JPH07173190A - 血漿蛋白の分画方法 - Google Patents

血漿蛋白の分画方法

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JPH07173190A JP5343231A JP34323193A JPH07173190A JP H07173190 A JPH07173190 A JP H07173190A JP 5343231 A JP5343231 A JP 5343231A JP 34323193 A JP34323193 A JP 34323193A JP H07173190 A JPH07173190 A JP H07173190A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 従来の遠心分離法に比較して、血漿蛋白含有
物、特に血漿から血漿蛋白を安全かつ効率よく分画する
ことができる方法を提供すること。 【構成】 血漿蛋白含有物を特定条件下で低温エタノー
ル分画処理した後に孔径０．４〜２０μｍ、濾過面積５
〜３０ｍ2 （液量１０００〜５０００Ｌ当たり）、圧力
３Ｋｇ／ｃｍ2 以下の各範囲から選定した条件下に濾過
処理を行うことにより特定の沈殿画分および上清画分を
分離回収することを特徴とする血漿蛋白の分画方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は血漿蛋白含有物、特に血
漿から血漿蛋白を効率よく各種血漿蛋白成分に分画する
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】血漿蛋白は血漿に含まれる蛋白の総称で
あり、１００種類以上の蛋白成分からなる。血漿蛋白の
主な成分はアルブミン、グロブリン、各種血液凝固因
子、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、プラスミノ
ーゲン、プロトロンビン等である。血漿からこれらの血
漿蛋白成分に分画する方法としては、コーンの低温エタ
ノール分画法、硫安分画法、ポリエチレングリコール分
画法等が知られている。
【０００３】ところで、低温エタノール分画法におい
て、生成された上清画分および沈殿画分を分離する方法
としては遠心分離法、濾過分離法等が知られている。こ
のような低温エタノール分画法としては、例えば、Ｐｒ
ｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７，２０（１９７
２）、Ｖｏｘ Ｓａｎｇ，３１，２８９−２９５（１９
７６）等に記載がある。
【０００４】遠心分離法は遠心機１台当たりの処理能力
に限界がある点や、高速回転に伴う発熱および騒音、あ
るいは高速回転体による危険性といった問題点のあるこ
とが指摘されている。そこで、このような問題点を回避
することを目的として、濾過処理法による実用化が展開
されてつつある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は従来の遠心分
離法に比較して、血漿蛋白含有物、特に血漿から血漿蛋
白を安全かつ効率よく分画することができる方法を提供
することを目的とするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記の事情
を考慮して各種検討を行った結果、低温エタノール分画
処理により調製された上清画分および沈殿画分を、特定
の条件下において濾過処理することにより効率よく分離
回収することに成功し、本発明を完成した。本発明は、 血漿蛋白含有物をエタノール濃度５〜１０％、ｐＨ
６．８〜７．４の条件下での低温分画処理後に孔径０．
４〜２０μｍ、濾過面積５〜１５ｍ2 （液量１０００〜
５０００Ｌ当たり）、圧力３Ｋｇ／ｃｍ2 以下の条件下
に濾過処理を行うことにより第Ｉ沈殿画分および第Ｉ上
清画分を分離回収することを特徴とする血漿蛋白の分画
方法、 第Ｉ上清画分をエタノール濃度１８〜３０％、ｐＨ
