JPH06505251A - コチニンのイムノアッセイのためのハプテン、トレーサー、免疫原および抗体 - Google Patents

コチニンのイムノアッセイのためのハプテン、トレーサー、免疫原および抗体

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JPH06505251A JP4505358A JP50535892A JPH06505251A JP H06505251 A JPH06505251 A JP H06505251A JP 4505358 A JP4505358 A JP 4505358A JP 50535892 A JP50535892 A JP 50535892A JP H06505251 A JPH06505251 A JP H06505251A
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ヒュー、シャン−ユン
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    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 コチニンのイムノアッセイのためのハプテン、トレーサー、免疫原および抗体発 明の背景 発明の技術分野 本発明は、試料、とりわけ尿、血清または血漿などの水性流体生物学的試料中の コチニンの存在および／または量を決定するためのイムノアッセイ、とりわけ蛍 光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）を行うための試薬および方法、該試薬の製造 法、および該試薬に基づくイムノアッセイに関する。さらに詳しくは、本発明は 、新規ハブテン、該ハプテンから調製した免疫原、該ハプテンに対して産生させ た抗体および本発明の試薬および方法を利用したイムノアッセイに関する。
発明の背景 喫煙した紙巻きタバコの本数と喫煙に関連する疾患の発症リスクとの間に用量一 応答関係が存在すると思われている。保険会社、外科医および法科学者は、喫煙 者と非喫煙者を区別する仕方に興味を示している。幾つかの従前の方法は、生物 学的流体中のニコチンおよびコチニンにニコチンの代謝物）の測定を含んでいる 。一般に、尿コチニンの測定が好ましいが、それは（１）ヒト生体において、コ チニンは本来的にニコチンの代謝のみに由来し、（２）尿は血液に比べて回収が 便利であり、（３）コチニンの半減期が約７〜４０時間であるのに対して、ニコ チンの半減期は約３０分未満であり、（４）コチニンの排泄はニコチンはどには 尿のｐＨに依存しないからである。
本発明は、生物学的流体中のコチニンの存在および／または量を決定するのに特 に適した試薬および技術を用いた、イムノアッセイ、とりわけ競合イムノアッセ イに関する。本発明は、なによりも、ニコチンの他の代謝物の妨害を最小にしな がらコチニンの量を決定することを可能とする利点を提供できる。本発明は、そ の一部を新規な実質的に光学的に純粋なハプテンに基づいており、該７％ブテン はイムノアッセイに使用するのに適した免疫原および／またはトレーサーの調製 に利用することができる。
背景技術 ランゴ：／　（Ｌ　ａｎｇｏｎｅ）ら（Ｂｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　３２　（ ２４）　、　５０２５−５０３０頁（１９７３））は、それぞれニコチンおよび コチニンのためのラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）におけるハブテンとしてラセ ミ体の３゛〜ヒドロキシメチルニコチンおよび４゛−カルボキシエチルンの使用 を記載しでいる。しかしながら、これらは、これらハブテンの光学活性の欠如の ため、およびコヂニンハブテンの場合はおそらく連結基の位置のためにイムノア ッセイにとって主要な欠点を有し。
ている。ラセミ体ハブテンからは、最終的に、光学対車体の識別が不能でしばし ば高レベルの妨害となる抗血清が得られる。
日本特許出願（公開番号６１−１２６０８３および６ｉ−１２６０８４）は４− アミノニチンおよび４−アミンニコチンの調製に関し、これら化合物のイムノア ッセイにおけるハブテンとしての可能な利用に言及している。これら公報は、こ れら公報に記載した手順に従って調製する間に光学純度が維持されることを示唆 しているが、その合成手順は厄介である。加えて、これら誘導体は４−アミノピ リジンであり、イムノアッセイのための真のハブテンとしての効力は、アミノ基 における核性の乏しさおよびそれに付随してその後のタンパク質結合のための「 連結アーム」の付着の困難さのために著しく制限されると思われる。
Ｒｅｓ、　Ｃｏｍ＋ｉｕｎ、　Ｃｈｅｔ　Ｐａｔｈｏｌ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ 、、　４１　（３）　、３９３〜４０４頁には６−アミノニコチンの使用が記載 されている。しかしながら、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１２　（２４）　 、５０２５〜５０３０頁（１９７３）（上記）に記載した仕事と同様、この材料 はラセミ体である。
日本特許番号５３／３１２１３は、ジアゾニウム結合によりタンパク質に結合し たハブテンとしての４−１５−１または６−バラーアミツベンズアミドニコチン 誘導体の使用に関する。しかしながら、そのような材料を調製するために用いる 親のアミンニコチンはラセミ体である。また、そのような堅固でヘテロ原子含有 連結アームを有する化合物に対して産生じた抗血清は、「架橋抗体Ｊを生成する 可能性が高く、それゆえ一般にイムノアッセイに由来する特異性が低くなる。
発明の要約 本発明は、コチニンのイムノアッセイに有用な実質的に光学的に純粋なハブテン を提供する。コチニンはＮ−メチル−２−（３−ピリジル）−５−ピロリドンま たは１−メチル−５−（３−ピリジニル）−２−ピロリジノンとしても知られ５ 、生体の流体（たとえば、尿）中にニコチンの代謝産物として左旋性（１または −）エナシオマー形にて存在する。本発明のハブテンは構造式：に対応する。式 （Ｉ）において、Ｘは第２−１４−１５−または６−位にてピリジル環に共有結 合的に結合した直鎖または分岐鎖、飽和または不飽和の２価ラジカルである。こ の２価ラジカル、Ｘは１〜１０の炭素原子を有しており、該２価ラジカルの鎖は 任意に８１０およびＮＺ（式中、ＺはＣ１〜ＣＳアルキル基を表すりよりなる群 から選ばれた１または２のへテロ原子を含有していてよい。式（Ｉ）においてｎ ＝１またはＯ，Ｑは−ＣＯＯＨ，−ＮＨｔ　（ただしｎは０に等しくない）　、 −Ｃ（０）ＮＨＮＨｓ、−０（ＣＯ）ＣＬ−ＣＨＯ，−ＮＣ３または−ＮＧＯか ら選ばれた官能基である。、ｗＲ単のため、とりわけ下記実施例において、式（ Ｉ）に対応する化合物はコチニンの誘導体として命名することができる。それゆ え、たとえば、ピリジル環の６位に２−カルボキシエチル基の結合した本発明の 化合物（実施例１で調製）は（ｓ）−（−）−６−（２−カルボキシエチル）コ チニンと命名され、左旋性エナシオマーである。
本発明はまた、本発明のハブテンに由来する免疫原をも提供する。
本発明はまた、本発明のハブテンに由来する免疫原に応答して産生させた抗体を も提供する。
本発明はまた、本発明の実質的に光学的に純粋な化合物に由来する蛍光トレーサ ーをも提供し、該トレーサーはコチニンのイムノアッセイに有用である。実質的 に光学的に純粋な化合物は、式（１）で定義されるハブテンに対応する。
本発明はまた、生物学的試料中のコチニンの存在または量を決定するための改良 イムノアッセイをも提供する。この改良イムノアッセイは、本発明の免疫原に応 答して産生させた抗体に試料を接触させる工程を含む。さらに、本発明は、生物 学的試料中のコチニンの存在または量を決定するための蛍光偏光イムノアッセイ （ＦＰＩＡ）をも提供する。このＦＰＩＡは、本発明の免疫原に応答して産生さ せた抗体に試料を接触させる工程、および／または本発明の蛍光トレーサーに試 料を接触させる工程を含む。
発明の詳細な記載 本発明のハブテンは実質的に光学的に純粋であり、コチニンにニコチンの代謝産 物）のイムノアッセイにとりわけ有用である。本明細書において「実質的に光学 的に純粋な」とは、ハブテンの右旋性（ｄまたは＋）エナシオマーと左旋性（１ または−）エナシオマーとの重量合計に基づいて２０重量％以下、好ましくは１ ０重１％以下、最も好ましくは５重量％以下の右旋性エナシオマーを生成物ハブ テンが含有することを意味する。本発明のハブテンは式（１）：に対応する。式 （１）において、Ｘは、構造式（１）の左側に示すピリジル環に共有結合的に結 合した２価ラジカルを表す。この２価うジカルＸは直鎮または分岐鎖ラジカルで あり、直鎖ラジカルが好ましい。この２価うジカルＸは飽和またはエチレン系不 飽和結合を含む。この２価うジカルＸは、式（Ｉ）に示すピリジル環の第２−１ ４−１５−または６−位にて該ピリジル環に共有結合的に結合している。好まし くは、この２価うジカルＸは、第４−１５−または６−位にてピリジル環に結合 する。本発明のハブテンから調製した免疫原から産生させた抗血清を利用して行 う蛍光偏光イムノアッセイは、コチニンに対して特に高い特異性を与え、ニコチ ンの他の代謝産物に対して特に低い交差反応性を与えることがわかった。
