JPH069426A - 骨形成促進剤 - Google Patents

骨形成促進剤

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JPH069426A
JPH069426A JP5121962A JP12196293A JPH069426A JP H069426 A JPH069426 A JP H069426A JP 5121962 A JP5121962 A JP 5121962A JP 12196293 A JP12196293 A JP 12196293A JP H069426 A JPH069426 A JP H069426A
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JP
Japan
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human
improvement
bone
human interleukin
cells
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Application number
JP5121962A
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English (en)
Inventor
Koji Ueno
好司 上野
Teruaki Katayama
輝昭 片山
Tsumoru Miyamoto
積 宮本
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Ono Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Ono Pharmaceutical Co Ltd
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 ヒトインターロイキン−4またはその類似体
を有効成分として含有する骨形成促進剤。 【効果】 骨粗鬆症、骨形成不全症、骨損傷および歯骨
異常の予防および治療、さらに骨の代謝異常の改善に有
用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトインターロイキン
−4またはその類似体を有効成分として含有する骨形成
促進剤に関する。
【0002】
【発明の背景】骨は、一旦成長してしまうと成長が止ま
ったように見えるが、決してそうではない。生体におい
て、骨は常に形成と吸収(代謝)を繰り返し、動的平衡
を保っている。細胞レベルで見ると、骨の形成には骨原
性細胞由来の骨芽細胞が、そして骨の吸収には造血幹細
胞由来の破骨細胞がその主役を演じている。骨形成期→
形成休止期→骨吸収期→骨形成期に至る一連の過程をリ
モデリングという。
【0003】骨形成期には、 第1段階:骨芽細胞の分化・増殖 第2段階:骨芽細胞の活性化 第3段階:骨基質の石灰化 の各段階が含まれる。
【0004】第1段階は、骨髄の骨原性細胞が分化し、
骨芽細胞となって増殖する過程である。第2段階では、
活性化された骨芽細胞はI型コラーゲンを分泌し、カル
シウムやリンが沈着する支持組織となるマトリックスを
形成する。次に、同じく骨芽細胞から分泌されたオステ
オカルシンやオステオネクチンをはじめとする非コラー
ゲン性蛋白が沈着し、骨基質を形成する。第3段階で
は、骨基質にヒドロキシアパタイト結晶[Ca10(PO
4 6 (OH)2 ]が沈着し、石灰化が行なわれる。
【0005】骨芽細胞はアルカリホスファターゼ活性が
強く、酸性リン脂質を高濃度に含んでいることから、こ
れらの作用によってアパタイト結晶をつくると考えられ
ている。
【0006】一方、骨吸収期は、 第1段階:未石灰化骨基質(類骨)の分解 第2段階:破骨細胞の形成誘導 第3段階:破骨細胞の活性化 の各段階に分けられる。
【0007】骨の表面はI型コラーゲンを主成分とする
類骨で覆われている。骨芽細胞から分泌されるコラゲナ
ーゼは類骨を消化吸収する(第1段階)。前段階で生じ
たコラーゲン分解物は破骨細胞の局所への遊走を誘発す
る。破骨細胞は接着分子(ビトロネクチン)によって接
着する(第2段階)。活性化された破骨細胞は炭酸脱水
素酵素を産生してリン酸カルシウムを溶解し、さらにカ
テプシンLを分泌してコラーゲン等の骨基質を分解する
(第3段階)。
【0008】インターロイキン−4(以下、IL−4と
略記する。)は、レクチンやフォルボールエステルある