４．５〜８の条件下での低温分画処理後に孔径０．４〜
２０μｍ、濾過面積２０〜３０ｍ2 （液量１０００〜５
０００Ｌ当たり）、圧力３Ｋｇ／ｃｍ2 以下の条件下に
濾過処理を行うことにより第II＋III 沈殿画分および第
II＋III 上清画分を分離回収することを特徴とする血漿
蛋白の分画方法、 第II＋III 上清画分をエタノール濃度３５〜４５
％、ｐＨ５〜７の条件下での低温分画処理後に孔径０．
２〜１０μｍ、濾過面積１０〜２０ｍ2 （液量１０００
〜５０００Ｌ当たり）、圧力３Ｋｇ／ｃｍ2 以下の条件
下に濾過処理を行うことにより第IV沈殿画分および第IV
上清画分を分離回収することを特徴とする血漿蛋白の分
画方法、および 第IV上清画分をエタノール濃度３５〜４５％、ｐＨ
４〜５．５の条件下での低温分画処理後に孔径０．４〜
２０μｍ、濾過面積２０〜３０ｍ2 （液量１０００〜５
０００Ｌ当たり）、圧力３Ｋｇ／ｃｍ2 以下に濾過処理
を行うことにより第Ｖ沈殿画分および第Ｖ上清画分を分
離回収することを特徴とする血漿蛋白の分画方法であ
り、これらにより上記目的を達成できる。
【０００７】本発明は、血漿蛋白含有物もしくはその画
分を低温エタノール分画処理し、次いで特定の条件下に
おいて濾過処理することにより効率よく低温エタノール
分画処理により生成した上清画分と沈殿画分をそれぞれ
分離回収するものであり、本発明の特徴は該濾過処理の
最適条件を見出したことにある。本発明〜における
濾過処理条件は、前記した通りである。そして、本発明
は該条件を満足するように従来公知の濾過手段（濾過
材、および濾過装置）を適宜選択し得る。
【０００８】濾過処理条件における孔径とは、濾過材の
平均孔径を意味し、濾過面積とは濾過すべき液１０００
〜５０００Ｌ（リットル）を柱体形状で保持している濾
過材表面の面積（即ち、柱体の横断面積または底面）を
指す。また、必要により濾過助剤を適宜使用することが
できる。この場合、濾過助剤は主として沈殿物を多孔質
化し、濾過抵抗を著しく減少させる作用を有するもので
あり、濾過材の濾過機能を促進する機能を有する。濾過
助剤は低温エタノール分画処理した液に濾過前もしくは
濾過と同時に添加される。そして、本発明では、該濾過
すべき液を圧力３Ｋｇ／ｃｍ2 以下で濾過する。
【０００９】〔１〕出発原料 本発明の出発原料として使用される血漿蛋白含有物は、
血漿蛋白を含有するものであれば、特に限定されない
が、通常、例えば、血液、血漿、血清、これらに由来す
る画分等が挙げられる。具体的には血漿からクリオプレ
シピテートを除去したもの、血漿からプロトロンビン複
合体を除去したもの等が例示される。
【００１０】本発明においては、濾過処理により第Ｉ
沈殿画分と第Ｉ上清画分が得られる。これは従来法によ
るコーンの第Ｉ沈殿画分およびその上清画分に相当する
ことが、後述の実験例からも明らかであるが、従来の画
分成分と厳密に一致しなければならないものではない。
従って、本発明に使用される第Ｉ上清画分は、本発明
からのものに限定されずこれと実質的に変わらない従
来法によるコーンの第Ｉ上清画分であってもかまわな
い。
【００１１】同様に、本発明に使用される第II＋III
上清画分、または本発明で使用される第IV上清画分も
従来法のコーンの各画分に相当するので、本発明の第
Ｉ上清画分と同様な取扱いができる。 〔２〕本発明の濾過処理（フィルタープレス使用） （１）第Ｉ沈殿画分と同上清画分の分離 出発原料をエタノール濃度５〜１０％、好ましくは７〜
９％で処理して上清画分と沈殿画分とに分離する。沈殿
画分よりフィブリノゲン等を回収することができる。
【００１２】エタノール処理条件 ｐＨ６．８〜７．４、温度５〜−３℃（特に−２〜−３
℃）、３０分間〜１５時間特に１〜５時間）程度が例示
される。なお、エタノール処理条件は公知のコーンの低
温エタノール分画法に準じている。以下、（２）〜
（４）も同様である。
【００１３】濾過処理条件 ａ．孔径０．４〜２０μｍ、濾過面積５〜１５ｍ2 （液
