JPH06501008A - オリゴ糖あるいはオリゴ糖抗原または抗体による転移能および侵襲性の抑制 - Google Patents
オリゴ糖あるいはオリゴ糖抗原または抗体による転移能および侵襲性の抑制Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
オリゴ糖あるいはオリゴ糖抗原または
抗体による転移能および侵襲性の抑制
技術分野
本発明は、一般的には、腫瘍細胞の転移および侵襲性の抑制、より詳細には、腫
瘍関連炭水化物抗原(tumor−ass。
ciated carbohydrate antigens)およびそれらの
オリゴ糖誘導体を包含する薬物の使用による前記抑制に関するもの莫大な資金お
よび人的資源の投入にもかがわらず、癌は依然として、主たる死因の一つである
。現行の癌治療では、悪性腫瘍を生じた患者の約50%しか治癒しない。ヒトで
の殆どの悪性腫瘍において、転移が主たる死因である。
転移は、遠隔部位における二次腫瘍コロニーの形成である。それは多段階プロセ
スで、その第一段階が腫瘍の侵襲である。腫瘍細胞が、上皮基底膜などの宿主組
織バリアーを局所的に侵襲し、間質に達し、そこから血管(またはリンパ管)に
入り、さらに散在する。血管壁の上皮層に侵入したのち、循環腫瘍細胞は血流内
へ移行し、内皮細胞管腔表面あるいは露出基底膜に接着することにより、標的器
官の前毛細血管細静脈に捉えられる。腫瘍細胞は再び血管壁に侵入して、臓器実
質に入る。結局、管外に遊出した腫瘍細胞が、それが生じたところとは異なる組
織で増殖する。
殆どのヒト悪性腫瘍では、遠隔転移は、−次腫瘍を治療している頃には、余りに
も小さくて、検出できないことが多い。さらに、広範囲に及ぶ転移コロニーのイ
ニシェーションは、転移性疾患の臨床症状が明瞭になるよりも前に起るのが普通
である。転移がサイズおよび年齢(age)で変動すること、転移の解剖学的部
位が散在すること、およびそれらの構成が雑多であることは、いずれも、手術に
よる除去を妨げ、転移コロニーへ送達されうる抗癌剤の濃度を限られたものとす
る因子である。
転移の治療および予防への現在のアプローチにおけるそれらの難点のため、当該
分野では、腫瘍細胞の転移能を抑制するための改良された方法および組成物がめ
られている。本発明はこの要求を満たし、さらに他の関連した利点を提供するも
のである。
発明の要約
要約すれば、本発明は、腫瘍細胞の転移能および侵襲性を抑制するための種々の
試薬(agent)および方法を提供する。本発明の一面では、生体試料(bi
ological preparation)内で腫瘍細胞の転移能を抑制する
方法が提供される。
その方法は、生体試料を、(a)鑑別診断上意義(differntial
prognostic 51gn1ficance)のある腫瘍関連炭水化物抗
原、(b)これらの抗原に特異的に結合する抗体、(C)これ゛ら抗原のオリゴ
糖成分、および(d)これらの抗原またはオリゴ糖の複合体(conjugat
e )からなる群より選ばれた少なくとも一種の試薬とインキュベートすること
からなり、この試薬は該試料の転移能を抑制するものである。好適な生体試料と
しては、細胞培養物および生体液が挙げられる。
本発明は、他の一面で、温血動物において腫瘍細胞の転移能を抑制する薬物の製
造に使用するための試薬を提供する。該試薬は、(a)鑑別診断上意義のある腫
瘍関連炭水化物抗原、(b)これらの抗原に特異的に結合する抗体、(C)これ
ら抗原のオリゴ糖成分および(d)これら抗原またはオリゴ糖の複合体からなる
群より選択され、該試薬は腫瘍細胞の転移能を抑制し得る。
関連した一面では、本発明は、オリゴ糖の生体内寿命を延長するのに有用な種々
の糖質複合体(glycoconjugate)を提供する。該複合体は、ポリ
(エチレングリコール)と結合したオリゴ糖を含む。
本発明において使用するためのその他のオリゴ糖としては、ラクトース、ラクト
−N−テトロース、メチルβ−りげられる。オリゴ糖類は、個々に用いても、互
いに組合わせて用いてもよい。
本発明のこれらおよびその他の面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照
すれば、明らかになるであろう。
図面の簡単な説明
図1は、その腫瘍中で一定の(defined)腫瘍関連炭水化物抗原(TAC
A)を発現するまたは発現しない癌患者の生存率をグラフによって示す。パネル
Aは、MAb MIA−15−5によってめた肺偏平上皮癌におけるH/Ley
/Le5抗原の発現を表す。パネルBは、結腸癌におけるシアロシル−L eX
(sialosyl−L eX)の発現を表す。パネルCは、結腸癌におけるシ
アロシル−Tnの発現を表す。パネルDは、卵巣癌患者の血清中のシアロシル−
Tnレベルを表す。
図2は、BL6細胞の肺コロニー沈着物(lung colonydeposi
t)の数および大きさに及ぼすメチルβ一旦−ラクトシトまたはフェニルβ−D
−チオラクトシトの効果をグラフによって示す。BL6を、対照培地、0.1M
メチルβ−D−ラクトシト(rMe−β−ラクトシト」)または0.1Mフェニ
ルβ一旦−チオラクトシト(rphe−β−8−ラクトシト」)とともにブレイ
ンキュベートした。2X104個の細胞を、C57/B Lマウスに静脈内注射
した。
21日目に肺コロニー数をめ、各カラムに示したように、コロニーを直径に基づ
