JPH06507398A - Heterogeneous conjugate antibody for treatment of HIV infection - Google Patents

Heterogeneous conjugate antibody for treatment of HIV infection

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JPH06507398A
JPH06507398A JP4510961A JP51096192A JPH06507398A JP H06507398 A JPH06507398 A JP H06507398A JP 4510961 A JP4510961 A JP 4510961A JP 51096192 A JP51096192 A JP 51096192A JP H06507398 A JPH06507398 A JP H06507398A
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Inventor
ヒギンズ　ポール　ジェイ
ポッツ　バーバラ　ジェイ
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リプリジェン　コーポレーション
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    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Abstract] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]

ＨＩＶ感染治療のための異種複合抗体 発明の背景 本発明はヒトの免疫不全ウィルス感染の治療に関する。 ヒト免疫不全症ウィルス（ＨＩ　Ｖ）は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の 病原体で、一種のレトロウィルスで、１４９２８球及び単球／マクロファージ系 のＣＤ４　細胞を含む一定の免疫系細胞に感染する。効果的な治療を行わないと ＡＩＤＳ＠者の死亡率はほぼ１００９６である（Ｆｕｃ　ｉ、５ｃｉｅｎｃｅ　 ２３０：６１７．　１９８８）。 優に１００を越えるＨＩＶの変種が確認されている。ＨＩＶエンベロープ糖蛋白 質ｇｐ１２０のアミノ酸配列は殊に変化し易い、そのアミノ酸は１つの種から次 の種へと２０−２５％も変化することがある。種から種への変化に加えて、逆転 写酵素の高いエラー率に起因するゲノム配列におけるさらに微妙な変化もある。 誤った組込みをする率は、１転写サイクル当たり、１ゲノムにつき１エラーを導 入する程十分に高い。従って、特定のウィルスとして分離されたものは、いずれ にせよ、類傭種の一団である。さらに、類似種の多様性と数は、１つのＨＩＶ変 種から次へと異なっているようである。これらの類似種はｉｎ　ｖｉ’Ｖｏ　で 進化するという十分な証拠がある。例えば、感染した個人から連続的に分離され たウィルスは、多様な類似種の比率に相当な一時的変動のあることを顕示してい る（Ｍｅｙｅｈａｎｓ、Ｃｅ／／　５８：９０１．　１９８９）、また、中和耐 性ＨＩＶ変種はＨＩＶが中和抗体の存在下に生育する時に、ｇｐ１２０をコード するウィルス配列における単一塩基の変化によって生じ得るという証拠もある（ Ｒｅｉｔｚ　ｅｔ　ａｌ。、Ｃｅ／／　５４＋５７．　１９８８）。感染した個 人は、最初、ＨＩＶに対して体液性及び細胞性免疫応答を開始する。感染した個 人の免疫応答が実際ウィルスの蔓延及びより耐性の高い変種の発生を促すと信じ るべき理由がある（ＭｃＣｕｎｅ　ｅｔ　ａｌ、、ｒｅツノ　６４：３５１．、 １９９１）。 ヒトＨＩＶ蛋白質に対するヒトモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ形成とＥ ｐｓｔｅｉｎ　Ｂａｒｒ　ウィルスの形質転換によって生成された（Ｂａｎａｐ ｏｕｒ　ｅｔ　ａｌ、、１．　／ｍｍｕｎｏ／、　１３９：４０２７．　１９８ ７；　Ａｍａｄｏｃｉ　ｅｔ　ａｔ、、ＡＩＤＳ　Ｒｅｓ、　１ｔｙｄ　Ｈｕｍ Ｊ／７　Ｒｅｔｒｏｙｉｒｕｓｅｓ　５ニア３．　１９８９）。 さらに最近になって、ＣＤ４受容体の一部に融合された細胞毒からなる細胞毒性 ハイブリッド蛋白質が、ＨＩＶにコードされている蛋白質を発現している細胞を 破壊するための１手段として提唱されている。このアプローチは、ＨＩＶエンベ ロープ蛋白質、ｇｐ１２０が、１４９２８球及び単球／マクロファージ系のある 種の細胞上に存在するＣＤ４受容体を認識するという事実に依存するものである 。このようにして、ＣＤ４の可溶性誘導体は表面ｇｐ’１２０を発現しているＨ ＩＶ感染細胞を標的としてサイトトキシンを向けるために利用できるがもしれな い。Ｃｈａｕｄｈａｒｔｙ　ｅｔ　ａｌ、（Ｎａｔｕｒｅ　３３５：３６９゜１ ９８８）は、ＣＤ４−シュードモナス外毒素ハイブリッド蛋白質をＨＩＶに慢性 感染しているリンパ球に投与すると全般的蛋白質合成に減少を起こすことを発見 した。Ｔｉ１ｌ　ｅｔ　ａｌ、（Ｓｃｉｅｔｙｃｅ　２４２：１１６６、１９８ ８）は、ＣＤ４−リシンＡ融合蛋白質が、慢性感染のＨ９細胞培養においてＤＮ Ａ合成を低減することを見いたした。この戦略の変法において、（：ａｐｏｎｅ ｔ　ａｌ、ＣＮｚ１ｕｒｅ　３３７：５２９．　１９８９）は、可溶性ＣＤ４と ある抗体の定常領域から成るハイブリッド蛋白質を立案した。この分子は免疫系 応答をｇｐ１２０に向けるために立案されたものである。この一般型の他の分子 は、補体を活性化することが示されている（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ 、　Ｎａｔｕｒｅ　３３９ニア８．　１９８９）。 ２つの共有結合した抗体、あるいは抗体が細胞に、あるいはウィルスに仕向けら れた蛋白質に共有結合した抗体から成る異種複合分子が、細胞毒性細胞及び腫瘍 細胞やウィルス感染細胞に仕向ける手段として提唱されている。Ｓｅｇａ　１ｅ ｔ　ａｌ、（米国特許第４，６７６．９８０号）は、架橋異種抗体を免疫系細胞 を好ましくない、あるいはを害な細胞に仕向けるために、架橋異種抗体を用いる ことを提案している。Ｆａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、（ＰＣＴ　公開　ＷＯ９１２ ・００３６０）は、この様な異種複合体をＡＩＤＳの治療に対して提案１７てい る。 特に、Ｆ　ａ　ｘｉ　ｇ　ｅ　ｒらは、ＣＤ４　（あるいはｇｐ１２０のＣＤ４ 結合ドメイン）に融合された高親和性Ｆｃγ受容体特異抗体をＡＩＤＳの治療に 用いることを提唱１−５ている。Ｆａｎｇｅｒらは、また、抗ｇｐ１．２０抗体 のようなＨＩ　Ｖ特異抗体に遊合された高親和性Ｆｅγ受容体特異抗体から成る 異種複合体をＡＩＤＳ冶吟に使用することを示唆している。Ｚａｒｌｉｎｇ　ｅ ｔ　ａｌ、（ＥＰ公開番号０３０８９．３６）は、ＨＩＶ感染細胞に発現された ＨＩＶ抗原に特異的な抗体で、末梢血液のエフェクター細胞に特異的で、ＨＩＶ 感染細胞を殺す能力のある第二抗体に架橋されたものから成る異種複合体抗体に ついて述べている。 発明の概要 一般に、本発明は、共有結合した第−及び第二蛋白質を含む異種複合抗体を特徴 とし、第一蛋白質は末梢血液のエフェクター細胞表面に存在する抗原に対する抗 体を含み、第二の抗体部分はＨＩＶ感染細胞表面に発現されたＨＩＶＭＮあるい はＨＩＶ　ＭＮ変種のｇｐ１２０エンベロープ蛋白質の■３ループ配列に対する 抗体を含んでいる。ここで、エフェクター細胞及びＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓ ｓ細胞を含む第一混合細胞培養において、初期濃度２０ｎｇ／ｍｌの異種複合抗 体は、この第一混合培養細胞の逆転写酵素活性を、エフェクター細胞とＨＩＶ− ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合細胞培養と比較して少なく とも８０％低下させる。ここで、エフェクター細胞は、第一、第二混合細胞培養 においてＣＥＭ−ｓｓ細胞の３倍過剰にあり、逆転写酵素活性は、感染後１（月 」目に測定され、異種複合抗体及びエフェクター細胞は、第一混合細胞培養に感 染後１８時間して加えられ、第一、第二細胞培養は１００−１．　ＯＯＯ単位の ＨＩＶ−ＭＮで感染される。 好適な態様において、第一細胞培養の逆転写酵素活性は、第二混合細胞培養の逆 転写酵素活性に比べて９［〕％以上減少する。 他の好適な態様において、エフェクター細胞及びＨＩＶ−ＭＮ以外のＨＩＶ株に 感染さ第１たＣＥＭ−ｓｓｌｉＢ胞を含む第一混合細胞培養において、初期濃度 ２００ｎｇ／’ｍｌの異種複合抗体は、第一混合培養細胞の逆転写酵素活性を、 エフェクター細胞とＨＩＶ−ＭＮ以外のＨＩ　Ｖ株に感染した当該ＣＥＭ−ｓｓ 細胞を含む他の同一の第二細胞培養の逆転写酵素活性に比べて少くとも５０％低 下させる９゜ここで、第一、第二混合細胞培養において、エフェクター＝細胞は 当該ＣＥＭ−ｓＳ細胞の３倍過剰にあり、逆転写酵素活性は感染後１０ＥコＩＩ に測定され、異種複合抗体及びエフェクター細胞は第一混合細胞培養に感染後１ ８時間にて添加され。 第一、第二細胞培養はＨＩＶ−ＭＮ以外のＨＩＶ株の１００−１０００感染単位 で感染された。 なお別の好適な態様において、異種複合抗体はＨＩＶ＝ＭＮ以外のＨＩ　Ｖ株の Ｖ３ループに結合する。 他の好適な態様において、エフェクター細胞は細胞毒性Ｔリンパ球、好中球、単 球／マクロファージ、及び大型顆粒リンパ球からなるグループから選択される。 そしてエフェクター細胞表面に存在する抗原はＣＤ３である。 もう１つの好適な態様において、エフェクター細胞及びＨＩＶ−ＩＩＩＢに感染 したＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む第一混合細胞培養において、２０日ｇ／ｍ＋の異種 複合抗体は、第一混合培養細胞の逆転写酵素活性を、エフェクター細胞とＨＩＶ Ｂ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合細胞培養の逆転写酵素活性に 比べて少くとも８０％低下させる。ここで、第一、第二混合細胞培養において、 エフェクター細胞はＣＥＭ−ｓｓ細胞の３倍過剰にあり、逆転写酵素活性は感染 後１０日目に測定され、異種複合抗体及びエフェクター細胞は第一混合細胞培養 に感染後１８時間して添加され、第一、第二細胞培養は１００−１０００感染単 位の旧Ｖ−ＩＩＩＢで感染される。 なお別の好適な態様において、エフェクター細胞と、ＨＩＶ株の一つ（Ａｌａｂ ａｍａ、Ｄｕｋｅ６５８７−５、Ｄｕｋｅ６５８７−７、Ｄｕｋｅ７８８７−７ 、ＳＦ２．　ＷＭＪ　２．及びＩＩＩＢ）に感染したＣＥＭ　ｓｓ細胞を含む３ 種またはそれ以上の混合培養細胞において、２０日ｇ／ｍｌの異種複合抗体は、 各々の混合細胞培養の逆転写酵素活性を、エフェクター細胞及び同じＨＩＶ株に 感染したＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一・の混合細胞培養の逆転写酵素活性に 比べて少くとも８０？６低ｒさせる。ここで、第一、第二混合細胞培養において エフェクター細胞はＣＥＭ−ｓｓ細胞の３倍過剰にあり、逆転写酵素活性は感染 後１０！１［１に測定され、異種ｉ（合抗体及びエフェクター細胞は第一混合細 胞培養に感染後１８時間して添加され、第一、第二細胞培養は１００−１．００ ０感染単位のＨＩＶ株で感染される。 関連する態様において本発明は、共有結合 Heterogeneous conjugate antibody for treatment of HIV infection Background of the invention The present invention relates to the treatment of immunodeficiency virus infections in humans. Human immunodeficiency virus (HIV) is the cause of acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). Pathogen, a type of retrovirus, 14928 cell and monocyte/macrophage system infect certain immune system cells, including CD4 cells. without effective treatment The mortality rate for people with AIDS is approximately 10,096 (Fuc i, 5science) 230:617. 1988). Well over 100 variants of HIV have been identified. HIV envelope glycoprotein The amino acid sequence of gp120 is particularly variable; its amino acids can vary from one species to the next. species can vary by as much as 20-25%. In addition to changing from species to species, reversal There are also more subtle changes in the genome sequence due to the high error rate of transcriptases. The rate of misintegration is one error per genome per transcription cycle. high enough to enter. Therefore, if a virus is isolated as a specific virus, In any case, they are a group of mercenaries. Furthermore, the diversity and number of similar species are It seems to vary from species to species. These similar species are invi’Vo There is enough evidence that it evolves. For example, if serially isolated from an infected individual viruses exhibit considerable temporal fluctuations in the proportions of diverse similar species. (Meyehans, Ce // 58:901. 1989), and neutralization resistance. sexual HIV variants encode gp120 when HIV grows in the presence of neutralizing antibodies. There is also evidence that it can be caused by a single base change in the viral sequence ( Reitz et al. , Ce// 54+57. 1988). infected individuals A person initially mounts a humoral and cellular immune response against HIV. infected individuals The belief is that the human immune response actually facilitates the spread of the virus and the development of more resistant variants. There are reasons to do so (McCune et al., retsuno 64:351., 1991). Human monoclonal antibodies against human HIV proteins have been shown to inhibit hybridoma formation and E. Produced by transformation of pstein Barr virus (Banap our et al, 1. /mmuno/, 139:4027. 198 7; Amadoci et at, AIDS Res, 1tyd Hum J/7 Retroyiruses 5 Near 3. 1989). More recently, cytotoxicity consisting of a cytotoxin fused to part of the CD4 receptor The hybrid protein targets cells expressing the protein encoded by HIV. It has been proposed as a means of destroying it. This approach Rope protein, gp120, is present in 14928 cells and monocyte/macrophage lineages. It relies on the fact that it recognizes the CD4 receptor present on the cells of the species. . In this way, a soluble derivative of CD4 can be isolated from surface gp'120-expressing H It could be used to target cytotoxins to IV-infected cells. stomach. Chaudharty et al, (Nature 335:369゜1 988) developed a CD4-Pseudomonas exotoxin hybrid protein to chronically infect HIV. Discovered that administration to infected lymphocytes caused a decrease in general protein synthesis did. Ti1l et al, (Science 242:1166, 198 8) showed that the CD4-ricin A fusion protein was able to stimulate DNA in chronically infected H9 cell cultures. It was found that A synthesis was reduced. In a variation of this strategy, (:apone tal, CNz1ure 337:529. (1989), soluble CD4 and A hybrid protein consisting of the constant region of an antibody was designed. This molecule is the immune system It was designed to direct the response to gp120. Other molecules of this general type has been shown to activate complement (Traunecker et al. , Nature 339 Near 8. 1989). Two covalently linked antibodies, or antibodies, directed against cells or viruses. A heterogeneous complex molecule consisting of an antibody covalently linked to a protein that targets cytotoxic cells and tumors. It has been proposed as a means to target cells and virus-infected cells. Sega 1e tal, (U.S. Pat. No. 4,676.980), cross-linked xenoantibodies to immune system cells. Using cross-linked xenoantibodies to target unwanted or harmful cells I am proposing that. Fanger et al, (PCT published WO912 ・00360) has proposed such a heterogeneous complex for the treatment of AIDS17. Ru. In particular, F.a.xi.g.e.r. et al. High-affinity Fcγ receptor-specific antibodies fused to (binding domain) for the treatment of AIDS There are 1-5 proposals for using the method. Fanger et al. also reported that anti-gp1.20 antibodies consists of a high affinity Feγ receptor-specific antibody conjugated to an HIV-specific antibody such as The use of heterogeneous complexes in the treatment of AIDS is suggested. Zarling e tal, (EP Publication No. 03089.36) was expressed in HIV-infected cells. Antibodies specific to HIV antigens, specific to peripheral blood effector cells, A heterogeneous complex antibody consisting of a second antibody cross-linked with the ability to kill infected cells It talks about. Summary of the invention In general, the invention features a heteroconjugate antibody comprising a covalently linked first and second protein. The first protein is an anti-antigen present on the surface of effector cells in the peripheral blood. The second antibody portion contains HIVMN expressed on the surface of HIV-infected cells or is for the ■3-loop sequence of the gp120 envelope protein of the HIV MN variant. Contains antibodies. Here, effector cells and HIV-MN infected CEM-s In the first mixed cell culture containing S cells, an initial concentration of 20 ng/ml of heterogeneous conjugate anti- The body transfers the reverse transcriptase activity of this first mixed culture of cells to effector cells and HIV- compared to another identical second mixed cell culture containing MN-infected CEM-ss cells. Both will be reduced by 80%. Here, the effector cells are the first and second mixed cell culture. in CEM-ss cells, and reverse transcriptase activity was in 3-fold excess in CEM-ss cells at 1 month postinfection. ”, the xenoconjugated antibodies and effector cells are first detected in the mixed cell culture. 18 hours after staining, the first and second cell cultures were incubated at 100-1.　OOO unit infected with HIV-MN. In a preferred embodiment, the reverse transcriptase activity of the first cell culture is reverse transcriptase activity of the second mixed cell culture. It decreases by more than 9% compared to the transcriptase activity. In other preferred embodiments, effector cells and HIV strains other than HIV-MN. In the first mixed cell culture containing infected CEM-ssliB cells, the initial concentration 200 ng/'ml of the heteroconjugate antibody inhibited the reverse transcriptase activity of the first mixed culture cells. The CEM-ss infected with effector cells and HIV strains other than HIV-MN at least 50% lower than the reverse transcriptase activity of another identical second cell culture containing cells 9°Here, in the first and second mixed cell culture, the effector = cell is The CEM-sS cells are in 3-fold excess, and reverse transcriptase activity is 10EcoII after infection. The xenoconjugated antibodies and effector cells were measured at 1 p.i. after infection of the first mixed cell culture. Added at 8 hours. The first and second cell cultures contain 100-1000 infectious units of HIV strains other than HIV-MN. was infected with. In yet another preferred embodiment, the heteroconjugate antibody is of an HIV strain other than HIV=MN. Binds to V3 loop. In other preferred embodiments, the effector cells are cytotoxic T lymphocytes, neutrophils, monocytes. selected from the group consisting of globules/macrophages, and large granular lymphocytes. The antigen present on the surface of effector cells is CD3. In another preferred embodiment, the effector cells and infected with HIV-IIIB In the first mixed cell culture containing CEM-ss cells, 20 days g/m+ xenogeneic The conjugated antibody increases the reverse transcriptase activity of the first mixed culture cells between effector cells and HIV. Reverse transcriptase activity of another identical second mixed cell culture containing B-infected CEM-ss cells. Reduce by at least 80% compared to Here, in the first and second mixed cell culture, Effector cells are in 3-fold excess over CEM-ss cells, and reverse transcriptase activity is The xenoconjugate antibodies and effector cells were measured 10 days after the first mixed cell culture. were added 18 hours after infection, and the first and second cell cultures had 100-1000 infected cells. It is infected with the former V-IIIB. In yet another preferred embodiment, the effector cell and one of the HIV strains (Alab ama, Duke6587-5, Duke6587-7, Duke7887-7 , SF2. WMJ 2. and IIIB) containing CEM ss cells infected with In mixed culture cells of species or more, 20 g/ml of xenoconjugated antibody Reverse transcriptase activity of each mixed cell culture was tested on effector cells and the same HIV strain. Reverse transcriptase activity of other identical mixed cell cultures containing infected CEM-ss cells Make it at least 80-6 lower r. Here, in the first and second mixed cell culture Effector cells are in 3-fold excess over CEM-ss cells, and reverse transcriptase activity is After 10!1 [1, xenogeneic antibodies and effector cells were 18 hours after infection, the first and second cell cultures were added at 100-1.00 infected with 0 infectious units of the HIV strain. In a related aspect, the invention provides covalent bonding