量１０００〜５０００Ｌ当たり）、圧力３Ｋｇ／ｃｍ2
以下、濾過時間１０時間以内の条件下に濾過処理を行う
ことが例示される。孔径の好ましい範囲は０．６〜４μ
ｍである。このうち、最も好ましいのは０．６〜２μｍ
の孔径幅を有する濾過材（例、ゼータプラス３０ＬＡ）
であるが、０．９〜４μｍの孔径幅を有する濾過材
（例、ゼータプラス１０ＬＡ）も同程度に好ましい。
０．４〜１μｍの孔径幅を有する濾過材（例、ゼータプ
ラス５０ＬＡ）も上記の２種には劣るものの使用可能で
ある。好ましい圧力は１ｋｇ／ｃｍ2 である。なお、濾
過時間は濾過面積、濾過液量に応じて適宜変更すること
ができる。また、濾過助剤を１〜１００ｇ（液量１Ｌ当
たり）程度添加することが好ましい。濾過助剤としては
ケイソウ土等が例示される。
【００１４】ｂ．フィルタープレス フィルタープレスは濾過装置および濾過材から構成され
る。濾過装置は加圧濾過式、圧搾式、ガスブロー式、電
気浸透式、それらの組合せ等が知られている。また、濾
過装置は、市販品を使用できる。具体的には加圧濾過と
ガスブローを組合わた濾過装置（ＳＥＩＴＺ社製、商品
名ＯＲＩＯＮ Ｃ４０）等が例示される。
【００１５】濾過材（濾布を含む概念である）は繊維
（例、セルロース等）、樹脂、無機濾過助剤（ケイソウ
土、パーライト等）等が知られている。この濾過材は市
販品を使用できる。具体的には高度精製セルロース繊維
と酸処理ケイソウ土を組合せた濾過材（キュノ社製ゼー
タプラスＬＡシリーズ）等が例示される。尚、以下の
（２）〜（４）においても上記と同様のフィルタープレ
スを使用することができる。
【００１６】（２）第II＋III 沈殿画分と同上清画分の
分離 第Ｉ上清画分をエタノール濃度１８〜３０％、好ましく
は２０〜２５％で処理して上清画分と沈殿画分とに分離
する。沈殿画分より免疫グロブリン等を回収することが
できる。 エタノール処理条件 ｐＨ４．５〜８（特にｐＨ５．２〜７）、温度０〜−７
℃（特に−５〜−６℃）、３０分間〜１５時間（特に１
〜５時間）程度が例示される。
【００１７】濾過処理条件 孔径０．４〜２０μｍ、濾過面積２０〜３０ｍ2 （液量
１０００〜５０００Ｌ当たり）、圧力３Ｋｇ／ｃｍ2 以
下、濾過時間１０時間以内の条件下に濾過処理を行うこ
とが例示される。孔径の好ましい範囲は０．６〜４μｍ
である。このうち、最も好ましいのは０．６〜２μｍの
孔径幅を有する濾過材（例、ゼータプラス３０ＬＡ）で
あるが、０．９〜４μｍの孔径幅を有する濾過材（例、
ゼータプラス１０ＬＡ）も同程度に好ましい。０．４〜
１μｍの孔径幅を有する濾過材（例、ゼータプラス５０
ＬＡ）も上記の２種には劣るものの使用可能である。好
ましい圧力は１ｋｇ／ｃｍ2 である。また、濾過助剤を
使用することもできる。
【００１８】（３）第IV沈殿画分と同上清画分の分離 第II＋III 上清画分をエタノール濃度３５〜４５％で処
理して上清画分と沈殿画分とに分離する。沈殿画分より
アンチトロンビン−III 、ハプトグロビン等を回収する
ことができる。 エタノール処理条件 ｐＨ５〜７（特にｐＨ５．８〜６．３）、温度０〜−７
℃（特に−５〜−６℃）、３０分間〜１５時間（特に１
〜５時間）程度が例示される。
【００１９】濾過処理条件 孔径０．２〜１０μｍ、濾過面積２０〜３０ｍ2 （液量
１０００〜５０００Ｌ当たり）、圧力３Ｋｇ／ｃｍ2 以
下、濾過時間１０時間以内の条件下に濾過処理を行うこ
とが例示される。孔径の好ましい範囲は０．４〜２μｍ
である。このうち、最も好ましいのは０．４〜１μｍの
孔径幅を有する濾過材（例、ゼータプラス５０ＬＡ）で
あり、次いで好ましいのは０．６〜２μｍの孔径幅を有
する濾過材（例、ゼータプラス３０ＬＡ）である。好ま
しい圧力は１ｋｇ／ｃｍ2 である。また、濾過助剤を１
〜１００ｇ（液量１Ｌ当たり）程度添加することが好ま
しい。濾過助剤としてはケイソウ土等が例示される。
【００２０】（４）第Ｖ沈殿画分と同上清画分の分離 第IV上清画分をエタノール濃度３５〜４５％で処理して
