JPH06509940A

JPH06509940A - ボンベシン様ペプチドに対するレセプター

Info

Publication number: JPH06509940A
Application number: JP4510596A
Authority: JP
Inventors: バッティ，ジェームズ　エフ．，　ジュニア; コージェイ，マーサ　エイチ．; ファシー，ザーラ; フェルドマン，リチャード　アイ．; ハーキン，リチャード　エヌ．; スレッテリー，ティモシー　ケー．; ワダ，エツコ; ウー，ジェームズ　エム．
Original assignee: バーレックス　ラボラトリーズ，インコーポレイティド; アメリカ合衆国
Priority date: 1991-03-15
Filing date: 1992-03-13
Publication date: 1994-11-10
Also published as: CA2105306A1; AU1793092A; WO1992016623A3; WO1992016623A2; EP0576609A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明はＧＲＰ及びＮｊ’ｌＢそれぞれに対するレセプターであるサブタイプＲＩＢＰ及びＲ２ＢＰを含むボンベシン様ペプチドに対する様々なレセプター（ＲＢＰ）　、並びにその他の類似のレセプター分子、例えばＲ３ＢＰの遺伝子及びタンパク質配列を提供する。

本発明は組換核酸、及び単離した又は実質的に純粋な核酸を提供し、これらはボンベシン様ペプチドに対するレセプター又はそのフラグメントをコードする配列と実質的に相同性である。融合ポリペプチドをコードする核酸はかかる核酸を含んで成るベクターとして、細胞として、及び生物として考慮される。典型的な態様は種々のＲＢＰサブタイプ、即ち、ＲＩＢＰ（ＧＲＰレセプター）　、Ｉ？２ＢＰ（ＮＭＢレセプター）及びＲ３８Ｐ　（そのリガンドが未だ同定されていない、レセプター様タンパク質に関する第３の近縁遺伝子）である。

これらのＲＢＰタンパク質配列配列来する組換ポリペプチド、及び単離した又は実質的に純粋なポリペプチドは本発明に包括される。

融合ポリペプチドを、このポリペプチドを含んで成る細胞及び生物と一緒に提供する。これらのポリペプチドを含んで成る組成物は本発明に包括される。典型的な態様はここでもＧＲＰレセプター、ＮＭＰレセプター及びＲ３ＢＰである。

本発明はボンベシン様ペプチドに対するレセプターに固有な又は特徴的なエピトープに対して特異的な抗体を提供する。これには、ボンベシン様ペプチドに対するレセプターの属によって共有されているエピトープ、又は種々のレセプターサブタイプ間で異なるエピトープのいづれかに特異的に結合する抗体が含まれる。

任意のこれらの組成物を含んで成るキットが本発明に包括される。

従って、様々な核酸分子、ポリペプチド及び抗体は様々な診断又は治療用キットの基礎を担うことができる。

様々な組成物は、特に異常なレセプター機能、例えば増殖細胞症状に苦しむ者のような宿主を処置せしめる方法の基礎も担い、それは有効量のこれらの試薬を投与することによるか、又は生物学的サンプルをそれと接触せしめることによる。

該組成物、例えばりガント結合性フラグメントは関連のレセプターサブタイプに関する更なる作動因子及び拮抗因子についての選別及びスクリーンのための手段も担う。リガンド結合性領域とは別のポリペプチド領域において相互作用するりガント及び分子の両者である選別化合物が獲得される。特に有用なのは、多重レセプターサブタイプに影響を及ぼす化合物、例えば生物学的活性を調節することに関して所望の範囲の特異性を示すものである。

ＲＢＰサブタイプのグループは、実質的な類似性及び臨界的な相違の両方を備えたレセプターポリペプチドのグループを提供するうえで非常に有用でもある。グループとしてのこれらのＲＢＰは、単一のブタイブの特徴付けからは不可能な方法で、クラスについての構造的及び機能的な分類を可能にする。

以下の説明はほとんどマウスのＲＩＢＰ（Ｇｌ？Ｐレセプター）について詳しく記述しであるが、１１（Ｑの概念をボンベシン様ペプチドに対するその他の近縁レセプター、例えばヒトＲＩＢＰ（ＧＲＰレセプター）、ラノ）　Ｒ２ＢＰ　（Ｎ闘しセプター）、ヒトＲ２ＢＰ　（Ｎ肝しセプター）及びヒトＲ３ＢＰ（不完全に特性化された相同推定レセプター）に適用することができる。特に、ボンベシン様ペプチドに対するその他の類似のレセプターに由来する類似の用途及び試薬が開発されうるであろう。新たなレセプターサブタイプに対する新たな生物活性リガンドの同定も得られるであろう。

本発明は、宿主細胞においてＧＲＰレセプターをコードするＤＮＡを発現させる（例えば転写及び翻訳）ことに関連し、これにより天然のＧＲＰレセプターのアミノ酸配列を有し、起源の種の他のタンパク質を実質的に有さないＧＲＰレセプター組成物の合成が可能となり、そして新規の突然変異ＧＲＰレセプターの合成が更に可能となる。

更に、本発明は欠陥ＧＲＰレセプターＤＮＡ又はａ＋ＲＮＡのハイブリダイゼーション診断におけるＧＲＰレセプター又はそのフラグメントをコードするＤＮＡの利用、及び天然起源からＧＲＰレセプターをコードするＤＮＡ［得することに関連する。ボンベシン様ペプチドに対するその他のレセプター（ＲＢＰ）　、例えばＲ２ＢＰ　（ＮＭＢレセプターサブタイプ）、Ｒ３ＢＰ、又はその他の近縁の関連レセプターについての遺伝子の類似の利用を同様に提供する。

より詳しくは、本発明は、例えば対応のレセプターに対する適当な結合親和力を有する化合物についての薬剤スクリーニングアッセイにおける、組換ＲＩＢＰ、　ｌ？２ＢＰ又はＲ３ＢＰ及び近縁タンパク質、　ＲＩＢＰ。

Ｒ２ＢＰ又はＩ？３８Ｐ及び近縁タンパク質の発現を導くベクターによりトランスフェクトされた細胞系；かかる細胞系由来の膜；の独立又は組合せでの利用；更にはそれらより獲得した抗体及びその他の試薬に関連する。

更により詳しくは、本発明は、患者＆ｌｌ織における関連のレセプターサブタイプの発現レベルを決定するための診断アッセイにおいて有用である、組換ＲＩＢＰ（ＧＲＰ−Ｒ）、　Ｒ２ＢＰ（Ｎ）ＩＢ−Ｒ）又はＲ３ＢＰ、及びこれらのレセプターのタンパク質フラグメント、更にはそれらに対する抗体に関する。レセプターに対する抗体の検出及び／又はレセプターの検出に基づくアッセイは予後的有用性も有しうる。

更に、本発明は組換レセプター又はそのフラグメントもしくは誘導体を、例えばこれらのレセプターもしくはフラグメントに対する抗体のような試薬を作製するために、又はスクリーングアソセイにおいて定義付けする特定のレセプター作動因子もしくは拮抗因子を単離するために利用することに関する。

好ましい態様の詳細な説明吉−麗 ■、　一般事項 ■、核酸 ■、レセプター変異体 ■、レセプターの作製 ■、レセプターの単離 ■、レセフ“ター類イ以体 ■、抗体 ■、レセプターの他の用途 ■、リガンド：作動因子及び拮抗因子Ｘ、　キットＸｌ、治療的用途Ｘ■、レセプターのサブタイプ ■、一般事項本発明はボンベシン様ペプチドに対する様りなレセプター、例えばＲＩＢＰとも呼ばれ、ガストリン放出性ペプチド（ＧＲＰ）　レセプターに相当する、ボンベシン様ペプチドに対するマウスレセプターサブタイプ１のアミノ酸配列及びＤＮＡ配列を提供する。これらの配列は、１１１８Ｐ又はＧＲＰレセプター（ＧＲＰ −１１）を精製し、そしてこのレセプターのトリプシンフラグメントのアミノ酸配列を決定した後に獲得できた。ヒトＲＩＢＰ（ＧＲＰ−Ｒ）と類似の配列である、ボンベシン様ペプチドに対するラットレセプターサブタイプ２、即ち、ニューロメジンＢレセプター（ＮＭＢ−Ｒ）　、ヒトＮＭＢ−Ｒ及びＲ３ＢＰで記述するヒトの第３レセプターサブタイプを提供する。下記の詳細は通常、マウスのＲＩＢＰ（ＧＮＰ−Ｒ）に対して向けられているが、しがしながらその他のレセプターサブタイプに同様に適用可能である。ヒ）　ＲＩＢＰ、ラッ）　Ｒ２ＢＰ。

ヒトＲ２ＢＰ及びヒトＲ３ＢＰはＲＢＰのクラスの典型的な態様である。

精製したＲＩＢＰから獲得した部分アミノ酸配列をＤＮＡプローブを推定するために用い、次いでそれを遺伝子のＲＩＢＰ　ｃＤＮＡ形態を単離するために用いた。いくつかの標準的な方法が、例えばＭａｎｉａｔｉｓら（１９８２）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１（ａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ　ｉ　Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ａ　ＬａｂｏｒａＬｏｒ　Ｍａｎｕａｌ　（第２版）、第１〜３巻、Ｃ３ＨＰｒｅｓｓ＋　ＮＹ　；　八ｕｓｕｂｅｌ　ら旦１仝１９盈ｙｌ　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ。

Ｂｒｏｏｋｌｙｎ、　ＮＹ　；又はＡｕ５ｕｂｅｌら（１９８７及び付録）　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｉｏ　、　Ｇｒｅｅｎｅ／Ｗｈｉｔｎｅｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋに記載又は論しられ、それらは本明細書に参考として組込んだ。このＲＩＢＰ遺伝子の単離は相同性の第２サブタイプ、Ｒ２ＢＰ　（一般にＮ？’ｌＢレセプターと呼ぶ）についての遺伝子の単離を可能とし、これはＲ３ＢＰと記述する第３のサブタイプの単離を更に導く。これらの遺伝子はボンへシン様ペプチドに対するその他のレセプター遺伝子の単離を可能とし、本明細書に記載している３つのサブタイプを超える科及び５つの特定の態様にまで及ぶ。その手順は以下におおまかに記載しである。

ラムダｇｔｌＯバクテリオファージにおいて構築したｃＤＮＡライブラリーをスイス３Ｔ３細胞から単離したＲＮＡより調製した。このライブラリーをオリゴヌクレオチドでプローブする際に、ｃＤＮＡクローンの単離に関連する問題を解消するためにいくつかの改質及び固有の技法を利用した。特に、ＲＩＢＰをコードするｃＤＮＡの種についてのライブラリーを富化する必要があり、それは富化せしめていないｃＤＮ＾ライブラリーにおけるかかる種の表現の低さに原因する。

オリゴヌクレオチドプローブは最も適当なコドン用法に基づくヌクレオチド配列を有するようにデザインした。ｃＤＮＡライブラリーをプレートアウトし、ｃＤＮＡインサートを含むラムダファージをそれらのＥ、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）宿主を溶菌するようにさせて、それぞれが個りのｃＤＮＡインサートを含むプラークを形成せしめた。これらのプラークをラベル化オリゴヌクレオチドプローブによってＲＩＢＰ　ＤＮＡ配列についてスクリーンした。サブタイプＩ　ＲＰＢ　ｃＤＮＡ種が単離されたが、これらは不完全な１１１８Ｐをコードした。

ＲＩＢＰ部分（ＧＲＰ−Ｒ）並びにその５′及び３′フランキング領域をコードする更なるｃＤＮＡ種を単離するためにポリメラーゼ連鎖反応技法を利用した。

レセプタ−サブタイプ１翻訳生成物全体をコードする単一のｃＤＮＡクローンを獲得するために遺伝子特異性プライマー特異的ｃＤＮＡクローニングを次に利用した。ここで利用した実際のクローニング技法は下記の実施例１２及び１３に詳しく記載した。マウス由来の単離化サブタイプルレセプター遺伝子を用い、ラットから相同性の第２サブタイプ（Ｒ２ＢＰ又はＮＭＢレセプター）を単離した。

同様に、ヒトＲＩＢＰ及びＲ２ＢＰ配列を第３のサブタイプ（Ｒ３ＢＰと呼ばれ、これは未だ完全に特性化されていない）と共に単離した。

レセプターサブタイプ１についてのｃＤＮＡがマウスから単離できたら、それをシーケンス化に付する。そのヌクレオチド配列はＧＩ？Ｐレセプターの一次翻訳生成物のアミノ酸配列、即ち、任意の後翻訳改質前のアミノ酸配列を示す。

完全なマウスアミノ酸配列を表１に示す。この配列はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１に相当する。表１はＧＲＰに結合するレセプターサブタイプ１のヌクレオチド配列、及びその推定アミノ酸配列の両者を開示し、それは本明細書に参考として組入れたＢａｔｔｅｒｙら（１９９１）　す四ＪＩ」工Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８８　：　３９５−３９９においても公開されている。インタクトレセプターサブタイプ１タンパク質及びレセプターに対する単離化トリプシンペプチドの実験決定アミノ酸配列を下線を付して示している。推定トランスメンプラン配列を１〜■で表示している。Ｎ−＝結合グリコジル化のための共通配列を枠で囲った。

−−１′：１Ｎ″′　〜　〜本明細書で用いている用語「ボンベシン様ペプチドに対するレセプターサブタイプ１」、ｒＲＩＢＰＪ又はｒ　ＧＲＰレセプター」は、表１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはペプチド、又はそのフラグメントを含むものとして定義する。これは少な（とも約１１００ｎ、通常は約３０ｎＭより優れた、好ましくは約１０ｎＭより優れた、そしてより好ましくは約３ｎＭより優れた高い親和力でＧＲＰタンパク質に機能的に、且つ、似たように結合するポリペプチドも称する。この用語はサブタイプルセブター遺伝子、マウスサブタイプルセブター又はマウスにおけるその他のサブタイプ１の対立遺伝子、並びにマウス以外の種、例えばヒト及びその他の哺乳動物のサブタイプルセブターを称するためにも用いられうる。この用語はリガンドに結合する天然の抗体は包括しておらず、なぜなら抗体の結合部位の構造的特徴はリガンドの結合部位とは異なるからである。

ヒトサブタイプ２レセプター（Ｉ１２ＢＰ）配列を表２に示す。この配列は５ＥＩＩ１１０　ＮＯ：　３に相当する。

表２：ヒトゲノムＲＩＢＰ（ＧＲＰ−Ｐ）クローン及びヒト５ＣＬＣ細胞系ＮＣｌ−Ｈ３４５ｃＤＮＡの両者に由来するヌクレオチド配列及び推定アミノ酸。

逆三角形はゲノムクローンより決定したイントロン位置を示している。

マウスサブタイプルレセプターＤＮＡをプローブとして用いて、ラント第２サブタイプレセプター遺伝子配列（表３参照）及びヒトサブタイブルセプター遺伝子配列（表２参照）を単離した。このサブタイプルレセプター配列をＲ３ＢＰと表示するヒト配列を単離するプローブとして用いた。　ＲＢＰ科の構成員としてのこの表示はレセプターサブタイプ１及び２に対するその高い相同性に由来する（表１２を参照のこと）。サブタイプルセブタ−（ボンベシン様ペプチドに対する）は一般にＧＲＰレセプターと呼ばれ、他方、サブタイプ２レセプター（ボンベシン様ペプチドに対する）は一般にＮＩ’ｌＢレセプターと呼ばれる。表３における配列はＳＥＱ　１０　Ｎｏ　：　５に相当し；そして表４における配列はＳＥＱ　１０　Ｎｏ　：　７に相当し；そして表１２における配列はＳＥＱ　Ｉｎ　Ｎｏ　：　９に相当する。単離せしめたラットサブタイプ２レセプター遺伝子配列を次にヒトサブタイプ２レセプター遺伝子配列（表４参照）を単離するために用いた。偵たような手順が、その他の種から相同性レセプターを単離するために、又は同一の種から別のレセプター、例えばヒトサブタイプ３レセプターを単離するために適用可能であろう。特に、その他のボンベシン様ペプチドに対するレセプターが単離されうるであろう。下記の実施例２９、図２０及び表１２を参照のこと。

表３二２種類の独立したラットサブタイプ２レセプター（ＮＭＢ−Ｒ）ｃＤＮＡクローンに由来するヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列。ヌクレオチドとアミノ酸の配列との間の水平下線は、その他のＧクンバク質複合化レセプター超科員に対する相同性に基づき、７つの推定トランスメンブランドメイン（順に番号を付した）の位置を示す。

大きな点はＮ−結合グリコシル化の陽性部位の位置を示す。この配列は−ａｄａら（１９９１）　Ｎｅｕｒｏｎ　−６：　４２１−４３０（本明細書に参考として組込む）にも開示されである。

ｇ　：　：　６　ｇ　呂　０　・・＋＋？　−１表４＝ヒトに由来するヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列、ヒトゲノムレセプターサブタイプ１　（ＧＲＰ−Ｒ）　クローン及びヒト５ＣＬＣ細胞系ＮＣｌ −Ｈ３４５ｃＤＮＡは共に同一のタンパク質配列を示す。逆三角形はゲノムクローンより決定したイントロンの位置を示す。

本発明は更に、表１．２．３もしくは４又はＳＥ口ＩＤ　ＮＯ：　１０におけるアミノ酸配列との実質的なアミノ酸配列相同性を有するタンパク質又はペプチドをも包括するが、しかしながら物質り又は物質にのレセプターと実質的に同程度又はより低めのアミノ酸配列相同性を示す任意のタンパク質又はペプチドを除く。この物質にレセプターを表６に、マウスＧＲＰレセプターと対比して示す。

ポリペプチド「フラグメント」又は「セグメント」は少なくとも約８個のアミノ酸、一般には少なくとも１０個のアミノ酸、より一般には少なくとも１２個のアミノ酸、しばしば少なくとも１４個のアミノ酸、よりしばしばには少なくとも１６個のアミノ酸、典型的には少なくとも１８個のアミノ酸、より典型的には少なくとも２０個のアミノ酸、通常は少な（とも２２個のアミノ酸、より通常には少なくとも２４個のアミノ酸、好ましくは少なくとも２６個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも２８個のアミノ酸、そして特に好ましい態様においては少なくとも約３０個又はそれより多くのアミノ酸のアミノ酸残基数の鎖である。

アミノ酸の配列相同性又は配列同一性は残基対合を最適化することにより、必要ならば、必要なだけギャップを導入することにより決定される。保存性置換を対合として考えるとこれは変わる。保存性置換には下記の群の中での置換が含まれるニゲリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン。相同アミノ酸配列は天然の対立配列及び各対応レセプター配列における種間変異を含むことを意図する。典型的に相同なタンパク質又はペプチドは表１．２゜３もしくは４、又はＳＥ［］　１０　ＮＯ：　１０のアミノ酸配列と２５〜１００％の相同性（もしギャップを導入できるなら）から５０〜１００％の相同性（もし保存性置換が含まれるなら）を有するであろう。相同性の尺度は少なくとも約３５％、一般には少なくとも４０％、より一般的には少な（とも４５％、しばしば少なくとも５０％、よりしばしば少なくとも５５％、典型的には少なくとも６０％、より典型的には少なくとも６５％、通常は少なくとも７０％、より通常には少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、そしてより好ましくは少なくとも８０％、そして特に好ましい態様においては少なくとも８５％又はそれより高いであろう、いくつかの相同性タンパク質又はペプチド、例えば様々なレセプターサブタイプは表１．２．３もしくは４、又はＳＥｏ　１０　Ｎｏ　：ｌＯのボンベシン様ペプチドに対するレセプターと様々な生物活性を共有するであろう。本明細書で用いる用語「生物活性」には、ボンベシン様タンパク質リガンド結合性、天然起源に由来する各対応レセプターに対して発生せしめた抗体との交差反応性、及びグアニルヌクレオチド調節タンパク質（Ｇ−タンパク質）への結合性が含まれるが、それらに限定されない。Ｇ−タンパク質結合は一般に、タンパク質のリン酸化及び封鎖Ｃａ”の放出を含む機能的な下流生化学作用の原因となり、これら両者はしばしばレセプター機能をアッセイするために用いられる。様々の種異なるボンベシン様ペプチドは同−又は異なる細胞タイプにおいて異なる細胞応答を及ぼすことに注目すべきである。「リガンド関連活性」とはリガンド結合自体を活性を言う。

［リガンドｊなる語はペプチドリガンド結合に包括されるセグメントに結合する、通常はボンベシン様ペプチド科の構成員である分子に関する。更に、リガンドはレセプター又はその類領体が結合する天然リガンドとして機能する分子、又は天然りガントの機能的類似体である分子のいづれかである。その機能的類似体は構造上の改質を有するリガンドでありうるか、又は適当なりガント結合決定基と相互作用する分子の形を有する完全に無関係な分子でありうる。

リガンドは作動因子又は拮抗因子として働きうる。例えばＧｏｏｄｍａｎら（＆１）（１９９０）　Ｇｏｏｄｓａｎ　＆　Ｇｉ１ｍａｎ’ｓ　：　Ｔｈｅ　Ｐｈ　ｒｓａｃｏｌｏ　１ｃａｌ　Ｂａ５ｅｓロー恒７（第８版）　Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓを参照のこと。

ポリペプチド又はフラグメントの溶解度は環境及びそのポリペプチドに依存する。数多くのパラメーターがポリペプチドの溶解度に影響を及ぼし、それには温度、電解質環境、ポリペプチドのサイズ及び分子特性、並びに溶媒の種類が含まれる。典型的には、ポリペプチドを用いる温度は約４°Ｃから約６５°Ｃに範囲する０通常利用する温度は約１８°Ｃ以上、そしてより通常には約２２゛Ｃ以上である。診断目的のためには、その温度は通常室温又はそれより高いが、しかしながらアッセイにおける成分の変性温度より低くする。治療的目的のためには、その温度は通常体温の温度、典型的にはヒトに関しては約３７°Ｃであろうが、しかしながら一定の状況のもとではその温度はインシトウ（生体内）又はインビトロにおいて高めても低めてもよいことがある。

電解質は通常はぼ生体内生理学的条件であろうが、しかしながら好都合な場合にはより高め又はより低めにイオン強度を変えてよい。

実際のイオンは生理学的又は分析的状況において用いる標準緩衝液に合うように改質されうる。

ポリペプチドのサイズ及び構造は一般的に実質的に安定な状態にすべきであり、そして通常は変性状態に°すべきではない。このポリペプチドは第四構造においてその他のポリペプチドと会合して、例えば溶解性が授けられているか、又は天然の脂質の二層相互作用に近い状況で脂質もしくは清浄剤と結合していることがある。

溶媒は通常生物活性を保持のために用いるタイプの生物学的適合性緩衝液であり、そして通常はほぼ生理学的な溶媒であろう８通常この溶媒は中性ｐ８を有し、典型的には約５〜１０、そして好ましくは約７．５であろう。ある場合、清浄剤、典型的には緩やかな非変性的なもの、例えばＣＨＳ又はＣＩＩＡＰＳを加えることがあろう。

溶解度は通常スベドバーグ（Ｓｖｅｄｂｅｒｇ　）単位において測定され、これは特定の条件下での分子の沈降速度の尺度である。沈降速度の決定は伝統的に分析用超遠心機において行われるが、しかしながら現在は標準の超遠心機において一般に行われている。本明細書にそれぞれを参考として組込むＦｒｅｉｆｅｌｄｅｒ（１９８２）　Ｐｈ　５ｊｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｗｉｓｔｒ（第２版）、　Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅ＋ｗａｎ　；及びＣａｎ　ｔｏｒとＳｃｈｉｍｍｅｌ（１９８０）　旦ヨｂ互国ａｌ−ｑ至影濾復ｌ　第１〜３部、Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃｏ、、　Ｓａｎ　Ｐｒａｎｃｉｓｃｏを参照のこと。大まかな決定として、予想の可溶性ポリペプチドを含むサンプルを標準のフルサイズ超遠心機において約５０Ｋｒｐｍで約１０分間遠心し、これにより可溶性分子は上清液に残るであろう。可溶性粒子又はポリペプチドは、典型的には約３０Ｓ以下、より典型的には約１５Ｓ以下、通常は約１０Ｓ以下、より通常には約６Ｓ以下、そして特定の態様において、好ましくは約４Ｓ以下、そしてより好ましくは約３Ｓ以下であろう。

■、核酸本発明はボンベシン様ペプチドに対するこれらのレセプター、例えば対応のレセプターサブタイプをコードする単離されたＤＮＡ又はフラグメント、又はレセプターポリペプチドに相当する生物学的活性体をコードする任意のそれらのフラグメントの利用を考慮している。更に、本発明はレセプター活性を有する生物学的活性タンパク質又はポリペプチドをコードし、そして表１．２．３．４又は１２に示すＤＮＡ配列と適当な条件下でハイブリダイズすることが可能な単離又は＆ｌｌＩ換ＤＮＡを包括する。前記生物学的活性タンパク質又はポリペプチドはレセプター自体又はフラグメントであってよく、そして表１．２．３もしくは４、又はＳＥＱ　Ｉ［ｌ　Ｎｏ　：　１０に示すアミノ酸配列を有する。更に、本発明は対応のレセプターサブタイプそれぞれと相同性であるタンパク質をコードする、又はボンベシン様ペプチドに対するレセプターをコードするｃＤＮＡをプローブとして用いて単離された、単離もしくは組換ＤＮ＾又はそのフラグメントの利用を包括する。この単離ＤＮＡは５′及び３′の隣りに関連の調節配列、例えばプロモーター、エンハンサ−、ポリーＡ付加シグナル及びその他を有することができる。

「単離」核酸は、ＲＮＡ、　ＤＮＡ又は複合ポリマーのような核酸であり、これは当然付随する天然配列、例えば起源種に由来するリポソーム、ポリメラーゼ及びフランキングゲノム配列であるその他の成分から実質的に分けられている。この用語はその天然の環境から取出された核酸配列を包括し、そして組換もしくはクローン化ＤＮＡ単離及び化学合成類似体、又は異種の系によって生物合成された類似体を含む。実質的に純粋な分子には分子の単離形態が含まれる。

単離核酸は一般に分子の均質組成物であるが、しかしある態様においては、若干の不均質性を含むであろう。この不均質性は典型的には所望の生物機能又は活性に重要でないポリマー末端又は領域にて見い出せる。

ｒ＆Ｉｌｌ換」核酸はその製造方法又はその構造のいづれかによって定義される。その製造方法に関すると、生成物は、例えばヌクレオチド配列におけるヒト介在配列を包括する組換核酸技術を利用する方法により作られる。他方これは、天然では互いに対して隣り合っていない２本のフラグメントの融合体を含んで成る配列を作製することによって作られた核酸であることができるが、しかしながら天然の生成物、例えば天然の突然変異体は排除することを意味している。

従って例えば、任意の天然でないベクターにより形質転換された細胞により作られた生成物は、任意の合成オリゴヌクレオチド方法を利用して誘導した配列を含んで成る核酸と同様に包括される。これは通常、典型的には配列認識部位を導入又は除去しながら、コドンを同−又は保存性アミノ酸をコードする重複コドンに置き換えるために行う。他方これは、−Ｍに入手できる天然形態において見い出せない機能の所望の組合せを含んで成る一本の遺伝子体を作り上げるために所望の機能の核酸セグメントを互いにつなげるために行われる。制限酵素認識部位を通常かかる人工操作体の標的とするが、しかしながらその他の部位特異的標的、例えばプロモーター、ＤＮＡ複製部位、調節配列、コントロール配列又はその他の有用な特徴をデザインによって含ませることができる。類似の概念は組換、例えば融合ポリペプチドにも向けられる。特に含まれるのは合成核酸であり、これはこれらのレセプターのフラグメントに類似するポリペプチド及び様々な種々のサブタイプに由来する配列の融合体をコードする。

核酸に関する「フラグメントＪは少なくとも約１７個のヌクレオチド、一般には少なくとも２０個のヌクレオチド、より一般には少なくとも２３個のヌクレオチド、たいていは少なくとも２６個のヌクレオチド、よりたいていには少なくとも２９個のヌクレオチド、しばしば少なくとも３２個のヌクレオチド、よりしばしば少なくとも３５個のヌクレオチド、典型的には少な（とも３８個のヌクレオチド、より典型的には少なくとも約４１個のヌクレオチド、通常は少なくとも４４個のヌクレオチド、より通常には少なくとも４７個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも５０個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも５３個のヌクレオチド、そして特に好ましいＢ様においては少なくとも５６個又はそれより多くのヌクレオチドの連続セグメントである。

ボンベシン様ペプチドに対するレセプターについてコードするＤＮＡは、近緑又は相同レセプターをコードする遺伝子、ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡ体を同定するのに、並びにレセプターサブタイプ及び異なる種に由来するレセプターをコードするＤＮＡを同定するのに特に有用である。

ＧＲＰに特異的に結合するサブタイプとは別のボンベシン様ペプチドに対する選択性を有する記述のレセプターサブタイプ、例えばＮＭＢへの結合に特異的な第２のサブタイプ（サブタイプ２）が少なくとも１つあり、そしてその他にもあるようである。特に、その他の推定ＲＢＰをコードする遺伝子配列が単離されており、そして「サブタイプ３」又はｒ　Ｒ３ＢＰ　Ｊと呼ばれているが、それらは完全に特徴付けされていない。種々のボンへシン様ペプチドレセプターサブタイプは高い相同性を有するようであり、従って本発明に包括される。しかしながら、ＲＩＢＰとはかなり離れた発生関係を有し、そしてガストリン放出性ペプチドに結合しないレセプタータンパク質でさえも、もしそれらが十分なる相同性を有するならばこれらのボンベシン様ペプチドレセプター配列を用いて単離されることができる。ラットＮ？ＩＢレセプター並びにヒトＧＲＰ及びＮ？ＩＢレセプターはヒトＲ３ＢＰと同様に近縁レセプターの典型例である。哺乳動物のレセプターに特に感心がもたれる。

かかるスクリーンにとって好ましいプローブは種々のレセプターサブタイプ間で保存されるレセプターの領域である。特に、表１のヌクレオチド３４５〜４１０にほぼ相当する第３トランスメンプランセグメントはその他のレセプターサブタイプの対応領域と高い相同性を示すと予測される。その他の保存領域はその他の類慎のレセプター又はレセプターサブタイプ、例えば第６、第７及び第２トランスメンプランセグメントとの比較により同定されるであろう。

本発明は本明細書に記載の単離ＤＮＡと同−又は相同性の高いＤＮＡ配列を有する組換ＤＮＡ分子及びフラグメントを更に包括する。特に、これらの配列は通常転写、翻訳及びＤＮＡ複製をコントロールするＤＮＡセグメントに作動連結しているであろう。

相同性核酸配列同志は比較したときに顕著な類似性を示す。核酸における相同性の基準は配列対比による当業界において一般に利用されている相同性についての、又はハイブリダイゼーション条件に基づく相同性についての尺度である。このハイブリダイゼーション条件は下記により詳しく記載しであるが、しかしながら物質Ｐ及び物質にのレセプターのいづれかに対する相同性によって更に限定している。任意の記載のパラメーターに加えて、相同性の尺度は、物質Ｐ又は物質Ｋにとってのレセプターに対するかがる類似性を超えることが制限されうるであろう。

核酸配列対比に関する実質的な相同性とはそのセグメント又はその相補鎖のいづれかを比較し合ったときに、正しく並べた際に、適当なヌクレオチド挿入又は欠失を伴って、ヌクレオチドの少なくとも約５０％、一般には少なくとも５６％、より一般には少なくとも５９％、たいていは少なくとも６２％、よりたいていには少なくとも６５％、しばしば少なくとも６８％、よりしばしばには少なくとも７１％、典型的には少なくとも７４％、より典型的には少なくとも７７％、通常は少なくとも８０％、より通常には少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５〜９８％、又はそれより高く、そして好ましい態様においては約９９％又はそれより高いほどのヌクレオチドにおいて同一である。他方、実質的な相同性はセグメントが選択的なハイブリダイゼーション条件下で鎖、又はその補体と、典型的には表１．２，３．４又は１２に由来する配列を利用してハイブリダイズするときに存在する。典型的には、選択的なハイブリダイゼーションは少なくとも約１４個のヌクレオチドの鎖にわたって少なくとも約５５％、好ましくは少な（とも約６５％、より好ましくは少な（とも約７５％、そして最も好ましくは少なくとも約９０％の相同性があるときに生ずるであろう。Ｋａｎｅｈｉｓａ　（１９８４）　Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

１２　：　２０３−２１３（本明細書に参考として組入れる）を参照のこと。相同性対比の長さは記述の通り長い鎖であってよく、そして一定の態様において少なくとも約１７個のヌクレオチド、通常は少な（とも約２０個のヌクレオチド、より通常には少なくとも約２４個のヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８個のヌクレオチド、より典型的には少なくとも約４０個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約５０個のヌクレオチド、そしてより好ましく少なくとも約７５〜１００又はそれより多くのヌクレオチドの鎖にわたるであろう。

ハイブリダイゼーションの文脈における相同性に関連する緊縮条件は塩、温度、有機溶媒及びその他のハイブリダイゼーション反応において典型的にコントロールされるパラメーターの緊縮複合条件であろう。緊縮温度は通常約３０°Ｃ以上、より通常には約３７°Ｃ以上、典型的には約４５°Ｃ以上、より典型的には約５５°Ｃ以上、好ましくは約６５°Ｃ以上、そしてより好ましくは約７０°Ｃ以上の温度を含むであろう。

緊縮塩条件はたいていは約１００軸り以下、通常は約５００ｓ＋Ｍ以下、より通常には約４００＋＊Ｍ以下、典型的には約３００ｍＭ以下、好ましくは約２００ＩＩＭ以下、そしてより好ましくは約１５０ｍＭ以下であろう、しかしながら、パラメーターの組合せは任意の単独パラメーターの値よりも重要である０例えば −ｅｔｍｕｒとＤａｖｉｄｓｏｎ　（１９６８）　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　３１　：　３４９−３７０（本明細書に参考として組入れる）を参照のこと。

■、レセプター変異体単離レセプターＤＮＡはヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入及びヌクレオチド鎖の反転によって容易に改質されうる。これらの改質はＧＲＰレセプター活性を有するそれらのレセプター、その誘導体又はタンパク質をコードする新規のＤＮＡ配列をもたらす、これらの改質配列は突然変異レセプターを作るために、又はレセプター種の発現を高めるために利用できうる。高められた発現性は、遺伝子増幅、高められた転写、高められた翻訳及びその他のメカニズムを包括しうる。かがる突然変異レセプター誘導体は関連のレセプター又はそのフラグメントの予備設定された又は部位特異的な突然変異を含む。「突然変異ＧＲＰレセプター」は本明細書において、上記したＧＲＰレセプターの相同性の定義に属する何らかのポリペプチドを包括するが、しがしなから欠失、置換又は挿入のいづれかにより天然において見い出せるＧＲＰレセプターのアミノ酸配列とは異なるそれを有するポリペプチドである。特に、「部位特異的突然変異ＧＲＰレセプター」とは、表１．２．３もしくは４、又はＳＥＱ　Ｉｎ　Ｎｏ　：　１０のレセプターとの相同性を有し、且つ、それらのレセプターと様々な生物学的活性を共有するものとして定義する。類似の概念がマウス及びヒトのＲＩＢ、Ｐ（ＧＲＰレセプター）、ラット及びヒトのＲ２８Ｐ　（ＮＭＰレセプター）、ヒトＲ３ＢＰ、並びにボンベシン様ペプチドに対するその他のレセプター、特に温血動物、例えば哺乳動物及び鳥類において見い出せるようなレセプターのそれぞれに適応する。

前述した通り、これらの説明はボンベシン様ペプチドに対する全てのレセプターを包括することを一般に意味し、特別に記載しであるＧＲＰレセプターの例に限定されないことを強調する。

部位特異的な突然変異部位を予め決定できるが、突然変異は部位特異的である必要はない。ＧＲＰ突然変異誘発はアミノ酸挿入又は欠失を行うことにより実施できる。置換、欠失、挿入又は任意の組合せは最終構築体に現われるように作り上げることができる。挿入にはアミノ−又はカルボキシ−末端融合が含まれる。ランダムな突然変異誘発は標的コドンにて実施でき、そして発現されたＧＲＰレセプター変異体は所望の活性についてスクリーンされうる。既知の配列を有するＤＮＡにおける予め決定した部位にて置換突然変異を行うための方法、例えばＭ１３プライマー突然変異誘発は当業界によく知られている。Ｓａｗｂｒｏｏｋら（１９８９）及びＡｕ５ｕｂｅｌら（１９８７及び付録）も参照のこと。