いて分類した(>1mm対<1mm)。コロニー数は肺片側当りで表した。実験
数(n)は括弧内に示した。
図3は、BL6細胞の肺コロニー沈着物の数および大きさに及ぼすメチルβ一旦
−ラクトシト前投与の効果をグラフによって示す。メチルβ一旦一ラクトシド(
用量1m1)をC57/B Lマウスに腹腔的注射した。10分後、816メラ
ノーマ細胞を静脈内注射した。19日目に肺コロニーを計数し、大きさを調べた
。A群は対照動物(メチルβ−ローラクトシト無投与)を、B群および0群は、
それぞれ0.25Mおよび0.5Mメチルβ−D−ラクトシトを注射した動物を
表す。各群について、カラム1はコロニーの総数を、カラム2は直径>1mmの
コロニーの数を、カラム3は直径<1mmのコロニーの数をそれぞれ表す。実験
数はnとして表しである。
図4は、メチル(Me)−β−ラクトシトの転移抑制効果をグラフによって示す
。腫瘍細胞を静脈内注射し、続いて対照PBS (A);0.25M Me−β
−ラクトシト(B);0.5M Me−β−ラクトシト(C);0.5Mラクト
ース(D);0.25M N−アセチルラクトサミン(E);または0.5M
Me−β−ガラクトシド(E)を腹腔内注射した。
図5は、LacCerへのメラノーマ細胞の接着がGM3−LacCer相互作
用に基づくことをグラフによって示す。転移能の順序は、BL6>FIO>Fl
>>WA4である。パネルAは、LacCer被覆固相へのメラノーマ細胞接着
の順序を示す。パネルBは、LacCer/フィブロネクチン(FN)共被覆固
相へのメラノーマ細胞接着の順序を示す。パネルCは、インテグリン依存性接着
(integrin−dependent adhesion )を示す。
図6は、LacCer (パネルA)および内皮細胞(HUVEC)(パネルB
)へのメラノーマ細胞(BL6)の接着がLacCerおよびGM3によって抑
制されることをグラフによって示す。
図7は、H−LeyおよびH−H相互作用をグラフによって示す。パネルAは、
種々の糖脂質に結合するH1リポソームを示す。パネルBは、種々の糖脂質に結
合するLeYリポソームを示す。
発明の詳細な説明
上述のように、本発明は、腫瘍細胞の転移能および侵襲性を抑制するための試薬
および方法に向けられている。多くの腫瘍細胞が転移能、すなわち、遠隔の部位
で二次腫瘍コロニーを形成する能力を有している。悪性腫瘍細胞源としては、メ
ラノーマ、肺癌、乳癌、結腸直腸癌、ならびに膀胱癌、前立腺癌などの泌尿生殖
器癌がある。本発明においては、腫瘍細胞の転移能は、(a)腫瘍関連炭水化物
抗原(T A CA)、(b)これらのTACAに対する抗体、(C)これらT
ACAのオリゴ糖成分または(d)かかるTACAの複合体、たとえば、リシル
リシンの多価複合体、TACAを担持するグリコスフィンゴリピド(GSL)リ
ポソームなどの使用によって抑制(すなわち、腫瘍細胞が転移する能力を抑制)
することができる。
TACAエピトープは、内皮細胞、血小板および基底膜との相互作用を通して、
腫瘍細胞との接着において重要な役割を演じ、それによって腫瘍の転移、侵入が
起りうる。
接着の機構は、炭水化物(CHO)−CHO相互作用、CHO−レクチン相互作
用またはセレクチンファミリー相互作用に基づいている可能性がある。活性化内
皮細胞または血小板への種々の腫瘍細胞の接着は、主として、Leccamまた
はセレクチンスーパーファミリー(たとえばELAM−1、GMP−140)が
媒介する。タイプl鎖シアロシル−Le(SA−Le)を発現するが、シアロシ
ル−Le(SA−Le)は発現しないCo1o205腫瘍細胞は、内皮細胞に接
着する。この接着は、抗SA−LeaMAbにより抑制されたが、5A−Le
MAbによっては抑制されなかった。これらの知見は、5A−Le8だけでなく
5A−Le もまたELAM−1およびGMP−140によって認識される重要
なリガンドであることを、示唆している。
本発明においては、腫瘍の転移および侵襲を、腫瘍細胞の接着をブロックするこ
とにより抑制し、それによって転移性細胞の拡散は有意に減少し、または排除す
る。本発明で使用するのに適したTACAは、鑑別診断上意義のあるもの(すな
わち、侵襲能または転移能と明らかに関係している可能性のあるTACA)であ
る。本発明でいうかかるTACAは、類似の腫瘍の侵襲性、転移および臨床予後
について、かかるTACAの発現を示すものと示さないものとを比較することに
より見分けることができる。本発明において使用するのに好ましいTACAとし
ては、H/Leb 。
y/Le 1ンアロシル−Le (SA−Le )、シアロシル−Le(SA−
Le)およびシアロシル−Tn(SA−Tn)が挙げられる。かかるTACAの
誘導体としては、Le 二量体、シアロシル−Le 二量体(sialosyl
−dimeric L e )およびトリ7−yシルL e (trifusc
osyl L e )が挙げられる。
シアロシル−Le (構造1)、シアロシル−Le −量体(構造2)、Le
二量体(dimeric Le ) (構造3)、トリフコシルL e (tr
ifucosyl L e ) (構造4)、Leb (構造5) 、H(構造
5)、5A−Lea(構造7)、5A−Tn(構造8)およびGM3 (構造9
)の各構造を以下に示す。
構造1:
構造2:
構造3:
構造4:
構造5:
構造6:
Fuayl−2Galj1−3G1cNAiJ1−3GalJ1−R構造7:
ua11
構造8:
NeLLIIvl!!2−6GaJNAcal−αSer/Thr構造9:
NeuAca2−30al!j1−40Icj1−Cer上述の通り、本発明で
使用するためのTACAは、鑑別診断上の意義を示す。たとえば、かかる鑑別診
断上の意義は、H/ L e / L e b抗原(MAb MIA−15−5
によって特定される)を発現する腫瘍が、これら抗原を発現しない腫瘍よりもず
っと悪い患者予後を示したという事 ′実によって、説明できる。たとえば、図
IAに示したように、H/Ley/Le5を発現する肺細胞偏平上皮癌患者の5
年間生存率は11%でしかなかった(すなわち、89%が死亡した)が、H/L
ey/Lebを発現しない比較可能な患者の5年間生存率はおよそ62%であっ
た。5A−Le および5A−Tn抗原の発現を示す腫瘍対示さない腫瘍の場合
にも、類似の結果が得られた。より明確には、図IBに示したように、5A−L
e を発現する結腸癌の患者では、5年間生存率は15%に過ぎなかったが、こ
の抗原を発現しない比較可能な患者では、約50%がこの期間を超えて生存した
。別の研究では、5A−Tnを発現しない初期結腸癌の患者での5年間生存率は
100%であったが、これに対して、5A−Tnを発現する患者では、75%で
あった(図IC参照)。図IDに示すように、5A−Tn抗原を発現するおよび
発現しない卵巣癌患者の間で、同様の、しかしより明瞭な差が観察された。
上述のように、適当なTACAに対する抗体も、本発明において採用し得る。こ
こでいうそのような抗体には、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体が
包含され、それらは、完全分子であっても、かかる分子の断片であっでも、ある
いはそれらの機能上の均等物であってもよい。
該抗体は、遺伝子工学によるものであってもよい。抗体断片の例としては、F
(ab’ ) 、Fab’ 、FabおよびFvが挙げられる。
簡潔に説明すれば、ポリクローナル抗体は、動物を免疫し、その後その血清を採
取することにより製造できる。免疫は、たとえば、ウサギ、ラットまたはマウス
への全身的投与、たとえば皮下、牌内または筋肉的注射によって行う。
通常、初回免疫に続いて、血清採取前に一回以上の追加抗原(booster
)免疫を行うことが好ましい。かかる方法は周知であり、多くの文献に記載され
ている。
本発明では、ポリクローナル抗体を用いてもよいが、モノクローナル抗体(MA
b)の方が好ましい。本発明における好適なMAbとしては、マウスまたはヒト
起源のもの、あるいはヒトおよびマウス抗体の両者の部分部分を結合したちの(
すなわち、マウス抗体の抗原結合領域(antigenbinding reg
ion)プラス ヒト抗体の定常領域(constantregion ) )
などのキメラ抗体が挙げられる。ヒト抗体およびキメラ抗体は、当業者に既知の
諸方法によって製造できる。ヒト抗体およびヒト−マウスキメラ抗体は、臨床投
与時に、マウス抗体に比して抗−抗体を生成させ難いため、有利である。
MAbは、通常、ケーラー(Kohler)およびミルスティン(Milste
in)の方法(Nature 256:495−497.1975;Eur、J
、Immunol、 6:511−519.1976)ならびに彼らの初期の方
法を改良した種々の技法(バーロウ(Harlot)およびレインド・スプリン
グ・ハーバ−・ラボラトリ−(Cold SpringHarbor Labo
ratory ) 、1988年、これの全体をここに引用して挿入する)によ
って製造できる。簡潔に述べれば、TACA類またはそれらのオリゴ糖成分の一
つで免疫した動物のリンパ節および/または膵臓をミエローマ(myeloma
)細胞と融合させてハイブリッド細胞系(「ハイブリドーマ」または「クローン
」)を形成させる。各ハイブリドーマは、単一タイプの免疫グロブリンを分泌し
、ミエローマ細胞と同様に、無限に細胞分裂する能力を有する。かかる分子をキ
ャリアーに結合させて、それらの免疫原性を高めることが望ましい場合もある。
好適なキャリアーとしては、キーホール・リンペット・ヘモシアニン(keyh
ole limpet hemocyanin ) 、チログロブリン(thy
roglobulin)、ウシ血清アルブミン、およびこれらの誘導体が挙げら
れる。
ハイブリドーマを介するMAbの製造の別法として、バクテリオファージおよび
細菌を用いてMAb発現ライブラリーを創作する方法がある(たとえば、サスト
リーら、Proc、Natl、Acad、Sci、USA 86:5728.1
989;ヒユーズら、5cience 246:1275.1989参照)。適
当な特異性を示す抗体の選択は、当業者には自明であろう種々の方法によって実
施できる。
本発明で使用するのに適したMAbの代表的な例としては、MIA−15−5(
ミャケおよびハコモリ、Biochem、 30:3328.1991)ならび
にハコモリ、Advances In Cancer Re5earch 52
:257−331.1989に引用されているMAb類が挙げられる。
上述のように、適当なTACAのオリゴ糖成分も本発明で使用できる。ここに言
う「オリゴ糖」という用語は、天然から導かれたオリゴ糖類、合成されたオリゴ
糖類、ならびにTACAオリゴ糖成分の部分を含むこれらの誘導体が包含される