上清画分と沈殿画分とに分離する。沈殿画分よりアルブ
ミン等を回収することができる。 エタノール処理条件 ｐＨ４〜５．５（特にｐＨ４．８〜５．２）、温度０〜
−７℃（特に−５〜−６℃）、３０分間〜１５時間（特
に１〜５時間）程度が例示される。
【００２１】濾過処理条件 孔径０．４〜２０μｍ、濾過面積２０〜３０ｍ2 （液量
１０００〜５０００Ｌ当たり）、圧力３Ｋｇ／ｃｍ2 以
下、濾過時間１０時間以内の条件下に濾過処理を行うこ
とが例示される。孔径の好ましい範囲は０．６〜４μｍ
である。このうち、最も好ましいのは０．６〜２μｍの
孔径幅を有する濾過材（例、ゼータプラス３０ＬＡ）で
あるが、０．９〜４μｍの孔径幅を有する濾過材（例、
ゼータプラス１０ＬＡ）も同程度に好ましい。０．４〜
１μｍの孔径幅を有する濾過材（例、ゼータプラス５０
ＬＡ）も上記の２種には劣るものの使用可能である。好
ましい圧力は１ｋｇ／ｃｍ2 である。また、濾過助剤を
使用することもできる。このようにして分画された血漿
蛋白は公知の手法により単離、精製することができる
（特開平３−１２８３９８を参照のこと）。
【００２２】
【発明の効果】本発明の方法によれば、血漿蛋白含有
物、特に血漿から血漿蛋白を効率よく分画することがで
きる。また、従来の遠心分離法に比較して、作業環境の
改善（危険性、騒音等）、血漿分画能力の増強、勤務体
制の改善（手間、勤務時間面）を図ることができる。
【００２３】
【実施例】本発明をさらに詳細に説明するために実施例
および実験例を挙げるが、本発明はこれらにより何ら限
定されるものではない。 実施例１ 血漿２０００Ｌからクリオペイスト、プロトロンビンお
よび血液凝固第IX因子を分離した後の上清画分２０００
Ｌに予め−２０℃に冷却されたエタノールを添加し、終
濃度８％とした。ｐＨ７．２、温度−２℃で２時間静置
して沈殿（第Ｉ画分）を生成した。ゼータプラス３０Ｌ
Ａ（孔径０．６〜２μｍ、キュノ社製）を用いて、濾過
面積１２ｍ2 、濾過圧力１Ｋｇ／ｃｍ2 以下の条件下で
濾過処理を行った。濾過助剤としてマンビル社製酸処理
セライト５３５を１０ｇ（液量１Ｌ当たり）使用した。
濾過装置は、ＳＥＩＺＴ社製、商品名ＯＲＩＯＮ Ｃ４
０（全長２９２０ｍｍ×幅７２０ｍｍ×高さ９８０ｍ
ｍ）を用いた。濾過処理は３時間で終了した。沈殿画分
は、フィブリノゲン製剤の原料となる。上清画分は次の
実施例に用いた。
【００２４】実施例２ 第Ｉ上清画分２３００Ｌに予め−２０℃に冷却されたエ
タノールを添加し、終濃度２１％ととした。ｐＨ６．
８、温度−５℃で２時間静置して沈殿（第II＋III 画
分）を生成した。ゼータプラス３０ＬＡを用いて、濾過
面積２４ｍ2 、濾過圧力１Ｋｇ／ｃｍ2 以下の条件下で
濾過処理を行った。濾過処理は９時間で終了した。沈殿
画分は、グロブリン製剤の原料となる。上清画分は次の
実施例に用いた。
【００２５】実施例３ 第II＋III 画分２７００Ｌに予め−３０℃に冷却された
エタノールを添加し、終濃度４０％とした。ｐＨ６．
０、温度−５℃で２時間静置して沈殿（第IV画分）を生
成した。ゼータプラス５０ＬＡ（孔径０．４〜１μｍ、
キュノ社製）を用いて、濾過面積１６ｍ2 、濾過圧力１
Ｋｇ／ｃｍ2 以下の条件下で濾過処理を行った。濾過助
剤としてマンビル社製酸処理セライト５３５を２０ｇ
（液量１Ｌ当たり）使用した。濾過処理は８時間で終了
した。沈殿画分は、アンチトロンビン−III 製剤および
ハプトグロビン製剤の原料となる。第IV上清画分は次の
実施例に用いた。
【００２６】実施例４ 第IV上清画分４０００Ｌ（エタノール終濃度４０％）を
ｐＨ４．８に調整し、温度−５℃で２時間静置して沈殿
（第Ｖ画分）を生成した。ゼータプラス３０ＬＡを用い
て、濾過面積２４ｍ2 、濾過圧力１Ｋｇ／ｃｍ2 以下の
条件下で濾過処理を行った。濾過処理は９時間で終了し
た。沈殿画分は、アルブミン製剤の原料となる。
【００２７】実施例５ 実施例３の第II＋III 沈殿画分からアンチトロンビン−