ＤＮＡにおける突然変異誘発は通常、解読枠の外にコード配列を置（べきでなく、そしてループ又はヘアーピンのような二次ｍＲＮＡ構造を作るようにハイブリダイズしうる相補性領域を作りあげないことが好ましいであろう。

本発明はまた組換タンパク質、例えばこれらのレセプター由来のセグメントを利用する異種融合タンパク質を提供する。異種融合タンパク質は同し状況において天然では通常融合し合っていないタンパク質又はセグメントの融合体である。従って、イムノグロブリンとレセプターポリペプチドとの融合生成物は、典型的なペプチド結合で融合した配列を有する連続タンパク質分子であり、典型的には単一翻訳生成物として作られ、そして各起源ペプチドに由来する特性を示すものである。’Ｗ４４以の概念が異種核酸配列に適応する。

更に、新規の構築体が、他のタンパク質に由来する類（以機能のドメインを組合せることによって作られうる。例えば、リガンド結合性又はその他のセグメントを、別の新たな融合ポリペプチド又はフラグメント間で「スワップＪさせることができる。本明細書に参考として組入れた、例えばＣｕｎｎ　ｉｎｇｈａｍら（１９８９）　５ｃｉｅｎｃｅ　２４３　：　１３３０−１３３６　；及びＯ’　Ｄｏｗｄら（１９８８）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６３　：　１５９８５ −１５９９２を参照のこと。従って、特異性の新たな組合せを示す新たなキメラポリペプチドは、リガンド結合特異性領域と細胞内領域との機能的連結に由来するであろう。例えば、その他の近縁レセプターに由来するリガンド結合性ドメインを加えるか、又はこれらのレセプターの別の結合性ドメインと置換さゼることかできる。得られるタンパク質は通常バイブリドな機能及び特性を有するであろう。

ＢｅａｕｃａｇｅとＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ　（１９８１）　Ｔｅｔｒａ、Ｌｅｔｔｓ、　２２　：　１８５９−１８６２により述べられているホスホラミジット法は適当な合成りＮＡフラグメントをもたらすであろう。二本鎖フラグメントは通常、相補鎖を合成し、次いで適当な条件のもとて鎖を互いにアニールさせることにより、又はＤＮＡポリメラーゼを用いて相補鎖に適当なプライマー配列を付加せしめることによって得られるであろう。

■、レセプターの作製ＧＲＰレセプター又はそのフラグメントをコードするＤＮＡは化学合成、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、又は広範囲にわたる様々な細胞系もしくは組織サンプルより調製したゲノムライブラリーのスクリーニングにより得ることができる。

このＤＮＡは、全長レセプター又はレセプターのフラグメントの合成のために（これは言い換えれば、ポリクローナル又はモノクローナル抗体の作製のために利用できる）；結合性の研究のために；改質レセプター分子の構築及び発現のために；並びに構造／ＩＩ能の研究のために広範囲にわたる様々な宿主細胞において発現されうる。

各レセプター又はそのフラグメントは、適当な発現ベクターにより形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞において発現されうる。これらの分子はその組換宿主に由来するもの以外のタンパク質又は細胞性夾雑物を実質的に含まないことができ、従って薬理学的に許容される担体及び／又は希釈剤と組合せたときに薬理学的組成物において特に有用となる。このレセプター、又はその一部は、他のタンパク質との融合して発現されうる。

発現ベクターは典型的には、所望のレセプター遺伝子又はそのフラグメントを含む自己復製型のＤＮＡ又はｌ？ＮＡ構築体であり、通常は適切な宿主細胞において認識される適切な遺伝子コントロール要素と作動連結している。これらのコントロール要素は適切な宿主の中で発現を及ぼすことが可能である。発現を及ばずのに必要な特定のタイプのコントロール要素は利用する実際の宿主細胞に依存するであろう。一般に、遺伝子コントロール要素は、原核系プロモーターシステム又は真核系プロモーター発現コントロールシステムを含むことができ、そして典型的には転写プロモーター、転写の開始をコントロールする任意のオペレーター、−ＲＮＡの発現レベルを高揚させる転写エンハンサ−１適当なリポソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳を終結させる配列を含む。発現ベクターはまた、宿主細胞とは独立してベクターが複製することを可能にする複製起点を含む。

本発明のベクターは、ボンへシン様ペプチドに対するレセプターをコードするＤＮＡ、又は生物学的に活性なレセプターポリペプチドをコードするそのフラグメントを含んでいる。このＤＮＡはウィルスプロモーターの制御下にあることができ、そして選別マーカーをコードすることができる。本発明は更に原核系又は真核系宿主においてレセプターをコードする真核系ｃＤＮＡを発現せしめることのできるかかる発現ベクターの利用を考慮しており、ここでこのベクターはその宿主に適応し、そしてここでこのレセプターをコードする真核系ｃ、ＤＮ＾はベクターの中に挿入されていてベクターを含む宿主の増殖が問題のｃＤＮＡを発現させるようにする。通常、発現ベクターはそれらの宿主細胞におＬＪる安定な複製のために、又は細胞当りの所望の遺伝子のコピーの総数を大いに高める増幅のためにデザインされている。宿主細胞の中で発現・・フタ−が複製する必要性は常に必要であるわけではなく、例えばＧＲＰレセプター又はそのフラグメントの一過性発現は、宿主細胞により認識される複製起点を含まないベクターを利用することで様々な宿主において及ぼされることが可能である。また、ＧＲＰレセプター又はそのフラグメントの組換えによる宿主ＤＮＡへの組込みを起こさせるベクターを用いることができる。

本明細書で利用するベクターはプラスミド、ウィルス、バクテリオファージ、組込み性ＤＮＡフラグメント、及び宿主のゲノムの中へのＤＮＡフラグメントの組込みを可能とするその他の媒体を含んで成る。発現ベクターは作動連結した遺伝子の発現を及ぼす遺伝子コントロール要素を含む特別のベクターである。プラスミドが最も一般的に利用されているベクターの型であるが、同等の機能を担い、そして当業界に知られている、又は知られるようになるであろうベクターのその他の型金てもここでの利用に適する。例えば、本明細書に参考として組入れるＰｏｕｗｅｌｓら（１９８５及び付録）Ｕ並ｕＬ■且■旦Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、　Ｎ、Ｙ、及びＲｏｄｒｉｑｕｅｚら（編）Ｖｅｃｔｏｒｓ　：　Ａ　鎖■胚ｏｆ　Ｍｏ上ｅｃｕｌａｒ　ＣＩｏｎｉｒ４　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｔｈｅｉｒ　Ｕｓｅｓ＋Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　１９８８を参照のこと。

形質転換細胞は、＆ｇ換ＤＮＡ技術を利用して構築したレセブターヘクターにより形質転換された又はトランスフェクトされた細胞、好ましくは哺乳動物細胞である。形質転換細胞は通常このレセプター又はそのフラグメントを発現するが、しかしながらそのＤＮＡをクローニング、増幅及び操作するためには、このレセプターを発現させる必要はない。本発明は更に栄養培地において形質転換細胞を培養せしめることを考慮しており、これによってこのレセプターを培養物の中に蓄積させることが可能となる。このレセプターは培養物又は培養培地のいづれかから回収できる。

本発明の目的のため、ＤＮＡ配列は互いに機能的に対応しているときに作動連結している。例えば、もしＤＮＡがプレタンパク質とじて発現されるか、又はポリペプチドを細胞膜に導くことを担う、もしくはポリペプチドの分泌を担うなら、プレ配列又は分泌リーダーについてのＤＮＡはポリペプチドに作動連結していることになる。プロモーターがポリペプチドの転写をコントロールするなら、それはコード化配列に作動連結している。リポソーム結合部位が翻訳を可能とするように位置しているなら、それはコード化配列に作動連結している０通常、作動連結は連続的であり、そして解読枠の中を意味するが、しかしながら一定の遺伝子要素、例えばレプレッサー遺伝子はつながっている必要はないが、ただしオペレーター配列に結合し続け、発現をコントロールする。

適切な宿主細胞には原核細胞、下等真核細胞及び高等真核細胞が含まれる。原核細胞にはグラム陰性及びダラム陽性の生物、例えばＥ、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）及びＢ、スブチリス（Ｂ、５ｕｂｔｉ　ｌｉｓ　）が含まれる。

下等真核細胞には酵母、例えばＳ、セレビジア（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）　、並びにタマホコリカビ（ＤｉｃＬ　ｏｓｔｅｌｉｕｍ）属の種が含まれる。高等真核細胞には、非呻乳動物起源、例えば昆虫細胞及び鳥類、並びに哺乳動物起源、例えばヒト、霊長類及びげっ歯頻の両者に由来の樹立された組織培養細胞系が含まれる。

原核宿主ベクター基には、数多くの様々な種のための広範囲にわたる様々なベクターが含まれる。ここで用いているＥ、コリ及びそのベクターはその他の原核細胞において用いられる同等のベクターを包括するように一般的に利用されるであろう。ＤＮＡを増幅させる代表的なベクターはｐＢＲ３２２又はその数多くの誘導体である。レセプター又はそのフラグメントを発現させるのに利用できるベクターには、　Ｉａｃプロモーター（ｐＵｃ−シリーズ）　；　ｔｒｐプロモーター（ｐＢＲ３２２−ｔｒｐ）　；　Ｉｐｐプロモーター（ｐｌＮ−シリーズ）；ラムダ−ｐＰもしくはｐＲプロモーター（ｐＯＴｓ）　；又はバイブリドプロモーター、例えばｐｔａｃ　（ｐＤＲ５４０）を含むようなベクターが含まれるが、それらに限定されない。本明細書に参考として組入れるＢｒｏｓ　ｉｕｓら（１９８８）ｒＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ　Ｌａｍｄａ−、ｔｒｐ−＋　１ａｃ−、ａｎｄ　Ｉｐｐ−ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｐｒｏ＊ｏｔｅｒｓ」、　Ｖｅｃｔｏｒｓ　：　Ａ　５ｕｒｖｅ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄＴｈｅｉｒ　Ｕｓｅｓ（ＲｏｄｒｉｇｕｅｚとＤｅｎｈａｒｄｔＷ）、　Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ＋　Ｂｏｓｔｏｎ　、第１０章、第２０５〜２３６を参照のこと。

下等真核細胞、例えば酵母及びタマホコリカビはＧＲＰレセプター配列含有ベクターにより形質転換されうる０本発明の目的のため、最も一般的な下等真核宿主はパン酵母、即ち、サッカロマイセスセレビジア（Ｓａｃｃｈａｒｏｓ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、これは下等真核細胞を代表するように一般的に利用されるが、しかしながら数多くのその他の株及び種も有用である。酵母ベクターは典型的には複製起点（組込み型を除＜）、選別遺伝子、プロモーター、レセプター又はそのフラグメントをコードするＤＮＡ、並びに翻訳終止、ポリアデニル化及び転写終止のための配列より成る。酵母のために適切な発現ベクターには３−ホスホグリセラードキナーゼ及び様々なその他の解糖酵素遺伝子のプロモーターのような構成プロモーター、又はアルコールデヒドロゲナーゼ２プロモーターもしくはメタロチオコンプロモーターのような誘発性プロモーターが含まれる。適切なベクターには下記のタイプの誘導体が含まれる：自己複製型低コピー数のタイプ（例えばＹＲｐ−シリーズ）、自己複製型窩コピー数のタイプ（例えばＹＥｐ−シリーズ）；組込みタイプ（例えばＹｌｐ−シリーズ）、又はミニ染色体のタイプ（例えばＹＣｐ−シリーズ）。

高等真核系組織培養細胞は機能的に活性なＧＲＰレセプタータンパク質の発現にとって好ましい宿主細胞である。原理的には、無を椎又はを椎起源にかかわらず全ての高等真核系組織培養細胞系、例えばバクロウィルス発現系が有用である。

しかしながら、哺乳動物細胞が好ましい、かかる細胞の形質転換又はトランスフェクション及び増殖は日常の手順となっている。有用な細胞系の例には、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵母（ＣＨＯ）細胞系、ベビーラントの腎１ｉ　（ＢＲに）細胞系、昆虫細胞系、鳥類細胞系及びサル（ＣＯ３）細胞系が挙げられる。かかる細胞系にとっての発現ベクターは通常、複製起点、プロモーター、翻訳開始部位、ＲＮＡスプライス部位（もしゲノムＤＮＡを用いたなら）、ポリアデニル化部位及び転写終止部位を含む。これらのベクターはまた選別遺伝子又は増幅遺伝子を通常含む。

適切な発現ベクターはプラスミド、ウィルス又はレトロウィルスであって、例えばアデノウィルス、ＳＶ４０、バーボウイルス、ワタシニアウィルス又はサイトメガロウィルスに由来するプロモーターを保有するものでありうる。適切な発現ベクターの代表例にはｐｃＩ］ＮＡＩ　１ｐＣＤ　（Ｏｋａｙａ＋ｉａら（］９８５）　Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　５　：　１１３６−１１４２を参照のこと）　；　ｐＭｃ１ｎｅｏポリＡ　（Ｔｈｏｍａｓら（１９８７）　Ｃｅ旦５１　：　５０３−５１２を参照のこと）；及びバクロウィルスベクター、例えばｐＡＣ３７３又はｐＡｃ６１０が挙げられる。

レセプターポリペプチドは、特定の又は規定のグリコジル化パターンを施すシステムの中で発現させることがしばしば所望されるであろう。この場合、通常のパターンは発現系によって当然に施されるであろう。しかしながら、このパターンは、グリコジル化されていない状態のようなポリペプチドを、異種の発現系に導入せしめた適当なグリコツル性タンパク質に暴露せしめることによって改変できるであろう。例えば、このレセプター遺伝子を哺乳動物の又はその他のグリコジル性酵素をコードする１又は複数の遺伝子と一緒に形質転換させることができる。この手法を用いることにより、一定の哺乳動物グリコジル化パターンが原核系又はその他の細胞において達成されるであろう。

■、レセプターの単離ｔｉ　ＧＲＰレセプターは下記に概略する方法によって活性の損失を伴うことなく活性状態において膜から可溶化され、そして精製されうる。ここでも、この方法はＧＲＰレセプターに適用しているが、ボンへシン様ペプチドに対するその他のレセプターも同様に挙動し、従って似たような方法を利用して単離可能されるであろう。

ＧＲＰレセプターの起源は前記した通り組換ＧＲＰレセプターＤＮＡを発現せしめることのできる真核系又は原核系宿主でありうる。この起源はマウスのスイス３Ｔ３繊維芽細胞のような細胞系であってもよいが、その他の哺乳動物の細胞系も本発明に考慮され、そして好ましい細胞系はヒトのそれである。

該活性ＧＲＰレセプターを安定化剤及び清浄剤を利用してＧＲＰレセプターを含む膜から可溶化せしめた。この安定化剤は好ましくは可溶性コレステリルエステルである。特に良好な結果はコレステリルヘミスクシネート（Ｃ）Ｉｓ）を用いて得られた。この清浄剤は非イオン性、双イオン性等でありうる。特に良好な結果は双イオン性清浄剤、即ち、３−Ｃ（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオツー１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）を用いて得られた。

ＧＮＰレセプターを含む細胞膜は、培養させたＧＲＰレセプターを含む細胞系、例えばスイス３Ｔ３繊維芽細胞の溶解、それに続く遠心によって調製される。得られるペレットを再懸濁によって洗い、そして再び遠心した。

上記及び実施例１に記載の通りに適当な細胞系から膜を獲得したら、タンパク質の最終濃度をＵ／４節する。適当な最終タンパク質濃度は約１５＋ｍｇ／ｍｌとする。

これらの膜を次にＧＲＰレセプターの可溶化の前に塩洗浄する。これらの膜を緩衝液と塩化ナトリウム（ＮａＣＩ　）で２回洗い、次いで可溶性緩衝液で洗い、そして最後に可溶性緩衝液の中で調節タンパク質濃度で９濁させる。最初の２回の洗浄にとっての適切な緩衝液組成は媒質、例えば５０＋Ｍの４−（２−ヒドロキソエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸０１ＥＰＥＳ）　、ｐＨ７，５、キレート剤、例えば２１１ＰＩのエチレンジアミン−四酢酸（ＥＤＴＡ）及びプロテアーゼインヒビターを含んで成る。適切なＮａＣ１濃度は１．０Ｍである。洗浄及び懸濁の両方のための可溶性緩衝液は典型的には５０＋ＭのＨＥＰＥＳ、　ｐＨ７，５，２１１１ＭのＥＤＴＡ、その他のキレート剤、例えば１ｍＭの〔エチレンビス−（オキシエチレンニトリロ）］四酢酸（ＥＣＴ八）、１００５ＭのＮａＣｌ及びプロテアーゼインヒビターを含んで成る。タンパク質濃度は例えば約７ｍｇ／ｍｌに合わせる。塩洗浄工程は２倍の精製度を提供する。似たような結果が、膜を２Ｍの尿素、高いｐ）Ｉの緩衝液（ｐＨｌＯ）　、又はカオトロピック塩、例えばヨウ化カリウム（Ｋｌ）で洗うことにより得られる。この手順は抽出物中のＧｌ？Ｐレセプターの安定性も高める。

緩衝液のその他の構成成分には、例えばスクロース、及び適当なプロテアーゼインヒビター、例えばアプロチニン、ロイペプチン、ペプスタチン、バシトリン及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）が含まれる。

次に清浄剤（（Ｊｌ＾ＰＳ）と可溶性コレステリルエステル安定化剤（Ｃ）Ｉｓ）との混合物をこの膜懸濁物にゆっくりと加えて設定の最終清浄剤濃度にする。

清浄剤の可溶性コレステリルエステルに対する重量比は約２００：１〜５：２の範囲内、好ましくは約１０＝１でありうる。他方、清浄剤を膜懸濁物に加え、続いて可溶性コレステリルエステルを加えてよい。この場合、まず清浄剤１００％が存在し、次いで可溶性コレステリルエステルを清浄剤のエステルに対する重量比が約ｚｏｏ：ｉ〜５：２の範囲、好ましくは約１０：１となるように加える。

ＧＲＰレセプターの可溶化のため、清浄剤の濃度は０．４〜３．０重量／容量％（ｗ／ｖ）とずべきであり、そして最適には約１５ｍｇ／＠１１の膜濃度（膜洗浄工程前）に対して約０．７５％（ｗ　／　ｖ　）に設定する。同様に、可溶性コレステリルエステルの濃度は約０．００１５〜１．２％（Ｗ／　ｖ　）の範囲内にする。同様に、４約１５ｍｇ／ｍｌの膜濃度に関して、可溶性コレステリルエステルの濃度は約０．０７５％（Ｗ／Ｖ）が好ましい。

この抽出物を次に約０〜３７°Ｃの範囲内の温度、典型的には室温、例えば２１ °Ｃでインキュベートし、次いで０〜２１°Ｃ１典型的には４°Ｃに冷却する。

この可溶性材料を次に包括される容置に依存して高速、好ましくは約１００，０００ｇにて、標準の遠心機において適当な時間遠心して、可溶化レセプターを含む抽出物（即ち、可溶性抽出物）を得る。

高い清浄剤濃度（０，４〜３．０％）ではこのレセプターは生物学的活性を損失する。しかしながら、緩衝液による希釈により、このレセプターは再活性化する。安定化剤として働（可溶性コレステリルエステルの存在は、レセプターが低清浄剤濃度で再活性化するために必要である。結合活性を示すように活性可溶化ＧＲＰレセプターを利用するアッセイに関して、懸濁物中の清浄剤の最終濃度は約０．０２５〜０．２％（ｗ　／　ｖ　）の範囲内に希釈すべきである。清浄剤の可溶性コレステリルエステルに対する重量比は約２００：１〜５：２の範囲内、好ましくは約ｌ０＝１に維持すべきである。従って、可溶性コレステリルエステルにとっての適切な範囲は約０．０００１２５〜０．０８％（Ｗ／ｖ）とする。

好ましいアッセイ濃度は０．０７５％（Ｗ／Ｖ）の清浄剤と約０．００７５％（Ｗ　／　Ｖ　）の可溶性コレステリルエステルである。

活性状態における可溶化レセプターを次に精製して、夾雑タンパク質を取除く。

ＧＲＰレセプターの精製は上記した可溶化手順に続く下記の工程を含む多段手順を包括している。

（１）ポリエチレングリコール沈殿、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の添加によってＧＲＰレセプターを可溶性抽出物から沈殿させる。ＰＥＧの添加は２０％（ｗ／ｖ）の最終濃度となるように行うのが好ましい。この沈殿物を次に遠心によって集め、次いで緩衝溶液にｇ濁させる。この緩衝溶液は典型的には２５ｄの）ＩＥＰＥＳ、　ｐｌ＋　７．５．２５１のトリス／Ｃ１，２＋ｌ１ＭのＥＤＴＡ、０．０７５％（ｗ／ｖ　）の清浄剤、０．００７５％（Ｗ／Ｖ）の可溶性コレステリルエステル及びプロテアーゼインヒビターを含んで成りうる。この懸濁物の最終容量はもとの可溶性抽出物の２５％とするのが好ましい。懸濁物の中に残っているタンパク質を遠心によって集める。この工程は２倍の精製度を提供し、そしてレセプターの安定性を高める。

（２）小麦胚芽凝集素クロマトグラフィー。この可溶性抽出物を、５０−ｈのＩＩＥＰＥｓｓ　ｐＨ７，５，２＋＋＋ＭのＥ［ｌＴＡ、０．２５％（ｗ／ｖ）の清浄剤、０．０２５％（Ｗ／ｖ）のコレステリルエステル及びプロテアーゼインヒビターを典型的に含んで成る緩衝溶液で平衡にした小麦胚芽凝集素アフィニティーカラムに適用した。このカラムをカラム緩衝溶液と５−１１のＮ−Ｎ’−Ｎ “−トリアセチルーチトトリオースで溶出させた。次に（ＪＰレセプターを含む画分を”Ｉ−ＧＲＰ結合アッセイによって同定した。この工程は炭水化物を含まないタンパク質を取除くことによって５倍の精製度を提供する。良好な収率を得るため、このカラムをチトトリオース又はチトビオースで溶出させることが必要である。その収率は清浄剤濃度を約０．２％以の清浄剤に、そして０．０２％の可溶性コレステリルエステルに維持せしめることによって高めることもできる。

（３）　ＧＲＰ−アフィニティークロマトグラフィー。小麦胚芽凝集素カラム溶出物をＧＲＰアフィニティ〜カラムで更に分画した。好ましい態様において、このカラムは、ペプチドヒト（ＮＩｅ１４．２７３　ＧＩ？Ｐ１．３−２７　（ＧＲＰのＣ末端領域）が２ｍｇのペプチド／充填ゲルｍｌで結合して有しているビーズマトリックスを含んでいる。このカラムは２５ｔｓＭのトリス、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、　ｐＨ７，５，２ＩＩＭのＥＤＴＡ、、０．０７５％（ｗ／ｖ）のＣＩｔ　Ａ　Ｐ　Ｓ、０．００７５％（Ｗ／Ｖ）のＣＨ３及びプロテアーゼインヒビターを典型的に含んで成る溶液で平衡にしである。小麦胚芽凝集素カラム溶出物中の清浄剤の濃度は、２５−ＭのＨＥＰＥＳ、２５＋ｗＭのトリス、ｐＨ７，５，２ｍＭのＥＤＴＡ及びプロテアーゼインヒビターを典型的に含んで成る溶液による希釈によって０．０７５％（Ｗ／Ｖ）に調節することが好ましい。サンプルの適用及びカラムの過剰の洗浄の後、結合したタンパク質を０．２Ｍ以上の濃度の塩で溶出させる。０．５ＭのＮａＣ１が特に適切である。Ｇｌ？Ｐレセプターを含む両分を次に”’Ｉ−ＧＲＰ結合アッセイによって同定する。利用したＧＲＰベプ千Ｆ　（（ＮＩｅ１４．２７１Ｇｌ？Ｐ１３−２７　）は、酸化に耐性なＴｒｉｔｏｎ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｉｎｃ、（＾ｌａｍｅｄａ。

ＣＡ）により作られた類イ以体である。有用なその他のＧＲＰペプチド及びマトリックスには、限定することなく、ＧＲＰｌ−２７，Ｇｌ？Ｐ１．４−２７及び（１，ｙｓ３）ボンベシンも含まれるが、最適収率及び溶出濃度の調節が必要であろう。レセプター結合活性が維持され、且つ、良好な収率が得られることを理由に、塩による結合タンパク質の溶出は重要である。カラムに載せられたサンプル中の清浄剤の濃度は慎重に最適化する。清浄剤の適切な範囲は約０．０２５〜０．２％（ｗ／ｖ　）である。清浄剤の安定化剤に対する比も同様に、２００：１〜５：２、好ましくは１０７１にする。

（４）第２アフイニテイーカラム。このアフィニティーカラムから溶出させたＧＲＰレセプターを含む両分を脱塩し、そしてそのサンプルを第２のＧｊｔＰアフィニティーカラムに適用し、そして工程（３）に記載の通りに溶出させた。レセプターを含む両分を結合アッセイにより同定した。この工程における２木の連続アフィニティーカラムの利用は高い度合いの精製度をもたらすのに好ましい。

（５）ゲル濾過。これはより純粋な生成物をもたらす任意的な工程である。ゲル濾過工程はまたプロテアーゼインヒビター、塩及び残留清浄剤をレセプターから除去するのに有用である。

一般に、本発明の可溶化した未精製の、及び可溶化した精製ＧＲＰレセプターは少なくともＫｎ　＝１０ｎＨの親和力でガストリン放出ペプチドと結合する０本発明にかかわるマウスのスイス３Ｔ３繊維芽細胞系由来のＧＲＰレセプターは下記の特徴を有することが認められた：約７０〜１００キロダルトンの見かけ上の分子量で５ＤＳ−ＰＡＧＥ上でブロードバンドとして泳動する；ボンベシン型のポリペプチドに特異的に結合する；約１０〜ｌｏＯｐＭのに０値を存する；結合したＧプロティンを有さない；Ｎ−結合化炭水化物を含む；脱グリコジル化したとき、５Ｏ３−ＰＡＧＥ上で３６±５キロダルトンの見かけ上の分子量を有する；そしてＮ−末端付近にて −Ｌｅｕ−＾５ｎ−Ｌｅｕ−へ５ｐ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ −３ｅｒ−の部分アミノ酸配列を有する。

全体の配列がこれでわかるため、ＧＲＰレセプター、そのフラグメント又は誘導体は、ペプチドを合成するための常用の方法によって製造できる。これらの方法には、本明細書にそれぞれの全体を組入れる、　ＳｔｅｗａｒｔとＹｏｕｎｇ　（１９８４）　５ｏｌｉｄ上ｈａｓｅ　Ｐｅ　ｔｉｄｅ　Ｓ　ｎｔｈｅｓｉｓ。

Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ　；　ＢｏｄａｎｓｚｋｙとＢｏｄａｎｓｚｋｙ　（１９８４）７ｈｅ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　Ｐｅ　ｔｉｄｅ　Ｓ　ｎｔｈｅｓｉｓ、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　；及びＢｏｄａｎｓｚｋｙ　（１９８４）　Ｔｈｅ　Ｐｒ１ｎｃｉ　ｌｅｓ　ｏｆ　Ｐｅ　ｔｉｄｅ　Ｓ　ｎｔｈｅｓｉｓ。

Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋに記載されているような方法が含まれる。例えば、アジド法、酸塩化物法、酸無水物法、複合無水物法、活性エステル法（例えば、ｐ−ニトロフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル又はシアノメチルエステル）、カルボジイミダゾール法、酸化還元法、又はジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣＤ）　／添加法が利用できる。固相及び溶液相合成は共に上記の方法に適用できる。

ＧＲＰレセプター、フラグメント又は誘導体は、ペプチド合成において典型的に採用される上記の方法に従って適切に製造され、一般には、末端アミノ酸にアミノ酸を１個づつ順に縮合することを含んで成るいわゆる逐次工程によって、又は末端アミノ酸にペプチドのフラグメントを結合させることのいづれかによって行われる。結合反応において利用されないアミノ基は不適切な配置での結合を防ぐために保護されていな（ではならない。

面相合成を採用するなら、Ｃ末端アミノ酸を不溶性担体又は支持体にそのカルボキシル基を介して結合させる。不溶性担体は、反応性カルボキシル基に対する結合能力を有する限り特に限定されない。

かかる不溶性担体の例にはハロメチル樹脂、例えばクロロメチル樹脂又はブロモメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、フェノール樹脂、第三−アルキルオキシカルボニルヒドラジド他樹脂等が挙げられる。

アミノ基保護化アミノ酸を順に、その活性化カルボキシル基と、予め作られているペプチド又は鎖の反応性アミノ基との縮合を介して結合させてペプチドを順々に合成させる。完全な配列が合成された後、このペプチドをこの不溶性担体から切り離してペプチドを得る。この固相手法は一般にＭｅｒｒｔｆｉｅｌｄら（１９６３）のＪ、Ａ−、Ｃｈｅ（Ｓｏｃ。

８５　：　２１４９−２１５６（本明細書に参考として組入れる）に述べられている。

製造せしめたレセプター及びそのフラグメントはペプチド分離、例えば抽出、沈殿、電気泳動及び様々な形態のクロマトグラフィーによってこの反応混合物から単離及び精製できる。本発明のレセプターはその所望の用途に応じて様々な程度の純度で得ることができる。精製は本明細書に開示しであるタンパク質精製技術の利用によって、又は本明細書に記述しである免疫吸着アフィニティークロマトグラフィーにおける抗体の利用によって成し遂げることができる。

この免疫吸着アフィニティークロマトグラフィーはまず抗体を面相支持体に連結し、次いでこの連結した抗体を小細胞肺癌細胞の可溶化リゼートと、ＧＲＰレセプターを発現するその他の細胞のリゼートと、又はＤＮＡ工学の結果としてＧＩ？Ｐレセプターを生産する細胞のリゼートもしくは上清液と接触させることによって実施する（下記を参照のこと）。

■、レセプター類似体ＧＲＰレセプターの「誘導体」にはアミノ酸変異体、グリコジル化変異体、及びその他の化学成分との共有結合又は凝集複合体が含まれる。共有結合誘導体は当業界によく知られる手段により、ＧＲＰレセプターのアミノ酸側鎖又はＮ−もしくはＣ−末端において見い出せる基と官能基とを連結させることによって製造できる。これらの誘導体には、限定することなく、カルボキシル末端又はカルボキシ側鎖含有残基の脂肪式エステル又はアミド、ヒドロキシル基含有残基のＯ−アシル誘導体、及びアミノ末端のアミノ酸又はアミノ基含有残基、例えばリジンもしくはアルギニンのＮ−アシル誘導体が挙げられる。アシル基はＣ３〜Ｃ１Ｂの通常のアルキルを含むアルキル成分の群より選ばれ、従ってアルカノイルアロイル種を形成する。

特に、例えばポリペプチドの合成及びプロセシング中又は更なる処理工程においてそのグルコシル化パターンを改変させることによってなされるグリコジル化変異が含まれる。これを成し遂げる特に好ましい手段は、ポリペプチドを、かかるプロセシングを通常施す細胞に由来するグリコジル性酵素、例えば哺乳類グリコジル性酵素にａｆ！せしめることによる。脱グリコジル化酵素も考慮される。また、リン酸化アミノ酸残基、例えばホスホチロシン、ホスホセリン又はホスホスレオニンを含むその他の小さな改質を有する同じ一次アミノ酸配列の型も包括される。

誘導体は組換培養物、例えばＮ−もしくはＣ−末端融合体においてに好ましいＧＲＰ誘導体の箇所は自由なアミノ基、炭水化物成分及びシスティン残基である。

レセプターと他の相同性又は異種タンパク質との融合ポリペプチドも提供する。

相同性ポリペプチドは異なる増殖因子レセプターの融合体であってよく、その結果例えば一方のレセプターのリガンド特異性と他方の細胞内領域を示すバイブリドタンパク質、又は幅広いもしくは狭い結合特異性を有しうるレセプターがもたらされる。

同様に、誘導タンパク質の組合わさった特性又は活性を示すであろう異種融合体が構築されうる。典型的な例はリポータ−ポリペプチド、例えばルシフェラーゼと、レセプターのセグメント又はドメイン、例えばリガンド結合性セグメントとの融合体であり、これにより所望のりガントの存在又は位置は容易に決定されうる。例えば本明細書に参考として組入れたＤｕｌｌらの米国特許第４，８５９，６０９号を参照のこと。その他の遺伝子融合体のパートナ−には細菌性β−ガラクトシダーゼ、ｔｒｐＥ、プロティンＡ１β−ラクタマーゼ、アルファーアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ及び酵母アルファー交雑因子が含まれる。例えばＧｏｄｏｗｓｋｉら（１９８Ｂ）　５ｃｉｅｎｃｅ　２４１　：　８１２− ８１６を参照のこと。

ＢｅａｕｃａｇｅとＣａｒｒｕＬｈｅｒｓ　（１９８１）　ＴｅＬｒａ、Ｌｅｔｔｓ、　２２　：　１８５９−１８６２に記述のホスホセリント法は適切な合成りＮＡフラグメントをもたらずであろう。二本鎖のフラグメントは通常、相補鎖を合成し、次いで適当な条件下で鎖を「いにアニールさせることにより、又は適当なプライマー配列をＤＮＡポリメラーゼによって相補鎖に付加することによって得られるであろう。

かかるポリペプチドは、リン酸化、スルホン化、ビオチニル化又はその他の成分、特にリン酸基と似たような分子形態を有するものの付加もしくは除去によって化学的に改質されているアミノ酸残基も有しうる。ある態様において、この改質は試薬をラベルするのに、又は精製標的、例えばアフィニティーリガンドとして働くために有用であろう。

融合タンパク質は典型的には組換核酸法又は合成ポリペプチド法のいづれかによって作られる。核酸操作及び発現のための技術は一般に例えば本明細書に参考として組入れる５ａｔａｂｒｏｏｋら（１９８９）艶凡咀（１）づ）桓」土［国呟１ＷＬ力王旦（第２版）、第１〜３巻、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに記述されている。ポリペプチドの合成のための技術は、例えばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　（１９６３）　Ｊ、Ａｍｅｒ、Ｃｈｃｖ、Ｓｏｃ。

８５　：　２１４９−２＋５６　；Ｍｅｒｒｉｆｉｅ！ｄ　（１９８６）　５ｃｉｅｎｃｅ　２３２　；　３４１−３４７　；及びＡｔｈｅｒｔｏｎら（１９８９）　５ｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅ　ｔｉｄｅ　Ｓ　ｎｔｈｅｓｊｓ　：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌ卸肛懸並、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄに記述されている：それぞれ本明細書に参考として組入れる。

本発明はアミノ酸配列における改変又はグリコジル化以外のＧＲＰレセプターの誘導体の利用も考慮している。かかる誘導体は化学成分との共有又は凝集会合を包括しうる。これらの誘導体は一般に３種類のクラスに分かれる：　（１）塩類、（２）側鎖及び末端残基共を結合改質体、並びに（３）例えば細胞膜との吸着複合体。かかる共有結合又は凝集誘導体は免疫原として、ガストリン放出ペプチド又はその他のりガント結合性リガンドのイムノアッセイ又は精製方法、例えばアフィニティー精製における試薬として有用である。例えばＧＲＰレセプターは、例えば当業界によく知られている方法によって固相支持体、例えばシアノゲンブロミドー活性化七ファロースに共有結合させることにより、又はグルグルアルデヒド架橋を伴ってもしくは伴わないでポリオレフィン表層に吸着させることによって、抗ＧＲＰレセプター抗体又はガストリン放出ペプチドのアッセイ又は精製において利用するために固定化することができる。　ＧＲＰレセプターは例えばクロラミン工手順によって放射ヨウ素化させることによって検出基でラベルせしめる、稀土類キレ−１・剤に共有結合させる、又はその他の蛍光成分に複合させて診断アッセイに用いることができる。

