JPH06508138A - インビボでのコラーゲン分解の検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 インビボでのコラーゲン分解の検出 本出願は、１９８７年１１月６日付で出願され現在米国特許４．９７３．６６６ として発行されている米国出願第１１８．２３４号の一部係属出願である１９８ ９年１２月１日付で出願された米国出願第４４４．８８１号の一部係属出願であ る米国出願第６１４．７１９号の一部係属出願である。

本発明は米国立保儒研究所から授与された補助金ＡＲ３７３１ｇおよびＡＲ３６ ７９４に基づいて政府の支援によって行われた。政府は本発明に一定の権利を有 している。

発明の分野 本願発明はインビボでのコラーゲン分解を検出しそして監視する方法に関するも のである。更に詳細には、本願発明はコラーゲンの分解によりインビボで生成さ れる成る種の架橋テロペプチドを定量する方法およびこのような方法に有用な試 薬に関するものである。

発明の背景 ３つの既知のクラスのコラーゲンが今日までに記載されている。

タイプＬ　ＩＩ、　ＩＩＩ　、　ＶおよびＸＩに更に分けられるクラス１のコラ ーゲンは細繊維を形成することが知られている。これらのコラーゲンは全て、Ｎ −末端およびＣ−末端プロペプチドで形成されるプロ、コラーゲン分子として合 成され、そして該プロペプチドはコアコラーゲン分子に結合している。コラーゲ ン合成中にインビボで自然に生じるプロペプチドを除いた後、残っているコラー ゲン分子のコアは大部分、非三重らせんの末端テロペプチド配列を有する三重ら せんドメインからなっている。これらのテロペプチド配列は細胞外ではコラーゲ ン細繊維の分子間架橋部位として重要な機能を有している。

本願発明はコラーゲン分解によってインビボで生成される特定の架橋テロペプチ ドのアッセイに基づいてコラーゲン分解を検出する方法に関するものである。過 去においては、種々の生化学的マーカーを測定することによってインビボでのコ ラーゲンの分解を監視するアッセイが開発されており、それらマーカーの幾つか はコラーゲンの分解生成物であった。例えば、パリエツト病に関連した骨の変換 は骨コラーゲンが分解した後尿中に排泄されヒドロキシプロリンを含有する小さ いペプチドを測定することによって監視されている。

ラッセル（Ｒｕ＋＋ｅｌｌ　）等、Ｍｅ＋ａｂ、Ｂｏｎｅ　Ｄｉｓ、　ａｎｄ　 Ｒｅ１．　Ｒｅｓ、　４および５．２５５〜２６２　（１９１１１年）；　ジン ガー（Ｓｉｎｇｅｒ）　Ｆ、Ｒ，等、Ｍｒｔａｂ。

ｌｉｃ　Ｂｏａｅ　Ｄｉｓｅａｓｓ、　１１巻（Ａｙｉｏｌｉ、Ｌ、Ｙ、および Ｋａｎｅ、　Ｓ、Ｍ、編）、４８９〜６７５　（１９７８年）、アカデミツクプ レス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク。

他の研究者は関節病におけるコラーゲン分解の指標として尿中の架橋化合物ピリ ジノリンを測定している。背景に関しては、例えばウー（Ｗａ）およびエア（Ｅ ｙｒｅ）　、Ｂｉｏｃｈｅｍｉ出ｙ、　２３＋１８５０　（１９１１４年）、　 ブラック（Ｂｌａｃｋ　）等、Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｒｈｅａｍａ＋ｉ ｃ　Ｄｉｓｅａｓｃｓ。

４８：６４１〜６４４　（１９８９年）；　ロビンス（Ｒｏｂｉｎｓ）等、Ａｎ ｎｚｉ　ｏ［ｔｈｅ参照。

本願発明とは対照的に、幾人かの先行研究者は体液から得られるペプチドを加水 分解しそしてその後側々のヒドロキシピリジニウム残基の存在を探している。こ れらの研究者は誰も、本願発明のような、コラーゲン分解によりインビボで自然 に生成される架橋含有テロペプチドの測定は報告していない。

英国特許出願ＧＢ　２．２０５．６４３は、体内のタイプＩＩＩコラーゲンの分 解が、体液中のタイプＩＩＩコラーゲンから得られるＮ−末端テロペプチドの濃 度を測定することによって定量的に測定されることを報告している。この参照文 献では、架橋テロペプチド領域は望ましくないと報告している。実際、この参照 文献は、コラーゲンの非架橋供給源を使用してテロペプチドを得る必要があると 報告している。

本願発明のペプチドは全て架橋している。コラーゲンの架橋は、「コラーゲン架 橋」の標題の項で以下に更に詳細に考察する。

コラーゲン分解は成る種のプロコラーゲンペプチドを定量することによって測定 できることを示している多数の報文がある。本願発明はプロペプチドではなくて テロペプチドに関するものであり、これら２つはコラーゲン分子中の位置および インビボでのそれらの開裂の時期で区別される。米国特許４．５０４．５８７． 米国特許４，３１２．８５３１〜＋３０４　（１９８５年）；およびロープ（Ｒ ｏｈｄｅ　）等、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎｉｌａｊ　Ｃ１１ｎｔｃｘｌ　 ＩｎｎｓｊｉｇＮｉｏｎ、　ｉ：４５１〜４５９　（１９７９年）参照。

米国特許４．７７８．７６８は滑液試料中のプロテオグリカンモノマーまたはそ の抗原性フラグメントの定量に係わる、関節軟骨中で生じる変化を測定する方法 に関するものである。この特許は分解したコラーゲン由来の架橋テロペプチドの 検出に関するものではない。

ドッグ（Ｄｏｄｇｅ　）　、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、、８３：６４７〜６ １ｉ１　（１９８１年）は、ヒトおよびウシのタイプＩＩコラーゲンの無傷アル ファー鎖および臭化シアン誘導のペプチドと特異的に反応するポリクローナル抗 血清を使用してタイプＩＩコラーゲンの分解を分析する方法を開示している。関 係しているペプチドは本願のような架橋テロペプチドではない。