【また第−及び第二蛋白質を含む異種 複合抗体を特徴とし、第一蛋白質は末梢血液のエフェクター細胞表面に存在する 抗原に対する抗体を含み、第二の抗体部分はＨＩＶ感染細胞表面に発現されたＨ ＩＶ−ＭＮあルイｌ！ＨＩ　Ｖ−ＭＮ変種のｇｐ１２０エンベロープ蛋白質のｖ ３ループ配列に対する抗体を含んでいる。ここで、エフェクター細胞及びＨＩＶ −ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む第一混合細胞培養において、初期濃度１０ｎ ｇ／口〕ｌの異ｆ！複合抗体は、この第一混合培養細胞の逆転写酵素活性を、エ フェクター細胞とＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合 細胞培養と比較して少なくとも８０％低丁させる。ここで、エフェクター細胞は 、第一、第二混合細胞培養においてＣＥＭ−ｓｓ細胞の３倍過剰にあり、逆転写 酵素活性は、感染後１０日［１にＭ１定され、異ｆ！複合抗体及びエフェクター 細胞は、第一混合細胞培養に感染後１８時間して加えられ、第一、第二細胞培養 は１００−１０００単位のＨＩＶ−ＭＮで感染される。 関連する態様において本発明は、共有結合した第−及び第二蛋白質を含む異種複 合抗体を特徴とし、第一蛋白質は末梢血液のエフェクター細胞表面に存在する抗 原に対する抗体を含み、第二の抗体部分はＨＩＶ感染細胞表面に発現されたＨＩ Ｖ−ＭＮあるいはＨＩＶ−ＭＮ変種のｇｐ１２０エンベロープ蛋白質のＶ３ル− プ配列に対する抗体を含んでいる。ここで、エフェクター細胞及びＨＩ　Ｖ−Ｍ Ｎ感染ＣＩＩＪｆ−ｓｓ細胞を３む第一混合細胞培養において、初期濃度５ｎｇ ／ｍｌの異種複合抗体は、この第一混合培養細胞の逆転写酵素活性を、エフェク ター細胞とＨ［Ｖ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合細胞培 養と比較して少なくとも８０９６低下させる。ここで、エフェクター細胞は、第 一、第二混合細胞培養においてＣＥＭ−ｓｓ細胞の３倍過剰にあり、逆転写酵素 活性は、感染後１０日目に測定され、異種複合抗体及びエフェクター細胞は、第 一混合細胞培養に感染後１８時間して加えられ、第一、第二細胞培養は１００− １０００中位のＨＩＶ−ＭＮて感染される。 他の関連する態様において本発明は、共有結合（７た第一・及び第一蛋白質を八 む異種複合抗体を特徴とし、第一蛋白質は末梢血液のエフェクター細胞表面に存 在する抗原に対する抗体を含み、第二の抗体部分はＨＩＶ感染細胞表面に発現さ れたＨＩＶ−ＭＮあルＬ”ｌ；ｉＨＩ　Ｖ−ＭＮ変ｍのｇｐ１２０エンベロープ 蛋白質〕Ｖ３ループ配列に対する抗体を含んでいる。ここで、エフェクター細胞 及びＨＩ　Ｖ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む第一混合細胞培養において、初 期１度１ｎｇ／ｍｌの異種複合抗体は、この第一混合培養細胞の逆転写酵素活性 を、エフェクター細胞とＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓ５細胞を含む他の同一の第 二混合細胞培養と比較し、て少なくとも８０％低下させる。ここで、エフェクタ ー細胞は、第一、第二混合細胞培養においてＣＥｈ４−ｓｓ細胞の３倍過剰にあ り、逆転写酵素活性は、感染後１０ＥＥ目にＭ１定され、異種複合抗体及びエフ ェクター細胞は、第一混合細胞培養に感染後１８時間ｊ７て加えられ、第一・、 第二細胞培養は１００−１０００単位のＨＸＶ−ＭＮで感染される。 関連する態様において本発明は、共有結合した第−及び第二蛋白質を含む異種複 合抗体を特徴とし、第一蛋白質は末梢血液のエフェクター細胞表面に存在する抗 原に対する抗体を含み、第二の抗体部分はアミノ酸配列ＧＰＧＲＡＦに対する抗 体を含んでいる。 好適な態様において、エフェクター細胞及びＨＩＶ−ＭＮに感染したＣＥＭ−ｓ ｓｍ胞を含む第一混合細胞培養において、２　（，１ｎ　ｇ／ｍ　ｌの異種複合 抗体は、第一混合培養細胞の逆転写酵素活性を、細胞きＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥＭ −ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合細胞培養の逆転写酵素活性に比べて少くと も８０％低下させる。ここで、第一、第二混合細胞培養において、エフェクター 細胞はＣＥＭ−ｓｓ細胞の′３倍過剰にあり、逆転写酵素活性は感染後１０日目 に測定され、異種複合抗体及びエフェクター細胞は第一混合細胞培養に感象後１ ８時間して添加され、第一、第二細胞培養は１００−１０００感染単位のＨＩＶ −ＭＮで感染される。 関連する態様において本発明は、共存結合した第−及び第二蛋白質を含む異種複 合抗体を特徴とし、第一蛋白質は末梢血液のエフェクター細胞表面に存在する抗 原に対する抗体を含み、第一の抗体部分はアミノ酸配列ＩＸＩＧＰＧＲに対する 抗体を含んでいる。ここで、Ｘはいかなるアミノ酸でもよい。 好適な態様において、エフェクター細胞及びＨＩＶ−ＭＮに感染したＣＥＭ−ｓ ｓ細胞を含む第一混合細胞培養において、２０ｎｇ／ｍｌの異種複合抗体は、第 一混合培養細胞の逆転写酵素活性を、エフェクター細胞とＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥ Ｍ−ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合細胞培養の逆転写酵素活性に比べて少く とも８０％低下させる。ここで、第一、第二混合細胞培養においてエフェクター 細胞はＣＥＭ−ｓｓ細胞の３倍過剰にあり、逆転写酵素活性は感染後１０日目に 測定され、異種複合抗体及びエフェクター細胞は第一混合細胞培養に感染後１８ 時間して添加され、第一、第二細胞培養は１００−１０００感染単位のＨＩＶ− ＭＮで感染される。 関連する態様において本発明は、共有結合した第−及び第二蛋白質を含む異種複 合抗体を特徴とし、第一蛋白質は末梢血液のエフェクター細胞表面に存在する抗 原に対する抗体を含み、第二の抗体部分はアミノ酸配列ＱＡＲＩＬＡＶＥＲＹＬ ＫＤＱＱＬＬＧ　ＩＷＧＣ５ＧＫＬ　ＩＣに対する抗体を含んでいる。 好適な態様において、エフェクター細胞及びＨＩＶ−ＭＮに感染したＣＥＭ−ｓ ｓ細胞を含む第一混合細胞培養において、２０ｎｇ／ｍｌの異種複合抗体は、第 一混合培養細胞の逆転写酵素活性を、エフェクター細胞とＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥ Ｍ−ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合細胞培養の逆転写酵素活性に比べて少く とも８０％低下させる。ここで、第一、第二混合細胞培養においてエフェクター 細胞はＣＥＭ−ｓｓ細胞の３倍過剰にあり、逆転写酵素活性は感染後１０日目に 測定され、異種複合抗体及びエフェクター細胞は第一混合細胞培養に感染後１８ 時間して添加され、第一、第二細胞培養は１００−１０００感染単位のＨＩＶ− ＭＮで感染される。 他の好適な態様において、エフェクター細胞は細胞毒性１９２６球、好中球、単 球／マクロファージ、及び大型顆粒リンパ球からなるグループから選択される。 そしてエフェクター細胞表面に存在する抗原はＣＤ３である。 その他の好適な態様において本発明は、薬理学的に効果的な量の上述の異種複合 抗体を含む、薬理学的に許容できる混成物に関する。 関連する態様において本発明は、ＨＩＶに感染した患者の治療法に関し、この方 法には、上述の薬理学的に許容できる混成物の患者への投与を含む。 その他の態様において本発明は、（ａ）細胞表面抗原を発現するエフェクター細 胞、及び（ｂ）上述の異種複合抗体を含む、ＨＩＶを標的とするエフェクター細 胞に関する。 関連する態様において本発明は、ＨＩＶに感染した患者の治療法に関し、この方 法には、上述のＨＩＶを標的とするエフェクター細胞の患者への投与を含む。 ＭＮ基本型ウィルスは、ｇｐ１２０エンベロープ蛋白質のｖ３ループ領域中、位 置ＡＩ　’１７における特定のアミノ酸サブ配列に−Ｒ−に−Ｒ−１−Ｈ−１− Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｆ−Ｙ−Ｔ−Ｔ−Ｋにより定義される。（アミノ酸配列は 標準的な一文字表記で示す。）ＭＮウィルス変種は、上述のＨＩＶ−ＭＮ配列と 位置Ａ７〜Ａ１、のアミノ酸残基１−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒが完全に一致し、残り１２ アミノ酸が上述のＨＩＶ−ＭＮ配列と最低３６％の相同性を有するものである。 “に対する°とは、指示された抗原に結合する抗体を意味する。ｇｐ１２０のＶ ３ループは、Ｒａｔｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（Ｎａｔｕｒｅ　３１３：２７７． １９８５）のｇｌ）１２０番号付けによるアミノ酸３０３〜３３８の３６アミノ 酸領域として定義される。 本発明の異種複合抗体は非常に効果的である。逆転写酵素アッセイにより示され る通り、低濃度においてもウィルス復製をほぼ完全に阻害する。好適な異種複合 抗体は、一つ以上の株に効果的なものである。 本発明の他の特徴及び利点は、以下に記載する好適な実施例及び特許請求の範囲 から明確である。 発明の詳細な説明 ４、【図面の簡単な説明】 図１は、細胞毒性１９２８球存在下でのＨＩＶ−１１１Ｂ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞 の逆転写酵素活性に対する、０ＫＴ３抗体と５９．１抗体の複合していない混合 物（黒菱形）及び０ＫＴ３１５９．１異種複合抗体（白四角）の効果を示したグ ラフである。逆転写酵素活性（ｃｐｍ／１０μｍ）は、細胞培養物中の初期抗体 濃度（ｎｇ／ｍｌ）の関数で示している。 図２は、細胞毒性１９２８球存在下でのＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞の逆 転写酵素活性に対する、０ＫＴ３抗体と５９．１抗体の複合していない混合物（ 黒菱形）及び０ＫＴ３１５９．１異種複合抗体（白四角）の効果を示したグラフ である。逆転写酵素活性（ｃｐｍ／１０μｍ）は、細胞培養物中の初期抗体濃度 （ｎｇ／ｍｌ）の関数で示している。 図３は、細胞毒性Ｔリンパ球非存在下でのＨＩＶ−１１１Ｂ感染ＣＥＭ−ｓｓ細 胞の逆転写酵素活性に対する、０ＫＴ３抗体と５９．１抗体の複合していない混 合物（白丸）及び０ＫＴ３１５９．１異種複合抗体（黒丸）の効果を示したグラ フである。細胞毒性１９２６球のみ存在下でのＨＩＶ−１１１Ｂ感染ＣＥＭ−ｓ ｓｌ［胞の逆転写酵素活性（黒三角）；ＨＩＶ−１１１Ｂ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞 のみの逆転写酵素活性（白玉角）；及び感染していないＣＥＭ−ｓｓ細胞のみの 逆転写酵素活性（黒画角）も併せて示している。逆転写酵素活性（ｃｐｍ／１０ μｌ）は、細胞培養物中の初期抗体濃度（ｎｇ／ｍｌ）の関数で示している（抗 体を添加しない場合を除く）。 図４は、１μｇ／’ｍｌの０ＫＴ３１５９．１異種複合抗体存在下での、逆転写 酵素活性に対する細胞毒性１９２６球とＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞の比 率の効果を示したグラフである。逆転写酵素活性（ｃｐｍ／１０μｍ）は、ＯＥ Ｍ−ｓｓ細胞に対する細胞毒性リンパ球の関数で示している（　ｌ　ｏ　ｇ　１ ０スケール）。 図５は、ＨＩＶ−ＭＮ（パネルＡ）　、ＨＩＶ−Ａｌａｂａｍａ　（パネルＢ） 、ＨＩＶ−Ｄｕｋｅ７８８７−７　（パネルＣ）　、ＨＩＶ−Ｄｕｋｅ６５８７ −５（パネルＤ）　、ＨＩＶ−Ｄｕｋｅ６５８７−７　（パネルＥ）　、ＨＩＶ −Ｉ　Ｉ　ＩＢ（パネルＦ）　、ＨＩＶ−５Ｆ２　（パネルＧ）、及びＨＩＶ− ＷＭＪ２（パネルＨ）に感染したＣＥＭ−ｓｓ細胞の逆転写酵素活性に対する、 細胞毒性１９２６球と０ＫＴ３１５９．１異種複合抗体（白四角）及び０ＫＴ３ 抗体と５９．１抗体の複合していない混合物（黒三角）の効果を示したグラフで ある。逆転写酵素活性（ｃｐｍ／１０μｍ）は、感染後の日数の関数で示してい る。 図６は、ＨＩＶ−１１１８感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞の逆転写酵素活性に対する、複 合０ＫＴ３抗体と６Ｃ５抗体の混合物（白丸）及び０ＫＴ３／６Ｃ５異種複合抗 体（黒丸）の効果を示したグラフである。逆転写酵素活性（ｃｐｍ／１０μｌ） は、細胞培養物中の初期抗体濃度（ｎｇ／ｍｌ）の関数で示している。 ＡＩＤＳ治療に対する異種複合抗体 本発明の分子は、ＨＩＶに感染した細胞を殺すことのできる細胞毒性免疫エフェ クター細胞表面に存在する抗原に対する第一の抗体を、ＨＩＶ感染細胞の表面に 存在するＨＩＶ抗原に対する第二の抗体に結合することにより作製した異種複合 抗体である。 本発明の異種複合抗体は非常に効力が高い。これらの異種複合抗体は、低濃度で も、ＨＩＶに感染した細胞とエフェクター細胞の混合細胞培養物中のＨＩＶ活性 を十分に低下させることができる。最も好適な異種複合抗体は、高い効力と広範 囲の反応性の両方を兼ね備えたものである。広範囲の反応性を有する異種複合抗 体とは、一つ以上のＨＩＶ株に対して効果的であるものを指す。例えば、広範囲 の反応性を有する異種複合抗体は、ＨＩＶ−ＭＮとＨＩＶ−３Ｆ２またはＩＩＶ −ＭＮとＨＩＶ−ＷＭＪ２まりｌ！ＨＩ　Ｖ−ＭＮとＨＩＶ−１１１Ｂｌ：対し て効果的である。 ＨＩＶに感染した細胞を殺すことのできる細胞毒性免疫エフェクター細胞に対す る異種複合抗体の一部は、細胞毒性１９２６球、単球／マクロファージ、大型顆 粒リンパ球（細胞とＮＫ細胞を含む）及び好中球のような細胞の表面に存在する 抗原を認識する。細胞毒性免疫エフェクター細胞に対する抗体はエフェクター細 胞表面上の抗原に結合し、細胞溶解活性を誘発することが好ましい。例えば、認 識された抗原はＣＤ３受容体またはＣＤ１６　（Ｆｃ）受容体である。細胞溶解 活性を誘発するために複数のシグナルを必要とする受容体（例えば、ＣＤ２及び ＣＤ２８受容体）に対する抗体はあまり好ましくない。 ＨＩＶに感染した細胞表面に存在する抗原に対する異種複合抗体の一部は、（１ ）ＨＩＶ−１のＭＮ基本型（ＨＩ　Ｖ−ＭＮ）のｇｌ）１２０エンベロープ蛋白 質のｖ３ループ配列中のエピトープ、（２）ＨＩＶ−１のＭＮ基本型のウィルス 変種のｇｌ）１２０エンベロープ蛋白質のｖ３ループ配列中のエピトープ、（３ ）アミノ酸５８４〜６１１の間にあるｇｐ４１の一部の中のエピトープを認識す ることが好ましい。 ｇｐ１２０の■３ループは、Ｒａｔｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、（Ｎａｔｕｒｅ　３１ ３：２７７．１９８５）のｇｌ）１２０番号付けによるアミノ酸３０３〜３３８ の３６アミノ酸領域である。ＭＮ基本型ウィルスは、ｇｐ１２０エンベロープ蛋 白質の中のアミノ酸サブ配列に−Ｒ−に−Ｒ−１−Ｈ−１−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ −Ｆ−Ｙ−Ｔ−Ｔ−Ｋ　（Ａ’　−Ａ’）により定義される。ＭＮウィルス変種 は、上述の旧Ｖ−ＭＮ配列と位置Ａ７〜Ａ１１のアミノ酸残基１−Ｇ−Ｐ−Ｇ− Ｒが完全に一致し、残り１２アミノ酸が上述のＨＩＶ−ＭＮ配列と最低３６％の 相同性を有するものである。 上述の、ＨＩＶに対する抗体は、非常に効力の高い異種複合抗体を作製するため の良い候補である。しかし、作製された異種複合抗体の効力が高くない場合もあ る。最終的には本発明の異種複合抗体の作製における、ＨＩＶに対する特定の抗 体の有用性を評価するには、異種複合抗体を作製するしかない。例えば、）Ｉｔ ■に対する抗体を抗ＣＤ３抗体に共有結合させ、適切なアッセイ法により異種複 合抗体の効力を評価するなどである。一度、ＨＩＶに対する特定の抗体の異種複 合抗体作製における有用性が示されれば、その抗体を他のエフェクター細胞抗原 に対する抗体に共有結合させることにより、他の異種複合抗体を作製するのに使 用することができる。 上述の通り、最も好適な異種複合抗体は、効力の高さと共に広範囲の反応性を兼 ね備えたものである。（１）Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｆの配列を有するエピトープ 、（２）Ｉ−Ｘ−１−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ（ここでＸはいかなるアミノ酸でもよ０） の配列を有するエピトープ、または（３）ｇｐ４１のアミノ酸５８４〜６１１（ Ｒａｔｎｅｒ　ｅｔ　ａｔ、、５ｕｔｙｒｓの番号付けζこよる）部分の中（こ あるエピトープ、を認識するＨＩＶに対する抗体は、効力が高く広範囲の反応性 を有する異種複合抗体の作製に有用であると思われる。これは、ＨＩＶ−ＭＮの ｖ３ループ、ＨＩＶ−ＭＮウィルス変種のｖ３ループ、またはｇｐ４１中のエピ トープを認識する抗体を、効力が高く広範囲の反応性を有する異種複合抗体の作 製；こ使用することができないことを示すものではない。 異種複合抗体の調製にＹ−１用なＨＩＶに対する抗体を作製及びスクリーニング 技術、異種複合抗体の調製法、及び異種複合抗体の効力及び反応性の広さの評価 法を以下に記載する。広範囲の反応性を有する異種複合抗体を作製するためには 、広範囲の１（ＩＭ株を認識する、ＨＩＶに対する抗体（すなわち、株に特異的 ではない抗体）を選択するのが効果的である。アミノ酸配列Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ −Ｆ。 アミノ酸配列１−Ｘ−［−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ（ここでＸはいかなるアミノ酸でもよ い）、またはｇｐ４１のアミノ酸５８４〜アミノ酸６１１部分の中にあるエピト ープに対する抗体を選択するのも効果的である。これらの抗体は、以下に記載す る標準的なエピトープマソビング技術を用いて同定することができる。 一般的に、有用な、ＨＩＶに対する抗体の作製及び選択過程には以下が含まれる 。（１）ハイブリドーマの作製及び反応性を有する抗体を生産するハイブリドー マの選択、（２）ＨｒＶエンベロープ蛋白質を発現する細胞への結合能を有する 抗体を生産するハイブリドーマの選択、（３）選択されたモノクローナル抗体の 増幅及び精製、（４）ｇｐ１２０　Ｖ３ループペプチドまたはｇｐ４１由来のペ プチドを用いた、抗体の反応性の解析、（５）エピトープマツピング。上述の通 り、これらの工程のすべてが必須なわけではない。１〜３の工程を簡略にし、異 種複合抗体を調製するのに精製された抗体を使用することができる。なお、この 異種複合抗体の効力及び反応性の広さは、以下に記載する逆転写酵素アッセイに より解析することができる。本発明の異種複合抗体を作製するために、精製され た、ＨＩＶに対する抗体を、免疫エフェクター細胞に対する抗体に共有結合させ る。異種複合抗体の効力及び反応性の範囲は、エフェクター細胞とＨＩＶに感染 した細胞の混合細胞培養物中で逆転写酵素アッセイを用いて測定することができ る。 異種複合抗体は、いかなる架橋法によっても形成することができる。適切な架橋 法には、５ＰＤＰＳＳＰＤＰとＳＭＣＣ，及びビオチン−アビジンが含まれる。 Ｓｅｇａｌ　ｅｔ　ａｌ、（米国特許第４，６７６．９８０号）は、多くの架橋 技術について記述している。その他の方法として、ハイブリッド−ハイブリドー マを経て２つの特異性を有する抗体を作製することにより（Ｓｕｒｅｓｈ　ｅｔ ａｌ、、Ａｆｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１２１°２１０．　 １９８６）　、または遺伝子工学により抗体を結合することができる。 ）１１Ｖに対する抗体の調製 本発明の異種複合抗体分子の調製に有用な抗体は、以下に記載する通りに作製及 びスクリーニングすることができる。ＨＩＶ−ＭＮまたはＨＩＶ−ＭＮのウィル ス変種のＶ３ループに対する抗体の調製及び解析も、１９９１年３月６日に出願 された米国特許出願第０７／６６５，３０６号（本発明の参考文献に取り入れら れている）に記載されている。 免疫原の調製 異種複合抗体分子の作製に有用な、ＨＩＶに対する抗体の１群は、ＨＩ　Ｖ−Ｍ ＮまたはＨＩ　Ｖ−ＭＮのウィルス変種のｖ３ループ中の配列を認識する。従っ て、これらの抗体の作製に使用する免疫原には、ｇｐ１６０、ｇｐ１２０、Ｖ３ Ｊレープの全体または一部を含むｇｐ１２０またはｇｐ１６０、またはｖ３ルー プの全体または一部を含む合成ペプチドが含まれる。すべての場合において、Ｖ ３／レープ配列はＨＩＶ−ＭＮまたはＨＩＶ−ＭＮのウィルス変種のものである 。Ｖ３）レープに対する抗体の作製に好適な免疫原には、閉鎖的なループ中に形 成されるＲＰ７０ペプチドが含まれる（以下に記載）。 異種複合抗体分子の作製に有用な、ＨＩＶに対する抗体の他の群は、ｇｐ４１中 のアミノ酸５８４〜６１１領域中の配列を認識する。これらの抗体の作製１ご使 用する免疫原には、ｇｐ　１６０、ｇｐ４１、Ｖ３ループの全体または一部を含 むｇｐ４１のアミノ酸５８４〜６１１の間にある配列、すなわちＱ−Ａ−Ｒ−１ −Ｌ−Ａ−Ｖ−Ｅ−Ｒ−Ｙ−Ｌ−に−Ｄ−Ｑ−Ｑ−Ｌ−Ｌ−Ｇ−１−Ｗ−Ｇ−Ｃ −８−Ｇ−に−Ｌ−１−Ｃ，の全体または一部を含むｇｐ１６０またはｇｐ４１ の断片が含まれる。 免疫化するペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質は、直鎖状である力）、また鑑 よ■３ループ配列末端のシスティン残基の間に形成されるジスルフィド結合Ｉこ より閉鎖的なループとなる■３ループを有することもある。免疫されるペプチド 力（一つ以上のＶ３ループを存する場合、各ループはジスルフィド結合を介して 別々のループを形成することもある。 目的の配列を有する合成ペプチドは、自動化ペプチド合成機を用いて合成するこ とができる。無傷の組み換えｇｐ１６０エンベローブポリベブチドは、本発明と 同一の譲渡人に譲渡されているＲｕ５ｃｈｅ　ｅｔ　ａｌ、の米国特許出願第０ ９１．４８１号（１９８７年８月３１日に出願され、本発明の参考文献に取り入 れられている）に記載されている通り、バキュロウィルス発現系を用も）で昆虫 細胞中で生産し、精製することができる。 免疫原として使用する合成ペプチドまたは蛋白質断片は複合していなくても、ま たは、以下のように、例えば、スクシニルマレイミドメチルシクロへキサニルカ ルボキシルレー）（ＳＭＣＣ）を複合媒体としてｋｅｙｈｏｌｅ　ＩＬｍｐｅｔ ヘモシアニン（ＫＬＨ）またはオボアルブミンのような免疫原性担体と複合させ ることもできる（Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ　ｅｔ　ａｌ、、）、Ｂ　ｉ　ｏ　ｃｈ　 ｅｍ。 ９２：１４１３．　１９８２）。 簡単に記載すると、ジメチルホルムアミド５０μｌに溶解した１ｍｇのＳＭＣＣ を５ｍｇの担体（０，１Ｍ　ＮａＰＯ、ｐＨ６，５中１０−２０ｍｇ／ｍ１の濃 度）に添加し、室温で０．　５時間インキュベートする。次（１で溶液をセファ デクスＧ−２５カラムに通して過剰な未反応ＳＭＣＣを除去し、２ｍｇのペプチ ドを添加する（１０ｍｇ／ｍｌの濃度で０．１．Ｍ　ＮａＰＣ）４　、ｐＨ８， １ｍＭ　ＥＤＴＡの脱気溶液中に懸濁）。溶液をＮ２　ガスと混合し、４℃で一 部インキユベートする。次いで、沈殿物が溶けるまで試料を６Ｍ尿素、０．１Ｍ ＮａＰＯ、ｐＨ７で透析する。次いで試料を、６Ｍ尿素、Ｏ，ＩＭ　ＮａＰ０　 で平衡化したＢｉｏＧｅｌ　Ｐ−１０カラムに通す。溶出した蛋白質を回収し、 蒸留水で透析する。 免疫原に有用な数種のペプチド（ＲＰ１４２．ＲＰ７０．ＲＰ３４２．ＲＰＩｏ ｏ、ＲＰ１０２．ＲＰ１０８．ＲＰ１２３ｃ、ＲＰ１７４ｃ）の配列を表１（こ 示す。この一覧はすべてを網羅しているわけではない。免疫原として使用するこ とができるペプチドの極一部を示したにすぎない。 （以下余白） 表１：免疫原として有用なペプチドの例ＲＰ１４２　ＹＮＫＲＫＲＩＨＩＧＰＧ ＲＡＦＹＴＴＫＮＩ　ＩＧ（Ｃ） ＲＰ３４２　１ＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴ ＲＰ７０　１ＮＣＴＲＰＮＹＮＫＲＫＲＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴＴＫＮ　１１　 ＧＴ　Ｉ　ＲＱＡＨＣＮ　Ｉ　５ＲＰ１００　（ＳＧＧ）ＴＲＫＧ　ＩＨＩＧＰ ＧＲＡＩＹ　（ＧＧＳＣ）ＲＰ１０２　（ＳＧＧ）ＴＲＫＳ　Ｉ　Ｓ　ＩＧＰＧ ＲＡＦ　（ＧＧＳＣ）ＲＰ１０８　（ＳＧＧ）ＨＩＧＰＧＲＡＦＹＡＴＧ　（Ｇ ＧＳＣ）ＲＰ１２３ｃ　（Ｃ）ＨＩＧＰＧＲＡＦ　（Ｃ）ＲＰ１３５（［１１Ｂ ）ＮＮＴＲＫＳＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫＩＧ（Ｃ） ＲＰ１７４ｃ　（Ｃ）ＮＮＴＲＫＳ　ＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫＩＧ（ Ｃ） ＲＰ３３９　（ＲＦ）　ＩＴＫＧＰＧＲＶＩＹ　（Ｃ）注：カッコ内のアミノ酸 は、単離ペプチドの天然配列ではないペプチドＲＰ７０．ＲＰ１２３ｃ、ＲＰ１ ７４ｃは、アミノ酸配列末端に近し１２つのシスティン残基の間に形成されるジ スルフィド結合によりル−プを形成することができる。このような結合の形成方 法は、Ｚｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、（５’ｔ’ｏｃｈｅｍｊｓｔｒｙ　２７＋３７ ８５．１９８８）に記載されている。 ペプチドを、定法に従いフロイント（Ｆｒｅｕｎｄ）完全アジュ７くンド中１； 乳化して免疫化用に調製した（ＣＦＡ、Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｓ、Ｇｒａｎｄ　ｌ ５ｌａｎｄ、ＮＹ）。 ）１１Ｖに対する抗体の作製 ＨＩＶに対する抗体は、マウスの系（Ｂａ　ｌｂ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６．Ａ、Ｓ Ｗ、　ＢＩＯ，ＢＲ，またはＢＩＯ，Ａ、Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｓ、、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）の腹腔内において、マウス１匹につき１０〜５０μｇの環 状化ＲＰ７０　（表１）または組み換えｇｐ１６０を用いて免疫化することによ り調製した。免疫原を最初の投与の後２〜４週間の間隔で２〜３回、フロイント 不完全アジュバント中に乳化した、または可溶化した形で、マウスに追加投与し た。 マウスから採血し、免疫原との反応性を有する抗体の有無について血清を調べた 。 血清学的に強い反応性を示すマウスに追加抗原投与し、その３〜５日後にこれら のマウスのひ臓細胞を、重鎖及び軽鎖イムノグロブリンの両方を分泌することの できないＮ５−１　（Ａ、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，Ｎｏ、　ＴｌＢ１８）　、５Ｐ２− ０　（Ａ、　Ｔ。 Ｃ，Ｃ，Ｎｏ、ＣＲＬ８２８７．ＣＲＬ８００６）またはＰ３．Ｘ６３．ＡＣ３ ゜６５３骨髄腫細飽に、Ｋｏｈ　ｌ　ｅ　ｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法に基づい た定法ＣＮ１ｆｕｒｅ　２５６：４９５．１９７５）に従って融合させた（Ｋｅ ａｒｎｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ／、１２３：１５４８，１９７９ ）。 融合後６〜２１日後に出現したハイブリドーマの上清について、以下の通りＥＬ ＩＳＡスクリーニングアンセグアより抗体の生産をスクリーニングした。ＲＰ７ ０により生産されたハイブリドーマにはＲＰ７０ペプチドを用い、ｇｐ１６０に より生産されたハイブリドーマにはｇｐ４１の残基５６７〜６４７のアミノ酸配 列と同一のアミノ酸配列を有するペプチドを用いた。 各ウェルにつき最終濃度０．１〜１０μｇ／ｍｌのペプチドを含む５０μｌのＰ ＢＳ溶液を用いて、９６ウエルＣｏ５ｔａｒ平底マイクロタイタープレートにペ プチドをコーティングした。ペプチド溶液を吸引し、ＰＢＳ＋０．５％　ＢＳＡ と置換した。インキュベーション後、ウェルを吸引、洗浄し、５０μｍのハイブ リドーマ上演を添加した。インキュベーション後、ＰＢＳを用いて細胞を３回洗 浄し、適切に希釈したヤギ抗マウス　イムノグロブリン−西洋ワサビパーオキシ ダーゼ護合体（ＨＲＰ、Ｚｙｍｅｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ　Ｆｒ ａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）５０．ｃａｌとともにインキュベートした。ＰＢＳを用 いてウェルを再度３回洗浄し、ＨＲＰの基質である１ｍＭ　ＡＢＴＳ　（０，１ Ｍクエン酸ナトリウム、ｐ）１４．２中の２，２ａｚｉｎｏ−ｂｉｓ　（３−ｅ ｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄに１ ：１０ＯＯ希釈のＨ２Ｏ２を添加したもの）５０μｍを添加して、結合している 抗体を検出した。ＨＲＰ活性は４１０ｎｍの吸収を測定することによりモニター した。 ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法で陽性のハイブリドーマについて、ＨＩＶエンベロープ蛋白質 を発現する細胞への結合能を試験することができる。このようなアッセイの一例 では、特定のＨＩＶ株のｅｎＶ遺伝子を発現する組み換えワクシニアウィルスを ＣＤ４＋ヒトＴ−リンパ腫系、ＣＥＭ−ｓｓ　（ＡＩＤＳ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　 ａｎｄ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｐｒｏｇｒａｍ、Ｒｏｃｋｖｉ ｌｌｅ、ＭＤ、ｃａｔａｌｏｇ　＃７７６）の細胞に感染させる。ハイブリドー マ上清（または精製抗体）を感染細胞と共にインキュベートし、二次抗体及び蛍 光活性化細胞ソータを用いて間接的免疫蛍光により抗体の結合を検出する。対照 実験として、ｅｔｙｒ’遺伝子を発現しないこと以外は同一の細胞への結合を測 定する。 θ〃ト・を発現する細胞に結合するがｅｎｐ遺伝子を発現しない細胞には結合し ない抗体を生産するハイブリドーマについて、さらに解析を行なう。ＨＩＶ株の ｅ〃に遺伝子を発現する細胞は、以下に記載する通りに調製することができる。 ある場合（抗体の中和において）、シンシチウム形成阻害アッセイにより、ＨＩ Ｖに対する抗体を評価することができる。このアッセイにおいては、ＨＩＶ感染 細胞と非感染細胞の混合物にに抗体を添加し、巨大細胞の形成をモニターする。 このアッセイの詳細は、１９９１年３月６日に出願された米国特許出願第０７／ ６６５、’３０６号（本発明の参考文献に取り入れられている）に記載されてい る。 組み換えワクシニアウィルスを用いたＨＩＶ　ｅｎｔｙを発現する細胞の調製Ｈ ＩＶ　ｅｎｙ遺伝子を発現する細胞への結合アッセイには、実際にＨＩＶに感染 した細胞よりもむしろ、ＨＩＶ　ｅｎｙ遺伝子を発現するワクシニアウィルスに 感染した細胞を使用する。ワクシニアウィルスプロモータにより全ｉＨＩ　Ｖエ ンベロープ遺伝子を発現することができる組み換えワクシニアウィルスの構築は 、ＥＰ　公告番号０　２４３　０２９（本発明の参考文献に取り入れられている ）に記載されている。ＨＩＶ　ｅｎｙ遺伝子と、第二のワクシニアウィルスプロ モータにより発現される大腸菌の／ｉｃＺ遺伝子、及びそれに隣接してチミジン キナーゼ（丁Ｋ）をコードするワクシニアウィルス配列を有する組み換えベクタ ーｐＳＣ２５を用いて組み換えウィルスを作製した。 ＨＩＶ−ＭＮ変種の特異性を有するエンベロープ遺伝子をコードするＤＮＡをて いる）を除去し、ＨＩＶ−ＭＮ　ｅｎｙ遺伝子由来の相似の３７１１１断片と置 換することにより調製した。その結果得られるプラスミドｐｓｃＲ２５０２は、 ベロープ遺伝子を有する。 上述の１８０アミノ酸の置換の代わりに、ＨＩＶ−ＭＮ　ｇｐ１６０蛋白質の小 さめの領域を使用することができる。例えば、いずれがのＨＩＶ株由来の３６他 の方法として、全長ＨＩＶ−ＭＮ　ｅｎｙ遺伝子を有する組み換え体を使用する ことができる。複数のＨＩＶエンベロープを発現する株は、抗体の特異性を評価 する上で有用である。 無傷のＴＫ遺伝子を有するワクシニアウィルスにあらがじめ感染したＣＶ−１宿 主細胞に、組み換えベクターｐｓｃＲ２５０２を感染させた。ＨＩＶエンベロー プ遺伝子は、ベクター上のＴＫ配列とウィルスゲノム中のＴＫ配列の間の相同組 み換えによりウィルスＤＮＡ中に組み込まれる。ＨＩＶエンベロープ遺伝子を６ する組み換え体は、ＴＫ欠損株細胞に感染させ、ブロモデオキシウリジン（ＢＵ ｄＲ）とＸ−ｇａｌを含む培地上にまくことにより選択した。ＢＵｄＲはＴＫ“ 細胞に対して毒性を示すので、ＴＫ−組み換え体を選択する。Ｘ−ｇａｌは１ｚ ｃ２遺伝子産物により分解される発色基質であり、ｊｚｃ２遺伝子が発現すると プラークが青（なり、ＨＩＶ−ｅｎｖ遺伝子も併せ持つ組み換えウィルスを同定 することができる。 抗体の精製及び増幅 ＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイにおいて、ペプチド結合性を有することが示されたハイ ブリドーマを、限定希釈法によりサブクローニングした。ハイブリドーマ細胞と 、免疫化していない同系マウス由来の放射線照射したび臓細胞を混合しくそれぞ れ、最終濃度５細胞／ｍ＋と２．５Ｘ１０６細胞／ｍｌ）、混合懸濁液２００μ ＋をマイクロタイターウェルに入れ、各ウェルにつき１個のハイブリドーマ細胞 となるようにした。７〜１４日後に出現したサブクローンについて、再度上述の ＥＬＩＳＡ法により評価した。代表的な陽性クローンをもう一部サブクローニン グした。 ５種の主要なマウス　イムノグロブリン　アイソタイプ（ＩｇＭ、ＩｇＧ１゜１ 　ｇＧ２Ａ、Ｉ　ｇＧ２Ｂ、Ｉ　ｇＧ３）にそれぞれ対応するヤギ抗マウス−Ｈ ＲＰ調製物を用いたＥＬＩＳＡ法により、抗体のアイソタイプを決定した。 ＥＬＩＳＡおよびシンシチウム阻害アッセイで陽性であることが繰り返し確認さ れたハイブリドーマサブクローンをｐｒｉｓｔａｎｅ−ｐｒｉｍｅｄ同系マウス の腹腔内に注入することにより、精製抗体を調製した。注入の２〜３週間後に腹 水を回収し、各抗体アイソタイプに応じた方法でモノクローナル抗体を以下に記 載する通りに精製した。溶出後、すべてのＩｇＧ抗体は、ＰＢＳに対して透析し た。 ＩｇＭ抗体は、対応するハイブリドーマ細胞を注入したマウスの腹水を５０％Ｎ Ｈ２ＳＯ４沈殿により精製し、次いで沈殿物を４ｘＰＢＳに対して透析した。 次いで、透析した抗体を、４ｘＰＢＳであらかじめ平衡化したＵｌ　ｔ　ｒａｇ ｅ　ＩＡ−６カラム（Ｂ　ｉｏ　ｔ　ｅｃｈｎ　ｉ　ｃｓ、Ｖｆ　Ｉ　１ｅｎｅ ｕｖｅ−Ｌａ−Ｇａｒｅｎｎｅ、Ｆｒａｎｃｅ）に通した。ＥＬＩＳＡにより抗 体を含をする画分を同定した。 ＩｇＧ１抗体を含有する腹水は、４倍量の０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、３ＭＮ ａＣ１，ｐＨ８，９により希釈し、同じＴｒｉｓ−ＮａＣＩ緩衝液で平衡化した Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ−セファロースアフィニティ力ラムに通すことにより単離し た。０．１Ｍ　クエン酸ナトリウム、ｐＨ６，０を用いて抗体を溶出した。 Ｉ　ｇＧ２抗体を含有する腹水は、２倍量のＰＢＳにより希釈し、ＰＢＳで平衡 化したＰｒｏｔｅｉｎ　Ａ−セファロースアフィニティカラムに結合させた。次 いで、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、０．１Ｍ酢酸、ｐＨ３，０によりカラムから溶出 した。溶出後、Ｉ　Ｍ　Ｎ　ａ　２　ＨＣＯ３を添加することにより抗体を迅速 に中和した。 ＩｇＧ３抗体を含有する腹水は、４倍量の０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、３ＭＮ ａＣ１，ｐＨ８，９により希釈し、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ−セファロースアフィニ ティカラムに適し、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、０．１Ｍ酢酸により抗体を溶出した 。 その他の方法として、すべてのＩｇＧサブクラスは、以下の方法により精製する ことができる。腹水を４倍量の０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、３Ｍ　ＮａＣ１゜ ｐＨ８，９により希釈し、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ−セファロースアフィニティ力ラ ムに通し、０．１５Ｍ　ＮａＣ１，Ｏ，１Ｍ酢酸、ｐＨ３，０により溶出する。 抗体の特異性の決定 以下に記載するアッセイは、ＨＩＶに対する抗体の株特異性を決定し、ＨＩＶに 対する抗体により認識されるエピトープをマツプするのに使用することができる 。これらのアッセイの一部またはすべては、異種複合抗体を生産するためのＨＩ Ｖに対する抗体を選択するのに使用することができる。上述のＨＩＶ　ｅｎｙ遺 伝子を発現する細胞への結合アッセイも、抗体の特異性の評価に使用することが できる。Ｖ３に対する抗体により認識されるエピトープは、標準的なＥＬＩＳＡ アッセイまたは以下に記載する競合的ＥＬＩＳＡアッセイによりマツプすること ができる。ＥＬ　Ｉ　ＳＡアンセイにａｍなペプチドには、（１）多様なＨＩＶ 変種由来のｖ３ループ配列（表２）を代表する２４〜２５ｍｅｒの配列、（２） ＭＮ　Ｖ３ルーブチンブ配列（Ｃ）−に−Ｒ−１−Ｈ−Ｉ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ −Ｆ−Ｙ−Ｔ−Ｔ−（Ｃ）に対応する１２ｍｅｒの配列を含み、それぞれ最初の アルギニン（Ｒ）残基からチロシン（Ｙ）残基までの１つのアミノ酸がアラニン 残基に置換されているＭＮ置換配列を含む。置換配列においては、天然ではアラ ニンであるところがグリシンに置換されている。抗体の、ＭＮ配列中に含まれる エピトープ認識は、アラニンが置換されたペプチドに抗体が結合しにくくなるこ とから示される。アラニン置換により結合は阻害される。 競合的ＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイは、標準的なＥＬＩ　ＳＡアッセイを以下のよう に修正し０行なった。抗体をプレートにアプライする前に、１０ＭＭ−０，００ ４５μＭの濃度の、先に列記した試験ペプチドの１つと共に抗体をインキュベー トした。