本発明の可溶化ＧＲＰレセプターは、このレセプター又は任意のそいる様々な状態の不純な調製品による免疫化によって作られたモノクローナル抗体又は抗原結合性フラグメントをスクリーンするために利用できる。特に、「抗体」なる語は天然の抗体の抗原結合性フラグメントをも包括している。精製レセプターは高いレベルのガストリン放出ペプチド又はＧＩ？Ｐレセプターを含む細胞フラグメントの存在に応答して作られた任意の抗体を検出する試薬としても利用できる。更に、ＧＲＰレセプターフラグメントは下記に記載の通り、本発明の抗体を製造するだめの免疫原として働くこともできる。例えば、本発明は表１．２．３もしくは４、又はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１０、あるいはそれらのフラグメントに対して結合親和性を有する、又はそれらに対して発生された抗体を考慮している。特に、本発明は脂質二層の外側にあると予測される特定のフラグメントに対する結合親和性を有する又はそれらに対して発生された抗体を考慮している。これらのフラグメントはＮ−末端付近に以下の１０個のアミノ酸配列（残基９〜１８に至る）を含む： −Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−＾５ｐ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ −５ｅｒ−０更に、本発明は膜の細胞外側上にあると予測されるＧｌ？Ｐレセプターのフラグメント、即ち：残基１〜３９；残基９８〜１１５；残基１７６〜２０９；及び残基２８８〜３００；を包括し；そして膜の細胞内側にあると予測されるレセプターの下記の領域、即ち：残基６４〜７７；残基１３８〜１５７；残基２３６〜２６６；及び残基３３０〜３８５；のフラグメントを包括する。ボンベシン様ペプチドに対するその他のレセプターの類似領域も利用されるであろう。

■、抗体抗体は様々なサブタイプのＲＢＰ、例えばＧＲＰ及び近縁レセプター、並びにそれらのフラグメントに対して、その天然形態において、又はそのｍ換形態の両方において発生されうる。更に、抗体はその活性形態におい°ζ又はその不活性形態のいづれかにおいてＧＲＰレセプターに対して発生されることがあり、この相違は活性レセプターに対する抗体が活性レセプターにおいてのみ存在しでいるエピ１−一ブを認識する傾向にあることにある。抗イデイオタイプ抗体も考慮される。

ＧＲＰレセプターの予め決定されたフラグメントに対する、結合性フラグメント及び一本積型を含む抗体は、免疫原タンパク質を伴うフラグメントのコンジュゲ −１・による動物の免疫によって発生する。

モノクローナル抗体は所望の抗体を分泌する細胞から調製される。

これらの抗体は正常もしくは欠陥ＧＲＰレセプターに対する結合性についてスクリーンされつるか、又は作動性もしくは拮抗性ＧＲＰレセプター活性についてスクリーンされうる。これらのモノクローナル抗体は通常少なくとも約１＠ＭのＫｎ、より通常には少なくとも約３００μＭ、典型的には少なくとも約１０μＭ、より典型的には少なくとも約３０μＭ、好ましくは少なくとも約１０μＭ、そしてより好ましくは少なくとも約３μＭ又はそれより優れて結合するであろう。

以上はＧＲＰレセプターについて向けられているが、ボンベシン様ペプチドに対するその他のレセプター、又はレセプターのサブタイプに対して似たような抗体が発生されるであろう。

抗原結合性フラグメントを含む本発明の抗体は有意義な診断的又は治療的価値を有しうる。これらはＧＲＰレセプターに結合し、そしてレセプターへのりガントの結合を阻止する又は生物学的応答を誘発するガストリン放出ペプチドの能力を阻止する潜在的な拮抗因子でありうる。これらは非中和性抗体としても有用であり、そして毒素又は放射性核種に結合してこの抗体がレセプターに結合したときに、その細胞自体を殺傷せしめることもできる。更に、これらの抗体は薬剤又はその他の治療剤に、直接に、又はリンカ−によって間接的に複合化されうる。

本発明の抗体は診断用途においても有用でありうる。捕獲又は非中和性抗体として、それらはりガントの結合性を阻止することなくＧＲＰレセプターに結合できる。中和性抗体としては、それらは競合結合アッセイにおいて有用となりうる。

これらはＧＲＰ又はＧＲＰレセプターを検出又は定量するうえでも有用であろう。

レセプターフラグメントは、免疫原として利用されるべき融合した又は共有連結したポリペプチドとし７て、その他の物質、特にポリペプチドに連結させてよい、ＧＲＰレセプター及びそのフラグメントを様々な免疫原、例えばキーホールリンベットヘモシアニン、牛血清アルブミン、破傷風毒素等に融合又は共存結合させてよい。

炬り印■ユ酊ｚ、ｔｌｏｅｂｅｒ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、　Ｈａｒｐｅｒ　とＲｏｗ、１９６９　；Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ　（１９６２）　Ｓ　ｅｃｉｆｉｃｉｔ　ｏｆ　５ｅｒｏｌｏ　１ｃａｌ　Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ。

Ｄｏｖｅｒ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、及び−ｉ　Ｉ　ｌ　ｉａｍｓら　（１９６７）　Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　ｒｓｎｕｎｏｌｏ　ａｎｄ　Ｔ＋ｕ＋ｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　第１巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ　ＰｒｅＳＳ＋Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋを参照のこと。それぞれは、ポリクローナル抗血清を調製する方法の詳細に関して、本明細書に参考として組入れている。典型的な方法は抗原による動物の超免疫を包括する。動物の血液を反復免疫のすぐ後に集め、そしてガンマ−グロブリンを単離している。

ある状況において、様々な哺乳動物宿主、例えばマウス、げっ歯頚、霊長類、ヒト等からモノクローナル抗体を製造することが所望される。かかるモノクローナル抗体を製造するための技術の詳細は例えば５ｔｉｌｅｓら（績）ハ護旦ｌせ」Ｕ加μ叫１斐ｙ匹国■（第４版）。

Ｌａｎｇｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、　Ｌｏｓ　Ａｌｔｏｓ、　ＣＡ及びその中の引用文献；　ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ　（１９８９）　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　：　Ａ↓仲犯１ユＤ５１ｎｕａ！、　Ｃ３ＨＰｒｅｓｓ　；　Ｇｏｄｉｎｇ　（１９８６）　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　：　Ｐｒ１ｎｃｉ　ｌｅｓ　ａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ　（第２版）　Ａｃａｄｅｓ＋ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　；そして特にモノクローナル抗体を作り上げる一方法を述べているＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ（＋９７５）　Ｎａｔｕｒｅ　２５６　：　４９５−４９７において見い出すことができる。それぞれは本明細書に参考として組入れる。簡潔すると、この方法は動物に免疫原を注射することを包括する。次にこの動物を殺し、そして肺臓から細胞を取出し、これらはミエローマ細胞と融合させる。

インビトロで再生可能なバイブリド細胞又は「ハイブリドーマ」が得られる。次にこのハイブリドーマの集団をスクリーンに付して個々のクローンであってそれぞれが免疫原に対する単独の抗体物質を分泌するものを単離する。これにより、獲得できる個々の抗体物質は、免疫原物質において認められる特異的な部位に応答して作り上げられた、免疫動物に由来する不死化され、且つ、クローンされた単独Ｂ細胞の生成物である。

その他の適当な技術には、抗原性ポリペプチドに対するリンパ球の暴露、又はそうでなければファージもしくは類領のベクターにおける抗体のライブラリーの選別が含まれる。Ｈｕｓｅら（１９８９）ｒＧｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｌａｒｇｅ　Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｙ　Ｌｉｂｒａｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＩｍｍｕｎｏｇｌｕｂｉｎＲｅｐｅｒｔｏｒｉｅ　ｉｎ　Ｐｈａｇｅ　Ｌａｍｄａ　ＪＳｃｉｅｎｃｅ　２４６　：　１２７５−１２８１　ｉ及び−ａｒｄら（１９８９）ハＵ朋３４１　：　５４４−５４６を参照のこと。それぞれ本明細書に参考として組入れる。本発明のポリペプチド及び抗体は改質を伴を共存的に又は非共有的に結合させることによりラベル化されうる。

広範囲にわたる様々なラベル及びコンジュデーション技術が知られており、そして科学及び特許文献の両者によく報告されている。適当なラベルには放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光成分、ケミルミネンセント成分、磁性粒子等が含まれる。かがるラベルの利用を教示する特許には、米国特許第３，８１７，８３７号；第３、８５０．７５２号；第３，９３９，３５０号；第３．９９６，３４５号；第４．２７７．４３７号；第４．２７５，１４９号；及び第４，３６６．２９１号が挙げられる。更に、組換イムノグロブリンが製造されうる。Ｃａｂｉｌｌｙの米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと。これらの特許は本明細書に参考として組入れる。

本発明の抗体はレセプターを単離するうえでのアフィニティークロマトグラフィーのためにも利用できうる。カラムは抗体を固相支持体、例えば粒子、例えばアガロース、セファデックス等に結合させることにより調製でき、細胞リゼートをこのカラムに通過させ、このカラムを洗い、続いて緩やかな変性剤の濃度を上昇させることで精製レセプタータンパク質が放出されるであろう。

抗体は特定の発現生成物についての発現ライブラリーをスクリーンするためにも利用できうる。通常、かかる手順において用いられる抗体は、抗体結合によって抗原の存在の容易な検出を可能とする成分によってラベルされているであろう。

各レセプターに対して発生された抗体は抗イデイオタイプ抗体を発生させるためにも利用されるであろう。これらは対応のレセプターの発現に関連する様々な免疫学的症状を検査又は診断するうえで有用であろう。

■、レセプターの他の用途本発明のボンベシン様ペプチドに対するレセプターの天然及び組換形態は、レセプターに対する結合活性についての化合物をスクリーンすることのできるキット及びアッセイ法において特に有用である。自動アッセイのいくつかの方法がここ数年において開発されており、年間当り数万の化合物のスクリーニングが可能となっている。

例えばＦｏｄｏｒら　（１９９１）　５ｃｉｅｎｃｅ　２５１　：　７６７−７７３を参照のこと。これは本明細書に参考として組入れており、そして固相支持体上で合成されたいくつかの一定のポリマーによる結合親和力の試験のための手段が述べられている。適切なアッセイの開発は、本発明により提供されるような活性状態における大量の精製された可溶性レセプターを利用することによって大いに促進されうる。

例えば、レセプター、この場合はＧＲＰ及びＮＭＢのレセプターが薬理学的に定義付けされたら、拮抗因子を見い出すことが通常できる。

潜在的なレセプター拮抗因子の試験はこれにより、精製レセプターを用いる大いに自動化されたアッセイ法の開発に基づいて可能となる。特に、新規の作動因子及び拮抗因子が、ここで有用となったスクリーニング技術を用いることによって発見されるであろう。特に重！なのは、多重レセプターサブタイプに対する複合結合活性を有するものと認められた化合物、例えばＧＲＰレセプター及びＮＭＢレセプターの両者に対する拮抗因子として働きうる化合物である。かがる化合物は多重レセプターサブタイプに同時に影響を及ぼす手段を担う。

本発明は任意の様々な薬剤スクリーニング技術において組換レセプターを利用することによる化合物のスクリーニングにとって特に有用である。レセプター反応性薬剤についてスクリーニングするうえでの組換レセプターの利用の長所には：　（ａ）特定の起源に由来するレセプターの改善された更新性起源；　（ｂ）アッセイにおいて優れたシグナル対ノイズ比を担う、細胞当りの潜在的により多い数のレセプター；及び（Ｃ）レセプターサブタイプの特異性（理論的には高い生物学的及び疾病特異性を担う）が挙げられる。

薬剤スクリーニングの一方法は、レセプターを発現する組換ＤＮＡ分子により安定に形質転換されている真核系又は原核系宿主細胞を利用する。単独のレセプターサブタイプ単離体を発現する細胞を他から単離できる。活動又は固定化形態のいづれかにあるかがる細胞は標準のレセプター／リガンド結合アッセイのために利用できる。

Ｐａｒｃｅら　（１９８９）　５ｃｉｅｎｃｅ　２４６　：　２４３−２４７　；及び０ｗ１ｃｋｉら　（１９９０）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ、Ｓｃ＋、　［ＪＳＡ　８７　：　４００７−４０１１　も参照のこと。これらは本明細書に参考として組入れ、そして細胞応答を検出する高感度な方法が述べられている。競合アッセイが特に有用であり、ここでは細胞（例えばＲＢＰの起源）をレセプターに対する既知の結合親和力を有するラベル化リガンド、例えば”’ｒ− ＧＲＰと接触及びインキュベートさせ、次いでＧＲＰレセプターに対する結合親和力を測定すべき化合物を試験する。結合リガンドと自由リガンドとを分けてリガンドの結合性の程度を評価する。試験化合物の量は測定すべきラベル化リガンド結合性の値に反比例する。真人な数の技術のいづれがを、自由リガンドから結合型を分けてリガンド結合性の程度を評価するために用いることができる。この分離工程は典型的にはフィルターへの付着、それに続く洗浄、グラス千ノ夕べの付着、それに続く洗浄、又は細胞膜の遠心のような手順を含む、活動細胞は、ＧＲＰレセプター仲介機能、例えば第２メツセンジヤーレベル（即ち、Ｃａ”）　；細胞増殖；イノシト−ルリン酸プール変動；他、に及ぼず薬剤の作用についてスクリーンするためにも利用できうる。いくつかの検出法、例えば近位感度検出系は分離工程の省略を可能にする。

カルシウム感受性色素はフルすりメーター又は蛍光セルソーティング装置でＣａ ”レベルを検出するのに有用であろう。

他の方法はＧＲＰレセプターの起源として、形質転換された真核系又は原核系宿主細胞由来の膜を利用する。これらの細胞はＧＲＰレセプターの発現をもたらすＤＮＡベクターによって安定に形質転換されている０本質的に、これらの膜は細胞から調製でき、そして任意のレセプター／リガンド結合アッセイ、例えば前記した競合アッセイに利用できる。

更に別の手法は、形質転換された真核系又は原核系宿主細胞由来の可溶化された未精製の、又は可溶化された精製レセプターの利用である。これは高められた特異性、自動化の能力、及び高い薬剤試験処理能力の長所を有する「分子」結合アッセイを可能にする。

薬剤スクリーニングのための別の技術は、ガストリン放出ペプチドレセプターに対する適当な結合親和力を有する化合物についての高い処理能カスクリーニングを担う手法を包括し、そして本明細書に参考として組入れる、１９８４年９月１３日に公開されたＧｅｙｓｅｎのヨーロッパ特許出願第８４１０３５６４号に詳しく記載されている。第１に、数多くの種々の小さなペプチド試験化合物を固相支持体、例えばプラスチックビン又はいくつかのその他の適切な表面の上で合成する。

Ｆｏｄｏｒら（１９９１）を参照のこと。次に、全てのビンを可溶化された未精製の、又は可溶化された精製ＧＲＰレセプターと反応させ、次いで洗う。次の工程は結合化ＧＲＰレセプターの検出を包括する。

合理的な薬剤デザインはレセプター及びその他のエフェクター又はリガンドの分子形態の構造的研究にも基づくことがある。エフェクターは、リガンド結合に応答してその他の機能を仲介するその他のタンパク質、又はレセプターと通常相互作用するその他のタンパク質でありうる。どの部位が特定のその他のタンパク質と相互作用するかを決定するための一手段は物理構造決定、例えばＸ線結晶グラフィー又は２次元ＮＭＲ技術である。これらはどのアミノ酸残基が分子接触領域を構成するかの指針を担うであろう。タンパク質の構造決定についての詳細は、例えば旧ｕｎｄｅｌｌとＪｏｈｎｓｏｎ（１９７６）　Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｑｌ互 υ杜上」「見１α、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋを参照のこと（本明細書に参考として組入れている）。

精製レセプターは前記の薬剤スクリーニング技術における利用のためにプレート上に直接コートされうる。しかしながら、これらのレセプターに対する非中和性抗体は、固相上の対応のレセプターを固定化するための捕獲抗体として利用できうる。

■、リガンド：作動因子及び拮抗因子ボンへシン様ペプチドに対する生理学的応答のブロッキングは、レセプターに対するリガンドの結合の阻止、同様に競合阻害を介して得られうる。従って、本発明のインビトロアッセイは通常、組換レセプターを発現する細胞に由来する単離膜、これらのレセプターのりガント結合性セグメントを含んで成る可溶性フラグメント、又は固相支持体に結合させたフラグメントを利用するであろう。これらのアッセイは結合性セグメントの突然変異体及び改質体、又はリガンド突然変異体及び改質体、例えばりガント類似体の作用の診断決定を可能にするであろう。

本発明は更に競合薬剤スクリーニングアッセイの利用も考慮しており、例えばここではレセプターに対する結合に関して試験化合物と競合する、レセプター又はレセプターフラグメントに対する抗体を中和させている。これにより、これらの抗体はレセプターの１又は複数の結合性部位を共有する任意のポリペプチドの存在を検出するために用いることができ、従ってボンへシン様ペプチドにより占拠されうるレセプター上の結合性部位を占拠するように用いることもできる。

更に、高い親和力のりガント結合性部位を含むレセプター及びレセプターの可溶性フラグメントに対する中和性抗体は、癌組織、例えば増殖異常となっている組織におけるガストリン放出ペプチドレセプター機能の阻止に利用されうる。

Ｘ、キット本発明は、ガストリン放出ペプチドレセプターの存在を検出するための樺ノンな診断キット及び方法におけるＧＩＩＰレセプター、そのフラグメント、ペプチド及びその融合生成物の利用も考慮する。典型的なキットは規定のレセプターペプチドもしくは遺伝子セグメント、又はその一方もしくは他方を認識する試薬のいづれかを含む区分を有するであろう。

ガストリン放出ペプチドに対する試験化合物の結合親和力を決定するためのキットは典型的には、試験化合物；ラベル化合物、例えばガストリン放出ペプチドレセプターに対する既知の結合親和力を有するリガンド又は抗体；ガストリン放出ペプチドレセプターの起ｆＡ（天然又は組換体）；及び自由ラベル化合物から結合化合物を分動するための手段、例えばガストリン放出ペプチドレセプターを固定化するための固相を含んで成るであろう。化合物がスクリーンされたら、ＧＲＰレセプターに対する適切な結合親和力を有するものを当業界によく知られる通りの適切な生物学アッセイで評価して、それらが作動因子又は拮抗因子として働くかどうかを決定することができる。＆１１換レセプターポリペプチドの有用性はかかるアッセイを検量化せしめるためのよく規定されている標準品も担う。

サンプル中の例えばガストリン放出ペプチドレセプターの濃度を決定するための好ましいキットは典型的には、ラベル化合物、例えばガストリン放出ペプチドレセプターに対する既知の結合親和力を有するリガンド又は抗体、ガストリン放出ペプチドレセプターの起ｍ＜例えば天然又は組換体）、及びラベル化合物から結合化合物を分離するための手段、例えばガストリン放出ペプチドレセプターを固定化するための固相を含んで成るであろう。試薬及び仕様書を含んでいる区分を通常提供する。

サンプル中のガストリン放出ペプチドレセプターの濃度を決定するための一方法は典型的には下記の工程：（１）ＧＲＰレセプター起源を含んで成るサンプルから膜を準備する；　（２）この膜を洗い、次いでそれらを緩衝液の中で洗う；　（３）これらの膜を、清浄剤及び可溶性コレステリルエステルの加えた培養培地の中でインキュベートすることによってＧＲＰレセプターを可溶化せしめる；　（４）可溶化レセプターの清浄剤濃度を調節する；　（５）前記希釈物を放射ラベルＧＲＰと接触及びインキュベートさせてＧＲＰ：　ＧＲＰレセプターの複合体を生成せしめる；　（６）この複合体を例えばポリエチレンイミン処理フィルターを介する濾過によって回収する；そして（７）回収した複合体の放射活性を測定する；ことを含んで成る。同様の方法はＲＢＰＯ科の他の構成員にも適応するであろう。

レセプター又はレセプターフラグメントに対して特異的な抗原結合性フラグメントを含んでいる抗体は、レセプター及び／又はそのフラグメントの高揚したレベルの存在を検出する診断用途において有用である。かかる診断アッセイはリゼート、活動細胞、固定化細胞、免疫蛍光体、細胞培養物、体液を採取することができ、そして更に血清等の中のＧＲＰレセプターに対応する抗原の検出を包括する。

診断アッセイは均質系（自由試薬とレセプター−リガンド複合体との分離工程を有さない）又は不均質系（分離工程を伴う）でありうる、様々な商品化アッセイキット、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）　、酵素結合型免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）　、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）　、酵素複合型イムノアッセイ技法（ＥＭＩＴ）　、基質ラベル化蛍光イムノアッセイ（ＳＬＦＩＡ）等が存在している０例えば、ラベル化されていない抗体は、ラベル化されており、且つ、ＧＲＰレセプター又はその特定のフラグメントに対する抗体を認識する第二抗体を利用することによって採用できる。これらのアッセイは論文の中にもかなり述べられている９例えばＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ　（１９８Ｂ）　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　：Ｖ農抑ｎ違口弘Ｖ規ａｌ、　ＣＨ３を参照のこと。

抗−イディオタイプ抗体も、例えば様々な異常な症状の診断でありうるレセプターに対する抗体の存在の診断に同様の用途を有しうる０例えば、ＲＢＰの過剰生産は様々な免疫学的反応の発生をもたらし、これは異常なレセプター発現、特に癌のような増殖細胞症状の特徴でありうる。

しばしば、アッセイの感度を最適化するために診断アッセイのための試薬をキットの中に供給する。本発明のためには、アツセイの種類、プロトコール及びラベルに応じて、ラベル化もしくはラベル化されていない抗体、又はラベル化レセプターを提供する。これは通常その他の添加剤、例えば緩衝剤、安定剤、シグナル発生に必須なＩＦＩ質、例えば酵素のための基質等を伴う。好ましくは、このキ・ントは適切な使用及び使用後の廃棄のための仕様書も含むであろう。

典型的にはこのキットは各有用な試薬のための区画を有する。所望するには、試薬は凍結乾燥粉末として提供し、試薬はアッセイを行うのに適当な濃度を有する水性媒体の中で再構成化されうる。

薬荊スクリーニング及び診断アッセイの上記の構成品のいづれも、改良を伴わないで、又は様々な方法で改良されて利用されうる０例えば、ラベル化は検出シグナルを直接的に又は間接的に担う成分を共有結合的に、又は非共有結合的に連結させることによって達成されうる。これらのいづれのアッセイにおいて、リガンド、試験化合物、ＧＲＰレセプター、又はそれに対する抗体は直接的に又は間接的のいづれかによってラベル化されうる。直接ラベル化に可能なものはラベル基、即ち、放射性ラベル、例えば＋！５■、酵素（米国特許第３，６４５，０９０号）、例えばベルキシダーゼ及びアルカリ性ホスフ１ターゼ、並びに蛍光ラベル（米国特許第３，９４０．４７５号）であって蛍光強度、波長シフト又は蛍光の局在における変化をモニターせしめるものが含まれる０両方の特許は本明細書に参考として組入れる。

間接的なラベル化に可能なのは、一方の構成成分のビオチニル化、それに続く上記のラベル基のいづれかにカップル化させたアビジンへの結合を含む。

更に、自由リガンドから結合物を分離する、又はそうでなければ自由試験化合物から結合物を分離する真人な数の方法がある。レセプターは様りなマトリックス上に固定化されてよく、続いて洗浄に付される。適切なマトリックスにはプラスチック、例えばＥＬＩＳＡプレート、フィルター及びビーズが含まれる。マトリックスへのレセプターの固定化の方法には、限定することなく、プラスチックへの直接吸着、捕獲抗体の利用、化学結合及びビオチン−アビチンが含まれる。この手法における最後の工程は、例えば有機溶剤、例えばポリエチレングリコール、又は塩、例えば硫酸アンモニウムの利用を含むいくつかの方法のどれかによる、レセプター／リガンド複合体の沈殿を包括する。その他の適切な分離技術には、限定することな（、Ｒａｔｔｌｅら（１９８４）　Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅｍ、　３０　（９）　：　１４５７−１４６１に記載の蛍光抗体磁性粒子法、及び米国特許第４，６５９，６７８号に記載の二重抗体磁性粒子分離が含まれ、それぞれ本明細書に参考として組入れる。

タンパク質レセプター又はそのフラグメントを様々なラベルに結合させるための方法は論文においてかなり報告されており、従ってここで詳細に説明する必要はない。数多くの技法には、ペプチド結合を生成するためのカルボジイミドもしくは活性エステルの利用のいづれかを介する活性化カルボキシル基の利用、メルカプト基を活性化ハロゲン、例えばクロロアセチルと反応させることによるチオエーテルの形成の利用、又は結合のための活性化オレフィン、例えばマレイミドの利用等を包括する。融合タン、ｅり質もこれらの用途において有用であることが見い出されるであろう。

本発明の他の診断的観点は、ＧＲＰ又はボンベシン様ペプチドに対するレセプターより得たオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド配列の利用を包括している。これらの配列は増殖細胞症状、例え番ｆ癌を有すると予測される患者においてそのレセプターのレベルを検査するためのプローブとして利用できる。ＲＮＡ及びＤＮ＾ヌクレオチド配列の両者の調製、この配列のラヘル化、及びこの配列の好ましいサイズは論文において豊富な説明及び解説がされてし）る。一般に、オリゴヌクレオチドプローブは少なくとも約１４個のヌクレオチド、通常は少なくとも約１８個のヌクレオチドを有すべきであり、そしてポリヌクレオチドプローブは数キロベースに至ることカベできる。様々なラベルが採用でき、最も一触には放射性核種、特に３１ｐである。

しかしながら、その他の技法は、例えばポリヌクレオチドへの導入のためのビオチン修飾化ヌクレオチドの利用も採用できる。ビオチンは広範囲にわたる樟りなラベル、例えば放射性核種、蛍光団、酵素等によってラベル化されうるアビジン又は抗体に対する結合のための部位を担う。他方、［ｌＮ八へ量体、ＲＮ＾二量体、［ｌＮＡ　−ＲＮＡ／−イブリドニ量体又はＤＮＡ−タンパク質二量体を含む特定の二量体を認識できる抗体を採用することができる。逆に抗体をラベルしてアツセイを実施してよく、この場合二量体を表層に結合させ、従ってこの表層上での二量体の形成に基づき、この二量体に結合した抗体の存在が検出できる。

新規のアンチセンスＲＮＡに対するプローブの利用は任意の常用の技術、例えば核酸）１イブリダイゼーシヨン、正とｆｉ（７）スクＩＪ−＝ング、組換ブロービング、Ａイブリド開放翻訳（ＨＲＴ）、及びバイブリド阻害翻訳（ＨＡＲＴ）において実施できる。これに番よ増幅技術、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）も含まれる。

その他のマーカーの定性的又は定量的な存在についても試験する診断キットも考慮する。診断又は予後はマーカーとしての複数の表示体の組合せに依存する。従って、キ・ノドはマーカーの組合せについて試験できる。例えばＶｉａｌｌｅｔら（１９８９）　Ｐｒｏ　ｒｅｓｓ　ｉｎ　ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ　Ｒｅｓ、　１　：　８９−９７を参照のこと。

類似の試薬が、その他のボンベシン様ペプチドに対するレセフ゛ターへのこれらの概念の用途のために有用である。

Ｘｌ、治療的用途本発明は有意義な治療的価値を有する試薬を提供する。　ＧＲＰレセプター（天然又は組換体）、そのフラグメント及びそれに対する抗体は、ＧＲＰレセプターに対する結合親和力を有すると同定された（ヒ合物と一緒になって、例えば癌＆ｌｌ織、例えば前立腺腫瘍及び膵臓腫瘍のような繁殖的増殖を示す症状の処置、特に小細胞肺癌の処置において有用であろう。更に、本発明はＧｌ？Ｐ又はその他のボンベシン様ペプチドに対するレセプターの異常な発現又は異常な誘発に関連する任意の疾患又は障害において治療的価値を有するであろう。例えば、ＧＲＰレセプターは神経学的機能におｐｓで一役かうこと力（イ言しられており、そして胃腸、肺及び脳組織に影響を及ばずことがある。

前記した通り、ＧＲＰレセプターについての本説明のちととなる基本的な原理は、ボンベシン様ペプチドに対する他のレセプターにも適応するであろう。

組換ＧＲＰレセプター又はＧＲＰレセプターの抗体を精製し、次いで患者に投与することができる。これらの試薬は追加の活性成分と一緒に治療的用途のため、常用の薬理学的に許容される担体又は希釈剤の中で、生理学的に無害な安定剤及び補助剤を伴って組合されうる。これらの組合せ物は滅菌濾過してよく、そして投与バイヤルの中での凍結乾燥により投与形態にするか、又は安定化水性調製品において保存する。本発明は抗体又は補体に結合しないその結合性フラグメントの利用も考慮している。

ＧＲＰレセプター又はそのフラグメントを利用する薬剤スクリーニングはＧＲＰレセプターに対する結合親和力を有する化合物を同定するために実施できる。その後の生物学的アッセイは、その化合物が固有の刺激活性を有し、従ってガストリン放出ペプチドの活性を阻害するブロッカ−又は拮抗因子であるかどうかを決定するために利用できる。同様ニ、固有の刺激活性を有する化合物がこのレセプターを刺激することができ、従ってガストリン放出ペプチドの活性を刺激する作動因子である。本発明は更に拮抗因子としてのＧＲＰレセプターに対する抗体の治療的用途を考慮する。この手法はボンへシン様ペプチドに対するその他のレセプターに極めて有効であろう。

例えば、Ｎ）ＩＢレセプターに対する有効な拮抗因子は発見されておらず、そしてＲ３ＢＰに対するリガンドの同定は未だ行われていない。

有効な治療にとって必要な試薬の量は数多くの様々な要因、例えば投与の手段、標的部位、患者の生理学的状態及び投与する他の医薬品に依存するであろう。従って、処置投与量は安全性及び薬効を最適化するために力価検定すべきである。

典型的には、インビトロで用いる投与量がこれらの試薬のインン１−ウ投与にとって有量な量の有効な指針を担うであろう。特定の障害の処置のための有効な投与量の動物試験はヒトへの投与量の更なる予測的な方針を担うであＰｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ　；及びＲｅ５ｉｎ　ｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｎｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版（１９９０）　Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、、　Ｅａｓｔｏｎ＋　Ｐｅｎｎ、に記述されており、それぞれ本明細書に参考として組入れる。投与のため方法、例えば経口、ｆｌＰ脈内、腹腔内、又は筋肉的投与、経皮拡散等についてか本明細書の中にそして下記に述べである。薬理学的に許容されている担体には水、食塩水、緩衝液及び例えばＭｅｒｃｋ　Ｉｎｄｅに、　Ｆｊｅｒｃｋ　＆Ｃｏ、、　Ｒａｈｗａｙ、　Ｎｅ！、４Ｊｅｒｓｅｙに記述の他の化合物が含まれる。ボンベシン様ペプチドとそのレセプターとの高い親和結合性のため、これらの試薬の低い投与量が有効であろうとまず予期されうる。従って、適当な担体を伴う投与量はたいていは１１以下の濃度、典型的には約１０μＭ以下の濃度、通常は約１１００ｎ以下の濃度、好ましくは約１゜ｐＭ（ピコモル）以下の濃度、そして最も好ましくは約１ｆＭ（フェムトモル）以下の濃度の量であると予期されうる。遅延放出型製剤、又は遅延放出装置がしばしば連続投与のために利用されるであろう。

ＧＲＰレセプター及び近縁レセプターの両方のレセプターの細胞内セグメントは下記に詳細の通り追加の用途が認められるであろう。

該ＧＮＰレセプター、そのフラグメント及びこのレセプター又はそのフラグメントに対する抗体、拮抗因子及び作動因子は、処置すべき宿主に直接投与せしめるか、又はこの化合物のサイズに依存して、それらを投与する前に担体タンパク質、例えばオハルミン又は血清アルブミンにコンジュゲートせしめることが所望されうる。治療的製荊は任意の常用の投与製剤において投与されうる。活性成分は単独で投与されることが可能ではあるが、それを薬理製剤として提供することが好ましい。製剤は前記した少なくとも一種の活性成分を、その１又は複数の薬理学的に許容される担体と一緒に含んで成る。

各担体はその他の成分と適合し、且つ、患者に損傷を与えない意味で薬理学的及び生理学的の両方で許容されなくてはならない。製剤には経口、直腸、経鼻又は非経口（皮下、筋肉内、静脈内及び皮肉を含む）投与に適するものが含まれる。

この製剤は単位投与形態において好適に提供されてよく、そして薬理学業界によく知られている任意の方法によって調製されうる。例えばＣｉｌｍａｎら（Ｗ）　（１９９０）Ｇｏｏｄｍａｎ　ａｎｄ　Ｇｉ１ｍａｎ’ｓ　：　Ｔｈｅ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏ　１ｃａｌ　Ｂａ５ｅｓ　ｏｆ　Ｔｈｅｒａ　ｅｕｔｔｃ刀B 第８版、Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ　；及びＲｅ５ｉｎ　ｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ±−３ｃｉｅｎｃｅｓ。

第１７版（１９９０）　、Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｔｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、、　Ｅａｓｔｏｎ、　Ｐｅｎｎを参照のこと；それぞれ本明細書に参考として組入れる。本発明の治療はその他の化学治療的又は化学予防的試薬と組合せる又は−緒に利用することができる。

Ｘ１１．　Ｉノセブターのサブタイプ本発明はその他のボンベシン様ペプチドに対する更なる密接に近縁したレセプターの単離を考慮する。前記した通り、これらは種々の機能を有する様々なタイプのボンへシン様ペプチドである。例えば、本明細書に参考として組入れるＬｅＢａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎら（１９９０）を参照のこと。様々なこれらのペプチドは消化ホルモン、代謝の中枢調節剤、増殖因子又は神経ペプチドとして機能的に分類されている。

広範囲にわたる様々な薬理学的作用がこれらのベプチ１′によって仲介される。

本発明は構造、発現性及び機能において相違性及び類僚性の両者を示す近縁レセプターのグループを分ける直接的な手段を提供する。

ボンベシン様ペプチドの数多くの生理学的作用の解釈はこのレセプター科の個々の構成員の単離及び特性化によって大いに促進されるであろう。特に、本発明は実施例２９に記述の通り、更なる相同性タンパク質を同定するための有用なプローブを提供する。ヒ）　Ｒ３８Ｐが一例である。これらの更なるタンパク質はその他のボンベシン様ペプチド、例えばフィロリドリン又はリドンに結合するレセプターの候補である。

単離遺伝子は近縁レセプターの発現性を欠く細胞、例えば対応のレセプターを欠き、そして陰性バンクグランド活性を示す種のタイプ又は細胞のいづれかの形質転換を可能にするであろう。形質転換遺伝子の発現は規定の又は単独のレセプターサブタイプを有する薬理学的に純粋な細胞系の単離を可能にするであろう。この手法は他から単離された各レセプターサブタイプの薬理学的作用のより高感度な検出及び区別を可能にするであろう。サブ細胞フラグメント、例えば細胞質又は膜フラグメントが単離されて利用できる。

様々なレセプターは無関係な機能をよく有するが、それらは有意な構造類憤性を共有する。レセプターにより提供される様々な生理学的機能を及ぼすその構造要素の分析は、近代の分子生物学の標準技術、特に近縁のクラスの構成員を対比する技術を利用して可能である。例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら　（１９８９）　５ｃｉｅｎｃｅ　２４３　：　１３３９−１３３６に記載のホモログスキャニング突然変異誘発技術；並びに０”Ｄｏｗｄら（１９８８）明細書に参考として組入れる。

特に、リガンド結合性セグメントは、どの構造的特徴がリガンド結合親和力及び特異性の両方において重要であるかを決定するためにレセプター間で交換されうる。細胞外リガンドに受容されうるしセプターのセグメントがかがるアッセイの第一標的であろう。一連の種々のレセプターが、種々のレセプターサブタイプとの相互作用の複合特性を示すリガンドのスクリーンのために利用されるであろう、これらのレセプターのうちで特に興味深いセグメントは、限定することなく、第三トランスメンプランセグメント、細胞質セグメントのアミノ末端、第二細胞質ループ、及び細胞質Ｃ００Ｈ−尾部におけるシスティン残基である。

細胞内機能は細胞質ゾルに通常受容されるレセプターのセグメントをおそらく含むであろう。しかしながら、一定の環境のもとではレセプターの内在化が起こることがあり、そして細胞内成分と設計した「細胞外セグメント」との相互作用が起こることがある。これらの細胞内機能は通常リガンド結合に由来するシグナル変換；及び報告されているＧ−プロティン相互作用を含む。レセプターとＧ−プロティンとの相互作用の特定のセグメントは突然変異誘発により、又は直接生化学手段、例えば架橋もしくはアフィニティー法によって同定されうる。結晶グラフィー又はその他の物理学的手法による構造分析も適用可能であろう。異なる機能を示すレセプターサブタイプ間の類似性及び相違性の同定は新たな診断及び治療的試薬又は処置をもたらすであろう。