ヒトのタイプ１１コラーゲン、ヒトのプロαＩ　（ＩＩ）コラーゲンおよびヒト のタイプ１１コラーゲンの全プレプロα１（ＩＩ＋）鎖のアミノ酸配列並びに対 応するｃＤＮＡクローンが幾つかの研究者グループによって研究されそして測定 されている。ロイトル（Ｌｏｉｄｌ　）等、Ｎａｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ＋　Ｒｅ ５ｕ＋ｃｈ　１２：９３８３〜９３９４　（１９８４年）；　サンジ＋５２１〜 ５２８　（１９８９年）；　およびアラコッコ（Ａｌｘ−Ｋｏｋｋｏ　）等、Ｂ ｉｏｃｈｅａ＋、］、　、２ｆｉ虹：５０９〜５１６　（１９８９年）参照。こ れらの参照文献はどれも、インビボで分解した細繊維コラーゲンの量を決定する ために測定できる特別のテロペプチド分解生成物の構造は特定していない。

上記した背景情報にも拘わらず、インビボでのコラーゲン分解を測定する有効で 単純なアッセイの需要が依然としである。このようなアッセイは、ヒトにおける 疾病状態、例えば変形性関節症（タイプ１１コラーゲンの分解）および覆々の炎 症性疾患、例えば脈管炎症候群（タイプ１１コラーゲンの分解）を検出しそして 監視するために使用できよう。

親ａ願、即ち米国出願第１１８．２３４号に記載されたタイプＩコラーゲンの分 解のアッセイはインビボでの骨吸収速度を検出しそして評価するために使用する ことができる。骨吸収速度の検出は骨粗髭症のような疾病を監視しそして検出す る際の重要なファクターであると思われる。骨粗髭症はヒトにおける最も一般的 な骨の疾病である。

骨折し易すくなる初期骨粗髭症は骨格骨質量の漸進的な正味損失に起因する。こ れは米国では１５００〜２０００万の人に影響を与えていると推定される。その 原因は骨の改変、即ち骨組織の合成と分解の速度における年令依存性の不均衡で ある。

約５３８．０００のを椎圧迫骨折、約２２７．０００の腰部骨折およびかなりの 数の初期骨折末梢骨を含めて、約１２０万の骨粗髭症に関連した骨折が毎年高齢 者に発生している。腰部骨折の１２から２０％は重篤な外傷や出血を生じさせる ので致命的であり、そして生存患者の半分は家庭での看護が必要である。骨粗髭 症に関連した傷害による総費用は現在、毎年少な（とも７０億米ドルに達する（ Ｂｏｎｅｓ、　Ｏ，Ｍ、、５ｃｉｅｎｃｅ　、　２３６　：９１４　（１９８７ 年））。

骨粗髭症は、平均して、閉経期後１０年で骨質量の１５％を失う閉経期後の女性 で最も一般的である。この疾病はまた、年寄りの男性や若い無月経の女性競技選 手にも発生する。骨粗幡症の社会的および経済的結果が重要でありそして増加し ているにも拘わらず、患者または正常対象者の骨吸収速度を測定する方法は得ら れていない。この疾病を監視する際の主要な困難は骨吸収速度を測定する特定の アッセイが無いことである。

骨質量を評価する方法はしばしば、ニュートロン活性化分析による全身カルシウ ムの測定またはフォトン吸収技術による一定の骨中の無機質量の測定に依拠して いる。これらの測定は骨質量が減少するかどうかに関する長期間の所見しか与え ない。摂取と排出との比較によってカルシウム平衡を測定することは冗長で、信 頼性がなく、そして骨の無機質が長期間に亘って失われているかどうかを間接的 に概算できるにすぎない。骨質量の減少および骨代謝の変化を評価するために現 在利用できる他の方法には、選択された骨の位置（腕、踵骨等）での定量的走査 型放射線測定および腸骨の稜（ｃｒ！ｓｊ　）生検の組織形態学がある。前者で は１本の骨の特定の部位における骨無機質含量の粗っぽい測定が提供される。組 織形態学では新たに沈着した骨の縁線と再吸収表面との間のバランスの半定量的 評価が得られる。

分解された骨の全身的排出についての２４時間尿アッセイがはるかに一層有用で あろう。無機質研究（例えば、カルシウム平衡）はこれを信頼できるほどまたは 容易に実施することはできない。骨吸収は無機質および有機マトリックスの分解 に関係しているので、体液中の新たに分解した骨生成物の特定の生化学的マーカ ーは理想的な指標であろう。幾つかの可能性のある有機指標が試験されている。

例えば、ヒドロキシプロリン、即ち、コラーゲンおよび骨や他の全ての結合組織 の主要な構造タンパク質に大いに限定されるアミノ酸が尿中に排泄される。その 排泄速度は、一定の条件下、顕著にはパフエツト病、即ち、上記したように骨の 変換が大いに高まっている代謝性骨疾患で高くなることが知られている。このた め、尿ヒドロキシプロリンはコラーゲン分解のアミノ酸マーカーとして広範囲に 使用されてきた。上記で引用したジンが−Ｆ、　Ｒ，等（１９７８年）。

米国特許第３．６００．１３２号は、コラーゲン代謝の偏向を監視するために血 清、尿、腰部液および他の細胞内液のような体液中のヒドロキシプロリンを測定 する方法を開示している。特に、この発明者はパフエツト病、マルファン症候群 、骨形成不全症、コラーゲン組織での新生物増殖および種々の形態の小人症のよ うな病理学的状態では、生物学的液体中のヒドロキシプロリン含量で測定される コラーゲン同化作用または異化作用の上昇が測定され得ることに注目している。

この発明者は、過酸化水素およびＮ−クロロ−ｐ−）ルエンスルホンアミドでヒ ドロキシプロリンをビロール化合物に酸化し、次にｐ−ジメチル−アミノ−ベン ズアルデヒド中で比色測定してヒドロキシプロリンを測定している。

