JPH0716397B2

JPH0716397B2 - 液中通気式培養方法及び培養装置

Info

Publication number: JPH0716397B2
Application number: JP1215037A
Authority: JP
Inventors: 昌彦石田
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1989-08-23
Filing date: 1989-08-23
Publication date: 1995-03-01
Anticipated expiration: 2010-03-01
Also published as: JPH0380071A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は生物細胞の液中通気式懸濁培養方法及び培養装
置及び培養システムに関する。

〔従来の技術〕

近年、動物細胞、植物細胞及び微生物細胞の懸濁培養
は、医薬品等の有用物質生産用の主流技術になりつつあ
る。

これらの細胞を懸濁培養するための従来の代表的な方法
として、ドラフトチューブ付エアリフト方式が知られて
いる。この方式について記載されている文献には例えば
以下のものがある。

（１）特開昭63−84492号公報（公開1986年）（２）化学技術誌,21巻,No.7,p.21（昭和58年）（３）アクタ．ビオテクノロギカ，２，（１）,3（1982
年）第３頁から第41頁（Acta Biotechnologica ２，
（１）p.31〜41（1982））（４）トレンズ．イン．バイオテクノロジー,3巻,No.7,
第162頁から第166頁（Trends in Biotechnology,３，
（７）p.162〜166（1985））（５）バイオテクノロジー．アンド．バイオエンジニア
リング,XIX,1503頁から1522頁（Biotechnology and Bio
engineering,XIX,p.1503〜1522（1977））これらの方法は、液中にガスを通気することにより、生体反応に必要なガスを培養液中に溶解させると同時
に、培養液を混合して細胞を液中に懸垂状態にできる利点
を有し、さらに、機械撹拌の様に複雑な構造を有しな
いため、大型化にも対応できる特徴を有している。

しかしながら、これらの方法は、細胞の培養に際し、以
下のような問題点を有している。

通気するガスとしては、空気だけでなく、空気よりも
コストの高い酸素、炭酸ガス、窒素等を富化した混合ガ
スを用いる場合が多い。

通気ガスは、微生物フィルタ濾過等により、無菌処理
しなければならない。

数日から数箇月間にわたる培養期間中、連続的に通気
を続ける必要があり、大量の通気ガスを消費する。

培養期間中に、細胞の濃度や液の粘度だけでなく、培
養液中の各細胞が母細胞から娘細胞に分裂して増殖して
いく過程における細胞集団としての細胞の分離のしやす
さ、細胞相互の接触時の付着しやすさ等の細胞特性が刻
々と変化し、それにつれて、細胞及び細胞集塊の比重す
なわち沈降特性が変化する。

通常ガスの溶解に必要な通気量に比べ、液の流動に必
要な通気量の方が大きい。

たとえ一時的であっても、細胞濃度や細胞の比重、液
性の変化に通気量が対応できず、一旦細胞が槽底部に沈
積すると、細胞相互の粘着、接着がおこりやすく、通気
量を増大しても最懸濁が困難になる。沈積すると、沈積
層中の細胞が酸素及び栄養成分の欠乏をおこし、増殖阻
害もしくは死に至る。

過度の通気は、却って細胞の増殖を阻害する。特に、
脆弱な動物細胞には影響が大きい。

動物細胞の培養のように、培地に血清やアルブミン等
の蛋白質を添加したり、蛋白性の生成物を分泌する場合
には、細胞を破壊しない消泡機構を設ける必要がおこる
が、通気量が大きいとそれだけ消泡機構への負荷が増大
し、消泡機構の容量が大きくなる。

このように、前述した従来のドラフトチューブ付エアリ
フト方式の培養槽では、ある特定の固定した条件下、例
えば、ある特定の細胞濃度、細胞比重、液性のもとで、
流動を最適化した構造に固定されており、条件が変化し
た場合には、通気量を規制するしか手段がなかった。こ
のため、条件の変化によっては、最適の構造を用いた場
合よりも、通気量が大きくなり、経済性が低下するだけ
でなく、運転の操作範囲を広く取りにくい等の幾多の欠
点があった。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明の目的は、前記従来のドラフトチューブもしくは
整流板付エアリフト方式の培養装置の欠点を改善し、細
胞濃度、細胞の比重、細胞の付着性等の細胞特性と、粘
度等の液性に対応して、かつ低通気量でも細胞を沈積さ
せずに円滑に流動化しうる培養装置及び培養方法及び培
養システムを提供することである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明の発明者は、まず細胞の沈積の原因について検討
したところ、細胞が静止又は低流速下で相互に接触する
と細胞どうしが付着して沈降しやすくなり、一旦沈積す
ると沈積層の再分散が困難になることがわかった。特
に、動物細胞ではその傾向が著しいことを見いだした。
沈積層の内側ある細胞は表層の細胞に酸素と栄養成分の
拡散が妨げられ、増殖が阻害されたり死に至ったりす
る。