抗体と結合する上で、試験ペプチドが固定化免疫原と競合する場合、抗 体がプレートにほとんどまたはまったく結合しないことがＥＬＩ　ＳＡにより示 される。 ｇｐ４１に対する抗体により認識されるエピトープは、ｇｐ４１配列の全体また は一部に基づくアラニン置換配列を用いて類似の方法でマツプすることができる 。ｇｐ４１の一部に対応する配列を有するペプチドを使用することも可能である 。 ｖ３ループに対する抗体 ＨＩＶ−ＭＮ　ｇｐ１２０のｖ３ループ中の配列を認識し、異種複合抗体の作製 に使用することのできる抗体を以下に記載する。 ＢＡＬＢ／ＣマウスをＲＰ７０　（表１）免疫原により免疫化して、ハイブリド ーマＦ５９及びＦ８３を作製した。Ｆ５９／Ｐ５Ｂ３　（５９，１）及びＦ８３ ／Ｐ６Ｆ１２　（８３，１）と命名した抗体は、株特異的ではない抗体として同 定された。５９．１抗体との結合においてＲＰ７０と競合するアラニン置換ペプ チドは、Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｆ配列中にアラニン置換を含まない。同様に、Ｇ −Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｆ配列を有するペプチドは５９．１抗体との結合においてＲ Ｐ７０と競合することができるが、この配列を有しないペプチド（すなわち、Ｒ ＰＩ２９及びＲＰ１７５）は競合することができない。これらの結果は、５９． １抗体がＧ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｆエピトープを認識することを示唆している。こ の配列は広範囲にわたるＨＩＶ変種中に存在する。５９．１の株特異性は、上述 の技術を用いて解析した。これらのアッセイにより、５９．１がＨＩ　Ｖ−１ｖ ＩＮＳＨＩＶ−３Ｆ２、旧Ｖ−ＷＭＪ２及び旧Ｖ−１１１ＢのＶ３ループを認識 すルコとが示された。 ＥＬＩＳＡアッセイにより、８３．１抗体がｌ−Ｘ−１−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒエピト ープ（Ｘはいかなるアミノ酸でもよい）を認識することが実証された。８３゜１ 抗体の株特異性は、上述の技術を用いて解析した。これらのアッセイにより、８ ３．１がＨＩＶ−ＭＮ、ＨＩＶ−Ａｌａｂａｍａ、ＨＩＶ−８Ｆ２、ＨＩＶ−Ｗ ＭＪ２及びＨＩＶ−Ｄｕｋｅ　７８８７−７のｖ３ループを認識することが示さ れた。 このように我々は、多くのＨＩＶ株を認識する抗体２種を同定した。８３．１抗 体はｌ−Ｘ−１〜Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒエピトープ（Ｘはいがなるアミノ酸でもよい） を認識する。一方、５９．１はＧＰＧＲＡＦエピトープを認識する。５９．１抗 体を用いて、５ｃｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ、（７，Ｉｍｍｕｔｙｏｌｏｚｙ　１４０ ：８．１９８８）により異種複合抗体を作製した。 ｇｐ４１に対する抗体 組み換えｇｐ１６０を用いて、根本的には以下に記載する通りにモノクローナル 抗体を作製した。ＥＬＩ　ＳＡアッセイにより、これらの抗体の一種、６ｃ５が ｇｐ４１の一部分（アミノ酸５８４〜６１１）を認識することが示された。ｇｐ ４１のこの部分は、ＨＩＶ株の間で大きく異なることはない。従って、この領域 に対する抗体は株特異的ではないと予想される。この抗体を用いて、５ｃｏｔｔ ｅｔ　ａｌ、（）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｚｙ　１４０：８，１９８８）により異種 複合抗体を作製、精製した。 ０ＫＴ３１５９．１及び０ＫＴ３／６Ｃ５異種複合抗体以下に記載する実験は、 種々のＨＩＶ株に感染したＣＥＭ−ｓｓ細胞（Ａｍｅｒｔｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃ ｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ：Ａｃｃｅｓｓ ｉｏｎ　Ｎｏ、ＣＣＬ１１９）に対する２種の異種複合抗体、０ＫＴ３１５９． １及び０ＫＴ３／６Ｃ５の影響を示したものである。 ０ＫＴ３１５９．１異種複合抗体は、抗ＣＤ３モノクローナル抗体、０ＫＴ３を ＨＩＶ−ＭＮのｇｐ１２０サブユニットのｖ３領域中のエピトープに対する二番 目のモノクローナル抗体、５９．１に共有結合により架橋して作製した。０ＫＴ ３／６Ｃ５異種複合抗体は、０ＫＴ３をＨＩＶ−ＭＮのｇｐ４１サブユニットの 残基５８４〜６１１　（Ｒａｔｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３１３： ２７７．１９８５の番号付けによる）中のエピトープに対するモノクローナル抗 体、６Ｃ５に共有結合により架橋して作製した。ＣＤ３は、抗原に対するＴ細胞 受容体（Ｔ　ＣＲ）と非常に関連性の高い受容体である。ＣＤ３受容体を発現す る細胞毒性１９２８球の存在下で感染細胞を培養した場合、本発明の異種複合抗 体は、ウィルスの逆転写酵素活性により測定される通り、ウィルスの複製を画期 的に減少させる。逆転写酵素活性は、ＨＩＶ活性の感度のよい指標であるため、 これらの結果はウィルスに感染した細胞が急激に減少することを示している。異 種複合抗体が、Ｔリンパ球を感染細胞に作用させることにより感染細胞の死滅を 促進することが、特定の理論に縛られることなく示された。 ＣＴＬの作製 異種複合抗体の活性の試験に使用するＣＴＬ細胞系（ＩＦ８）は、５ｃｏｔｔｅ ｔ　ａｌ、（）、Ｉｍｍｕｎｏｊｏｆｙ　１４０：８，１９８８）の方法を修正 した方法により調製した。簡単に記載すると、大量の供与体ＰＢＬ培養物を同種 異系の、ＥＢＶによりトランスフオームされたリンパ芽球細胞系（ステイミュレ ータ細胞）と共に２０％　ＦＢＳ　（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌ ａｎｄ、ＮＹ）　、ＰＨＡに刺激されたＰＢＬ由来の上清及び１００Ｕ／ｍｌの 組み換えインターロイキン２を添加したＲＰＭＩ　１６４０培地中で７日間イン キュベートした。次いで、Ｕ底トレー中で限定希釈する（１細胞／ウエル）こと により細胞をクローニングした。支持細胞層には放射線照射した自系ＰＢＬとス テイミュレータ細胞を使用した。クローンをＣＴＬ活性（ステイミュレータ細胞 の溶解により評価した）及びＮＫ活性（Ｋ５６２細胞の溶解：ＣＣＬ　２４３゜ Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、Ｂｅｔ ｈｅｓｄａ、ＭＤ）についてスクリーニングした。ＣＴＬ活性を示すがＮＫ活性 ヲ示さないクローン１Ｆ８を選択した。 るウィルス複製の減少か逆転写酵素活性の測定により示された特記しない限り、 ＣＥＭ−ｓｓ細胞（９６ウエルプレート中１５，０００細胞／ウエル）は、６４ 感染単位（ＩＵ）のＨＩＶ−ＭＮまたはＨＩＶ−１１１Ｂに感染させた。感染の １８時間後、エフェクタ細胞（ＩＦ８細胞、４５，０００／ウエル）を種々の濃 度の０ＫＴ３１５９．１異種複合抗体または等量の複合していない抗体と共に感 染ＣＥＭ−ｓｓ細胞に添加した。ＣＴＬを１０％　ＦＢＳ（Ｇ　ｉ　ｂ　ｃ　ｏ ／ＢＲＬ）を含むＲＰＦ、１１　１６４０中で生育させ、新鮮な培地で洗浄した 後、抗体を添加した。７８後無細胞培養上清を回収し、ｗｔｔ＋ｅｙｅｔ　ａｌ 、（）、Ｖｌｒｏ／、６２：１３９，１９８８）の方法により逆転写酵素活性を 測定した。 図１及び図２の通り、０．５日ｇ／ｍｌの０ＫＴ３１５９．１異種複合抗体（黒 菱形）は、ＨＩＶ−ＭＮまたはＨＩＶ−ＩＩＩＢのいずれかに感染したＣＥＭ− ｓｓ細胞中の逆転写酵素活性を事実上除去した。０ＫＴ３抗体と５９．１抗体の 複合していない混合物（白四角）は、２，０００ｎｇ／ｍｌの場合でさえも逆転 写酵素活性に影響を及はさなかった。 図３では、別の実験を行ない、ＣＴＬ細胞細胞性存在下丸）では０ＫＴ３１５９ ．１異種複合抗体は逆転写酵素活性に影響を及ぼさないことを実証した。同様に 、０ＫＴ３１５９．１異種複合抗体非存在下（黒三角）ではＣＴＬはＨＩＶ−１ 目８感染細胞の逆転写酵素活性に事実上影響を及ぼさなかった。ＣＴＬ細胞細胞 性存在下複合していない抗体（白丸）及びＣＴＬのみ（白三角）は感染細胞の逆 転写酵素活性に事実上影響を及はさなかった。非感染細胞（黒四角）の逆転写酵 素活性は検出されなかった。すべての場合、ＣＴＬ及び／または抗体は、感染の １８時間後に添加した。 長時間のウィルス復製及びこれによるウィルスの蔓延が異種複合分子の効力に影 響を及はすかどうかを決定するために、抗体及びＣＴＬの添加に先立つＨｒＶ感 染時間を変化させた。抗体及びＣＴＬを添加する前に、ＣＥＭ−ｓｓ細胞をＨＩ Ｖ−ＭＮまたはＨＩＶ−１１１Ｂ（６４１Ｕ）と共に６．１８．４８または７２ 時間インキュベートした。逆転写酵素活性は、感染の７日後に測定した。０ＫＴ ３１５９．１異種複合抗体及びＣＴＬを添加する前に、６．１８または４８時間 感染させた場合、逆転写酵素活性を完全に除去するには０．５日ｇ／ｍｌの異種 複合抗体で十分であった。同一条件下で、逆転写酵素活性を除去するためには、 ２，０００ｎｇ／ｍ１以上の０ＫＴ３抗体及び５９．１抗体の複合していない混 合物が必要であった。抗体及びＣＴＬを添加する前に、７２時間感染させた場合 、逆転写酵素活性を除去するにはｌｎｇ／ｍｌのＯＫＴ’３１５９．１が必要で あった。この時点では、逆転写酵素活性を除去するためには、２．ＯＯＯｎｇ５ ／ｍ１以上の複合していない抗体か必要であった。 さらに、抗体の濃度を一定にし、ＣＴＬのＣＥＭ−ｓｓ細胞に対する比率を変化 させた実験を行ない、０ＫＴ３１５９．１異種複合抗体のｉｎ　ｖｊｔ’ｒｏに おける効勾を解析した。この実験におい°Ｃは、０ＫＴ３１５９．１異種複合抗 体の濃度（１Ｕｇ／ｍｌ）　、ＣＥＭ−ｓ　ｓ細胞の数（１５，０００／ウエル ）及びＨＩＶ−ＭＮまたはＨＩＶ−１１１の感染用量（６４，ＩｔＪ）を一定に １２、培長物に添加するＣＴＬの数を変化させた。ＣＴＬ及び／または異種複合 抗体は感染の１８時間後に添加Ｌ、感染７日］」に逆転写酵素活性を測定］７た 。図４にお（翫て、逆転写酵素活性は、ＣＴＬ　：　ＣＥＭ−ｓ　ｓ比が０１１ の場合完全に除去され、ＣＴＬ　：　ＣＥＭ−ｓ　ｓ比か（’１．００６旨のよ うに低い場合でも時部分的に（≧６０９６）除去された。この結果は、ｌ’　Ｉ ）　Ｊ’　／’　Ｖθで見られる条件のように標的細胞（ＣＥＭ−ｓ　ｓ　）の 数がエフ−フタ−細胞の数よりも非常に多（Ｘ場合にも０ＫＴ３１５９．１異種 複合抗体が効果的であることを実証している。 ０ＫＴ３．１５９．１は多くのＨＩＶ株に対して効用的である０ＫＴ３１５９． １異種複合抗体が種々のＨＩ　Ｖ株に対して効果的である力覧否かを試験するた めに、ＣＥＭ−ｓｓ１！１胞（２４ウェルプレート中１５０．０００７７′ウエ ル）ｉ：ｘｏｏ〜１０００　１ＵのＨ［Ｖを感染させた。感染時１こｌよ、３倍 量のＣＴＬ　（４５０，０００／ウエル）及び’］、ｚｚｇ／ｒｎｌの０ＫＴ３ １５９．１異種Ｎ合抗体（またはｌｌＪｇ／ｍｌの単量体抗体）を培養物に添加 ［、た。培養物は、週に−う回分側し、４〜５［１毎に培養上清を回収して逆転 写酵素活性を測定した。抗体は、一度添加した後は追加添加しなかった。このた め、培養物を分割することにより抗体濃度及び標的細胞と１フエクター細胞の絶 対数は減少する。文■照実験Ｊし７て、ウィルスのみと共にＣＥＭ−ｓｓ細胞を 培養【７た。ＨＩ　Ｖ単離物を試験し、それらのＶ３配列を表２に示した。 表２：Ｖ３ループ配列 Ａｌａｂａｍａ　−ＫＳ−−−−−−−−−−Ｈ−−ＲＤｕｋｅ　６５８７−５ 　Ｖ−Ｎ　−−−一−−−−−−−Ｈ−−−３Ｆ２　Ｔ−−３−Ｙ−−−−−− −Ｈ−−ＧＷＭＪ２　Ｉ−Ｒ３ＬＳ−−−−−−ｍ＝−Ｒ，−ＲＥ１１　Ｉ　Ｂ ＫＳ　Ｉ　−ＱＲ−一−−−−−Ｖ−Ｉ　ＧＤＵＫＥ　６５８７−７　Ｔ　−− Ｇ　−−−−−−−−−１−Ａ−ＧＤＵＫＥ７８８７−７ＴＳＲＧ−Ｒ−−−− −−ＩＬＡ−Ｅこの表において、−”はぞの位置のアミノ酸がλ４Ｎと同一・で あることを示している。保存されたＧＰＧＲＡＦモチーフは下線で示している。 図６において、ＨＩＶ単離物がＧＰＧＲＡＦ配列を有する場合はずべて（ＭＮ。 Ａｌａｂａｍａ、、Ｄｕｋｅ　６５８７−５、ＩＮＩＢ、ＳＦ２、ＷＭＪ２．そ れぞれパネルＡＳＢ、、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）　、０ＫＴ３１５９．１　（白四角） は、逆転写酵素活性を抗体またはＣＴＬを添加ｔ、ないＣＥＭＳ８（黒丸）と比 較し２て９５９６以上阻害した。ＧＰＧＲＡＩモチーフを有する２種の単離物、 ＤＵＫＥ　６５８７−７　（パネルＥ）　、ＤＵＫＥ　７Ｂ８７−７　（パネル Ｃ）を試験したところ、１つ（ＤＵＫＥ　６５８７−７）は１１．［ｌ害した。 ０ＫＴ３と５９．１の複合していない混合物（黒三角）は効果を示さなかった。 ０ＫＴ３／６Ｃ５異種複合抗体は感染細胞中で逆転写酵素活性を阻害する０ＫＴ ３／６Ｃ５異種複合抗体の、ＨＩＶ−１１１Ｂ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞中の逆転写 酵素活性を阻害する能力を試験した。簡単に記載すると、ＣＥＭ−’５ｓ（９６ ウエルプレート中１５，０００細胞／つｘル）を６４　１ＵのＨＩＶ−ＩＩＩＢ に表出した。１８時間後、ＣＴＬ　（４５，０００細胞／ウエル）及び種々の濃 度の０ＫＴ３／６Ｃ５異種複合抗体を添加した。７日後、上述の通りに逆転写酵 素活性を測定した。 図６において、０ＫＴ３／６Ｃ５異種複合抗体（白丸）は０．５ｎｇ／ｍｌのよ うな低濃度でも逆転写酵素活性を事実上除去した。これに対して、０ＫＴ３と６ Ｃ５の複合していない混合物は、逆転写酵素活性に対して特に影響を示さながっ た。 ０ＫＴ３１５９．１及び０ＫＴ３／６Ｃ５はＣＴＬ存在下で細胞毒性を有する異 種複合抗体の細胞毒性活性を試験するために、まず初めに我々は組み換えワクシ ニアウィルスに感染したＣＶＩ細胞を使用したモデル系中での５Ｉｃｒ放出アツ セイを行なった。ＨＩＶ−ＩＩＩＢ　ｅｎｖ遺伝子（ＶＰＥ１６）または旧Ｖ　 −ＭＮ　（ＶＭＮ）ｅｎｙ遺伝子のいずれかを発現する組み換えワクシニアウィ ルスによりＣＶＩ細胞を感染させた。ＨＩＶ　θｎＶ遺伝子を発現しない組み換 えワクシニアウィルス（ｖ　ｓ　Ｃ８）を負の対照として用いた。細胞培養混合 物は根本的には逆転写酵素アッセイの場合と同様に準備した。エフェクター細胞 としてＩＦ８細胞を使用した。この細胞自体はＣＶ１細胞またはワクシニアウィ ルスに感染したＣＶＩ細胞に対して細胞毒性を示さない。 表３において、１０μｇ／ｍｌの０ＫＴ３１５９．１異種複合抗体は５８％のＶ ＰＥ１６感染ＣＶＩ細胞及び６２％のＶＭＮ感染ＣＶＩ細胞を溶解した。非感染 細胞の溶解は非常に少なかった。１１１量体抗体を添加した場合にも細胞溶解は 同じくらい少なかった（データ示さず）。０ＫＴ３１５９．１を使用した場合の 溶解率が１００９６ではなく最大６０％なのは、恐らく、ワクシニアウィルスに よるＣＶＩ細胞への感染が不完全であったためであろう（ＣＶＩ細胞の限定希釈 によるシンシチウム形成アッセイにより、細胞の５０〜６０％がｇｐ１６０を発 現することを示した）。ｇｐ１２０のカルボキシル末端のエピトープを認識し、 ＨＩＶ　ｅｎｖを発現する（ＦＡＣ３により評価）細胞に結合する２種の抗体、 ＩＣ１または７Ｃ６を用いて形成した異種複合抗体は、ＨＩＶ−ＭＮまたはＨＩ Ｖ−ＩＩＩＢ　ｅ／７Ｖ蛋白質のいずれかを発現するワクシニアウィルスに感染 した細胞の溶解には相対的に効果的ではなかった。細胞表面結合は、ある所定の 抗体が細胞毒性異種複合抗体を作製できるかどうか決定するのに必要だが十分な 特性ではないことは明白である。 表３：異種複合抗体による細胞溶解 ０ＫＴ３１５９．１　６　５８　６２ ０ＫＴ３／７Ｃ６９１７Ｎ、Ｄ。 ０ＫＴ３／ＩＣ１１１８Ｎ、Ｄ。 以下に記載するアッセイは、本発明の異種複合抗体の効力を決定するのに使用す るものである。種々のＨＩＶ株を使用することにより、所定の異種複合抗体の反 応性の広さも併せて決定することができる。本発明の異種複合抗体の効力を正確 に決定するためには、慎重に制御された条件下で、ＨＩＶ感染細胞に対する異種 複合抗体の効果を測定することが重要である。好適なアッセイを以下に記載する 。 １００〜１０００感染単位（ＩＵ）の目的Ｈ夏■株によりＣＥＭ−ｓｓ細胞（２ ４ウエルマイクロタイタープレート、ウェル容Ｊｉ２ｍｌ中、１５０，０００細 胞／ウエル）を感染させる。感染の１８時間後、目的の初期濃度を達成するのに 十分な量の異種複合抗体と共に４５０，０００エフエクター細胞を添加する。 樟準的な条件下で細胞を培養し、３日毎に分割する。異種複合抗体は追加添加し ないため、培養物を分割する度に異種複合抗体濃度は半分になる。異種複合抗体 を添加しない以外は全く同一の条件の培養を対照実験とする。感染１０日１に、 Ｗｉｌｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ、（）、Ｖｊｒｏ１０！、）’　６２：１３９；１９ ８８）の方法により、両方の培養物の逆転写酵素活性を測定する。ウィルス生産 がピークに達するのに感染後１４０以上要するＨＩＶ株については、逆転写酵素 活性を感染１０日後に測定すべきてはない。代わりに、ウィルス生産が最大に近 い時点で逆転写酵素活性を測定すべきである。 感染単位はＫｉｂｅｒ法により決定する。ウィルスのタイターは保存中に低下す るため、ウィルス保存液のタイターは使用直前に測定することが重要である。 ウィルス保存液は不完全なウィルス粒子を少なくするよう慎重に調製すべきであ る。例えば、調製したウィルス保存液の感染の多重度は０．００１が望ましく、 細胞は対数増殖するような条件で培養すべきであり、また、ウィルスはウィルス 生産が最大の時点（逆転写酵素活性またはｐ２４発現が最大であることで判断す る）で回収すべきである。 組み換え異種複合抗体 モノクローナル抗体は大部分の場合ヒト以外の種の中で生産されるため、ヒトに 対して免疫原性を示すことが多い。ヒトの治療において異種複合抗体を効果的に 使用するために、抗原結合部分（可変領域）はある種に由来し、構造的安定性及 び生物学的機能に関与する部分（一定領域）はヒト抗体に由来するキメラ抗体分 子を作製する必要があるかもしれない。可変領域がある種に由来し一定領域が他 の種に由来するキメラ抗体の作製法は、当業者に熟知されている。例えば、Ｎｅ ｕｂｅｒｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、ＰＣＴ　公開　ＷＯ３６１０１５３３、優先口 １９８４年９月３日；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、ＥＰ公開番号０，１７３ ．４９４、優先臼１９８４年８月２７日参照のこと。その他の方法として、可変 領域の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）のみを、望ましい抗原特異性を有するイムノ グロブリン由来のＣＤＲ５と置換する方法がＷｉｎｔｅｒ（ＧＢ公開番号２゜１ ８８．６３８、優先８１９８６年３月２７日）により記載されている。ヒトＦＣ 部分を有する抗体を作製することによりマウスモノクローナルをヒトの治療に適 合するようにすることもできるＣＭｏｒｒｔｓｏｎ、５ｃｉｅｎｃｅ　２２９： １２０２．１９８５）。単一ポリペプチド鎖抗体も、組み換え法により従来の抗 体よりも簡便に作製することができる。単一ポリペプチド鎖抗体の作製方法はＬ ａｄｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、（米国特許第４．９４６，７７８号）により記載され ており、これらの方法は異種複合抗体の作製に応用することができる。′このよ うなハイブリッドモノクローナル抗体の構築、発現及び精製方法は確立している 。 二重の特異性を有する抗体の作製にクアドローマを使用することができる（Ｒｅ ａｄｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、米国特許第４，４７４．８９３及び４，７１４．６ ８１）。 使用法 本発明の抗体は、静脈注射または筋肉注射のいずれかの経路により非経口的に投 与することができる。典型的な治療法は、約１週間〜約６か月間にわたって効果 的な量の抗体を投与するものである。患者の疾患を制御するために必要な治療回 数は、疾患の重さや進行段階及び患者の特性により各患者ごとに異なる。各治療 に必要な総用量は数回に分けても、−回で投与してもよい。ヒトモノクローナル 抗体は、単独で投与しても、また、患者の疾患を制御するためにＡＺＴのような 他のＨＩＶ治療と連動して投与してもよい。 異種複合抗体の薬理学的混成物は目的の投与モードに従って、リポソーム、溶液 、懸濁剤及び微粒子などの形状に作製する。 ある場合には、異種複合抗体を適切なエフェクター細胞と共に投与することが望 ましい（Ｎｉｔｔａ　ｅｔ　ａｌ、、１ｈｅ　１ａｎｃｅｔ　３３５：３６８゜ １９９０）。例えば、ＨＩＶ感染の治療が必要な患者（または適合する提供者） から抹消血液リンパ球（Ｐ　Ｂ　Ｌ）を回収し、異種複合抗体と共にインキュベ ートしてから細胞を再注入する。ある場合、ＰＢＬは培養物中に広がる（Ｒｏｓ ｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｔｙｃｅ　２３３：１３１８，１９８６ ）ｏＰＢＬはインターロイキン、インターフェロンまたは他のイムノモジュレー タと共にインキュベートしてもよい。さらに、細胞は、エフェクター細胞の細胞 溶解活性を刺激する受容体特異的抗体（Ｓｃｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅｌｌｕ ｌａｒＩｍｍｕｎｏｌｏｚｙ　１１４：３７０．１９８８）のような分子と共に インキュベートしてもよい。 請求の範囲： 配列表 （２）配列番号：コ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：　６ ＣＢ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘｉ）配列番号：１の配列： Ｃ１ｙ　Ｐｒｏ　ｃｌｙ　Ａｒｇ　ＡＬａ　Ｐｈａ（２）配列番号：２ （１）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：　７ （Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘｉ）配列番号：２の配列： １１＠　Ｘａａ工ｌ＠　（ｉｌｙ　Ｐｒｏ　ＧＬｙ　Ａｒｇ（２）配列番号・３ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２８ （Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘｉ）配列番号：３の配列： Ｇｉｎ　ＡＬａ　Ａｒｇ　ＸＬｍ　Ｌ＠ＬＩ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ 　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙ−＾−ｐ　（ｉｎｎ　Ｇｉｎ　Ｌａ■ Ｓ　！Ｏｉｓ Ｌ＊ｕ　Ｇｌｙ　Ｘｌ・τｒｐ　Ｇｌｙ　ＣＹ＠　Ｓ＠ｔ　Ｇｌｙ　Ｌｙｅ　Ｌ ４Ｌｌ工Ｘ＠Ｃｙｓ（２）配列番号：４ （ｉ）配列の特徴。 （Ａ）配列の長さ＝１７ （Ｂ）配列の型・　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （Ｘｌ）配列番号＝４の配列： Ｌｙｅ （２）配列番号：５ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：　５ （Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘｉ）配列番号：５の配列： ＸＬｍ　ＧＬＹ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ（２）配列番号＝６ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝２４ （Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘｉ）配列番号二６の配列： Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｌｙｅ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　入ｒｇ　Ｘｉ・　１１１ｇ　ＸＬｍ 　Ｇｌｙ　１ｌｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｒ９　ＡＬａ　Ｐｈ・　’pｒ Ｓ　１０　ｉｓ τｈｒ　Ｔｈｒ　Ｌｙ＠　Ａｓｎ　！ｌｅ　！ｌｅ　ＧＬｙ　Ｃ１ｍ２゜ （２）配列番号ニア （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝１１ （Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘｉ）配列番号ニアの配列： Ｘｉｓ　１１Ｌｍ　ＸＬｍ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｐｈａ 　Ｔｙｒτ■（２）配列番号：８ （ｉ）配列の特？ｊｉ： （Ａ）配列の長さ＝４０ （ｘｉ）配列番号：８の配列： ！ｉ＠Ａｓｎ　ＣＹ＃　Ｔｈｘ　ｋｇ　Ｐｅａ＾−ｎ？ｙｒ＾−ｎ　ＬＦ　ＪＬ ｒｇ　ＬＦ　ｈｘｑ　ＸＬｍ　ＢＬｍ　！ｌｅＳ　１０　１ｓ ＧＩＹ　Ｐｒｏ　ａｌｙ　Ａｒ９　ＡＬａ　Ｐｈ＠Ｔｙｔ　Ｔｈｒ　テｈｒ　Ｌ ｙ−Ａｓｎ　ＸＬｍ　！ｌｅ　３１ｙ　Ｔｈｒ　Ｘｌ・＾ｒｑ　Ｇｉｎ　Ａｌａ 　ＸＬｍ　Ｃｙ−＾ｍＩ′１　工１ｍ　Ｂ＠ｒ３％　４０ （２）配列番号；９ （ｉ）配列の特徴； （Ａ）配列の長さ：２１ （Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘｉ）配列番号：９の配列： Ｓ＠３？　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｌ）ｎ　Ｏｌｙ　Ｈ＠Ｍｉ・Ｘｉ ｓ　ｃｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ＾ｌａ　！ｌ＠Ｓ　１０　１５ ？ｙｒ　Ｇｌｙ　Ｏｌｙ　ＳＱＬ　ｃｙｓ（２）配列番号＝ｌＯ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝２０ （Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘｌ）配列番号＝１０の配列： ｓ＠ｒ　Ｇｌｙ　ｃｘｙ　Ｔｈｒ　Ａｒ９　ＬＹ＠　ＳＱＬ”　ＸＬ拳Ｓ社ＸＬ ＠　Ｏｌｙ　ｐｒｏ　０１７　社ｇ＾ｌａ　Ｐｈｓ５　１０　１ｓ Ｇｌｙ　Ｏｌｙ　ａ＠ｒ　Ｃｙｓ （２）配列番号：１１ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝１９ （Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘ　ｉ）配列番号＝１１の配列： ＳＱＬ　Ｃ：Ｌｙ　Ｏｌｙ　Ｈ１ｓエエ＠　Ｏｌｙ　Ｐｒｏ　Ｏｌｙ　Ａｒｇ＾ Ｌａ　Ｐｈ＠Ｔｙｔ＾ｌａ　Ｔｈｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ（２）配列番号：１２ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１０ ＣＢ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘｉ）配列番号：１２の配列： Ｃｙｓ　１ｌｌｓ　Ｘｉｓ　Ｇｌｙ　！’ｒｏＧｌｙ　ｋｇ＾ｌａ　Ｐｈｓ　Ｃ ｙｓＳ　ユ０ （２）配列番号；１３ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝２５ （Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘｌ）配列番号＝１３の配列： ＾−ｎ　＾−ｎ　ｒｈｒ　＾ｘｑ　Ｌｙｓ　ｌｉ＠ｒ　Ｘｉｓ　Ａｒｇ　工１＠ 　ｃｔｎ　Ａ１９　ｓｔｙ　ｐｒｏ　Ｇｌｙ　＾ｘｑ　Ａ１■ ５　１０　１ｓ Ｐｈ＠　Ｖａｌ　丁ｈｒ　Ｘｉｓ　ＧＡＹ　ＬＹ＠　ＸＩＪ　ｃｌｙ　ＣＹ＠（ ２）配列番号＝１４ （１）配列の特＠： （Ａ）配列の長さ：２６ （Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘｉ）配列番号：１４の配列： ｑ−＾ａｎ　Ａ釦ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｌｙ＃　１！＋＠ｒ　Ｘ１ｍ　社ｇ　１１ｍ 　Ｇｉｎ　社ｇ　Ｏｌｙ　ｐｒｏ　Ｏｌｙ　Ａｒ９５　工Ｏ工５ ＾１ｍ　１１）１＠　ＶＪＬＩＴｈｒ　Ｚ工＠　Ｏｌｙ　Ｌｙｓ工ｌ＊　（ｉｌ ｙ　ｃｙｍ（２）配列番号＝１５ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝１１ （Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘ　ｉ）配列番号＝１５の配列： Ｘｉｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｏｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　ＪＬｒｇ　ＶＪＬＬ　Ｉｌ ＠？ｙｒ　Ｃ’ｙｓ（２）配列番号：１６ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１６ （Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘｉ）配列番号＝１６の配列： Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　１１ｍ　ＲＬ＠　Ｘｉｓ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　 Ａｒｇ＾１ｍ　Ｐｈ・Ｔ７ｒ　Ｔｈｒτｈｒ　ＣＹ＠５　１０　ｉｓ （２）配列番号＝１７ （１）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１７ （Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （Ｘｌ）配列番号＝１７の配列： （２）配列番号＝１８ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝１７ （Ｂ）配列の型・　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘｉ）配列番号＝１８の配列： Ｌｙ＠Ｌｙ＠ｇｓｒ　Ｍｇ　工ｌ＠Ｉｕｓ　Ｘｉｓ　Ｏｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　 ｋｇ＾ｌａ　Ｐｈｓ　ＨＬｍ丁ｈｒτｈｒ（２）配列番号２１９ （ｉ）配列の特徴工 （Ａ）配列の長さ：１７ （Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘｉ）配列番号＝１９の配列： （２）配列番号＝２０ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１７ （Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘｉ）配列番号；２ｏの配列： （２）配列番号：２１ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１７ （Ｂ）配列の型ニ　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー、　直鎖状 （ｘｌ）配列番号＝２１の配列： ＶａＬ　＾ｒ９　Ａｒｇ　Ｓ＠ｒ　Ｌｙｅ　Ｓａｔ　Ｘｌｅ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　 （Ａｙ　Ａｒｇ　Ａｌａ　ｔｈｅ　入ｒ９　丁ｈｒ　＾ｘ９（２）配列番号：２ ２ （ｉ）配列の特徴； （Ａ）配列の長さ−１７ （Ｂ）配列の型・　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘｌ）配列番号−２２の配列： ＬＹＩＩ　ｓ＠ｒ　Ｘｌｅ　λｒ９　工１１１　ｃａｎ　ｍｇ　ＧＬｙ　Ｉ’ｒ ｏ　ＧＬｙ　入ｒｇ　入Ｌａ　ｔｈｅ　ＶｓｉＬ　Ｔｈｅ　氏B Ｓ　１０　ｉｓ ＩＹ （２）配列番号：２３ （ｉ）配列の特徴・ （Ａ）配列の長さ：１７ （Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘｉ）配列番号：２３の配列： Ｔｈｅ　入ｒｇ　ＬＹ＃　Ｇｌｙ　Ｘｌｅ　１ｌｉｓ　Ｘ１ｅ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ 　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｌａ　工↓ｓ　Ｔｙｒ　入Ｌａ　Ｔｈ■ （２）配列番号：２４ （ｉ）配列の特ｉｊｉ： （Ａ）配列の長さ＝１７ （Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘｌ）配列番号：２４の配列・ 丁ｈｒ　ｓ＠ｒ　＾ｔｑ　Ｏｌｙ　Ｘｌｅ　＾ｒ９　工１ｅ　Ｇｌｙ　Ｐｌ：ｏ 　ＯＬｙ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｘｌｅ　Ｉａ＠ｕ　入１ａ　Ｔ■■ Ｓ　１０　ｘｓ Ｇ↓υ （ｌｎ　Ｑｌ／ＬＬｌｄ：）） 峯穀危ＹＩ班 （Ｉｎ　０＋／ＬＬＩ（１：’） 峯ａ九）班 （ＬＬＩｄり）　峯！Ｉ危）研 感染後の日数 一◆−十対照（ＣＴＬまたは抗体非存在下）−→−ＣＴＬ十単量体 感染後の口数 ＋　ＣＴ　Ｌ＋異種複合体　図５（１）感染後の日数 一心−ＣＴＬ十異［複合体 図５（Ｃ） ０　２　４　６　８　ｔｏ　１２ 感染後の日数 図５（Ｄ） 感染後の１１数 −４−４一対照（ＣＴ　Ｌ、または抗体非仔在「）−１−ＣＴ　Ｌ　＋　ｆｉｔ 二体 −Ｏ−ＣＴ　ｉ、十異種複合体 図５（Ｅ） 感染後の日数 一◆−十対照（ＣＴＬまたは抗体非存在下）感染ｉその日数 ｍ＝１−　十対照（ＣＴ　Ｌまたは抗、体非存在下）感染後の日数 一→−（一対照（ＣＴＬまたは抗体非存在下）−一〇−−ＭＯＮ　０ＫＴ３＋６ Ｃ −一◆−−ＨＣ０ＫＴ３／６Ｇ５ 図６ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）１、国際出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ９２１０３６１６ ２、発明の名称 ＨＩＶ感染治療のための異種複合抗体 ３、特許出願人 住　所　アメリカ合衆国　マサチューセッツ州　ケンブリッジビルディング　７ ００　ワン　ケンダル　スフウェア名　称　リブリジェン　コーポレーション国 　籍　アメリカ合衆国 ５、補正書の提出年月日 １９９３年　７月１４日 ６、添付書類の目録 （１）補正書の写しく翻訳文）　１通 く原文第１３頁の翻訳文〉 １Ｈｇ／ｍｌの０ＫＴ３１５９．１異種複合抗体存在下での、逆転写酵素活性に 対する細胞毒性１９２８球とＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞の比率の効果を 示したグラフである。逆転写酵素活性（ｃｐｍ／１０μｍ）は、ＣＥＭ−ｓｓ細 胞に対する細胞毒性リンパ球の関数で示している（１Ｇｇｌｏスケール）。 図５　（Ａ）　〜５　（Ｈ）は、ＨＩＶ−ＭＮ　（５Ａ）　、ＨＩＶ−Ａｌ　ａ ｂａｍａ（５Ｂ）　、ＨＩＶ−Ｄｕｋｅ７８８７−７　（５Ｃ）　、ＨＩＶ−Ｄ ｕｋｅ６５８７５　（５Ｄ）　、ＨＩ　Ｖ　Ｄｕｋ　ｅ６５８７　７　（５Ｅ） 　、ＨＩＶ　Ｉ　Ｉ　Ｉ　ｓ　（５Ｆ）　、ＨＩＶ−３Ｆ２　（５Ｇ）　、及び ＨＩＶ−ＷＭＪ２　（５Ｈ）に感染したＣＥＭ−ｓｓ細胞の逆転写酵素活性に対 する、細胞毒性１９２８球と０ＫＴ３１５９゜１異種複合抗体（白四角）及び０ ＫＴ３抗体と５９．