パリエツト病の場合には、尿ヒドロキシプロリンの上昇は多分前分解に大いに由 来する１　しかし乍ら、ヒドロキシプロリンは一般には特定の指標として使用す ることはできない。尿中のヒドロキシプロリンの多くは新しいコラーゲン合成（ 新たに作られるタンパク質のかなりの量は分解されそして組織繊維に導入される ことなく排泄される）、そしてヒドロキシプロリンを含有する成る種の血液タン パク質並びに他のタンパク質の変換に由来すると思われる。更に、タンパク質分 解に由来する遊離ヒドロキシプロリンの約８０％は肝臓で代謝されそして尿中に 現れることはない。キビリコ（Ｋｉｖｉｒｉｋ＋＋）Ｋ、　１．、ＩｎＬ　Ｒｅ ｖ、　Ｃｏｎｎｅｃｔ、　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｒｅｓ、　５：９３　（１９７０年） 並びにバイス（Ｗｅｉｓｓ　）　ｆ’、Ｈ，およびクライン（Ｋｌｅｉｎ）Ｌ、 、］、　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ。

４８：１　（１９６９年）。

コラーゲン性タンパク質に特有のヒドロキシリジンおよびそのグリコシド誘導体 はコラーゲン分解のマーカーとしてヒドロキシプロリンより正確であると考えら れてきた。しかし乍ら、ヒドロキシプロリンに関して上記したのと同じ理由で、 ヒドロキシリジンおよびそのグリコシドも多分同様に骨吸収の非特異的マーカー であろう。

クレーン（Ｋ＋ａｎｅ　）　Ｓ、　Ｍ、およびシモン（Ｓｉｍｏｎ　）　Ｌ、　 Ｓ、、Ｄｅｖｅｌｏｐ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、２２：１８５　（１９８１年）。

コラーゲンに固有のアミノ酸に加えて、オステオカルシン（ｏｎｅｏｃａｌｃｉ ｎ　）またはそれらの分解生成物のような骨マトリックスの覆々の非コラーゲン 性タンパク質が骨代謝の測定を目的としたイムノアッセイの基礎となってきた。

プライス（Ｐｒｉｃｅ　）　Ｐ、Ａ、等、１．　Ｃｌ１ｎ、　ｌｎｗｅ＋Ｌ、６ ６：８７８　（１９８０年）およびグンドバーグ（Ｇａｎｄｂｅｒｇ）Ｃ，Ｍ、 等、Ｍｅｓｈ、　Ｅｎｚ７ｍｏ１．、！０７　：５１６　（１９８４年）。しか し乍ら、骨に由来する非コラーゲン性タンパク質は、潜在的には骨代謝活性の有 用な指標であるが、それ自体では骨吸収の定量的尺度を提供するようには思われ ない。例えば、オステオカルシンの血清濃度は通常の骨および代謝性骨疾病の両 方で実に広範囲に変化する。その濃度は高度の骨格変換の状態で上昇するが、こ れが骨の合成または分解に起因するかどうかは明らかでない。クレーンＳ、Ｉｔ 　等、Ｄｅｖｅｌｏｐ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、２２：１１１５　（１９１１１年）、プライスＰ、　Ａ、等 、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、６６：８７８　（１９８０年）、およびグン ドバーグＣ，Ｍ、等、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｒ７大部分の遺伝タイプのを椎動物コラー ゲンのポリマーは通常の機能のためにアルデヒドが介在した架橋を形成すること が必要である。

コラーゲンアルデヒドはりシルオキシダーゼの作用によって２，３の特定のリジ ンまたはヒドロキシリジン側鎖に由来する。種々のジ、トリおよびテトラ機能性 架橋アミノ酸が、新たに形成されたコラーゲンポリマー内にこれらのアルデヒド の自然発生的な分子内および分子間作用によって形成される。架橋残基のタイプ は組織タイプによって特異的に変化する（エアＤ、　Ｒ，等、Ａｎｎ、Ｒｅｙ、 　ＢｉｏｃｈｅｍＳ５３・７１７〜７４８　（１９８４年））。

架橋の２つの基本的な経路はバンド化した（６７ｎｍ反復）細繊維コラーゲンで 識別することができ、１つの経路はリジンアルデヒドに基づき、もう１つはヒド ロキシリジンアルデヒドに基づいている。

リジンアルデヒド経路は成人の皮膚、角膜、強膜およびラット尾鍵で優勢であり 、そして他の柔軟性結合組織でもしばしば生起する。

ヒドロキシリジンアルデヒド経路は骨、軟骨、靭帯、身体の大部分の朧および大 部分の内部結合組織で優勢である、エアＤ、　Ｒ，等（１９８４年）、上記参照 。生成経路はテロペプチド部位でリジン残基が加水分解されるかどうかによって 支配され、そこでその後リシルオキシダーゼによってアルデヒド残基が形成され る（Ｂｘｒｎｅｓ、　Ｍ、Ｉ、等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、　１３９　：４６１　 （１９７４年））。

リジンアルデヒド経路で成熟した架橋アミノ酸の化学構造は知られていないが、 ヒドロキシピリジニウム残基がヒドロキシリジンアルデヒド経路での成熟生成物 として同定されている。両経路および大部分の組織で、中間体のホウ化水素還元 性の架橋残基は新たに形成されたコラーゲン成熟体として消失し、それらが比較 的短期寿命の中間体であることを示唆している（Ｂａｉｌｅ７．　Ａ、　Ｊ、等 、ＦＥＢＳ　Ｌｅｄ、、残基は、１部には明らかに、新たに作られたコラーゲン 細繊維が急速に無機質化されてそれ以上の自然発生的架橋相互作用を阻止するノ テ、全寿命でカなリノ濃度で存続すル（Ｅ７＋ｅ、　Ｄ、Ｒ，、Ｔｈｅ　Ｃｈｅ ｍｉ＋ｔ＋７　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇ７　ｏｆ　Ｍｉｎｅ＋ａｌｉｚｃｄ　Ｃｏ ｎｎｅｃｔｉｗｅ　Ｔｉｏｕｅｓ　（Ｖｅｉｌ、Ａ編）、５１〜５５頁（１９１ １１年）　、Ｅｌ＋ｅｖｉｅ＋、ニューヨークおよびＷａｌｔｅ＋ｈ、　Ｃ，等 、Ｃａ１ｃ、　Ｔｉ１ｔ、Ｉｎｔｌ、３５：４０１〜４０５　（１９８３年）） 。