。
本発明において有用なその他のオリゴ糖としては、ラクトースならびにメチルβ
一旦−ラクトシト、ラクト−N−シトロース(Galβ1−=3GlcNAcβ
1−3Galβ1→4G1c)およびフェニルβ−D−チオラクトシトなどのラ
クトース誘導体が挙げられる。他のラクトース誘導体、たとえばエチルまたはフ
ェニルラクトシト、メチルまたはエチルチオラクトシトも使用できる。
特定腫瘍の細胞の転移能を抑制するのに適したその他のオリゴ糖類は、腫瘍の転
移能に関係する特定の炭水化物鎖の構造決定に基づいて同定することができる。
腫瘍の転移能に関係する炭水化物含有分子の同定は、グリコシダーゼ類およびグ
リコジルトランスフェラーゼ阻害剤の使用による方法を含めて、種々の方法で実
施できる。脂質または蛋白質に結合した炭水化物の構造は、分解、電子衝撃直接
プローブ(EI)および高速原子ボンバードメント(FAB)を含めたマススペ
クトル、およびメチル化分析(それぞれ、たとえば、ヌーデルマンら、J、Bi
ol、Chem。
261:5487−5495.1986に記載の手法)に基づいて測定すること
ができる。分解分析は、化学的におよび/または酵素的に、たとえばグリコシダ
ーゼにより実施できる。分解分析により示唆された炭水化物配列は、メチル化分
析(ハコモリ、J、Biochem、 55:205−208.1964)とそ
れに続くパーメチル化糖の化学イオン化マススペクトル(ステルナ−ら、Arc
h。
Biochem、Biophys、 155:464−472.1974:レヴ
工り−ら、Meth、Enzym。
1、138:13−25.1987)によって決定できる。別法として、あるい
はこれらの手法と共に、ノ々−メチル化グリカンについて、またζシそのままの
グリカンの適宜の分解の後、EI質量分析(EI mass spectrom
etry)を行ッテもよい(カンナギら、J、Biol、Chem、251.1
988)。炭水化物配列の均一性は、そのままのまたはメチル化されたグリカン
のプロトンNMRおよびFABマススペクトルを含めて、種々の化学的および物
理的基準に基づいて証明できる。いったん炭水化物配列が決定されれば、腫瘍細
胞の転移能を抑制するのに適したオリゴ糖を選択することは、当業者にとっては
自明であろう。
上に簡潔に述べたように、適当なTACAまたはそれらのオリゴ糖成分の複合体
、たとえばリシルリシンとの多価複合体やTACA担持グリコスフィンゴリピド
(GSL)リポソームも、本発明において使用できる。
複合体の成分は互いに、直接またはリンカ−基(1inkergroup)を介
して、共有結合していてもよい。各成分が互いに反応しうる置換基を有している
ときには、それら成分の間での直接反応が可能である。たとえば、一方の成分に
あるアミノ基またはスルフヒドリル基などの核性の基は、他方にあるカルボニル
含有基、たとえば無水物や酸ハロゲン化物と、あるいは良好な脱離基、たとえば
ハロゲンを含有するアルキル基と反応できるであろう。
リンカ−基を介して複数成分を共有結合させることが望ましいこともある。種々
の二官能性または多官能性試薬、ホモ官能性およびヘテロ官能性の両方(たとえ
ばピアス・ケミカル社のカタログ、ロックフォード、イリノイに記載のもの)を
リンカ−基として用いうろことは、当業者にとっては明らかであろう。リンカ−
基は、置換基の化学反応性を高め、か(して結合(カップリング)効率を高める
のに役立ちうる。化学反応性の向上は、さもなければ可能ではなかったであろう
成分上の官能基の使用を容易にすることもできるであろう。たとえば、カルボキ
シル基を活性化できる。カルボキシル基の活性化としては、スクシンイミジルエ
ステルなどの「活性エステル」の形成が挙げられる。
「活性エステル」なる語が請求核置換反応において高度に反応性のエステル類を
指すことは既知のことである。
また、非共有結合によって成分が結合されている複合体を製造することが望まし
い場合もある。たとえば、一種または二種以上のTACAをGSLリポソームの
外表面に、先に述べたのと同様にして導入することができる(エツゲンスら、J
、Biol、Chem、 264:9476−9484.1989;バラツリと
コルン、Biochim。
Bio h s、Acta 298:1015−1019゜1973 ;ツカと
パパハジョプーロス、Proc、Natl、Acad、Sci、USA ヱ5
: 4194−4198.1978)。
オリゴ糖の生体内寿命を増すことが望ましい場合もある。
本発明において開示したように、オリゴ糖類を、ポリ(エチレングリコール)な
どの直鎖両親媒性ポリマーに結合(すなわち共有結合)させることができる。オ
リゴ糖−ポリ(エチレングリコール)複合体を製造する方法の代表的な例は、オ
リゴ糖をスクシンイミジル基を持つように誘導したのち、末端アミノ基を持つポ
リ(エチレングリコール)と反応させるものである。後者の化合物は、一般式N
H2−(CH2CH2−0) n−CH3によって表される。式中、nは、一
般的には、平均44.7(すなわち分子量約2.000)ないし112.9(す
なわち分子量約5. 000)である。
腫瘍細胞の転移能の抑制には、生体外(fn vitro)および生体内(in
vivo)での種々の用途、たとえば分離した腫瘍細胞あるいは腫瘍をもつ宿
主の処置という用途がある。
生体外について言えば、上に述べたように、本発明は、生体試料内で腫瘍細胞の