発明者は更に、培養槽底部とドラフトチューブもしくは
整流板下部の近傍の細胞の流れに着目し、細胞濃度や液
性を変えながら流動状態を観察した。その結果、槽底部
及びドラフトチューブもしくは整流板下部の細胞濃度と
それ以外の場所における細胞濃度との対比に基づいて槽
底部とドラフトチューブもしくは整流板下部との間隙を
調節することにより、培養期間中に細胞濃度が変化して
も、従来のドラフトチューブもしくは整流板の固定され
た培養槽を用いた場合よりも格段に低い通気量で細胞を
沈積させずに円滑に流動化できることを見いだした。

本発明は上記したような観察から得られた結果に基づい
てなされたものである。

本発明は、液中に通気して懸濁状態で生物細胞にガスを
供給するドラフトチューブもしくは整流板内蔵型培養槽
を用いる培養方法において、ドラフトチューブもしくは
整流板の下端と槽底部との間隙を変化させ細胞の流動を
調節することを特徴とする生物細胞の培養方法であり、
槽内底部とその他の槽内部とにおける細胞濃度の差を検
知して、該濃度が予め設定された濃度差の範囲内である
ようにドラフトチューブもしくは整流板を移動してドラ
フトチューブもしくは整流板下端と槽底部との間隙を調
節すること、槽内培養液中の酸素、炭酸ガスの一方もし
くは両者の濃度をも検知して、該濃度が予め設定された
溶存ガス濃度の範囲内であるように通気ガス中のガス濃
度を調節すること、槽内培養液中のpHをも検知して、該
pHが予め設定されたpHの範囲内であるように通気ガス中
の炭酸ガス濃度を調節すること、また前記濃度の調節は
細胞濃度差を最優先し、続いて溶存酸素濃度、pHのいず
れかを優先して行うこと、そして溶存酸素濃度の調節に
際し、該調節が原料ガスの混合ガス中の酸素濃度の増加
によっては対応できない場合には、通気量を増大させる
ことにより溶存酸素濃度の調節を行うこと、さらにドラ
フトチューブもしくは整流板の上端が液面上に出ない範
囲内でドラフトチューブもしくは整流板の上端と液面と
の間隔をも変化させることは、本発明の生物細胞の培養
方法を実施するうえでの具体的乃至より好ましい態様で
ある。

また本発明は通気により生ずるドラフトチューブもしく
は整流板下端と槽底部との間隙部分の液の流れにおける
供試細胞の線速度の上限が3m/s.となるように通気量を
限定することを特徴とする生物細胞の培養方法であり、
好ましくは前記液流速が3m/s.をこえるばあいには前記
間隙を増加し、ついで細胞濃度差を検知して該濃度差が
設定値を越えている場合には、設定範囲内になるよう通
気量を増加させて細胞濃度差、溶存ガス濃度、液線速度
を満足するように調節するものである。

また本発明は、液中に通気して懸濁状態で生物細胞に酸
素供給する培養槽において、ドラフトチューブもしくは
整流板の上端が液面上に出ない範囲内で上下方向に移動
可能なドラフトチューブもしくは整流板を内蔵したこと
を特徴とする生物細胞用の培養槽であり、前記ドラフト
チューブもしくは整流板下方部、ドラフトチューブもし
くは整流板上方部のいずれかもしくは両方が上下動自在
であること、ドラフトチューブが内筒と外筒とから構成
されること、ドラフトチューブもしくは整流板の一部が
槽に固定され、かつ他の部分は可動であること、ドラフ
トチューブもしくは整流板を動かす機構がベローズもし
くはピストンへの流体の入出機構、ギア付モータによる
駆動機構、熱膨張材料の伸縮機構、マグネット駆動機構
のいずれかもしくはそれらが重複したものであること
は、本発明の具体的乃至より好ましい態様である。

さらに本発明は、前記した培養槽を直列、あるいは液の
流れにおいて直列と並列とが混合されている状態に複数
積層することを特徴とする生物細胞の培養システムであ
り、本発明の目的を達成するうえで具体的乃至より好ま
しい態様としては、培養槽内に、ドラフトチューブもし
くは整流板の動きを制御する手段及びその他細胞の培養
条件を制御する手段、例えばDO制御系、pH制御系、培地
供給系を含むこと、そして前記複数積層された培養槽の
各槽におけるドラフトチューブもしくは整流板の動き及
びその他の細胞の培養条件を個別に制御できるようにす
ることである。

なお、前記本発明の態様において、液の流れにおいて培
養槽を直列の状態に積層するとは、第11図のＨに示すよ
うに積層された培養槽内を順次流れる液が１方向の流れ
の状態になるように積層されていることを意味し、ま
た、液の流れにおいて培養槽を並列の状態に積層すると
は、第11図のＪに示すように積層された培養槽内を流れ
る液が並列の流れの状態になるように積層されているこ
とを意味する。したがって、液の流れにおいて直列と並
列とが混合されている状態に複数積層するとは、第11図
Ｉに示すような状態を意味するものである。