いは抗原の刺激を受けたTリンパ球が産生する糖蛋白質
であり、Bリンパ球またはTリンパ球の分化および増殖
に関与する因子として同定された[Y.Noma et al., Nat
ure, 319, 640 (1986); F.Lee et al., Proc. Natl.Aca
d. Sci. USA, 83, 2061 (1986); E.Severinson et al.,
Eur. J. Immunol.,17, 67 (1987) およびT.R.Mosmann
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83,5654 (1986)
参照のこと]。
【0009】1986年、ヒトIL−4のcDNAがクロー
ン化され、153個のアミノ酸からなる分子量18〜2
1kdの物質であることが確認された[T.Yokota et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 5894 (1986)参
照のこと]。153個のアミノ酸のうち、N末端の24
個はシグナルペプチドである。従って、成熟IL−4は
残り129個のアミノ酸をコアペプチド(分子量15k
d)とし、これに糖鎖がついて全体の分子量としては1
8〜21kdとなる。
【0010】最近の研究によれば、IL−4の生物活性
は、Bリンパ球やTリンパ球だけでなく、血球細胞にも
及んでいることが判明した。特に、マクロファージに対
しては抑制的に働き、マクロファージからのインターロ
イキン−1(IL−1)、腫瘍壊死因子(TNF)、イ
ンターフェロン(IFN)等の各種サイトカインの放出
を抑制することがわかった[P.H.Hart et al., Proc. N
atl. Acad. Sci. USA,86, 3803, (1989) およびM.Hurme
et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.,157, 861
(1988) ]。
【0011】ごく最近、IL−4が、副甲状腺ホルモン
等によって刺激された骨吸収を抑制することが報告され
た[K.Watanabe et al., Biochem. Biophys. Res. Comm
un.,172(3), 1035 (1990)]。この中で、著者はIL−
4が作用を及ぼすモノサイト/マクロファージ系細胞と
破骨細胞はともに造血幹細胞を共通の前駆細胞としてい
ることから、IL−4は破骨細胞への分化や破骨細胞の
増殖を抑制し、ひいては骨吸収の抑制を引き起こすであ
ろう、という仮説をたてて、この実験に臨んだとしてい
る。結果は予想通りのものであった。
【0012】一方、IL−4を医薬品化するには大量に
供給される必要がある。そのため遺伝子工学を用いて酵
母、大腸菌または種々の動物細胞の遺伝子にIL−4の
遺伝子を組み込んで培養し、目的とするIL−4を大量
に生産させる方法が開発されている。例えば、特開平2-
485 号、PCT公開WO87/02990号、EP公開301835号
およびEP公開342892号の各明細書に詳しく記載されて
いる。これらの方法によって得られた各々のIL−4
は、糖付加の有無などわずかな違いはあるが、基本的に
は天然のIL−4と同じコアペプチドを有しており、従
って天然のIL−4と同じ生物活性を示すことが証明さ
れている。また、最近ではヒトIL−4のコアペプチド
を構成するアミノ酸の一部を削除または変換したり、コ
アペプチドに別のアミノ酸またはポリペプチドを付加し
たIL−4類似体が提案されている。例えば、PCT公
開WO88/04667号明細書ではコアペプチドに付加と変換
を施したIL−4類似体が天然のIL−4と同じ生物活
性を有していることが記載されている。
【0013】
【発明の目的】本発明者らは、以上のような観点からI
L−4の骨芽細胞に対する作用を検討した結果、意外に
もIL−4が骨芽細胞の活性化および骨基質の石灰化に
対し、促進的に働くことを見出し、本発明を完成した。
【0014】IL−4の骨芽細胞に対する作用は、まっ
たく未知であるばかりか、前出の文献(Biochem. Bioph
ys. Res. Commun.)を考慮すれば、IL−4が骨芽細胞
に対し促進的に作用することなどまったく予測すること
はできなかった。なぜなら、破骨細胞は、IL−4の作
用が知られているモノサイト/マクロファージ系細胞と
共通の前駆細胞(造血幹細胞)から分化したものである
が、骨芽細胞は別個の前駆細胞である骨原性細胞から分