３−ヒドロキシピリジニウム架橋の２つの化学式が同定されている（式Ｉおよび Ｉ＋）。

同化合物は共に天然では蛍光性であり、同一の特徴的な励起および発光スペクト ルを有する（ＦｏｉｉＩＩＩＮｏ、　Ｄ、等、８ｉｏｃｂｓｍ、Ｂｉｏｐｈ７（ Ｒｅｓ、　ＣｏｍｍｏＩｌ、、７６：１１２４　（１９７７年）、およびＥ７ｒ ｅ、Ｄ、Ｒ，、Ｄｅｗｅｌｏｐ、　Ｂ１ｏｃｈｃ＋＋＋、　、２２：５０　（１ ９８１年））。これらのアミノ酸は、逆相ＨＰＬＣおよび蛍光検出を使用して良 好な感度で、組織加水分解物中で直接分画しそして分析することができる。ｇ７ ｒｅ　Ｄ、Ｒ，等、Ａｎｘ１７＋ｅ。

Ｂｉａｃｈ帽１．１３７　：３８０　〜３８１１　（１９８４年）。本願発明は アミノ酸ではな（て特別のペプチドの定量に係わっていることに注目すべきであ る。

成長中の動物では、これらの成熟架橋は無機質化したコラーゲン中より骨コラー ゲンの非無機質化フラクション中で一層集中している可能性があることが報告さ れているベーンズ（Ｂｘｎｅｓ、Ａ、Ｊ、等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈ７＋ 、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、、１１３　：１９７５　（１９８３年））。しか し乍ら、若いウシまたはヒト成人の骨に関する他の研究はこの概念を支持してい ない、Ｅ７ｒｅ　Ｄ、Ｒ，、Ｔｈｅ　Ｃｈｅｍｉｓ＋ｔ７　ｘｎｄ　Ｂｉａｌｏ ｇ７　ｏｆ帽ｎｅｒａｌｉｚｅｄ　Ｔｉ５ｓｕｅｓ　（Ｂｕｔｌｅｒ、　Ｗ、Ｔ 、編）　、１０５頁（１９８５年）、エブスコ　メディア　インコーホレーテッ ド（Ｅｂｓｃｏ　Ｍｅｄｉｘ　Ｉｎｃ、）、アラバマ州バーミンガム。

ヒト尿におけるコラーゲン　ヒドロキシピリジニウム架橋の存在は、ペプチド用 の冗長な単離方法および慣用のアミノ酸分析を使用して、リンジャースミス（Ｇ ｕｎｉａ−３ｍｉｔｈ　）およびブセツク（Ｂｏｕｃｅｋ）によって最初に報告 された（Ｇｕｎｊａ−３ｍｉｔｈ、２．　およびＢａｕｃｅｋ、　Ｒ，１，ｓＢ ｉｏｃｈｅｍ、１．．１９７　：１５９　〜７６２　（１９８１年））。その当 時、彼らは架橋のＨＰ形態にしか気付かなかった。ロビンス（Ｒｏｂｉｎｓ、Ｓ 、Ｐｏ、に抱合した遊離アミノ酸に対してポリクローナル抗体が上昇している尿 中のＨＰを測定するために酵素結合イムノアッセイを報告している。このアッセ イは関節炎疾患で生じる関節破壊の増加を監視する指標を提供することを意図し ており、そしてロビンスによれば、ピリジノリンは骨コラーゲン中より軟骨中で はるかに優勢であるとの所見に基づいている。

酵素結合イムノアッセイに係わる更に最近の研究で、ロビンスは、リシルピリジ ノリンはウシ血清アルブミンに共有的に結合したピリジノリンに対する抗血清に 非反応性であることを報告している（Ｒｅｂｉ＋＋＋等、Ａｎｎ、　Ｒｈｅｕｍ 、　Ｄｉｓｅａｓｅｓ、　４５：９６９〜９７３　（１９１１６年））ｏ軟骨破 壊に関するロビンスの尿指標は、主として軟骨に由来するヒドロキシリシルピリ ジノリンが尿中で関節軟骨吸収（即ち、分解）速度に比例する濃度で見い出され るという発見に基づいている。原則として、この指標は全身軟骨損失を測定する ために使用できよう；　しかし乍ら、骨吸収に関する情報は入手できないであろ う。

それ故、ヒトの全身の骨吸収速度の測定を可能にする方法が必要である。最も有 用なこのような方法は体液、特に尿に適用し得るものであろう。方法は感受性、 即ち１ピコモルまで定量的でなければならず、そして種々の療法（例えば、エス トロゲン）の進行を評価できるように２４時間の骨吸収速度を迅速に測定しなけ ればならない。

先願の米国出願第６１４．７１９号、第４４４．　Ｈ１号および第１１８．２３ ４号（これらは本明細書に参照として引用する）は、特別のペプチド、これらペ プチドに基づくコラーゲン分解のアッセイ法、および該方法の実施に有用なキッ トを開示した。更に、米国出願第６１４．７１９号は、次の構造： シュ旦 Ａｓｐ−Ｇｌｕ−に−３ｅｔ−Ｔｈｔ−ＧＩ７−ＧＩ７　ａ　Ｉ　（１）Ｇｌｎ −Ｔ７＋−Ａｓｐ−Ｇ１７−に−Ｇ１７−Ｖａｔ−Ｇ１７　ａ２　（Ｉ）（式中 、　Ｋ はヒドロキシリシルピリジノリン（ＨＰ）またはりシルピリジノリン（Ｌ　Ｐ） であり、そしてＧｌｎはグルタミンまたはピロリドンカルボン酸および同一の結 合エピトープを有する他のペプチドである）を有するペプチドに結合し得る特別 のモノクローナル抗体ＭＡｂ　−ＩＨｌｌを開示した。本願発明はこれら先願の 発見に基づいているが、これまでに開示されていなかったそれらの追加的要素を 提供する。