転移能を抑制する方法を提供する。
該方法は、生体試料を、(a)鑑別診断上意義のある腫瘍関連炭水化物抗原、(
b)これらの抗原に特異的に結合する抗体、(C)これら抗原のオリゴ糖成分お
よび(d)こ、 れら抗原またはオリゴ糖の複合体からなる群より選択した少な
くとも一種の試薬とインキュベートすることを含み、該試薬は、該試料の転移能
を抑制する。好適な生体試料としては、血液、尿、リンパ液、滑液、脳を髄液な
どの体液中の細胞培養物および細胞懸濁液が挙げられる。T A CA。
オリゴ糖、またはそれらの複合体は、通常、最終濃度的0゜1〜LM、一般には
約0.2〜0.5Mで、インキュベートする。インキュベーションは、一般に、
37℃で5〜15分間行う。生体試料処理後、該試料は、たとえば転移能抑制効
果確認のため、動物に注射または移植することができる。
本発明は、ヒトなどの温血動物において腫瘍細胞の転移能を抑制するための薬物
および方法における前記試薬の使用法をも提供する。(a)鑑別診断上意義のあ
る腫瘍関連炭水化物抗原、(b)これらの抗原に特異的に結合する抗体、(c)
これら抗原のオリゴ糖成分および(d)これら抗原またはオリゴ糖の複合体から
なる群より該試料の転移能を抑制する試薬を一種または二種以上選択する。TA
CA1オリゴ糖、またはそれらの複合体は、通常、約0.1〜LM、一般には約
0. 2〜0.5Mの濃度で投与する。
ある特定の物質について、たとえばヒト以外の動物における生体外および生体内
での研究に基づいて、最適有効量を定める方法は、当業者にとっては明らかであ
ろう。覆々の投与経路を用いうる。一般に、投与は、静脈内にまたは体腔内、た
とえば胸腔内または腹腔内に、あるいは切除腫瘍の層(bed)内に行う。上述
のごときTACA、Ab、オリゴ糖あるいはそれらの誘導体は、生理食塩水など
の薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせて投与してよい。さらに、
かかる物質は、免疫療法剤または化学療法剤と組み合わせて投与してもよい。か
かる物質および薬物の組み合わせが望まれる場合には、各々の化合物を順次に投
与しても、同時に投与しても、あるいは組み合わせて、単一の組成物として投与
してもよい。CATスキャンなどの診断手法を、投与の前後に実施して、転移能
抑制効果を確認することができる。
以下の実施例は、説明のために示すものであって、限定を意味するものではない
。
実 施 例
実施例1 ラクトース誘導体の合成
ヘプタアセチルラクトシルイミデート(ツインメルマンら、J、Carbohy
dr、Chem、 ヱ:435゜1988)を、標準的操作法(グルンドラーと
シュミット、Liebigs Ann、Chem、 1984:1826.19
84)に従って、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネートを含有する
乾燥ジクロロメタン中で、メタノールと反応させた。シリカゲルカラムクロマト
グラフィー(トルエン/EtOAc に1)により精製し、0.01Mナトリウ
ムメトキシドで脱−〇−アセチル化すると、メチルβ−D−ラクトシトが、イミ
デートから68%の収率で得られた:融点211−212℃(文献値205℃、
スミスとヴアン・クレーヴ工、J、Am、Chem。
Soc、 77 二 3159. 1955) ; [α] +1゜−−D
3° (旦 6,9、H20) (文献値;+1°、旦 5゜0、H2O1同上
文献)。
B、フェニルβ−D−チオラクトシト
ラクトース・オクタアセテート(ハドソンとクンツ、J。
Am、Chem、Soc、 47:2052.1926)を、ジクロロメタン中
0℃で、チオフェノールおよび5nC14で処理しくニコラウら、工し工2」エ
エChem、一旦」−生成物をM e OH中N a OM eで脱アセチル化
し、アンノく一リスト(^mberlyst)R15で中和した。生成物を、水
を溶離剤として用い、バイオゲル(BioGel) P−2カラムで精製し、続
いて糖含有画分を凍結乾燥すると、フェニルβ−D−チオラクトシトが、白色無
定形粉末として残った。
C8ラクト−N−テトロース
このオリゴ糖(Galβ1−−3G1cNAcβ1→3Ga1β1→4Glc)
は、人乳から、エタノールでの前処理および水を溶離剤としてのバイオゲルP−
2循環カラムクロマトグラフィーと、続いての水を用いての逆相(C18)高速
液体クロマトグラフィー(デユアとブ・νシュ、Anal、Biochem、
133:1,1983)によって調製した。’H−NMRスペクトルは、基準試
料(authentic sample) (バイオカーブ・ケミカルズ、ルン
ド、スウェーデン(BioCarb Chemicals、 Lund、 Sw
eden ) )のそれと重なった。
D、β−D−ラクトシトのポリ(エチレングリコール)誘導体
反応式は下記の通りである:
+ れz−(c只、ca2−o7. CM3体は、容易に入手できる3−スクシ
ンイミドオキシカルボと末端アミノ基を有する(ザリプスキーら、Eur、P。
lym、J、よ旦:1177.1983)ポリ(エチレングリコール)メチルエ
ーテル(平均分子量2000 、アル)と2 (163mg、0.082ミリモ
ル)とを、乾燥量処理すると、アセトンを溶離剤としたLH−20でのクロマト
グラフィーの後に、β一旦−ラクトシドヘプタアセM水酸化ナトリウムにより室