本発明に適用でいる生物細胞は特には限定されない。す
なわち、動物細胞、植物細胞、微生物細胞に適用するこ
とができる。これらの細胞は単独状態であっても集合状
態であってもよい。集合状態とは、細胞相互が付着した
フロックや器官や組織を指す。また、他材料を担体とし
て粒状化したものも含むことができる。例えば、細胞を
付着させたマイクロビーズや細胞を包括した細胞包括ゲ
ル粒子等も含まれる。

培地も特に限定されない。すなわち、供試細胞又は培養
条件等に適した培地を適宜選択して用いることができ
る。例えば、炭素源としては、低分子から高分子にわた
る糖類、有機酸、アルコール等、窒素源としてはアミノ
酸、ペプチド、無機窒素源等が用いられる。その他、細
胞の種類、培養条件に応じ、血清、アルブミン、ビタミ
ン類、無機塩類、有機pH緩衝剤、抗生物質、増殖促進因
子、接着因子、分化因子等の成分も用いられる。

本発明の培養は、細胞又は細胞を含む粒状物を液中に懸
垂状態で流動させて培養する方式に限定される。すなわ
ち、液中に気体を注入し、気泡と液とを接触させること
により、細胞の生体反応やpH等の液性調節に必要なガス
成分を溶解させると同時に、エアリフトを利用して粒状
物を液中に懸垂させる培養に限られる。この際、温度、
pH、其質濃度、溶存ガス濃度、イオン強度等も適宜、細
胞の種類、設定培養条件に応じ、一般の培養と同様、適
宜調節される。

通気するガスも適宜選択して用いればよい。一般的に
は、空気、酸素、炭酸ガスを単独又は、空気、酸素、炭
酸ガス、窒素のいずれかを混合して用いられる。これら
のガスは培養期間中、ガス組成を固定して用いても変化
させて用いてもどちらでもよい。

尚、これらのガスは、すべて、微生物フィルター濾過等
により無菌処理したものが用いられる。

培養槽としては、上記した培養に適した培養槽のうち、
ドラフトチューブもしくは整流板を有するものであれば
特には限定されない。例えば、円筒形、角柱形、板状形
等の形状のものを用いることができる。特に、角柱形、
板状形のものは複数積層しても用いることが出来るので
好ましい。

ドラフトチューブは、直円筒か、上下方向に直径が変化
するものでもよく、培養槽形状、培養条件により適宜選
択される。後者については、例えば円錐形、下方部また
は上方部もしくは両部がロート状に拡張した形状のもの
が用いられる。培養槽が角柱形又は板状形の場合には、
２次元的形状の整流板を用いる。

ドラフトチューブもしくは整流板内の液の流れが上昇
流、下降流のいずれを選択するかにより、ドラフトチュ
ーブもしくは整流板の形状も適宜選択される。例えば、
上昇流には下方部を拡大したドラフトチューブもしくは
整流板が適している。

本発明においては、前記したように、槽底部とその他の
部分との細胞濃度の差を検知して、設定範囲を越える場
合、すなわち細胞が沈降傾向にある場合は、ドラフトチ
ューブもしくは整流板下端と槽底部との間隙を調節し
て、間隙部分での液の線速度を変化させる。

細胞濃度の検知箇所は、少なくとも２個所必要である。
すなわち槽底部もしくはその近傍と、その他の場所、例
えば、槽中央部や槽上半部等である。

細胞濃度の測定方法は特に限定されるものではない。例
えば、透過光又は透過波もしくは反射光反射波もしくは
散乱光を用いる濁度計等の粒子濃度測定装置や、画像計
測による粒子濃度測定装置等がある。

ドラフトチューブもしくは整流板の上下方向の移動や伸
縮は、槽内のスチーム殺菌に耐え、かつ培養期間中、槽
内を無菌状態に保つことができる機構であればよい。具
体的な例としては、槽外からの流体の出入により作動さ
せるベローズの伸縮や、シールした電動機や電磁石ピス
トン等がある。この際、動力を発生する部分や動力伝達
機構は槽の内部でも外部にあってもよい。

ドラフトチューブもしくは整流板は下方部だけでなく、
上方部も、液面末端を限定範囲として移動、伸縮するこ
とができ、槽内の液の流動を一層敵した状態にすること
も可能である。

ドラフトチューブもしくは整流板の伸縮は、分割したド
ラフトチューブもしくは整流板が２重又は多重に組み合
わされることによっても、またそれらが伸縮性の材料で
構成されることによってもできる。ドラフトチューブの
場合には、分割されたチューブが２重筒又は多重筒に形
成され、それらが水平方向には移動せずに上下方向にの
み移動してもよいし、ネジ機構により相互に回転して伸
縮してもよいし、それらの複合された手段により伸縮す
るものでもよい。

槽底部の構造は、液の流動を円滑にする形状であればよ
い。例えば、なだらかな凹面やさらに凹面の中央部だけ
凸状にしてもよい。

通気ノズルも培養条件により適宜選択される。通常は、
槽底部と、ドラフトチューブもしくは整流板下端との中
間部に設けられる。槽底部の流動化を円滑にするため槽
底面に開口する補助用通気ノズルを設けてもよい。