液中で見い出され得るタイプエコラーゲンから誘導される成る種の新規ペプチド を提供する。これらのペプチドは抗体ＭＡｂ　−ＩＨＩＩによって認識されそし て結合される。ペプチドの構造はエレクトロスプレー質量分析計（ＳＣＩＥＸ器 機を使用して）で測定されおよび／または証明されている。ＭＡｂ　−ＩＨＩＩ を使用して尿から単離されたペプチドの構造は図１の説明で以下に報告し、そし てそれらには米国特許４．９７３．６６６で以前に報告された式並びに幾つかの 比較的小さいそれらの変形体を有するタイプエコラーゲンペプチドが含まれる。

更に、これまでに知られていなかったペプチドがアフィニティークロマトグラフ ィー技術を使用して尿中で発見された。下記図１のピークＤに相当しそして図１ の説明で提供されている構造を有するこのペプチドはコラーゲンのα（２）鎖の ２つの断片からなるペプチドである。本願発明の第１の特徴はこの二量体ペプチ ド、該ペプチドの定量に基づき骨吸収速度に関係があるコラーゲン分解の分析方 法およびこのような定量のためのキットに関するものである。

本願発明の策２の実施態様は、タイプＩコラーゲンに由来する架橋コラーゲンテ ロペプチドを定量する際に使用する組成物に関するものである。骨から得られる コラーゲンをプロテアーゼ処理し、続いてコラーゲンフラグメントを精製して抗 体ＭＡｂ　−ＩＨＩＩによって特異的に認識されるエピトープ中の混合物を富化 すると、体液中インビボで生成するタイプＩコラーゲンテロペプチドのアッセイ に使用できる組成物になることが発見されている。それ故、本発明のこの特徴は 、骨のプロテアーゼ処理で誘導されるコラーゲンペプチドの組成物、該組成物を タイプ■コラーゲンテロペプチドの定量に使用する方法、および凍結乾燥するか または固体支持体上に被覆した上記組成物を溶液中に含有するキットに向けられ ている。

本願発明のこれらの特徴および他の特徴は以下で更に詳細に記載する。

図面の簡単な説明 図１はヒト尿からアフィニティークロマトグラフィーによって単離されたペプチ ドの溶出プロフィールを示す。質量分析計で測定したペプチドの構造は次のとお りである：（式中、Ｊはピログルタミン酸またはグルタミンであり、そして括弧 はアミノ酸が存在するかまたは存在しないことを示す）。

好ましい実施態様の詳細な説明 架橋ペプチド 本願発明の最初の実施態様は、タイプＩコラーゲンに由来しそして骨がインビボ で再吸収されるときに放出され尿から単離できる架橋ペプチドに関するものであ る。これらのペプチドは体液、例えば尿中で自然に生成し、そして標準的な精製 プロトコールで単離することができる。精製されたペプチドは、例えば抗原とし て使用して、その免疫学的結合パートナ−を製造することができる。好ましい精 製プロトコールでは抗体ＭＡｂ−ＩＨＩＩを使用する。この好ましいモノクロー ナル抗体を産生ずるハイブリドーマ（ＩＨＩＩ）は米国菌培養収集機関（ＡＴＣ Ｃ）　、２０８５２メリーランド州ロツクビル、パークローンドライブ１２３０ １　に受理番号ＨＢ　１０６１１で寄託されている。

ＩＨｌｌで産生じたモノクローナル抗体を使用するアフィニティークロマトグラ フィーによるこれらペプチドの精製によって図１に示される高度に精製された骨 −タイブＩコラーゲン架橋Ｎ−テロペプチドが得られる。この方法で単離される 特に興味のあるペプチドは図１のビークＤに相当するものであり、これは次の構 造：１−τｙ丁−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−に−Ｇｌｙ４ａｌ−Ｇｌｙ−（Ｌｅｕ）□ ｊ−Ｔｙ＋−Ａ＋ｐ−Ｇｌｙ−に−Ｇ１７−Ｖａｌ−Ｇ１７−（Ｌｅａ）（式中 、Ｊはピログルタミン酸またはグルタミンであり、（Ｌｅａ）は任意のロイシン （即ち、どちらか１つのロイシンが存在する力＼、両ロイシンが存在するか、ま たはどちらのロイシンも存在しな１ｌＸ）を意味し、そして架橋アミノ酸ＨＰま たはＬＰは結合して（Ｘるに残基で示される）を有している。上記構造は幾つか のペプチドをカッく−するが、便宜上、以下の考察では１つのペプチドを参照す る０この構造は、３つの全く別個のコラーゲン分子から誘導されそれらが一緒に なって架橋していることを意味している点で驚くべきことである。コラーゲン分 子の架橋が分子内で生じるのかまた（よ分子間で生じるのかどうかに関して科学 文献中には議論がある。上記二量体ペプチドの構造は後者の見解を支持している 。

更に実際的な関係では、上記ペプチドは骨吸収速度のア・ソセイで使用すること ができる。このような状況下で、上記参照によって本願明細書に導入した先願の 関連出願で開示された方法、技術、キ・ソト等はこのペプチドに同じように使用 すること力（できる。

