JPH06505637A - 高分子量ポリオールによる乳酸脱水素酵素イソ酵素ｌｄ１の選択的安定化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 高分子量ポリオールによる乳酸脱水 素酵素イソ酵素ＬＤＩの選択的安定化 技術分野 本発明は乳酸脱水素酵素イソ酵素（ＬＤＩ）の診断アッセイに関し、そしてより 詳細には、イオン性両親媒性剤（ｉｏｎｉｃ　ａｌｐｈｉｐｈｉｌｅ）を用いて 乳酸脱水素酵素イソ酵素ＬＤ２、ＬＤ３、ＬＤ４およびＬＤ５を選択的に不活化 するＬＤＩアッセイに高分子量ポリエチレングリコールを用いるＬＤｌの診断ア ッセイに関する。

背景技術 乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）は２つのサブユニット、ＨおよびＭの４量体酵素であ り、それらが合体して活性ＬＤｌ’ｌ酵素を形成する。５種類のイソ酵素、ＬＤ ｌ、ＬＤ２、ＬＤ３、ＬＤ４およびＬＤ５がこれら２つのサブユニットの様々な 順列を代表している。これらＬＤＩＩイソ酵素の相対レベルおよび患者血清中の 総ＬＤｆｌが組織傷害の診断上重要なことがある。例えば心筋梗塞や各種肝障害 に起因する可能性のある傷害である。

１９８１年２月１０日に５ａｎｆｏｒｄに付与された米国特許４、２５０．２５ ５は、イソ酵素活性に対し識別効果をもつ所定濃度の両親媒性剤の存在下にイソ 酵素の活性を測定しそして検体中に存在するイソ酵素の量を測定することによる イソ酵素活性の測定方法を開示している。特にこの特許は、検体中の総ＬＤＨを 測定する第一アッセイを行い、関心のあるイソ酵素を特異的に阻害する所定濃度 のイオン両親媒性剤の存在下に第二アッセイを行い、そして第一および第ニアッ セイ間の差異を用いてイソ酵素の活性を測定することによる、ＬＤｌなどＬＤＨ イソ酵素の測定方法を開示している。

この特許は、アッセイの一成分としてポリマーポリオールを用いて、ＬＤ２、Ｌ Ｄ３、ＬＤ４およびＬＤ５の選択的不活化を妨害することなくＬＤ１回収を向上 させることは開示または示唆していない。

Ｄｉ　５ａｂａｔｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏ ｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２３９　：　４３８−４４３（１９６４ ）は、ドデシル硫酸ナトリウムを用いてニワトリ心臓およびウシ心臓由来の乳酸 脱水素酵素をサブユニットの構造に著しい変化を伴うことなくサブユニットに解 離させることを開示している。

５ａｎｆｏｒｄ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２０　：　３ ２０７−３２１４（１９８１）は、ＬＤＨイソ酵素の選択的不活化にイオン性界 面活性剤例えば陰イオン性界面活性剤ドデシル硫酸ナトリウムを用いることを開 示している。

１９９０年２月８日に公開された５ｈｉｈａｂｉらのＰＣＴ国際特許出願公開番 号１０９０１０１０６７は、水素結合を破壊することにより作用するタンパク質 変性剤とチオシアネートイオンとの反応生成物より成る、中性またはアルカリ性 環境におけるＬＤ２〜ＬＤ５の不活化用試薬を開示している。

Ａｂｂｏｔｔらに付与され１９８８年１１月８日に公開された欧州特許２９２８ ３８は、カオトロピック剤例えば過塩素酸ナトリウムの存在下における生物学的 液体とＬＤ■試薬の反応混合物を調製しそしてＬＤＩイソ酵素の活性を測定する ことにより、生物学的液体のＬＤＩイソ酵素活性の測定方法を開示している。そ の試薬は緩衝剤、ラクテートまたはピルベートおよび色原体を含むことができる 。

タンパク質の分別沈殿およびタンパク質結晶化にポリエチレングリコール（ＰＥ Ｇ）を用いることのメカニズムは知られている。（Ａｔｈａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｔ ｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２ ５６：　１２１０８−１２１１７（１９８１）、　Ｌｅｅｅｔ　ａｌ、、Ｔｈｅ 　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２５６ 　：６２５−６３１（１９８１）、＾ｒａｋａｗａｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２４：６７５６−６７６２（１９８５））。さらに、Ｐ ＥＧの存在がタンパク質の熱安定性に効果がある旨示されている（Ｌｅｅ　ｅｔ 　ａｌ、。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２６　：　７８１３−７８１９（１９８７））。