化したものであるからである。
【0015】
【発明の構成】本発明は、ヒトIL−4またはその類似
体を有効成分として含有する骨形成促進剤に関する。
【0016】本発明において、有効成分として含有する
ヒトIL−4またはその類似体とは、天然のヒトIL−
4およびそれと同じアミノ酸配列を有するポリペプチド
部分をコアとし、場合によりコアペプチド中のアミノ酸
が糖付加、リン酸化、核酸付加、リピッド付加のような
化学的修飾を受けた構造を有し、かつ前記したヒトIL
−4がもつ生物活性を有する物質、およびコアペプチド
中のアミノ酸の一部を削除するか、または他のアミノ酸
に置換するか、あるいはコアペプチドにひとつ以上のア
ミノ酸を付加した修飾ポリペプチドをコアとし、場合に
より前記した化学的修飾を受けた構造を有し、かつ前記
したヒトIL−4様生物活性を有する物質が含まれる。
【0017】天然のヒトIL−4は、IL−4産生細胞
(脾臓細胞など)を刺激剤とともに培養し、培養液中に
放出されるヒトIL−4を回収、精製することにより得
られる。
【0018】ヒトIL−4の類似体としては、遺伝子組
み換え技術によって大量生産されたリコンビナントヒト
IL−4(以下、rhIL−4と略記する。)が含まれ
る。rhIL−4には、COS−7細胞やCHO細胞の
ような動物細胞のほか、大腸菌や酵母を宿主細胞に用い
て生産されたものが知られているが、これらに限定され
ない。例えば、CHO細胞由来のrhIL−4は特開平
2-485 号明細書に詳しく記載されている。また、COS
−7細胞、大腸菌および酵母由来のrhIL−4はPC
T公開WO87/02990号明細書、EP公開301835号明細書
およびEP公開342892号明細書に詳しく記載されてい
る。これらはいずれも天然ヒトIL−4と同様の生物活
性を示すことが確認されている。
【0019】コアペプチド自身を修飾したrhIL−4
はPCT公開WO88/04667号明細書に記載されている。
この中では具体的にrhIL−4(Asp62,Asp
129 )やGluAlaGluAla−hIL−4(Asp62,Asp
129 )が生産され、ともにヒトIL−4と同様の生物活
性を有していることが確認されている。
【0020】
【発明の効果】本発明に用いられるヒトIL−4または
その類似体は、ヒト骨芽細胞の活性化および骨基質の石
灰化を強力に促進する作用を有しているため、骨形成促
進剤として種々の骨疾患の予防および治療、例えば、
(1)加齢、薬物等による骨粗鬆症の予防および治療、
(2)骨形成不全症の予防および治療、(3)骨折等の
骨損傷の治療、(4)歯科領域における歯骨異常の予防
および治療、および(5)関節リウマチ等の疾患によっ
て発生する骨の代謝異常の改善等に有効である。
【0021】また、本発明に用いられるヒトIL−4ま
たはその類似体の毒性は非常に低いものであり、医薬品
として十分安全に使用することができると考えられる。
例えば、雌性ニホンザルを用いた実験では、CHO細胞
由来のrhIL−4は1mg/kg(静脈内投与)、2
mg/kg(20分間の持続注入投与)および500μ
g/kg(静脈内投与)の7日間の連投で、いずれの場
合も死亡例はなく、また血圧、心電図、心拍数、呼吸数
および体温に変化は見られなかった。また、ヒトIL−
4は生体内分泌蛋白であることから、ヒトに対する安全
性にはまったく問題がないと考えられる。
【0022】ヒトIL−4またはその類似体を上記の目
的で用いるには、通常、全身的または局所的に、経口ま
たは非経口で投与されるが、好ましくは静脈内投与され
る。投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、投与方
法、処理時間等により異なるが、通常成人一人当たり、
1回に1mg〜10mgの範囲で、1日1回から数回経
口投与されるか、または成人一人あたり、1回に10μ
g〜1mgの範囲で1日1回〜数回非経口投与(好まし
くは、静脈内投与)される。もちろん、前記したように
投与量は種々の条件で変動するので、上記投与量より少
ない量で十分な場合もあるし、また範囲を超えて投与す
る必要のある場合もある。
【0023】本発明化合物を投与する際には、経口投与
のための固体組成物、液体組成物およびその他の組成
物、非経口投与のための注射剤、外用剤、座剤等として
用いられる。経口投与のための固体組成物には、錠剤、
丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤などが含まれる。この
ような固体組成物においては、ひとつまたはそれ以上の
活性物質が、少なくともひとつの不活性な希釈剤(乳
糖、マンニトール、ブドウ糖、ヒドロキシプロピルセル
ロース、微結晶セルロース、デンプン、ポリビニルピロ
リドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等)と混合
して用いられる。これらの組成物は、常法に従って、不
活性な希釈剤以外の添加物、例えば潤滑剤(ステアリン
酸マグネシウム等)、崩壊剤(線維素グリコール酸カル
シウム等)、溶解補助剤(アルギニン、グルタミン酸、
アスパラギン酸等)や安定化剤(ヒト血清アルブミン、
ラクトース等)を含有していてもよい。錠剤または丸剤
は、必要により胃溶性または腸溶性物質(白糖、ゼラチ
ン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピ
ルメチルセルロースフタレート等)のフィルムで被覆し
てもよい。カプセル剤にはハードカプセルおよびソフト
カプセルが含まれる。
【0024】経口投与のための液体組成物としては、溶
液剤、乳濁剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤が含
まれる。このような液体組成物においては、ひとつまた
はそれ以上の活性物質を含み、一般的に用いられる不活
性な希釈剤(精製水、エタノール等)が含まれる。これ
らの組成物は、不活性な希釈剤以外に、湿潤剤、懸濁剤
のような補助剤、甘味料、風味剤、芳香剤、防腐剤を含
有していてもよい。
【0025】経口投与のためのその他の組成物として
は、ひとつまたはそれ以上の活性物質を含み、常法によ
り処方されるスプレー剤が含まれる。スプレー剤は、不
活性な希釈剤以外に安定化剤(亜硫酸ナトリウム等)や
等張性を与えるための緩衝剤(塩化ナトリウム、クエン
酸ナトリウム、クエン酸等)を含有していてもよい。ス
プレー剤の製造には、例えば米国特許第2,868,691 号、
同第3,095,355 号明細書記載の方法を用いることができ
る。
【0026】非経口投与のための注射剤としては、無菌
の水性または非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤が含まれ
る。このような注射剤においては、ひとつまたはひとつ
以上の活性物質が少なくともひとつの不活性な水性の希
釈剤(注射用蒸留水、生理食塩水等)や不活性な非水性
の希釈剤(プロピレングリコール、ポリエチレングリコ
ール、オリーブ油、エタノール、ポリソルベート80
(登録商標)等)と混合して用いられている。これらの
注射剤は、さらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安
定化剤(ヒト血清アルブミン、ラクトース等)、溶解補
助剤(アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、ポ
リビニルピロリドン等)のような補助剤を含有していて
いもよい。
【0027】これらは、通常、ろ過(バクテリア保留フ
ィルター等)、殺菌剤の配合または照射によって無菌化
されるか、またはこれらの処理をした後、凍結乾燥等の
方法により固体組成物とし、使用直前に無菌水、または
無菌の注射用希釈剤を加えて使用される。
【0028】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に
説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものでは
ない。実施例1 :ヒトIL−4の、ヒト骨芽細胞の活性化およ
び骨基質の石灰化を促進する効果
【0029】(1)方法 20才男子長管骨骨膜由来ヒト骨芽細胞(Biochem. Bio
phys. Res. Commun.,145, 651 (1987) 記載の方法によ
り調製した。)を10%牛胎児血清を含むα−MEM
(alpha modification of Eagles' minimal essential
mediumの略)中、37℃、5%炭酸ガス−空気のインキ
ュベーターで培養した。培養液は2日ごとに交換し、細
胞が培養皿一杯になったところで、0.025 %トリプシン
と0.05%EDTAの混液で細胞をはがし、均一に懸濁し
た後、1:2または1:4となるように新しい培養皿に
播き直し継代培養を行なった。
【0030】このようにして得られたヒト培養骨芽細胞