このペプチド（およびその寺価吻］の１！ｆましい疋貢玉は七の免役学的結合パ ートナ−を使用する。このペプチドは抗原として、単独かまたは担体分子に抱合 させて使用して、ポリクローナル若しくはモノクローナルまたはその結合フラグ メントであることができる抗体を産生させる。結合フラグメントは、所望の場合 、組み換え技術で産生させることもできる。モノクローナル抗体が好ましい。特 に好ましいモノクローナル抗体は本願明細書に記載したＩＨｌｌによって産生さ れるものである。このペプチドの体液中の量は絶対的な骨吸収速度に直接関係付 けることができるかまたは、このペプチドの値はより多量で生起する他のタイプ ■コラーゲンペプチドに関係付けることができ、これは順次絶対的な骨吸収速度 に関係付けることができる。このペプチドを定量するための試薬等を含有するキ ットも本願発明に従って意図されている。これらのキットは典型的には、上記ペ プチドに対する免疫学的結合パートナ−のような適当な試薬、適当な対照、競合 結合試薬等の容器を含む。他の任意の標準的なペプチド定量法をこれらの目的で 使用することができる。このような方法を実施するためのキットも意図されてい る。

先願の米国出願第６１４．７１９号から本願明細書に導入した開示と同様にして 、上記ペプチドに含有されるピリジノリン環は開環させるかまたは閉環させるこ とができる。ペプチドのどちらか１つの形態かまたは両形態の定量に基づくアッ セイおよびこのアッセイを実施するためのキットも意図されている。

上記した二量体ペプチドに加えて、現在米国特許４．９７３．６６６として発行 されている米国出願第１１８．２３４号の式ＩＩ＋に対応する別のペプチドも尿 から単離される。これらのペプチドは、少数のアミノ酸（例えば、１〜３個）が 体液中でペプチドのＮまたはＣ末端に結合できるという事実を示している。例え ば、式ＩＩ＋のペプチドはＣ１（１）鎖のＮ−末端に結合したＴ７ｒ残基を有す ることができる。更に、図１のビークＡに対応するペプチドはピークＢおよびＣ に含まれるペプチドの等価物である。同様に、ピークＤ内に入るペプチドも、１ 個または少数のアミノ酸がペプチドのＮまたはＣ末端と結合している等価のペプ チドを有していると思われる。これらのアミノ酸は典型的には、インビボでタイ プＩコラーゲン分子中に自然に見い出されるアミノ酸に対応する。用語「から本 質的になる」にはこのようなペプチド等価物が含まれる。

ここで、上記しそして図１に図式的に示されるペプチドを単離する好ましい方法 を記載する： ヒト骨コラーゲンから架橋Ｎ−テロペプチドのアフィニティーカラモノクローナ ル抗体（ＭＡｂ　）ＩＨＩＩは慣用の方法によって、ＣＮＢ＋で活性化したセフ ァロース（登録商標）　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）にカップリングさせた（製造 者のプロトコール）。ＭＡｂ　ＩＨｌｌを含有するマウス腹水液（３ｍｌ　）は 、Ｏ，１５ＭのＮａ　Ｃ１，０，０２５Ｍのトリス−ＨＣｌ　（ＴＢＳ）　、ｐ 　Ｈ７，５で希釈した（１：１ｖ／ｖ）プロティンＧ−セファロース（登録商標 ）アフィニティーカラムに吸着させた。同じ緩衝液で洗浄した後、ＩｇＧは０． １Ｍのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２，５で溶出し、カップリング緩衝液で透析し、 そして活性化したセファロース（登録商標）にカップリングさせた。

２、尿ペプチドの結合および溶出 尿（１７オの青年期男性）をＴＢＳＳ　ｐＨ７，５で希釈しく１：１ｖ／Ｖ）そ してＩＨ１１アフィニティーカラム（５ｍｌの床容量）から２５℃で滴下させ乍 ら溶出した。ＴＢＳで洗浄した後、結合したペプチドは１％（ｖ／ｖ）　トリフ ルオロ酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ）を含有する５０％飽和硫酸アンモニウムで溶出した。

溶出したペプチドは予め調節したＣ１ｇ−５ｅｐ−Ｐａｋ　（Ｗａｔｅｒｙ）を 通過させ、結合したペプチドは５０％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリルで溶出し、そし て乾燥させた。個々のペプチドは、水性０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ中でアセトニ トリル：ｎ−プロパノール（３：１ｖ／ｖ）を使用して逆相ＨＰＬＣ（Ｃ８、Ｒ Ｐ　−３００８ｔｏｖｎｌｅｅ）で分画した。高度に精製した骨のタイプエコラ ーゲン架橋Ｎ−テロペプチドを回収した（図１参照）。

プロテアーゼで生成した組成物 本願発明の第２の実施態様は、インビトロでプロテアーゼを用いて骨コラーゲン を処理して骨コラーゲンから誘導されるペプチドからなる組成物に関するもので ある。１つの好ましいプロテアーゼはコラ−ゲナーゼである。このような組成物 は、ＩＨｌｌによって産生されるモノクローナル抗体によって認識されるエピト ープを有するペプチドフラグメントを含有していなければならない。上記組成物 を精製してこのようなエピトープに富ませることが好ましい（以下で考察する） 。得られた組成物は、上記したようにインビボで生成されるコラーゲン由来のペ プチドを定量するアッセイを実施する際に有用である。例えば、エピトープに富 むコラ−ゲナーゼで生成されたペプチドフラグメントを含有する組成物は固体基 質（例えば、微量滴定アッセイプレート）上に被覆して異種競合イムノアッセイ で使用することができる。これらのペプチドは比較的親水性であると考えられて いるので、それらを比較的疎水性の固体表面に被覆するためには担体分子、例え ば固体基質への吸着を高めるウシ血清アルブミンと組成物中のペプチドの抱合が 必要である。