温で1時間かけて鹸化し、凍結乾燥すると、所望のラクトシドエが、定量的に得
られた:トースおよびラクトース誘導体の作用
A、 細胞および動物
B16メラノーマ細胞系の高度に転移性のクローンBL6は、もともと、ジーン
・スターキー博士(モンタナ州立大、ボウズマン、モンタナ)から入手したもの
である。同系のC57/B Lマウスを用いて、クローンを、それらの転移能に
従って、再選択した。C57/B Lマウスを、濾過空気雰囲気下に、プラスチ
ックケージに入れておき、水およびペレット飼料を自由に摂取させた。2mMグ
ルタミンおよび10%ウシ胎児血清(F CS)を加えたRPM11640中で
細胞を培養し、2mM EDTA含有燐酸緩衝食塩水(P B S)を用いて剥
離した。トリパンブルー排除試験(trypan blue exclusio
n test)で生存能力(viability )を試験した。
B、 転移能に対するオリゴ糖類の作用BL6細胞懸濁液(RPMI 1640
培地1ml当り1−3×106個の細胞)を調製し、アリコート(aliqu。
t)を、種々濃度の各種オリゴ糖の存在下または不存在下に、37℃で5−10
分間インキュベートした。インキュベーション後、たとえば、200μl当り3
X 104または2×104個の細胞を(オリゴ糖による前処理を行ったのち
または行わずに)8週令の雌性マウスの尾静脈に注射した。18−21日後に、
マウスを殺し、肺をPBS(pH7,4)中の10%ホルムアルデヒドによって
固定し、解剖顕微鏡下に腫瘍細胞コロニーを計数し、これらの条件下での肺にお
ける転移性メラノーマコロニー数の背景値(background value
)を得た。コロニーの数および大きさに関するデータは、分散分析(ANOVA
)法によって統計学的に処理した。直径1mm以上のコロニーを大型、直径1m
m未満のものを小型とした。
1つの実験では、BL6細胞を、種々濃度のラクトース、ラクト−N−テトo−
ス(Galβ1−3G1cNAcβ1−3Galβ1−4Glc)、メチルβ−
D−ラクトシトまたはフェニルβ−D−チオラクトシトと共に、種々の時間にわ
たってインキュベートした。大部分の実験では、0.1Mの濃度を用い、細胞を
37℃で10分間インキュベートし、400Xgで10分間の緩和な遠心分離に
よって糖含有培地から分離し、RPMI 1640に再懸濁し、尾静脈に注射し
た(懸濁液0.2ml中に3X104信の細胞)。いくつかの実験では、2 X
104個の細胞を注射し、21日後にコロニーを計数した。覆々の糖溶液中で
インキュベートした後のBL6細胞の生存力(viability)および細胞
成長能をトリパンブルー排除試験によって試験し、生体外の標準条件下にRPM
I 1640中で平板培養することにより、また退会を合わせた(age−ma
tched)C57/BLマウスに皮下接種することにより、試験して、腫瘍の
増殖を調べた。
ラクトースおよびラクト−N−テトロースは、BL6細胞をこれらの糖類と共に
ブレインキュベートしたのち、同一条件下に細胞を静脈内注射したとき、肺にお
ける転移性コロニーを、それぞれ26%および36%減少させた。上と同じ条件
下で0.1M、0.OIMまたは0.005Mのメチルβ−D−ラクトシトでB
L6細胞を処理すると、対照(control)と比較して、転移性腺コロニー
数を(それぞれ)43%、16%、および8%減少した。0.1Mのメチルβ−
D−ラクトシトが惹起した有意の減少は、別々の3回の実験で再現され、減少率
は、終始一貫して、35%と45%の間であることが判明した。
第二の、完全に独立した一連の実験で、異なる条件下でメチルβ一旦一ラクトシ
ドまたはフェニル−β一旦一チオラクトシドで処理した場合にも、転移コロニー
形成が有意に減少した。すなわち、メチルβ−且−ラクトシトまたはフェニルβ
−且−チオラクトシトと共にブレインキュベーションしたのちの総コロニー数は
それぞれ対照値の35%または50%に減少した。全ての実験において、大型コ
ロニーの減少が、小型コロニーの減少よりもより明瞭で、とくに、フェニルβ−
D−チオラクトシトでそうである(図2)。メチル−β−D−ラクトシトおよび
フェニル−β−D−チオラクトシトは共に、細胞数の増加およびチミジンの取り
込みに対して僅かな生体外刺激効果を示す。すなわち、腫瘍沈着に対する抑制作
用は、生体外および生体内における細胞成長に対する作用とは関係しない。
別の実験では、メラノーマ細胞の転移に対するメチルβ−D−ラクトシトの影響
を、該オリゴ糖を投与し、腫瘍細胞とインキュベートした後に調べた。すなわち
、メチル−β−D−ラクトシト(濃度0.25Mまたは0.5M)の1ml量を
マウスに腹腔的注射した。10分後、B16メラノーマ細胞を静脈内注射した。
19日後に、肺コロニーを計数した。腫瘍細胞接種に先立つメチルβ一旦一ラク
トシドの注射により、肺での転移コロニー形成が有意に減少した(図3)。
さらに、メチル−β−ラクトシトの転移抑制効果に関する観察を、別のメチル−
β−ラクトシト注射法にまで拡張した;すなわち、腫瘍細胞を静脈内注射したの
ち、メチル−β−ラクトシトを腹腔的注射した。これらの実験で、0゜250.
5Mメチル−β−ラクトシトの注射は、肺の転移コロニー数を40%−70%減
少させた(図4参照:A=PBS対照、B=0.25M Me−β−ラクトシト
;C=0.5M Me−β−ラクトシト;D=0.5M ラクトース;E=0.