式（１）において、２価うジカルＸは１〜１０の炭素原子（分岐鎖構造の分岐か らのいずれの炭素原子をも含む）を有する。任意に、この２価ラジカルの鎖また は骨格（分岐から識別される）は、Ｓ１０およびＮ（ただし、Ｎが含まれる場合 はＮＺ（式中、ＺはＣ７〜Ｃ３アルキル基を表す）の形態でなければならない） よりなる群から選ばれた１または２のへテロ原子を含有していてよい。本発明の 幾つかの好ましい態様において、この２価うジカルＸはＣ２〜ＣＳアルキレン基 であり、典型的にＸは−ＣＨ，ＣＨ，−である。
構造式（ＤにおいてＸの下付き文字ｎは１または０のいずれかに等しく、ただし Ｑが−ＮＨＩである場合はｎ＝１である。もちろん、ｎ＝０の場合は残基Ｑはピ リジル環に該ピリジル環の第２−１４−１５−または６−位、好ましくは第４− １５−または６−位、典型的には第４−または６−位にて直接結合する。
式（１）において、Ｑは、たとえば、抗原性付与担体からの共反応官能基との直 接反応によりまたは中間工程を経た反応により、たとえば抗原性付与残基を該ハ ブテンに結合させるのに利用するのに適した官能基を表す。Ｑに適した官能基の 例としては、−ＣＯＯＨ，−ＮＨ，、−Ｃ（０）ＮＨＮＨ！、−０（Ｃｏ）ＣＬ 　−ＣＨｏ、−ＮＣＳおよび−ＮＣＯが挙げられる。本発明の好ましい態様にお いて、Ｑはカルボキシルであり、その調製はたとえば下記実施例において説明し である。
本発明のハブテンは以下のようにして調製することができる。一般に、本発明の 光学活性な２−１４−および６−１１換コチニン誘導体（ハブテン）は、適当に 官能化した有機金属試薬を適当なハロゲン化アシル誘導体の存在下でコチニンと 反応させることにより調製する。かくして得られたＮ−アシルジヒドロピリジン 誘導体を適当な酸化剤と反応させると、Ｎ−アシル基が除去されると同時にコチ ニンのピリジン環残基の再芳香族化が起こる。このように、別の官能基を含有す るアルキレン基のコチニンの２−１４−および６−位への全結合が、実質的に光 学活性のハプテン性コチニン誘導体の生成のための中心となる。かくして上記で 得られる生成物を、当業者に一般に知られた方法により操作して本明細書に記載 するハブテン性材料とする。
上記ハロゲン化アシル誘導体は、アセチルクロライド、ピバロイルクロライドな どの脂肪族酸のクロライドまたはブロマイドであってよい。芳香族酸に由来する 酸ハライドはより劣った有用性を示す。別法として、芳香族アルコールおよび脂 肪族アルコールのクロロホルメート誘導体を用いることができ、脂肪族アルコー ルのクロロホルメート誘導体が好ましい。
本発明において利用する有機金属化合物は当業者により容易に調製することがで き、実施例に記載するように、金属中心から遠位に別の官能基としてエステル、 ニトリル、エーテルまたはオレフィン基を有する。中間体Ｎ−アシルジヒドロコ チニン誘導体の官能化コチニン誘導体への変換に有用な酸化剤としては、当業者 に一般に知られた硫黄、キノン誘導体、鉄の銀塩および他の無機塩などが挙げら れる。中間体Ｎ−アシルジヒドロコチニン誘導体の酸化に対してとりわけ有用な のは、硝酸セリウム（ＩＶ）アンモニウムである。この形態のセリウム（ＩＶ） は−例として挙げたまでで、硫酸セリウム（ＩＶ）アンモニウムなどの他の塩も 用いることができる。
本発明の５−置換コチニン誘導体は、ハロゲン化アシル誘導体の存在下でコチニ ンの水素化物還元により得られたＮ−アシルジヒドロピリジンと適当なホルミル 化試薬との反応により調製する。ホルミル化に適した試薬は当業者に知られてお り、ジメチルホルムアミド／オキシ塩化リンおよびジメチルホルムアミド／ホス ゲンが挙げられるがこれらに限られるものではない。かくして得られた５−ホル ミルジヒドロコチニン誘導体を上記試薬によりコチニン誘導体に酸化する。かく して得られた生成物を当業者に知られた方法および技術によりハプテン性コチニ ン誘導体に処理する。
本明細書に記載するハプテン性材料の抗原性付与材料への共有結合的連結は当該 技術分野でよく知られた方法により行うことができ、その選択はコチニン誘導体 中の連結官能基の性質および連結のために選択した担体によりなされるであろう 。
本発明の免疫原は、本発明の実質的に光学的に純粋なハブテンより得られる。
本発明の免疫原はコチニンのイムノアッセイにおいて特に有用である。この免疫 原は、式： （式中、Ｘは上記式（１）に対応するハブテンの定義と同じであり、ｎ−１また は０、好ましくは１である）に対応する。構造式（ｒＶ）において、Ｑｏは−Ｎ ＨＣ（０）−１−０Ｃ（０）ＮＨ−１−Ｎ）１＝ＣＨ−１−ＮＨ１＝ＣＨ−１− ＮＨＣＨ！−１−ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ−１およびＮＨＣ（０）ＮＨ−１−ＮＨＮＨ Ｃ（０）−から選ばれた２価ラジカルである（ただし、Ｑｏが一層Ｃ（０）ＮＨ −１−ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ−または−ＮＨＣ（０）ＮＨ−である場合はｎ＝１であ る）。本明細書および請求の範囲を通じて、２つの他の構造を一緒に連結する２ 価残基を明記する場合（たとえばＡおよびＸ、を連結するＱｏとして−ＮＨＣ（ ０）−）　、該２価残基の左側部分は該構造に左側にて結合し、右側部分は該構 造に右側にて結合する（すなわち、この例ではＡ−ＮＨＣ（０）−Ｘ、）。
式（ｒＶ）において、Ａは抗原性付与担体残基である。ｎ＝１の場合、Ｑｏは抗 原性付与担体残基Ａを２価うジカルＸに連結する。ｎ＝０の場合、Ｑｏは抗原性 付与担体残基Ａを該ハブテンのピリジル環に直接、２−１４−１５−または６− 位にて、好ましくは４−１５−または６−位にて、典型的に４−または６−位に て連結する。抗原性付与担体残基Ａは、広範囲の抗原性付与担体残基から選択す ることができる。式（■）から理解できるように、残基Ａは、式（ｒＶ）の免疫 原のハプテン部分にＱｏを介して結合した抗原性付与担体の残基を表す。
一般に、抗原性付与担体残基Ａは、式（Ｉ）に対応するハブテンの官能基Ｑを、 一般に知られた調製法により、たとえば天然または合成のポリ（アミノ酸）など の抗原性付与担体の共反応性官能基と反応させることにより提供される。一般に 、本発明の好ましい態様において、天然のポリ（アミノ酸）、ウシ血清アルブミ ン（ＢＳＡ）を抗原性付与担体として利用して構造式（ｒＶ）において残基Ａを 提供するが、たとえばアルブミンおよび血清タンパク質（グロブリンなど）、リ ポタンパク質、眼レンズタンパク質などを含む他のタンパク質担体を利用するこ ともできることを理解すべきである。幾つかの抗原性付与タンパク質担体の例示 としては、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、卵アルブ ミン、ウシガンマグロブリン、チロキシン結合グロブリンなどが挙げられる。別 法として、ポリリシンなどの合成ポリ（アミノ酸）を利用することができる。
たとえば、下記実施例において一層詳細に説明するように、式（１）のＱがカル ボキシルであるハブテンを、好ましくはアミド結合を生成するのに通常用いる条 件下（該条件は当業者によく知られている）、カップリング剤、たとえばカルボ ジイミド、とりわけ１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジ イミド（ＥＤＣ）または１−シクロへキシル−３−（２−モルホリノエチル）カ ルボジイミドメト−ｐ−トルエンスルホネートなどの水溶性力ルポジイミトヲ利 用してウシ血清アルブミンにカップリングさせる。該ハブテンのＱが−ＮＨ。
基または−Ｃ（０）ＮＨＮＨ！基である場合も同じ試薬を用いることができ、そ の場合はウシ血清アルブミン上のカルボキシル基との間でアミド結合が生成する 。
該ハブテンのＱが−ＮＣＯ１−ＮＣ８または一層（Ｃｏ）ＣＩである場合は、た とえば、ポリ（アミノ酸）を該ハブテンと直接混合することにより免疫原を調製 することができる。該ハブテンのＱが−ＣＨ０である場合は、該アルデヒドを還 元的にアミノ化して対応アミン官能基とすることができる。有用なハブテンへの 該アルデヒドの他の変換は当業者には自明である。
