WO2024096133A1 - Ｈｔｌｖ－１細胞－細胞間感染阻害薬、ｈｔｌｖ－１感染症治療薬、ｈｔｌｖ－１関連脊髄症（ｈａｍ／ｔｓｐ）治療薬 - Google Patents

Ｈｔｌｖ－１細胞－細胞間感染阻害薬、ｈｔｌｖ－１感染症治療薬、ｈｔｌｖ－１関連脊髄症（ｈａｍ／ｔｓｐ）治療薬 Download PDF

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大介 兒玉
正和 田中
龍二 久保田
周二 出雲
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Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic agent for HTLV-1 associated myelopathy (HAM/TSP), a disease caused by human T-cell leukemia virus type 1 (HTLV-1), a therapeutic agent for the condition of HTLV-1 infected individuals including asymptomatic HTLV-1 carriers and for HTLV-1 infection including complications caused by HTLV-1, or, by its mechanistic designation, an inhibitor of HTLV-1 cell-to-cell infection. More specifically, the present invention relates to a substance and compound that inhibits HTLV-1 infected cell-to-noninfected cell infection, which is the mode of proliferation of the HTLV-1 provirus or infected cells in HTLV-1 infected individuals.
  • HTLV-1 the retrovirus that causes the intractable rare diseases adult T-cell leukemia (ATL) and HTLV-1-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP, hereafter sometimes referred to simply as "HAM"), is incorporated as a provirus into the DNA of human CD4-positive T lymphocytes in HTLV-1-infected individuals and causes an increase in the number of infected cells, i.e., the amount of HTLV-1 provirus, in the body through two main modes: cell division or clonal expansion within the human body, and infection between HTLV-1-infected cells and non-infected cells (HTLV-1 cell-to-cell infection). It can also be transmitted between individuals by mother-to-child infection via breast milk, and horizontal infection via semen and blood.
  • ATL adult T-cell leukemia
  • HAM/TSP HTLV-1-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis
  • ATL in which infected cells undergo genetic mutation and tumor formation leading to clonal proliferation
  • HAM in which infected cells infiltrate into the spinal cord and cause inflammation
  • Asymptomatic carriers have not been treated to reduce the HTLV-1 proviral load, but it is known that there are high-risk carriers that will progress to ATL.
  • drugs for HTLV-1 infection or HAM there has been almost no development or clinical trials of drugs for HTLV-1 infection or HAM, and only a few developments for ATL have been conducted in Japan.
  • the monoclonal antibody Mogalizumab (trade name Potelizio, Kyowa Kirin Co., Ltd.) is available against the surface marker CCR4, which is expressed on approximately 60-70% of HTLV-1-infected cells.
  • CCR4 surface marker
  • Clinical trials to investigate the effect of Potelizio on HAM have been conducted in recent years, but although a reduction in the number of infected cells was observed, the number quickly returned to normal, and the drug was not launched.
  • the surface marker of HTLV-1-infected cells is targeted for treatment, similar results are expected.
  • oral steroids and IFN- ⁇ injections are available as symptomatic treatments to suppress inflammation, but the effect on reducing the amount of HTLV-1 provirus is small, so the reality is that the status quo is maintained.
  • TKIs tyrosine kinase inhibitors
  • HTLV-1 proviral load there are two mechanisms by which the number of infected cells (HTLV-1 proviral load) increases in the body of an infected person: division of infected cells and infection between infected and non-infected cells. TKIs can block the former by inducing cell death specifically in HTLV-1-infected cells, but are unable to adequately address the latter. Therefore, there is a need to develop drugs that inhibit cell-to-cell infection of HTLV-1.
  • the viral receptor on non-infected cells is a ubiquitous molecular aggregate, making it difficult to use it as a therapeutic target.
  • a new structure for cell-to-cell infection has been identified in which a biofilm-like extracellular virus structure consisting of various extracellular matrices, BST-2/tetherin, Gal-3, CD62, and the O-glycan sialyl Lewis X exists around HTLV-1-infected CD4+ T cells, and the virus particles attach to this structure and move to uninfected cells, thereby spreading the infection (Patent Document 2, Non-Patent Document 1).
  • Galectin-3 is a protein with a characteristic glycan recognition domain consisting of approximately 130 amino acids that binds to ⁇ -galactoside. Gal-3 is highly expressed in HTLV-1-infected T cells after being transactivated by tax, but is also weakly and constitutively expressed in non-infected T cells. Gal-3 is in a ligand-receptor relationship with the membrane protein-binding glycan N-acetyllactosamine (Gal ⁇ 1, 4GlcNAc, LacNAc), and is known to form a lattice between Gal-3 pentamer and LacNAc.
  • LacNAc-Gal-3 axis highly expressed glycans on HTLV-1-infected cells were not known, and it was completely unknown until the present inventors discovered that the interaction between LacNAc and Gal-3 on non-infected cells (hereinafter sometimes referred to as the LacNAc-Gal-3 axis) was involved in infection between HTLV-1-infected and non-infected cells.