培養には、液の流動化以外に、溶存ガスの供給も必要で
ある。

本発明においては、細胞濃度差を第１優先し、さらに其
質用ガスの溶存濃度、pHのうち、少なくともこの２つ以
上において、この優先順で調節する。例えば、動物細胞
の培養の例としては、細胞濃度差による通気ガス両、溶
存酸素濃度に対応する通気ガス組成、pHに対応する通気
ガス中の炭酸ガス濃度の優先順で制御する。

もし、溶存酸素濃度の調節に際し、原料ガスの通気用混
合ガス中の濃度が調節の限界を越える場合には、溶存濃
度の調節を細胞濃度差調節に優先し、すなわち通気量を
細胞濃度差調節に適した量以上に増加して通気させるも
のである。

上記したような運転方法をとることにより、液の流動を
円滑にし、かつ溶存酸素濃度等、他の必要条件をも満た
すことができる。

以下に本発明の実施例について詳述する。

〈実施例１〉第１図に示すものは、本発明の培養システムにかかる一
実施例のフローチャートである。

培養槽１はドラフトチューブ外筒支持体５により槽内壁
面で固定されたドラフトチューブ外筒３と、ドラフトチ
ューブ内筒上下駆動部６により上下可動なドラフトチュ
ーブ内筒４からなる円筒形ドラフトチューブを内蔵して
いる。

培養槽には、液体培地27が液体培地貯槽29から培養槽１
内に導入され、必要に応じ培養液28を培養液貯槽30に抜
き出すことができるようになっている。

ガス集合配管18から空気、酸素、窒素、炭酸ガスを配合
したガスが移送され、ドラフトチューブ底部のスパージ
ャー７から培養液中に散気される。

培養槽底部への細胞の沈積を監視するため、細胞濃度セ
ンサー10、具体的には例えば濁度センサーが２箇所に設
置されている。一方は培養槽底部とドラフトチューブ内
筒下端との間隙もしくはその近傍に、他方は前者との比
較のため前者と離れた位置、例えば槽内上部に設置され
る。上記センサーと細胞濃度検出装置16で細胞濃度差を
測定し、設定濃度差の域内に入るよう、間隙コントロー
ラ15によりドラフトチューブ内筒上下駆動部６に信号を
送り、円筒を上下させることにより間隙を調節する。

液上面で消泡する必要がある場合には、液面上に消泡用
のネット２を設けることもできる。

溶存酸素はDOセンサー12によりDOコントローラー13で、
pHはpHセンサー11によりpHコントローラ14で調節され
る。DOは通気ガスの組成と通気量を調節することによ
り、pHは、例えば通気ガス中の炭酸ガス濃度及び通気量
を変化させて調節することができる。また、縁切間隙に
液流速センサー31を付設し、間隙での液を線速度を液流
速検出器32で測定し、前記線速度が細胞の剪断が起こる
ことのない流速域内に入るよう通気ガス量と間隙を調節
する。

本発明の第１実施例の生物細胞の培養に用いられる培養
装置は下記の通りである。

◎培養槽形状：円筒形張込液量:5 槽内径 :120mm 槽内深さ:600mm ◎ドラフトチューブ外筒上部：直径50mm,長さ33mm 外筒下部：直径80mm,長さ50mm 内筒：直径75mm,長さ90mm 上記培養装置のドラフトチューブにおける内筒の上下機
構を第２図に示す。

外筒３と外筒支持体５付近に金属製ベローズ36を配置
し、ベローズ伸縮伝達肢38を介してベローズ下部とドラ
フトチューブ内筒とを接続している。ベローズ上部のエ
ア駆動ベローズ用給排気管37より圧縮空気を導入排出す
ることにより、ベローズを伸縮して内筒４を上下させ
る。

槽内の温度は恒温水循環ジャケット33により一定に調節
されている。

第３図に示すものは、本実施例におけるフローチャート
である。

本培養方法及び培養装置を用いて細胞濃度、pH,DO,ドラ
フトチューブもしくは整流板の下端と槽底部との間隙等
を調節しながら培養した場合と、他の例とを比較した結
果を以下に述べる。

○培養条件供試細胞はラット肝臓の癌細胞株JTC−１′（Japan Ti
ssue Culture No.1株）を用いる。

種培養はイーグルMEM培地を用い、偏平フラスコで培養
後、ローラボトルで培養する。

培養温度は37℃である。

上記培養液を遠心分離して細胞を回収して接種用細胞と
する。

培養槽内にイーグルMEM培地を５導入後、細胞濃度が
１×10⁶cells/mlになるように上記種細胞を接種し、36
〜38℃,pH6.8〜7.2,DO2.5〜3.0ppmになるように調節し
ながら、回分式で10日間培養する。