しかしながら、これらの文献の一つとして、ＬＤ２〜ＬＤ５イソ酵素の選択的不 活化にイオン性両親媒性剤を用いるアッセイにおけるＬＤ１回収の向上にポリエ チレングリコールが有効であることを示唆するものはない。

ＬＤ２〜ＬＤ５イソ酵素を選択的に阻害するためにイオン性両親媒性剤例えばド デシル硫酸リチウムを、そしてその測定に先立ちＬＤＩを安定化するために高分 子量ポリオールを用いた自動化システムにおけるＬＤＩイソ酵素の直接的診断ア ッセイが必要とされている。

本発明の方法は、次の段階、すなわち （＾）少くとも１０００の分子量および少くとも２個の遊離水酸基を有する高分 子量ポリマーポリオールを乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を含有する生物起源の検体 に添加する、（Ｂ）所定量のイオン性両親媒性剤を添加して検体中のＬＤ２、Ｌ Ｄ３、ＬＤ４およびＬＤＳを不活化させる、そして（Ｃ）　３４０　ｎ−におけ る検体の吸光度変化を測定することにより乳酸脱水素酵素イソ酵素ＬＤＩを直接 測定する段階より成る前記検体中のＬＤＩの直接測定のためのもの本発明の改良 アッセイは、高分子量重合体ポリオール例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ ）は、生物起源の検体中に存在すると、ＬＤＩイソ酵素を安定化して、イオン性 両親媒性剤によるＬＤ２、ＬＤ３、ＬＤ４およびＬＤ５イソ酵素の選択的不活化 または阻害を妨害することなくＬＤＩイソ酵素を次いで測定することを可能にす る、という驚くべき、そして予期せざる知見に基づいている。すなわち、本発明 の方法は、自動化システム例えばａＣａ■ディスクリート・クリニカル・アナラ イザ（ｄｉｓｃｒｅｔｅ　ｃｌｉｎｉｃａｌａｎａｌｉｚｅｒ）　（Ｅ、１．　 ｄｕ　Ｐａｎｔ　ｄｅ　Ｎｅｍｏｕｒｓ　ａｎｄ　Ｃｏ、の登録商標名）で有用 なＬＤＩの高感度の診断アッセイを可能にするものである。

乳酸脱水素酵素イソ酵素ＬＤ２〜ＬＤ５の活性を選択的に阻害できるいかなる両 親媒性剤も本発明のアッセイに用いることができる。両親媒性剤は親水性部分と 疎水性部分とを有するイオン性化合物であって、界面活性剤などの化合物を包含 する。本発明に有用なイオン性両親媒性剤の例には例えばドデシル硫酸ナトリウ ム、ドデシル硫酸リチウム、ドデシル硫酸ナトリウム、塩酸ドデシルアミンおよ びセチルピリジニウムブロマイドなどが包含される。ドデシル硫酸リチウムが好 ましい。両親媒性剤は、それがＬＤ２〜ＬＤ５イソ酵素の活性に差別的に影響し く該活性を特異的に阻害し）、以ってＬＤｌの直接測定を可能にするように選択 される。

両親媒性剤濃度は広い濃度範囲に及ぶ一連の溶液を調製し、そしてＬＤ２〜ＬＤ ５イソ酵素の最大不活化が起こる濃度を測定することにより容易に決めることが できる。

高分子量ポリオールとは、少くとも２個の水酸基および少くとも１０００の分子 量を有するいかなるポリマー物質をも意味する。本発明に用いるのに適したポリ オールの例は、多糖類、ポリエチレングリコール類およびポリプロピレングリコ ール類である。

分子量８０００のポリエチレングリコールが好ましい。これらポリオールの濃度 は、広い濃度範囲に及ぶ一連の溶液を調製し、そしてＬＤＩの活性測定値がポリ オール濃度の増加に伴ってもはや増加しなくなる一方その他のＬＤイソ酵素の活 性が最小レベルに保たれる濃度を測定することにより容易に決めることができる 。

本発明の好ましい一態様であるＬＤＩアッセイにおいては、ＬＤＩは３４０ｎｍ の吸光度変化の測定により測定され、またＮＡＤＨ＋ピルベート＋Ｈ“を生じる （ＬＤ２〜ＬＤ５が不活化されたＬＤＨの溶液からの）Ｌｌｌｌと乳酸ナトリウ ムおよびＮＡＤ＋との反応に基づいている。