(19PDL)を24穴の培養皿に播き(3.3 ×104
個cells/well)、細胞が培養皿一杯になった(confluen
t の状態)後、ヒトIL−4(特開平2-485 号明細書記
載の方法により製造したrhIL−4)を所定濃度(最
終濃度として0.03、0.3 および3ng/ml)で加え、
さらに2mMのα−グリセロリン酸ナトリウムの存在下
20〜24日間培養した。この間、2日毎にヒトIL−
4の入った新しい培養液に交換した。なお、本実験で
は、1,25−ジヒドロキシビタミンD3 (以下、単に
ビタミンD3 と略記する。)をポジティブコントロール
として用いた。培養後、細胞外マトリクスのコラーゲ
ン、オステオカルシン、カルシウムおよびリンの量を測
定した。
【0031】まず、培養皿より培養液を除き、 Hank's
塩類溶液(pH7.4 )で2回洗浄後細胞を集め、 Blume
nkrantz らの方法(Anal. Biochem., 55, 288 (1973)に
記載の方法)に従って細胞外マトリクスのヒドロキシプ
ロリン量を測定した。ヒドロキシプロリンは骨芽細胞か
ら生成したコラーゲン量の指標となる。
【0032】オステオカルシンは、 Hank's 塩類溶液
(pH7.4 )で2回洗浄後、20%ギ酸を加えて細胞を
集めた後、オステオカルシン測定用キットであるBGP
IRMAキット(商品名、三菱油化販売)を用いて測
定した。
【0033】カルシウムとリンは、 Hank's 塩類溶液
(pH7.4 )で2回洗浄後、冷5%過塩素酸を加え、1
5分間振盪してカルシウムおよびリンを抽出した後、抽
出液中のカルシウムおよびリンの量をそれぞれの測定用
キットであるカルシウムC−テストワコーおよびピーテ
ストワコー(いずれも商品名、和光純薬販売)を用いて
測定した。
【0034】(2)結果 結果を図1から図4に示す。図からわかるように、コラ
ーゲンやオステオカルシンの生成量、および沈着したカ
ルシウム、リンの量はIL−4の濃度に依存して増加し
ている。この事実は、IL−4が骨芽細胞の活性化およ
び骨基質の石灰化を促進していることを示している。
【0035】
【製剤例】ヒトIL−4 10mgを生理食塩水500
mlに十分溶解させ、得られた溶液を常法により殺菌消
毒し、5mlずつアンプルに充填後、凍結乾燥すること
により、1アンプル中に100μgの活性成分を含有す
る注射剤100本が得られる。
【図面の簡単な説明】
【図1】ヒトIL−4のヒドロキシプロリンの生成に対
する効果を示すグラフである。
【図2】ヒトIL−4のオステオカルシンの生成に対す
る効果を示すグラフである。
【図3】ヒトIL−4のカルシウムの沈着に対する効果
を示すグラフである。
【図4】ヒトIL−4のリンの沈着に対する効果を示す
グラフである。

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 ヒトインターロイキン−4またはその類
    似体を有効成分として含有する骨形成促進剤。
  2. 【請求項2】 有効成分がリコンビナントヒトインター
    ロイキン−4である請求項1に記載の骨形成促進剤。
JP5121962A 1992-04-27 1993-04-26 骨形成促進剤 Pending JPH069426A (ja)

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TW82102942A TW224943B (en) 1993-04-26 1993-04-17 The pharmaceutical composition for the stimulation of bone formation
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JP13419492 1992-04-27
JP4-134194 1992-04-27
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103826632A (zh) * 2011-08-26 2014-05-28 国立大学法人名古屋大学 骨形成促进剂及其用途

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103826632A (zh) * 2011-08-26 2014-05-28 国立大学法人名古屋大学 骨形成促进剂及其用途
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