以上のような条件のもとで培養を行い、培養開始後34時
間までの調節結果が第４図に示されている。

○調節のプロセス種細胞を接種後、通気を開始し10分経過後、細胞濃度
差、DO、pH、間隙の液流速の測定を開始した。

DO及びpHが徐々に低下し、５時間後に両者とも設定下
限（第４図点線で表示）に達した。

DOについては酸素ガス濃度を上昇させ、pHについては
炭酸ガス濃度を低下させて調節した。開始後18時間後に
も同様の調節を行った。

21時間後に細胞濃度差分率、すなわち、が設定上限である10％を越え、槽底部への沈積が検知さ
れたため、間隙を5cmから4cmに減少させた結果、間隙部
分における液線速度が0.5m/s.から0.7m/s.に増加すると
ともに、細胞濃度差分率も設定上限以下となり、細胞の
沈積を防止することができた。

32時間後、再びDOが設定下限に達したが、通気ガスの
酸素濃度がすでに調節上限の40％に達していて酸素濃度
を上昇することができなかったため通気速度を0.3/mi
n.から0.35/min.に増加した。この操作を行った結果D
Oは再び設定領域内に戻った。この時、間隙での線速度
は1m/s.と設定上限（3m/s.）内であったので、間隙は変
化させることなく培養を続行した。

もし前記の場合において、液線速度が設定上限以上
に達する場合には、第３図のフローチャートに示すよう
に、間隙を開いて3m/s.以下になるようにし、再び細胞
濃度差を測定する。この時、細胞濃度差が設定域内であ
るならそのまま培養を続け、もし設定域をこえる場合に
は、設定域内に入るまでガス線速度を増加させることに
より対応することになる。

○比較例１ドラフトチューブもしくは整流板の下端と槽底部との間
隙を調節せずに10cmに固定する以外は、上記した実施例
１の場合と同様の培養装置、同様の細胞を用い、同様な
操作で10日間培養した。

○比較例２ドラフトチューブもしくは整流板の下端と槽底部との間
隙を調節せずに0.4cmに固定する以外は、実施例１の場
合と同様の培養装置、同様の細胞を用い、同様な操作で
10日間培養した。

○培養成績以上３例の培養結果の概略を第１表に示した。

実施例１の場合には、比較例１及び２に比べ、到達細胞
濃度及び生存率が高く、かつ小さい通気量で培養できる
ことがわかる。

比較例１の場合は通気量を増大させることにより、実施
例１の場合と同様に細胞を均一に懸垂した状態に保って
培養できるが、実施例１の３倍の通気量を必要としか
つ、細胞濃度及び生存率も実施例１に及ばない。

比較例２は間隙が狭く固定されているため、細胞が槽底
部に沈積しつつ、順次再懸濁化する状態で平衡状態を維
持するものであった。そして間隙が狭いため間隙での液
線速度が細胞への剪断が生ずる3m/s.に接近した他、沈
積した細胞への酸素供給、栄養成分の拡散が不十分にな
ったため、細胞濃度及び生存率は実施例１の成績に比
べ、著しく劣るものであった。

〈実施例２〉実施例１と同様の培養槽の上部を透明ガラスとし、白色
光源により液面の照度を1000ルックスに保ち、クロレラ
・エリプソイデアを回文式で懸濁培養する。

本発明の第２実施例の生物細胞の培養に用いられる諸条
件は下記の通りである。

張込液量:5 培地：ブリストル培地接種濃度:5×10⁶cells/ml pH :6.6〜7.5 温度:27〜29℃ 通気ガス：空気、炭酸ガス（上限10％）、窒素の混合ガ
ス次いで、本発明の第２実施例として後に詳述する培養方
法及び培養装置を用いて、ドラフトチューブもしくは整
流板の下端と槽底部との間隙を調節しながら回分式で20
日間、懸濁培養した場合と、他の例とを比較した結果を
以下に述べる。

○比較例３ドラフトチューブもしくは整流板下端と槽底部との間隙
を調節せずに8cmに固定する以外は、実施例２と同様の
培養装置、同様の細胞を用い、同様の操作で20日間培養
した。

○比較例４ドラフトチューブもしくは整流板下端と槽底部との間隙
を0.4cmに固定する以外は、実施例２と同様の培養装
置、同様の細胞を用い、同様の操作で20日間培養した。

以上３例の結果の概略を第２表に示した。

第２表からも明らかなように、本発明の実施例２により
培養すると、比較例3,4に示すようなドラフトチューブ
もしくは整流板下端と槽底部との間隙が固定されている
従来の方法及び装置を用いた場合に比べ、培養効率が格
段に優れており、又、通気ガス量を大幅に削減できる。