本発明の抗体は、本発明の免疫原に対して動物中で免疫応答を起こさせることに より調製する。免疫原をウサギ、マウス、ラット、ヒツジまたはウシなどの動物 に当該技術分野で一般に知られた技術に従った一連の注射により投与する。本発 明による抗体は、本発明の実質的に光学的に純粋なハブテンに由来する本発明の 免疫原に応答して産生される。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の 両方とも免疫原上の特定のエピトープを認識し、一般にポリクローナル抗体を本 発明では用いるが両抗体とも用いることができる。ポリクローナル抗体は、それ ぞれ特定のエピトープを認識する複数の抗体の混合物からなり、一方、モノクロ ーナル抗体は特定のエピトープを認識する単一の抗体を分泌する細胞により産生 される。ポリクローナル抗体を調製する技術は一般に当該技術分野でよく知られ ている。モノクローナル抗体の調製は、マウスやラットなどの動物に抗原、すな わち上記式（ＩＶ）に対応する免疫原を腹腔内、皮下、静脈内、または幾つかの 他の仕方で注射して該動物中で免疫応答を起こさせる（すなわち、該抗原に特異 的な抗体の産生）ことにより行う。該動物から血清を取り出し、この血清を試験 して該血清中の抗体力価を決定する（該動物が所望の免疫応答を引き起こしたか どうか、およびどの程度引き起こしたかを決定するため）。所望の免疫応答を引 き起こした動物を約２〜３カ月休ませる。この２力月から３力月の期間の後、ミ エローマ細胞（腫瘍細胞）とのＢ−リンパ球細胞（抗原の刺激により、抗体を合 成する形質球に成熟する細胞：Ｂ細胞とも呼ばれる）の先行する融合の約３日前 に該抗原のブー・スター注射をこれら動物に投与する。ついで、これら動物の胛 体からＢ−リンパ球細胞を標準法により取り出し、ついでコー・ブーおよびミル シコ、ナインの［コンティニュアス・カルチャー・オン・ヒューズド・セルズ・ ジ−クリ−ティング・アンタイボディー・オグ・プレディファインド・スベシフ ィシティ−（Ｃｏｒ＋ｔｉｎｕｏｕｓ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ｏｆ　ＦｕｓｅｄＣｅ ｌｌｓ　Ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｏｆ　Ｐｒｅｄｃｆｉｎｅｄ 　５ｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）　Ｊ　、Ｎａｔｕｒｅｓ　２５６．４９５　（ｉ９ ７５）に記載されているような標準法に従い、これらＢ−リンパ球細胞をミエロ ・−マ融合パートナ−と融合させる。ついで、Ｂ−リンパ球−ミエローマ融合物 をＨＡＴ培地、または他の適当な培地を含有するマルチウェル組織培養プレート 中に入れる。得られた培養液に細胞融合から５日または７日前後にＨＴ培地、ま たは他の適当な培地、およびウシ胎仔血清または仔牛血清を与え、ついで融合か ら１０日前後に該抗原に特異的な抗体の存在について試験する。ついで、特定の 所望のハイブリッドを限界希釈法によりクローニングする。（ハイブリッド細胞 を異なる量のＨＴ培地、または他の適当な培地中に希釈し、単一の所望のクロー ンを単離するために組織培養プレート中にブレーティングする。）ついで、確立 したクローンを広範囲の交差反応物のパネルに対する特異性について再試験する 。
ついで、（１）組織培ＩＩ（組織培養、またはＨＴ培地中の細胞数を拡張するこ とにより）；または（２）腹水のためのマウスのいずれかにおいて、所望のクロ ーンにより産生されたモノクローナル抗体の量をスケールアップして精製のため に充分な量の抗体を産生させることができる。ハイブリッド細胞をマウスの牌腔 内に注射し該細胞を増殖させる（通常、約７日間）ことによりモノクローナル抗 体をマウス中でスケールアップすることができる。マウスを層殺し、腹水を回収 し、腹水を精製することにより、マウスから腹水を得ることができる。Ｂ　Ａ　 Ｌ　Ｂ／Ｃマウスはこの目的に使用する実験マウスの最も一般的な株であり、い かなるマウス業者からも入手することができる。マウスの免疫系を刺激してＢ細 胞およびＴ細胞を産生さぜるためにブリスタンをマウスに注射すべきであり（ハ イブリッド細胞をマウスに注射する約２〜３週間前）、これらＢ細胞およびＴ細 胞はマウスに注射するクローン細胞のフィーダ一層として働く。１丁れは、ハイ ブリッド細胞が増殖することのできる適切な環境を提供するために行う、。
本発明はまた、生物学的試料中のコチニンの存在または量を決定するための改良 イムノアッセイをも提供する。本発明の改良イムノアッセイは、。決定すべき試 料を本発明の免疫原に応答し７”Ｃ産生させた抗体に接触させる。［程を邑む。
本発明によるハブテン、免疫原、および／または該免疫原に対して産生させた抗 体を利用したコチニンのあらゆるイムノアッセイが本発明の範囲に包含されるこ とが考えられる。イムノアッセイの例としては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ ｓ）、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡｓ）、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ （ＥＬＩＳＡｓ）および蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＮＡｓ）が挙げられる。
蛍光偏光イムノアッセイ（Ｆ　Ｐ　ｉ　Ａ）において、本発明の免疫原に応答し て産生させた抗体を利用してまたは利用せずに、本発明の蛍光トレーサーを利用 することができる。
本発明の蛍光トレーサーは、本発明のハブテンに対応する実質的に光学的に純粋 な化合物に由来するものと考えることができる。本発明のトレーサーはコチニン のイムノアッセイに有用であり、式：（式中、Ｘは上記式（Ｉ）に対応するハプ テンの定義と同じであり、ｎ＝１または０、好ましくは１である）に対応する。
式（Ｖ）中のＱ′は、−ＮＨＣ（０）−１−ＯＣ（０）ＮＨ−１−Ｃ（０）−Ｎ ＨＮＨ−１−ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ−およびＮＨＣ（０）ＮＨ−から選ばれた２価ラ ジカルである（ただし、Ｑ゛が一０Ｃ（０）ＮＨ−１−ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ−また は−ＮＨＣ（０）ＮＨ−である場合はｎ＝１である）。式（■）において、Ｆは 蛍光付与残基である。ｎ＝１である場合は、Ｑ゛は蛍光付与残基Ｆを２価うジカ ルＸに連結する働きをする。ｎ＝０の場合は、Ｑ′は蛍光付与残基Ｆをピリジル 環に直接、２−１４−１５−または６−位、好ましくは４−１５−または６−位 、典型的には４−または６−位にて連結させる働きをする。蛍光付与残基Ｆは、 広範囲の蛍光付与残基から選択することができる。式（Ｖ）から理解できるよう に、残基Ｆは、ｎ＝１の場合はＸを介して、またはｎ＝Ｏの場合はピリジル環に 直接、該トレーサーの残りの部分にＱ゛を介して結合した蛍光付与化合物の１価 残基を表す。本発明の好ましい態様において、蛍光トレーサーの蛍光付与残基は 、フルオレセインの１価残基またはフルオレセイン誘導体の１価残基である。例 として下記フルオレセイン誘導体のいずれをも用いることができる： Ｆｌ−ＣＨ２ＮＨ２アミノメチルフルオレセインＦ　Ｉ　−ＮＨ！　フルオレセ インアミンＦ　Ｉ　−ＣＣｈＨカルボキンフルオレセインＦ　Ｉ　ＮＨＣＯＣＨ ｚＩ　アルファーヨードアセトアミドフルオレセインＦｌ−ＮＣ３フルオレセイ ンチオイソシアネート上記に用いたＦｌとは、下記式（■）：に対応するフルオ レセイン残基を表す。本発明のトレーサーは、適当な蛍光化合物を上記式（Ｉ） で示される本発明のハプテン（式中、Ｑは該蛍光化合物のハブテンへの結合に利 用するのに適した官能基を表す）に、たとえば、該蛍光化合物からの共反応官能 基と直接、または中間工楔を経て反応させることによつて連結することにより調 製することができる。ハプテンのための官能基の例としては、−ＣＯＯＨ，−Ｎ Ｈ！　（ただし、ｎは０に等しくはない）　、−Ｃ（０）ＮＨＮＨ，、−０（Ｃ ｏ）ＣＩ、−ＮＣ３および−ＮＧＯが挙げられる。
通常、試料中のコチニンの存在および／または量を決定するために、競合結合イ ムノアッセイを本発明の方法に従って利用する。一般に、競合結合イムノアッセ イは試験試料中のりガントを測定するのに用いる。この開示の目的のためには、 「リガンド」は、競合結合イムノアッセイ法によって定量的に測定すべき生物学 的に興味のもたれる物質（コチニン）である。リガンドは、該リガンドおよびリ ガンド類似体に特異的な抗体（本明細書においては、本発明の免疫原への応答に おいて調製される抗体）上の限られた数のリガンド結合部位に対して標識試薬（ 「リガンド類似体Ｊまたは「トレーサー」）と競合する。試料中のリガンド濃度 は該抗体に結合するリガンド類似体の量を決定し、該抗体に結合するリガンド類 似体の量は試料中のりガントの濃度に反比例する。なぜなら、リガンドおよびリ ガンド類似体はそれぞれの濃度に比例して該抗体に結合するからである。