これらのレセプターサブタイプの発現及びコントロールの更なる研究が有用であろう。レセプターと一体化したコントロール要素は異なる発生組織特異性、又はその他の発現パターンを示す。上流又は下流の遺伝子領域、例えばコントロール要素が注目される。

レセプターサブタイプの構造的研究は新たなりガント、特に作動的又は拮抗的特性を示す［（具体の設計をもたらすであろう。これは所望の域の活性を示すリガンドを単離するために、前記したスクリーニング法と組合せることができる。

その他の細胞タイプにおける発現は特定のレセプターにおけるグリコノル化の相違性をしばしばもたらすであろう。様々のレセプターサブタイプはアミノ酸配列以外の構造的相違に基づいて異なる機能を示すことがある。異なる改質は異なる機能のちととなることがあり、これにより作用の解釈をすることが可能となる。

従って、本発明はボンベシン様ペプチドに対する数多くのレセプター及びそれより開発した試薬を提供する。以上の説明はＧＲＰに主として焦点を当ててきたが、当業者は本発明がその他のボンベシン様ペプチド、例えばＮＭＩＩレセプター及びＲ３ＢＰに対するレセプターを包括していることを直ちに理解するであろう。

本発明の幅広い範囲は、本発明を何ら限定することを意図しない下記の実施例を参照することで最も良く理解できる。

大騒夫旌燃上マウス３Ｔ３　のｉｌｌマウスのスイス（Ｓｗｉｓｓ）　３Ｔ３線維芽を、Ｔ８５０ローラーボトルの中の１０％（ｖ／ｖ）胎児仔ウシ血清（１００のロット）を補充したダルベツコ変性イーグル培地の中で３７°Ｃにおいて１０％のＣｏ、７９０％の空気の環境中でコンフルエントに生長させた。収穫すると、培地を注ぎ出し、そして各ボトルを５０１のカルシウム／マグネシウム不合リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ−Ｃ門Ｆ）で２回すすいだ、細胞を２５〜３０ｍ１のＰＢＳ−ＣｒＩＦ中の０．０４％（ｗ／ｖ）のＥＤＴＡ　（３７°Ｃに加温した）を室温において１５分間インキュベーションした。次いで、細胞を強打で取り出し、そして氷上の円錐形の２５（１ｗｌの遠心管の中にピペットで入れた。６本のローラーボトルからの細胞を一緒にして各遠心管の中に入れた。

ローラーボトルを最後に２５ｍ１のＰＢＳ−ＣＭＦですすいだ。細胞を１８０Ｏｒｐｍで１０分間４°Ｃにおいてソーハル（Ｓｏｒｖａｌｌ）ＲＣ−３Ｂ遠心機の中で沈澱させた。各ペレットを５０ｍ　ｌの新鮮なＰＢＳ−ＣＭＦの中に４　 ’Ｃにおいて再懸濁させた。２〜３本の遠心管からの細胞を一緒にし、沈澱させ、そして追加の１２０１のＰＢＳ−ＣＭＦで洗浄した。最終の細胞のペレットを２００ｍ１（７）溶解緩衝液（５０ｍＭ（７）ＨＥＰＥＳ、　ｐＨ７，５，２ｍＭ（７）ＭｇＣｈ、　１＋ｎＭのＥＧ丁Ａ、　５０ｔＩｇ　／ｍｌのロイペプチン、２．５μｇ／ｍｌのペプスタチン、ＩＯμｇ／ｍｌのアプロチニン、および０．５１のフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）　）の中に再懸濁させた。細胞をＮ２のキャビテーションにより熔解さセた。簡単に述べると、１００ｍ１の細胞懸濁液を密閉した鋼製容器の中の氷の中に入れ、これを９００ｐｓ　ｉのＮ２に加圧した。この懸濁液をチャンバーから小さいオリフィスを通して収集管の中にゆっくり解放し、そして細胞の急速な分解および溶解を引き起こした。細胞の溶解は微鏡検査の可視化により完結したように見えた。膜を３９，０ＯＯＸ　ｇで３０分間４°Ｃにおいて沈澱させ、溶解緩衝液の中に再懸濁させ、そして再び沈澱させた。ペレットを貯蔵緩衝液（５（１ｗＭのＩＩＥＰＥｓ、　ｐＨ７，５，１ｍＭのＥＣＴ八、　０．２５Ｍのスクロース、５０Ｍｇ／− １のロイペプチン、２．５μｇ／＋＋＋Ｉのペプスタチン、ＩＯμｇ／ｌのアプロチニン、および０．５ｍＭのＰＭＳＦ　）の中に１５＋ｗｇの膜タンパク質／閘１の濃度で懸濁させた。膜を１および５ｍｌの体積のアリコートに分割し、液体Ｎ２の中でフラッシュ凍結し、そして８０°Ｃにおいて貯蔵した。

夫施撚又ＧＲＰレセプターの可溶化のための清浄剤の比較他の系におけるレセプターの抽出のために使用されるいくつかの清浄剤を試験して、スイス（Ｓｗｉｓｓ）　３７３線維芽の膜からＧＲＰレセプターを可溶化するそれらの能力を測定した。ジジトコン、トリトンχ−１００，ＣＨＡＰＳ、およびＣＨＡＰＳ　＋　ＣＨ５のすべてを０．５０％の清浄剤濃度で使用して膜を抽出し、そしてすべては”’　Ｉ−ＧＲＰへの架橋により放射線標識したレセプターを可溶化するために有効であった。

”’　Ｉ　−ＧＲＰ　（０，０２％Ｍ）の結合を、カウント７分（ＣＰＭ）として測定し、第１図に示すように、Ｇｌ？Ｐ（ＧＲＰ１４−２７）の非標１１１１４−２７Ｃ−末端のアミノ酸の抽出およびいくつかの濃度において使用した清浄剤（０，１％）の存在下にアッセイした。ＣＨＡＰＳ　＋　ＣＨ３を使用する抽出のみは検出可能な結合活性を生した。すべての清浄剤はＧＲＰレセプターの可溶化において有効であったので、ジジトコン、トリトンＸ−１００またはＣ）ＩＡＰＳを使用して個々に調製した抽出物の中で結合活性を観測できなかったことは可溶化プロセスの間のレセプターの不活性化の結果であった。しかしながら、ＣＩＩＡＰＳ　（Ｃ１ｆＳなし）で抽出したレセプターの部分的反応性はＣＨ３の引き続く添加により達成することができることが認められた。これにより、ＣＨ５は活性Ｇｌ？Ｐレセプターを促進するとき安定剤として作用することが確立された。

ＧＲＰレセプターの可溶化のための清浄剤濃度の比較実施例１におけるように調製したスイス３７３線維芽の膜を、種々の濃度の清浄剤ＣＩＩＡＰＳとインキュベーションした。遠心により不活性物質の分離後、上清液中の可溶性ＧＲＰレセプターの結合活性を測定した。０．７５％（ｗ　／　ｖ　）のＣＨＡＰＳを使用してＧＲＰレセプターを可溶化したとき、第２図に示すように、最大のレセプターの結合が観測された。しかしながら、タンパク質の最大の可溶化を得るために、１．０％（ｗ／ｖ　）またはそれより大きいＣＨＡＰＳ濃度を使用した。

ＧＲＰレセプターの結合はより高い清浄剤濃度において着実に減少した。Ｃ）ＩＡＰｓにより可溶化されたレセプターへの特定のＧＲＰの結合を観測するために、可溶化剤のＣＨ５を含めることは有用であった。

ＣＨＡＰＳ　：　ＣＨＡＰＳの比は抽出およびアッセイの両者の条件下に１０＝１に維持された。

ＧＲＰレセプターの可溶化のための安定剤の濃度の比較実施例１におりるように調製したスイス３Ｔ３線維芽の膜を、種々の濃度のコレステリルヘミスクシネート（Ｃ）Ｉｓ）の存在下に、ｏ、７５％０．０７５％（ｗ／ｖ）のＣＨＡＰＳｉ１度および可溶化工程において使用したよりＩＯ倍少ないＣｌｌ５濃度において、上澄み液の中で測定した。第３図に示すように、ＣｔｌＡＰＳ／　ＣｔｌＳの最適な比は約１０：１であった。

可溶化ＧＲＰレセプターの結合活性のために清浄剤濃度の比較清浄側の濃度への結合活性の依存性を研究した。第４図に示すよウニ、シー１１＝フ’ターへ（７）　ＧＲＰ（７）結合は、０．０７５および０．１％（７）　ＣＨＡＰＳの間で狭い最適さを有し、そして比結合は０．４％より大きいＣＨＡＰＳ濃度で著しく低下する。０．４％の濃度より上の清浄剤のレベルは、また、アッセイにおいて非特異的バックグラウンドの大きい増加を引き起こし、これは多分清浄剤の凝集物の形成のためである。ＧＲＰレセプターは高度に阻止性である清浄剤のレベル（０，７５％）で膜から最大に抽出されるが、ＣＩＩ　Ａ　Ｐ　Ｓによるレセプターの分子の不活性化は可逆的であるように思われた。０．７５％のＣＨＡＰＳおよび０．１５％のＣＩＩＡＰＳの中でインキュベーションしたレセプターの完全な結合特性は、透析により清浄剤の濃度を減少したとき、回復することができ／こ。

ＧＲＰの結合のために最適なｐＨ５００μｌの２（１ｗＭのＭＥＳ、　２０ｍＭのＣＨＥＳ、　２０ａ＋ＭのＨＥＰＥＳ、２　ｍｌｌのＥＤＴＡ。

１０μｇ／＋ｉｌのＢＳＡ、　３０μｇ　７閘ｌのバシトラシン、　０．０２ｎＦＩの１２５７−ＧＩ’ＩＰ　、および５ｎｇの（ＪＩＡＰＳ抽出した膜タンパク質の中でｐｌ＋５〜１０の範囲の種々の１Ｈ値において、　”５ｌ−ＧＲＰの結合を決定した。１５°Ｃにおいて３０分間インキュベーションした後、試料を氷上で冷却した６　これに引き続いて５．Ｑｍｉの５０ｍＭのＩＩＥＰＥｓ、　ｐＨ７，５を添加して、ｐｌ＋を中和し、次いで結合したおよび遊離のりガントを分離した。レセプターの結合はＰＨ７，５において最適であることが発見された。しかしながら、レセプターは活性を損失しないでｐ）１１０．　４°Ｃにいて少なくとも２４時間インキ１ヘーシヨンすることに耐えることができる。

対照的に、レセプターをρ）（５の緩衝液と４　”Ｃにおいてインキュベーションすると、結合活性の急速な損失を引き起こした。

尖旅貫主アッセイのためのＧＲＰレセプターの可溶化実施例１において調製したスイス３７３線維芽の膜を、５０１ｍＭのＨＥＰＥＳ、　ｐＨ７，５，１，０ｍＭのＥＧＴＡ、　１００５ＭのＮａＣ１，、０，２５Ｍのスクロース、５０μｇ／ｍｌのロイペプチン、５μｇ／ｍｌのペプスタチン、１０μｇ／Ｉ１１のアプロチニン、３０μｇ／ｍｌのバシトラシンおよび０．５ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオライドの中で１．５ａｔｇのタンパク質／囮１において懸濁させた。３− ［（３〜コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネートヘミスクシネート（ＣＨＳ）の１０：１の混合物をゆっくり添加して、最終濃度を０．７５％のＣＨＡＰＳにした。抽出物を２１°Ｃにおいて３０分間インキユヘーンヨンし、４°Ｃに冷却し、そして不溶性物質を１００，ＯＯＯＸ重力で６０分間遠心により除去した。透明な上澄み液を液体Ｎ２の中で凍結し、そして− ８０°Ｃにおいて活性を損失しないで貯蔵した。

完全な膜または清浄剤で可溶化した膜（２０〜５０μｇ、実施例３におけるように調製した）に対する特異的”５１−ＧＲＰ　（３−（　ｌｆｓｌヨードチロシル−１５）ガストリン放出ペプチド、１９００〜２０００Ｃ　ｉ　／　ｍｍｏ　ｌ　）結合を、５０ｍＭのＩＩＥＰＥｓ，　ｐｌ（７．５＋　２　ｍＭのＥＤＴＡ．　ＩＯＢ／−１のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）　、０μｇ／ｍｌのバシトラシンおよび０、０２％Ｍの”’　Ｉ−ＧＲＰの中でアッセイした。清浄剤で可溶化した膜抽出物のアッセイのために、最終のＣＨＡＰＳ清浄剤の濃度を０．０５％〜０、２０％に調節した，　ＣＨＳの濃度をＣＩＩＡＰＳの濃度の１１５〜１／１０に維持した。ＢＳＡを省略した試料をまた調製した。１５°Ｃにおいて３０分間インキュベーションした後、試料を０”Ｃに冷却した。結合したリガンド（”Ｊ−ＧＲＰ　：　ＧＲＰリポータ−複合体）をポリエチレンイミンで処理したワットマン（Ｗｈａ　Ｌａｕａｎ　）　ＧＦ　／　Ｂフィルターを通す急速濾過により回復し、次いで４閘ｌの氷冷ＴＲＩＳ緩衝液（５ｈ＋ＭのＴＲＩＳ／ＣＩ。

ｐ）１７．５）で４回洗浄した。フィルターをイソダタ（Ｉｓｏｄａｔａ）５００ガンマカウンターで計数した。アッセイにおいて１００ｎＭの非標ｉ　Ｇｌ？Ｐを含めて特異的結合部位について競争させることによって、非特異的バックグラウンドを決定し、そして典型的には結合した特異的放射能の１．５〜２％を表した。非特異的結合はフィルターへの１２５１−ＧＲＰの小さい程度の結合に帰属させることができた。可溶化されたレセプターの結合活性は清浄剤の濃度に高度に依存することが発見された。第４図に示すように、レセプターＧこ結合するＧＲＰは、０、０７５％のＣＩＩＡＰＳｌｏ．０１５％のＣＨＳと０．　１０％のＣＩ（ＡＰＳｌｏ．０２５％のＣＨＳとの間の狭い最適さを存し、そして特異的結合は０．４％１０．０８％の大きいＣ　１１　Ａ　Ｐ　Ｓ　／’　Ｃ　Ｈ　Ｓ　ｉｌ１度において著しく低下する。存在する約０、４％のＣＩＩＡＰＳ＋０．０８％のＣＩＩＳより上の清浄剤レベルは、また多分清浄剤の凝集の形成のために非特異的ハックグラウンドを大きい増加を引き起こす。レセプターは高度に阻止性である清浄剤レベル（０．７５％のＣＨＡＰＳ）で膜から最大に抽出されるので、ＣＩＩＡＰＳによるレセプターの不活性化は可逆的であるように思われた。事実、０．７５％のＣＨＡＰＳ　４−　０．　１５％のＣＨＳの中でインキュベーションしたレセプターの完全な結合部位は、透析により清浄剤の濃度を減少することができた。

実施例５レセプターの反応速度論アッセイをインキュヘーンヨンの種々の時間について実施し、そしてＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ　）をアッセイにおいて含めるか、あるいは省略した。１５°Ｃにおいて可溶性レセプターへの１２’　［−ＧＲＰの結合は２０分で安定し、そして２時間まで一定に止まった。リガンドのタンパク質分解を防止するために添加したＢＳＡの省略は、結合の反応速度論に有意の作用をもたなかった。

実施例６Ｇ−プロティンの複合体スイス３Ｔ３線維芽の膜の中のＧＲＰレセプターはＧ−プロティンがカップリングしていることが発見された。したがって、可溶性レセプターに結合する”　ｌ −Ｇｌ？Ｐへのグアニルヌクレオチドの作用を研究した。最終の清浄剤の濃度は０．０７５％のＣＩＩＡＰＳであり、そして０、０１５％のＣＨＡＰＳが存在した。完全なスイス３Ｔ３線維芽の膜の中のＧＲＰレセプターのＧ−プロティンのカンプリングは、レセプターのリガンドの親和性がヌクレオチドのＧＤＰおよびＧＴＰおよび非加水分解性ＧＴＰＩＩ似体のＧＭＰＰＮＰの存在下に約１０倍減少したという観察から推定された。旬゛２の存在下に、グアニルヌクレオチドは商い親和性のりガント／レセプター／Ｇープロティンの３成分複合体からのＧ− ブ「コナインの解離を誘発し、より低い親和性を表すリガンド／レセプターの複合体の形成を生ずると推定される。ＣＩＩＡＰＳにより膜から抽出されたＧＩ？Ｐレセブクーは、？１ｇ−２及びＧＴＰまたはＧＭＰＰＮＰの存在下に膜のＧＲＰの結合を約８０％だけ減少するレベルにおいて、それらのりガントの結合性質の変化を示さなかった。Ｍ　ｇ　″の存在下のＧＲＰの結合へのＧＴＰの作用の欠如は、レセプターとＧ−タンパク質との相互作用が清浄剤の抽出において維持されないことを示す。表５における対照はＭｇＣ＋□を含有する。

表５ニゲアニルヌクレオチドの存在下のＧＲＰの結合可溶化した膜計数７分の結合ＬＪ、：　”’　Ｉ　−ＧＲＰ添加した合計の％とじて測定した対照　２８対照＋１０ｍＭのＡＭＰＰＮＰ　２７．８対照＋１０ａ＋ＭのＧＴＰ　２７．５対照＋１０−ｈのＧＭＰＰＮＰ　２６．５対照＋ｌｏｓＭのＧＭＰＰＮＰ＋　１１００ｎのＧＲＰ　１−２７　２．０可溶化した膜計数７分の結合した”’　Ｉ　−ＧＲＰ添加した合計の％とじて測定した対照　２８．９対照＋５ｍＭのＡＴＰ　２９．７対照＋５ｍＭの＾ＭＰＰＮＰ　３３．４対照＋５ｍＭのＧＴＰ　１０．７対照＋５＋ｓＭのＧＭＰＰＮＰ　１０．５対照＋５ｍＭのＧＭＰＰＮＰ＋　１１００ｎのＧＲＰ　１−２７　１．４実施例７可溶性ＧＲＰレセプターのスキャッチャード分析完全なスイス３Ｔ３線維芽の膜および可溶化したスイス３７３線維芽の膜へのＩｔ’　Ｉ−ＧＲＰの結合のスキャッチャード分析を実施した。

１つの特定の実験を下に論考し、ここでレセプターの可溶化した形態および膜に結合した形態の結合のパラメーターを同様な条件下に決定した。アッセイを１５ °Ｃにおいて決定した。可溶化した膜または完全な膜のアッセイについて、反応は、それぞれ、３０分および１８０分に停止した。次は結合のパラメーターであり、ここでに、は解離定数であり、そしてＢＩｌｌは最大の結合能力である：ＫＯ（完全な膜）　＝　３７ｐＭＫｎ（可溶化した膜）　＝１０ｐ門８ｍ　（完全な膜）　−０，７９ｐｍｏｌ　／　ｍｇタンパク質Ｂｍ　（可溶化した膜）　＝　１．０　ｐｍｏｌ　／　ｍｇタンパク質スキャソチャード分析は高い親和性の結合活性の存在を明らかにした。データの多少の非直線性および散乱は低い値の結合したリガンド／遊離のリガンドにおいて観測され、ここで正確な結合のデータの決定は最も困難であった。可溶性レセプター（１０ｐＭ）へ結合するりガントの解離定数は、観測された可溶性レセプターにカップリングするＧ−プロティンの欠如にかかわらず、完全な膜の中のレセプター（３７ｐＭ）が示したものより小さかった。前述したように、このようなＧ−プロティンのカップリングは１桁の大きさで膜のレセプターの親和性を促進する。しかしながら、アッセイはＧ−プロティンの相互作用により損失した親和性について補償されていることができる可溶性レセプターへのＧＲＰについて最適化された条件下に実施した。他の実験において、可溶化したレセプターの解離定数を１０〜３０ｐＭの範囲と計算された。データは、レセプター結合部位の機能的コンフォメーションが清浄剤の溶液の中で維持されていることを証明した。

この実験からのスキャッチャードのデータは、また、粗製のスイス３Ｔ３線維芽の膜の中に０．７９ｐｍｏｌのレセプター／ｌｓｇのタンパク質が存在し、そしてレセプターの結合部位が清浄剤で膜を抽出することによって可溶化されることを示した。レセプターの活性の最も効率よい可溶化のために必要であることが発見された因子のいくつかは、ＮａＣｌ　（＞　１０１００ｎを含めること、２価のカチオンの排除、および室温における膜の抽出であった。　ＮａＣ１はレセプターの最適な可溶化のために必要であったが、塩はスイス３７３線維芽の膜および清浄剤可溶化したの両者へのＧＲＰの結合を阻止する（ｔＣＳ。＝はぼ５ｈＭ）。

しかしながら、１．０Ｍまでの濃度のＮａＣ１によるレセプターの阻止は完全に可逆的であることが発見された。

尖施１可溶性膜抽出物の中のＧＲＰ結合部位のりガント特異性可溶化した３Ｔ３膜への ”’　Ｉ−ＧＲＰの結合を、種々の非標識競争ペプチドの存在下にアッセイした。ＧＲＰ　（ＧＲＰ２０−２７　）のＣ−末端の８アミノ酸は、全細胞の中のＧＲＰレセプターへの高い親和性の結合にとって必須であることが発見された。完全なＧＲＰ配列（ＧＲＰ　１−２７）　。

ＧＲＰ　（ＧＲＰ　１−１６）のＮ−末端部分、物質Ｐ、物質Ｐ拮抗因子、フイサレミン（それらのすべてはペコンスラ・ラボラトリーズから入手した、カリフォルニア州ベルモント）、および（ＮＩＣ１４，２７）　ＧＲＰ１３−２７と呼ぶメチオニンがノルロイシンで置換したＧＲＰのＣ−末端部分（すなわち、Ｌｙｓ−Ｎ１ｅ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｈ４５−Ｔｒｐ−Ａ　ｌａ−Ｖａ　Ｉ−ｃ＋ｙ−旧５−Ｌｅｕ−１（Ｎｚ）を、可溶性３７３線維芽の膜の抽出物へのＩ！５ｌ−ＧＲＰの結合について競争するそれらの能力について試験した。可溶性レセプターへの”５ｌ−ＧＲＰの結合の５０％の阻止を引き起こすために要求される（ＮＩｅ１４．２７　）　ＧＲＰ　１３−２７の濃度（ｒｃｓｏ＝ｏ、３ｎＭ）は、ＧＲＰＩ−２７のそれ（ＩＣｓ。＝　０．１ｎＭ）よりわずかに高かった。対照的に、Ｎ−末端部分（ＧＲＰ　１−１６）は、可溶性レセプターへの結合について”’　Ｉ−ＧＲＰと競争することができなかった。

さらに、物質Ｐ、物質Ｐ拮抗因子、およびフィサレミンは試験濃度（１０００ｎＭ）までにおいて阻止作用をもたなかった。これらの結果は、全細胞および分離された膜の中の同様な研究において見いたされるもとに密接に匹敵する。

尖旌炭■ 目うＩ−ＧＲＰ　レセプターの架橋可溶化したスイス３Ｔ３膜の中のＧＲＰレセプターの分子量は、結合した”’　Ｉ−ＧＮＰにそれをホモ２官能性架橋剤のビス（スルホスクシニミジル）スベレート（ＢＳ３）を介して共有結合で架橋し、そして標識したレセプターの親和性をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ　）により分析することによって推定した。この架橋側は第１７ミノ基に対して特異的である。可溶性３７３線維芽の膜のタンパク質（４０μｇ）を、５００μＩの最終体積の５０１のＨＥＰＥＳ、　２　ｓＨのＥＤＴＡ、　０．０７５％のＣＨＡＰＳ、　０．０１５％のＣ）ＩＡＰＳ。

３０μｇ／ｍｌのハンドラシン、および０．２ｒ＋ｒｌの”５ｌ−ＧＲＰＯ中で１５°Ｃにおいて３０分間インキユヘーンヨンした。結合反応を０°Ｃに冷却し、そしてＢＳ’を添加して最Ｐ濃度を３１とした。架橋は０．１０…１のＴＲｌ５緩衝液（１，０ＭのＴＲｌ５／ＣＩ、　ｐＨ７，５）の添加によりクエンチングした。さらに１０分のインキュヘーション後、０．１ｍｌのＴＣＡ　（１００％）を添加し、そしてこの溶液をさらにＯ′Ｃにいて３０分間インキュベーションした。沈澱した物質を遠心により集め、水冷アセトンで洗浄し、そして５Ｏ３ −ＰＡＧＥ試料緩衝液の中で３分間９５°Ｃに加熱した。試料を７．５％のゲルの５Ｏ５−ＰＡＧＥにかけ、そしてゲルをフルオログラフィーにかけた。５Ｏ５ −ＰＡＧＥ技術の詳細な説明はＬａｅｍｍｌｉら（１９７０）ハｔｕｒｅ２２７　：　６８０（その開示をここに引用によって加える）の中に見いだされる。第５図はゲルの表示を示す。

レーン　組成Ａ　添加なし８　０．１ｎＨの非標識ＧＲＰＣ０，５ｎＭのレーンＧＲＰＤ　１．０ｎＨの非標識ＧＲＰＥ　１１００ｎのレーンＧＲＰ強く標識された種は、約７５〜１００ｋＤａの見掛けの分子量をもつ拡散バンドで移動した。低いレベルの非標識ＧＲＰはこの種の標識っけを阻止し、標識っけが高度に特異的であることを示す。標識したバンドの広さは、ＧＲＰレセプターが炭水化物を含有することが発見されたという事実と一致する。標識した生成物は、全細胞または膜の架橋の実験から誘導されたものに類似する。架橋された全細胞から誘導された試料のＮ−グリカナーゼ処理は、標識した生成物がＮ一連鎖した炭水化物を含有するであることを示した。脱グリコジル化したタンパク質は５ＤＳ−ＰＡＧＥ上に３８ｋＤａの見掛けの分子量を表した。

夫隻炎刊ＧＲＰレセプターの精製ＧＲＰレセプターの可溶化スイス３７３線維芽の膜（２〜３ｇのタンパク質）を実施例１に記載するように調製し、そして２０抛１の貯蔵緩衝液（実施例１を参照のこと）の中に懸濁させた。膜を５０ｍ１のＮａＣ１（５，０Ｍ　）と混合し、ＮａＣｌ濃度を約ＩＭにし、４０，０ＯＯＸ　ｇで３０分間遠心することによって沈澱させ、そして４° Ｃにおいて２００ｍ　ｌの高い塩の緩衝液（５０ｗＭのＨＥＰＥＳ、　ｐＨ７，５＋　２　ｍＭのＥＤＴＡ、　１．０ＭのＮａＣｌ、　２５μｇ　／ｍｌのロイペプチン、１０μｇ／ｍｌのアプロチニン、２．５μｇ／ｍｌのペプスタチン、および０．５ｍ１ｌのＰＭＳＦ　）で２回洗浄した。次いで、膜を低い塩の緩衝液（５０ｗＭの）ＩＥＰＥＳ、　ｐＨ７，５，２ｍＭのＥＤＴＡ、　２５μｇ／ｎ＋＋のロイペプチン、１０μｇ／ｍｌのアプロチニン、２．５μｇ／ｍｌのペプスタチン、および０、５ｍＭのＰＭＳＦ　）で洗浄し、そして２００ｍ１の５０ｍＭの！（ＥＰＥＳ、　ｐＨ７，５＋　２１１ＭのＥＤＴＡ、　１．０（］ｗＭのＮａＣｌ、　０．０３μｇ／ｍｌのバシトラシン、２５ｎｇ／ｌのロイペプチン、１０μｇ／ｍｌのアプロチニン、２．５μｇ／ｍｌのペプスタチン、および０．５ｍＭのＰＩＩＳＦの中に再懸濁させた。ＣＨＡＰＳおよび（ＪＩＳの混合物を含有する原溶液を膜にゆっくり添加して、最終濃度を０．７５％のＣＨＡＰｓおよび０．０７５％のＣｌｌ５にした。この混合物を２１°Ｃにおいて３０分間インキユヘーソヨンし、４°Ｃに冷却し、そして１００．０００ｘ＆で４° Ｃにおいて６０分間遠心した。上澄み液は可溶化したＧＲＰレセプターを含有した。

ポリエチレングリコールによる゛可溶化した抽出物（１９０ｍｌ）に、１２６１の水冷したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）８．０００（Ｈ２Ｏ中の５０ｗ／ｖ％）を添加した。よく混合した後、形成した沈澱を１００，０ＯＯＸ　ｇで１０分間遠心することによって集めた。ベレットを２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、　２５ｏ＋ＭのＴＲｌ５．ｐＨ７，５，２ｍＭのＥＤＴＡ。

０．０７５％のＣｌ５．５　ｕ　ｇ　／ｍｌのロイペプチンおよび１１０１Ｉ／ｍｌのバシトラシンの中に５０ｎ＋Ｉの合計の体積でボッター〜エルヘージェム（Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ）ホモジナイザーの助けにより懸濁させた。

この懸濁液は、多少の不溶性タンパク質を含有し、これを６９，０００ｘ　ｇで１０分間遠心し、そしてペレットを廃棄した。

コムギ・７のアプロチニンのクロマトグラフィーＰεＧによる沈澱後、ＧＩ？Ｐレセプターをレクチン親和クロマトグラフィーによりさらに精製した。コムギ胚芽のアグルチコンーアガロース樹脂を含有するカラム（１，６Ｘ９ｃｍ）（３〜５ｍｇのレクチン／ｍｇの湿潤ゲル）（Ｅ−Ｙラボラトリーズ、カリフォルニア州すンメイテオ）を、５（１ｗＭのＨＥＰＥＳ、　ｐＨ７，５，２−門のＥＤＴＡ、　０．２５％のＣＨＡＰＳ。

０．０２５％のＣｌ５．　５ｎｇのロイペプチン、および１０ｍｇ／ｍｌのバシトラシンと４°Ｃにおいて平衡化した。可溶性抽出物を１体積のカラム緩衝液で希釈し、そして最終の清浄剤濃度を０．２５％のＣＨＡＰＳおよび０．０２５％のＣｌ５に調節した。試料をレクチンのカラムに１．５ｍｌ／分の流速で適用した。次いでカラムを抗体１０カラム体積の緩衝液で洗浄し、そしてカラム緩衝液＋５１のＮ、Ｎ’　、Ｎ’　−１リアセチル−キトトリオースで溶離した。ＧＲＰレセプターの結合活性を含有する分画をプールし、そして２．３体積の２５１１ＩＩＭの）ＩＥＰＥｓ、ｐＨ７，５，２，０ｄのＥＤＴへ、５ｎｇのロイペプチン、および１０μｇ／ＩＩ＋１のバシトラシンアクチゲルのスーパーフロー樹脂（１，０ｍ１）　（ステロジーン、カリフォルニア州サンガブリエル）を５体積の１００１のＫＰＯａ、　ｐＨ７，０で洗浄した。この樹脂を２ｍｇ／ｍｌの（ＮＩｅ１４．２７　”Ｊ　ＧＲＰ　１３−２７を含有する１０削１の１０（ｂ、＋ＭのＫＰＯ４，ｐＨ７，０，１００ｍＭのＮａＣＮＢＨ３，ｐＨ７，０とおだやかに攪拌しながら２時間インキュベージジンした。この樹脂を１００ｍＭのＫＰＯ，、ｐＨ７，０で洗浄し、次いで１００ｍＭのＫＡｃ、　ｐＨ４，０，０，５ＭのＮａＣｌ　；および１００１のＴＲｌ５．　ｐＨ８，０，５ＭのＮａＣｌで交互に洗浄した。

この樹脂のカラム（１，６Ｘ　５　Ｃｍ）を２５ＮＩＨのＴＲｌ５．２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、　ｐＨ１，５゜２．０１のＥＤＴＡ、　０．０７５％のＣＨＡＰＳ、　０．００７５％のＣｌ５．　５μｇ／ｍｌのロイペプチン、および１０μｇ／−１のバシトラシンと４°Ｃにおいて平衡化した。レクチンのカラムから溶離された粗製のＧＩ？ＰレセプターをＧＲＰ親和カラム上に０．１ｉ１／分で負荷した。次いでカラムを約２０体積の平衡化緩衝液で洗浄した。結合したレセプターをカラムから平衡化緩衝液＋０．５ＭのＮａＣｌで０．２ｍｌ／分の流速で溶離した。レセブターを含有する両分を”’　１−ＧＲＰ結合活性のアッセイにより同定し、そしてプールした。（１０〜１３１）。溶離のプールをセントリコンプ（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ）　１０装置（アミコン、マサチュセソッ州デンバース）を使用する限外濾過により約１１に濃縮した。次いで、試料を１５体積の親和カラＪ、の平衡化緩衝液で希釈し、そして試料を１１に再濃縮することによって、試料を脱塩した。この脱塩工程を反復し、そして生ずる１１の塩を親和カラムの緩衝液で５＋ｉｌに希釈した。精製したＧＲＰレセプターのＰＡＧＥ分析は有意のレベルの汚染の存在を明らかにした。

この準純粋なレセプターの溶液を、前述したように調製した、第２　ＣＮ１ｅ１４．２７　）　ＧＲＰ　１３　２７−アクアゲルスーパーフローのカラム（１，ＯＸ３ｃｍ）の上に１．８ｍｌ／時間で負荷した。カラムを２０力ラム体積の平衡化緩衝液で洗浄し、そして結合したレセプターを平衡化緩衝液＋０．５ＭのＮａＣｌで０．１ｍｌ／分の流速で溶離した。ＧＲＰレセブクーの結合活性を含有する分画をプールし、そして限外濾過により０．３ｍｌに濃縮した。

ｒ土４通精製したレセプターを、スバロース（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ　）　６１１Ｒ１０／　３０カラム（ファーマシアＬＫＢ、ニュージャーシイ州ピスカタウェイ）のクロマトグラフィーによる脱塩した。このカラムを２０ｍＭのＨＥＰＥＳ。

ｐＨ７，５，２＋ｗＭのＥＤＴＡ、　０．０７５％のＣＩＩＡＰＳ、　０．００７５％のＣＮ５．および１００＋１ＭのＮａＣｌと平衡化した。レセプターを０．４ｍｌ／分でクロマトグラフィーにかけた。このレセプターをカラムから約２ｍｌで溶離した。

精製したＧＲＰレセプターの特性決定粗製の可溶化した抽出物からの純粋なＧＲＰレセプターの全体の収率は、高い親和性の”’　１−ＧＲＰ結合活性に基づいて、１０〜２０％の範囲であった。精製したレセプターを使用して得られた結合のスキャノチャード分析により、ＧＩ？Ｐについてのその親和性（Ｋ、＝１０〜３０ｐＭ　）は粗製の清浄剤の可溶化し、た抽出物の中のレセプターと本質的に同一であることが示された。データが示すように、３０〜５０ｐＭのレセプター部位は典型的には、この実施例において概説したように、レセプターの最終の精製した分画の中に得られた。脱グリコジル化レセプターが５Ｏ５−ＰＡＧＥゲル上で３６４５キロダルトンの見掛けの分子量を示すことを考慮すると、これは約１〜２μｇのレセプタータンパク質に相当する。

レセプター調製物の銀染色５Ｏ５−ＰＡＧＥゲルは、７０〜１００ｋＤの見掛けの分子量をもつ単一の強く染色された拡散バンドを示した。レセプター調製物は夾雑物を木質的に含まなかった。第６図は精製したＧＲＰレセプターの銀染色したゲルの表示を示す。ＧＲＰレセプターの銀染色の相対的レベルを既知の量のタンパク質と比較して、ゲルに負荷したレセプターのタンパク質の概算量を決定した。得られた荒い値は”’　Ｉ−ＧＲＰの結合データのスキャノチャード分析により存在すると推定された範囲内にあり、これはゲル上の強く染色されたバンドがＧＲＰレセプターであることを確証した。さらに、精製したＧＲＰレセプターの見掛けの分子量は親和標識したレセプターを使用して得られたものに相当する。これは全細胞、完全な膜、または粗製の可溶性抽出物の中のレセプターに”’ 　Ｉ−ＧＲＰを結合させ、そしてレセプターリガンド複合体をホモ２官能性架橋剤と架橋させることによって得られた。

５Ｏ５−ＰＡＧＥ上のＧＲＰレセプターのハンドの拡散の性質は、炭水化物を含有するタンパク質の特性である。精製したレセプターの小さい部分をヨードゲン（Ｉｏｄｏｇｅｎ）　（ピアース、イリノイ州ロックフォード）の存在下に”’ 　ｌ−Ｎａ１でヨウ素化して、ゲル上のレセプターの検出を増大した。放射線標識したレセプターをＮ−グリカナーゼで処理すると、７０〜１００ｋＤａのバンドが損失し、そして脱グリコジル化されたレセプターを表す約３６±５キロダルトンにおける新しいハンドが発生した。