III を分離した後の画分を用いて、実施例３に準じて濾
過処理を行った。調製された沈殿画分はハプトグロビン
製剤の原料となる。 実験例１（処理時間） 実施例１の本発明法（濾過処理法）と同じ出発原料を同
量使用して、実施例１〜４に対応した各画分を夫々、従
来法（シャープレス型遠心分離装置（例、商品名シャー
プレスＮｏ６Ａ）を用いた遠心分離法）で上清画分と沈
殿画分とを分離回収するのに必要な時間を比較検討し
た。尚、従来法のエタノール処理条件は、実施例と同様
に行った。
【００２８】結果を表１に示す。
【００２９】
【表１】
【００３０】実験例２（収量の比較） 実験例１と同様に本発明法（濾過処理法）と従来法（遠
心分離法）で各々調製された沈殿画分（ペイスト）から
常法により回収できる血漿蛋白の量を比較検討してみ
た。量は血漿１０００Ｌ当たりの換算値で表示した。結
果を表２に示す。尚、表２中、第IV画分のアンチトロン
ビン−III の「１倍」は正常人血漿１ｍｌに含まれるア
ンチトロンビン−III 量に相当する。
【００３１】
【表２】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 1/34 8318−4Ｈ 14/745 8318−4Ｈ 14/75 8318−4Ｈ 14/765 8318−4Ｈ (72)発明者 祇園 吉彦 大阪府高槻市大塚町４丁目12番１号 株式 会社ミドリ十字淀川工場内 (72)発明者 冨岡 新二 大阪府高槻市大塚町４丁目12番１号 株式 会社ミドリ十字淀川工場内 (72)発明者 木村 清 大阪府高槻市大塚町４丁目12番１号 株式 会社ミドリ十字淀川工場内 (72)発明者 高橋 剛 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 西槇 秀雄 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 武智 和男 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 血漿蛋白含有物をエタノール濃度５〜１
    ０％、ｐＨ６．８〜７．４の条件下での低温分画処理後
    に孔径０．４〜２０μｍ、濾過面積５〜１５ｍ2 （液量
    １０００〜５０００Ｌ当たり）、圧力３Ｋｇ／ｃｍ2 以
    下の条件下に濾過処理を行うことにより第Ｉ沈殿画分お
    よび第Ｉ上清画分を分離回収することを特徴とする血漿
    蛋白の分画方法。
  2. 【請求項２】 第Ｉ上清画分をエタノール濃度１８〜３
    ０％、ｐＨ４．５〜８の条件下での低温分画処理後に孔
    径０．４〜２０μｍ、濾過面積２０〜３０ｍ2 （液量１
    ０００〜５０００Ｌ当たり）、圧力３Ｋｇ／ｃｍ2 以下
    の条件下に濾過処理を行うことにより第II＋III 沈殿画
    分および第II＋III 上清画分を分離回収することを特徴
    とする血漿蛋白の分画方法。
  3. 【請求項３】 第II＋III 上清画分をエタノール濃度３
    ５〜４５％、ｐＨ５〜７の条件下での低温分画処理後に
    孔径０．２〜１０μｍ、濾過面積１０〜２０ｍ2 （液量
    １０００〜５０００Ｌ当たり）、圧力３Ｋｇ／ｃｍ2 以
    下の条件下に濾過処理を行うことにより第IV沈殿画分お
    よび第IV上清画分を分離回収することを特徴とする血漿
    蛋白の分画方法。
  4. 【請求項４】 第IV上清画分をエタノール濃度３５〜４
    ５％、ｐＨ４〜５．５の条件下での低温分画処理後に孔
    径０．４〜２０μｍ、濾過面積２０〜３０ｍ2 （液量１
    ０００〜５０００Ｌ当たり）、圧力３Ｋｇ／ｃｍ2 以下
    に濾過処理を行うことにより第Ｖ沈殿画分および第Ｖ上
    清画分を分離回収することを特徴とする血漿蛋白の分画
    方法。
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