１抗体の複合していない混合物（黒二角）の効果を示したグ ラフである。逆転写酵素活性（ｃｐｍ／１０μｌ）は、感染後の日数の関数で示 している。 図６は、ＨＩＶ−Ｉ１１８感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞の逆転写酵素活性に対する、複 合０ＫＴ３抗体と６Ｇ５抗体の混合物（白丸）及び０ＫＴ３／６Ｇ５異種複合抗 体（黒丸）の効果を示したグラフである。逆転写酵素活性（ｃｐｍ／１０μｌ） は、細胞培養物中の初期抗体濃度（ｎ　ｇ／ｍ　１　）の関数で示している。 ＡＩＤＳ治療に対する異種複合抗体 本発明の分子は、ＨＩＶに感染した細胞を殺すことのできる細胞毒性免疫エフェ クター細胞表面に存在する抗原に対する第一の抗体を、ＨＩＶ感染細胞の表面に 存在するＨＩＶ抗原に対する第二の抗体に結合することにより作製した異種複合 抗体である。 く原文第３２頁の翻訳文〉 表２：ｖ３ループ配列 Ａ　ｌ　ａ　ｂ　ａｍａ　−ＫＳ　−−−−−−−−−−Ｈ−−ＲＤｕｋｅ　６ ５８７−５　Ｖ−Ｎ　−−−−−−−−−−Ｈ−−−８Ｆ２　”ｒ−−ｓ−ｙ− −−−−一−１（−−ｃＷＭＪ２　Ｖ−Ｒ８ＬＳ−−−−−−−Ｒ−ＲＥｌ　１ １　ＢＫＳ　ｌ　−−ＱＲ−−−−−−Ｖ−Ｉ　ＧＤＵＫＥ　６５８７−７　Ｔ −−Ｇ−−−−−−−−１−Ａ−ＧＤＵＫＥ　７８８７−７　ＴＳＲＧ−Ｒ−− −−−−ＩＬＡ−Ｅこの表において、°−１はその位置のアミノ酸がＭＮと同一 であることを示している。保存されたＧＰＧＲＡＦモチーフは下線で示している 。 図５（Ａ）〜５（Ｈ）において、ＨＩＶ単離物がＧＰＧＲＡＦ配列を有する場合 はすべて（ＭＮ、Ａ１ａｔ＋ａｍａ、Ｄｕｋｅ　６５８７−５、ＩＩＩＢ、ＳＦ ２、ＷＭＪ２　；＋ｔ’Ｌｆｔ’Ｌ図５Ａ、ＢＳＤ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）　、０ＫＴ３ １５９．１（白四角）は、逆転写酵素活性を抗体またはＣＴＬを添加しないＣＥ Ｍ−ｓｓ（黒丸）と比較して９５９６以上阻害した。ＧＰＧＲＡＩモチーフを有 する２Ｎの単離物、ＤＵＫＥ　６５８７−７　（図５Ｅ）　、ＤＵＫＥ　７８８ ７−７　（図５Ｃ）を試験しタトコロ、１つ（ＤＵＫＥ　６５８７−７）　は１ ｌＪ１害した。０ＫＴ３と５９．１の複合していない混合物（黒三角）は効果を 示さなかった。 ０ＫＴ３／６Ｇ５異種複合抗体は感染細胞中で逆転写酵素活性を阻害するＯＫＴ 　３／６　Ｃ５，ｆｌＦ！複合抗体の、ＨＩＶ−１１１感染ＣＥＦｖ１−ｓｓ細 胞中の逆転写酵素活性を阻害する能力を試験した。簡単に記載すると、ＣＥＭ− ｓｓ（９６ウエルプレート中１５，０００細胞／ウエル）を６４　１ＵのＨＩ　 Ｖ−１目、に表出１〜た。１８時間後、ＣＴＬ　（４５，０００細胞／ウエル） 及び種々の濃度の０ＫＴ３／６Ｃ５異種複合抗体を添加した。７日後、上述の通 りに逆転写酵素活性を測定した。 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　５／１０ １５／１３　ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ　２１１０８　８２１４−４ＢＩ [It is also characterized by a heterologous composite antibody containing a first protein and a second protein, where the first protein contains an antibody against an antigen present on the surface of effector cells in peripheral blood, and the second antibody portion is expressed on the surface of an HIV-infected cell. H IV-MN Arui! Contains antibodies against the v3 loop sequence of the gp120 envelope protein of HIV-MN variants. Here, in a first mixed cell culture containing effector cells and HIV-MN-infected CEM-ss cells, different f. The conjugated antibody suppresses the reverse transcriptase activity of this first mixed culture cell. The cell density is reduced by at least 80% compared to an otherwise identical second mixed cell culture containing effector cells and HIV-MN infected CEM-ss cells. Here, effector cells were in 3-fold excess over CEM-ss cells in the first and second mixed cell cultures, and reverse transcriptase activity was determined at M1 at 10 days postinfection [1], with different f! Conjugate antibody and effector cells are added to the first mixed cell culture 18 hours after infection, and the first and second cell cultures are infected with 100-1000 units of HIV-MN. In a related aspect, the invention provides a heterologous complex comprising covalently linked first and second proteins. The first protein is an antibody present on the surface of effector cells in peripheral blood. The second antibody portion contains an antibody against the V3 loop sequence of the gp120 envelope protein of HIV-MN or HIV-MN variants expressed on the surface of HIV-infected cells. Here, in a first mixed cell culture containing effector cells and HIV-MN-infected CIIJf-ss cells, the heterologous conjugate antibody at an initial concentration of 5 ng/ml inhibits the reverse transcriptase activity of the first mixed culture cells. Effect Another identical second mixed cell culture containing target cells and H[V-MN-infected CEM-ss cells. decrease by at least 8096 compared to the Here, effector cells were in 3-fold excess over CEM-ss cells in the first and second mixed cell cultures, reverse transcriptase activity was measured 10 days post-infection, and xenoconjugated antibodies and effector cells were The first mixed cell culture is added 18 hours after infection, and the first and second cell cultures are infected with between 100 and 1000 HIV-MN. In another related aspect, the invention features a heterologous conjugate antibody comprising a covalently linked first protein and a first protein, the first protein being present on the surface of effector cells in peripheral blood. a second antibody portion expressed on the surface of an HIV-infected cell. contains an antibody against the V3 loop sequence of the gp120 envelope protein (gp120 envelope protein) of infected HIV-MN cells. In one mixed cell culture, the first A single phase of 1 ng/ml of xenoconjugated antibody was used to compare the reverse transcriptase activity of this first mixed culture with another identical second mixed cell culture containing effector cells and HIV-MN-infected CEM-s5 cells. , by at least 80%. Here, the effector - cells were in 3-fold excess of CEh4-ss cells in the first and second mixed cell cultures. Reverse transcriptase activity was determined in M1 at 10 EE postinfection, and the Vector cells are added to the first mixed cell culture 18 hours after infection, and the first and second cell cultures are infected with 100-1000 units of HXV-MN. In a related aspect, the invention provides a heterologous complex comprising covalently linked first and second proteins. The first protein is an antibody present on the surface of effector cells in peripheral blood. the second antibody portion comprises an antibody against the amino acid sequence GPGRAF. Contains the body. In a preferred embodiment, in a first mixed cell culture comprising effector cells and CEM-ssm cells infected with HIV-MN, a The enzyme activity was reduced compared to the reverse transcriptase activity of another identical second mixed cell culture containing HIV-MN infected CEM-ss cells. also reduced by 80%. Here, in the first and second mixed cell cultures, effector cells were in 3-fold excess over CEM-ss cells, reverse transcriptase activity was measured at day 10 post-infection, and heteroconjugate antibodies and effector cells were detected at day 10 postinfection. One mixed cell culture is added 18 hours after challenge, and the first and second cell cultures are infected with 100-1000 infectious units of HIV-MN. In a related aspect, the invention provides a heterologous complex comprising a co-associated first and second protein. The first protein is an antibody present on the surface of effector cells in peripheral blood. The first antibody portion contains an antibody against the amino acid sequence IXIGPGR. Here, X may be any amino acid. In a preferred embodiment, in a first mixed cell culture comprising effector cells and CEM-ss cells infected with HIV-MN, 20 ng/ml of the heteroconjugate antibody inhibits the reverse transcriptase activity of the first mixed culture cells from the effector cells. at least 80% compared to the reverse transcriptase activity of another identical second mixed cell culture containing CEM-ss cells and HIV-MN infected CEM-ss cells. Here, effector cells were in 3-fold excess over CEM-ss cells in the first and second mixed cell cultures, reverse transcriptase activity was measured 10 days after infection, and the heteroconjugate antibody and effector cells were in the first mixed cell culture. The first and second cell cultures are infected with 100-1000 infectious units of HIV-MN, which are added to the cell cultures 18 hours after infection. In a related aspect, the invention provides a heterologous complex comprising covalently linked first and second proteins. The first protein is an antibody present on the surface of effector cells in peripheral blood. The second antibody portion contains an antibody against the amino acid sequence QARILAVERYL KDQQLLG IWGC5GKL IC. In a preferred embodiment, in a first mixed cell culture comprising effector cells and CEM-ss cells infected with HIV-MN, 20 ng/ml of the heteroconjugate antibody inhibits the reverse transcriptase activity of the first mixed culture cells from the effector cells. at least 80% compared to the reverse transcriptase activity of another identical second mixed cell culture containing CEM-ss cells and HIV-MN infected CEM-ss cells. Here, effector cells were in 3-fold excess over CEM-ss cells in the first and second mixed cell cultures, reverse transcriptase activity was measured 10 days after infection, and the heteroconjugate antibody and effector cells were in the first mixed cell culture. The first and second cell cultures are infected with 100-1000 infectious units of HIV-MN, which are added to the cell cultures 18 hours after infection. In other preferred embodiments, the effector cells are selected from the group consisting of cytotoxic 1926 cells, neutrophils, monocytes/macrophages, and large granular lymphocytes. The antigen present on the surface of effector cells is CD3. In another preferred embodiment, the present invention relates to a pharmacologically acceptable hybrid comprising a pharmacologically effective amount of a heteroconjugate antibody as described above. In a related aspect, the invention relates to a method for treating patients infected with HIV; The method involves administering to the patient a pharmacologically acceptable composition as described above. In other embodiments, the invention provides: (a) effector cells expressing cell surface antigens; and (b) an effector cell targeting HIV, comprising the above-mentioned heteroconjugate antibody. Regarding cells. In a related aspect, the invention relates to a method for treating patients infected with HIV; The method involves administering to the patient the HIV-targeted effector cells described above. The MN basic type virus has a position in the v3 loop region of the gp120 envelope protein. The specific amino acid subsequence at position AI '17 is defined by -R- to -R-1-H-1- G-P-G-R-A-F-Y-T-T-K. (Amino acid sequences are shown in standard one-letter notation.) The MN virus variant has a complete match with the HIV-MN sequence described above in amino acid residues 1-G-P-G-R at positions A7-A1, and the rest. 12 amino acids have a minimum of 36% homology with the HIV-MN sequence described above. "°" refers to an antibody that binds to the indicated antigen. amino Defined as acid region. The heteroconjugate antibodies of the invention are highly effective. indicated by reverse transcriptase assay As shown, it almost completely inhibits virus reproduction even at low concentrations. Suitable heteroconjugate antibodies are those that are effective against more than one strain. Other features and advantages of the invention will be apparent from the preferred embodiments described below and from the claims. Detailed Description of the Invention 4. [Brief Description of the Drawings] Figure 1 shows the conjugate of 0KT3 antibody and 59.1 antibody on the reverse transcriptase activity of HIV-111B-infected CEM-ss cells in the presence of cytotoxic 1928 cells. Not mixed Groups showing the effects of 0KT3159.1 (black diamonds) and 0KT3159.1 heteroconjugate antibody (white squares). It's rough. Reverse transcriptase activity (cpm/10 μm) is shown as a function of initial antibody concentration (ng/ml) in cell culture. Figure 2 shows the reverse of HIV-MN infected CEM-ss cells in the presence of cytotoxic 1928 cells. Figure 2 is a graph showing the effects of an unconjugated mixture of 0KT3 and 59.1 antibodies (black diamonds) and a 0KT3159.1 heteroconjugate antibody (open squares) on transcriptase activity. Reverse transcriptase activity (cpm/10 μm) is shown as a function of initial antibody concentration (ng/ml) in cell culture. Figure 3 shows HIV-111B infected CEM-ss cells in the absence of cytotoxic T lymphocytes. Uncomplexed mixture of 0KT3 and 59.1 antibodies on reverse transcriptase activity in cells. Graph showing the effects of compound (white circle) and 0KT3159.1 heteroconjugate antibody (black circle) It is f. Reverse transcriptase activity of HIV-111B-infected CEM-ss cells in the presence of only cytotoxic 1926 cells (black triangles); Reverse transcriptase activity of only HIV-111B-infected CEM-ss cells (open circles); The reverse transcriptase activity (black angle of view) of only CEM-ss cells that are not treated is also shown. Reverse transcriptase activity (cpm/10 μl) is shown as a function of initial antibody concentration (ng/ml) in cell culture (anti- (except when not adding body). Figure 4 shows the ratio of cytotoxic 1926 cells and HIV-MN infected CEM-ss cells to reverse transcriptase activity in the presence of 1 μg/'ml 0KT3159.1 heteroconjugate antibody. This is a graph showing the effect of rate. Reverse transcriptase activity (cpm/10 μm) is shown as a function of cytotoxic lymphocytes against OEM-ss cells (log 10 scale). Figure 5 shows HIV-MN (panel A), HIV-Alabama (panel B), HIV-Duke7887-7 (panel C), HIV-Duke6587-5 (panel D), HIV-Duke6587-7 (panel E), Cytotoxic 1926 spheres and 0KT3159.1 heterologous complex on reverse transcriptase activity of CEM-ss cells infected with HIV-II IIB (panel F), HIV-5F2 (panel G), and HIV-WMJ2 (panel H). This is a graph showing the effects of antibodies (white squares) and an uncomplexed mixture of 0KT3 and 59.1 antibodies (black triangles). Reverse transcriptase activity (cpm/10 μm) is shown as a function of days post-infection. Ru. Figure 6 shows multiple effects on reverse transcriptase activity of HIV-1118-infected CEM-ss cells. Mixture of 0KT3 antibody and 6C5 antibody (white circle) and 0KT3/6C5 heterogeneous composite antibody This is a graph showing the effect of the body (black circles). Reverse transcriptase activity (cpm/10 μl) is shown as a function of initial antibody concentration (ng/ml) in cell culture. Heteroconjugate Antibodies for AIDS Treatment Molecules of the invention are cytotoxic immune effecters capable of killing cells infected with HIV. This is a heterogeneous composite antibody produced by binding a first antibody directed against an antigen present on the surface of HIV-infected cells to a second antibody directed against an HIV antigen present on the surface of HIV-infected cells. The heteroconjugate antibodies of the invention are highly potent. These heteroconjugate antibodies can be used at low concentrations. can also sufficiently reduce HIV activity in mixed cell cultures of HIV-infected cells and effector cells. The most suitable heteroconjugate antibodies have high potency and broad spectrum. It has both the reactivity of Heterogeneous composite antibody with a wide range of reactivity A body refers to one that is effective against one or more strains of HIV. For example, a heteroconjugate antibody with a broad range of reactivities may be used for HIV-MN and HIV-3F2 or IIV-MN and HIV-WMJ2. Effective against HIV-MN and HIV-111Bl. against cytotoxic immune effector cells that can kill HIV-infected cells. Some of the xenoconjugate antibodies used are cytotoxic 1926 cells, monocytes/macrophages, and large condyle cells. Recognizes antigens present on the surface of cells such as granular lymphocytes (including cells and NK cells) and neutrophils. Antibodies to cytotoxic immune effector cells are Preferably, the antigen binds to the antigen on the cell surface and induces cytolytic activity. For example, The recognized antigen is the CD3 receptor or the CD16 (Fc) receptor. Less preferred are antibodies directed against receptors that require multiple signals to elicit cytolytic activity (eg, CD2 and CD28 receptors). A part of the heterologous complex antibody against the antigen present on the surface of HIV-infected cells is derived from (1) gl120 envelope protein of the MN basic form of HIV-1 (HIV-MN). (2) an epitope in the v3 loop sequence of the gl120 envelope protein of the MN basic viral variant of HIV-1; (3) an epitope in the v3 loop sequence of the gp41 envelope protein between amino acids 584-611 recognize epitopes within the It is preferable that The 3-loop of gp120 is a 36 amino acid region from amino acids 303 to 338 according to the gl)120 numbering of Ratner et al. (Nature 313:277.1985). The MN basic virus has gp120 envelope protein. The amino acid subsequence in white matter is defined by -R- to -R-1-H-1-G-P-G-R-A -F-Y-T-T-K (A' -A'). Ru. The MN virus variant has a complete identity of amino acid residue 1-G-P-G-R at positions A7 to A11 with the old V-MN sequence described above, and the remaining 12 amino acids are at least 36% identical to the HIV-MN sequence described above. It has homology to . The antibodies against HIV mentioned above are good candidates for generating highly potent heteroconjugate antibodies. However, there are cases where the efficacy of the produced heterogeneous conjugate antibody is not high. Ru. Finally, in the production of the heterologous composite antibody of the present invention, The only way to evaluate its usefulness in the body is to create a heterogeneous conjugate antibody. For example, an antibody against ) It can be covalently linked to an anti-CD3 antibody, and a suitable assay can be used to For example, to evaluate the efficacy of conjugated antibodies. Once a heterogeneous copy of a specific antibody against HIV If the antibody is shown to be useful in generating conjugated antibodies, it can be used to generate other heteroconjugate antibodies by covalently linking the antibody to antibodies directed against other effector cell antigens. can be used. As mentioned above, the most suitable heteroconjugate antibodies combine high potency with a wide range of reactivity. This is what I prepared for. (1) an epitope with the sequence G-P-G-R-A-F, (2) an epitope with the sequence I-X-1-G-P-G-R (where X can be any amino acid). Antibodies against HIV that recognize epitopes within (3) amino acids 584-611 (according to the numbering of Ratner et al., 5utyrs) of gp41 have high potency and broad reactivity. This may be useful for the production of heterologous conjugate antibodies with the v3 loop of HIV-MN, the v3 loop of HIV-MN viral variants, or the epitope in gp41. The antibody that recognizes the tope can be used to create a heterogeneous composite antibody with high potency and wide-ranging reactivity. manufactured; this does not indicate that it cannot be used. Techniques for producing and screening antibodies against HIV for Y-1 in the preparation of heteroconjugate antibodies, methods for preparing heteroconjugate antibodies, and methods for evaluating the potency and breadth of reactivity of heteroconjugate antibodies are described below. In order to create a heterogeneous composite antibody with a wide range of reactivity, it is effective to select an antibody against HIV that recognizes a wide range of IM strains (i.e., an antibody that is not strain-specific). Amino acid sequence G-P-G-R-A -F.Amino acid sequence 1-X-[-G-P-G-R, where X can be any amino acid. ), or an epitope within the amino acid 584 to amino acid 611 region of gp41. It is also effective to select antibodies against the same group. These antibodies are listed below. can be identified using standard epitope mapping techniques. Generally, useful antibody generation and selection processes against HIV include the following. (1) Production of hybridomas and hybrids that produce reactive antibodies (2) selection of hybridomas that produce antibodies capable of binding to cells expressing the HrV envelope protein, (3) amplification and purification of the selected monoclonal antibodies, (4) gp120 V3 loop peptide or gp41 origin of pe Analysis of antibody reactivity using peptides, (5) Epitope mapping. As mentioned above However, not all of these steps are essential. Simplify steps 1 to 3 and make them different. Purified antibodies can be used to prepare species-conjugated antibodies. The potency and breadth of reactivity of this heterogeneous conjugate antibody are determined by the reverse transcriptase assay described below. It can be analyzed more easily. To produce the heteroconjugate antibodies of the present invention, purified antibodies against HIV are covalently linked to antibodies against immune effector cells. Ru. The potency and range of reactivity of heteroconjugate antibodies can be determined using reverse transcriptase assays in mixed cell cultures of effector cells and HIV-infected cells. Ru. Heteroconjugate antibodies can be formed by any crosslinking method. Suitable crosslinking methods include 5PDPSSPDP and SMCC, and biotin-avidin. Segal et al. (US Pat. No. 4,676,980) describe a number of crosslinking techniques. Another method is hybrid-hybrid Antibodies can be combined by producing antibodies with dual specificity via multi-layer hybridization (Suresh et al., Methods in Enzymology 121°210.1986) or by genetic engineering. ) Preparation of Antibodies to 11V Antibodies useful in the preparation of the heteroconjugate antibody molecules of the invention can be produced and prepared as described below. and screening. HIV-MN or the Will of HIV-MN Preparation and analysis of antibodies against the V3 loop of the S-variants is also described in U.S. patent application Ser. ). Preparation of Immunogens One group of antibodies against HIV that are useful for generating heteroconjugate antibody molecules recognize sequences in the v3 loop of HIV-MN or viral variants of HIV-MN. follow The immunogens used to generate these antibodies include gp120 or gp160, including all or part of gp160, gp120, V3 J-Rape, or V3 J-Rape. Synthetic peptides containing all or part of a polypeptide are included. In all cases, the V3/Rape sequence is of HIV-MN or a viral variant of HIV-MN. V3) Suitable immunogens for the generation of antibodies against rape include (described below). Another group of antibodies against HIV that are useful for generating heteroconjugate antibody molecules recognize sequences in the amino acid 584-611 region of gp41. Preparation of these antibodies 1. The immunogen used includes all or part of the gp160, gp41, V3 loop. -D-Q-Q-L-L-G- in the sequence between amino acids 584 and 611 of mugp41, that is, Q-A-R-1 -L-A-V-E-R-Y-L- 1-W-G-C-8-G- includes gp160 or gp41 fragments containing all or part of -L-1-C. The immunizing peptide, polypeptide, or protein may be a linear chain (i.e., a linear chain) or a disulfide bond formed between the cysteine residues at the end of the three-loop sequence. It may have three loops, which is a more closed loop. The peptide to be immunized (if more than one V3 loop is present, each loop may form a separate loop via disulfide bonds). Synthetic peptides with the desired sequence can be synthesized using an automated peptide synthesizer. to synthesize I can do it. Intact recombinant gp160 envelope polypeptides are described in U.S. Patent Application No. 091.481 of Ruche et al. Incorporate into references It can be produced and purified in insect cells using a baculovirus expression system as described in (2009). Synthetic peptides or protein fragments used as immunogens may be unconjugated or or, for example, succinylmaleimidomethylcyclohexanylcarbonate, as follows: (SMCC) as a complexing medium with an immunogenic carrier such as keyhole ILmpet hemocyanin (KLH) or ovalbumin. (Yoshitake et al., ), Biochem. 92:1413.1982). Briefly, 1 mg of SMCC dissolved in 50 μl of dimethylformamide was mixed with 5 mg of carrier (at a concentration of 10-20 mg/ml in 0.1 M NaPO, pH 6.5). and incubate for 0.5 h at room temperature. Next (separate the solution in step 1) Excess unreacted SMCC was removed by passing through a Dex G-25 column, and 2 mg of peptide (suspended in a degassed solution of 0.1.M NaPC4, pH 8, 1mM EDTA at a concentration of 10mg/ml). The solution is mixed with N2 gas and partially incubated at 4°C. The sample is then dialyzed against 6M urea, 0.1M NaPO, pH 7 until the precipitate is dissolved. The sample is then passed through a BioGel P-10 column equilibrated with 6M urea, O, IM NaPO. Collect the eluted protein and dialyze it against distilled water. The sequences of several peptides useful as immunogens (RP142.RP70.RP342.RPIoo, RP102.RP108.RP123c, RP174c) are shown in Table 1. This list is not exhaustive. to be used as a source. This is only a small part of the peptides that can be used. (Left below) Table 1: Examples of peptides useful as immunogens RP142 YNKRKRIHIGPG RAFYTTKNI IG (C) RP342 1HIGPGRAFYT RP70 1NCTRPNYNKRKRIHIGPGRAFYTTKN 11 GT I RQAHCN I 5RP 100 (SGG)TRKG IHIGP GRAIY (GGSC)RP102 (SGG)TRKS I S IGPG RAF (GGSC) RP108 (SGG) HIGPGRAFYATG (G GSC) RP123c (C) HIGPGRAF (C) RP135 ([11B) NNTRKSIRIQRGPGRAFVTIGKIG (C) RP174c (C) NNTRKS IRIQRGPGRAF VTIGKIG (C) RP339 (RF) ITKGPGRVIY (C) Note: In parentheses The amino acids of peptide RP70. are not in the native sequence of the isolated peptide. RP123c and RP174c are diamino acids formed between 12 cysteine residues near the end of the amino acid sequence. A loop can be formed by a sulfide bond. How to form such a bond The method is described in Zhang et al, (5't'chemistry 27+37 85.1988). Peptides were prepared for immunization by emulsification in Freund's complete adjuvant according to standard methods (CFA, Difco Labs, Grand 15 Land, NY). ) Generation of antibodies against 11V Antibodies against HIV were produced by intraperitoneal injection of mouse strains (Balb/c, C57BL/6.A, SW, BIO, BR, or BIO, A, Jackson Labs, Bar Harbor, ME). 10-50 μg of rings per mouse. by immunization with modified RP70 (Table 1) or recombinant gp160. It was prepared as follows. The immunogen was boosted to mice in emulsified or solubilized form in Freund's incomplete adjuvant two to three times at intervals of two to four weeks after the initial administration. Ta. Blood was collected from the mice and the serum was examined for the presence of antibodies reactive with the immunogen. Mice showing strong serological reactivity were boosted, and 3 to 5 days later the spleen cells of these mice were challenged with N5-1 (A), which is incapable of secreting both heavy and light chain immunoglobulins. , T, C, C, No, TlB18), 5P2-0 (A, T. C, C, No, CRL8287.CRL8006) or P3. X63. AC3 653 myeloma cells were fused according to a standard method based on the method of Kohler and Milstein (Kearney et al., Immuno/, 123:1548, 1979). The supernatant of the hybridoma that appeared 6 to 21 days after the fusion was screened for antibody production using ELISA screening Ansegua as follows. For hybridomas produced by RP70, RP70 peptide was used to infect gp160. The hybridomas produced by this method contain the amino acid sequence of residues 567 to 647 of gp41. A peptide with the same amino acid sequence as the sequence was used. Peptide into a 96-well Co5tar flat bottom microtiter plate using 50 μl of PBS solution containing peptide at a final concentration of 0.1-10 μg/ml per well. Coated with petite. The peptide solution was aspirated and replaced with PBS+0.5% BSA. After incubation, the wells were aspirated, washed, and placed in a 50 μm hive. Added ridoma performances. After incubation, wash the cells three times with PBS. Goat anti-mouse immunoglobulin - horseradish peroxy, purified and diluted appropriately. Dase Protector (HRP, Zymed Laboratories, San Francisco, CA) 50. Incubated with cal. Use PBS Wells were washed again three times with HRP substrate, 2,2azino-bis(3-e thylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) in 1mM ABTS (0,1M sodium citrate, p) 1:1: Bound antibodies were detected by adding 50 μm of H2O2 diluted to 100 μm. HRP activity was monitored by measuring absorption at 410 nm. Hybridomas that are positive by ELISA can be tested for their ability to bind to cells expressing HIV envelope protein. In one example of such an assay, a recombinant vaccinia virus expressing the enV gene of a particular HIV strain is incubated with a CD4+ human T-lymphoma line, CEM-ss (AIDS Research and Reference Reagent Program, Rockville, MD, catalog #776). infect cells. hybrid The supernatant (or purified antibody) is incubated with infected cells, and the secondary antibody and fluorescent Detect antibody binding by indirect immunofluorescence using a light-activated cell sorter. As a control experiment, we measured binding to the same cells except that they did not express the etyr' gene. Set. It binds to cells that express θ〃to・ but does not bind to cells that do not express the enp gene. Further analysis will be conducted on hybridomas that produce antibodies that do not have the following characteristics. Cells expressing genes in HIV strain e can be prepared as described below. In some cases (in neutralizing antibodies), antibodies to HIV can be evaluated by syncytium formation inhibition assays. In this assay, antibodies are added to a mixture of HIV-infected and uninfected cells and the formation of giant cells is monitored. Details of this assay are described in U.S. Patent Application No. 07/07, filed March 6, 1991. No. 665, '306 (incorporated by this reference). Ru. Preparation of cells expressing HIV eny using recombinant vaccinia virus For binding assays to cells expressing the HIV eny gene, cells infected with vaccinia virus expressing the HIV eny gene, rather than cells actually infected with HIV, were used. Use cells that have been purified. The vaccinia virus promoter allows all iHIV vectors to be The construction of a recombinant vaccinia virus capable of expressing envelope genes is described in EP Publication No. 0 243 029 (incorporated by reference to this invention). HIV any gene and second vaccinia virus pro A recombinant vector having an E. coli /icZ gene expressed by a motor and a vaccinia virus sequence encoding thymidine kinase (DingK) adjacent to it. - A recombinant virus was created using pSC25. (containing the DNA encoding the envelope gene with specificity for the HIV-MN variant) was removed and replaced with a similar 37111 fragment derived from the HIV-MN eny gene. It was prepared by replacing. The resulting plasmid pscR2502 carries the envelope gene. Instead of the 180 amino acid substitution described above, a small portion of the HIV-MN gp160 protein Shark area can be used. For example, any HIV strain derived from a recombinant with the full-length HIV-MNeny gene can be used. Strains expressing multiple HIV envelopes are useful in assessing antibody specificity. CV-1 host pre-infected with vaccinia virus with intact TK gene Principal cells were infected with recombinant vector pscR2502. HIV envelope The target gene is a homologous group between the TK sequence on the vector and the TK sequence in the viral genome. It is integrated into the viral DNA by recombination. Recombinants carrying the HIV envelope gene were selected by infecting TK-deficient cells and plating them on a medium containing bromodeoxyuridine (BUdR) and X-gal. TK-recombinants were selected because BUdR is toxic to TK cells.X-gal is a chromogenic substrate that is degraded by the 1zc2 gene product, and when the It is possible to identify recombinant viruses that also contain the -env gene. Purification and amplification of antibodies Antibody antibodies shown to have peptide binding properties in ELISA assay Bridemas were subcloned by limited dilution. A mixture of hybridoma cells and irradiated liver cells from non-immunized syngeneic mice was used. (final concentrations of 5 cells/m+ and 2.5×10 6 cells/ml) and 200 μ+ of the mixed suspension were placed in microtiter wells, one hybridoma cell per well. The subclones that appeared after 7 to 14 days were evaluated again by the above-mentioned ELISA method. Subcloning some representative positive clones I clicked. The isotypes of the antibodies were determined by ELISA using goat anti-mouse-H RP preparations corresponding to each of the five major mouse immunoglobulin isotypes (IgM, IgG1, 1, 1, 1, 2, 1, 2, 3). Repeatedly confirmed positive in ELISA and syncytial inhibition assays Purified antibodies were prepared by intraperitoneally injecting the hybridoma subclones obtained into pristane-primed syngeneic mice. 2-3 weeks after injection Collect the water and prepare monoclonal antibodies using the method appropriate for each antibody isotype. Purified as described. After elution, all IgG antibodies were dialyzed against PBS. Ta. IgM antibodies were purified by 50% N