ＧＲＰレセプターの。′・アミノ　配置の゛精製したＧＲＰレセプターのＮ−末端の部分的配列は順次のエドマン分解により決定した。残基８−１７について得られた配列は、次の通りであったニー１．ｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−八５ｐ−Ｖａｌ−＾５ｐ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−１，ｅｕ−５ｅｔ−０裏適桝Ｕ精製したＧＲＰレセプターは実施例１０に記載するようにして調製した。スパロース−６のクロマトグラフィー後、４０ｐＭのレセプターが１ｔ’　Ｉ−ＧＲＰの結合のデータのスキャノチャード分析に基づいて得られた。これは約１．６μ ｇのタンパク質に相当する。試料（３ｍｌ　）を、セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）　１０装置（アミコン）を使用する限外濾過により、約１００１Ｉｌに４縮した。次いで試料を２ｍｌの８２０で希釈し、そして１００μｍにａ縮した。もう一度、試料を２ｍｌの８２０で希釈し、そして１００μｍに濃縮し、そして最後に１ｍｌのｎ、ｏで希釈し、そして１３８μｍに濃縮した。レセプターをトリプシンで消化するために、０．１μｇのｌ・リプシンを添加し、そして試料を３７°Ｃにおいてインキエヘーノヨンした。２時間後、追加の０．１μｇのトリプシンを添加し、次いで他の０．２μｇのトリプシンを５時間のインキュヘーノヨン後に添加した。３７°Ｃにおいて２２時間インキユヘーンヨンした後、試料を液体Ｎ２の中で９速凍結し、そして−８０°Ｃにおいて貯蔵した。

トリプシン消化したＧＲＰレセプターを室温に融解し、そしてジチオスレイトール（１）ＴＴ）で１０ｍＭの最終濃度で３７゛Ｃにおいて３０分間還元した。次いで、全体のＤＴＴ処理したトリプノン消化物を逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＣＬ）により分別し、ここで２．１ｍｍ　Ｘ　３　ｃｍのＣ４カラム（ブロウンリー、アクアポアーブチル、３００オングストロームの孔サイズ）および水中の０．０５％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ　）（溶媒Ａ）から１００％のアセトニトリル中の０．０５％のＴＦＡ　（溶媒Ｂ）の直線の勾配を使用した（第７図参照）。ＨＰＬＣの勾配のための条件・は６０分で０．２ｍｌ／分の流速において０％の溶媒Ｂがら１００％の溶媒Ｂであった。流出液の分画を２１５ｒ＋＋ｗにおいて検出し、１分の間隔で集め、そして４°Ｃにおいて貯蔵した。

ペプチドの配列の分析のために、連続的両分をプールし、そしてスピード・ハタ（Ｓｐｅｅｄ　Ｖａｃ）　（ソバント、ニューヨーク州ファーミングデール）でほぼ５０μｍの最終体積に濃縮した。バイオブレン（Ｂｉｏｂｒｅｎｅ）　（アプライド・バイオシステムス、カリフォルニア州フォスターシティ）で処理しそして前取てサイクリングしたガラス繊維のフィルターの上に、試料全体を負荷した。自動化したアミノ酸配列の分析を、Ｈｅｗｉｃｈら（１９８１）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５６　：　７９９０−７９９７に従い＾Ｂｌ型４７５八気相配列決定装置で実施し、この装置はフェニルチオヒダントイン（ＰＨＴ− ）アミノ酸の同定のためのＡＢＩ型１２０＾オンライン検出１１ＰＬＣ系を装備した。ＰＨＴ−アミノ酸の定量は、へＢｌ型９００データンステムにより６０ｐＭの１＆［ｌの既知のＰＴＨ−アミノ酸貯蔵（ＡＢＩ）を使用して実施した。この方法において、−緒にしたＨＰＬＣの画分５６〜５９をアミノ酸配列ＭＡＳＦＬＶＦＹＶＩＰＬＡＩＩ　（Ｔ５６１５９と表示する）を与えた；トリプシンノＨＰＬＣ分画４４はアミノ酸配列ＱＬＴＳＶＧＶＳＶ　（Ｔ４４と表示する）を生じ、そしてトリプシンのＨＰＬＣ分画５０はアミノ酸配列ＰＮＬＦＩＳＸＬＡＬＧ　（Ｔ２Ｏと表示する）を与え、ここでＸは同定することができなかった残基である。

試料をＦＩ２０で洗浄し、そしてセントリコン１０限外濾過装置（アミコン、マサチュセノツ州デンハース）で試料を濃縮した後、ＮＨｚ−末端の配列の分析を完全な精製したＧＲＰレセプターについて実施した。

試料（９５％すなわちほぼ９５μｌ）をバイオブレン（Ｂｉｏｂｒｅｎｅ）　（ＡＢＩ）の前取てサイクリノグしたガラスファイバー上に負荷し、そしてＡＲＩの４７５＾気相配列決定装置により自動化エドマン分解の３０サイクルを通して、ＮＨ２−末端の配列分析を実施した（Ｈｅｗｉｃｈら（１９８１）　）。

ＰＴＨ−アミノ酸の同定および定量を、ＡＢＩ　１２０Ａ　ＰＴＨ−アミノ酸分析装置およびへ〇＋９００データシステムを使用して実施した。Ｇｌ？Ｐレセプターの２つの精製した調製物についての２つの別々の１ｆ８２−末端の配列の実験後、次のコンセンサス）ＩＬ−末端アミノ酸配列がｊ７残基に・ついて得られ、ここでＸは特定のアミノ酸の正確な帰属がなされなかった残基を、意味する：１　５　’１０　１５ＡＰＮＸＸＳＸＬＮＬＩ］ＶｒｌＰＦＬＳ。

実迦律１２スイス３Ｔ３ＧＲＰレセプターをコードするｃＤＮＡクローンの同定予備的研究において、７ズミ胚線維芽細胞系（）＼ルブ［Ｂ、１１ｂｌ１３Ｔ３）は存在量および分布がＧＲＰレセプターを発現するスイス３Ｔ３２ズミ線維芽細胞系に非常に類憤するｍＲＮＡのレパートリ−を発現するが、標準の結合アッセイにおいて検出可能な細胞表面のＧＲＰレセプターをもたないことが確立された、次の文献を参照：　Ｋｒ１ｓら（１９８７）こに引用によって加える。これらの観察は、ＧＩＩＰレセプターのｍＲＮＡはスイス３Ｔ３の中に存在するが、バルブ３Ｔ３のｍＲＮＡの中に存在しない、制限された数の転写体の１つであろうことを示唆した。ポリアデニル化ｍＲＮ＾スイス３Ｔ３およびバルブ３Ｔ３の両者から分離し、そして発表された方法、例えばＴｉｍ１ｉｎら（１９９０）　Ｎｕｃｌ、　Ｑ−値士と１８＋　１５８７−１５９３　（これを引用によってここに加える）の方法に従い、スイス３Ｔ３ｍＲＮＡに由来するが、バルブ３Ｔ３ｍＲＮＡの中で発現できないｃＤＮＡについて濃縮されたスイス３Ｔ３の消去した（ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ）　ｃＤＮＡを発生させるために使用した。その長さが３００塩基対を越えるｃＤＮ＾インサートをラムダｇｔｌｏバクテリオファージｃＤＮＡクローニングベクターの中に結合し、そしてライブラリーを確立された方法、例えばＤａｖｉｓら（１９８６）　（Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅ鼎セｒＢ１０１０ｇ、ｚ）　ＥｌｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ）ＨＣｏｍｐａｎｙ、二１．・−ヨークを使用して増幅した。

このライブラリーをオリゴヌクレオチドのプローブでスクリーニングし、ここでこのプＩコープの配列は精製したＧＲＰＩ／セプターのタンパク質のトリプノン消化物から）ＩＰＬＣにより精製した内部のトリプシン断片（Ｔ５６１５９）のアミノ酸配列に基づいた。内部のペプチドのアッセイ系（？ＩＡＳＦＬＶＦＹＶＩＰＬＡＩｌ）を使用して、長い非同義性のアンチセンスのオリゴヌクレオチドをデザインし、このヌクレオチドの配列は文献Ｌａｔｈｃ（１９８５）　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１８３：　１　１２に記載するように最適なコドンの使用頻度に基づき、１３と呼ふ４４塩基長さのプローブを生成した：（５′　八ＴＧＡＴＧＧＣＣＡＧＧＧＧＧＡＴＣＡＣＡＴＡＧＡＡＧＡＣＣＡＧＧＡＡＧＧＡＧＧＣＣＡＴ３　’　）このＩ３プローブを、Ｄａｖｉｓら（１９８６）の確立された技術に従い、ガンマ”Ｐ−ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼを使用する５′末端のリン酸化により標識した。この標識したプローブを使用して、記載したようなハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件下に、消去したライブラリーから１００，０００の構成員のクローンをクロ−ニングした。

Ｗｏｏｄ　（１９８７）第４８章、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚπカ至■１５２　：４４３−４４７　（これをここに引用によゲで加える）を参照のこと。二重反復のスクリーニングは５つの陽性のクローンを同定し、これらをプラーク精製した。５つのクローンからのＥｃｏＲＩインサートをプラスミドのヘクターｐＧＥＭ４　（プロメガ）の中にサブクローニングし、そしてハイブリダイゼーションのインサートのヌクレオチド配列をセクエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）　２．０二本鎖配列決定キット（ＵＳバイオケミカル）を使用して決定した。５つのクローンのうちの２つ（丁１およびＴ２）は、オリゴヌクレオチドのプローブをデザインするために使用した内部のペプチドをコードするオーバーラッピングＤＮＡ配列の同一領域を有した。断片をプラスミドのヘクターからＥｃｏＲＩ消化により取り出し、そしてＤａｖｉｓら（１９８６）に記載されているようにゲル電気泳動および電気溶離により精製した。精製したインサートの断片を商業的に入手可能なキットおよび供給会社の推奨（ヘセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ）を使用するランダムプライマー伸長により標識して、　１００　、０００のライブラリー構成員の第２スクリーニングにおいて、消去したライブラリーから他のオーバーラッピングｃＤＮＡクローンを同定するためのプローブを発生させた。同定された９つのｌのクローンのヌクレオチド配列の分析は単一の長いオープンリーディングフレームを明らかにし、その予測された翻訳生成物は内部のトリプシン断片のアミノ酸配列を含み、その配列は複合配列内の終止コドンで終わっていた。オープンリーディングフレームのアミノ末端は、消去したライブラリーから分離されたクローンのいずれの中にも存在しなかった。

ｃＤＮＡの５′末端およびオープンリーディングフレームのアミノ末端における配列を得るために、ｉｎ　ｖｉｔｒｏポリメラーゼ連鎖反応の増幅（ＰＣＲ）　ｃＤＮ＾クローン手順（５’　ＲＡＣＥ）を、本質的にＦｒｏｈｍａｎら（１，９８８）　？ｒｏｃ、　Ｎａす、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｌｌ５Ａ　８５　：８９９８−９００２に記載されているように、前に分析されたｃＤＮＡクローンの既知のヌクレオチド配列から誘導された２つの入れ子型遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＥＸＴ　３　：　５　’　ＧＧＧＧＡＧＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＧＣ３’　：　ＥＸＴ　２　：　５　’ＣＣＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＴＴＴＡ）を使用して実施した。ＥＸＴ　３をスイス３Ｔ３のｍＲＮＡの逆転写のために遺伝子特異的プライマーとして使用し、そしてＥＸＴ　４をＴａｑポリメラーゼ触媒ＰＣＲのための遺伝子特異的プライマーとして使用した。１９の５　’　ＲＡＣＥのｃＤＮＡを分離しそして特性決定し、そして最長距離を伸長したクローンの５つを従来記載されたように配列決定した。ヌクレオチド配列の分析により、イニシエイターのメチオニンのコドンで開始する、内部のトリプシンペプチドのアミノ酸配列をコードする長いオープンリーディングフレームの伸長が明らかにされた。オープンリーディングフレームの予測されたアミノ酸配列を、精製したＧＲＰレセプターから誘導されたアミノ末端の配列と比較した（実施例１１を参照のこと）。実験的に決定されたアミノ酸配列は推定された配列の位置１にメチオニンを含有しなかったが、残基２−１８によく対応した。推定されたアミノ酸２− ４および８−１８（表１）は同一であった。合致しないアミノ酸（アミノ酸５− ７、表１）は、多分それらがＮ−結合したグリコジル化部位に位置する（Ａｓｎ −Ｃｙｓ−３ｅｒ）ので、もとのアミノ酸配列において不明確であった。さらに、内部のトリプシンのペプチドＴ４４から誘導された７−、／酸配列（［１ＬＴＳＶＧＶＳＶ）およびＴ２Ｏ（ＰＮＬＦＩＳＣＬＡＬＧ）　（精製したスイス３Ｔ３ＧＲＰレセプター（実施例１１）から誘導された）は、複合ＧＩＩＰレセプターコドンの長いオープンリーディングフレーム内のセグメントと合致した。

遺伝子特異的プライマー特異的ｃＤＮＡのクローニングを使用して、全体の中断されないオープンリーディングフレームをコードする単一のｃＤＮＡクローンを得た。この手順において、ＧＲＰレセプターのｍＲＮＡの３′未翻訳領域の１８ヌクレオチドの断片に対して相補的な遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＥＸＴ７　：　５　’　ＴＡＣＴＴＴＧＡＧＡＴＡＣＡＡＴＧＧ３　’　）を使用して、ＭｕＬν逆転写酵素により第１　鎖ｃＤＮＡの合成をブライミングした。二本鎖ｃＤＮＡが発生し、そしてＤａｖｉｓら（１９８６）の標準の方法を使用してラムダｇＬ１０の中にクローニングした。ｃＤＮＡの５′未翻訳領域の中に伸長した５　’　ＲＡＣＥのｃＤＮＡクローンの１つから誘導されたｃＤＮＡ断片のプローブで、５００．０００のクローンをスクリーニングした。２０を越えるクローンが同定され、そして１０をプラーク精製し、そしてＤａｖｉｓら（１９８６）の標準の方法によりプラスミドのヘクターの中にサブクローニングした。ヌクレオチド配列の分析により、クローンはＧＲＰレセプターのタンパク質の全体の中断されないオープンリーディングフレームを含有することが確証された。マウスからのＧＲＰレセプターのＤＮＡ配列およびその推定されたアミノ酸配列を表に示す。

オープンリーディングフレームのヌクレオチド配列の分析は、予測されたタンパク質のいくつかの興味ある特徴を明らかにした。このタンパク質の予測された分子量は約４３．１００ダルトンであり、実施例１０に記載する、スイス３Ｔ３細胞からのＮ−グリカナーゼ処理したＧＲＰ結合結合タンパクワいて報告された分子量によく一致する。疎水性の分析を第８図を示し、そして７つの推定上のトランスメンブレンドメインの存在を予測し、これはＧＲＰレセプターがグアニン− ヌクレオチド結合タンパク質（Ｇ−プロティン）にカップリングしているという前の観察と一敗する。Ｆｉｓｃｈｅｒら（１９８Ｂ）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

劫μｗ、　２６３　：　２８０８　２８１６を参照のこと。Ｇ−プロティンがカップリングしたレセプター遺伝子の超料は、典型的には、７つのトランスメンブレンドメインの内部か、あるいはそれに隣接するある種の保存された残基を共有する、Ｍａｓｕら（１９８７）　Ｎａｔｕｒｅ　３２９　：　８３６−８３８゜これらの観察されたアミノ酸は、マウスＧＲＰレセプター配列のオーブンリーディングフレーム内の予測された位置において見いだされる（表１）。Ｎ−結合したグリコジル化のための５つの潜在的部位（Ａｓｎ−Ｘ−３ｅｒ／　Ｔｈｒ）が認められ、ＧＲＰレセプターが高度にグリコジル化されていること、そしてＧＲＰレセプターの糖タンパク質のＮ−グリカナーゼ処理が５Ｏ５−ポリアクリルアミドゲルの中のタンパク質の見掛けの分子量を約７０〜１００キロダルトンから約３８±５キロダルトンに減少するという観察と一致する（実施例１０）。表６はＧＲＰレセプターと物質にレセプターとの間の比較を示す。

表６　：　ＧＲＰレセプターおよび物質にレセプターのアミノ酸の比較３８４　ｖ”　、、、、３８５「３８０ν５ＴＥＰ”　３８５几側、エ　表６ ■　ＧＲＰレセプターム　物質にレセプターノザンプロット分析を実施して、スイス３Ｔ３ＧＲＰレセプターをコードする転写体の性質を同定した。スイス３Ｔ３細胞およびバルブ３Ｔ３細胞から誘導されたポリアデニル化５ＲＮＡのｊｕｇを精製し、そしてホルムアルデヒドを含有する１％のアガロースゲルの電気泳動により分割し、これを引き続いてニトロセルロースのフィルターに移した。このフィルターをカルボキシ末端のトランスメンブレンドメイン５．６および７ならびに３′未翻訳配列の一部分をコードする、４５０塩基対のｃＤＮＡ断片のプローブとハイブリダイゼーションした。

このプローブを３２ｐで商業的に入手可能なランダムプライマー伸長キット（ヘセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ）を使用して比活性５００ｃｐｍ　／ピコグラムに標識した。２つの…Ｉ？ＮＡはこのプローブに特異的にハイブリダイゼーションし、それらの大きさはマウス２８Ｓ（５，０ｋｂ）および１８Ｓ（２，０ｋｌ））のマーカーとの比較により７．５ｋｂおよび３．０ｋｂであると推定された。期待するように、２つのｍＲＮＡの形態はスイス３Ｔ３細胞からのｍＲＮＡの中でのみ検出され、バルブ３Ｔ３細胞からのｍＲＮＡ０中でＧＲＰレセプターの転写体は検出されなかった。

実施例１３マウスＧＲＰレセプターｃＤＮＡに対して相同性のヒトｍＲＮ＾種ノザンブロ７）分析を実施して、ヒト胎児肺細胞の中で発現されたＧＲＰレセプター（Ｋｒｉｓら（１９８７）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ＋ｗ、　２６２：　１１２１５−１１２２０を参照のこと）とスイス３Ｔ３ＧＲＰレセプターとの間の相同性の程度を決定した。ポリアデニル化ｌｌＲＮＡをヒト胎児肺細胞から分離し、そして実施例１２に記載されているように、プローブとしてスイス３Ｔ３細胞のＧＲＰレセプターの同一の４５０塩基対のｃＤＮＡ断片を使用してノザン分析したが、ただしハイブリダイゼーシぢンフィルターの洗浄工程のストリンジエンシーを減少した。はぼ７．０および３．Ｏｋｂの２つの−ＲＮＡ種がヒト細胞系において検出され、これらはマウスのスイス３Ｔ３細胞の−ＲＮＡにおいて観察されたものに相当する。プロットについて使用した条件に基づいて、同定されたｓ＋ＲＮＡ種はスイス３Ｔ３ＧＲＰし仕ブタ−のプローブに対して少なくとも８０％相同性であった。結果は、実施例１２に記載するマウスＧＲＰレセプターのｃＤＮＡを使用して、ヒトを包含する他の哺乳動物スペーサーの中のＧＲＰレセプターをコードするｃＤＮＡまたはゲノムのＤＮＡ断片を容易に同定することができることを示す。これらの相同性のレセプターは、同様な技術を使用して他の相同性レセプターを分離するために利用可能であろう。

実施ルレセプターの機能を実証するためのアフリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　）卵母細胞の中のｃＤＮＡクローンから誘導されたマウスＧＲＰレセプターの発現！！ｌｌ６ＲＮＡポリメラーゼおよびＤａｖｉｓら（１９８６）の確立された方法を使用して、転写−・フタ−ｐＧＥＭ４　（プロメガ）の中でクローニングしたマカスＧＩ？ＰレセプターのｃＤＮＡレセプターｃＤＮＡタンパク質の解読領域（表１）から、センスｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写体を調製した。合成した転写体（抗体２０ｎｇ）をアフリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　）の卵母細胞の中に注入した。１６時間後、卵母細胞を電圧でクランプし、そして１０−９ＭのＧＲＰを含有する溶液の中に入れた。第１１図に示すように、ＧＲＰリガン［依存性塩化物電流（約１６０ナノアンペアの大きさ）はりガントの添加と同時に発生した。これらの結果は、Ｇ−プロティンを通してＣａ”依存性塩化物チャンネルへカップリングする、アフリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　）の卵母細胞の表面上のｔｎ　ｖｉｔｒｏ転写体依存性Ｇ１１ｌ”レセプターの発現を証明する。リガンド依存性塩化物電流は、アンチセンスｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写体を注入した対照卵母細胞において観測されず、こうして応答の特異性を証明する。

ス新ｌＩ腫ＩＬＬ、Ｎ　１１　Ｂ　−ＲのｃＤＮＡ９Ｕ−７（Ｄ分離ヘキサマーでブライミングしたｃＤＮＡライブラリーをラットの食道から構成し、そして低いストリンジエンシーにおいてスイス３Ｔ３のＧＩｉＰ−ＲのｃＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。いくつかの候補のクローンを分翻し、これらの２つは長いオープンリーディングフレームの全体の解ｆＨｆ、ｌ域を含有した。

いくつかの基準を使用して、ｃＤＮＡクローンがＩＩＭＢを好むボンベシンレセプターのタンパク質は最初に分離したＧＲＰ−、Ｒと区別されることを確立した。これらの２つのボンベシンレセプターのサブタイプを区別する性質は、タンパク質の構造、特定の拮抗因子４に対するレセプターの感受性、ボンへジンペプチドのりガントに対する相対的結合活性、および発現の＆１ＩＩｉＩｉの分布を包含する。食道のｃＤＮ＾ライブラリーから低いストリンジエンシーで分離したｃＤＮＡクローンを使用しζ、これらの性質を研究した。

実施■亜ＮＭＢ−ＲのｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列推定上のＮＭＢ− Ｒをコードする２つの独立のクローンの中に存在する単一の長いオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列および予測されたアミノ酸配列を、表３に示す。これらのｃＤＮＡは、４３ｋＤａの計算された分子量をもつ、３９０アミノ酸長さのタンパク質をコードするｍＲＮＡから誘導される。予測されたＮＭＢ− Ｒタンパク質のヒドロパン−の分析は、疎水性アミノ酸の７つのストレッチを明らかにし、これらはＧ−）”ロチインとカンブリングしたレセフ゛ターに典型的な７つのトランスメンブレン構造と一致する。第１２図を参照のこと。Ｎ−結合したグリコジル化のための３つの潜在的部位（八ｓｎ’、　Ａｓｎ”、Ａｓｎ１９りが存在し、これらはＮＭＢ−Ｒタンパク質が、ＧＲＰ−Ｒに似て、糖タンパク質であることがあるという予測と一致する。表３を参照のこと。

表７において、マウスのスイス３Ｔ３ＧＲＰレセプターおよびラット１１ＭＢ− Ｒタンパク譬を比較する。Ｎ阿Ｂ−１？アミノ酸配列は、今日まで報告された他の配列ＧＲＰ−Ｒに対してより高いｆｆ（Ｅｌ性を有する（５４％の同一性）。

ラントの物質Ｐおよび物１ｆＫのレセプターの従来報告された比較は、これらの２つのタキキニンのレセプターのサブタイプの間の匹敵するアミノ酸配列の同一性を示す（４８％の同一性）、Ｙｏｋｏｔａら（１９８９）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６４．　１７６４９−１７６５２を参照のこと、対照的に、推定上のラットＮＭＢ−ＲおよびマウスＧＲＰ−ＩＩの間の配列の同一性は、物質にのレセプターをウシ（Ｍａｓｕら（１９８７）　Ｎａｔｕｒｅ３２９、　８３６−８３８を参照のこと）、およびラット（Ｙｏｋｏｔａら（１９８９）シュ」坦Ｌ１一旦枦びユ２６４．　ｉ、７６４９−１７６５２を参照のこと）、からと比較するとき観測される（８５％）よりかなり低い。

表７：ラノト）ｆＭＢ−ＲとマウスＧＲＰ−Ｒとの予測されたアミノ酸配列の比較。ラントＮＭＢ−Ｒ（表３）およびマウスのスイス３Ｔ３のＧＲＰ−Ｉｔ（表１）の予測されたアミノ酸配列を、ライスコンシン大学のジェ不ティソク・コンピューター・グループのソフトウェアパッケージの中のＧＡＰプログラムを使用して、整列させて相同性を最大にする。

Ｄｃｖｅｒｅａｕｘら（１９８４）　Ｎｕｃｌ、＾ｃｊｄｓ　Ｒｅｓ、　１２　：　３８７−３９５を参照のこと。多数の他の既知の６−プロティンがカンブリングしたレセプターの上科の構成員において典型的には保存されるアミノ酸残基の間の実線は、ボンクスの中に囲まれている。

ＮｔＩＢ−１１および（Ｉ；−タンパク質がカップリングし７にレセプターの部材の他の構成Ｈム二ついて１−測されたアミノ酸配列の間の比較により、この族において保存された多数のア、ミ７）酸残基はＮＭＢ−Ｒ配列の中の対応する位置も一存在することが示される。第１および第２の細胞外のレープの中に位置す −る〕；スルフィド結合を形成することができる２つのシスティン残基は、予測されたＮＭＢ−１１配列の中の位置１１６および１９８において保存される。血ＷＩ’ｌＩにベータ・アドレナリン作動性レセプターを定着するとき重要であると考えられる、他のよく保存されたシスティン残基は、また、ＮＭＢ−Ｒの予測された配列の中の第７トランスメンブレンドメインの末端から１４アミノ酸残基下流に存在する。さらに、Ｇ−プロティンがカップリングした部材の構成員において典型的に保存される、多数の他のアミノ酸残基は、また、ＮＭＢ−１１の予測されたアミノ酸配列の中に見いだされる（表７のボックスで囲んだ残基）。これらの類似性が示すように、ＧＲＰ−Ｒに似て、ＮＭＢ−ＲはＧ−タンパク質がカップリングした部材の構成員である。

災ＭｆｆｉＮＭＢ−Ｒの機能的性質の分析ＮＭＢ−ＲのｃＤＮ＾の機能的同一性を確証するために、全体のＮＭＢ−Ｒタンパク質の解読ドメインを含有するｃＤＮＡクローンからｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写したＲＮＡを、アフリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の卵母細胞に注入した。

製造業者（プロメガ）により推奨されるようにＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用してＮＭＢ−ＲまたはＧＲＰ−ＲのｃＤＮＡクローンからＲＮＡを転写し、そしてｉｎν１ｔｒｏ−Ｆヤノビングした。脱卯胞した卵母細胞を約１０ｎｇのｍＲＮＡ／卵母細胞でマイクロインジェクションし、そしてＬｕｐｕ−Ｍｅｉｒｉら（１９８９）　１１−罰６ｅｒｓ　Ａｒｃ、ｈ、　４１３　：　４９８−５０４のＮＤ卵母細胞のＮＤ温溶液中に２０゛Ｃに保持し、た。２４〜４８時間後、卵母細胞を潅流チャン／Ｎ−の中に入れ、そして−６０ｍＶの保持電位で電圧クランプした。リガンドをチャンバーに直接添加ｔ２、そしてリガンド依存性Ｃ１電流を測定した。ＧＲＰＩ−２７およびＮＭＢペプチドをベニンスラ（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ）（カリフォルニア州へ−リンゲイム）から購入（７１、そ１，７て（Ｄ −Ｐｈｅ’）ＢＮ　（６−１３）エチルエステル旦−１９１．ｑ回竺．　２６５　：　１５６９５−１．’５７０３に記載されているようにして合成した。

Ｎｌ’１１１（１０−６門）またはＧＲＰ（１０−’Ｍ）は、ＩＰ．またはＣａ ”が仲介するチャンネルのオープニングについて典型的である、消極電流を引き起こす。より低い作動因子濃度（１０−”Ｍ）において、ＮＭＢのみは検出可能な応答を引き出す。食道のライブラリーから分離されたｃＤＮＡクローンは機能的Ｎ）１Ｂ−Ｒをコードし、このＮＭｌ’１．、ｌｌは、ＧＲＰ−Ｉｔと対照的に、ＧＲＰより低い濃度のＮＭＢに対して応答することを、これらのデータは確立する。

卵母細胞の中で発現されたＮＭＢ−Ｈの機能へのＧＲＰ−Ｒに対して特異的な拮抗因子の作用を試験した。ｄｅｓ−Ｍｅｔボンへシン類似体（［Ｄ−Ｐｈｅ６］　ＢＮ　（６−１３）エチルエステル）は膵臓のＧＲＰ−Ｒに対して特異的な拮抗因子として機能するが、食道のＮＭＢ−Ｈについて機能しない。

この拮抗因子は、マイクロモル濃度のＧＲＰまたは８Ｍ８作動因子とともに１０：ｌのモル比で適用するとき、クローニングしたスイス３Ｔ３のＧＲＰ−Ｒを発現する卵母細胞の電気生理学的応答を完全にブロックする。対照的に、この拮抗因子をＮＭＢまたはＧＲＰ作動因子と一緒に（１０：１のモル比）添加するとき、アフリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の卵母細胞の中で発現されたクローニングしたＮＭＢ−Ｒの応答は減少しなかった。

Ｎ？ＩＢおよびＧＲＰに対するレセプターの生理学的応答の差が相対的結合の親和性のためであることを確立するために、バルブ３Ｔ３の線維芽の中でを発現されたクローニングしたレセプターのりガント結合性πを検査した。予備的結合の研究において、バルブ３Ｔ３細胞は非常に低いレベルの内因性の変位可能なボンへシンの結合を有するので、クローニングしたＮＭＢ−Ｒを発現する適当な宿主であろうことが示された。

全体のオーブンリーディングフレームをコードする最長のＮＭＢ−ＲのｃＤＮ＾クローンからのＥｃｏＲＩ断片を、Ｗａｄａら（１９８９）　Ｎａｔｕｒｅ　３４２　：６８４　−　６８９からのｐｃ［１２プラスミドの修飾したバージョンの中にサブクｒ−ｓ　−　−＝−　７グした。バルブ３Ｔ３細胞を、Ｇｒａｈａｍら（１９７３）　誼遅旦ｕ５２：　４５６−４６７のリン酸カルシウム沈澱法に従い、わずかの変更を加えて、４０μｇのｌＩＭＢＲを発現するプラスミド構成体でトランスフェクションした、Ｉｌａｖｉｓら（１９８６）を参照のこと。

安定にトランスフ−クツダンされた細胞をアミノグリコシドＧ４１８（８００μ ｇ／ｌ）に対する耐性について選抜した。３週の選抜期間後、１０クローンを高い親和性の結合についてスクリーニングした。高い１ノヘルの特異的結合を丞す１つの細胞系をより詳細な分析のために選抜した。

トランスフェクションしたバルブ３Ｔ３細胞についての結合および置換の研究を、Ｋｒｉｓら（１９８７）Ｊ．　βーｉーｏｆ．　Ｃｈ９！．　２６２　：　１１２１５−１１２２０に従来記載された，Ｊ、うに、２４ウエルの組織培養皿の中で、逆用高圧液体りｔ−＋−＝′ｌ−ゲラノイーにより標識後精製した２５ｐ門の１２Ｓ１標識したボンベシンを使用して実施した（ｖｏｎ　Ｓｃ．ｈｒｅｎｃｋら（１９９０）　ＡＰａｅｒ。

Ｊ．、、　−Ｐ．ｈｙ−≦ーリｌ　、　２５９　：　Ｇ４６８　−　Ｇ４７３）。置換曲線上の各点を４回決定し、そして平均埴をプロ、トシた。膵臓および食道の組織の切片上のＮＩ’ｌＢ．　ＧＲＩ）およびエチルエステルの拮抗因子についてのＫ。値を決定づるために実施したボンへシンの置換の研究は、ｖｏｎ　ＳｃｈｒｅｎＣｋら（　＋９９０　）に記載されているようにして実施した。

Ｉ・ランスフ丁６：′７ノ４二′したＮＭＢ　１７の相対的リガ〕／ドの親和性を、非標識Ｎ肝またはＧＩＩＰ４こよる！２′Ｉ標識１−７た．ｒソー１シン（ＢＮ）の結合の定量的置換により評価した。ＩＩＭＢは標識したＢＮの置換においてＧＲＰより効力があった（　ＮＭＢについてのＫＰ　＝　２　ｎＭ　ｉ　ＧＲＰについてのＫＰ　＝４３ｎＭ）。トランスフェクションした細胞について決定されたりガントの置換性質を、表８において、Ｎ？ｌＢ−１？ならびに膵臓の豚房細胞系ＡＲ４２Ｊを発現することが知られている食道組織の切片、およびスイス３Ｔ３のＧＲＰ−Ｒに類似する性質をもつＧＲＰ−Ｒを発現することが知られている膵臓組織の切片から得られた性質と比較する。食道ｌｔＩｌｓｅの切片において観測されるように、ＮＭＢはＮＭＢ−１？を発現するトランスフェクションしたバルブ３Ｔ３細胞に結合したＩｔ５Ｉ　ＢＮの置換においてＧＲＰより効力があった。対照的に、ＧＲＰは膵臓の豚房細胞、ＡＲ４２Ｊ、またはスイス３Ｔ３細胞へのｌ！Ｊ−ボンベシンの結合のＫｍ！において、ＮＭＢより効力がある。これらの結果が示すように、研究しているｃＤＮＡは機能的ＮＭＢを好むボンベシンのレセプターをエンコードし、ここで結合性質は従来報告された食道のＩＩＭＢ優先ボンへシンのレセプターに類似する。期待するように、特定のＧＲＰ−Ｒ拮抗因子（Ｄ−Ｐｈｅ６］　ＢＮ　（　６　１３）エチルエステルはＧＲＰ優先レセプター（膵臓、ＡＲ４２Ｊ、スイス３Ｔ３）に高い親和性（Ｋ．＝　１．６〜５、３門Ｍ）で結合するが、クローニングしたＮＭＢ−Ｒを発現する食道またはバルブ３Ｔ３細胞十のＮＭＢ優先レセプターについて非常に低い親和性を有する（Ｋ．　＞］、０００ｎＭ）　（表８）。

表８＝異なるＢＮレセプターのサブタイプにおけるＧＲＰ、　ＮＭＢおよび（Ｄ −Ｐｈｅ’）　ＲＮ　（６−１３）エチルエステルの拮抗因子による１−ＢＮ結合の置換畦胸勿ヱ　Ｋｉ　（ｎＭ）桔−抗−１Ｌ　ぜ１　り伊バルブ３Ｔ３／Ｎ門Ｂ−Ｒ２４３＞１０００食道　０゜３　３０　＞１０００膵臓　３５１　１５　５．３ＡＩ＋４２Ｊ　２８７　２　２．１スイス３工３　６２　２　１　、６＊　ＧＲＰＩ−２７，ＮＭＢおよびＧＩＩＰ−Ｒ拮抗因子（Ｄ−Ｐｈｅ’）　ＢＮ　（６−１３）エチルエステルに結合するＩｘｓＩＢＮの置換を、異なるボンへシンのレセプターのサブタイプを発現する組織および培養した細胞の中で分析した。細胞系（バルブ３Ｔ３／ＮＭＢ−Ｒのトランスフェクション体、スイス３Ｔ３）についての細胞の結合の研究を、本質的にＫｒ１ｓら（１９８７）ム１９Ｕ−１２６２，１１２１５−１，１２２０に記載されているようにして実施した。組織の切片およびＡＲ４２Ｊ細胞の結合の置換の分析は、ｖｏｎ　５ｃｈｒｅｎｃｋら（１９９０）　Ａｍｅｒ、　Ｊ、　Ｐｈ　５ｉｏ１．２５９　：　Ｇ４６Ｂ−０４７３の方法に非常にＲ４Ｑする、わずかの変更を加えた、方法で実施した。

トランスフェクションしたバルブ３７３線維芽上で発現されたＮ？ＩＢ−１？の結合性質は、食道のＮ？ＩＢを好むレセプターに密接に類似し、そして膵臓の線屑細胞、スイス３Ｔ３細胞、およびＡＲ４２Ｊ細胞上で見いだされるＧＲＰが好むレセプターのサブタイプと明瞭に異なる。