25M N−アセチルラクトサミン;F=0.5M Me−β−ガラクトシド;
腹腔的注射)。
他の実験で、転移能の程度を異にするマウスメラノーマB16の諸変異体(va
riant) (B L 6/ F 10/F 1/WA4)は、先にメラノー
マ関連抗原であると同定されている(ヒラバヤシら、J、Biol、Chem、
260:13328.1985;ノアズら、J、Immunol。
139 : 3171,1987)GM3ガングリオシドの発現を同じ順序を示
した。GM3は、内皮細胞表面で高度に発現されるLacCerと相互作用する
。LacCer被覆固相または内皮細胞へのB16変異体の接着の順序も、それ
らの転移能の順序と同じであった。これに対し、816変異体のインテグリン依
存性接着は、BI6、FloおよびFlとほぼ同じであった(図5参照)。これ
らの観察は、LacCerのBI3接着が分子的GM3−LacCer相互作用
に基づくことを示唆する。内皮細胞への816メラノーマの接着が、メチル−β
−ラクトシトによってだけでな(、LacCerリポソーム、Gg3Ce rリ
ポソームおよびGM3リポソームによっても阻害されることも、証明された(図
6参照)。
実施例3 ヒト肺腺癌細胞系でのシアロシル−Le −量体の発現と転移能
A、 細胞系
KUM−LK−2は、ヌードマウスにおいて自然肺転移を生じることが明らかに
されているヒト非腺癌細胞系である。35のヒト癌細胞系をヌードマウスでスク
リーニングしたが、この細胞系のみが、ヌードマウスの肺で転移沈着物(met
astatic deposit)を生じた。KUM−LK−2を親細胞系とし
て用いて、限界希釈法(limiting dilutiontechniqu
e)により、IV注射で肺転移を生じる亜細胞系(sub−cell 1ine
)を得た。
限界希釈法の操作法は次の通りであった。KUM−LK−2を、10%FC8(
ハイクローン、ローガン、ユタ(Hyclone、 Logan 、UT) )
を加えたRPMI 1640培地(ギブコ、グランド・アイランド、ニューヨー
ク(GIBCO,Grand l5land、 NY ) )中、37℃で、5
%CO2/95%空気雰囲気下に培養した。細胞を2mM EDTA溶液で簡単
に処理し、RPMI 1640で2回洗浄して、10%FC8含有RPMI中の
単細胞懸濁液を調製した。
細胞の生存率は、トリパンブルー排除染色によりめたところ、〉98%であった
。100μ!当り1個の細胞を含有する細胞懸濁液を96ウエルのマイクロタイ
タープレート(コーニング・グラス・ワークス、コーニング、ニューヨーク(C
orning Glass Works、 Corning、 NY) )の各
ウェルに移し、24時間連続培養した。ついで、各ウェルを、位相差顕微鏡で調
べた。
安定した細胞形態を根拠に、限界希釈法によって得られた25クローンの中から
、転移能(rMPJ )を異にする3細胞系(HAL−8、HAL−24および
HAL−33)を選択した。それらの25クローンは、もともと、安定した形態
および連続した生体外細胞成長を示す63クローンから選んだものである。これ
らのクローンはすべて、自然肺転移を生じた。しかし、IV注射したときには、
肺転移沈着物形成において、クローン間に明瞭な差が認められた。
MPの高い2クローン、MPの低い5クローンおよびMPを示さない18クロー
ンが区別された。これらクローンのIV注射による選択を繰り返して、終始一貫
したMPを示す最も安定な亜細胞系(sub−cell 1ine )を確立し
た。これらが、nu/nuマウス肺に対して、それぞれMPの高い、低い、およ
びMPを示さないHAL−8、−33および−24であった(表1参照)。肉眼
および顕微鏡検査から判断すると、これらの3つの亜細胞系はいずれも、他の器
官あるいはリンパ節への転移を示さなかった。それらの亜細胞系は、KUM−L
K−2中にもともと存在していた安定な変異体を表す。染色体分析によれば、こ
れらのサブクローンは独立したものである。
表 1
クローンHAL−8、−24および
−33のヌードマウスにおける転移能8HAL−81515,8(8−23)
22 15゜0 (10−22)
46 16.3 (11−25)
HAL−24150
HAL−33154,3(3−7)
a 上記各世代期にヌードマウスの尾静脈に注射(細胞数2×105)した。注
射から56日後、マウスを殺し、肺表面の転移性小結節(metastatic
nodules)を解剖顕微鏡の下で数えた。
b 6匹の平均(括弧内は範囲)。
B、 細胞表面炭水化物エピトープの発現種々の炭水化物エピトープの細胞表面
での発現を、Lex (MAb 5HI)、シアロシル−Le (MAb 5H
4)、シアロシル−Le 二量体(MAb FH6)、T (MAb HH8)
、Tn (MAb IF5)およびシアロシル−Tn (MAb TKH2)
に対する種々のモノクローナル抗体(MAb)を用いたサイトフルオロメトリー
により解析した。使用した抗体は全て、それぞれのハイブリドーマからの培養上
澄みを、免疫グロブリンとして10μg/mlに調整したものであった。
細胞を、0.25%トリプシン、2mM EDTA溶液によって培養フラスコか
ら剥離した;各MAb処理のために、1×105個の細胞を用意した。細胞をM
Abと共に4℃で1時間インキュベートし、RPMr 1640で2回洗った。
つぎに、ヤギ抗マウスIgGまたはIgM−FITC(ベーリンガー・マンハイ
ム、インディアナポリス、インディアナ(Boehringer−Mannhe
im、 Indianapolis、 IN ))をPBSで50倍希釈して、
加え、4℃で30分間インキュベートした。最後に、細胞を3回洗い、PBSで
再懸濁して、EPrC8PROFILEフローサイトメトリー(エピマウス、ハ
イアリ−170リダ(Epics、 flialeah。
FL) )にかけた。これらの実験を、異なる3世代の細胞を用いて反復した。
亜細胞系HAL−8、−24および一33表面における6種の炭水化物エピトー
プ(それぞれのMAbによって定義される)の発現のパターンは、シアロシル−
Le 二量体の場合を除いて、はぼ同じプロフィールを示した(3種の亜細胞系
について示した蛋白質プロフィールとして)。