〔作用〕以上述べたように、本発明の生物細胞培養方法及び培養
装置及び培養システムによれば、ドラフトチューブもし
くは整流板の下端と槽底部との間隙を変化させ細胞の流
動を調節し、しかも培養槽内底部とその他の槽内部とに
おける細胞濃度の差を検知して前記間隙を変化させるば
かりでなく、槽内培養液中の酸素、炭酸ガスの一方もし
くは両者の濃度をも検知して、さらには、槽内培養液中
のpHをも検知し、設定溶存ガス濃度の範囲内に、あるい
は設定pH範囲内であるように通気ガス中のガス濃度ある
いはpHをも調節するから、細胞の濃度、液の粘度、細胞
特性の変化による細胞及び細胞集塊の比重すなわち沈降
特性の変化に通気量がよく対応でき、細胞の槽底部への
沈降を防ぎ、細胞が酸素及び栄養分の欠乏を起こすこと
による増殖阻害、もしくは細胞の死を排除することがで
きるから、常に一定の精度により生物細胞の培養を行う
ことができる。

〈実施例３〉第５図に示すように、本発明の生物細胞の培養装置に用
いる円筒形ドラフトチューブである。

第５図において、 A:培養槽１内に配置したドラフトチューブ８全体が上下
駆動装置７により上下動する形式。

B:培養槽１の外部に上下駆動装置を有する形式。

C:ドラフトチューブが上下分割され、上部のドラフトチ
ューブ内筒９が固定され、下部のドラフトチューブ外筒
６が上下動する形式。

D:上中下３分割され、中間の外筒のみ固定されていて、
上下両内筒5,6が上下動する形式。

のものがそれぞれ示されている。

〈実施例４〉第６図に示すように、培養槽壁をドラフトチューブと共
有するか、もしくは整流板を有する培養槽である。

第６図において、 E:槽の水平断面が矩形で、整流板と槽側壁とでドラフト
チューブ4,5が形成されており、ドラフトチューブ上部
４は固定され、ドラフトチューブ下部５が上下動する形
式。

F:槽側面に平行して整流板を有しており、整流板５は固
定され、整流板８が上下動する形式。

G:槽の横方向に貫通した空洞部により培養槽２とドラフ
トチューブ４とに分割され、ドラフトチューブ４の下部
に設けられた整流板８を上下させる形式。

のものがそれぞれ示されている。

〈実施例５〉第７図に示すように、ドラフトチューブ内筒の上下によ
る間隙調節以外に、ドラフトチューブ底面に対向する培
養槽底面を凹に、スパージャー近傍の槽底面を凸にそれ
ぞれ形成し、沈降する細胞が液の上昇流に乗りやすくし
た培養槽である。

〈実施例６〉第８図に示すように、ドラフトチューブ内筒の上下によ
る間隙調節以外に、底面上部の主スパージャーとは別の
副スパージャーを底面に設け、底面に滞留しやすい細胞
を液の上昇流に乗せやすくした培養槽である。

〈実施例７〉第９図に示すように、実施例４のＥにおいて、さらにド
ラフトチューブの中間部分を固定し、上部の整流板を上
下させる形式のものをユニット化した培養槽である。

本実施例の形式のものは、張込液量に対応して使用でき
る。例えば、培養開始時には小液量で培養し、培養の進
行にともない、順次培地を追加する、いわゆる流加培養
にも使用できる。

〈実施例８〉第10図に示すように、実施例７のユニット培養槽を複数
基積層した培養槽である。

本実施例におけるユニット培養槽の組合せの例が第11図
に示されている。すなわち、 H:単純直列方式。

I:並列に接続したユニット培養槽群を直列に配管するも
の。

J:積層形培養槽をユニット培養槽群に分け、それぞれを
別個に運転するもの。図においては、並列結合した２つ
のユニット培養槽に分けて運転するフローチャートを例
示している。

〔効果〕

以上述べたように、本発明の液中通気式培養方法は、液
中に通気して懸濁状態で生物細胞にガスを供給するドラ
フトチューブもしくは整流板内蔵型培養槽を用いる培養
方法において、ドラフトチューブもしくは整流板下端と
槽底部との間隙を変化させ細胞の流動を調節するもので
あり、槽内底とその他の槽内部とにおける細胞濃度の差
を検知して、該差が予め設定された濃度差の範囲内であ
るようにドラフトチューブもしくは整流板を移動させて
ドラフトチューブもしくは整流板下端と槽底部との間隙
を調節するものであり、さらには槽内培養液中の酸素、
炭酸ガス、またpHをも検知しそれらが予め設定された範
囲内であるようにドラフトチューブもしくは整流板下端
と槽底部との間隙を調節するものであるから、槽内の培
養液の流動を常に円滑にし、かつ大量の通気ガスを必要
としないという大きな効果を有している。

又、生物細胞の培養においては、培養期間中に、細胞の
濃度や液の粘度だけでなく、培養液中の各細胞が母細胞
から娘細胞に分裂して増殖していく過程における細胞の
分離のしやすさ、細胞相互の接触時の付着しやすさ等の
細胞特性が刻々と変化し、それにつれて、細胞及び細胞
集塊の比重すなわち沈降特性が変化するものであるが、
本発明の培養方法によれば、細胞濃度差のみならず培養
液中の酸素、炭酸ガスの濃度、さらにはpHをも検知し、
これらの濃度を調節し、ドラフトチューブもしくは整流
板下端と槽内底部との間隙を調節するので、培養を効率
よく高精度に行うために必要な条件を満たすことができ
る、という優れた効果をもたらすものである。