実１１１律１１」（７）　ｍ　ＲＮ人ｑ朝織−ｑ分布ボンベシンのレセプターは神経の組織および神経以外の組織の両者、ならびに種々の細胞系において記載されてきている。ｃＤＮＡクローンの中にコードされたＮＭＢ（ｊＥ先ボンへシンのレセプターのサブタイプをどの細胞が発現するかを決定するために、ａ＋ＲＮＡを種々の＆［ｌ織および細胞系においてノザンブロノトハイブリダイゼーション分析により検査した。ラットの脳、嗅覚領域、食道、およびＣ６グリオーマ細胞系から分離したポリ（Ａ）　’　ＲＮＡの各々は、高いストリンジエンソーの洗浄後に存在する２つのハイブリダイゼーションするｍＲＮＡ種を含有し、これらの種はほぼ３．２ｋｂおよび２．７ｋｂの推定された大きさをもつ。両者のバンドはすべてを発現する組織の中に一緒に観察され、そして高いストリンジエンシーの洗浄後にさえ存在し、それらが同一遺伝子からの転写体であることを示唆する。対照的に、ＮＭＢ−ＲのｍＲＮＡは、各々がＧｌ？Ｐ−１’ｉのＭＲＮＡを発現することが従来示された膵臓、ＡＲ４２Ｊラット膵臓の豚房細胞系およびスイス３Ｔ３細胞から分離されたポリ（Ａ）　’　ｍＲＮＡ０試ｒ４の中に検出されなかった。肺、胸腺およびバルブ３Ｔ３細胞からの試料において、ハイブリダイゼーションするｍＲＮＡ種はＧＲＰ−ＲまたはＩＩＭＢ−Ｒのプローブにより検出されなかった。これらの結果が示すように、この研究において報告するクローニングしたＮＭＢ−ＲのｍＲＮＡは脳ならびに食道において発現される。脳内のＮｌ’ １Ｂ−ＲのｍＲＮＡは、喫味、ＮＭＢ優先ボンベシンのレセプターのための結合部位を相対的に高いレベルで発現することが報告された脳領域に局在化された。

夫癒撚■ 異なる脳領域におけるＮＭＢ−ＲおよびＧＲＰ−ＲのｍＲＮＡＮＭＢ−Ｒプローブおよびスイス３Ｔ３のＧＲＰ−１？プローブの両者を使用するラットの脳のｍＲＮＡについてのＲＮＡプロットハイブリダイゼーションの研究において、両者のボンへシンのレセプターのサブタイプは脳の中で発現されることが示された。

ラットＣＮＳの中のＮＭＢ−ＲおよびＧＲＰ−１１のｍＲＮＡの発現をｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼ一シヨン組織化学によりいっそう詳細に検査して、特定のクローニングしたＮＭＢ−ＲおよびＧｌ？Ｐ−１１遺伝子を発現する領域と、従来のリガンド結合オートラジオグラフィーの研究において脳ボンベシン結合部位を発現することが示された領域との間の相関関係を決定した。ｗａｄａら（１９９０）Ｊ、凡ｅｕｒｏｓｃｉ。１０　Ｆ　２９１７−２９３０の方法を、５ｉｔｕハイブリダイゼーシヨンについて使用した。簡単に述べると、成体の雄のマウスを４％のバラホルムアルデヒド、０．０５％のグリタルアルデヒドで潅流することによって固定した。潅流後、脳を取り出し、そして後固定溶液（４％のバラホルムアルデヒド　１０％のスクロース）の中に４°Ｃにおいて一夜入れた。切片（２５ミクロンの厚さ）をポリリジンで被覆したスライド上に取り付け、次いでプロテイナーゼＫ　（１０ｇ　／Ｍｌ。

３７°Ｃ１３０分）、無水酢酸で処理し、そして５０％、７０％、９５％および１００％のエタノールの中に連続的に浸漬することによって脱水した。

”　Ｓ　［識したセンスまたはアンチセンスのｃＲＮＡプローブ（比活性、約２　Ｘｌ０９ｃｐ鋼／μｇ）をｐＧＥ門−４プラスミトヘクター（プロメガ）から合成し、このヘクターはＳＰ６およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターの間のポリリンカー領域においてサブクローニングしたう、　）　ＮＭＢ−Ｒまたはラット　ＧＲＰ−Ｒをコードする２、０ｋｂのｃＤＮＡフラグメントを含有した。ハイブリダイゼーションを５０％のホルムアミド、０．３ＭのＮａＣｌ、１０％の酢酸デキストラン、１０ｍＭのＤＴＴの中で５５°Ｃにおいて一夜実施し、プローブの濃度は５　Ｘ　１１０６ｃｐ　／　ｍｌのハイブリダイゼーション緩衝液であった。次いで、切片を４　Ｘ５ＳＣ（１ｘｓｓｃ　：１５０ｍＭのＮａＣ１，１５ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐｌ＋７．０）および１ｍＭのＤＴＴを含有する溶液の中で室温において洗浄し、ＲＮアーゼＡ（２０ｇｇ／ｍｌ、３７°Ｃ１３０分）とインキュベーシヨンし、そして室温において漸進的により低い濃度のＳＳＣおよび１ｍＭのＤＴＴの溶液で洗浄し、２ｘｓｓｃで開始し、そして０．５のｓｓｃで１９ｊｉｌｌシた。最終の高いストリンジエンシーの洗浄を０．　Ｉ　Ｘ　ＳＳＣおよび１＋＋ＭのＤＴＴを含有する溶液の中で５５ａｘｃ３０分間実施した。スライドを５０％、　７０％、９５％および１００％のエタノールの中で脱水し、そしてβＷａＸフィルム（アマ−ジャム）に室温において３〜７日間露出した。

プローブを嗅覚領域からの環状ラット脳切片ならびに視床および視床下部の領域にハイブリダイゼーションし、ここで視床および視床下部の領域において標識したボンベシンおよびＮＭＢの結合は前の研究において優勢であった。全体で、ＮＭＢ−Ｒの発現は嗅覚および中央の視床領域において最も顕著であったが、ＧＲＰ−Ｒの発現は視床下部においてもっとも優勢であった。切片のいっそう詳細な分析は、ＪｔＭＢ−Ｒの鱈ＮＡの発現が前方の嗅覚核、蓋ひもおよび型状皮質において最高であった。さらに、多数の他の領域、例えば、付属の喫味、前頭皮質、視床核（室傍、前方背側、内側中心、外側中心、および菱外）、歯状向、アミグダロビリフォーム（ａｍｙｇｄａｌｏｐｉｒｉｆｏｒｖ）核、および背側継ぎ目は、また、ＮＭＢ−Ｒを発現した。ＧＲＰ−ＲのｍＲＮＡの発現は、交差上核、室傍核、外側嗅索の核、大形細胞の複索前核、および外側乳頭核において最高であった。中程度の発現は付属の複索の床核、外側の視床下部区域、複索上積、歯状向、アンモン角のＣＡ３野、同種皮質、内側扁桃核、および疑核において見られた。これらの結果が示すように、ＮＭＢ−ＲおよびＧＲＰ−Ｒの搦ＲＮＡは異なるラット脳領域において選択的に発現される。同様な選択的発現は他の種において見いだされるであろう。

実施−例神ヒトのＧ）ＩＰ−Ｒの生殖系列の配列を決定するために、胎盤のゲノムのライブラリーをプｌ′−１・−ブとしてスイス３Ｔ３のＧＲＰ−１７のｃ、Ｄ　Ｎ　Ａの解読領域を使用（７てスクリーニングした。

ヒ［−胎盤ゲノムのライブラリー（ストラタジーン、カリフズルニア州うジョラ）からのほぼｌＸｌ０ｈの組み換え体を、解読領域を含有する３　ｔ　ｐ　標識したスイス３Ｔ３のＧＲＰ−Ｒプローブでスクリーニングした。フィルターのハイブリダイゼーションをＤａｖｉｓら（１９８６）の従来記載された方法に従い３７°Ｃにおいて実施した。フィルターを室温において１５分間３００＋＋＋ＭのＮａＣ１，３０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．１％のドデソル硫酸ナトリウム（ＳＯ３）の中で２回洗浄し、そして５０°Ｃにおいて１５分間１５ｍＨのＮａＣｌ、１．５＋ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳの中で２回洗浄した。陽性のクローンをプラーク精製し、そしてより小さいハイブリダイゼーションする断片をｐＧＥＭ４　（プロメガ、ウィスコンシン州メディソン）の中にサブクローニングした。

ゲノムのヒトＧＲＰ−Ｒクローンの３′−未翻訳領域を同定した後、プライマーをこの領域から合成し、そして第１鎖ｃＤＮＡの合成をＤａｖｉｓら（１９８６）の従来記載された方法によりＮＣｌ−Ｈ３４５オリゴｄＴセルロース選抜ｍｌ？ＮＡからブライミングするために使用した。ＭＣｌ−８３４５細胞系はＧＲＰ応答性Ｓ　ＣＬ　Ｃ細胞系である、Ｃｕｔｔｉｔｔａら（１９８５）ハｔｕｒｅ、　３１６　：８２３−８２５を参照のこと。このライブラリーから４つの陽性クローンをプラーク精製し、そして配列決定した。　５ＣＬＣからのこれらのクローンのタンパク質解読配列を決定する１１５２ヌクレオチドは、ゲノムのヒトＧＲＰ−Ｒ配列の中に見いだされるエクソンのそれらと同一であることが発見された。この結果が示すように、ＧＩ？Ｐ−Ｒタンパク質解読配列はこの５ＣＬＣ細胞系において変更されていない。

ヒ）　ｃｐｐ−ｐｌ！ｖ読領域の配列を表２に示す、ヒ）　Ｇ１１Ｐ−Ｒは３つのエクソンの中に含有され、そして予測されたアミノ酸配列は長さがスイス３Ｔ、３マウスＧｌ？Ｐ−！？Ｍついて決定されたものに同一である３８４−アミノ酸のタンパク質をコードする。ヒトクローンから誘導されたアミノ酸配列をマウスのスイス３Ｔ３配列のそれと比較すると、９０％のアミ２ノ酸の同一性が証明された（表９において垂直の線）、マウスとヒトとの間のＧＲＰ−Ｒタンパク質のアミノ末端における保存は非常に少なかった（表９）ｅ予測されたヒトＧＲＰ −Ｒタンパク質のヒトロバシー分析（第１３図を参照のこと）は、疎水性アミノ酸の７つの領域を明らかにし、これらはＧ−プロティンがカンプリングしたレセプターに典型的な７つのトランスメンブレン構造と一致する（Ｄｏｈｌｍａｎ　ら（１９８７）　Ｂｉｏｃｈｅｎす互封１２２６　：　２６５７−２６６３を参照のこと）。また、潜在的なタンパク質のキナーゼＣのリン酸化の４つのＢｉｏｃｈｅｍ、　１６１　：　１７７−１８４を参照のこと）（表９において潜在的なリン酸化部位の上の星印）。

表９；マウスのスイス３Ｔ３１の配列）およびヒトＧＲＰ−Ｒ（下の配列）について誘導されたアミノ酸配列の比較。全体のアミノ酸の同一性は９０％であった、垂直の線で示されている。アミノ酸の上の番号をイ１した肉太の線は、７つの予測された疎水性トランスメンブレンドメインの位置を示す。星印はタンパク質のキナーゼＣのリン酸化のための部位を示す。

実施１」Ｕハ携１ンニ変馳ＮＡ（７）、ＩＩＸ的評」仇クローニングしたＮＣｌ−１１３４５ヒトＧＲＰ−ＲｃＤＮＡの機能および薬理学を評価するために、アフリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の卵母細胞にＮＣｌ−Ｈ３４５ＧＲＰ−ＲｃＤＮＡの解読領域を包含するｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写体を注入した。

製造業者（プロメガ）により推奨されるようにＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用してＣＩＩＰ−ＲのｃＤＮＡクローンから、ＲＮＩＩを転写およびｉｎ　ｖｉｔｒ。

キャップした。脱卵胞した卵母細胞を約１０ｎｇの−ＲＮＡ　／卵母細胞でマイクロインジェ’）　シｇ　：／し、そし７Ｌｕｐｕ−Ｍｅｉｒｉら（１９８９）　町旦ｒｐＡｒｃｈ、　４１３　：　４９８−５０４０）ＮＤｉ’＃液の中ニ２０″ｃに保持した。２４〜４８時間後、卵母細胞を潅流チャンバーの中に入れ、そして−６０ｅ＋Ｖの保持電位で電圧クランプした。リガンドをチャンバーに直接添加し、そしてリガンド依存性ｃ１−電流を測定した。

ナノモル濃度で適用したＧＲＰは、転写体を注入した卵母細胞における消極応答を引き出すことが示された。この応答は、ＧＲＰ−Ｈに対して特異的なｔ古抗因子、（１：Ｄ−Ｐｂｅ”）　ＢＮ　（６１３）エチルエステル）により拮抗因子；作動因子のｔｏ：ｉのモル比においてブロックされることが示された。これらのデータを一緒にすると、ＮＣｌ−１（３４５がら分離されたｃＤＮＡ＋よ、スイス３Ｔ３細胞がら分離されたもと機能的にかつ薬理学的に区別できない機能的ＧＲＰ−Ｒをコードすることが示される。

実＄１２２ノザンブロントおよびｌ？Ｎアーゼ保護分析によるＧＲＰレセプターのｍＲＮＡの発現の分析にＲＰ−１？（７）＃ｌｌ？１ＪＡ（７）発現を、５ＣＬＣ細胞系、ＮＣｌ４１３４５ニおいて、ノザンプロット分析により検査した。この細胞系における優勢なハイブリダイゼーションするｍＲ８６種は、３．１ｋｂの推定される大きさを有した。

ヒトＧＲＰ−Ｒフ゛ローフ゛は、また、スイス３Ｔ３細胞からの−ＲＮへの２つの大きさのもの（はぼ７．２ｋｂおよび３．１ｋｂ）にハイブリダイゼーションした。ＭＣｌ−Ｈ３４５において観察されたＧＲＰ−Ｒの−Ｒ１ｉＡのレベルは低く、検出の限界近くであった。ＲＮＡのプロント分析は低いが、有意なレベルのＧＲＰ−Ｒの鵬ＲＮＡを検出することができないので、より感受性のＲＮアーゼ保護のアッセイを使用して、５ｃｔｃおよび非５ＣＬＣ肺癌細胞系のパネルにおいてＧｌ？Ｐ−ＲのｍＲＮＡを検出した。

肺癌細胞系はＪ、ミンチ（旧ｎｎａ　）博士およびＡ、ガズダ（Ｇａｚｄａ）博士室しそして＆１ｌＩＩ学的に型別した。合計のＲＮＡを細胞から、Ｄａｖｉｓら（１９８６）に記載されているように、グアニジンチオソア不一トのホモジナイゼインヨンおよびＣｓＣｌ勾配の精製により分離した。このアッセイのためのプローブを、製造業者（プロメガ）の指示に従いｐＧＥＭ４の中にクローニングしたＢｇｌｌｌ−Ｈｉｎｄｌｌｌの６００ｂｐのゲノムの断片からＴ７ボリメラーゼで転写した。ＤＮＡの鋳型を５単位のＲΩＩＲＮアーゼ（プロメガ）で消化して除去した。生ずる反応における組み込まれなかったヌクレオチドを多数回のエタノール沈澱により除去し、そして生ずるペレットを１０１のトリスＨＣＩ、ｐＨ７゜４；１１のＤＴＴの中に再懸濁させた。このプローブを２．５Ｘ　ＩＯ ’ｃｐｓ／μｌの濃度に希釈した。ハイブリダイゼーションすべきＲＮＡの試料（３０μｌ）を乾燥し、そして５０μｍのハイブリダイゼーション混合物の中に再懸濁させた（２０ｍＭのトリスＨＣＩ、　ｐＨ１，４：　５００ｍＭのＮａＣｌ　：　２’＋ＭのＥ［ｌＴＡ　。

７８％のホルムアミド；　１　ｐ　Ｉ　、２．５Ｘ１０’ｃｐｍのＧＲＰ−Ｒプローブ）。

試料を８０°Ｃに２分間加熱し、そして４３°Ｃにおいて１６〜１８時間ハイブリダイゼーションした。

保護されなかったＩＮＮ＾を８８単位のＲＮアーゼＡ（ユナイテッド・ステーク・バイオケミカル）；２０ｍＭのトリスＨＣＩ、　ｐＨ７，４；　３００ｍＭのＮａＣｌ　；および１１のＥＤＴＡから成る反応において３５０μｍの最終体積で消化した。次いで反応をＳＤＳの中で０．５％とし、そして０．０５ＭｇのプロテイナーゼＫ（ＢＲＬ）を添加し７、そして３７°Ｃにおいて１５分間インキユヘーションした。次いで反応混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し、そしてエタン・−ル沈澱させた。ベレットを遠心により集め、そして５μｌの次の溶液の中に再懸濁させた；　５０μｌＭのトリス；　５０ｍＭのホウ酸塩；１１ｍＭのＥＤＴＡ；　０．１％のブロモフェノールブルー；０．１％のキシレンシアツール。試料を９５°Ｃにおいて２分間変性し、次いで６％の変性ポリアクリルアミドゲルの電気泳動にかけた。

このゲルを乾燥し、そして増強スクリーンの存在下にＸ線フィルムに対して露出した。

上で使用したＧＲＰ−Ｒプローブは２９９ｂｐのエクソン２を含むヒトゲノムのＧＲＰ−Ｒクローン（ヌクレオチド４６５−７６４　、表２）から誘導し、そして第２イントロンの中に３０１ｂｐ伸長した。したがって、このプローブはＧＲＰ−ＲのｍＲＮＡの２９９塩基の領域によりリボヌクレアーゼの消化から保護されるであろう。

ＧＲＰ−ＲのｍＲＮＡは検査した肺癌のすべての組織学的型からの細胞系の中で検出されたが、任意の１つの組織学的グループのすべての構成員がＧＲＰ−１７のｍＲＮＡを発現するわけではないことが発見された。種々の肺癌細胞系からのデータを表１０に要約する。アッセイの結果の代表的なオートラジオグラフを第１９図に示し、そして実施例２６においていっそう詳細に説明する。さらに、ＧＮＰ−Ｒのメツセージのレベルは発現する細胞系の間で変化した。発現の最高のレベルは５ＣＬＣ細胞系ＮＣｌ−Ｈ３４５において見いだされた。

表１０　：　ＲＮアーゼ保護アッセイにより決定された肺癌細胞系におけるＧＲＰおよびＩＪＭＢのレセプターのｍＲＮＡ、生ずるオートラジオグラフ上のシグナルの強さをアッセイし、そして他の細胞系に関して任意の値を割り当てた。また、実施例２６の中の説明を参照のこと。

Ｗ液朱五夫びス省Ｉｔじ２１ンヘシン１王プチドのための日　なレセプ　−の’Ｊｉ且ヱ旬Ｉ■ボンヘソン様ペプチドは、ＮＣｌ−８３４５細胞系において細胞内カルシウムの増加を誘発する。ボンへシン刺激Ｃａ”の動員化の研究を、ヒト肺癌細胞系ＮＣＴ−Ｈ３４５において、フィン（Ｑｕｉｎ）　２−フルオレセンスを使用して実施して、１または２以上のボンベシンのレセプターのサブタイプがこれらの細胞の中で活性できるかどうかを決定した。

ＮＣｌ−［３４５５ＣＬＣ細胞をＳＩＴ培地（ＲＰＭＩ　１６４０．　（ＧＩＢＧＯ）　１１０ｍＭのｕＥＰＥｓ　（ｐＨ７，４）および３０ＭＭのセレン酸ナトリウム、５６　ｇ　／ａｌｌのインスリン、および１０Ｍｇ／ｍｌのトランスフェリン）の中で培養した。

細胞を０．０１５ＭのＮａＰＯａ、　０．１５ＭのＮａＣｌ、　０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、　ｐｌ＋７．４の中で３回洗浄し、そしてＳＩＴ培地の中で１回洗浄した。洗浄した細胞をＳＩＴ培地の中にｌＸｌ０’細胞／ｓｌで懸濁させた。これらの細胞を５μＭのフィン−２−アセトキシメチルエステル（フィン−２；モレキユラー・プローブ、オレゴン州エウジーン）と３７°Ｃにおいて９０分間インキユヘーションした。インキュヘーシヲン後、細胞を１回洗浄し、そしてフィン−２を含まないＳＩＴ培地の中にｌＸｌＯ７細胞／ｍ＋で再！！濁させた。はぼ５Ｘ１０６の細胞を沈澱させ、そしてニルカイ・ラブ・システム（Ｅｌｋａｙ　Ｌａｂ　Ｓｙ＋ｔｅｍｓ）のアクリル「ウルトラ−［ＩＶＪの４側面の１０１ｗ−のクヘノトの中の２１のＨＥＰＥＳＩｌ衝化生理的塩順化生理的塩類溶液のＮａＣｌ、５ｍｌ’ｌのＭＣＩ、１ｍＭのＣｕＣＩｘ、　１ｓ＋ＭのＭｇＣｈ、５１１−のグルコース、および２０ｍＭのＩＩＥＰＥｓ、　ｐＨ７，４）の中に再懸濁させた。

パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）１．５Ｂルミネセンス分光光度計を使用して、３３９ｎ−の励起波長および４９２ｎｍの放射波長（スリット＝５ｒｖ）で、リガンドの添加後の蛍光の変化を測定した。タペットの中の細胞を一定温度（３７’Ｃ）に保持し、そして磁気攪拌機で連続的に懸濁させると同時に蛍光の測定を実施した。安定な蛍光の読みが得ら罎またとき、通常５分以内、リガ：／ドを細胞に添加し、た。インヒビター　［Ｉｆ−Ｐｈｅ＆］Ｂｌ−（６−Ｉ（）エチルエステルをリガンｌ′の添加の５分前に細胞に添加した。合計の〔Ｃａ”　）Ｈを決定するために、細胞を１０μｍの１０％のトリトン−Ｘの添加により溶解してＦ　１ｌａｘを得た。次いで、　１００７／ｌの０．４ＭのＥＧＴＡをクヘノトに添加して、蛍光のバ、クグラウンＦ　（Ｆｍ１ｎ　）を決定した。［Ｃａ”°］、は蛍光の測定値から代：を使用して計算した。

ボンベシンおよび）ｔＭＢの両者は、これらの細胞において直ちのカルシウムの応答を引き出した（第１４図）。いくっがの実験において、ＮＭＢにより仲介された細胞内カルシウムの増加はＴｙｒ’−ボンへシンにより引き出されるものより首尾一貫していっそう持続された。細胞内カルシウムの増加は＜１ｎＰの濃度のＮＭＢ作動因子において検出され、そし、てＮ門ＢおよびＴｙｒ’−ボンベシンの両者について約１００ｎＨにおいて最大であっ人・。いずれかのペプチド単独は１〜１０ｎＨのレベルにおいて検出ｉＪ能な応答を引き出した（第１５図）。これらの観測が示すように、カルシウム動員化の応答の少なくとも一部分は、食道ＮＭＢ−Ｒに薬理学的に類似する、高い親和性でＮＭＢに結合するボンへジンレセプターのサブタイプにより仲介される。

第１６図が示すように、Ｔｙｒ’−ボンへシンにより引き出される細胞内カルシウムの増加のほぼ５０％は、ＧＲＰレセプター特異的拮抗因子であるＣＤ−Ｐｈｅ’）　ＢＮ　（６−１３）エチルエステルにより３０％Ｍの濃度においてブロックされるが、ＢＮ仲介されるカルシウムの応答のそれ以りの阻止は１０００〜１０．０００ｎＭの拮抗因子の添加後に完結する。ＮＭＢが引き出したカルシウムの応答は拮抗因子に対して不感受性であった（第１６回に示すように、＞　ｉｏｏｏｎＭの濃度において力ルシウ１、の応答に対して最小の作用）。これらのデータがさらに示すように、ＮＣｌ−１１３４５においてボンへシン様ペプチドに対するカルシウムの応答は少なくとも２つの明確なレセプタ〜により仲介され、そしてヒトＧＲＰ優先ボンベシンのレセプターおよびＮＭＢ優先ボンベシンのレセプターの両者は発現され、そし、てヒト肺癌細胞の中で機能的である。

ボンへシン様ペプチドはヒト５ＣＬＣの中で発現され、そしてオートタリン成長因了として機能すると考えられる。これらの結果が示すように、Ｓ　ＣＬ　（：細胞系ＮＣｌ−Ｈ３４５は２つの薬理学的に明確なボンベシン−ペプチドレセプターを発現し、それらの１つはＧＲＰを優先し、そして拮抗因子であるＣＤ−Ｐｈｅ６）　ＢＮ　（６１３）エチルエステルによりブロックされ、そして他方はＮＭＢ優先であり、そしてその拮抗因子によりブロックされなかった。検査した肺癌細胞系のサブセットはいずれかのレセプターまたは両者のレセプターを、感受性のＲＮアーゼ保護アッセイにより検出可能なレベルで発現させるが、そのレベルはしばしば合計のＲＮＡのノザンプロット分析による検出のレベルより低い（下の説明、実施例２６を参照のこと）。ＧＲＰ−ＲおよびＮＭＢ−ＲのｍＲＮＡの低いレベルは、５０００レセプター／細胞より小を示した肺癌細胞系におけるボンへシンリガンドの結合の研究と一致する。

尖施匪Ａ見上−８１寸ブタ−の分離ボンベシン刺激したカルシウムの動員化の性質は、■より多いボンへシンのレセプターのサブタイプがＮＣｌ−０３４５の中に存在することを示した。こうして、明確なヒトＧＲＰ−ＲおよびＮ？ＩＢのレセプターのｃＤＮ＾クローンは、プローブ゛とじて、ネズミのスイス３Ｔ３　ＧＲＰ−ＲｃＤＮＡ。

を参照のこと、を使用して検出可能であるべきである。ヒトＧＲＰ−Ｒの分離は実施例２０に記載されている。簡単に述べると、ヒトゲノムのＮＭＲ−１１クローンを胎盤および末梢血液のゲノムのライブラリーの両者から分離して、ＮＣｌ −８３４５腫瘍細胞から誘導されたレセプターのｃＤＮＡクローンの配列を、それらの正常のゲノムの相手と比較した。

り圀力み一机よｐ■ｙ０ノ□ワ二４（ハ）皇ヒト胎盤ゲノムのライブラリー（スＩ・ラタジーン、カリフォルニア州うジョラ）およびヒト末梢血液ゲノムのライブラリー（プロメガ、ウィスコンシン州マディソン）からのほぼｌＸｌ０ｈの組み換え体を、解読領域を含有するｉｚｐ標識ラッうニューロメジンーＢプローブでスクリーニングした。ヒトＧＲＰレセプターの分離のための前述の一般的手順（実施例２０参照）に従った。

ヒトニューし１メジンＢレセプターのｃＤＮＡを得るために、解読領域を直ちにフランキングする５′−および３′　−未翻訳ドメインからの配列に対して相補的である、オリゴヌクレオチド（５′センスプライマー：　５’　ＧＴＧＧＧＣＧＴＴＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧ　３’　：　３’アンチセニ／スフ゛ライマー：　５’　ＧＴＴＣＴＣＴＣＣＡＧＧＴＡＧＴＧＡＧＴＴ　３　’　）を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーとして使用するために合成した。次いで、これらのプライマーを、Ｐｃｔ？において、ポリ−Ａ　４−　ＮＣｌ−８３４５ｍＲＮＡから逆転写された２０％ｇのヘキザマープラ・イム化ｃＤＮＡ鋳型とともに使用した。緩衝液およびヌクレオチドをギーンアンブ（ＧｅｎｅＡｍｐ）　ＰＣＲキット（パーキン・エルマー）の中に準備した。サイクリングの条件は次の通りであった：９４°Ｃ，１分；６０’Ｃ，１分；７２°Ｃ，２，５分、４０ザイクルについて。生ずる生成物の末端をＴ、ＤＮＡポリメラーゼで平滑にし、そし、７５′末端をＴ、ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化して、ｐＧＥＭ −４の５′脱リン酸化されたＳｍａ　１部位の中へのサブクローニングをｊｉＪ能とし、た。陽性のコ１に一を→ノト二１−ロメジンーＢレセプターのプローブへのハイブリダイセーンゴンにより同定した。

２つのクローンを配列決定した。

ヒトＮ門Ｂレセプターのゲノムのクローンの全体のアミノ酸の解読配列を、両者の鎖について、遺伝子特異的合成オリゴヌクレオチドのプライマーを使用して配列決定した。表４参照。ライスコンシン大学のジエ不ティノク・グループの配列分析ソフトウェアのパンケージ（ヒトロバシーの分析のためのペプロソトプログラム）およびＶＡＸコンピューターを使用して実施した。Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（１，９８４）　Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓユ　１２：　３８７−３９５を参照のこと。ヒトロバシーの分析を第１７図に示す。

ヒ）　ＧＲＰ−Ｒの解読領域は３つのエクソンの中に含有されており、そして予測されたアミノ酸配列は前述したように３８４−アミノ酸のタンパク質をコードする。ヒｌ−ＮＭＢ−１？は、また、３つのエクソンの中に含有され、そして予測されたアミノ酸配列は３９０−アミノ酸のタンパク質をコートする。ＭＣｌ− ８３４５から分離された２つのＮＭＢ−ＲのｃＤＮＡクローンの分析により、これらのクローンのタンパク質解読領域の配列はヒトゲノムのＮＭＢ−Ｒ遺伝子の中に見いだされるエクソンの配列と同一であることが明らかにされた。正常細胞系および５ＣＬＣ細胞系からのＧＲＰ−Ｒ配列の同様な比較は、上に報告されており抗体同一の同一性を示す。こうして、ｌ’；ＲＰ−ＲまたはＮＭＲ−Ｒのタンパク質の解読配列のいずれも、この５ＣＬＣ細胞系において体細胞突然変異により構造的に変更されない。

占−ヒー８町−＆圭へｉｕｓ＋見１升２し分圧り遺市４７」す勿１斤−ヒｌ−ＧＲＰ−ＲおよびＮＭＢ−Ｒの解＠領域の両者は、それらの１歯類の相手と高いアミノ酸の同一性を示す（ＧＲＰ　Ｒ９０％の同一性、ＮＭＢ　Ｒ８９％の同一性）。予測されたＧＲＰ−Ｉ！およびＮＭＢ−Ｒのタンパク質のヒドロパン−の分析は疎水性アミノ酸の７つの領域明らかにしく表２および４：表１１、ボックス）、これらはＧ−タンパク質がカップリングしたレセプターに典型的な７つのトランスメンブレンの構造と一致する。ヒ）　ＧＲＰ−ＲおよびＮＭＢ−１１の配列を比較すると、アミノ酸！ノベルにおいて５５％の同一性を示す（垂直線、表１１）。また、ＧＲＰ−ＲおよびＮＭＢ−Ｒの両者の中に潜在的なタンパク質キナーゼＣリン酸化の２つのコンセンサス部位が存在する（表１１において破線の輪郭のボックスは潜在的なリン酸部位を囲む）。興味あることには、タンパク質解読領域を分割Ｖる２つのイントロンはＧＲＰ−ＲおよびＮＭＢ−Ｉｔの両者の遺伝子の中の類偵する位置に見いだされ（表１および４）、両者のレセプター遺伝子が共通の祖先の複製により発生したことを示唆する。

ヒトＧＲＰ−ＲおよびＮＭＢ−Ｉｌｌのいくつかの構造の特徴は注目に値する。

ヒト［；ＩＩＰ−ＲおよびヒトＮＭＢ−Ｒの予測されたアミノ酸配列の比較（表ＩＩが示すように、第３トランスメンブレンドメインはこれらの２つのレセプターのサブタイプの間に極めてよく保存される；この領域における９５％の同一性／全体のアミノ酸配列について５５％の同一性）。

対照的に、このドメインは、他の既知のＧ−プロティンがカップリングしたレセプターと比較したとき、とくによく保存される（＜２５％の同−一性）。これらの結果が示唆するように、この領域はりガントの結合に関係することができるか、あるいは同様な密接に関係するレセプターのサブタイプの間で期待されるが、Ｇ−プロティンがカップリングしたレセプターの族すべての構成員に対して共通ではない他の機能的性質に関係することができる。ＮＭＢ−ＲおよびＧＲＰ−１＋のゲノムの配列は、最初のイントロンが両者の遺伝子の中の同一位置に位置し、第３トランスメンブレンドメインに対して直ちにカルボキシ末端であることを示す（表２および４　；　Ａｓｐ　ヤＩＴｙｒ）。いくつかの他のイントロンを含有するＧ−プロティンがカップリングしたレセプターの遺伝子、例えば、物質Ｐのレセプター、Ｄ２およびり、ドパミンのレセプター、およびオプシンは、また、この位置にイントロン、例えば、Ａｓｐ　Ａ！Ｊ−Ｔｙｒを含有する。この保存されたｆｌＩｍの特徴は、Ｇ−プロティンがカップリングしたレセプターの部材のこれらの構成員が共通の祖先から発生したことを示唆する。

表１１：ヒトＧＲＰ−Ｒ（上の配列）およびヒトＮＭＢ−１？　（下の配列）から誘導されたアミノ酸配列の比較。全体のアミノ酸の同一性は５５％であった（垂直線で示す）。陰影を施したボックスは、７つの予測された疎水性トランスメンブレンドメインの位置を示す。破線の輪郭のボックスはタンパク質キナーゼＣリン酸化の保存された潜在的部位を囲む。

９７８；！？　二ニヱミた芝×ヌ組量ｎ貫例クローニングしたＮＣＩ−）１３４５ヒトＧＲＰ−ＲおよびＮｌ’１Ｂ−Ｒの機能的性質および薬理学を評価するために、ＮＣＩ−）１３４５のＧＲＰ−Ｒまたは＋ＩＭＢ−１２のｃＤＮＡの解読領域を包含するｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写体をアフリカッメガエルの卵母細胞に注入した。

製造業者（プロメガ）により推奨されるようにＴ７またはＳＦ３　ＲＮＡポリメラーゼを使用して、ＲＮＡをＧｌ？Ｐ−ＲおよびＮＭＢ−ＲｃＤＮＡクローンからｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写しそしてキャップした。脱卵胞した卵母細胞にほぼ１０ｎｇのｍＲＮ＾／卵母細胞をマイクロインジェクションし、そしてこれらをＮｌ）？Ｗ液（９６ｎＭのＮａＣｌ、２！ＩＭのＫＣＩ、１　ｄの−ｇｃ１ｇ＋　５　ｍＭのＮａ’　ＨＥＰＥＳ、　１．１３＋ＭのＣａＣＩｔ）の中で２０°Ｃに保持した。２４〜４８時間後、卵母細胞を潅流チャソバ−に入れ、そして６０− νの保持電位で電圧クランプした。リガンドをチャンバーに直接添加し、そしてリガンド依存性ＣＦ電流を測定した。

はぼ］ＯｎｇのＧＲＰ−１１転写体を注入した卵母細胞において、１０−’Ｍの濃度で適用したＧＲＰは１０”　ＭのＮＭＢに対する応答より大きさ大きい消極応答を首尾一貫して引き出した（第１８Ａ図）。この応答はＧＲＰ−Ｈに対して特異的な拮抗因子である（Ｄ−Ｐｈｅ”３　ＢＮ　（６１３）エチルエステルにより、第１８Ａ図に示すように、拮抗因子二作動因子の１０：Ｉのモル比でブロックされた。対照的に、１ｎｌＢ−１？転写体を注入した卵母細胞は、等しい濃度のＧＲＰに対するより１０−＠ＭのＩＩＭＢに対して大きい応答を示した。ＮＭＢ−ＩＩを注入した卵母細胞の応答は、ＧＲＰレセプターに対して特異的な拮抗因子である（Ｄ−Ｐｈｅ’）　ＢＮ　（６−１３）エチルエステルによりブロックされなかった（第１８Ｂ図）。これらの結果は１歯類のボンベンンのレセプターのサブタイプの前の研究と−敗する６ＮＣＩ−１１３４５から分離されたり１゛】−コングしたＧｔＩＰ−ＩｔおよびＮＭＩ’ｌ−１？の卵母細胞の発現の研究は、完全なＭＣｌ−Ｈ３４５細胞の中でボンへシンペプチドの作動因ｔにより引き出されたＣａ”の応答の性質と−敗し２、ここでボンへシンに対する拮抗因子感受性応答および拮抗因子不感受性ＮＭＢの応答の両者が観測された（第１４図）。