本発明の一つの態様において、競合結合イムノアッセイにおいて生成したトレー サー−抗体結合体の量を決定するために蛍光偏光イムノアッセイ（Ｆ　Ｐ　Ｉ　 Ａ）法を利用する。そのような手順は、蛍光標識化合物が、平面偏光により励起 されたときに、その回転速度と逆の相関を有する偏光の程度の蛍光を放出すると いう原理に基づいている。従って、蛍光標識を有するトレーサー−抗体結合体が 平面偏光により励起されると、放出される光は高度に偏光されたままである。な ぜなら、蛍光団は光が吸収されてから放出されるまでの間、回転が束縛されるか らである。対照的に、未結合のトレーサーが平面偏光により励起されると、その 回転は対応トレーサー−抗体結合体よりも遥かに速く、該分子は一層ランダムに 向けられるようになる。その結果、該未結合トレーサー分子から放出される光は 偏光が解消する。
さらに詳しくは、試料中のコチニンの存在または量を決定するための本発明の好 ましいＦＰＩＡ法は、工程：　（ａ）試料を（１）本発明の免疫原に応答して産 生したモノクローナルまたはポリクローナル抗体、一般にポリクローナル抗体； および（２）本発明の蛍光トレーサー（該蛍光トレーサーは、抗血清の存在に対 する検出可能な蛍光偏光応答を生成し得る）と接触させ：　（ｂ）工程（ａ）で 得られた溶液に平面偏光を通して蛍光偏光応答を得：ついで（Ｃ）試料中のコチ ニンの存在または量の測定手段として工程（ｂ）の溶液の蛍光偏光応答を検出す る工程からなる。
蛍光トレーサーおよび抗体の濃度を一定に保つことにより、蛍光トレーサー−抗 体複合体に対するコチニンー抗体複合体の比は試料中のコチニンの量に正比例す る。この混合物を直線偏光で励起し、蛍光トレーサーおよび蛍光トレーサー−抗 体複合体により放出される蛍光の偏光（ミリ偏光の単位で）を測定することによ り、試料中のコチニンの量を定量的に決定し、またはコチニンの存在を定性的に 決定することができる。
得られた結果は、正味のミリ偏光単位およびスパン（ミリ偏光単位にて）により 定量化することができる。正味のミリ偏光単位の測定値は、コチニンの不在下で 最大量の蛍光トレーサーが抗体に結合した場合の最大偏光を示す。正味のミリ偏 光単位が高くなればなるほど、トレーサーの抗体への結合は良好となる。アッセ イスパンは、コチニンの不在下で最大量のトレーサーが結合した場合に得られる 正味のミリ偏光値と、試料中に特定量のコチニンが存在する場合に得られる正味 のミリ偏光値との差異である。スパンが大きくなるほど、アッセイについて作成 した標準曲線の各カリプレーター間に一層多くのミリ偏光単位を入れることがで き、それゆえアッセイの正確さが一層良好となり、このことが今度は得られたデ ータの一層良好な数値分析を可能とする。スパンは使用した試料サイズに依存し て変化し、このことが今度は好ましい組合せを変えることを認識することが重要 である。
本発明の蛍光トレーサーは、実質的に光学的に純粋である。これらトレーサーは 、ポリクローナル抗体に基づ（抗血清を利用する場合に特に利点を有する。生体 中のコチニンは本質的に光学的に純粋であるので、実質的に光学的に純粋なトレ ーサーを実質的に光学的に純粋な免疫原から得られる抗体と組み合わせて用いる と、ＦＰＩＡ法を利用したコチニンアッセイにおいて選択した動的範囲を越えて シグナル減衰を促進することが可能となることがわかった。得られる一つの利点 は、従来のコチニン用ＦＰＩＡアッセイで得られる不利な低い感度と比較して、 本発明のＦＰＩＡアッセイでは５０ｎｇ／ｍｌのオーダーのコチニンの感度を達 成することができるということである。
本発明の蛍光トレーサーと本発明の免疫原との最も好ましい組合せの幾つかの重 要な特徴としては＝　（１）免疫原との応答により生成したコチニンのための抗 体の高程度の特異性、および（２）これら抗体のニコチンの他の代謝産物に対す る最小の交差反応性が挙げられる。
本発明のＦＰＩＡ法を行う際の、Ｈは、蛍光トレーサーのフルオレセイン残基が 開環形で存在することができるものでなければならない。このｐＨは、約３〜１ ２の範囲、一層通常には約５〜１０の範囲、最も好ましくは約６〜９の範囲であ る。ＦＰＩＡ法の間にこのｐＨを達成し維持するために種々の緩衝液を用いるこ とができる。代表的な緩衝液としては、ホウ酸、リン酸、炭酸、トリス、バルビ ツール、クエン酸などが挙げられる。特定の緩衝液を用いることは本発明にとっ て重要ではないが、トリス、リン酸、クエン酸緩衝液が好ましい。緩衝液のカチ オン部分は、一般に溶液中のトレーサー塩のカチオン部分を決定するであろう。
リボフラビン結合タンパク質（ＲＢＰ）を試料または１または２以上のアッセイ 試薬に加えて試料中に存在するりボフラビンをＲＢＰ−リボフラビン複合体とし て結合させ、かくして蛍光妨害の可能性を排除する。ＲＢＰは、卵白から単離さ れる分子量約３２，０００のタンパク質である。卵から単離したとき、ＲＢＰの 各分子は一つのりボフラビン分子を含有している。このホロタンパク質の形態の ＲＢＰを酸性条件下で透析してアポタンパク質の形態に変換することにより結合 したりポフラビンを除去する必要がある。本発明で利用するＲＢＰアポタンパク 質は、シグマ・ケミカル・カンパニー、セントルイス、ミズーリ州から市販され ている。使用する量は重要でない。ただし、充分な量を用いて試料中のすべての 遊離のリボフラビンを結合させるようにする。
本発明の蛍光偏光イムノアッセイは「均一アッセイ」であり、このことは、最終 偏光の読み取りを結合トレーサーを未結合トレーサーから分離していない溶液か ら行うことを意味する。このことは、読み取りを行うことができる前に結合トレ ーサーを未結合トレーサーから分離しなければならないような不均一イムノアッ セイ法に対する顕著な利点である。
本発明の蛍光偏光アッセイの試薬は、（１）コチニンに対するポリクローナルま たはモノクローナル、一般にはポリクローナルの抗体；および（２）蛍光トレー サー試薬からなる。
加えて、前処理溶液、希釈緩衝液、コチニンカリブレーターおよびコチニンコン トロールを含む主として通常の溶液を調製するのが望ましい。これら試薬の典型 的な溶液（幾つかは下記に記載する）は、アボット・ラボラトリーズ、アポ・ソ トパーク、イリノイ州からのアッセイ「キット」において市販されている。
本明細書に記載するパーセントは、特に断らない限りｗ／ｖである。本発明の好 ましい蛍光偏光イムノアッセイのための好ましい試薬、カリプレーターおよびコ ントロールは、下記実施例８に記載するものである。
好ましいＦＰＩＡ法は、アボットＴＤＲクリニカルアナライザーまたはアボット ＡＤＲドラッグズオンアビューズシステム（ともにアボット・ラボラトリーズ、 アボットパーク、イリノイ州より入手可能）と組み合わせて用いるように特に設 計する。カリブレーター、コントロール、または未知の試料をＴＤＲ試料カート リッジの試料ウェル中に直接ピペットにて入れる。この方法の利点の一つは、試 料が特別の調製を必要としないということである。この点から、アッセイ手順を 完全に自動化することができる。
手動のアッセイを行う場合には、試料を希釈緩衝液中の前処理溶液と混合し、バ ーツクグラウンドの読み取りを行う。ついで、蛍光トレーサーをアッセイと混合 する。ついで、最後に抗体を試験溶液と混合する。インキュベーション後、蛍光 偏光の読み取りを行う。
各カリブレーク−、コントロールまたは試料の蛍光偏光値を測定し、アボットＴ ＤＲアナライザーやＡＤＲシステムなどの装置の出力テープ上にプリントする。
非線形回帰分析を用いて各カリブレーターの偏光をその濃度に対してプロットす ることにより、装置中で標準曲線を作成する。貯蔵しである検量曲線から各コン トロールまたは試料の濃度を読み取り、出力テープ上にプリントする。
上記好ましい手順に関して、トレーサー、抗体、前処理溶液、洗浄溶液、カリブ レーク−およびコントロールは約り℃〜約８℃にて貯蔵すべきであり、一方、希 釈緩衝液は周囲温度にて貯蔵すべきであることに注意すべきである。標準曲線お よびコントロールは各２週間毎に行うべきであり、各カリブレーターおよびコン トロールは２つずつ行う。試料はすべて２つずつ行うことができる。
下記実施例は本発明の態様をさらに説明するために記載するが、本発明の範囲を 限定することを意図するものではない。
下記一般的な実験手順は、下記実施例のハプテンの調製において利用した。