特に、HAL−8、−24および−33は、シアロシル−Le およびシアロシ
ル−Tnの構造を高度に且つ等しく発現することが見出された。これら3系の各
々は、少量のLe およびTnを発現したが、Tは発現しなかった。これに対し
、シアロシル−Le 二量体の発現は、HAL−8で高度であり、HAL−33
で中程度であり、HAL−24で低度であった。
C2細胞のシアリダーゼ処理による転移の抑制細胞を、2mM EDTA含有P
BSを用いて剥離し、洗浄し、9倍体積のPBSに再懸濁した。細胞懸濁液の1
mlを、0.2U/mlのクロストリジウム・パーフリンジエンス((’jos
trjdjtti perfrt’nzetys )由来のシアリダーゼ(タイ
プX1シグマ・ケミカル・カンパニー、セントルイス、ミズーリ (type
X、 Sigma Chemical Co、、 St、Louis。
MO))と共に、37℃で5分間インキュベートした。インキュベーションの後
、細胞を3回洗い、RPMI 1640で再懸濁し、MPおよびシアロシル−L
e −量体の発現を調べた。HAL−8および−33のMPは、細胞のシアリダ
ーゼ処理によって完全に抑制された(下記表2参照)。シアロシル−Le −量
体の発現は、血液に運ばれての転移において重要な役割を果しているように思わ
れる。
表 2
クローンHAL〜8および−33の転移能処理 クローン 56日目の肺小結節
数5対照(PBS) HAL−8t6.3 (9−24)HAL−334,6(
3−7)
シアリダーゼ HAL−80
HAL−330
a ヌードマウスの尾静脈に注射(細胞数2×105)した。注射から56日後
に、マウスを殺し、肺表面の転移性小結節を解剖顕微鏡の下で数えた。
b 6匹の平均(括弧内は範囲)。
以上から、本明細書では説明のために特定の実施態様を記載したが、本発明の精
神、範囲を逸脱することなく、種々の修飾をなしつることは、明らかであろう。
生存工数
FIGURE IA
FIGURE IB
FIGURE IC
FIGURE ID
FIGURE 2
FIGURE 3
FIGURE 4
FIGURE 5A
FIGURE 5B
01.0 10 100
[FN] LIg/m1
FIGURE 5C
丁1筈管1も電層
(JJM)
FIGURE 6A
FIGURE 6B
+m、−a+ max−−4L P(:r/US 91106202m、1.−
h−−+ 1911.e−++−11a、 PCT/US 91106202+
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#ff$l+−ユ^−tlitm1m 舛LρCTIJS 91106202国
際調査報告
pcT/l’s 91106202
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(81)指定国 EP(AT、BE、CH,DE。
DK、 ES、 FR,GB、 GR,IT、 LU、 NL、 SE)、 A
U、 CA、JP
(72)発明者 ハコモリ センイチロウアメリカ合衆国 98040 ワシン
トン マーサー アイランド エイティース サウスイースト 2024
Claims (13)
- 1.鑑別診断上意義のある腫瘍関連炭水化物抗原、該抗原に特異的に結合する抗 体、該抗原のオリゴ糖成分および該抗原または該オリゴ糖の複合体からなる群よ り選ばれた、温血動物での腫瘍細胞の転移能を抑制する薬物の製造に用いるため の試薬。
- 2.オリゴ糖成分が、ラクトース、ラクト−N−テトロース、メチルD−ラクト シドおよびフェニルD−チオラクトシドからなる群より選ばれたものである請求 項1の試薬。
- 3.腫瘍関連炭水化物抗原が、シアロシル−Lex、H/Ley/Leb、シア ロシル−Lea、シアロシル−Tn、Lex二量体、シアロシル−Lex二量体 およびトリフコシル−Lexからなる群より選ばれたものである請求項1の試薬 。
- 4.オリゴ糖成分が、H/Ley/Leb、シアロシル−Lex、シアロシル− Lea、シアロシル−Tn、Lex二量体、シアロシル−Lex二量体およびト リフコシル−Lexからなる群より選ばれた腫瘍関連炭水化物抗原のオリゴ糖基 (group)である請求項1の試薬。
- 5.オリゴ糖がポリ(エチレングリコール)に結合されている請求項2または4 の試薬。
- 6.ポリ(エチレングリコール)に結合されたオリゴ糖を有する複合体。
- 7.オリゴ糖が、ラクトース、ラクト−N−テトロース、メチルD−ラクトシド およびフェニルD−チオラクトシドからなる群より選ばれたものである請求項6 の複合体。
- 8.オリゴ糖が、シアロシル−Lex、H/Ley/Leb、シアロシル−Le a、シアロシル−Tn、Lex二量体、シアロシル−Lex二量体およびトリフ コシル−Lexかりなる群より選ばれた腫瘍関連炭水化物抗原のオリゴ糖部分で ある請求項6の複合体。
- 9.生体試料を、鑑別診断上意義のある腫瘍関連炭水化物抗原、該抗原に特異的 に結合する抗体、該抗原のオリゴ糖成分、および該抗原または該オリゴ糖の複合 体からなる群より選ばれた、該試料の転移能を抑制する少なくとも1種の試薬と 共にインキュベートすることからなる、生体試料中で腫瘍細胞の転移能を抑制す る方法。
- 10.オリゴ糖成分が、ラクトース、ラクト−N−テトロース、メチルD−ラク トシドおよびフェニルD−チオラクトシドからなる群より選ばれたものである請 求項9の方法。
- 11.腫瘍関連炭水化物抗原が、シアロシル−Lex、H/Ley/Leb、シ アロシル−Lea、シアロシル−Tn、Lex二量体、シアロシル−Lex二量 体およびトリフコシル−Lexからなる群より選ばれたものである請求項9の方 法。
- 12.オリゴ糖成分が、H/Ley/Leb、シアロシル−Lex、シアロシル −Lea、シアロシル−Tn、Lex二量体、シアロシル−Lex二量体および トリフコシル−Lexからなる群より選ばれた腫瘍関連炭水化物抗原のオリゴ糖 基(group)である請求項9の方法。
- 13.オリゴ糖がポリ(エチレングリコール)に結合されている請求項10また は12の方法。
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