ボンベシンペプチドの作動因子の反復した適用は、アフリカッメガエルの卵母細胞の中で発現されたＧＲＰ−ＲまたはＮＭＢ−Ｒを通して仲介された応答、あるいはＭＣｌ−８３４５において観察されたボンへシンに対するカルシウム移動化の応答の急速な脱感作を生ずる。５ＣＬＣの中のボンベシンレセプターの機能の前の研究において、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫ−Ｃ）を活性化するホルポル化合物ＰＭＡは、５ＣＬＣ細胞系ＮＣｌ−Ｈ３４５において細胞内Ｃａ”濃度に作用をもたなかったが、ボンへシン刺激の細胞内Ｃａ”の増加を弱くした。リガンドによるスイス３７３　ＧＲＰレセプターの刺激後の早期の細胞の応答は、ＰＫ −Ｃのための８０ｋＤａのタンパク質基質のボンへシン刺激リン酸化により証明されるように、タンパク質キナーゼＣの活性化を含むことが証明された。

これらの観察を一緒にすると、示唆されるように、ボンへシンレセプターはレセプターの活性化後にレセプタータンパク質の中に存在するＰＫ−Ｃ認識部位においてリン酸化され、そしてこれらの部位のリン酸化は引き続（活性化に対してレセプターを脱感作することができる。顕著なことには、２つのコンセンサスＰＫ −Ｃリン酸化部位は、ヒトＧＲＩ’−ＲおよびＮＭＢ−Ｒの両者の配列の中に、細胞内であることが予測されたタンパク質のセグメント（第３細胞質ループおよびカルボキシ末端のドメイン）において保存される。

これらの部位の一方または両者のＰＫ−Ｃ仲介リン酸化は、レセプターを一時的に脱感作するメカニズムを提供することができる。これらの部位を変更するためのＧＲＰ−ＲｃＤＮＡおよびＮＭＢ　ｃＤＮＡの部位特異的突然変寮へ発を使用 −（−る研究は、下の実施例２Ｈに記載されている。

丈顛７β 肺Ｍ独−□□□車へ−ＮｆｉＬハ列峠Ｕ至発］（此Ｊｕ膨陣則Ａ二」１■１の勿訴ＮＣｌ−８３４５肺癌細胞は機能的なＧＩＩＰ−ＲおよびＮＭＢ−ｔ＋の両者を発現するので、他の肺癌細胞系のパネルにおける両者のレセプターについての発現のパターンをまた検査した。　ＧＲｒ’−ＲおよびＮＭＢ−ＲのｍＲＮＡはＮＣｌ−１！３４５のｍＲＮＡにおいて比較的希な転写体であり、好ましくは長いオートラジオグラフィーの露出後にＲＮＡプロット分析により検出可能である。

低いが有意なレベルのＧＲｒ”−ＲｍＲＮＡおよびＮＭＢ−ＲｍＲＮＡを検出するために、実施例２２に記載するように、いっそう感受性のＲＮアーゼ保護の分析を使用して、肺癌ｍＲＮＡ試料をこれらのタンパク質のレセプターの発現について分析した。

ム太ｚ１旦ヱ上分狐合計のＲＮＡ　（１０μｇ）をアガロース／ホルムアルデヒドゲルの電気泳動により分割し、そしてＤａｖｉｓら（１９８６）の方法を使用してニトロセルロース膜にプロッティングした。８０°Ｃにおいてベーキングした後、膜を全体の解読領域を含有する３ｔｐ標識したヒトベーターアクチン断片にハイブリダイゼーションさせた。プロットを高いストリンジエンシーにおいて洗浄した（６５°Ｃ，１５ｍＭのＮａＣ１，１，５ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、各々１５分の２サイクルについて）。

叩ヱニ叉促１□□□況折このアッセイはＧＲＰ−Ｒ転写体について前述した手順に従い実施した。

肺癌細胞系はＪ、ミンチ（Ｍｉｎｎａ）博士および＾、ガズダ（Ｇａｚｄａｒ）博士から入手した。合計のＲＮＡをＤａｖｉｓら（１９８６）に従いそして前述したように、グアニジンチオシアネートのホモジナイゼイションおよびＣｓＣ１勾配の精製により分離した。ＮＭＢ−Ｒプローブは４００ｂｐのＨｉｎｄｌｌＩゲノム断片であった。断片をｐＧＥＭ−４の中にクローニングし、そして製造業者（プロメガ）の指示に従い転写した。ＤＮＡの鋳型を５単位のＲＱＩＲＮアーゼ（プロメガ）で消化して除去した。生ずる反応において組み込まれなかったヌクレオチドを多数回のエタノール沈澱により除去し、そして生ずるベレノ１〜を１０ｍＭのトリスＨＣＩ。

ｐＨ７，４；　ｌ　ｄのＤＴＴＯ中に再懸濁さセた。このプローブを２．５　Ｘ　１０’ｃｐｓ／μｍの濃度に希釈した。ハイブリダイゼーションすべきＲＮＡの試料（３０μｇ）を乾燥し、そして５０μＩのハイブリダイゼーション混合物の中に再懸濁させた（２０ｄのトリスＨＣＬ　ｐＨ７，４；　５００ｎ＋ＭのＮａＣ１；　２ｍＭのＥＤＴ＾ニア８％のホルムアミド；　ｌ　７１１　、　２．５Ｘ１０ｓｃｐｍのＮＭＢ−Ｒプローブ）、、試料を８０’Ｃｆ、１ｍ２分間加熱し、そしテ４３°Ｃにおいて１６〜１８時間ハイブリダイゼーションした。

ＲＮアーゼ保護の分析乙こおいて使用したＮＭＲ−Ｒプローブは、第２インドＩＪンの一部分を含有しそして第３エクソンの中に２１９ｂｐ　（ヌクレオチド７７Ｌ−９９０、表４）伸長した、ヒトゲノムのＮＭＢ−Ｒクローンのほぼ４００ｂｐの１ＩｉｎｄｌＩｌ断片であった。したがって、プローブはＮ門Ｂ−ＲｍＲＮへの２１９塩基の領域により保護されるであろう。

このアッセイの結果を示す代表的なす−　１−ラジオグラフは第１９図（第１９Ａ図、ＧＲＰ−Ｒ、第１９８図、ｌｌｆＭＢ−Ｒ）に示されており、そし２で検査し、たずべての肺癌細胞系からのデータは表１０に要約されている。

ＧＲＰＲｍＲＮＡは、検査し７た肺癌のすべての組繊学的型からの１１細胞系のうちの１０において検出さ才また。すべての５ＣＬＣ細胞系がＧＲＰ−Ｒを発現するわけではない（７のうちの４）。さらに、ＧＲＰ−ＲｍＲＮＡのレベルは発現する細胞系の間で変化した。発現の最高のレベルは５ＣＬＣ細胞系ＮＣｌ−１１３４５の中に見いだされた。Ｎｌ’１Ｂ−１１’の発現は２２の肺癌細胞系のうちの５つにおいて発現され、最高のレベルはＮＣＩ−）１２０９において見いだされた。レセプターのサブタイプの発現は他のサブタイプの発現を排除しなかった。ＳＣ１，Ｃ細胞系ＮＣｌ−Ｈ３４５およびＮＣ［−Ｈ２Ｏ２の両者はＧＲＰ−ＲおよびＮＭＢ−Ｒの両者のｍＲＮＡを発現する。

ヒト肺癌細胞の中の成長ＵＮ節遺遺伝の構造の分子遺伝学的研究は、２エンコードされたタンパク質の調節または機能を変更する体細胞突然変異または遺伝子の欠失の証拠をしばしば示した。５ＣＬＣ細胞系ＮＣｌ−Ｈ３４５から分離されたいくつかのＧＲＰ−ＲおよびＮＭＢ−ＲｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、タンパク質解読領域を通してこれらのレセプターのための代表的なゲノムのクローンの配列と同一である。こうして、肺癌細胞において観察されたＧＲＰ依存性の成長の刺激は、ＧＲＰ−Ｒタンパク質またはＮＭＢ−Ｒタンパク質における構造の変化を必要としない、すなわち、天然のレセプターが存在しそして発現される。

その代わり、ボンへノン様ペプチドのレセプターのりガント依存性活性化により発生し５た、正常の細胞内有意のにより、悪性細胞を成長するように刺激することができるようにいっそう思われる。多数の異なる推定上のＧ−プロティンがカップリングしたニューロペプチドのレセプター、例えば、パオプレシン、ブラディキニン、コレサ、イトキニン、ガラコン、およびニューロテンシンは５ＣＬＣにおいて細胞内カルシウムを一時的に増加することができることが報告された。

前の研究が示すように、個々の５ＣＬＣ細胞系は特定のニューロペプチドに応答して大きい不均質性を有するが、少なくとも１つのニューロペプチドに応答して細胞内カルシウムを増加する能力をもつおいうことにおいて大きい類似性を有する。これらのニューロペプチドのためのレセプターはすべてのＧ−プロティンがカップリングされており、そして５ＣＬＣの成長または細胞の経済性に対して重要であることがある、同様なシグナルの形質導入経路を潜在的に活性化する。

拮抗因子（Ｄ−Ｐｈｅ’）　ＢＮ　（６１３）エチルエステルは、５００ｎＭの濃度において、ＮＣｌ−１１３４５ｓｃＬｃ細胞の中で５０ｎＨの（Ｔｙｒ’）　ＢＮにより引き出されたカルシウムの応答を部分的にのみ阻止し、これは拮抗因子感受性ＧＲＰ−Ｒおよび比較的不感受性のＮＭＢ−Ｒの両者によりボンへシンの応答が仲介されるという、分子遺伝学の研究からの結論と一致する。非常に高い濃度の拮抗因子（１０ｎＭ）は５０ｎＨの（Ｔｙｒ’）　ＯＮに対するＮＣｌ−Ｈ３４５のカルシウムの応答を完全にブロックすることができるが、同様な高いレベルの拮抗因子は同様な環境下でアフリカッメガエルの卵母細胞の中で単独で発現されたクローニングしたＮＭＢ−Ｒから引き出された応答をブロックしないことに注意すべきである。

この感受性の差についての説明は現在明らかでない。ある方法におけるＧＲＰ− ＲおよびＮＭＢ−ＩＩの共発現は、ＮＣｌ−Ｈ３４５細胞の中のＣＴｙｒ’　）ＢＮに対する）ｉ？ＩＢ−１’！仲介のカルシウムの応答の拮抗因子の感受性を多分増加する。　ＧＲＰ−ＲおよびＮＭＢ−Ｒの両者を発現する細胞の中のボンへノンペプチドにより引き出される応答の性質の追加の研究は、２つのレセプターが独立に応答を発生するか否か、あるいはいくつかのより複雑な方法で相互作用するか否かを決定するであろう。

ＧＲＰリガンドの発現は５ＣＬＣ細胞系に制限されるが、ＧＲＰ−ＲおよびＮＭＲ−Ｒ霧ＲＮＡの発現はＳ　ＣＬ　Ｃ肺癌細胞系に限定されない。これらの非ＳＣＩ、Ｃ細胞系はプレプロＧＲＰ　＠ＲＮＡを発現しないので、ＧＲＰ−Ｒのオートクリン成長刺激はこれらの非５ＣＬＣ細胞系において不可能であるように思われる。ボンへシン様ペプチドのレベルの増大はヘビースモーカーの気管支の分泌物の中に認められてきている。　ＧＩｌｉＰを発現することが知られている肺の中の他の細胞、例えば、肺の内分泌細胞により合成されるボン−・シン様ペプチドはバラタリンの方法で作用して、ボンへシンのレセプターを発現するいくつかの非ｓ　ｃ　１．ｃ　ＩＩｌ瘍の成長を刺激するようである。ＧＲＰ−Ｒの発現は、多分、これらの特定の非５ＣＬＣｉｌ瘍の病因におけるある段階において重要である。これらの挿瘍の逆転またはブロックは、ここにおいて入手可能となった種々の試薬を治療的に投与すると、生成することができる。

ボンへシン依存性成長を示すと報告された少なくとも１つの５ＣＬＣ系０１ｃＩ −）１４１７）は、ＧＩＩＰ−ＲまたはＮＭＩＩ−Ｒについて検出可能なａ＋ＲＮＡを発現しなかった。これはＧＲＰ−Ｒおよび／またはＮＭＢ−ＲｌｌＲＮＡが存在するが、ＲＮアーゼ保護アッセイによる検出のレベルより低いという事実のためであろう。別の説明は、これらの細胞がまだ同定されてきていないボンへシンのレセプターのサブタイプを発現することである。このようなレセプターを分離するためのプローブはここにおいて提供され、そしてそれらの使用方法は、例えば、実施例２９に記載されている。

尖癒桝銘９−Ｒ」門ニーＲ結４ｉ　）１１旦ユ」えヂｐ二ンζＪ彎１矢Ｌ〕喝づ都嘴謬書１ｉｎ　ｖｉｔｒｏまたは部位特異的突然変異誘発の方法は、標準の参考文献、例えば、Ｓａ＋ｗｂｒｏｏｋら（１９８９）またはＡｕ５ｕｂｅｌら（１９８７および補遺）、それらの各々をここに引用によって加える、に記載されてＬ）る。突然変異誘発はレセプターの種々の異なる活性および機能の分析に向けることができる。とくに、翻訳後の修飾部位の突然変異誘発は、例えば、種々の活性へのグリコジル化の効果を決定するために重要である。融合タンパク質は標準の技術、典型的には組み換え法により作られるであろう。他のＧ−プロティン結合レセプクーの同定されたリン酸化部位に対して相同性のセグメントの突然変異誘発または置換は実施されるであろう。問題の活性は、結合の結合、Ｇ−タンパク質の連鎖、リン酸化活性、およびＣａ−のキレート形成を包含する。各活性のための標準のアッセイは既知であり、そしてそれらと相関関係をもつ構造の特徴を特異的に同定するために使用されるであろう。

実美朋毅柑Ｍｌレセプターｑ分離本発明は、ボンへシン様ペプチドのための追加のレセプターのための少なくとも４つの全長のプローブを提供する。とくに、マウスＧＩ？Ｐレセプター、ラットニューロメゾインＢレセプター、およびヒトＧＩ？ＰおよびＮＭＢレセプターが提供される。これらの核酸またはその断片は、単独であるいは組み合わせて使用して、他のｏＮＡｓを種々のレベルの相同性を有する配列についてスクリーニングすることができる。とくに、第３トランスメンブレンセグメントはボンベシン捧ペプチドのための種々のレセプターの間で高い相同性を示したが、他の断片をまた使用することができる。ＥｃｏＲＩ消化したヒトゲノムのＤＮＡへのＧＲＰ −ＲおよびＮＭＢ−１？プローブの低いストリンジエンノーのハイブリダイゼーションは少なくとも６つの新規な断片を示し、これらの断片はいずれかあるいは両者のプローブにハイブリダイゼーションするが、早期のに同定されたヒトＧＲＰ−ＲまたはＮＭＢ−Ｒ遺伝子ではない。第２０図参照。これらの断片は、ボンへシン様ペプチドのための追加のレセプターのサブタイプのエクソンをエンコードするようである。ゲノムクローニング、配列決定、および発現の分析は、上で通用したように、これらのハイブリダイゼーションする断片の性質を確立するであろう。

１５μｇのヒトゲノムのＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、そして断片を電気泳動により分割し、そしてニトロセルロースに毛管的に移した。ニトロセルロースのフィルターを約３００ｃｐｍ／ｐｇの比活性にエンタ翻訳により標識したマウスＧＲＰ−ＲのｃＤＮＡプローブ（ｃＤＮ＾の全体のオープンリーディングフレームからなる）にハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーション緩衝液は４０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ，２０ｍＭのトリス、１×デンハルト溶液、２０／／ｇ／ｍｌの変性したサケ精子ＤＮ＾、１０６ｃｐｍ／ｍｌの変性標識したプローブであった。ハイブリダイゼーションを一夜３７゛Ｃにおいてインキュベーションした。

フィルターを２　Ｘ５ｓｃ、　０．１％の５ＤＳＯ中で室温において２回洗浄し、そして１５分間０．ｌＸ５ＳＣ，０，１％のＳＯ５の中で３７°Ｃにおいて２回洗浄した。プロットをＸＡＲ−５フイルムに数日間露出した。６つの新しいバンドが検出された、第２０図参照。

フィルター上の陽性のハイブリダイゼーションの結果に基づいて、ライブラリーのスクリーンのための条件を決定し、そしてクローンを分離した。１つの分離されたクローンの配列を表１２に示す。ヌクレオチド配列を配列識別番号；９としてエンターし、そして対応するアミノ酸配列は配列識別番号ｉ１０である。このレセプターの遺伝子の配列はヒ）　ＲＩＢＰと約６０％のヌクレオチドの相同性を有し、そしてその対応するアミノ酸配列は約５０％のアミノ酸配列の同一性を有する。表１３は２つの間のアミノ酸配列の比較を示す。

表１２：ヒｌ−１？３１１Ｐのヌクし一メ（１配列、、准定コード領域はヌクし・オチド１７２にて開始する開始コドン及びヌクレオ（ド１３７１で終わる終止コドンＵＧＡを有する。

Ｉ　ＧＡＡＡＣＡＣＡＩ”；Ａ　ＡＣＴＧＭＧＣＭ　ＡＧＧＡＧＴＡＴＣＴ　ＧＧＡＴＧＴＣＴＴＧ　ＧＡＴｒＴｒＣＴＴＣ５１ＣＣＡＴｒＣＴＧＴＴ　ＣＴＧＴＴＣＴＧＴＴ　ＣＴＣＣＴＡＡＴＡＣＣＡＴＣＴＣＧＴｒＡ　ＣＴＡＧＡＣＧＴＡＧｌｏｌ　ＧＣＡＴＴＧＧＡＣＧ　ＴＧＡＣＡＡＴＣＡＡ　ＣＴＧＣＡＴＴＴＧ八　八ＣＴＧＡＧＡＡＧＡ　ＡＧＡＡＡＴＡＴｒＡ１５１　ＡＡＧＡＣＡＣＡＧＴ　ＣＴＴＣＡＧＡＡＧ八　八ＡＴＧＧＣＴＣＡＡ　ＡＧＧＣＡＧＣＣＴＣＡＣＴＣＡＣＣＴＡＡ２０１　ＴＣＡＧＡＣＴＴｒＡ　ＡＴＴＴＣＡＡＴＣＡ　ＣＡＡＡＴＧＡＣＡＣＡＧＭＴＣＡＴＣＡ　ＡＧＣＴＣＴＡＴＧＧ２５１　ＴＴＴＣＴＡＡＣＧＡ　ＴＡＡＣＡＣＡＡＡＴ　ＡＡＡＧＧＡＴＧＧＡ　ＧＣＧＧＧＧＡＣＡＡ　ＣＴＣＴＣＣＡＧＧＡ３０１　ＡＴＡＧＡＡＧＣＡＴ　ＴＧＴＧＴＧＣＣＡＴ　ＣＴＡＴＡＴＴＡＣＴ　ＴＡＴＧＣＴＧＴＧＡ　ＴＣＡＴＴＴＣＡＧＴ３５１　ＧＧＧＣＡＴＣＣＴＴ　ＧＧＡＡＡＴＧＣＴＡ　ＴＴＣＴＣＡＴＣＡＡ　ＡＧＴＣＴＴＴＴｒＣＡＡＧＡＣＣＡＡＡＴ４０１−　ＣＣＡＴＧＣＡＡＡＣＡＧＴＴＣＣＡＡＡＴ　ＡＴＴＴＴＣＡＴＣＡ　ＣＣＡＧＣＣＴＧＧＣＴＴｒＴＧＧＡＧＡＴ４５１　ＣＴＴＴＴＡＣＴＴＣＴＧＣＴＡＡＣＴＴＧ　ＴＧＴＧＣＣＡＧＴＧ　ＧＡＴＧＣＡＡＣＴＣＡＣＴＡＣＣＴＴＧＣ５０１ＡＧＡＡＧＧＡＴＧＧ　ＣＴＧＴＴＣＧＧＡＡ　ＧＡＡＴＴＧＧＴｒＧ　ＴＡＡＧＧＴＧＣＴＣＴＣ：ｒＴＴＣＡＴＣＣ５５１ＧＧＣＴＣＡＣＴＴＣＴＧＴＴＧＧＴＧＴＧ　ＴＣＡＧＴＧＴＴＣＡ　ＣＡＴＴＡＡＣＭＴ　ＴＣＴＣＡＧＣＧＣＴ６０１　ＧへＣＡＧＡＴＡＣＡ　ＡＧＧＣＡＧＴＴＧＴ　ＧＡＡＧＣＣＡＣＴｒ　ＧＡＧＣＧＡＣＡＧＣＣＣＴＣＣＭＴＧＣ６５１ＣＡＴＣＣＴＧＭＧ　ＡＣＴＴＧＴＧＴＭ　ＡＡＧＣＴＧＧＣＴＧ　ＣＧＴＣＴＧＧＡＴＣＧＴＧＴＣＴＡＴＧＡＥＩＯＩ　ＧＡＡＧＣＴＣＴＴＧ　ＣＡＡＧＡＡＡＴＡＣＡＴＴＣＴＣＴＧＣＴ　ＧＴＧＣＴＴＣＴＴＡ　ＧＴＧ’Ｔ’ｒＣＴＡＣＡ８５１　ＴＴＡＴＴＣＣＡＣＴ　ＣＴＣＴＡＴｒＡＴＣＴＣＴＧＴＣＴＡＣＴ　Ａ’ｎ’ＣＣＴｒＧＡＴ　ＴＧＣＴＡＧＧＡＣＣ９０１ＣＴＴＴＡＣＡＡＡＡ　ＧＣＡＣＣＣＴＧＡＡ　ＣＡＴＡＣＣＴＡＣＴ　ＧＡＧＧＡＡＣＡＡＡ　ＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧ９５１　ＴＡＡＧＣＡＧＡＴＴ　ＧＭＴＣＣＣＧＭ　ＡＧＡＧＭＴＴＧＣＣＡＧＡＡＣＧＧＴＡ　Ｔ’ｒＧＧＴＧＴＴＧＧ１００１　ＴＧＧ（？ＴＣＴＧＴＴ　ＴＧＣＣＣＴＣＴＧＣＴＧＧＴＴＧＣＣＡＡ　ＡＴＣＡＣＣＴＣＣＴ　ＧＴＡＣＣＴＣＴＡＣ１０５１ＣＡＴＴＣＡＴＴＣＡ　（？ＴＴＣＴＣＡＡＡＣＣ’Ｉ’八ＴＧへＡＧＡＣＣＣＣＴＣＴＧＣＣＡ　ＴＧＣＡＴＴＴＣＡＴｌｌｏｌ　ＴＴテＣＡＣＣＡＴＩ’　ＴｒＣＴＣＴＣＧＧＧ　ＴＴＴＴＧＧＣＴＴＴ　ＣＡＧＣＡＡＴＴ（ゴＴＧＣＧＴＡＡＡＣＣ１１５：Ｌ　ＣＣＴＴｒＧＣＴ（？Ｔ　ＣＴＡＣＴＧＧＣＴＧ　ＡＧＣＡＡＡＡＧＣｒ　ＴＣＣＡＧＭＧＣＡ　ＴＴｒＴＡＡＡＧＣＴ１２０１　ＣＡＧＴＴＧＴＴＣＴ　ＧＴｒＧＣＭＧＧＣＧＧＡＧＣＧＧＣＣＴ　ＧＡＧＣＣＴＣＣＴＧ　ＴＴＧＣＴＧＡＣＡＣ１２５１ＣＴ（？ＴＣＴＴＡＣＣＡＣＣＣＴＧＧＣＴＧ　ＴＧＡＴＧＧＧＭＣＧＧＴＣＣＣＧＧＧＣＡ、ＣＴＧＧＧＡＧＣＡｌ：ｌＯｌ　ＴＡＣＡＧＡＴＧＴＣＴＧＡＡＡＴＴＡＧＴ　ＧＴＧＡＣＣＴＣＧＴ　ＴＣＡＣＴＧＧＧＴＧ　ＴＡＧＴＧＴＧＡＡＧｌ：１５１　ＣＡＧＧＣＡＧＡＧＧ　ＡＣＡＧＡＴＴＣＴＡ　ＧＣＴＴＴＴＣＡＡＧ　ＧＡＡＡＡＡＴＧＣＴ　ＧＣＴｒＣＴαテＣ１４０１ＣＣＡＧＣＧＴＧＴＧ　ＴＡＴＣＣＧＡＣＴＣＴＭＧＣＴＧＴＧＴ　ＧＣＡＧＧＴＧＴＡＴ　ＧＧＴＧＴＣＣ’ＡＧＡ１４５１　ＴｒＴＴＴＧＴＴＧＴ　ＴＴＧＡＡｊｌｉＡＧＴＧ　ＴＧＴＴＧＭＡＴＣＴＴＡＧＧＡＧＴＧＡ　ＡＧＧＡＴＣＣＣＴＡ１５０１　ＴＡＡＧＴＡＡＧＴＡ　ＡＡＡＴＡＣＡＡＡＣＣＡＴＴＡＣＴＩＴＣＴＴＣＡＡＡＧＴＡＣＡＡＡＴＡＧＴＡＡＴ１５５１　ＧＴＣＡＴＣＧＧＣＴ　ＴＣＴＡＡＴＡＡＡＴ　ＧＡＧＣＣＣＡＣＴＡ　ＧＴＧＣＡＧＡＡＡＧ　ＡＣＡにＴＴＴＡＴＡ１６０１　ＴＡＴＧＣＣ表１３：ヒトＲ３［ＩＰとヒトＲＩＢＩ’　（ＧＲＰ−Ｒ）　ノア’ミノ酸配タリの対比、　Ｒ３ＢＰは上であり、ＲＩＢＰは下である。

増幅方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応技術を、これらのプローブと共に更なるレセプターを単離及び精製するために利用することができる。

他方、抗体又は活性アッセイを利用するその他のスクリーニング方法を新たなレセプターの単離を評価又は補助するめたに用いることができるであろう。レセプターの発現は抗体により又は適当なレセプター配列を発現する細胞の内分泌刺激によってスクリーンされる。

本明細書における全ての公開物及び特許出願はあたかもそれぞれの公開物又は特許出願を特別に、且つ、独立して参考として組入れるように本明細書に参考として組入れる。本発明を完全に説明してきたが、本発明は請求の範囲を逸脱することな（変更及び改良がなされることが当業者にとって明らかであろう。

表１４：請求の範囲において、下記のＳＥ口ＴＤＮＯ：は下記に相当する：ＳＥｏ　１０　Ｎｏ　：　その相当物１　表１　マウスＩＩＩＢＰ　（ＧＲＰ−１？）核酸２　〃１　マウスＲＩＢＰ　（ＧＲＰ−１？＞アミノ酸３　〃２　ヒトＲＩＢＰ　（ＧＲＰ−Ｒ）核酸４　〃２　ヒトＲ１，ＢＰ　（ＧＲＰ−Ｒ）アミノ酸５　〃３　ラット１ｉ２ＢＰ　（ＮＭＢ−）１）核酸６　〃３　ラットＲ２ＢＰ　（Ｎ？ＩＢ−！ｌ）アミノ酸７　〃４　ヒトＲ２ＢＰ　（ＮＭＢ−１？）核酸８　〃４　ヒトＲ２ＢＰ　（Ｎ門Ｂ−Ｒ）アミノ酸９　〃１２　ヒトＲ３ＢＰ核酸ｌＯヒト　Ｒ３ＢＰアミノ酸配列表（１）一般情報：（１）出願人：　Ｂａｔｔｅｙ　Ｊｒ、、　Ｊａｍｅｓ　Ｆ。

Ｃｏｒｊａｙ、　Ｍａｒｔｈａ　Ｈ。

Ｆａｔｈｉ、　ＺａｈｒａＦｅｌｄｗａｎ、　Ｒｉｃｈａｒｄ　Ｉ。

Ｈａｒｋｉｎｓ、　Ｒｉｃｈａｒｄ　Ｎ。

５ｌａｔｔｅｒｙ、　Ｔｉｍｏｔｈｙに。

Ｗａｄａ、　Ｅｔｓｕｋ。

Ｍｕ、　Ｊａｖａｅｓ　Ｍ。

（１、発明の名称：ポンベシン梯ペプチドに対するレセプター（ｉｉ）配列の数：１０（ｉｖ）宛先：（Ａ）受信人：　Ｅｄｗｉｎ　Ｐ、　Ｃｈｉｎｇ（Ｂ）通り：　１５０１　Ｈａｒｂｏｒ　Ｂａｙ　Ｐａｒｋｗａｙ（Ｃ）　市　：　Ａｌａｍｅｄａ（Ｄ）　州　：　Ｃ八（Ｅ）国：　ＵＳＡ（Ｆ）ＺＩＰ　：９４５０１（ｖ）コンピューター解読形態（Ａ）媒体タイプ：フロンピーディスク（Ｂ）コンピューター：　ＩＢ？Ｉ　ＰＣコンパチブル（Ｃ）作動システム：　ＰＣ−００５／ＭＳ−ＤＯ５（Ｄ）ソフトウェア：　Ｐａｔｅｎｔｌｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　＃１．０＋　Ｖｅｒｓｉｏｎ　１１．２５（ｖｉ）現出願データー：（Ａ）出願番号：（Ｂ）提出日：ＴＣＡ　にＴＧ　ＣＧＧ　ＧＴＧ　ＴＣＴ　ＣＴＣＴＴＣ＾ＣＡＣ了丁　ＡＣＣＣＣＡ　ＣＴＧ　τＣＡＧＣ丁　ＣＡＣ八（、Ｃ７９４Ｓ＠ｒ　Ｖｌｌｌ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　５ａｒ’　Ｖａｌ　Ｐｈ＠Ｔｈｒ　Ｌ＠ｕ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ＾１ａλｓｐ　ＡｒｇＴＡＣＡＡＡ　ＧＣＣ入子τ　Ｇ１八　Ｃ（、Ｇ　ＣＣＡ　入子ＣＣ入゛ｒ　入ＴＣＣへＧＧＣ＾　丁ＣＣＣ入Ｔ　ＧＣＣＣＴＣ８４２ＡＴＣＡＡＧ　ＡＴＣＴＧＴ　ＣＴＣＡＡＡ　ＧＣＴ　ＧＣＴ　ＴＴに　ＡＴＣＴＧＧ　入ＴＴ　ＧＴＣＴＣＴ　入ＴＧ　ＴＴＣＥ１９０ＴＴＧ　ＧＣＣＡＴＣＣＣＡ　ＣＡＧ　ＧＣＴ　ＧＴＧ　丁τＴ　ＴＣＴ　Ｇ入ｃ　ＣＴａ　ＣＡＣＣＣＣＴＴＣＣＡＴ　Ｇ’ｌ［９３８Ｌｅｕ　八ｌａ　工ｉｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　入ｓｐ　Ｌｓｕ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｈｉｓ　Ｖａ１人入Ａ　ＣＡＴ　八ｅｃ　へＡＣＣ入Ａ　ＡＣＣＴＴＣＡＴＴ　ＡＣτ　ＴＣＴ　ＧＣＣＣＣＣＴｈＣＣＣＡ　ＣＡＣＴＣＣ９ｅ６人ＡＴ　ＧＡＧ　ＣＴＡ　ＣＡＣ００丁　入＾Ａ　ＡＴＣＣＡＴ　ＴＣＣＡＴＣＧＣＴ　ＴＣＣ，Ｔ丁ＴＣτＧ　ＧＴＴ　ＴＴＣ１０３４＾ｓｎ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ｈｌｓ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｘ１ｅ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｈｓセ　入１ａ　Ｓｕｒ　Ｐｈ＠Ｌ＠ｕ　Ｖａｔ　ＰｈａＴＡＣＧＴＴ　ＡＴＣＣＣＡ　ＣＴＧ　ＧＣＧ　ＡＴＣＡＴＣＴＣＴ　ＣＴＣＴＡＧ　ＴＡＣＴＡＣＴＴＣＡＴＴ　ＧＣＣ１０Ｂ２ＣＣ＾　入ＡＴ　ＣＴＧ　ＡＴＴ　ＣＡに　＾ＧＴ、ＧＣＣＴＡＣ八人Ｔ　ＣＴＴ　ＣＣＣＧＴＧ　ＣＡＡ　（、ＧＯ入＾Ｔ　入τへ　１１R０ＣＡＴ　ＧＴＣＡＡＧ　入ＡＧ　ＣＡＧ　八ＴＣＧＡＡ　ＴＣＣＣＧＧ　八＾Ｇ　ＣＧＩＩ；　ＣＴｒ　ＧＣＣｋＡＧ　八ＣＡ　ＧＴＡ　１P７８Ｃ丁Ｇ　ＧＴＣ：　ＴｒＴ　ＧＴＧ　Ｇｌ’；ＣＣＴＣＴＴＴ　ＣＣＣＴＴＣＴｌｌ；ＣＴＧＧ　ＣＴＣｃｅｃ　入＾ＣＣＡＴ　にＴＣ１２Q６Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｐｈ＠　Ｖａｌ　ＧＬｙ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　八Ｌａ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　入ｓｎ　）ｕｓ　Ｖａ１ＡＴＣＴＡＣＣＴＧ　丁ＡＣＣＧτ　ＴＣＣＴＡＣＣＡＣＴＡＣ丁ＣＴ　ＣＡＡ　ＧＴＧ　ＧｋＣ入ＣＣＴＣＣＡＴに　１２７４ＣＴＣＣＡＣＴＴＴ　にＴＣＡＣＣＡＧＣ入子ＣＴＧＴ　ＧＣＣＣＡＣＣＴＣＣＴＣＧＣＣＴＴＣＡＣＣ入ＡＣ１３２２Ｌ＠ｕ　）ＩＬｓ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　丁ｈｒ　Ｓｅｒ　工１ｅ　Ｃｙ＠　八ｌａ　Ｈｌｍ　Ｌｅｕ　Ｌ＠ｕ　Ａｌａ　Ｐｈ＠　Ｔｈｒ　八６■ ！００　３０５　３１０　３１５ｋｋＧ　ＣＡＧ　ＴＴＣＡＡＣ＾ＣＴ　ＣＡＡ　ＣＴＴ　ＣＴＣＴＣＣ７＋１；ＣＣＪＩＧ　ＣＧ？　＋１；ＣＯＣＴＧλＷ　ＡＡＣ１４１奄P ＡＴＴＧＴＡＴＣＴＣＡ　１７００（２）ＳＥｏ　１０　ＮＯ：　２に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：３８４アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｄ）トポロジー；線状（ｉｉ）分子のタイプ：タンパク質（ｘｉ　）配列の詳細：５ＩＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　：　２　：ＸＬ＠Ｐｈｅ　Ｃ２Ｓ　Ｔｈｒ　ＶａＩＬｙｌＩ５ｅｒ　Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ＾ａｎ　Ｌａｕ　Ｐｈｓ　ｒｌｅＳａｒ　Ｓｕｒ　Ｌａｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ＾＊ｐ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ　Ｌａｕ　Ｖａｌτｈｒ　Ｃ２Ｓ　ＡＩＪＩ　Ｐｒ。