ドデシル硫酸リチウムはＬＤ２〜ＬＤ５イソ酵素を不活化させるために乳酸脱水 素酵素（ＬＤｌｌ）の溶液に添加される。

残るＬＤＩは乳酸ナトリウムのピルベートへの酸化を触媒すると同時にニコチン アミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）をＮＡＤ旧こ還元する。３４０ｎ−に おける吸光度変化はＬＤＩ活性に直接比例する。その反応は約８．５のｐｎで起 きる。

実施例１ ドデシル硫酸ナトリウムを用いたＬＤｉアブセイにおけるＰＥＧ　８０００によ るＬＤｌの安定化ＬＤＩの安定化および測定に対する高分子量ポリエチレングリ コ−・ルの効果を測定するために一連の反応混合物を調製した。以下の原液を調 製した：　ＮＡＤ　（１０ｇ＋９／　１００ｕｌ）　、乳酸ナトリウム（４，４ Ｍ）　、ＮＡＤと塩化カリウム（ｌｆｂｇ／　１００＋＋１ＮＡＤと０．４す／ １００ｔ／　ＫＣＪ）　、ＮＡＤとポリエチレングリコール（１０層ｇ／１００ β／　ＮＡＤと５．２６薦ｇ／１００＋＋４’ポリエチレングリコール、分子量 ８０００）、ＮＡＤとマンニｈ−ル（１０ｍｇ／　１０ｈｉ’　ＮＡＤと５．２ ６＋ｗｑ／　１００＊Ｚマンニトール）、ｔｒｉｓ緩衝液中のドデシル硫酸リチ ウム（ＬＤＳ）　（０、ＩＭｔｒｉｓ、　ｐＨ８，５中の０．７５Ｍ　ＬＤＳ） 　。それら原液を４．８０ｔ／のｔｒｉｓｌｌ衝液（０，５Ｍ　ｔｒｉｓ、　３ ７℃でｐＨ８，５５）に希釈して用いて５種類のサンプル反応混合物を調製した ：サンプル１　：　５０ａｌの乳酸ナトリウム１００ｍ１のＮＡＤ ６５ａｌのドデシル硫酸リチウム サンプル２　：　５０ｘｌの乳酸ナトリウム１００μｌのＮＡＤと塩化カリウム ６５ｔ／のドデシル硫酸リチウム サンプル３　：　５０ｙｌの乳酸ナトリウム１００＊ｊのＮＡＤとポリエチレン グリコール（分子量８０００） ６５８１のドデシル硫酸リチウム サンプル４　：　５ｈｌの乳酸ナトリウム１０ｈ／のＮＡＤとマンニトール ６５μｌのドデシル硫酸リチウム サンプル５　：　５ｈ１の乳酸ナトリウム３２ＩのＮＡＤとＫＣｌ ３２ａｌのＭＡＤとポリエチレングリコール（分子量８０００） ３２μｌのＮＡＤとマンニトール ６５ｕｌのドデシル硫酸リチウム それら反応混合物はＬＤＳと乳酸ナトリウムを除く上で列挙したすべての試薬を 混合することにより調製した。

３００　Ｕ　／１Ｏ）ＬＤ　１を含有する２００＊／のＬＤｌの標準溶液を各反 応混合物に添加した。次にＬＤＳと乳酸ナトリウムを添加し、そして各サンプル 中のＬＤＩの活性を３回ずつ測定した。それらアッセイはａＣａ■ディスクリー ト・クリニカル・アナライザを用いて行ったところ、反応混合物に添加されたＬ ＤＩ溶液の濃度を反映するように校正された結果（各々、３回の反応の平均）を 表１に示す：これらの結果は、ポリオール含有サンプルであるサンプル３および ５においてはイソ酵素を不活化する両親媒性剤であるＬＤＳがＬＤｌは不活化し なかった、換言すれば該ポリオールがＣＤＩを安定化してＬＤＩイソ酵素の実質 的に完全な測定（回収）を可能にしたことを示している。