H2SO4 precipitation of ascites fluid of mice injected with the corresponding hybridoma cells, and the precipitates were then dialyzed against 4x PBS. The dialyzed antibody was then passed through an Ultra IA-6 column (Biotechniques, VfI 1ene uve-La-Garenne, France) pre-equilibrated with 4xPBS. Anti- The fraction containing the body was identified. Ascites containing IgG1 antibodies was diluted with 4 volumes of 0.1 M Tris-HCI, 3 MN aCl, pH 8,9 and passed through a Protein A-Sepharose affinity column equilibrated with the same Tris-NaCI buffer. isolated Ta. Antibodies were eluted using 0.1M sodium citrate, pH 6.0. Ascitic fluid containing IgG2 antibodies was diluted with 2 volumes of PBS and bound to a Protein A-Sepharose affinity column equilibrated with PBS. Next The column was then eluted with 0.15M NaCl, 0.1M acetic acid, pH 3.0. After elution, the antibodies were quickly neutralized by adding IM Na2HCO3. Ascites containing IgG3 antibodies was diluted with 4 volumes of 0.1M Tris-HCI, 3MN aCl, pH 8,9, and treated with Protein A-Sepharose Affinity. The antibody was eluted with 0.15M NaCl, 0.1M acetic acid. Alternatively, all IgG subclasses can be purified by the following method. Ascites was diluted with 4 times the volume of 0.1M Tris-HCI, 3M NaCl, pH 8,9, and subjected to Protein A-Sepharose affinity assay. Elute with 0.15M NaCl, O, 1M acetic acid, pH 3.0. Determination of Antibody Specificity The assay described below determines the strain specificity of antibodies to HIV and can be used to map epitopes recognized by antibodies directed against it. Some or all of these assays can be used to select antibodies against HIV for producing heteroconjugate antibodies. The above-mentioned HIV Binding assays to cells expressing the gene can also be used to assess antibody specificity. Epitopes recognized by antibodies to V3 can be mapped by standard ELISA assays or by competitive ELISA assays as described below. Peptides that are suitable for ELISA assays include (1) a 24-25mer sequence representative of v3 loop sequences from various HIV variants (Table 2), (2) MN V3 lubutin sequence (C)- to -R -1-H-I-G-P-G-R-A -F-Y-T-T- (C), each containing a 12-mer sequence corresponding to the first arginine (R) residue to tyrosine (Y ) contains an MN substitution sequence in which one amino acid up to the residue is replaced with an alanine residue. In substitution sequences, naturally occurring Glycine is substituted for nin. Antibody recognition of epitopes contained in the MN sequence makes it difficult for antibodies to bind to peptides in which alanine is substituted. It is shown from. Binding is inhibited by alanine substitution. A competitive ELISA assay was performed using a standard ELISA assay with the following modifications. Before applying the antibody to the plate, incubate the antibody with one of the test peptides listed above at a concentration of 10 MM - 0,00 45 μM. I did it. If the test peptide competes with the immobilized immunogen for binding to the antibody, ELISA shows little or no binding of the body to the plate. be done. The epitope recognized by antibodies against gp41 may be the entire gp41 sequence or can be mapped in an analogous manner using partially based alanine substitution sequences. It is also possible to use peptides with sequences corresponding to parts of gp41. Antibodies against v3 loop Antibodies that recognize sequences in the v3 loop of HIV-MN gp120 and can be used for the production of heterologous composite antibodies are described below. BALB/C mice were immunized with the RP70 (Table 1) immunogen to generate hybrid mer F59 and F83 were produced. Antibodies designated F59/P5B3 (59,1) and F83/P6F12 (83,1) are identical as non-strain-specific antibodies. established. Alanine-substituted peptides that compete with RP70 in binding to 59.1 antibodies Tide does not contain an alanine substitution in the G-P-G-R-A-F sequence. Similarly, peptides with the G-P-G-R-A-F sequence can compete with RP70 in binding to the 59.1 antibody, whereas peptides without this sequence (i.e., R PI29 and RP175 ) cannot compete. These results suggest that the 59.1 antibody recognizes the G-P-G-R-A-F epitope. child sequences are present in a wide range of HIV variants. The strain specificity of 59.1 was analyzed using the techniques described above. These assays demonstrated that 59.1 recognizes the V3 loop of HIV-1v INSHIV-3F2, old V-WMJ2, and old V-111B. An ELISA assay showed that the 83.1 antibody was isolated from the l-X-1-G-P-G-R epitope. (X can be any amino acid). The strain specificity of the 83°1 antibodies was analyzed using the techniques described above. These assays showed that 83.1 recognizes the v3 loop of HIV-MN, HIV-Alabama, HIV-8F2, HIV-W MJ2 and HIV-Duke 7887-7. It was. We thus identified two antibodies that recognize many HIV strains. 83.1 anti The body recognizes l-X-1 to G-P-G-R epitopes (X can be any amino acid). On the other hand, 59.1 recognizes the GPGRAF epitope. 59.1 anti A heterogeneous composite antibody was produced by Cott et al. (7, Immutyology 140:8.1988) using a human body. Antibodies against gp41 Monoclonal antibodies were generated using recombinant gp160 essentially as described below. ELISA assays showed that one of these antibodies, 6c5, recognizes a portion of gp41 (amino acids 584-611). This portion of gp41 does not vary significantly between HIV strains. Therefore, antibodies against this region are not expected to be strain specific. Using this antibody, a heterogeneous composite antibody was produced and purified by Cott et al. (2001), Immunology 140:8, 1988). 0KT3159.1 and 0KT3/6C5 xenoconjugate antibodies. This figure shows the influence of the composite antibodies, 0KT3159.1 and 0KT3/6C5. The 0KT3159.1 heteroconjugate antibody is an anti-CD3 monoclonal antibody, 0KT3, directed against an epitope in the v3 region of the gp120 subunit of HIV-MN. It was prepared by covalently cross-linking the eye monoclonal antibody 59.1. The 0KT 3/6C5 heteroconjugate antibody is a monoclonal antibody directed against an epitope in residues 584-611 (according to the numbering of Ratner et al., Nature 313: 277.1985) of the gp41 subunit of HIV-MN. It was prepared by covalently cross-linking 6C5. CD3 is a receptor highly related to the T cell receptor (TCR) for antigens. Expresses CD3 receptors When infected cells were cultured in the presence of cytotoxic 1928 cells, the heterologous conjugate antibody of the present invention The body dramatically reduces viral replication, as measured by viral reverse transcriptase activity. Since reverse transcriptase activity is a sensitive indicator of HIV activity, these results indicate a rapid decrease in virus-infected cells. different Without being bound by any particular theory, it has been shown that species-conjugated antibodies promote the death of infected cells by causing T lymphocytes to act on infected cells. Preparation of CTL The CTL cell line (IF8) used for testing the activity of the heteroconjugate antibody was prepared by a modified method of Scott et al. Briefly, large numbers of donor PBL cultures were harvested from an allogeneic, EBV-transformed lymphoblastoid cell line (Stemulae). cells) were incubated for 7 days in RPMI 1640 medium supplemented with 20% FBS (Gibco/BRL, Grand 15L and NY), supernatant from PHA-stimulated PBL, and 100 U/ml recombinant interleukin-2. Cubated. Cells were then cloned by limited dilution (1 cell/well) in U-bottom trays. The supporting cell layer contains irradiated autologous PBL and stem cells. tamulator cells were used. Clones were screened for CTL activity (assessed by lysis of stimulator cells) and NK activity (lysis of K562 cells: CCL 243° American Type Culture Collection, Bethesda, MD). Clone 1F8, which exhibits CTL activity but no NK activity, was selected. CEM-ss cells (15,000 cells/well in 96-well plates) contained 64 infectious units (IU) of HIV-MN or -111B. 18 hours after infection, effector cells (IF8 cells, 45,000/well) were cultured at various concentrations. 0KT3159.1 xenoconjugated antibody or an equivalent amount of unconjugated antibody. was added to stained CEM-ss cells. CTLs were grown in RPF, 111640 containing 10% FBS (Gi bco /BRL) and washed with fresh medium before addition of antibodies. After 78 days, the cell-free culture supernatant was collected, and the reverse transcriptase activity was measured by the method of wtt+eye et al. As shown in Figures 1 and 2, 0.5 g/ml of 0KT3159.1 xenoconjugate antibody (black diamond) was able to inhibit reverse transcriptase in CEM-ss cells infected with either HIV-MN or HIV-IIIB. activity was virtually eliminated. An unconjugated mixture of 0KT3 and 59.1 antibodies (open squares) had no effect on reverse transcriptase activity even at 2,000 ng/ml. In Figure 3, another experiment was performed in which CTL cells (circle) in the presence of 0KT3159. We demonstrated that the 1 xenoconjugated antibody had no effect on reverse transcriptase activity. Similarly, in the absence of the 0KT3159.1 heteroconjugate antibody (black triangles), CTLs had virtually no effect on reverse transcriptase activity in HIV-1 infected cells. CTL cells Unconjugated antibodies in the presence of cells (white circles) and CTL alone (white triangles) are the opposite of infected cells. Transcriptase activity was virtually unaffected. Reverse transcription enzyme in uninfected cells (black squares) No elementary activity was detected. In all cases, CTLs and/or antibodies were added 18 hours after infection. Prolonged virus replication and the resulting spread of the virus may affect the efficacy of heterogeneous complex molecules. HrV sensitivity prior to addition of antibodies and CTLs to determine whether The dyeing time was varied. CEM-ss cells were incubated with HIV-MN or HIV-111B (641U) for 6.18.48 or 72 hours before adding antibodies and CTLs. Reverse transcriptase activity was measured 7 days after infection. If infected for 6.18 or 48 hours before adding 0KT 3159.1 xenoconjugate antibody and CTL, 0.5 g/ml xenoconjugate antibody is sufficient to completely eliminate reverse transcriptase activity. Met. Under the same conditions, an unconjugated mixture of 0KT3 and 59.1 antibodies at 2,000 ng/ml or more was added to remove reverse transcriptase activity. A compound was needed. 1ng/ml OKT'3159.1 was required to eliminate reverse transcriptase activity when infected for 72 hours before addition of antibodies and CTLs. At this point, to remove reverse transcriptase activity, 2. Uncomplexed antibodies of OOOng5/ml or higher were required. Furthermore, we conducted an experiment in which the concentration of antibody was kept constant and the ratio of CTL to CEM-ss cells was varied, and the in vitro conjugate antibody of 0KT3159.1 was We analyzed the effective gradient at . In this experiment °C was 0KT3159.1 heterogeneous conjugate anti- CTL added to the culture at a constant concentration of CEM-s cells (1 Ug/ml), number of CEM-s cells (15,000/well), and infectious dose of HIV-MN or HIV-111 (64, ItJ). The number of . CTL and/or heterologous conjugate antibodies were added 18 hours after infection, and reverse transcriptase activity was measured 7 days after infection. Figure 4 shows that reverse transcriptase activity is completely eliminated when the CTL:CEM-ss ratio is 011, and when the CTL:CEM-ss ratio is It was partially removed (≧6096) even at very low levels. This result indicates that the number of target cells (CEM-s s ) is much larger than the number of F-phthalmocytes (X also in the case of 0KT3159. 1 Heterogeneous conjugate antibody has been demonstrated to be effective. 0KT3.159.1 is effective against many HIV strains 0KT3159.1 heterogeneous conjugate antibody is effective against various HIV strains In order to test whether or not the CEM-ss1!1 cells (150.00077′ well in 24-well plate) i: xoo ~ 1000 infected with 1 U of H[V. At the time of infection, 3 times the amount of CTL (450,000/well) and 0KT3 159.1 heterologous N-conjugate (or 1 Jg/ml monomeric antibody) of zzg/rnl was added to the culture. Addition [,ta. Cultures were harvested weekly, and culture supernatants were collected every 4 to 5 days to measure reverse transcriptase activity. No additional antibodies were added after the once addition. others Therefore, by splitting the culture, antibody concentration and isolation of target cells and one effector cell can be determined. Logarithm decreases. In a text-based experiment, CEM-ss cells were cultured with only the virus [7]. HIV isolates were tested and their V3 sequences are shown in Table 2. Table 2: V3 loop sequence Alabama -KS------H---RDuke 6587-5 V-N----1---H----3F2 T--3- Y-- −G −−−−−−−−−1−A−GDUKE7887‐7TSRG‐R−−−−−ILA−EIn this table, the amino acid at the position marked with “−” is the same as λ4N. Conserved GPGRAF motifs are underlined. In Figure 6, in all cases where an HIV isolate has a GPGRAF sequence (MN. Alabama, Duke 6587-5, INIB, SF2, WMJ2. So Panels ASB, D, F, G, H) and 0KT3159.1 (open squares) compare reverse transcriptase activity with CEMS8 with and without antibody or CTL (black circles). compared to 2, it was inhibited by 9596 or more. Two isolates with GPGRAI motifs were tested, DUKE 6587-7 (Panel E), DUKE 7B87-7 (Panel C), and one (DUKE 6587-7) was 11. [l harmed. An uncomplexed mixture of 0KT3 and 59.1 (black triangles) showed no effect. The 0KT3/6C5 heteroconjugate antibody inhibits reverse transcriptase activity in infected cells The ability of the 0KT3/6C5 heteroconjugate antibody to inhibit reverse transcriptase activity in HIV-111B infected CEM-ss cells was tested. Briefly, CEM-'5s (15,000 cells/cell in 96-well plates) were expressed in 64 IU of HIV-IIIB. After 18 hours, CTL (45,000 cells/well) and various concentrations 0KT3/6C5 heteroconjugate antibody was added. After 7 days, reverse transcription fermentation was performed as described above. Elementary activity was measured. In Figure 6, the 0KT3/6C5 heteroconjugate antibody (white circle) was at a concentration of 0.5 ng/ml. Even at low concentrations, reverse transcriptase activity was virtually eliminated. In contrast, the uncomplexed mixture of 0KT3 and 6C5 showed no particular effect on reverse transcriptase activity. 0KT3159.1 and 0KT3/6C5 are cytotoxic proteins in the presence of CTL. To test the cytotoxic activity of species-conjugated antibodies, we first used recombinant vaccines. 