（：ｌｙ　Ａｒｇ　Ｓ＠ｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｃ２Ｓ　Ｍａｔ　Ｔｈｒ　Ｓａｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｍ５＠ｒτｈｒ＾−ｎ　Ｐｒｏ　Ｓ＠ｒ：（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　３に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：　１７２６塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー二線状（１１）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ（ｉｉ）ハイボセティカル：Ｎ０（ｖｉ）起源：（Ａ）生物二人類（Ｇ）細胞のタイプ：小細胞肺癌腫（Ｈ）細胞系：　ＮＣｌ−８３４５（ｖｉ）直接の起源：（Ａ）ライフ゛ラリー名：　Ｌａｍｂａ　ＧＴＩＯ（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：　ＣＤ５（Ｂ）位ｉ１　：　３９９．．１５５３（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　：　３　：ＴＴＴＧＡＪｔＴｈＣＣＡＴＡＧＴＴＡＣＴＡ　ＴＡＴｈＴＧＴＡＣＴ　ＣｋＧ＾Ｃ；ＴＡＴＴＴＴＴｋＴＴｋ）ＪｋＧｋ　ＡＧＧＣｋＭＣl、　３００ＣＣＣＧＧＣＡＴＡＧ　Ａ丁ＣＴＴＡＴＣ’Ｔ？　ＣＡＴＣＴＴＣＡＣＴ　ＣＧＧτ″ｒＧＣＡＡｋ　ＡＴＣＡＡＴＡＧＴＴ　ＡＡｃＡＡＡsＡにＣ３６０＾τＣ丁ＡＡＧＧＧＡ　ＡＣＴＴＴＴＡＧＧＴ　ＧＧＧＡＡＡＡＡＡＡ　ＡＴＣＴＡＧＭ；　ＡＴＣＧＣｒ　ＣＴＡ　ＡＡＴ　ＧＡＣ４１３ｃｃｃ　ＣＴｃ　入Ｔτ　ＣＣＣ入＾ＣＡ丁ＣＡＣ丁　丁ＴＧ　へＴＣＡ入Ｇ　ＡＴＣ丁τＣＴＣ丁　＾Ｃ＾　ＧτＣＡ入Ｇ　６０５丁ＣＣ入子ＣＣＧＡ　ＡＡＣＧＴＴ　ＣＣＡ　八ＡＣＣＴＣＴＴＣＡＴＴ　ＴＣＣＰＩＧＴ　ＣＴＧ　ＧＣＴ　ＴＴＧ　（、Ｇ＾　６５３ＧＡＣＣＴＧ　ＣＴＣＣＴＣＣＴＡ　ＡＴＡ　ＡＣＧ　ＴＧＴ　ＧＣＴ　ＣＣＡ　ＧＴＧ　ＣＡＴ　ＧＣＣＡＧＣＡＣＧ　ＴＡＣ７０１ＣＴＧ　ＧＣＴ　ＣＡＣＡＧＩ　ＴＣＧ　ＣＴＡ　ＴＴＴ　ＧＧＣＡＣｆｌ；　ＡＴＴ　（、ＧＣＴＣＣ入入Ａ　ＣｒＧ　ＡＴＣＣＣＣ７４X 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（２）ＳＥＱ　１０　ＮＯ：　５に関する情報：（ｉ）配列の特ｒ′Ｉ１．：（Ａ）長さ：　１５８４塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：綿状（１１）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ＝ｍＲＮＡ（ｉｊ）ハイポセティカル：Ｎ０（ｖｉ）起源：（Ａ）生物：　Ｒａｔｔｕｓ　ｒａｔｔｕｓ（Ｆ）＆［ｌ織タイプ：　Ｅｓｏｐｈｇｕｓ（ｔｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：　ＣＤ５（Ｂ）位置：　１３２．．１３０４（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥｏ　１０　Ｎｏ　：　５　：にＡＡＡＧＧＡＣＡＣＣＡＴＧ　ＣＣＣＣＣＣ＾ｅｃ　ＴＣＴ　ＣＴＣＣＣＣＡＡＣＣＴＣτＣＣ丁ＴＧ　ＣＣＣＡＣＣ１７０ＧＡＧ　ＧＣＧ　ＡＧＯＧＡＣＡＣＣＧＡＧ　ＴＴＧ　ＣＡＡ　ＣＣＣにＡＧ　ＧＴＧ　ＴＧＧ　ＣＡＡ　ＡＡＴ　Ｇ入Ｔ　ＴＴＣ２１８ＣＴＧ　ＣＣＴ　にＡＣＴＣＡ　ＣＡＣＧＧＧ　ＡＣＣＡＣＣＣＣＣＧＡＧ　ＴＴＧ　にＴＡ　ＡＴＣＣＧＣＴＧＴ　ＧＴＧ　２６６ＡＴＡ　ＣＣＡ　丁ＣＣＣＴＣ丁ＡＣＣＴＡ　ＡＴＣＡＴＣＡＴＣＴＧＧ　ＧＴＧ　ＧＣＣＴＴＧ　ＣＴＧ　ＧＧＣｕｃ　３１４ＣＡＴ　ＴＴＣ八＾ＣＡＧＯ（ＪＵＧ　ＣＴＣＴＧＴ　ＴＣＴ　ＧＧＧ　ＣＡｃ　ＪＬｊＬＣ＋ｒｃＣ〒１’？　Ｃ（’！　ＣｈＱ　ｌｖａ@１１７１１ＴＣＴ　ｋｃｃ　ＡＧＣＴＡＣＣＴＣＣＴＣｋＧｃ　ＴＣＴ　ＴＣＡ　ＧＣＡ　ＧＴＡ　ｋＧＡ　ＡＴＩＩ；　ＡＣＴ　ＴＣＴ　ＣＴＧ　１Q２６ＡＡＡ　ＡにＣＡＡＣＧＣＧ　ｋＡＧ　ＡＡＴ　ＧＴＧ　ＧＴＧ　八ＣＣ入Ａτ 　丁ＣＴ　ＣＴＣＣＴＧ　ＣＴＣ入ＡＣＧＧＡ　１２７４（２）ＳＥ口ＩＤＮ０ニアに関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：　１３５２塩基対（Ｂ）クイプ：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー二線状（ｉｉ　）分子のタイプ：　ｃＤＮ八〜ｍ　ＲＮ　Ａ（ｉｉ）ハイボセティカル二Ｎ０（ｖｉ）起源：（Ａ）生物二人類（Ｇ）細胞のタイプ：小細胞肺癌腫（Ｈ）細胞系：　ＮＣｌ−１１３４５（１ｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：　Ｃ０５（Ｂ）位置：　１４０．．１３１２（ｘｉ　）配列の詳細：ＳＥＱ　１０　ＮＯ：　７　：ＣＴＣＴにＣＴＧＧＡ　ＡＡＧＧＡＧＡＴＣ＾τｃ　ｃｃｃ　ＴＣＴ　入Ａに　ＴＣＴ　ＣＴＴ　丁ＣＣＡＡＣＣ’ｒＣＴＣに　ＧＴＧ　１V２ 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Ｃｙｍ　Ｖａｌ　Ｌｙｅ　Ａｌａ　Ｍｓｔ　Ｇｌｙ　工ｉｓ　Ｔｒｐ　Ｖａｎ　Ｖａｌ　５ｅｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌａｕ　Ａｌａ　Ｖａ１１６５　１フ０　１７５Ｌｍｕ　Ａｌａ工１ｅ工１ｅ　Ｓｅｒ工ｌｅ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　）Ｉｉｓ工１ａ　Ａ１１ｌ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌ＠ｕ工１ｅ（２）ＳＥＱ　１０　Ｎｏ　：　９に関する情報：（１）配列の特徴：（Ａ）長さ：　１６０６塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖の数二二本鎖（Ｄ）トポロジー二線状（ｉｉ　）分子のタイプ＝ＤＮへ（ゲノム）（ｉｉｉ　）ハイポセティカル：Ｎ０（ｖｉ）起源：（Ａ）生物二人類（ｉｘ　）特徴：（Ａ）名称／キー：　Ｃ０５（Ｂ）位置：　１７２．．１３７１（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ　ＩＱ　Ｎｏ　：　９　：＋４ａｔ　入１ａＣＡＡ　Ａ（Ｊ　ＣＡＧ　ＣＣＴ　ＣＡＣＴＣＡ　ＣＣＴ　ＡＡＴ　ＣＡＣＡＣＴ　ＴＴＡ　八Ｔ？　ＴＣＡ　ＡＴＣＡＣＡ　入ＡＴ　２２T Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　工１ａ　Ｓｅｒ　工１ｅ　Ｔｈｒ　ＡｓｎＧＧＡ　ＴＧＧ　ＡＧＣＧＧＧ　ＣＡＣ入ＡＣＴＣＴ　ＣＣＡ　ＧＧＡ　入子へ　Ｇ入＾　ＣＣＡ　ＴＴＣＴＣＴ　ＧＣＣＡＴＣ３２１丁八丁へＡＴＴ　ＡＣＴ　ＴＡＴ　ＧＣＴ　ＧＴＧ　ＡＴＣＡＴＴ　ＴＣＡ　ＧＴＧ　にＧＣＡＴＣＣＴＴ　ＧＣＡ　八＾Ｔ　ＧＣＴ　３６X ＾ＴＴ　ＣＴＣＡＴＣＡＡＡ　ＧＴＣＴＴｒ　ＴＴＣＡＡＧ　ＡＣＣ入入Ａ　ＴＣＣｋＴＧ　ＣＡＡ　ＡＣＡ　ＧＴＴ　ＣＣＪ　４１１ＡＡＴ　ＡＴＴ　”ＩＴＣＡＴＣＡＣＣＡＧＣＣＴＧ　ＧＣ’ｒ　ｍ　ＧＧＡ　ＣＡＴ　ＣＴｒ　ＴＴＡ　ＣＴｒ　ＣＴＧ　ＣＴＡ　４６５ＡＣＴ　ＴＧＴ　ＧＴＧ　ＣＣＡ　ＣＴＧ　ＧＡＴ　ＧＣＡ　ＡＣＴ　ＣＡＣＴＡＣＣＴＴ　ＧＣｋ　ＣＡＡ　ＧＧＡ　ＴＧＧ　ＣＴＧ　５P３ＴＴＣＧＧＡ　ＡＧＡ　ＡＴＴ　ＧＧＴ　ＴＧＴ　ＡＡＧ　にＴＯＣＴＣＴＣＴ　ＴＴＣＡＴＣＣＧＧ　ＣＴＣＡＣＴ　ＴＣＴ　５６１ＧＴＴ　ＧＣＴ　ＧＴＧ　ＴＣＡ　ＧＴＧ　ｆｆｃ　ＡＣＡ　ＴＴＡ　ＡＣＡ　ＡＴＴ　ｃｒｅ　ＡＧＣＧＣＴ　ＣＡＣＡＣＡ　ＴＡｃ　６O９ＣＣＴ　ＣＣＴ　ＧＴＴ　ＧＣＴ　ＧＡＣＡ（：ＣＴＣＴ　ＣＴＴ　Ａｃｅ　ＡＣＣＣＴＧ　ＧＣＴ　ＧＴＧ　ＡＴＣＧＣＡ　ＡＣＧ　１２W１にＧＴＣＣＣＧ　ＧＣＣＡＣＴ　（、ＧＣＡＧＣ＾Ｔ八　ＣＩＧ　ＡＴＣＴＣＴ　ＧＡＡ　ＡＴＴ　Ａ０丁　ＣＴＧ　ＡＣＣＴＣＧ　１コ２X Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　ＸＬ＠Ｇｉｎ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｉｌ＠Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　５ｅｘＴ丁ＣＡＣＴ　ＧＧＧ　丁ＧＴ　ＭＡＴ　ＧＴＧ　ＡＡＧ　ＣＭ；　にＣＡ　ＧＡＧ　ＣＡＣＡＧＡ　ＴＴＣτ＾ＧＣＴＴ丁丁ＣＡ　ｌコツW （２）　ＳＥＱ　１０　Ｎｏ　：　１０に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：３９９アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：線状（１１）分子のタイプ：タンパク質（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥ［ｌ　１０　Ｎｏ　：　ｔｏ：Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　ｋｒｑ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　ＨＬｍ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　、Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｘ１■ Ｌ＠ｕ　Ｌ＠ｕ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　八ｓｐ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　）Ｉｔｓ　Ｔｙｒ　Ｌｓｕ　Ａｌａ　にｌｕ　ＧＩx ｌｏｏ　１０５　１１０Ｃ１ｙ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｓ＠ｒ　工１ｍ　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ　５ｅｒ　Ｇｌｕ　Ｉｌａ　Ｓｅｘ　Ｖｔ１ＡＢＣ口　［ビ、ＷＩｋＤｑ）　− 図面の簡単な説明図１はＲＩＢＰ（ＧＲＰレセプター）を可溶化せしめるためのいくつかの清浄剤の能力の比較のグラフであり、そして結合活性に及ぼすこの可溶化の効果を示す。

図２は清浄剤（Ｃ）ＩＡＰＳ）の濃度の関数としてのＧＲＰ−結合活性及びＲＩＢＰ（ＧＲＰレセプター）の可溶化のグラフである。

図３は可溶性コレステリルエステル安定化剤（ＣＨ３）の濃度の関数としてのＲＩＢＰの可溶化及び活性のグラフである。

図４は清浄剤（ＣＨＡＰＳ）の濃度の関数としてのＧＲＰ結合活性のグラフである。

図５は粗可溶性抽出物中のＲＩＢＰ　（ＧＲＰ−Ｒ）に架橋した”５Ｉ−ＧＲＰの５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析のゲルの表示である。

図６は精製ＲＩＢＰの５Ｏ３−ＰＡＧＥ分析の銀染色ゲル表示である。

図７は逆相１（ＰＬＣによるＲＩＢＰのトリプシン処理フラグメントの分離を示す。

図８はマウスＲＩＢＰ（ＧＲＰ−Ｒ）の推定アミノ酸配列のバイトロバシー（ｈｙｄｒｏｐａ　ｔｈｙ　）分析を示す。これは−１ｓｃｏｎｓｉｎ大学のＧｅｎｅｔｉｃｓグループのシーケンス　アナリシス　ソフトウェア−パッケージにおけるベプロノ）（Ｐｅｐρ１ｏｔ）（窓枠−２０個のアミノ酸）を用いて作製した。Ｄｅｖｅｒｅａｕｘら（１９８４）　Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１２　：　３８７−３９５（本明細書に参考として組入れる）を参照のこと。正の領域は相対的に疎水性であり、そして負の領域は相対的に親水性である。推定トランスメンブランドメインは順に１番から１番と番号付けした。実線：　Ｋｙｔｅ −Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅｉ準、点線：　Ｇｏｌｄｍａｎ基ｍ。

図９はスイス３Ｔ３細胞に由来するｍＲＮＡのノーザンハイブリダイゼーンゴン分析を示す。

図１０はヒト胎児肺細胞（）ＩＦＬ）に由来するｍＲＮＡのノーザンハイブリダイゼーシタン分析を示す。

図１１はＲＩＢＰ（ＧＲＰ−Ｒ）ｃＤＮＡクローン由来のインビトロ転写体を発現するアフリカッメガエルの卵母細胞における塩素電流のＧＲＰリガンド依存性誘発を示す。

図１２はラットＮＭＢレセプターの推定アミノ酸配列のバイトロバシー分析プロットを示す。

図１３はヒトＧＲＰレセプターに由来するハイドロバシープロットを示す。

図１４は２種類のボンベシン様ペプチドに対するレセプターの生物学的応答を示す。この図はＴｙｒ’−ボンベシン（ＢＮ）及びニューロメジンＢ　（ＮＭＢ）に応答するＭＣｌ−１４３４５細胞の細胞内Ｃａ”の上昇を示している。４９２ｎｍでの蛍光の上昇は表示のリガンドの添加後に認められる。このリガンドは１００ｎ−の最終濃度が達せられるように加えた。

１０％のトリトン−Ｘ　１０μｍを実験測定の終りにて示す通りに加えた。−回の測定当り５Ｘ１０’個の細胞を用いた。タイムスケールはこの図の右側の下部に表示している。

図１５はＮＣＴ−Ｈ３４５細胞におけるＮ？ＩＢ又はＢＮの濃度効果関係を示す。

データーは休息基底からのｎＭ変化として示す。その値は２〜３回の別々の測定の平均値である。５Ｘ１０’個の細胞を各アッセイにおいて用いた。Ｘ：ＮＭＢ作動応答、ム：ボンヘシン応答。

図１６は、ＮＣｌ−Ｈ３４５細胞における５０ｎＭのＮＭＢ又はＢＮの存在下における、拮抗因子又はインヒビターＣＤ−Ｐｈｅ”）　８Ｎ　（６１３）エチルエステルの濃度効果関係を示す。このインヒビターを細胞と５分間、リガンドの添加前にインキュベートした。（Ｃａ”）ｉにおける％変化は前記の通りに決定した。その値は２回の独立した測定の平均値である。測定当り５ＸｌＯ”個の細胞を利用した。　Ｘ　：　ＮＭＢ応答、ム：ボンベシン応答。

図１７はヒトＲ２ＢＰ　（ＮＭＢ−Ｒ）に由来するハイドロバシープロットである。

図１８はヒトＲＩＢＰ　（ＧＲＰ−Ｒ）及びヒトＲ２ＢＰ　（ＮＭＢ−Ｒ）の機能発現を示す。

電気生理学的応答（塩素電流対時間）は、インビトロでのｃＤＮＡクローン鋳型より転写した、注入せしめたヒトＧＲＰ−レセプターｍＲＮＡ又はＮＭＢ−レセプターの発現の後のＧＲＰ又はＮＭＢ適用に対するアフリカッメガエルの卵母細胞のそれで示している。パネルＡは作動因子（１０ｎＭ）に対する、及びＣＤ− Ｐｈｅ６）　ＢＮ　（６−１３）（１ｉｔ　Ｍ）と作動因子（１０ｎＭ）に対する、ＧＲＰ−１１応答を示す。パネルＢは作動因子（１０ｅ＋Ｍ）に対する、及びＣＤ−Ｐｈｅ６）　ＢＮ　（６−１３）（１μＭ）と作動因子（１０ｎＭ）に対するＮＭＢ−Ｒ応答を示す。未注入の卵母細胞はＧＲＰ又はＮＭＢに対して応答しなかった。

図１９は種々の癌細胞系における定常状態のＲＩＢＰ（ＧＲＰ−Ｒ）ｍＲＮＡ及びＲ２ＢＰ（ＮＭＢ−Ｒ）ｍＲＮ＾のレベルのＲＮａｓｅ保護分析を示す。３０ｕｇの全ＲＮＡを記載の３２Ｐ−ラベル化ＧＲＰ−１１又はＮＭＢ−ＲｃＲＮＡプローブとハイブリダイズさせた。得られるオートラジオグラフの一部を示す；Ａ）　ＲＩＢＰ（ＧＲＰ−Ｒ）　、増強スクリーンの存在において５日間の暴露；Ｂ　）　１１２ＢＰ（ＮＭＢ−１２）、増強スクリーンの存在において１２日間の暴露。

調べた全ての細胞系からの結果を表１０にまとめている。得られるオートラジオグラフ上のシグナル強度を評価し、そして図１９において下記のように示す相対値で示す：＋＋ＮＣＩ−）１３４５　＋　ＮＣｌ−Ｎ５９２＋ｒ　ＮＣＩ−ｆ１５１０　− ＮＣＩ−８２０ｇ当量のインタクトＲＮＡが分析されたかをＷ１認するため、分析した各サンプル由来の全ＲＮＡを電気泳動にかけ、プロットし、そしてヒトヘーターアクチンでプローブせしめることもした。全てのＲＮＡサンプル由来のシグナルは同等であり、分析したＲＮＡが分解していないことを示す、ヒトグリオブラストーマ細胞系Ｕ１１８由来のＲＮＡをＧＲＰ−Ｒ実験において陽性コントロールとして含ませた。

図２０はＥｃｏＲＩで切ったヒトＤＮ＾の低緊張ゲノムプロットの結果を示す、マウスＲＩＢＰ（ＧＲＰ−Ｒ）プローブを用い、６つの新たなフラグメントが示され、どれも本明細書で初めに特性化したレセプターと対応しなかった。この６つの新規のバンドを矢印で表示している。

２０に− ＷＦＩＧ　９．　ＦＩＧ　１０゜リガンド濃度（ｎＭ）ＦＩＧ、１５゜インヒビター濃度（ｎＮ）ＦＩＧ、／６゜ＦＩＧ、／９Ａ。

＋ｍ−−Ａ−１ｍ＋ｈ＋　Ｎ＋　ρＣＴ／ｕｓ　９２１０２０９１国際調査報告フロントベージの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１３１００　８３１８−４ＨＣ１２Ｎ　５／１０Ｃ１２Ｐ　２１１０２　Ｃ８２１４−４Ｂ２１１０８　８２１４−４ＢＣ１２Ｑ　１／６８　Ａ　７８２３−４８ＧＯＩＮ　３３１５６６　８３１０− ２Ｊ／／（Ｃ１２Ｎ　１５／１２Ｃ１２Ｒ１：９１）（Ｃ１２Ｐ　２１１０２Ｃ１２Ｒ１：９１）（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＰＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、ＡＵ、ＣＡ、ＪＰ、Ｎ。

（７２）発明者　バッティ、ジェームズ　エフ３．　ジュニアアメリカ合衆国、メリーランド　２０８１７゜ベゼスダ、サバンナー　コート　１３（７２）発明者　コージェイ、マーサ　エイチ。

アメリカ合衆国、プラウエア　１９８０８．ウィルミントン、プロークン　アベニュＩ（７２）発明者　ファジー、ザーラアメリカ合衆国、メリーランド　２０９０４゜シルパースプリンゲス、キャッスル　ブールバード　１３８１１−４３（７２）発明者　フェルトマン、リチャード　アイ。

アメリカ合衆国、カリフォルニア　９４５３０゜エル　セリット、ポモナ　アベニュ　１００（７２）発明者　バーキン、リチャード　エフ。

アメリカ合衆国、カリフォルニア　９４５０１゜アラメダ、シー　ビュー　パークウェイ（７２）発明者　スレッテリー、ティモジ−ケー。

アメリカ合衆国、カリフォルニア　９４４０３゜マウンテン　ビュー、クライア −コート（７２）発明者　ワダ、エツコアメリカ合衆国、メリーランド　２０８５２゜ロックビル、ビレッジ　スクエア　テラス（７２）発明者　ウー、ジエームズ　エム。

アメリカ合衆国、カリフォルニア　９４５３０゜エル　セリット、ザラ　アベニュ　５５１４

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒトガストリン放出ペプチドレセプターに相当するアミノ酸配列を有するポリペプチドについてコードするＤＮＡセグメント、又はその固有の領域。２．前記ＤＮＡがＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７において示す配列を有する請求項１に記載のＤＮＡセグメント、その対立遺伝子もしくは種変異体、又はその固有の領域。３．前記ＤＮＡセグメントがＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８に記載のアミノ酸配列をコードする請求項１に記載のＤＮＡセグメント、その対立遺伝子もしくは種変異体、又はその固有の領域。４．天然に結合したタンパク質を有さず、そしてヒトガストリン放出ペプチドレセプターに相当するアミノ酸配列を有するポリペプチド又はその固有の領域。５．固相支持体に結合しており、そしてヒトガストリン放出ペプチドレセプタに相当するアミノ酸配列を有するポリペプチド又はその固有の領域。６．前記ポリペプチドがＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８に記載のアミノ酸配列を有する請求項４又は５に記載のポリペプチド、その対立形質もしくは種変異体、又はその固有の領域。７．ベクター及び請求項１に記載のＤＮＡセグメントを含んで成る組換ＤＮＡ分子。８．請求項７に記載の組換ＤＮＡ分子を含む細胞。９．ヒトガストリン放出ペプチドレセプターに相当するアミノ酸配列を有するポリペプチドを製造する方法であって、前記ＤＮＡセグメントが発現され、従って前記ポリペプチドが生産される条件のもとで請求項８に記載の細胞を培養し、次いで前記ポリペプチドを単離することを含んで成る方法。１０．組換ヒトガストリン放出ペプチドレセプターに対する結合親和力を有する抗体又はその固有の領域。１１．前記レセプターがＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８に記載のアミノ酸配列を有している請求項１０に記載の抗体、その対立形質もしくは種変異体、又はその固有の領域。１２．ニューロメジン−Ｂ−優先ボンベシンレセプターに相当するアミノ酸配列を有するポリペプチドについてコードするＤＮＡセグメント、又はその固有の領域。１３．前記ＤＮＡセグメントがＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５に示す配列を有する請求項１２に記載のＤＮＡセグメント、その対立遺伝子もしくは種変異体、又はその固有の領域。１４．前記ＤＮＡセグメントがＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６に記載のアミノ酸配列をコードする請求項１２に記載のＤＮＡセグメント、その対立遺伝子もしくは種変異体、又はその固有の領域。１５．天然に結合したタンパク質を有さず、そしてニューロメジン−Ｂ−優先ボンベシンレセプターに相当するアミノ酸配列を有するポリペプチド又はその固有の領域。１６．固相支持体に結合しており、そしてニューロメジン−Ｂ−優先ボンベシンレセプターに相当するアミノ酸配列を有するポリペプチド又はその固有の領域。１７．前記ポリペプチドがＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６に記載のアミノ酸配列を有する請求項１５又は１６に記載のポリペプチド、その対立形質もしくは種変異体、又はその固有の領域。１８．ベクター及び請求項１２に記載のＤＮＡセグメントを含んで成る組換ＤＮＡ分子。１９．請求項１８に記載の組換ＤＮＡ分子を含む細胞。２０．ニューロメジン−Ｂ−優先ボンベシンレセプターに相当するアミノ酸配列を有するポリペプチドを製造する方法であって、前記セグメントが発現され、従って前記ポリペプチドが生産される条件のもとで請求項１９に記載の細胞を培養し、次いで前記ポリペプチドを単離することを含んで成る方法。２１．組換ニューロメジン−Ｂ−優先ボンベシンレセプターに対して結合親和力を有する抗体又はその固有の領域。２２．前記レセプターがＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６に記載のアミノ酸配列を有する請求項２１に記載の抗体、その対立形質もしくは種変異体、又はその固有の領域。２３．ボンベシン様ペプチドに対するレセプター又はそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列に対して実質的な相同性を示す配列を含んで成る、組換又は実質的に純粋な核酸。２４．第二ポリペプチド又はそのフラグメントをコードする配列を更に含んで成る請求項２３に記載の核酸。２５．請求項２３に記載の核酸を含んで成るベクター、細胞又は生物。２６．ボンベシン様ペプチドに対するレセプターのアミノ酸フラグメントに対して実質的な同一性を示す領域を含んで成る、組換又は実質的に純粋なポリペプチド。２７．第二ポリペプチドのフラグメントを含んで成る、請求項２６に記載のポリペプチド。２８．請求項２６に記載のタンパク質を含んで成るサブ細胞構造、細胞又は生物。２９．請求項２３に記載の核酸を発現せしめることを含んで成る、ボンベシン様ペプチドに対するレセプター又はそのフラグメントを製造する方法。３０．ボンベシン様ペプチドに対するレセプターに対して結合親和力を有する化合物についてスクリーニングする方法であって、下記の工程：ａ）請求項２９に記載の方法によって前記レセプターを製造し、次いでｂ）前記レセプターに対する前記化合物の結合性についてアッセイすること、を含んで成る方法。３１．ボンベシン様ペプチドに対するレセプター又はそのフラグメントに対して結合親和力を有する抗体。３２．ボンベシン様ペプチドに対する複数のレセプターのサブタイプの生物活性を同時に調節する方法であって、前記レセプターとの接触に基づいて前記活性を調節する化合物と前記レセプターとを接触せしめることを含んで成る方法。３３．下記のもの：ａ）マウスのＲ１ＢＰ、又はそのフラグメント；ｂ）ヒトのＲ１ＢＰ、又はそのフラグメント；ｃ）ラットのＲ２ＢＰ、又はそのフラグメント；ｄ）ヒトのＲ２ＢＰ、又はそのフラグメント；及びｅ）ヒトのＲ３ＢＰ、又はそのフラグメント；より成る群から選ばれる、ボンベシン様ペプチドに対する少なくとも１種のレセプターへの結合に特異性を示す抗体。３４．ボンベシン様ペプチドに対するレセプターの生物活性を調節する方法であって、前記レセプターを、下記のもの：ａ）前記レセプターに結合する抗体；ｂ）非ＧＲＰボンベシン様ペプチドに対するレセプターに対する既知の作動因子又は拮抗因子；及びｃ）ボンベシン様ペプチドに対するレセプターに由来するリガンド結合性フラグメント；より成る群から選ばれる組成物と接触させることを含んで成る方法。３５．癌又はボンベシン様ペプチドに対するレセプターの異常な発現を示す宿主を処置する方法であって、前記宿主に：ａ）ボンベシン様ペプチドに対するレセプターに結合する抗体；ｂ）非ＧＲＰボンベシン様ペプチドに対するレセプターに対する作動因子もしくは拮抗因子；又はｃ）ボンベシン様ペプチドに対する結合性レセプター、もしくはそのフラグメント；を含んで成る治療的に有効な量の組成物を投与することを含んで成る方法。３６．宿主生物における癌について診断する方法であって、下記の工程；ａ）前記宿主に由来するサンプルを、ｉ）ボンベシン様ペプチドに対するレセプターをコードする遺伝子；又はｉｉ）ボンベシン様ペプチドに対するレセプター；に対して特異的な試薬と接触させ；次いでｂ）前記サンプルに対する前記試薬の結合性のレベルを測定すること、を含んで成る方法。３７．ボンベシン様ペプチドに対するレセプターへの試験化合物の結合親和力を評価する方法であって、下記の工程：ａ）前記レセプターを含むサンプルを、ｉ）前記レセプターに対する既知の親和力を有するラベル化合物；及びｉｉ）前記試験化合物；と接触させ；次いでｂ）結合したラベル化合物のレベルを測定することを含んで成り、前記値が、前記レセプターに結合した試験化合物の量に反比例している方法。３８．サンプル中のボンベシン様ペプチドに対するレセプターの量を決定するためのキットであって、前記レセプターに対する既知の結合親和力を有するラベル化合物を有する区画を含んで成るキット。３９．サンプル中のボンベシン様ペプチドに対するレセプターに対する抗体をアッセイするためのキットであって、前記レセプター及び抗体検出手段を有する区画を含んで成るキット。４０．下記の方法：ａ）前記化合物を、ボンベシン様ペプチドに対する単離もしくは組換レセプター、又はそのフラグメントと接触させ；次いでｂ）前記接触に基づいて生物活性に及ぼされる影響を評価すること；によって選ばれる、ボンベシン様ペプチドに対するレセプターの活性を調節することが知られている化合物。４１．生物学的に活性なガストリン放出ペプチドレセプターをコードする単離ＤＮＡ、又はガストリン放出ペプチドレセプターポリペプチドをコードするそのフラグメント。４２．ガストリン放出ペプチドレセプター活性を有し、そしてＳＥＱＩＤ　ＮＯ：１のＤＮＡにハイブリダイズすることの可能な生物学的に活性なタンパク質をコードする単離ＤＮＡ。４３．前記タンパク質がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のアミノ酸配列を有する、請求項４２に記載のＤＮＡ。４４．ガストリン放出ペプチドレセプターに対して相同性のタンパク質をコードしそしてプローブとしてガストリン放出ペプチドレセプターｃＤＮＡを用いることによって単離される、単離ＤＮＡ。４５．５′及び３′フランクにおいて関連の調節配列を更に含んで成ることを特徴とする、請求項４１，４２又は４４に記載のＤＮＡ配列。４６．請求項４１，４２又は４４に記載のＤＮＡ配列とハイブリダイズし、そしてヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入及びヌクレオチド鎖の反転より成る群から選ばれる突然変異を含み、そしてガストリン放出ペプチドレセプター活性を有するタンパク質をコードする、ＤＮＡ配列。４７．請求項４１，４２又は４４に記載のＤＮＡ配列を含んで成ることを特徴とする、組換ＤＮＡ分子。４８．遺伝子コントロール要素に作動連結している請求項４１，４２又は４４に記載のＤＮＡ配列を含んで成ることを特徴とする組換ＤＮＡ分子。４９．前記コントロール要素が原核系プロモーターシステム及び真核系発現コントロールシステムより成る群から選ばれることを特徴とする、請求項４８に記載の組換ＤＮＡ分子。５０．前記分子が原核系又は真核系宿主においてガストリン放出ペプチドレセプターについてコードする真核系ｃＤＮＡを発現するための発現ベクターであり、前記ベクターが前記宿主と適合しており、そしてここでこのガストリン放出ペプチドレセプターについてコードする真核系ｃＤＮＡが前記ベクターの中に挿入されており、前記ベクターを含む宿主の増殖が前記ｃＤＮＡを発現せしめる、請求項４７に記載の組換分子。５１．請求項４７に記載の組換ＤＮＡ分子が前記宿主に導入されており、そして前記ＤＮＡによりコードされるタンパク質を発現することを特徴とする宿主。５２．Ｅ．コリを含む、グラム陰性及びグラム陽性生物を含む原核細胞；酵母を含む下等真核細胞；並びにヒトを含む動物細胞及び哺乳動物細胞を含む高等真核細胞；より成る群から選ばれる、請求項５１に記載の宿主。５３．請求項４７に記載のＤＮＡ配列によってコードされ、そして組換宿主に由来するもの以外のタンパク質又は細胞夾雑物を実質的に有さない、組換タンパク質。５４．請求項５３に記載の組換タンパク質並びに常用の薬理学的に許容されている担体及び／又は希釈剤を含んで成る薬理学的組成物。５５．ガストリン放出ペプチドレセプターをコードするＤＮＡ又は生物学的に活性なガストリン放出ペプチドレセプターポリペプチドをコードするＤＮＡを含んで成るベクター。５６．前記ＤＮＡがウィルスプロモーターのコントロール下にある、請求項５５に記載のベクター。５７．選別マーカーをコードするＤＮＡを更に含んで成る、請求項５５に記載のベクター。５８．前記ＤＮＡが、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のガストリン放出ペプチドレセプターと約５０％以上のアミノ酸相同性を有する予め決定された部位特異的突然変異ガストリン放出ペプチドレセプターをコードし、そしてＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のガストリン放出ペプチドレセプターと共通の生物活性を示す、請求項５５に記載のベクター。５９．請求項５５に記載のベクターにより形質転換された、多重細胞生物に由来する細胞。６０．哺乳動物細胞である、請求項５９に記載の細胞。６１．請求項５９に記載の細胞を栄養培地の中で培養し、この培養物の中でこのレセプターを蓄積させ、そしてこの培養物からこのレセプターを回収することを含んで成る方法。６２．前記レセプターを培養培地から回収する、請求項６１に記載の方法。６３．組換ガストリン放出ペプチドレセプター又はそのフラグメントに対する結合親和力を有する抗体。６４．ガストリン放出ペプチドレセプター又はそのフラグメントに対して発生された、請求項６３に記載の抗体。６５．前記レセプターがＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のアミノ酸配列を有する、請求項６３又は６４に記載の抗体。６６．前記フラグメントが下記の部分アミノ酸配列：残基１〜３９；残基６４〜７７；残基９８〜１１５；残基１３８〜１５７；残基１７６〜２０９；残基２３６〜２６６；残基２８８〜３００；及び残基３３０〜３８５より成る群から選ばれる、請求項６５に記載の抗体。６７．非中和性抗体である、請求項６３に記載の抗体。６８．中和性抗体である、請求項６３に記載の抗体。６９．毒素に複合した、請求項６３に記載の抗体。７０．放射性核種に複合した、請求項６３に記載の抗体。７０．サンプル中のガストリン放出ペプチドレセプターの濃度を決定するためのキットであって、このガストリン放出ペプチドレセプターに対する既知の結合親和力を有するラベル化合物、組換ガストリン放出ペプチドレセプター、及び自由ラベル化合物から結合物を分離するための手段を含んで成るキット。７２．分離のための前記の手段がガストリン放出ペプチドレセプターを固定化するための固相である、請求項７１に記載のキット。７３．前記ラベル化合物がリガンドである、請求項７１に記載のキット。７４．前記リガンドがガストリン放出ペプチドである、請求項７３に記載のキット。７５．前記ラベル化リガンドが抗体である、請求項７１に記載のキット。７６．前記固相が捕獲分子を含む、請求項７２に記載のキット。７７．前記捕獲分子がガストリン放出ペプチドレセプターに対する抗体である、請求項７６に記載のキット。７８．ガストリン放出ペプチドレセプターに対する試験化合物の結合親和力を決定するためのキットであって、試験化合物、このガストリン放出ペプチドレセプターに対する既知の結合親和力を有するラベル化合物、組換ガストリン放出ペプチドレセプター、及び自由ラベル化合物から結合物を分離するための手段を含んで成るキット。７９．分離のための前記の手段がガストリン放出ペプチドレセプターを固定化するための固相である、請求項７８に記載のキット。８０．前記ラベル化合物がリガンドである、請求項７８に記載のキット。８１．前記リガンドがガストリン放出ペプチドである、請求項８０に記載のキット。８２．前記ラベル化リガンドが抗体である、請求項７８に記載のキット。８３．前記固相が捕獲分子を含む、請求項７９に記載のキット。８４．前記捕獲分子がガストリン放出ペプチドレセプターに対する抗体である、請求項８３に記載のキット。８５．ガストリン放出ペプチドレセプターの異常な発現又は異常な誘発に関連する疾患又は障害を有する患者を処置する方法であって、組換ガストリン放出ペプチドレセプターに対する結合親和力を有する抗体を投与することを含んで成る方法。８６．ガストリン放出ペプチドレセプターの異常な発現又は異常な誘発に関連する疾患又は障害を有する患者を処直する方法であって、組換ガストリン放出ペプチドレセプター又はそのフラグメントを投与することを含んで成る方法。