実施例２ ＰＥＧ　８０００の存在下におけるドデシル硫酸リチウムによるＣＤ２の選択的 不活化 ＣＤ２の、そしてパラレルな条件下でのしＤｌの不活化に対する高分子量ポリエ チレングリコールの効果を測定するために一連の反応混合物を調製した。以下の 原液を調製した：　ＮＡＤ（１０ｍ＋９／　１０ｈり　、乳酸ナトリウム（４， ４Ｍ）、ポリエチレングリコール（分子量８０００．３０１／１００ｔ／）、ト リス緩衝液中のドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）　（０，１Ｍｔｒｉｓ、　ｐＨ ８，５中の０．７５Ｍ　ＬＤＳ）　。そノＰＥＧ原液を下記濃度へとさらに希釈 した。それら原液を４．８０ｍ１のｔｒｉｓ緩衝液（０，５Ｍ　ｔｒｉｓ、　３ ７℃でｐｆ＋８．５５）に希釈して用いて５種類のサンプル反応混合物を調製し た： サンプル１：５０＋＋／の乳酸ナトリウム５０ａｌのＮＡＤと５０ａｇの３０１ １９／　１０ｈｔ’ポリエチレングリコール（分子量８０００）溶液６５１１の ドデシル硫酸リチウム サンプル２：５０βｌの乳酸ナトリウム５ｈ／のＮＡＤと５０譚ｌの２０富、／ 　１００ｊｌポリエチレングリコール（分子量８０００） ６５ＩＩ／のドデシル硫酸リチウム サンプル３　：　５０ｘｌの乳酸ナトリウム５０ａｌのＮＡＤと５０ｍ１の１０ ｍｇ／　１００１１ポリエチレングリコール（分子量８０００） ６５ｘｌのドデシル硫酸リチウム サンプル４：５０μｌの乳酸ナトリウム５ｈｌのＮＡＤと５０ｓｌの３諺ｇ／１ ０ｈ／ポリエチレングリコール（分子量８０００） ６５ａｌのドデシル硫酸リチウム サンプル５　：５ｈ／の乳酸ナトリウム５ｈ／のＮＡＤと５０１の脱イオン水 ６５＋＋ｊのドデシル硫酸リチウム それら反応混合物はＬＤＳと乳酸ナトリウムを除（上で列挙したすべての試薬を 混合することにより調製した。

それら混合物の各々を二分した。これら二分されたちのの各々にそれぞれ、３０ ０Ｕ＃のＬＤＩを含有する２００μｌのＬＤＩの標準溶液および２５０Ｕ＃のＣ Ｄ２を含有する２００ＩＩ／のＣＤ２の標準溶液を添加した。次にＬＤＳと乳酸 ナトリウムをそれら二分されたものの各々に添加し、そして各サンプル中のそれ ぞれＬＤｌおよびＣＤ２の活性を３回ずつ測定した。それらアッセイはａＣａ　 ＠ディスクリート・クリニカル・アナライザを用いて行ったところ、それぞれ反 応混合物に添加されたＬＤＩ溶液およびＣＤ２溶液の濃度を反映するように校正 された結果（各々３回の反応の平均）を表２に示す： 表２の結果は、ポリエチレングリコールがＬＤＩを安定化した（必要な正確な最 小ＰＥＧ濃度は反応環境に依存する）が、ＬＤＳによるＣＤ２の選択的で、かつ 実質的に完全な不活化は妨害しなかったことを示している。

国際調査報告

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. １．（Ａ）少くとも１０００の分子量および少くとも２個の遊離水酸基を有する 高分子量ポリマーポリオールを乳酸脱水素酸素（ＬＤＨ）を含有する生物起源の 検体に添加する段階、 （Ｂ）所定量のイオン性両親媒性剤を添加して検体中のＬＤ２、ＬＤ３、ＬＤ４ およびＬＤ５を不活化させる段階、および （Ｃ）３４０ｎｍにおける検体の吸光度変化を測定することにより乳酸脱水素酸 素イソ酸素ＬＤ１を直接測定する段階 より成る前記検体中のＬＤ１の直接測定方法。
2. ２．ポリオールがポリエチレングリコールである請求項１記載の方法。
3. ３．両親媒性剤がドデシル硫酸リチウムである請求項１記載の方法。
4. ４．（Ａ）分子量８０００のポリエチレングリコールを乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ ）を含有する生物起源の検体に添加する段階、 （Ｂ）所定量のドデシル硫酸リチウムを添加して検体中のＬＤ２、ＬＤ３、ＬＤ ４およびＬＤ５を不活化させる段階、および （Ｃ）３４０ｎｍにおける検体の吸光度変化を測定することにより乳酸脱水素酵 素イソ酸素ＬＤ１を直接測定する段階 より成る前記検体中のＬＤ１の直接測定方法。