更に本発明の培養方法においては、細胞の沈積を通気量
のみにより防ぐものではないから、過度の通気により却
って細胞の増殖を阻害するようなこともなく、特に脆弱
な動物細胞の培養に好結果を与えることができる、とい
う優れた効果を有している。

そして本発明は、液中に通気して懸濁状態で生物細胞に
酸素供給する培養槽において、ドラフトチューブもしく
は整流板の上端が液面上に出ない範囲内で上下方向に移
動可能なドラフトチューブもしくは整流板を内蔵した生
物細胞の培養槽であり、又ドラフトチューブもしくは整
流板下方部、ドラフトチューブもしくは整流板上方部の
いずれかもしくは両方が上下動自在であるドラフトチュ
ーブもしくは整流板を内蔵した生物細胞の培養槽である
から、生物細胞の培養期間中に培養の条件、具体的には
例えば、細胞濃度、細胞比重、液性等が変化した場合に
は、従来のものにおいては、通気量の増減により制御す
るしか手段がなく、経済性が低下し、運転の操作範囲を
広くとることが困難であったが、本発明の培養槽を使用
し、ドラフトチューブもしくは整流板下端と槽底部との
間隙を変化させることにより、前記したような培養条件
の変化にも素早く対応することができ、低通気量でも細
胞を沈積させずに円滑に流動させることができ、運転の
操作範囲が広く、経済効果も高くなる、という卓越した
効果を得ることができるものである。

さらに本発明の実施例に記載したように、本発明の培養
槽を複数積層して用いることにより、異バッチ培養の並
列運転を、熱、通気ガス、培養液を削減した状態の下で
行うことができ、経済的な効果が大であり、さらには培
養のスケールアップにも著しい効果を発揮するものであ
る。

また、従来のドラフトチューブを固定する培養方法、培
養装置及び培養システムは培養期間中に槽内張込液量を
変えることは実質上不可能であるが、本発明の培養方法
又は培養装置或いは培養システムによれば、培養期間中
に槽内張込液量を変化させながら培養を行うことができ
る。例えば、種培養から本培養まで同一槽で継続して行
うこともできる。すなわち、培養の規模、培養液中の細
胞の特性の変化に応じて常に適正な液量のもとで培養を
行うことができ、培養の精度を一定に保ち、ニーズによ
く応え、高い経済効果を得ることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第５〜10図は本発明の培養システム及び培養
装置を示す説明図、第２図は第１図のドラフトチューブ
チューブ内筒の上下駆動部分を拡大した図、第３図は本
発明の培養方法の説明図、第４図は本発明による培養の
進行に関する説明図、第11図は第10図に示された培養槽
の運転に関する説明図である。第12図は生物細胞の培養
期間中における槽内細胞分布状況を示す説明図である。 0:培養槽,1:ドラフトチューブ,2:消泡ネット,3:ドラフ
トチューブ外筒,4:ドラフトチューブ内筒,5:ドラフトチ
ューブ外筒支持対,6:ドラフトチューブ内筒上下駆動部,
7:スパージヤー,8:エアフィルター,9:排気用配管,10:細
胞濃度センサー,11:pHセンサー,12:DOセンサー,13:DOコ
ントローラー,14:pHコントローラー,15:間隙コントロー
ラー,16:細胞濃度検出装置,17:ガス組成、流量コントロ
ーラー,18:ガス集合配管,19:酸素ガス貯槽,20:窒素ガス
貯槽,21:炭酸ガス貯槽,22:エアコンプレッサー,23,24,2
5,26:流量調節弁,27:液体培地,28:培養液,29:液体培地
貯槽,30:培養液貯槽,31:液流速センサー,32:液流速検出
器,33:恒温水ジャケット,34:ドラフトチューブ内筒上下
駆動部のケーシング,35:エア駆動ベローズ,36:エア駆動
ベローズ用給排気配管,37:ベローズ伸縮伝達肢,38:吊ア
ーム,39:整流板,40:整流板上下駆動装置,41:整流板上
部,42:整流板中部,43:整流板下部,44:槽底丘部,45:槽底
撹拌用スパージャー,46:スパージャー空気移送配管,47:
排気管,48:恒温水抜出配管,49:培養液抜出配管,50:培地
導入配管,51:恒温水導入配管,52,53:空気移送配管,54:
ガス移送配管,55:液流入配管 A:ユニット培養槽,B:積層培養槽,C:液移送配管

