 3). Questa topologia è tipica di una famiglia di proteine indicata come LRR recettor chinasi. Al terminale amminico della proteina matura, una regione ripetuta di 4 eptadi di leucine interdigitata con amminoacidi di carica opposta (residui 22-43) corrisponde ad un putativo motivo antipatico a cerniera ricco in leucina, che potrebbe partecipare alla formazione di omo- e di eterodimeri (20). Una porzione principale del dominio putativo extracitoplasmatico, dall’aa. 71 all'aa.

592, contiene 23 LRR, arrangiate in tandem (Fig. 4A). Così come per molte proteine contenenti LRR, la regione LRR è affiancata da coppie di cisteine spaziate (Fig. 1C). La sequenza LRR consensus corrisponde a LxxLxxLxxLdLxNxLSGxlPxx. Un paragone della sequenza consensus LRR del gene LRPKm1 con quelli di parecchie protein-chinasi simili a recettori clonate da piante è mostrata in Figura 4B. Tredici sequenze corrispondono alla sequenza consensus per la N-glicosilazione NX(S/T), e undici di queste sono entro le LRR. Il dominio idrofobico che attraversa la membrana segue la regione LRR, e a sua volta è seguito da diversi amminoacidi caricati positivamente, che funzionano probabilmente come sequenza di blocco del trasferimento per inibire l'ulteriore traslocazione del sito carbossilico della proteina (21).

Il dominio chinasico citoplasmatico carbossi-terminale comprende tutti i subdomini trovati in tutte le protein chinasi eucariote (10): in particolare, una regione di legame all'ATP è presente dal’amminoacido 692 al 715, mentre i subdomini Vlb and Vili sono dei forti indicatori di una protein chinasi a serina/treonina (Fig. 5).

Un paragone della sequenza amminoacidica di LRPKm1 con le sequenze in banca dati rivela che la LRPKm1 è strettamente correlata al prodotto del gene RLK5 di A. thaliana (8), una chinasi LRR di funzioni non note. A livello di amminoacidi, LRPKm1 e RLK5 sono identici per il 58.7% dell’intera lunghezza; i domini extracitoplasmatici sono per il 56.1% identici, mentre i domini chinasici sono per 62.9% identici, il dominio extracitoplasmatico di LRPKm1 è per il 31.6% identico alla PGIP di fagiolo (Fig. 3). Identità con altre proteine vegetali contenenti LRR sono mostrate in Fig. 3.

I trascritti LRPKm1 si accumulano a seguito di infezione con V. inaeaualis e trattamento con acido salicilico

Sono stati effettuati esperimenti di Northern blot su mRNA poli(A)+ di melo estratto da foglie del cultivar Fiorina infettato con V. inaequalis (interazioni incompatibili, usando come sonda un DNA marcato corrispondente al cDNA di LRPKm1. L'accumulo di trascritti di LRPKm1 (3500 nt) inizia 24 h dopo l’infezione, raggiunge i massimi livelli tra 24 e 48 h e diminuisce dopo 72 h (Fig. 7A).

Un’analisi Northern blot è stata anche effettuata su RNA estratto da piante di melo trattate con acido salicilico. L'accumulo di trascritti LRPKm1 era evidenziato 6 h dopo il trattamento e aumentava costantemente fino a 48 h dopo il trattamento (Fig. 7B).

Claims (15)

1. RIVENDICAZIONI 1. Acido nucleico comprendente una sequenza nucieotidica dalla specie Malus x domestica codificante per una proteina, o porzioni funzionali di essa, responsabile della resistenza a patogeni fungini per le piante, o una sequenza regolatrice di detta sequenza codificante.
2. 2. Acido nucleico secondo la rivendicazione 1 in cui il patogeno è Venturia inaequalis.
3. 3. Acido nucleico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui la sequenza nucieotidica codifica per una proteina, o porzioni funzionali di essa, avente la sequenza di Fig. 1C.
4. 4. Acido nucleico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 0 2 comprendente una sequenza in grado di ibridizzare a bassa stringenza con la sequenza nucieotidica dal nt. 1 al nt. 3000 di Fig. 1 C, o a parti di essa.
5. 5. Acido nucleico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3 comprendente una sequenza nucieotidica regolatoria compresa nella Fig. 1C, preferibilmente compresa dal nt -1683 al nt -1.
6. 6. Acido nucleico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3 comprendente una sequenza nucieotidica dal nt. 1 al nt. 3000 di Fig. 1 C, o porzioni di essa.
7. 7. Acido nucleico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3 comprendente una sequenza nucieotidica complementare a quella di Fig. 1 C, o a porzioni di essa.
8. 8. Vettore di espressione comprendente, sotto ii controllo di un promotore attivo e regolabile in piante, l’acido nucleico codificante secondo le rivendicazioni precedenti.
9. 9. Vettore di espressione comprendente le sequenze regolatone secondo le rivendicazioni precedenti.
10. 10. Uso del vettore secondo le rivendicazioni 8 o 9 per la produzione di piante transgeniche resistenti a patogeni fungini.
11. 11. Uso del vettore secondo la rivendicazione 10 in cui dette piante transgeniche appartengono alla specie Mafus x domestica.
12. 12. Pianta transgenica ottenibile per trasformazione con il vettore secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 8 o 9.
13. 13. Pianta transgenica secondo la rivendicazione 12 appartenente alla specie Malus x domestica.
14. 14. Proteina, o porzioni funzionali di essa, responsabile della resistenza a patogeni fungini codificata dall’acido nucleico secondo una delle rivendicazioni da 1 a 8.
15. 15. Proteina secondo la rivendicazione 14 comprendente la sequenza amminoacidica di Fig. 1C o porzioni di essa.