すべての反応は、特に断らない限り、乾燥Ａｒの雰囲気下で行った。旋光度は、 ０、ｌｄｍセルおよびスペクトル源としてナトリウムＤ〜線を用い、パーキン− エルマーモデル２４１偏光計に記録した。プロトンＮＭＲスペクトルは、ケマグ ネティックス（Ｃｈｅｓｍａｇｎｅｔｉｅｓ）モデルＡ−２００（２００ＭＨｚ ）またはジｔネラルエレクトリカルモデルＱＥ−３００（３００ＭＨｚ）分光光 度計のいずれかで記録した。プロトンＮＭＲは、内部標準としてテトラメチルシ ランを用いたＣＤＣｌ５中で記録した。ＮＭＲシグナルの多重度を示すため、以 下の略語を用いる：８１−重項；ｄ、二重項；ｔ、三重項：ｑ、四重項；ｂｓ、 ブロードの一重項。
クロマトグラフィーの溶媒は高速液体クロマトグラフィー（Ｉ（Ｐ　Ｌ　Ｃ）の グレードであり、さらに精製することなく用いた。無水テトラヒドロフラン（Ｔ ）ＩＦ）を、使用直前にＮａ／ベンゾフエノンケチルからアルゴン下で蒸留した 。無水メチレンクロリドを水素化カルシウムから蒸留した。他のすべての化学物 質は、販売者から受け取ったままで用いた。水性溶液を抽出するのに用いる溶媒 はすべて硫酸マグネシウムで乾燥し、３５℃またはそれ以下にて回転エバポレー ター上で蒸発させた。カラムクロマトグラフィーは、イーメルクシリカゲル６０ ．２３０〜４００メツシュＡＳＴＭ上で行った。分析薄層および分取層クロマト グラフィーは、イーメルクプレコーティングシリカゲル６０Ｆ２５４プレート上 で行った。
すべての化合物の命名は、下記式（Ｉ）に示すナンバリング系に基づく。
実施例１ この実施例は、下記式（Ｖｌ）に対応する本発明のハプテン、すなわち（Ｓ）− Ｃ−＞−６−（２−カルボキシエチル）コチニンの調製を説明する。
４°　３゜ 工程（ａと　撹拌棒と隔壁を具えた２５ｍ１丸底フラスコに２１１ミリグラム（ ｍｇ；４．０ミリモル）の亜鉛−銅カップル（Ｚｎ−Ｃｕ）を入れ、フラスコに アルゴンを流した。このカップルを５．５ミリリツトル（ｍｌ）の乾燥ベンゼン 中に懸濁し、０．３５ｍ１の乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を加えた。こ の撹拌懸濁液に５ＱＱｍｇ　（２，６３ミリモル）の３−ヨードプロピオン酸エ チルを加え、この混合物を周囲温度で１時間撹拌し、ついで６０℃にて４時間加 熱した。得られるオルガノ亜鉛試薬を周囲温度に冷却し、１０ｍ１のベンゼン中 の（−）−コチニン（すなわち、左旋性コチニン）（４０４ｍｇ、２．３０ミリ モル）およびフェニルクロロホルメート（０，２９ｍ１．２．３０ミリモル）の 混合物にカニユーレで滴下した。得られる懸濁液を２０分間撹拌し、ついで１０ 重量％水性ＨＣＩ　（５ｍｌ）およびジエチルエーテル（１０ｍｌ）で処理した 。層を分離し、水性層をエーテルの５ｍ！部分で抽出した。コンバインした有機 抽出物を１０％水性ＨＣＩ、飽和水性重炭酸ナトリウムで順番に洗浄し、硫酸マ グネシウム（ＭｇＳＯ４）で乾燥した。濾過および回転蒸発後、６１３ｍｇの透 明な油状物が得られた。
工程（ｂ）　この粗製混合物（上記工程ａから）の一部（４６６ｍｇ）をベンゼ ン（２０ｍｌ）および氷酢酸（１，ｍｌ）中に溶解し、２，３−ジシアノベンゾ キノン（ＤＤＱ）（２９４ｍｇ、１．３０ミリモル）を加えた。この反応混合物 を温めて１時間還流し、ついで周囲温度に冷却し、冷水（１００ｍｌ）中に投げ 入れた。水性相を重炭酸すトリウムでｐＨ９の塩基性にし、１：１ジエチルエー テル／酢酸エチルの２つの２０ｍ１部分で抽出した。乾燥および回転蒸発後に得 られた生成物をメタノール／クロロホルム混合物を用いたシリカゲル上のクロマ トグラフィーにかけて、式（■）に対応する純粋な化合物（４８，７ｍｇ、７． ６重量％）を得た：ＴＬＣ（５％メタノール／ＣＨＣｌ５）Ｒｆ＝０．２８　； ’ＨＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ　３）デルタ８．４０　（ｄ、ＩＨ，Ｊ＝ ２Ｈｚ）、７．４３　（ｄｄ、ＩＨＳＪ＝８．２Ｈｚ）　、７．２３　（ｄ、Ｉ ＨＳＪ＝８Ｈｚ）、４．５４（ｍ、ＩＨ）、４．１３　（Ｑ、２Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ ）　、３．２５　ｃｔ、２Ｈ１Ｊ＝７Ｈｚ）　、２．８０　ｃｔ、２Ｈ，Ｊ＝７ Ｈｚ）　、２．６６　（ｓ、３Ｈ）　、２゜６２−２．３８　（ｍ、３Ｈ）　、 １．９５〜１．７５　（ｍ、ＩＨ）　、１．．２１　（ｔ、３ＩＮ、Ｊ＝ｊ　Ｈ ｚ）　；　［アルフｙ］　”ｎ−２４，５（ｅ＝０．２０、エタノール中）１７ ・こり（凸ル）の溶液に粉末状の水酸化リチウム（１２ｍｇ、０．５１ミリモル ）を加え、得られた混合物を周囲温度ｔｌ’７時間撹拌し、蒸発乾固した。この 粗製の生成物をメタノ・−ル／′クロロホルム混合物を用いたシリカゲルＬのク ロマトグラフィーにかけで、化合物（ＶＩ）（２９，１ｍｇ、７４％）を透明な 無色ガラスとしで得た：　［アルファ］　”ｏ　１５　（ｅ＝１．３２、メタ、 ノール中）。化合物（■）は、抗Ｊチニン抗体の生成に有用な本発明のハプテン である。
この実施例は、コヂニンのイムノアッセイのた島の本発明の蛍光トレーサーの調 製に有用な化合物、すなわち（Ｓ）　−（−）−６〜（３−ヒドロキシプロピル ）コチニンの調製を説明する。この化合物は下記式（■）に対応する。
工、［（ａ）−テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（］、０ｒｎｌ）中の（−）−１ ヂニン（１７６，４ｍｇ５１．０ミリモル）の冷（０℃）溶液にエチルク■１０ ホルメ−１・（１，０ミリモル）を含有する９６マイクロリツトル（μｍ）を加 え、得られた白色−濁液を０℃にて１０分間撹拌した。この懸濁液を一７８℃に 冷却し、３−ブテニルマグネシウムプロミドの０．７７モル（Ｍ）ＴｌｌＦ溶液 （１，０２Ｅリモル）（１，３２ｒｎｌ）で５分間滴下処理した。この反応混合 物を一７８℃で３０分ＦＩＪｆｆｆｆ拌し、周囲温度に温めＳエーテ゛ル（１５ ｍｌ）および水（５ｍｌ）を添加して反応を停止トさせた。実施例１、土稈（ａ ）の処理を行−）て透明な無色油状物（１２９ｍｇ）を得た。
１稈（ｂ）　、）−紀−Ｌ秤（ａ）で得た油状物をアセト：、］・リル（６＋ｎ ｌ）中に溶解し、７ｋ（２，０ｒｎｌ）中の硝酸セリウム（■）アンモニウム（ ＣＡＮ）（３３０ｒｎｇ、Ｑ、５ＱＥリモル）の溶液を激しく撹拌しながら滴Ｆ した。添加完了後、混合物を周囲温度にてさらに５分間撹拌し、クロロホルム（ ２０ｍｌ）で希釈ｊ５・、クエン酸（８００ｒｎｇ、４．１６”、リモル）を加 えた。この混合物を充分な飽和水性炭酸ナトリウムで塩基性にして最終ｐＨを９ とし、相を分離した。水性相をクロロホルＩ５の１０ｒｎｌ部分で抽出した。有 機抽出物をコンバインし、水洗し、乾燥した（ＭｇＳＯ４）。濾過および蒸発後 に得られた残渣をシリカゲル上のクロマトグラフィーにかけて、式（ＩＸ）に対 応する化合物（３７ｍｇ）および式Ｃ）に対応する化合物（１８ｍｇ）を透明な ほぼ無色の油状物として得た。（ＩＸ）について：’ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、 、ＣＤＣ１３）デルタ８．４１　（ｄ、　１１−１゜Ｊ＝２．５Ｈｚ）　、７． ４２　（ｄｄ、ＩＨＳＪ＝８．１．２．５Ｈｚ）、７．１９　（ｄ、ＩＨ，Ｊ＝ ８．１Ｈｚ）、５．９５〜５．８１　（ｍ、２Ｈ）　、５．１１〜４．９６（ｍ 、ＩＨ）　、２．９０　（ｍ、２Ｈ）　、２．６７　（ｓ、３Ｈ）　、２．６３ 〜２．４１（ｍ、５Ｈ）　、１．９４〜１．８２　（ｍ、ＩＨ）；　（Ｘ）につ いて：　ＩＨＮＭＲ（３００ＭＨｚＳＣＤＣ１３）δ８．４６　（ｄ、ＩＨＳＪ ＝５．７Ｈｚ）　、８．３２　（ｓ、ＩＨ）　、７．１５　（ｄ、ＩＨＳＪ＝５ ．７Ｈｚ）　、５．９０〜５．７６　（ｍ。
ＩＨ）　、５．１１〜５．０３　（ｍ、２Ｈ）　、４．８８〜４．８０　（ｍ、 ＩＨ）　、２゜８１〜２．３５　（ｍ、ｌ０Ｈ）　、１．９２〜２．８０　（ｍ 、ＩＨ）；［アルフｙ］　”Ｄ−６０，４°　（ｃ＝０．２６、エタノール中； ＭＳ　（Ｅｌ）ｍ／ｅ２３０（Ｍつ　（２２％）　、２１５　（１５％）　、２ ０１　（３９％）、１８８（Ｃ６％）　、１７３　（１６％）　、１５８　（３ ６％）　、９８　（１００％）；ＩＲ（ＣＤＣ１ｓ）１６８０．１５９８．１４ ００．１２７０．１１０８ｃｍ一つ。
４°　３′ ド（７，５ｍ１）および酢酸エチル（０，５ｍ１）中に溶解し、撹拌しながらト リフルオロ酢酸（１４マイクロリツトル（μｍ））で処理した。この混合物を一 ７８℃に冷却し、過剰オゾンの微かな青色が観察されるまでオゾン流を通した。
アルゴンガスを泡立てて通して過剰のオゾンと置き換え、ついで混合物をジメチ ルスルフィド（０，２５ｍ１，３．４ミリモル）で処理した。この混合物を周囲 温度６　に−夜かけて温めた。水性処理後、粗製のアルデヒドを油状物として得 た。
工程（ｄ）　上記工程（Ｃ）の粗製のアルデヒドをメタノール（４ｍｌ）中に溶 解し、撹拌しなから０℃に冷却し、混合物を水素化ホウ素ナトリウムＣ２５ｍｇ 、。