これらの組成物のペプチドは、検出可能なマーカーを有するペプチドを標識する ことによって溶液中の同種競合イムノアッセイでも有用である。検出可能な適当 な一カーの例には次のものがあるが、これらに限定されない　酵素、補酵素、酵 素インヒビター、発色団、蛍光、燐光物質、化学ルミネセンス物質、常磁性体金 属、スピンラベル（＋ｐｉｎｌａｂｅｌｓ）　、アビジン／ビオチンおよび放射 性核種。プロテアーゼ消化によって生成されるペプチド混合物（標識するかまた は標識していない）は溶液（好ましくは１ミリリツトル当たりＩＨ１１エピトー プを含有する１から１００　ピコモルの濃度のペプチド構造体を有する）で提供 され、そしてキット中に含まれている。これらの標識ペプチドは体液中で自然に 生起するペプチドフラグメントと競合して適当な結合パートナ−と結合する。こ のような組成物はアッセイで対照溶液として使用することもでき、骨コラーゲン のユニットに関して目盛付けすることができる。溶液は安定化するかまたは保存 するために塩および他の標準的な成分を含有することができる。好ましくは、ホ スフェートまたはトリス緩衝生理食塩液が使用される。固体（例えば、凍結乾燥 した）形態のプロテアーゼで生成される組成物を提供することもできる。

任意の種々の標準的なタイプのイムノアッセイを使用して体液中に含有されるコ ラーゲン由来のペプチドの濃度を測定することができる。これらアッセイの多く は本願明細書に記載するプロテアーゼで生成される組成物と適合できる。１つの 特異的なアッセイは、ＩＨ１ｌ抗体を固体支持体に被覆しそしてこの被覆した抗 体を標準量のプロテアーゼで生成するペプチドの存在下で使用して体液中の標的 （＋ａｒｇｃｔ）ペプチドに結合させることに関するものである。次に、プロテ アーゼで生成するペプチドにだけ存在するエピトープに特異的な第２の標識（ｌ ａｂｅｌｅｄ　）抗体を使用して結合した非標的ペプチド（単数または複数）を 検出することができよう。標識抗体量がより多（検ａされることは体液中に標的 ペプチドがより少ないことを意味するだろう。

「富化した」によって、プロテアーゼで生成する組成物が部分的に精製されて組 成物中に含有されるＩＨｌｌによって認識されるエピトープの量が増えることが 意味される。骨コラーゲンは、ＩＨ１１エピトープを含有する約０．１重量％の 式ＩＶ−４１１１のペプチドからなると理解される。それ故、理論的には、可能 な最大富化（完全に精製されたＩＨ１１エピトープに相当する）は１０００倍で あると計算することができる。この精製度は、結合したＩＨ１１抗体を使用して アフィニティークロマトグラフィーで達成することができよう。より低い富化度 、例えば１０倍から５０倍は、ＨＰＬＣまたは他の標準的な精製プロトコールで 達成することができる。好ましくは、ＩＨＩＩエピトープの富化は少なくとも約 １０倍である。特に好ましくは、富化は少なくとも５０倍である。富化度は、Ｉ Ｈ１１モノクローナル抗体を含有するアフィニティーカラムで調製試料を試験し そしてカラムに保持された物質量をカラムに導入された物質量のパーセントとし て測定して確認することができる。

本発明の上記組成物を製造するためには、プロテアーゼ、好ましくは細菌性コラ ゲナーゼを骨コラーゲンと、骨コラーゲンからペプチドフラグメントを生成させ るのに十分な時間接触させることが必要である。好ましくは、骨は微粉末化しそ してこれをコラゲナーゼと接触させる前に脱無機質化する。例えば、ウー、Ｊ− ＪおよびエアＤ、Ｒ，、ｒ微粉砕して無機質保護骨コラーゲンをプロテアーゼ消 化にさらすＪ　、Ｃａ１ｃｉ１．　Ｔｉ５ｓｕｅ　ｌｎｔ、　％　４２：２４３ 〜２４７　（１９８８年）参照。

ＩＨｌｌによって結合され得るペプチドフラグメントを生成できる他のプロテア ーゼも使用できよう。プロテアーゼを骨コラーゲンと接触させ、そしてその後、 生成したフラグメントがＩＨＩＩに結合するかどうかを測定することによって一 定のプロテアーゼをスクリーニングすることができる。

コラゲナーゼはシグマ（Ｓｉｇｔａ　）　、Ｉ　ＣＮバイオケミカルズ（Ｂｉｏ ｃｈｅｍｔｃｘｌｓ）　、ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｔｉｎｇｅｒ　Ｍ ｉｎｎｈｅｉｍ　）等のような商業的な供給元から得ることができる。市販で入 手できるコラゲナーゼは一般に不純物として少量のエラスターゼおよび／または 他の酵素を含有している。このような不純物は、含有されるＩＨ１１エピトープ の収量を高めるコラーゲン分子の更なる開裂をもたらすので、本願明細書に記載 される組成物の製造に実際に有益である。このような調製物はタイプＩコラーゲ ンのＮ−末端のピリジノリン架橋周囲の幾つかの位置でコラーゲン分子を開裂さ せると考えられる。

これら組成物を製造する典型的な方法では、粉末化した骨をコラゲナーゼと接触 させる前に、粉末化した骨を標準的な方法で脱カルシウム化し、洗浄し、加熱し 、水浴中で約３７℃に冷却し、そしてその後細菌性コラゲナーゼと接触させなけ ればならない。コラゲナーゼの量は典型的には、脱カルシウム化した骨の乾燥重 量に基づいて約１＝２５〜１：１（１０重量である。消化は室温から４０℃で少 なくとも約２４時間から４日間またはそれ以上進行させる。好ましくは、接触時 間は約３７℃で２４時間から４８時間である。消化が完了した後、消化物を精製 して約１０００ダルトン未満の分子量を有する小さいペプチド（好ましくは、ト リペプチド）を除去する。例えば、精製はゲルろ過によって達成できよう。次に 、組成物は上記したようにして更に精製してＩＨ１１エピトープを富化させる。