5Icr release in a model system using CVI cells infected with Niavirus. Said. Recombinant vaccinia virus expressing either the HIV-IIIB env gene (VPE16) or the old V-MN (VMN) eny gene. CVI cells were infected with the virus. Recombinant that does not express the HIV θnV gene Elephant vaccinia virus (vs C8) was used as a negative control. cell culture mix The preparation was essentially the same as for the reverse transcriptase assay. IF8 cells were used as effector cells. This cell itself is CV1 cell or vaccinia virus. It does not show cytotoxicity to CVI cells infected with R. In Table 3, 10 μg/ml 0KT3159.1 heteroconjugate antibody lysed 58% of V PE16-infected CVI cells and 62% of VMN-infected CVI cells. Lysis of uninfected cells was very low. Cell lysis was equally low when the 111-mer antibody was added (data not shown). The reason why the lysis rate is up to 60% when using 0KT3159.1 instead of 10096 is probably due to the vaccinia virus. (A syncytium formation assay using limited dilution of CVI cells showed that 50-60% of the cells expressed gp160.) ). A heteroconjugate antibody formed using two antibodies, IC1 or 7C6, that recognizes an epitope at the carboxyl terminus of gp120 and binds to cells expressing HIV env (assessed by FAC3) can be used to detect HIV-MN or HIV-IIIB. It was relatively ineffective in lysing cells infected with vaccinia viruses expressing either e/7V protein. It is clear that cell surface binding is a necessary but not sufficient property to determine whether a given antibody is capable of generating a cytotoxic xenoconjugate antibody. Table 3: Cell lysis by heteroconjugate antibodies 0KT3159.1 6 58 62 0KT3/7C6917N,D. 0KT3/IC1118N, D. The assay described below is used to determine the potency of the heteroconjugate antibodies of the invention. It is something that By using various HIV strains, a given heterologous conjugate antibody can be produced. The breadth of responsiveness can also be determined at the same time. In order to accurately determine the efficacy of the heteroconjugate antibodies of the invention, it is important to measure the effects of the heteroconjugate antibodies on HIV-infected cells under carefully controlled conditions. A suitable assay is described below. Incubate CEM-ss cells (2 4-well microtiter plates, 150,000 cells in 2 ml wells with 100-1000 infectious units (IU) of the objective H summer strain). cells/wells). Eighteen hours after infection, 450,000 effector cells are added with sufficient amount of xenoconjugated antibody to achieve the desired initial concentration. Cells are cultured under camphoric conditions and split every 3 days. Additional heterogeneous conjugate antibody was added. Therefore, each time the culture is split, the heteroconjugate antibody concentration is halved. A control experiment is a culture under exactly the same conditions except that no heteroconjugate antibody is added. On day 10 of infection, Willey et al, (), Vjro10! Reverse transcriptase activity of both cultures is determined by the method of , )'62:139;1988). For HIV strains that require more than 140 days postinfection to reach peak virus production, reverse transcriptase activity should not be measured after 10 days of infection. Instead, virus production is near maximum. Reverse transcriptase activity should be measured at a later time point. Infectious units are determined by the Kiber method. Virus titer decreases during storage Therefore, it is important to measure the titer of the virus preservation solution immediately before use. Virus preservation solutions should be carefully prepared to minimize the number of incomplete virus particles. Ru. For example, the multiplicity of infection of the prepared virus stock solution is preferably 0.001, the cells should be cultured under conditions that allow logarithmic growth, and the virus should be collected at the point of maximum virus production (reverse transcriptase activity or Judging by maximum p24 expression It should be collected at Recombinant xenoconjugate antibodies Monoclonal antibodies are mostly produced in non-human species and are therefore often immunogenic in humans. In order to effectively use a heteroconjugate antibody in human therapy, the antigen-binding portion (variable region) must be derived from a species and must be structurally stable and stable. The parts (certain regions) involved in biological functions are chimeric antibody parts derived from human antibodies. It may be necessary to create a child. Methods for producing chimeric antibodies in which the variable region is derived from one species and the constant region is derived from another species are well known to those skilled in the art. See, for example, Neuberger et al, PCT Publication WO 36101533, Priority Entry September 3, 1984; Morrison et al, EP Publication No. 0,173. 494, Priority Mortar August 27, 1984. Another method is to replace only the complementarity determining regions (CDRs) of the variable region with CDR5 derived from an immunoglobulin with the desired antigen specificity, as described by Winter (GB Publication No. 2.1 88.638, Priority 81986.3). July 27th). By creating antibodies with human FC portions, we have made mouse monoclonals suitable for human therapy. CM Morrtson, 5science 229: 1202.1985). Single polypeptide chain antibodies can also be produced by recombinant methods. It can be produced more easily than the body. Methods for making single polypeptide chain antibodies have been described by Ladner et al. (US Pat. No. 4,946,778), and these methods can be applied to making heteroconjugate antibodies. 'This way Methods for constructing, expressing, and purifying hybrid monoclonal antibodies have been established. Quadromas can be used to generate antibodies with dual specificity (Reading et al., US Pat. Nos. 4,474.893 and 4,714.681). Methods of Use Antibodies of the invention may be administered parenterally, either by intravenous or intramuscular injection. can be given. A typical treatment regimen involves administering an effective amount of the antibody over a period of about one week to about six months. the number of treatments needed to control the patient's disease; The number varies for each patient depending on the severity and stage of the disease and patient characteristics. The total dose required for each treatment may be divided into several doses or administered in multiple doses. Human monoclonal antibodies may be administered alone or in conjunction with other HIV treatments, such as AZT, to control the patient's disease. Pharmacological mixtures of heteroconjugate antibodies are prepared in forms such as liposomes, solutions, suspensions, and microparticles, depending on the intended mode of administration. In some cases, it may be desirable to administer the xenoconjugated antibody together with appropriate effector cells. (Nitta et al., 1he 1ancet 335:368° 1990). For example, peripheral blood lymphocytes (PBL) are collected from a patient (or a compatible donor) in need of treatment for HIV infection and incubated with a xenoconjugated antibody. and then reinject the cells. In some cases, PBLs are spread in culture (Rosenberg et al., 5cietyce 233:1318, 1986). may be incubated with Additionally, cells may be incubated with molecules such as receptor-specific antibodies (Scott et al., Cellular Immunology 114:370.1988) that stimulate the cytolytic activity of effector cells. Claims: Sequence listing (2) Sequence number: (i) Sequence characteristics: (A) Sequence length: 6 CB) Sequence type: Amino acids (D) Topology: Linear (xi) Sequence number: Sequence of 1: C1y Pro cly Arg ALa Pha (2) SEQ ID NO: 2 (1) Sequence characteristics: (A) Sequence length: 7 (B) Sequence type: Amino acids (D) Topology: Linear ( xi) Sequence of SEQ ID NO:2: 11 @ Amino acid (D) Topology: Linear (xi) Sequence of SEQ ID NO: 3: Gin ALa Arg XLm L@LI Ala Val Glu Arg Tyr Leu Ly-^-p (inn Gin LaS !Ois L*u Gly Xl・τrp Gly CY@S@t Gly Lye L 4Ll Engineering Linear (Xl) Sequence of SEQ ID NO: 4: Lye (2) SEQ ID NO: 5 (i) Sequence characteristics: (A) Sequence length: 5 (B) Sequence type: Amino acids (D) Topology: Linear (xi) Sequence of SEQ ID NO: 5: XLm GLY Pro Gly Arg (2) SEQ ID NO: = 6 (i) Sequence characteristics: (A) Sequence length = 24 (B) Sequence type: Amino acid ( D) Topology: Linear (xi) Sequence of SEQ ID NO: 26: Tyr Asn Lye Arg Lys In rg Xi・ 111g XLm Gly 1lro Gly Ar9 ALa Ph・ 'pr S 10 is τhr Thr Ly@ Asn !le !le GLy C1m2゜ (2) Sequence number near (i) Sequence characteristics: (A) Sequence length = 11 (B) Sequence type: Amino acid (D) Topology: Linear (xi) Sequence near SEQ ID number: Xis 11Lm XLm Gly Pro Gly Arg Ala Pha Tyrτ (2) Sequence number: 8 (i) Sequence characteristics?ji: (A) Sequence length = 40 (xi) Sequence of sequence number: 8: !i@Asn CY# Thx kg Pea＾-n?yr＾-n LF JL rg LF hxq XLm BLm !leS 10 1s GIY Pro ally Ar9 ALa Ph@Tyt Thr Tehr Ly-Asn XLm! le 31y Thr Type: Amino acid (D) Topology: Linear (xi) Sequence of SEQ ID NO: 9: S@3? Gly Gly Thr Arg L)n Oly H@Mi・Xi s cly Pro Gly Arg^la! l@S 10 15? yr Gly Oly SQL cys (2) Sequence number = lO (i) Sequence characteristics: (A) Sequence length = 20 (B) Sequence type: Amino acid (D) Topology: Linear (xl) Sequence number = Sequence of 10: s@r Gly cxy Thr Ar9 LY@SQL” XL Ken S Co. XL @ Oly pro 017 Co. g^la Phs5 10 1s Gly Oly a@r Cys (2) Sequence number: 11 (i) Characteristics of the sequence : (A) Sequence length = 19 (B) Sequence type: Amino acid (D) Topology: Linear (x i) Sequence of SEQ ID NO: 11: SQL C:Ly Oly H1s＠ Oly Pro Oly Arg＾ La Ph@Tyt^la The Gly Gly (2) SEQ ID NO: 12 (i) Sequence characteristics: (A) Sequence length: 10 CB) Sequence type: Amino acid (D) Topology: Linear (xi) Sequence of SEQ ID NO: 12: Cys 1lls Xis Gly !'roGly kg^la Phs CysS Yu0 (2) SEQ ID NO: 13 (i) Sequence characteristics: (A) Sequence length = 25 (B) Sequence length Type: Amino acid (D) Topology: Linear (xl) Sequence of SEQ ID NO: 13: ^-n ^-n rhr ^xq Lys li@r Xis Arg 工1@ctn A19 sty pro Gly ^xq A15 10 1s Ph @ Val Dhr Xis GAY LY @ XIJ cly CY @ (2) Sequence number = 14 (1) Sequence characteristics @: (A) Sequence length: 26 (B) Sequence type: Amino acid (D) Topology: Direct Chain (xi) Sequence of SEQ ID NO: 14: q-^an A button thr Arg Ly# 1!+@r Engineering @ Oly Lys Engineering * (il y cym (2) Sequence number = 15 (i) Sequence characteristics: (A) Sequence length = 11 (B) Sequence type: Amino acid (D) Topology: Linear (x i) Sequence of sequence number = 15: Xis Thr Lys Oly Pro Gly JLrg VJLL Il @?yr C'ys (2) Sequence number: 16 (i) Sequence characteristics: (A) Sequence length: 16 ( B) Sequence type: Amino acid (D) Topology: Linear (xi) Sequence of SEQ ID NO: 16: Cys Lys Arg 11m RL@Xis Gly Pro Gly Arg^1m Ph・T7r Thrτhr CY@5 10 is (2) SEQ ID NO: 17 (1) Sequence characteristics: (A) Sequence length: 17 (B) Sequence type: Amino acid (D) Topology: Linear (Xl) Sequence of SEQ ID NO: 17: (2) Sequence Number = 18 (i) Sequence characteristics: (A) Sequence length = 17 (B) Sequence type/amino acid (D) Topology: Linear (xi) Sequence of SEQ ID NO: 18: Ly@Ly@gsr Mg Engineering@Ius Xis Oly Pro Gly kg^la Phs HLmdinghrτhr(2) SEQ ID NO: 219 (i) Sequence characteristics (A) Sequence length: 17 (B) Sequence type: Amino acids (D) Topology : Linear (xi) Sequence of SEQ ID NO: 19: (2) SEQ ID NO: 20 (i) Sequence characteristics: (A) Sequence length: 17 (B) Sequence type: Amino acids (D) Topology: Linear (xi) Sequence of SEQ ID NO: 2o: (2) SEQ ID NO: 21 (i) Sequence characteristics: (A) Sequence length: 17 (B) Sequence type 2 amino acids (D) Topology, straight Chain (xl) Sequence of SEQ ID NO: 21: VaL ^r9 Arg S@r Lye Sat (A) Sequence length - 17 (B) Sequence type/amino acids (D) Topology: Linear (xl) Sequence of SEQ ID NO: 22: LYII s@r Xle λr9 Engineering 111 can mg GLy I'r o GLy input rg input La the VsiL The Mr. B S 10 is IY (2) Sequence number: 23 (i) Sequence characteristics・ (A) Sequence length: 17 (B) Sequence type: Amino acid (D) Topology: Linear (xi) Sequence of SEQ ID NO: 23: The rg LY# Gly (A) Sequence length = 17 (B) Sequence type: Amino acid (D) Topology: Linear (xl) Sequence of SEQ ID NO: 24・Dinghr s@r ＾tq Oly Xle ＾r9 Engineering 1e Gly Pl :o OLy Arg Ala ri) Mine! I) Laboratory Days after infection 1-10 control (in the absence of CTL or antibodies) -→-CTL 10 monomer Number of mouths after infection + CTL + xenocomplex Figure 5 (1) Days after infection Isshin-CTL 10 different complexes Figure 5 (C) 0 2 4 6 8 to 12 Days after infection Figure 5 (D) 11 numbers after infection -4-4 One control (CTL, or antibody-free) -1 -CT L + fit two bodies -O-CT i, ten heterologous complexes Figure 5 (E) Days after infection 1-10 control (in the absence of CTL or antibodies) infection i days m = 1- 10 control (CT Days after infection (in the absence of L or anti-body) 1→-(one control (in the absence of CTL or antibody) -10--MON 0KT3+6 C -1--HC0KT3/6G5 Figure 6 Copy and translation of the amendment 1. Indication of international application PCT/US92103616 2. Title of invention Heterologous conjugate antibody for treatment of HIV infection 3. Patent applicant Address 700 Cambridge Building, Massachusetts, United States of America One Kendall Software Name Librigen Corporation Nationality United States of America 5. Date of submission of written amendment July 14, 1993 6. List of attached documents (1) Copy and translation of written amendment) 1 copy Original page 13 Translation> Reverse transcriptase activity in the presence of 1Hg/ml 0KT3159.1 heteroconjugate antibody 2 is a graph showing the effect of the ratio of cytotoxic 1928 cells and HIV-MN-infected CEM-ss cells. Reverse transcriptase activity (cpm/10 μm) was measured using CEM-ss cells. It is shown as a function of cytotoxic lymphocytes against cells (1Gglo scale). Figures 5 (A) to 5 (H) show HIV-MN (5A), HIV-Alabama (5B), HIV-Duke7887-7 (5C), HIV-Duke65875 (5D), HIV-Duke65877. (5E), HIV IIIs (5F), HIV-3F2 (5G), and HIV-WMJ2 (5H)-infected CEM-ss cells. A graph showing the effects of cytotoxic 1928 cells and 0KT3159゜1 heteroconjugate antibody (white squares) and an unconjugated mixture of 0KT3 antibody and 59.1 antibody (black squares). It's rough. Reverse transcriptase activity (cpm/10 μl) is shown as a function of days post infection. are doing. Figure 6 shows multiple effects on reverse transcriptase activity of HIV-I118-infected CEM-ss cells. Mixture of 0KT3 antibody and 6G5 antibody (white circle) and 0KT3/6G5 heterogeneous composite anti- This is a graph showing the effect of the body (black circles). Reverse transcriptase activity (cpm/10 μl) is shown as a function of initial antibody concentration (ng/m 1 ) in cell culture. Heteroconjugate Antibodies for AIDS Treatment Molecules of the invention are cytotoxic immune effecters capable of killing cells infected with HIV. This is a heterogeneous composite antibody produced by binding a first antibody directed against an antigen present on the surface of HIV-infected cells to a second antibody directed against an HIV antigen present on the surface of HIV-infected cells. Translation of original text, page 32> Table 2: v3 loop sequence Al a b ama -KS -----------H--RDuke 6 587-5 V-N −−−−−−−−−H−−−8F2 ”r−−s−y−−−−−1−1(−−cWMJ2 V−R8LS−−−−−− R-REI 1 1 BKS l --QR-------V-I GDUKE 6587-7 T --G--------1-A-GDUKE 7887-7 TSRG-R-- -- --ILA-E In this table, °-1 indicates that the amino acid at that position is the same as MN. Conserved GPGRAF motifs are underlined. Figures 5(A)-5(H ), all cases where the HIV isolate has the GPGRAF sequence (MN, A1at+ama, Duke 6587-5, IIIB, SF2, WMJ2; +t'Lft'L Figure 5A, BSD, F, G, H), 0KT3 159.1 (white square) inhibited reverse transcriptase activity by 9596 or more compared to CEM-ss (black circle) without addition of antibody or CTL. Two 2N isolates, DUKE 6587-7 (Figure 5E) and DUKE 788 7-7 (Figure 5C) were tested; An uncomplexed mixture of 0KT3 and 59.1 (black triangles) showed no effect. 0KT3/6G5 heteroconjugate antibody inhibits reverse transcriptase activity in infected cells OKT 3/6 C5,flF! of the composite antibody to HIV-111-infected CEFv1-ss cells. The ability to inhibit reverse transcriptase activity in cells was tested. Briefly, CEM-ss (15,000 cells/well in a 96-well plate) was expressed in 64 1 U of HIV-1 cells. After 18 hours, CTL (45,000 cells/well) and various concentrations of 0KT3/6C5 xenoconjugate antibody were added. After 7 days, the above notification Reverse transcriptase activity was then measured. Continuation of the front page (51) Int, C1,’ Identification code Office serial number C12N 5/10 15/13 ZNA C12P 21108 8214-4BI

Claims (18)