０．６５ミリモル）で処理した。この混合物を周囲温度に一夜かけてゆフくりと 温めた。５％塩酸水溶液（０，５ｍ１）を加えて過剰の水素化物を破壊し、飽和 水性重炭酸ナトリウムでｐＨ−４０とし、生成物をクロロホルム（５ｍｌ）中に 抽出した。乾燥、濾過および濃縮後、粗製のアルコール（１１，５ｍｇ）を得た 。
この生成物をメタノール／クロロホルム混合物を用いたシリカゲル上のクロマト グラフィーによりさらに精製して、高度に純粋な■（３，６ｍｇ）を透明な無色 油状物として得た：’ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣ１３）デに９８．４９　 （ｄ、ＩＨＳＪ＝２．４Ｈｚ）　、７．４７　（ｄｄ、ＩＨ，、Ｊ＝７．６．２ ．４Ｈｚ）　、７゜３３（ｄ、ＩＨ，ｊ＝７．６Ｈｚ）　、４．５３　（ｍ　Ｉ Ｈ）　、３．７３　（ｔ、２Ｈ。
Ｊ＝６．６Ｈｚ）、３．６６　（ｂｓ、ＩＨ）　、２．９９　（ｔ、ＩＨ，Ｊ＝ ６．６Ｈｚ）、２．６７　（ｓ、３Ｈ）　、２．６５〜２．４１　（ｍ、３Ｈ） 　、２．０５〜１．９４　（ｍ、２Ｈ）　、１．９２〜１．８１　（ｍｌ　１Ｈ ）。
実施例３ この実施例は、下記式（Ｘ［）に対応する本発明の好ましいハブテン、すなわち （Ｓ）−（−）−４−（２−カルボキシエチル）コチニンの調製を説明する。
モル）の冷（−２０℃）溶液に３−ブテニルマグネシウムプロミドの０．７７Ｍ 溶液（２，４３ミリモル）（３，１５ｍ１）を滴下した。この混合物を一２０℃ にて２０分間撹拌し、−７８℃に冷却し、ホウ素トリフルオライドエーテレート （０，３０ｍ１，２．４３ミリモル）をゆっくりと加えた。得られた灰−褐色の 懸濁液を両頭（ｄｏｕｂｌｅ−ｅｎｄｅｄ）針でＴＨＦ　（８ｍｌ）中のコチニ ン（３６４ｍｇ、２゜０７ミリモル）およびエチルクロロホルメー）　（０，１ ９ｍ１）の冷（−７８℃）混合物に移した。この反応混合物を周囲温度に１時間 かけて温め、ついで実施例１工程（ａ）の処理を行って付加生成物の粗製混合物 （２８５ｍｇ）を得た。
工程（ｂ）　上記実施例３、工程（ａ）の粗製付加生成物をアセトニトリル（２ ５ｍｌ）中に溶解した。水（５ｍｌ）中のＣＡＮ（１，０３グラム（ｇ）　、１ ．８ミリモル）の溶液を撹拌しながら滴下し、得られた溶液を周囲温度にて１０ 分間撹拌した。この薄黄色の溶液に重硫酸ナトリウム（１００ｍｇ）を加えて過 剰のＣＡＮを破壊し、反応物を実施例２、工程（ｂ）と同様にして処理した。ク ロマトグラフィー後、純粋な（Ｘ）（６９ｍｇ）および（ＩＸ）　（６，８ｍｇ ）が得られた（（Ｘ）および（ＩＸ）の分析データについては実施例２参照）。
工程（ｃ）　塩化メチレン（３０ｍｌ）およびメタノール（４ｍｌ）中の（Ｘ） （３０２ｍｇ、１．３１ミリモル）の冷（−７８℃）溶液をオゾンで処理し、実 施例２、工程（Ｃ）の記載と同様の仕方でジメチルスルフィドで処理した。得ら れた粗製の残渣をクロマトグラフィーにかけて純粋なアルデヒド（ｎ）（２８６ ｍｇ）を透明な無色油状物として得た：’ＨＮＭＲ（３００ＭＨＹｚ、ＣＤＣｌ ５）δ９．８８（ｓ、ＬＨ）　、８．４８　（ｄ、１ｈＳＪ＝５．２Ｈｚ）　、 ８．３１（ｂｓ、ＩＨ）　、７．１３　（ｄ、１１−１、Ｊ＝５．２Ｈｚ）　、 ４．９４〜４．８６　（ｍ。
ＩＨ）　、３．０８〜２．８２　（ｍ、４Ｈ１２，７０〜２．４２　（ｍ、　７ Ｈ）　、１．９２〜１．７６（ｍ、ＬＨ）。化合物（ＸＩ）は可能なコチニンハ プテンであり、当業者に公知の還元的アミノ化法によりタンパク質担体に結合す ることができる。
ルコール（１，８ｍ１）および２−メチル−２−ブテン（０，４２ｍ１）中に溶 解した。激しく撹拌しながら、０．１Ｍ　ｐＨ＝３．５リン酸緩衝液（０，４ｍ １）中の塩素酸ナトリウム（５３ｍｇ）の溶液を滴下し、混合物を３時間撹拌し た。この反応混合物を回転エバポレーター上で濃縮乾固し、得られた残渣をメタ ノール／クロロホルム混合物を用いたシリカゲル上のクロマトグラフィーにかけ て（ＸＩ）（７６，０ｍｇ）を吸湿性の泡として得た：’ＨＮＭＲ（３００ＭＨ ｚ、ＣＤｓＯＤ）δ８．３８（ｄ、ＩＨ，Ｊ＝５．３Ｈｚ）　、８．１９　（ｂ ｓ、１．Ｈ）　、７．３８　（ｄ、ＩＨ，Ｊ＝５．３Ｈｚ）　、５．０８　（ｍ 、ＩＨ）　、３．０５〜２．９５　（ｍ。
２Ｈ）、２．７２　（ｓ、３Ｈ）　、２．７ｓ　（ｓ、３Ｈ）　、２．７１〜２ ．４５　（ｍ。
５Ｈ）　、１．９３〜１．８０　（ｍ、ＩＨ）；ＭＳ　（ＤＣ！、ＮＨｓ）Ｍ” 　）（＠　ｍ／ｅ＝２４９；［アルファＪ！邸。−７６，８°　（Ｃ＝０．２５ 、エタノール中）。
実施例４ この実施例は、式（Ｘｍ）に対応する本発明の好ましい蛍光トレーサー、すなわ ち：ｌ［（−）−４〜コチニル］プロピオン酸アミノメチルフルオレセインアミ ドの調製を説明する。
上記実施例３、工程（ｄ）で調製した酸、すなわち式（Ｘｌ）に対応する（Ｓ） −（−）　−４−（２−カルボキシエチル）コチニンを２７．２ｍｇ　（０，１ １０ミリモル）の量にて、各５００マイクロリツトル（μＬ）のＴＨＦ、ジオキ サンおよびＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）中に溶解した。この溶液に４゛−ア ミノメチルフルオレセイン塩酸塩（４４ｍｇ、０．Ｌ１０ミリモノリ、トリエチ ルアミン（６４μＬ、０．４３ミリモル）およびビス（２−オキソ−３−オキサ ゾリジニル）ホスフィン酸クロリド（ＢＯＰ−ＣＩ）（３３，５ｍｇ、、０．１ ３２ミリモル）を順番に加え、この混合物を周囲温度にて４時間撹拌した。この 混合物を真空下、はぼ濃縮乾固し、１．０ｍｍｘ　２　Ｑ　ｅｍＸ　２０　ｃｍ シリカゲルプレートに適用し、それぞれクロロホルム中の１５％メタノール（２ ×）で展開した。適当なバンドをプレートから除き、粉末にし、フルオレセイン 誘導体をメタノールでゲルから溶出した。この誘導体を同様にしてさらに２回ク ロマトグラフィーにかけて（ＸＩＩＩ）　、式（Ｘｌｌｌ）で示すフルオレセイ ン誘導体（４５ｒｒ＋ｇ）を得た：ＭＳ　（ＦＡＢ）によりＭＨ”＠５９４が得 られる。
実施例５ この実施例は、本発明の蛍光トレーサー、すなわち式（ＸＩＶ）に対応する３− ［（−）−６−コチニル］プロピオン酸アミノメチルフルオレセインアミドの調 製を説明する。
アルコール（■）（上記実施例２、工程ｄで調製）（３，６ｍｇ、０．０１５４ ミリモル）の乾燥ジオキサン（０，１５ｍ１）中の溶液にベンゼン中のホスゲン の２．４Ｍ溶液（６０マイクロリツトル（μＬ））を加え、得られた混合物を周 囲温度にて５分間撹拌した。溶媒を真空除去し、得られた残渣を乾燥ジオキサン （０，１０ｍ１）中に溶解した。この撹拌溶液に４゛−アミノメチルフルオレセ イン（４，８ｍｇ、０．０１２ミリモル）　、ＮＭＰ　（０，０５ｍ１）および トリエチルアミン（６，５μＬ、０．０４６ミリモル）を加えた。この混合物を １０分間撹拌し、さらにトリエチルアミン（６，０μＬ）を加えた。周囲温度に て全部で１時間撹拌した後、反応混合物を０．５ｍｍＸ　２０　ｅｍＸ　２０　 ｃｍシリカゲルＴＬＣプレートに適用し、溶媒をプレートから蒸発させ、プレー トをクロロホルム中の】５％メタノール（２Ｘ）で展開した。適当なバンドをプ レートから除き、粉末にし、得られた半精製トレーサーをメタノールを用いてシ リカゲルから溶出した。トレーサーのメタノール溶液を濃縮乾固し、０．２５ｍ ｍＸ２０ｅｍＸ２０ＣｍシリカゲルＴＬＣプレート上で同様にクロマトグラフィ ーにかけて、精製（ＸＩＶ）　（その構造は図（ｘｒｖ）中に示す）（２００マ イクログラム（μｇ））を得た：ＭＳ　（ＦＡＢ）によりＭＨ”＠５９４が得ら れる。
実施例に の実施例は、式（ＸＶ）に示す本発明の免疫原（式中、ＢＳＡは、該化合物の残 りの部分にアミド結合により結合したウシ血清アルブミン残基を表す）の調製を 説明する。
水中の（ｓ）　−（−）７６−（２−カルボキシエチル）コチニン（２３，１ｍ ｇ）を撹拌しながらウシ血清アルブミン（６５，２ｍｇ）に加えた。最初のｐＨ は５．５３であった。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ ジイミド（１１２，５ｍｇ）を２回に分けて加え、各添加後に０．０１．ＮＨＣ Ｌおよび０．１ＮＨＣ１を用いてｐＨを約ｐＨ５，５〜５．７に調節した。この 混合物を２〜８℃にて１８時間撹拌した。終了ｐＨは６．６であった。この混合 物を脱イオン水に対して室温にて２日間、透析液を４回変えて透析した。透析管 からの溶液は、ビウレットタンパク質濃度決定法により１１．４ｍｇ／ｍ１タン パク質を含有することがわかった。
実施例７ この実施例は、式（ＸＶＩ）に示す本発明の好ましい免疫原（式中、ＢＳＡは、 該化合物の残りの部分にアミド結合により結合したウシ血清アルブミン残基を表 す）の調製を説明する。