  • the Gal-3 inhibitor GB1107 (3,4-dichlorophenyl 3-deoxy-3-[4(3,4,5-trifluorophenyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl]-1-thio- ⁇ -D-galactopyranoside) has been developed as a treatment for idiopathic pulmonary fibrosis (Patent Documents 4 and 5).
  • Patent Documents 4 and 5 there have been no reports of research into the clinical application of these drugs as drugs that inhibit the LacNAc-Gal-3 axis, or research into their use as therapeutic agents targeting HTLV-1 infection.
  • the object of the present invention is to provide a means of treating HAM and HTLV-1 infections by identifying important molecules on the infected and non-infected cell sides in cell-to-cell infection of HTLV-1 and inhibiting cell-to-cell contact infection of HTLV-1 by blocking their interaction and suppressing the proliferation of HTLV-1 infected cells or HTLV-1 proviral load.
  • the present inventors performed comprehensive glycan analysis of CD4+ T cell membrane proteins derived from HAM patients using a lectin array, and identified LacNAc as a glycan that is significantly highly expressed on the membrane surface of HTLV-1-infected CD4+ T cells.
  • the present inventors suspected that LacNAc may be involved in cell-to-cell infection, and focused on the receptor-ligand relationship between LacNAc highly expressed on infected cells and Gal-3, a LacNAc-specific receptor known to be constitutively expressed on non-infected cells.
  • HTLV-1 infectivity was inhibited when LacNAc on infected cells was treated with LacNAc-specific lectins STL, UDA, and LEL or 4-F-GlcNAc, a LacNAc biosynthesis metabolic inhibitor, or when LacNAc ligand Gal-3 on non-infected cells was treated with Gal-3 inhibitor GB1107, targeting LacNAc on the infected cells.
  • HTLV-1 cell-to-cell infection involves a receptor-ligand interaction (LacNAc-Gal-3 axis) between the disaccharide sugar chain LacNAc, which is highly expressed on HTLV-1-infected CD4-positive T cells, and Gal-3 on uninfected CD4-positive T cells as a target, and that the mechanism of action of the agent of the present invention is to inhibit this interaction, thereby inhibiting HTLV-1 cell-to-cell infection through inhibition of conjugate formation, thereby completing the present invention.
  • HTLV-1 human T-cell leukemia virus type 1
  • LacNAc N-acetyllactosamine
  • Galectin-3 galectin-3
  • the inhibitor according to Item 1 which is (c) a substance that binds to Gal-3 and inhibits the binding between LacNAc and Gal-3, or (d) a substance that inhibits the expression of Gal-3.
  • the substance (a) is contained, and the substance is (a1) UDP-GlcNAc:betaGal beta-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase 2 (B3GNT2) or (a2) an inhibitor of metabolic LacNAc biosynthesis.
  • the inhibitor according to Item 3 which contains the inhibitor (a2) and is peracetylated 4-fluorinated glucosamine (4-F-GlcNAc).
  • the inhibitor according to Item 2 which contains the substance (b) and is Urtica dioica agglutinin (UDA), Solanum Tuberosum (Potato) lectin (STL), or Lycopersicon Esculentum (Tomato) lectin (LEL).
  • UDA Urtica dioica agglutinin
  • STL Solanum Tuberosum
  • Tomato Lycopersicon Esculentum
  • LEL Lycopersicon Esculentum
  • the inhibitor according to Item 2 which contains the substance (c) and is selected from the group consisting of GB1107, TD139, GB1211, GCS-100, and GR-MD-02 (belapectin).
  • HAM/TSP HTLV-1 associated myelopathy
  • [Item 8] A method for inhibiting HTLV-1 cell-to-cell infection in an HTLV-1-infected individual, comprising administering to the infected individual an effective amount of a substance that inhibits the receptor-ligand interaction between LacNAc and Gal-3.
  • HTLV-1 proviral load an increase in the number of infected cells (HTLV-1 proviral load), which is useful for treating HTLV-1-associated myelopathy (HAM) and HTLV-1 infection.
  • FIG. 1 shows the results of comprehensive glycan analysis (glycome by lectin array) of membrane proteins of CD4-positive T cells derived from HAM patients, asymptomatic carriers (AC), and non-infected individuals (NC).
  • Membrane proteins from four cases each of HAM, AC, and NC extracted by salting out were labeled with fluorescent dye Cy3, and 100 ⁇ l of each sample at various concentrations (2,000, 1,000, 500, 250, 125, 62.5, and 31.25 ng/ml) were placed in one well and incubated at 4°C for 17 hours.
  • Raw images acquired with a GlycoStation Reader 1200 were quantified into signal intensity using GlycoStaion Tools 2.0 software (all from GPBioscience KK., Tokyo; now transferred to Glycotechnica KK, Ltd., Yokohama). Comparable data from the low signal intensity data set were used by interpolating the saturated part of the high signal intensity data set using the least squares method (Kuno A.