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】液中に通気して懸濁状態で生物細胞にガス
を供給するドラフトチューブもしくは整流板内蔵型培養
槽を用いる培養方法において、槽内底部とその他の槽内
部とにおける細胞濃度の差を検知して、該差が予め設定
された濃度差の範囲内となるようにドラフトチューブも
しくは整流板を移動してドラフトチューブもしくは整流
板の下端と培養槽底部との間隙を調節することを特徴と
する生物細胞の培養方法。
【請求項２】槽内培養液中の溶存酸素、炭酸ガスの一方
もしくは両者の濃度をも検知して、該濃度が予め設定さ
れた溶存ガス濃度の範囲内であるように通気ガス中のガ
ス濃度を調節することを特徴とする、請求項１記載の生
物細胞の培養方法。
【請求項３】槽内培養液中のpHをも検知して、該pHが予
め設定されたpHの範囲内であるように通気ガス中の炭酸
ガス濃度を調節することを特徴とする、請求項１または
２記載の生物細胞の培養方法。
【請求項４】細胞濃度差を最優先し、続いて溶存酸素濃
度、pHのいずれかを優先してドラフトチューブもしくは
整流板の下端と槽底部との間隙を調節することを特徴と
する、請求項１または３に記載の生物細胞の培養方法。
【請求項５】溶存酸素濃度の調節に際し、該調節が原料
ガスの混合ガス中の酸素濃度の増加によっては対応でき
ない場合には、通気量を増大させることにより溶存酸素
濃度の調節を行うことを特徴とする、請求項２乃至４の
いずれか１つに記載の生物細胞の培養方法。
【請求項６】ドラフトチューブもしくは整流板の上端と
液面との間隙をも変化させることを特徴とする、請求項
２乃至５のいずれか１つに記載の生物細胞の培養方法。
【請求項７】ドラフトチューブもしくは整流板の調節は
ドラフトチューブもしくは整流板の上端が液面上に出な
い範囲で行うことを特徴とする、請求項６記載の生物細
胞の培養方法。
【請求項８】液中に通気して懸濁状態で生物細胞にガス
を供給するドラフトチューブもしくは整流板内蔵型培養
槽を用いる培養方法において、通気により生ずるドラフ
トチューブもしくは整流板下端と槽底部との間隙部分の
液の流れにおける供試細胞の線速度の上限が3m/s.とな
るように通気量を限定する操作をドラフトチューブもし
くは整流板下端と槽底部との間隙を調節する操作と共に
行うことを特徴とする生物細胞の培養方法。
【請求項９】ドラフトチューブもしくは整流板下端と槽
底部との間隙部分の液の流れにおける供試細胞の線速度
が3m/s.を越える場合には、まず前記間隙を増加し、つ
いで細胞濃度差を検知して該濃度差が設定範囲を越えて
いる場合には、設定範囲内になるよう通気量を増加させ
て細胞濃度差、溶存ガス濃度、液線速度を満足させるよ
うに調節することを特徴とする、請求項８記載の生物細
胞の培養方法。
【請求項１０】ドラフトチューブもしくは整流板を移
動、伸縮させることにより槽底部との間隙、あるいは液
面との間隙を変化させることを特徴とする、請求項８ま
たは９に記載の生物細胞の培養方法。
【請求項１１】液中に通気して懸濁状態で生物細胞に酸
素供給する培養槽であって、相対的に移動可能な複数の
部材からなるドラフトチューブもしくは整流板を内蔵
し、かつ、該ドラフトチューブもしくは整流板の上端は
液面上に出ないようにされていることを特徴とする生物
細胞用の培養槽。
【請求項１２】前記ドラフトチューブもしくは整流板を
構成する相対的に移動可能に構成された部材のうちの１
の部材は培養槽に固定されていることを特徴とする請求
項11記載の生物細胞の培養槽。
【請求項１３】ドラフトチューブもしくは整流板を動か
す機構が、ベローズもしくはピストンへの流体の入出機
構、ギア付モーターによる駆動機構、熱膨張材料の伸縮
機構、マグネット駆動機構のいずれかもしくはこれらの
重複したものであることを特徴とする、請求項11または
12に記載の生物細胞の培養槽。
【請求項１４】請求項11乃至13のいずれか１つの培養槽
と、該培養槽に内蔵したドラフトチューブもしくは整流
板の動きを制御する手段及びその他の細胞培養条件制御
手段とを有することを特徴とする生物細胞の培養装置。
【請求項１５】その他の細胞培養条件制御手段が、DO制
御手段もしくはpH制御手段のいずれか、もしくは両者で
あることを特徴とする請求項16記載の生物細胞の培養装
置。
【請求項１６】培地供給手段をさらに有することを特徴
とする請求項14または15記載の生物細胞の培養装置。
【請求項１７】請求項14乃至16のいずれかに記載の培養
装置を単位とする培養装置を直列に複数積層したことを
特徴とする生物細胞の培養装置。
【請求項１８】請求項14乃至16のいずれかに記載の培養
装置を液の流れにおいて直列と並列とが混合している状
態で複数積層することを特徴とする生物細胞の培養装
置。
【請求項１９】複数積層した培養装置におけるドラフト
チューブもしくは整流板の動き、及びその他の細胞の培
養条件を個別に制御できるようにしたことを特徴とす
る、請求項17または18記載の生物細胞の培養装置。