脱イオン水（１０ｍｌ）中の（ｓ）−（−）−４−（２−カルボキシエチル）コ チニン（５７，４ｍｇ）を撹拌しながらウシ血清アルブミン（１５１，５８ｍｇ ）に加えた。Ｉ）Ｈを０．ｌＮＨＣｌを用いて６．０に調節した。ｌ−エチル− ３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（２５０ｍｇ）を５回に分 けて加え、各添加後に０．ｌＮＨＣｌを用いて混合物のｐＨを約ｐＨ６，０に調 節した。この混合物を１８時間撹拌した。ついで、この混合物をセルロース透析 管（スペクトラ／ポル（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐａｒ）　”、ＭＷ　１２．０００〜 １４，０００）中で蒸留水に対して４８時間、透析液を５回変えて透析した。透 析管からの溶液は、ビウレットタンパク質濃度決定法により１３．５ｍｇ／ｍｌ タンパク質を含有することがわかった。
実施例８ 上記実施例６および７の免疫原から抗血清を生成させ、尿試料中のコチニンの決 定のための蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡｓ）に利用した。実施例７の免疫 原から生成した抗血清は実施例６の免疫原から生成した抗血清に比べてＦＰｒＡ において良好であると考えられた。
ＦＰＩＡｓのための好ましい試薬、カリブレーターおよびコントロールの構成は 以下の通りである。
１、トレーサーの調合は、０．１モルトリス緩衝液（ｐＨ７，５）中の１２０ナ ノモルトレーサー、０．０１％ウシガンマ−グロブリン、および０．１％アジ化 ナトリウムである。
２、抗血清の調合物は、０．１モルクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，５）で 希釈したウサギ血清、１０％グリセロール、２％ウシ血清アルブミン、および０ ゜１％アジ化ナトリウムからなる。
３、前処理溶液は、０．１モルトリス緩衝液（ｐＨ７，５）　、０．０１％ウシ ガンマ−グロブリン、０．１％アジ化ナトリウムおよび１０ｍｇ／ｍｌリボフラ ビン結合タンパク質からなる。
４、洗浄溶液は、０．１モルリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，５）　、０．１ ％アジ化ナトリウムおよび０．０１％ウシガンマ−グロブリンからなる。
５、希釈緩衝液は、０．１モルリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，５）　、０． １％アジ化ナトリウムおよび０．０１％ウシガンマ−グロブリンからなる。
６、カリブレーター／コントロール希釈液は、０．９％塩化ナトリウム（ｐＨ６ ，５）、０．４％硫酸オクチルナトリウム、および０．１％アジ化ナトリウムか らなる。このカリブレーター／コントロール希釈液は、コチニンに由来するハブ テンに対して産生させた抗血清において認められる尿マトリックス効果を中和す るのに役立つ。
７、コチニン力リブレークーは、ミリリットル当たり０．０．２００．０．５０ ０．０、ｉ　ｏ　ｏ　ｏ、　ｏ、２０００．０および４０００．０ナノグラムの 濃度のカリブレーター／コントロール希釈液中のコチニンからなる。
８、コチニンコントロールは、ミリリットル当たり４００．０．１５００．０お よび３０００．０ナノグラムの濃度のカリブレーター／コントロール希釈液中の コチニンからなる。
実施例７の免疫原から生成した抗血清は、実施例６の免疫原から生成した抗血清 を用いて行ったアッセイと比較した場合に、陰性尿におけるマトリックス作用お よび他のニコチン／コチニン代謝産物に対する交差反応性に関してアッセイの性 能が向上していた。陰性尿は、実施例６の免疫原からの抗血清で分析した場合に 、マトリックス効果のために２００ナノグラム／ミリリツトル（ｎｇ／ｍ１）（ 該アッセイの提案されるカットオフ）よりも高い読み取りが得られた。これは、 実施例７からの免疫原を用いた場合には５０　ｎ　ｇ／ｍ　］に減少した。
加えて、ニコチンの他の２つの代謝産物に対する交差反応性は、実施例７の免疫 原を用いた場合は実施例６の免疫原を用いた場合に比べて有意に減少した。代表 的な値を下記表１に示す。
国際調査報告 １ｆｉ１＃ｌ＋Ｉｌｌ＠Ｎａ１Ａ＠＊ＭｍｂｅＲＮ＋１．ＰＯＴ／ＩＪ！コ９２ １００３８２Ｖｌ、０ＢＳＥＲＶＡＴＩＯＮＳ　Ｗ）ＩＥＲＥ　ｔＪＮＩＴＹ　 ＯＦ　ＩＮＶＥＮＴ工ＯＮ　ＷＡＳ　ＬＡＣＫＩＮＧＴｈｉｓ　１５Ａ　ｆｏｕ ｎｄ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　１ｎｖｅｎｔｉｏｎｓ　ａｓ　ｆｏｌｌｏｗｓ：（７ ２）発明者　ヒユー、シャンーユンアメリカ合衆国６００４８イリノイ州リバテ ィービル、シーダー・グレン・ドライブ１７６３番 （７２）発明者　ハッズ、バーバラ・イーアメリカ合衆国６００６８イリノイ州 、パーク・リッジ、ノースウェスト・ハイウェイ１４６１番

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. １．コチニンのイムノアッセイに有用な実質的に光学的に純粋なハプテンであっ て、式： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）（式中、Ｘは該式（Ｉ）のピリジル環 に第２−、４−、５−または６−位にて共有結合により結合した直鎖または分岐 鎖、飽和または不飽和の２価ラジカル、該２価ラジカルは１〜１０の炭素原子を 有し、該２価ラジカルの鎖はＳ、ＯおよびＮＺ（式中、ＺはＣ１〜Ｃ３アルキル 基を表す）よりなる群から選ばれた１または２のヘテロ原子で任意に置換されて いてよい；ｎ＝１または０；および Ｑは−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２（ただし、ｎは０に等しくない）、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＮ Ｈ２、−Ｏ（ＣＯ）Ｃｌ、−ＣＨＯ、−ＮＣＳまたは−ＮＣＯから選ばれた官能 基）に対応するハプテン。
  2. ２．ｎ＝１であり、Ｘが該式のピリジル環の第４−、５−または６−位にて結合 している請求項１に記載のハプテン。
  3. ３．ｎ＝１であり、ＸがＣ１〜Ｃ８アルキレン基である請求項１に記載のハプテ ン。
  4. ４．ｎ＝１であり、Ｘが−ＣＨ２ＣＨ２−である請求項１に記載のハプテン。
  5. ５．Ｘが−ＣＨ２ＣＨ２−である請求項２に記載のハプテン。
  6. ６．Ｑが−ＣＯＯＨである請求項５に記載のハプテン。
  7. ７．コチニンのイムノアッセイに用な実質的に光学的に純粋なハプテンに由来す る免疫原であって、式： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＶ）（式中、Ｘは該式（ＩＶ）のピリジ ル環に第２−、４−、５−または６−位にて共有結合により結合した直鎖または 分岐鎖、飽和または不飽和の２価ラジカル、該２価ラジカルは１〜１０の炭素原 子を有し、該２価ラジカルの鎖はＳ、ＯぉよびＮＺ（式中、ＺはＣ１〜Ｃ８アル キル基を表す）よりなる群から選ばれた１または２のヘテロ原子を任意に含有し ていてよい；ｎ＝１または０； Ｑ′ば−ＮＨＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨ＝ＣＨ−、−ＮＨ２＝Ｃ Ｈ−、−ＮＨＣＨ２−、−ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ−および−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−から 選ばれた２価ラジカル（ただし、Ｑ′が−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ Ｈ−または−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−である場合、ｎ＝１）；およびＡは抗原性付与 担体残基である）に対応する免疫原。
  8. ８．該抗原性付与担体残基Ａがポリ（アミノ酸）である請求項７に記載の免疫原 。
  9. ９．ｎ＝１であり；Ｘが該式のピリジル環に第４−、５−または６−位にて結合 したＣ１〜Ｃ８のアルキレン基であり；該２価ラジカルＱ′が−ＮＨＣ（Ｏ）− であり；該抗原性付与担体残基Ａがポリ（アミノ酸）である請求項７に記載の免 疫原。
  10. １０．Ｘが−ＣＨ２ＣＨ２−である請求項９に記載の免疫原。
  11. １１．該抗原性付与担体残基Ａがウシ血清アルブミンである請求項１０に記載の 免疫原。