本願発明のコラゲナーゼで生成した架橋ペプチドを調製する特別の方法を次のよ うに記載する： 細菌性コラゲナーゼで生成した架橋ペプチドの調製ヒトの皮質骨（大腿骨）は、 液体Ｎ２で冷却したスペックスミル（Ｓｐｅ！ｗｉｌｌ）　（ＳＰＥＸ　１ｎｄ ｕｓＨｉｅ＋　）で粉末化した。粉末化した骨は４℃で５〜１０日間０．５Ｍの ＥＤＴＡＳ　ｐＨ７，５中で脱カルシウム化した。洗浄したコラーゲンマトリッ クスを０．１ＭのＣ１Ｃ１２、Ｑ、０５Ｍのトリス−ＨＣｌ５　ｐＨ７，５中に 懸濁させ、７０℃で１５分間加熱し、水浴中で３７℃に冷却し、そして細菌性コ ラゲナーゼを加えた（脱カルシウム化した骨の乾燥重量当たりで１：５０）。消 化は３７℃で最低２４時間継続した。消化物を遠心し、そして上清液（ｌｖ／ｖ ％ＴＦＡに調整する）はＣ１８−Ｓ　ｅｐ　−Ｐ　ａｋカートリッジ（Ｗａｔｅ ｒｓ）を通過させた。５％（ｖ／ｖ）のアセトニトリルで洗浄して小さいコラー ゲン性ペプチドを除去した後、富化した架橋ペプチドフラグメントを２０％のア セトニトリルで溶出しそして乾燥した。更なる精製は、モレキュラーシーブクロ マトグラフィー（１０％（ｖ／Ｖ）酢酸中Ｂｉｏ−Ｇｅｔ　ＰＩＯ）　、イオン 交換ＨＰＬＣ（ＤＥＡＥ−５−ＰＷＢｉｏ−Ｒａｄ）および逆相ＨＰＬＣによっ て行うことができよう。

或いは、細菌性コラゲナーゼで生成した骨コラーゲンの架橋Ｎ−テロペプチドは 、本質的に上記方法を使用して、ＭＡｂ　ＩＨＩＩアフィニティーカラムでの吸 着によって直接高度に精製することができよう。

上記した組成物はキット中の容器に水性溶液として入れることができ、またはイ ムノアッセイ等で使用するために固体基質上に被覆して含めることができる。こ のようなアッセイは、本願明細書に上記参照として導入されている先願の関連出 願に記載されているようにして実施することができる。

本発明は好ましい実施態様に関連して記載したが、通常の技彌を有する者は上記 説明を読んだ後に種々の変更、等何物の置換、および本願明細書に記載した主題 の変更を行うことができょう。それ故、本発明は本願明細書に詳記した以外の方 法で実施することができる。

それ故、本願に基づく特許で認められる保護は以下の請求の範囲およびそれらの 等何物だけに限定されるように意図される。

排他的所有権または権利を請求する本発明の実施態様は次のように特定される。

フロントページの続き （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　Ｆｌ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、 ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ、ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ、ＵＳ

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．骨吸収速度の測定方法であって、 ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ および ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、 ▲数式、化学式、表等があります▼ はヒドロキシリシルピリジノリンまたはリシルピリジノリンであり、Ｊはピログ ルタミン酸またはグルタミンであり、そして括弧は任意のアミノ酸を示す）から 本質的になる群から選択される１つまたはそれ以上のペプチドを体液中で定量す る工程を含んでなる上述の測定方法。
2. ２．上記定量が、上記体液を１つまたはそれ以上の上記ペプチドに対する免疫学 的結合パートナーと接触させ、次いで任意の結合した免疫学的結合パートナーを 検出することを含んでなる請求項１に記載の方法。
3. ３．上記体液が尿、血液、血清または滑液である請求項１に記載の方法。
4. ４． ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、▲数式、化学式、表等があります▼はヒドロキシリシルピリジノリンま たはリシルピリジノリンであり、Ｊはピログルタミン酸またはグルタミンであり 、そして括弧は任意のアミノ酸を示す）から本質的になる群から選択されるペプ チド。
5. ５．骨吸収速度測定用キットであって、▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、▲数式、化学式、表等があります▼はヒドロキシリシルピリジノリンま たはリシルピリジノリンであり、Ｊはピログルタミン酸またはグルタミンであり 、そして（Ｌｅｕ）は任意のロイシンである）から本質的になるペプチドに対す る免疫学的結合パートナーのコンテナーを含んでなる上記キット。
6. ６．モノクローナル抗体１Ｈ１１に結合するペプチドを生成し得るプロテアーゼ で骨コラーゲンを消化し、次いで、１Ｈ１１によって認識されるエピトープを少 なくとも１０倍含有するようにペプチド濃度を高めるべく、前記の消化された骨 コラーゲンを精製することによって製造されるペプチドを含んでなる組成物。
7. ７．水性溶液中にある請求項６に記載の組成物。
8. ８．上記ペプチドの濃度が、上記水性溶液１ミリリットル当たり約１から約１０ ０ピコモルである請求項７に記載の組成物。
9. ９．基質に被覆されている請求項６に記載の組成物。
10. １０．上記基質が微量滴定アッセイプレートである請求項９に記載の組成物。
11. １１．上記ペプチドが検出可能なマーカーで標識される請求項６に記載の組成物 。
12. １２．請求項７に記載の組成物のコンテナーを含んでなる骨吸収速度測定用キッ ト。
13. １３．請求項１０に記載の被覆された微量滴定アッセイプレートを含んでなる骨 吸収速度測定用キット。
14. １４．請求項１１に記載の組成物のコンテナーを含んでなる骨吸収速度測定用キ ット。
15. １５．体液を骨コラーゲンから誘導された架橋Ｎ−テロペプチドに対する免疫学 的結合パートナーと接触させ、そして任意の結合した免疫学的結合パートナーを 検出することを含む骨吸収速度の測定方法であって、その際、請求項６に記載の 組成物を対照として使用する上記の方法。
16. １６．体液を骨コラーゲンから誘導された架橋Ｎ−テロペプチドに対する免疫学 的結合パートナーと接触させ、そして任意の結合した免疫学的結合パートナーを 検出することを含む骨吸収速度の測定方法であって、その際、請求項１１に記載 の組成物を競合リガンドとして使用する上記の方法。