【特許請求の範囲】[Claims] １．共有結合した第一及び第二蛋白質を含む異種複合抗体であり、前記第一蛋白 質は末梢血液のエフェクター細胞表面に存在する抗原に対する抗体を含み、前記 第二の抗体部分はＨＩＶ感染細胞表面に発現されたＨＩＶ−ＭＮあるいはＨＩＶ −ＭＮ変種のｇｐ１２０エンベロープ蛋白質のＶ３ループ配列に対する抗体を含 んでいる、ここで、エフェクター細胞及びＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を 含む第一混合細胞培養において、初期濃度２０ｎｇ／ｍｌの前記異種複合抗体は 、前記第一混合培養細胞の逆転写酵素活性を、前記エフェクター細胞と前記ＨＩ ＶｒＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合細胞培養と比較して少 なくとも８０％低下させる、ここで、前記エフェクター細胞は、前記第一、第二 混合細胞培養において前記ＣＥＭ−ｓｓ細胞の３倍過剰にあり、前記逆転写酵素 活性は、感染後１０日目に測定され、前記異種複合抗体及び前記エフェクター細 胞は、前記第一混合細胞培養に感染後１８時間して加えられ、前記第一、第二細 胞培養は１００−１０００単位のＨｌＶ−ＭＮで感染される。1. A heterologous composite antibody comprising a covalently bonded first and second protein; The protein contains antibodies against antigens present on the surface of effector cells in peripheral blood; The second antibody portion is derived from HIV-MN or HIV expressed on the surface of HIV-infected cells. - Contains an antibody against the V3 loop sequence of the gp120 envelope protein of the MN variant. Here, effector cells and HIV-MN-infected CEM-ss cells are In a first mixed cell culture containing the heteroconjugate antibody at an initial concentration of 20 ng/ml, , the reverse transcriptase activity of the first mixed culture cells is determined by the effector cells and the HI compared to another identical second mixed cell culture containing VrMN-infected CEM-ss cells. at least 80%, wherein said effector cells reduce said first, second in a 3-fold excess of the CEM-ss cells in a mixed cell culture, and the reverse transcriptase Activity was measured on day 10 post-infection and cells were added to the first mixed cell culture 18 hours after infection, and the first and second cells were added to the first mixed cell culture 18 hours after infection. Cell cultures are infected with 100-1000 units of HlV-MN. ２．前記第一細胞培養の前記逆転写酵素活性を、前記第二の細胞培養と比較して ９０％以上低下させることを特徴とする請求項１に記載の異種複合抗体。2. comparing the reverse transcriptase activity of the first cell culture with the second cell culture; The heterogeneous composite antibody according to claim 1, characterized in that the antibody is reduced by 90% or more. ３．共有結合した第一及び第二蛋白質を含む異種複合抗体であり、前記第一蛋白 質は末梢血液のエフェクター細胞表面に存在する抗原に対する抗体を含み、前記 第二の抗体部分はＨＩＶ感染細胞表面に発現されたＨＩＶ−ＭＮあるいはＨＩＶ −ＭＮ変種のｇｐ１２０エンベロープ蛋白質のＶ３ループ配列に対する抗体を含 んでいる、ここで、エフェクター細胞及びＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を 含む第一混合細胞培養において、初期濃度１０ｎｇ／ｍｌの前記異種複合抗体は 、前記第一混合培養細胞の逆転写酵素活性を、前記エフェクター細胞と前記ＨＩ Ｖ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合細胞培養と比較して少 なくとも８０％低下させる、ここで、前記エフェクター細胞は、前記第一、第二 混合細胞培養において前記ＣＥＭ−ｓｓ細胞の３倍過剩にあり、前記逆転写酵素 活性は、感染後１０日目に測定され、前記異種複合抗体及び前記エフェクター細 胞は、前記第一混合細胞培養に感染後１８時間して加えられ、前記第一、第二細 胞培養は１００−１０００単位のＨＩＶ−ＭＮで感染される。3. A heterologous composite antibody comprising a covalently bonded first and second protein; The protein contains antibodies against antigens present on the surface of effector cells in peripheral blood; The second antibody portion is derived from HIV-MN or HIV expressed on the surface of HIV-infected cells. - Contains an antibody against the V3 loop sequence of the gp120 envelope protein of the MN variant. Here, effector cells and HIV-MN-infected CEM-ss cells are In a first mixed cell culture containing the heteroconjugate antibody at an initial concentration of 10 ng/ml, , the reverse transcriptase activity of the first mixed culture cells is determined by the effector cells and the HI compared to another identical second mixed cell culture containing V-MN infected CEM-ss cells. at least 80%, wherein said effector cells reduce said first, second 3 times more than the CEM-ss cells in mixed cell culture, and the reverse transcriptase Activity was measured on day 10 post-infection and cells were added to the first mixed cell culture 18 hours after infection, and the first and second cells were added to the first mixed cell culture 18 hours after infection. Cell cultures are infected with 100-1000 units of HIV-MN. ４．共有結合した第一及び第二蛋白質を含む異種複合抗体であり、前記第一蛋白 質は末梢血液のエフェクター細胞表面に存在する抗原に対する抗体を含み、前記 第二の抗体部分はＨＩＶ感染細胞表面に発現されたＨＩＶ−ＭＮあるいはＨＩＶ −ＭＮ変種のｇｐ１２０エンベロープ蛋白質のＶ３ループ配列に対する抗体を含 んでいる、ここで、エフェクター細胞及びＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を 含む第一混合細胞培養において、初期濃度５ｎｇ／ｍｌの前記異種複合抗体は、 前記第一混合培養細胞の逆転写酵素活性を、前記エフェクター細胞と前記ＨＩＶ −ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合細胞培養と比較して少な くとも８０％低下させる、ここで、前記エフェクター細胞は、前記第一、第二混 合細胞培養において前記ＣＥＭ−ｓｓ細胞の３倍過剰にあり、前記逆転写酸素活 性は、感染後１０日目に測定され、前記異種複合抗体及び前記エフェクター細胞 は、前記第一混合細胞培養に感染後１８時間して加えられ、前記第一、第二細胞 培養は１００−１０００単位のＨＩＶ−ＭＮで感染される。4. A heterologous composite antibody comprising a covalently bonded first and second protein; The protein contains antibodies against antigens present on the surface of effector cells in peripheral blood; The second antibody portion is derived from HIV-MN or HIV expressed on the surface of HIV-infected cells. - Contains an antibody against the V3 loop sequence of the gp120 envelope protein of the MN variant. Here, effector cells and HIV-MN-infected CEM-ss cells are In a first mixed cell culture comprising: The reverse transcriptase activity of the first mixed culture cells was determined by the effector cells and the HIV - less compared to another identical second mixed cell culture containing MN-infected CEM-ss cells. at least 80%, wherein said effector cells reduce said first and second mixtures by at least 80%. in 3-fold excess of the CEM-ss cells in combined cell culture, and the reverse transcription oxygen activity The sex was determined on day 10 post-infection, and the xenoconjugated antibody and the effector cell was added to the first mixed cell culture 18 hours after infection, and added to the first and second cell cultures. Cultures are infected with 100-1000 units of HIV-MN. ５．共有結合した第一及び第二蛋白質を含む異種複合抗体であり、前記第一蛋白 質は末梢血液のエフェクター細胞表面に存在する抗原に対する抗体を含み、前記 第二の抗体部分はＨＩＶ感染細胞表面に発現されたＨＩＶ−ＭＮあるいはＨＩＶ −ＭＮ変種のｇｐ１２０エンベロープ蛋白質のＶ３ループ配列に対する抗体を含 んでいる、ここで、エフェクター細胞及びＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を 含む第一混合細胞培養において、初期濃度１ｎｇ／ｍｌの前記異種複合抗体は、 前記第一混合培養細胞の逆転写酵素活性を、前記エフェクター細胞と前記ＨＩＶ −ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合細胞培養と比較して少な くとも８０％低下させる、ここで、前記エフェクター細胞は、前記第一、第二混 合細胞培養において前記ＣＥＭ−ｓｓ細胞の３倍過剰にあり、前記逆転写酸素活 性は、感染後１０日目に測定され、前記異種複合抗体及び前記エフェクター細胞 は、前記第一混合細胞培養に感染後１８時間して加えられ、前記第一、第二細胞 培養は１００−１０００単位のＨＩＶ−ＭＮで感染される。5. A heterologous composite antibody comprising a covalently bonded first and second protein; The protein contains antibodies against antigens present on the surface of effector cells in peripheral blood; The second antibody portion is derived from HIV-MN or HIV expressed on the surface of HIV-infected cells. - Contains an antibody against the V3 loop sequence of the gp120 envelope protein of the MN variant. Here, effector cells and HIV-MN-infected CEM-ss cells are In a first mixed cell culture comprising: The reverse transcriptase activity of the first mixed culture cells was determined by the effector cells and the HIV - less compared to another identical second mixed cell culture containing MN-infected CEM-ss cells. at least 80%, wherein said effector cells reduce said first and second mixtures by at least 80%. in 3-fold excess of the CEM-ss cells in combined cell culture, and the reverse transcription oxygen activity The sex was determined on day 10 post-infection, and the xenoconjugated antibody and the effector cell was added to the first mixed cell culture 18 hours after infection, and added to the first and second cell cultures. Cultures are infected with 100-1000 units of HIV-MN. ６．共有結合した第一及び第二蛋白質を含む異種複合抗体であり、前記第一蛋白 質は末梢血液のエフェクター細胞表面に存在する抗原に対する抗体を含み、前記 第二の抗体部分はアミノ酸配列ＧＰＧＲＡＦに対する抗体を含んでいる。6. A heterologous composite antibody comprising a covalently bonded first and second protein; The protein contains antibodies against antigens present on the surface of effector cells in peripheral blood; The second antibody portion includes an antibody against the amino acid sequence GPGRAF. ７．共有結合した第一及び第二蛋白質を含む異種複合抗体であり、前記第一蛋白 質は末梢血液のエフェクター細胞表面に存在する抗原に対する抗体を含み、前記 第二の抗体部分はアミノ酸配列ＩＸＩＧＰＧＲに対する抗体を含んでいる、ここ で、Ｘはいかなるアミノ酸でもよい。7. A heterologous composite antibody comprising a covalently bonded first and second protein; The protein contains antibodies against antigens present on the surface of effector cells in peripheral blood; The second antibody portion comprises an antibody against the amino acid sequence IXIGPGR, where and X may be any amino acid. ８．前記エフェクター細胞及びＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む第一混 合細胞培養において、初期濃度２０ｎｇ／ｍｌの異種複合抗体が、前記第一混合 培養細胞の逆転写酵素活性を、前記エフェクター細胞と前記ＨＩＶ−ＭＮ感染Ｃ ＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合細胞培養と比較して少なくとも８０％ 低下させることを特徴とする請求項６または７に記載の異種複合抗体、ここで、 前記エフェクター細胞は、前記第一、第二混合細胞培養において前記ＣＥＭ−ｓ ｓ細胞の３倍過剰にあり、前記逆転写酵素活性は、感染後１０日目に測定され、 前記異種複合抗体及び前記エフェクター細胞は、前記第一混合細胞培養に感染後 １８時間して加えられ、前記第一、第二細胞培養は１００−１０００単位のＨＩ Ｖ−ＭＮで感染される。8. A first mixture containing the effector cells and HIV-MN infected CEM-ss cells. In the combined cell culture, a heteroconjugate antibody with an initial concentration of 20 ng/ml was added to the first mixture. The reverse transcriptase activity of the cultured cells was determined by the effector cells and the HIV-MN-infected C. at least 80% compared to another identical second mixed cell culture containing EM-ss cells The heteroconjugate antibody according to claim 6 or 7, characterized in that it reduces The effector cells are in the CEM-s in the first and second mixed cell culture. in 3-fold excess of S cells, and the reverse transcriptase activity was measured 10 days post-infection; The heterologous conjugate antibody and the effector cells are added to the first mixed cell culture after infection. 18 hours later, the first and second cell cultures were treated with 100-1000 units of HI. infected with V-MN. ９．前記エフェクター細胞及びＨＩＶ−ＩＩＩＢ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む第 一混合細胞培養において、初期濃度２０ｎｇ／ｍｌの異種複合抗体が、前記第一 混合培養細胞の逆転写酵素活性を、前記エフェクター細胞と前記ＨＩＶ−ＩＩＩ Ｂ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合細胞培養と比較して少なくと も８０％低下させることを特徴とする請求項１に記載の異種複合抗体、ここで、 前記エフェクター細胞は、前記第一、第二混合細胞培養において前記ＣＥＭ−ｓ ｓ細胞の３倍過剰にあり、前記逆転写酵素活性は、感染後１０日目に測定され、 前記異種複合抗体及び前記エフェクター細胞は、前記第一混合細胞培養に感染後 １８時間して加えられ、前記第一、第二細胞培養は１００−１０００単位のＨＩ Ｖ−ＩＩＩＢで感染される。9. A cell comprising the effector cells and HIV-IIIB-infected CEM-ss cells. In one mixed cell culture, a heteroconjugate antibody at an initial concentration of 20 ng/ml was added to the first The reverse transcriptase activity of the mixed culture cells was determined by comparing the effector cells and the HIV-III. Compared to another identical second mixed cell culture containing B-infected CEM-ss cells, The heteroconjugate antibody according to claim 1, characterized in that the heteroconjugate antibody reduces by 80%, The effector cells are in the CEM-s in the first and second mixed cell culture. in 3-fold excess of S cells, and the reverse transcriptase activity was measured 10 days post-infection; The heterologous conjugate antibody and the effector cells are added to the first mixed cell culture after infection. 18 hours later, the first and second cell cultures were treated with 100-1000 units of HI. V-IIIB infection. １０．前記エフェクター細胞と、Ａｌａｂａｍａ，Ｄｕｋｅ６５８７−５、Ｄｕ ｋｅ６５８７−７，Ｄｕｋｅ７８８７−７，ＳＦ２，ＷＭＪ２，及びＩＩＩＢか らなるＨＩＶ株の一つに感染したＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む３種またはそれ以上の 混合培養細胞において、２０ｎｇ／ｍｌの異種複合抗体が、前記エフェクター細 胞及び同じ前記ＨＩＶ株に感染したＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一の混合細胞 培養の逆転写酸素活性に比べて少くとも８０％低下させることを特徴とする請求 項１に記載の異種複合抗体、ここで、前記第一、第二混合細胞培養において前記 エフェクター細胞は前記ＣＥＭ−ｓｓ細胞の３倍過剰にあり、前記逆転写酵素活 性は感染後１０日目に測定され、前記異種複合抗体及び前記エフェクター細胞は 前記第一混合細胞培養に感染後１８時間して加えられ、前記第一、第二細胞培養 は１００−１０００単位の前記ＨＩＶ株で感染される。10. The effector cells and ke6587-7, Duke7887-7, SF2, WMJ2, and IIIB? CEM-ss cells infected with one of the following HIV strains: In mixed culture cells, 20 ng/ml of the heteroconjugate antibody was added to the effector cells. cells and other identical mixed cells containing CEM-ss cells infected with the same said HIV strain. A claim characterized in that the reverse transcription oxygen activity of the culture is reduced by at least 80%. Item 1. The heterologous conjugate antibody according to item 1, wherein said first and second mixed cell cultures Effector cells are in 3-fold excess of the CEM-ss cells and have reverse transcriptase activity. The sex was determined on day 10 post-infection, and the xenoconjugated antibodies and the effector cells were added to said first mixed cell culture 18 hours after infection, said first and second cell cultures are infected with 100-1000 units of the HIV strain. １１．共有結合した第一及び第二蛋白質を含む異種複合抗体であり、前記第一蛋 白質は末梢血液のエフェクター細胞表面に存在する抗原に対する抗体を含み、前 記第二の抗体部分はアミノ酸配列ＱＡＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫＤＱＱＬＬＧＩＷＧ ＣＳＧＫＬＩＣに対する抗体を含んでいる。11. A heterologous composite antibody comprising covalently bonded first and second proteins; White matter contains antibodies against antigens present on the surface of effector cells in peripheral blood, and The second antibody portion has the amino acid sequence QARILAVERYLKDQQLLGIWG Contains antibodies against CSGKLIC. １２．前記エフェクター細胞及びＨＩＶ−ＭＮ感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む第一 混合細胞培養において、初期濃度２０ｎｇ／ｍｌの異種複合抗体が、前記第一混 合培養細胞の逆転写酵素活性を、前記エフェクター細胞と前記ＨＩＶ−ＭＮ感染 ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合細胞培養と比較して少なくとも８０ ％低下させることを特徴とする請求項１１に記載の異種複合抗体、ここで、前記 エフェクター細胞は、前記第一、第二混合細胞培養において前記ＣＥＭ−ｓｓ細 胞の３倍過剰にあり、前記逆転写酸素活性は、感染後１０日目に測定され、前記 異種複合抗体及び前記エフェクター細胞は、前記第一混合細胞培養に感染後１８ 時間して加えられ、前記第一、第二細胞培養は１００−１０００単位のＨＩＶ− ＭＮで感染される。12. A first cell comprising the effector cells and HIV-MN infected CEM-ss cells. In a mixed cell culture, a heteroconjugate antibody at an initial concentration of 20 ng/ml was added to the first mixture. The reverse transcriptase activity of the co-cultured cells was determined by the effector cells and the HIV-MN infection. at least 80 compared to another identical second mixed cell culture containing CEM-ss cells. 12. The heteroconjugate antibody according to claim 11, wherein the heteroconjugate antibody is characterized in that the The effector cells are the CEM-ss cells in the first and second mixed cell cultures. The reverse transcription oxygen activity was measured on day 10 post-infection, and the reverse transcription oxygen activity was in 3-fold excess of the The heterologous conjugate antibody and the effector cells were added to the first mixed cell culture 18 days after infection. The first and second cell cultures contain 100-1000 units of HIV- Infected by MN. １３．前記エフェクター細胞が細胞毒性Ｔリンパ球、好中球、単球／マクロファ ージ、及び大型顆粒リンパ球からなるグループから選択されることを特徴とする 請求項１または請求項１１に記載の異種複合抗体。13. The effector cells include cytotoxic T lymphocytes, neutrophils, monocytes/macrophages. large granular lymphocytes, and large granular lymphocytes. The heterologous composite antibody according to claim 1 or claim 11. １４．前記エフェクター細胞表面に存在する抗原がＣＤ３であることを特徴とす る請求項１または請求項１１に記載の異種複合抗体。14. The antigen present on the surface of the effector cell is CD3. The heterologous composite antibody according to claim 1 or claim 11. １５．前記エフェクター細胞及びＨＩＶ−ＭＮ以外のＨＩＶ株感染ＣＥＭ−ｓｓ 細胞を含む第一混合細胞培養において、初期濃度２００ｎｇ／ｍｌの異種複合抗 体が、前記第一混合培養細胞の逆転写酵素活性を、前記エフェクター細胞と前記 ＨＩＶ−ＭＮ以外のＨＩＶ株感染ＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む他の同一の第二混合細 胞培養と比較して少なくとも５０％低下させることを特徴とする請求項６または ７に記載の累積複合抗体、ここで、前記エフェクター細胞は、前記第一、第二混 合細胞培養において前記ＣＥＭ−ｓｓ細胞の３倍過剰にあり、前記逆転写酵素活 性は、感染後１０日目に測定され、前記異種複合抗体及び前記エフェクター細胞 は、前記第一混合細胞培養に感染後１８時間して加えられ、前記第一、第二細胞 培養は１００−１０００単位のＨＩＶ−ＭＮ以外のＨＩＶ株で感染される。15. CEM-ss infected with the effector cells and HIV strains other than HIV-MN In a first mixed cell culture containing cells, an initial concentration of 200 ng/ml of heterogeneous conjugate anti- The body increases the reverse transcriptase activity of the first mixed cultured cells with the effector cells and the first mixed cultured cells. Another identical second mixed cell containing CEM-ss cells infected with an HIV strain other than HIV-MN or claim 6, characterized in that it is reduced by at least 50% compared to cell culture. 7. The cumulative complex antibody according to 7, wherein the effector cell is the first and second mixed antibody. In combined cell culture, the reverse transcriptase activity is in 3-fold excess of the CEM-ss cells. The sex was determined on day 10 post-infection, and the xenoconjugated antibody and the effector cell was added to the first mixed cell culture 18 hours after infection, and added to the first and second cell cultures. Cultures are infected with 100-1000 units of an HIV strain other than HIV-MN. １６．異種複合抗体がＨＩＶ−ＭＮ以外のＨＩＶ株のＶ３ループに結合すること を特徴とする請求項１に記載の異種複合抗体。16. Binding of the heterologous conjugate antibody to the V3 loop of HIV strains other than HIV-MN The heterologous composite antibody according to claim 1, characterized by: １７．薬理学的に効果的な量の請求項１または請求項１１に記載の異種複合抗体 を含む薬理学的に許容できる混成物。17. A pharmacologically effective amount of the heteroconjugate antibody according to claim 1 or claim 11. A pharmacologically acceptable mixture containing. １８．（ａ）細胞表面抗原を発現するエフェクター細胞と、（ｂ）請求項１また は請求項１１に記載の異種複合抗体と、を含むＨＩＶを標的とするエフェクター 細胞。18. (a) an effector cell expressing a cell surface antigen; and (b) claim 1 or is an effector targeting HIV, comprising the heterologous conjugate antibody according to claim 11. cell.
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