  12. １２．コチニンのイムノアッセイに有用な実質的に光学的に純粋なハプテンに由 来する免疫原であって、式： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＶ）（式中、Ｘは該式（ＩＶ）のピリジ ル環に第２−、４−、５−または６−位にて共有結合により結合した直鎖または 分岐鎖、飽和または不飽和の２価ラジカル、該２価ラジカルは１〜１０の炭素原 子を有し、該２価ラジカルの鎖はＳ、ＯおよびＮＺ（式中、ＺはＣ１〜Ｃ３アル キル基を表す）よりなる群から選ばれた１または２のヘテロ原子を任意に含有し ていてよい；ｎ＝１または０； Ｑ′は−ＮＨＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨ＝ＣＨ−、−ＮＨ２＝Ｃ Ｈ−、−ＮＨＣＨ２−、−ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ−および−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−から 選ばれた２価ラジカル（ただし、Ｑ′が−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ Ｈ−または−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−である場合、ｎ＝１）；およびＡは抗原性付与 担体残基である）に対応する免疫原に対する応答において産生された抗体。
  13. １３．ｎ＝１であり；Ｘが該式のピリジル環に第４−、５−または６−位にて結 合したＣ１〜Ｃ８のアルキレン基であり；該２価ラジカルＱ′が−ＮＨＣ（Ｏ） −であり；該抗原性付与担体残基Ａがポリ（アミノ酸）である請求項１２に記載 の抗体。
  14. １４．Ｘが−ＣＨ２ＣＨ２−である請求項１３に記載の抗体。
  15. １５．Ｘが該式のピリジル環に第４−、５−または６−位にて結合している請求 項１４に記載の抗体。
  16. １６．該抗原性付与担体残基Ａがウシ血清アルブミンである請求項１５に記載の 抗体。
  17. １７．実質的に光学的に純粋な化合物に由来する蛍光トレーサーであって、コチ ニンのイムノアッセイに有用であり式：▲数式、化学式、表等があります▼（Ｖ ）（式中、Ｘは該式（Ｖ）のピリジル環に第２−、４−、５−または６−位にて 共有結合により結合した直鎖または分岐鎖、飽和または不飽和の２価ラジカル、 該２価ラジカルは１〜１０の炭素原子を有し、該２価ラジカルの鎖はＳ、Ｏおよ びＮＺ（式中、ＺはＣ１〜Ｃ３アルキル基を表す）よりなる群から選ばれた１ま たは２のヘテロ原子を任意に含有していてよい；ｎ＝１または０； Ｑ′は−ＮＨＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ−および− ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−から選ばれた２価ラジカル（ただし、Ｑ′が−ＯＣ（Ｏ）Ｎ Ｈ−、−ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ−または−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−である場合、ｎ＝１） ；およびＦは蛍光付与残基である）に対応する蛍光トレーサー。
  18. １８．ｎ＝１であり；Ｘが該式のピリジル環に第４−、５−または６−位にて結 合している請求項１７に記載の蛍光トレーサー。
  19. １９．ＸがＣ１〜Ｃ８のアルキレン基である請求項１８に記載の蛍光トレーサー 。
  20. ２０．Ｘが−ＣＨ２ＣＨ２−である請求項１９に記載の蛍光トレーサー。
  21. ２１．該蛍光付与残基がフルオレセインの１価残基またはフルオレセイン誘導体 の１価残基である請求項１７に記載の蛍光トレーサー。
  22. ２２．試料中のコチニンの存在または量を決定するための改良イムノアッセイで あって、該試料を免疫原に対する応答において産生された抗体と接触させる工程 を含むことを特徴とするイムノアッセイにおいて、免疫原として、実質的に光学 的に純粋なハプテンに由来する免疫原であって、式：▲数式、化学式、表等があ ります▼（ＩＶ）（式中、Ｘは該式のピリジル環に第２−、４−、５−または６ −位にて共有結合により結合した直鎖または分岐鎖、飽和または不飽和の２価ラ ジカル、該２価ラジカルは１〜１０の炭素原子を有し、該２価ラジカルの鎖はＳ 、ＯおよびＮＺ（式中、ＺはＣ１〜Ｃ３アルキル基を表す）よりなる群から選ば れた１または２のヘテロ原子を任意に含有していてよい； ｎ＝１または０； Ｑ′は−ＮＨＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨ＝ＣＨ−、−ＮＨ２＝Ｃ Ｈ−、−ＮＨＣＨ２−、−ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ−および−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−から 選ばれた２価ラジカル（ただし、Ｑ′が−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ Ｈ−または−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−である場合、ｎ＝１）；およびＡは抗原性付与 担体残基である）に対応する免疫原を利用することを特徴とするイムノアッセイ 。
  23. ２３．試料中のコチニンの存在または量を決定するための蛍光偏光イムノアッセ イであって、該試料を実質的に光学的に純粋なハプテンに由来する免疫原に対す る応答において産生された抗体と接触させる工程を含むことを特徴とし、該免疫 原が、式： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＶ）（式中、Ｘは該式のピリジル環に第 ２−、４−、５−または６−位にて共有結合により結合した直鎖または分岐鎖、 飽和または不飽和の２価ラジカル、該２価ラジカルは１〜１０の炭素原子を有し 、該２価ラジカルの鎖はＳ、ＯおよびＮＺ（式中、ＺはＣ１〜Ｃ３アルキル基を 表す）よりなる群から選ばれた１または２のヘテロ原子を任意に含有していてよ い； ｎ＝１または０； Ｑ′は−ＮＨＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨ＝ＣＨ−、−ＮＨ２＝Ｃ Ｈ−、−ＮＨＣＨ２−、−ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ−および−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−から 選ばれた２価ラジカル（ただし、Ｑ′が−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ Ｈ−または−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−である場合、ｎ＝１）；およびＡは抗原性付与 担体残基である）に対応することを特徴とする蛍光偏光イムノアッセイ。
  24. ２４．該試料を実質的に光学的に純粋な化合物に由来する蛍光トレーサーであっ て、式： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｖ）（式中、Ｘは該式（Ｖ）のピリジル環 に第２−、４−、５−または６−位にて共有結合により結合した直鎖または分岐 鎖、飽和または不飽和の２価ラジカル、該２価ラジカルは１〜１０の炭素原子を 有し、該２価ラジカルの鎖はＳ、ＯおよびＮＺ（式中、ＺはＣ１〜Ｃ３アルキル 基を表す）よりなる群から選ばれた１または２のヘテロ原子を任意に含有してい てよい；ｎ＝１または０； Ｑ′は−ＮＨＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ−および− ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−から選ばれた２価ラジカル（ただし、Ｑ′が−ＯＣ（Ｏ）Ｎ Ｈ−、−ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ−または−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−である場合、ｎ＝１） ；およびＦは蛍光付与残基である）に対応する蛍光トレーサーと接触させる工程 を含む請求項２３に記載の蛍光偏光イムノアッセイ。
  25. ２５．該蛍光付与残基がフルオレセインの１価残基またはフルオレセイン誘導体 の１価残基である請求項２４に記載の蛍光偏光イムノアッセイ。
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