  • the data at a protein concentration of 250 ng/ml for the sample in which the signal intensity was not saturated for any of the lectins was normalized and used.
  • the horizontal axis of the figure shows the normalized Cy3-labeled lectin signal intensity.
  • the vertical axis shows the lectins loaded on LecChip ver1.0 (GPBioscience).
  • the black, gray, and white bars show the lectin signal intensity of CD4+ T cell membrane proteins derived from negative controls (NC), asymptomatic carriers (AC), and HAM patients, respectively.
  • Student's t test with Bonferroni correction shows that there is a significant difference between HAM and NC, with *: P ⁇ 0.0167 and ⁇ : P ⁇ 0.0033.
  • FIG. 1 shows the relationship between LacNAc expression, LacNAc biosynthetic enzyme B3GNT2 gene expression, and HTLV-1 proviral load in CD4-positive T cells derived from HAM patients, asymptomatic carriers, and non-infected individuals.
  • B3GNT2 mRNA the enzyme responsible for LacNAc biosynthesis
  • RNA samples from 10 cases each of CD4+ T cells from HAM, AC, and NC the expression of mRNA variant 1 (NCBI Reference Sequence: NM_006577.6) of the B3GNT2 gene (Gene ID: 10678) (Togayachi A. Proc Natl Acad Sci USA. 104(40):15829-34.(2007)), which is considered to be the enzyme responsible for LacNAc biosynthesis, was examined by the qRT-PCR ⁇ Ct method.
  • the primers were B3GNT2 mRNA forward, 5'-ACTCGGGGAGGTTAAAGACC-3' (1515-1534) (SEQ ID NO: 1); B3GNT2 mRNA reverse, 5'- GCCACAGACTGTCCTGGTATCT-3' (1589-1610) (SEQ ID NO: 2); GAPDH mRNA transcript variant 2 forward, 5'-GACTAACCCTGCGCTCCTG-3' (133-151) (SEQ ID NO: 3); and GAPDH mRNA transcript variant 2 reverse, 5'-GCCCAATACGACCAAATCAG-3' (268-249) (SEQ ID NO: 4).
  • sequence numbers correspond to those of the reference sequences (B3GNT2 mRNA: NM_007313.2; and GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), transcript variant 2, mRNA: NM_001256799.2).
  • GAPDH mRNA was used as an endogenous control gene. Amplification cycles were 50°C, 2 min, 1 cycle; 95°C, 10 min, 1 cycle; and 95°C, 15 sec and 60°C, 1 min, for 40 cycles. Comparisons between HAM or AC and NC samples were performed using the Mann-Whitney U test with Bonferroni correction. *: significant at P ⁇ 0.0167; ns: not significant.
  • PVL HTLV-1 proviral load
  • Figure 1 shows the results of flow cytometry analysis showing LacNAc expression on HTLV-1 infected and non-infected cell lines: a) FACS histograms with STL staining, b) FACS histograms with UDA staining, c) Immunohistochemistry with UDA staining.
  • HTLV-1-infected human T cell lines HUT102, C91/PL, and MT-2
  • HTLV-1-uninfected human T cell lines Jurkat and Molt-4
  • LacNAc glycans were stained with specific lectin staining either with STL-DyLight488 conjugate (EY labs) diluted 1:100 in staining buffer or with a combination of biotinylated UDA (EY laboratories) diluted 1:200 and Streptavidin-Alexa Fluor488 conjugate (EY laboratories) diluted 1:200. Each staining was performed without permeabilization and incubated at room temperature for 15 min.
  • the stained/unstained MFI ratio was positive in both infected and uninfected cells, indicating that the cancer cell lines were positive for LacNAc expression, unlike normal lymphocytes, which do not express LacNAc.
  • the STL signal MFI ratio was not significantly different between HTLV-1-infected and non-infected cells, but the UDA signal in flow cytometry, which indicates LacNAc, showed a higher MFI ratio in HTLV-1-infected cells than in non-infected cells. The same was true for the UDA immunofluorescence microscopy findings.
  • STL is a lectin more specific for Poly-LacNAc than for LacNAc.
  • Figure 1 shows the results of flow cytometry analysis of LacNAc expression on peripheral blood mononuclear cells derived from HAM patients.
  • a-d Relationship between HTLV-1-infected cell marker CADM1/TSLC1 and LacNAc expression (stained with specific lectins STL and UDA).
  • e, f Relationship between the expression level of HTLV-1-infected cell marker CADM1/TSLC1 and LacNAc expression (stained with specific lectins STL and UDA).
  • PBMCs from seven HAM patients were stained with mouse monoclonal anti-CADM1 antibody (kindly provided by Professor Kazuhiro Morishita, Department of Tumor Biochemistry, Faculty of Medicine, University of Miyazaki), goat anti-mouse IgG1-PE (Southern Biotech, Birmingham, AL, USA), mouse monoclonal anti-human CD4 antibody (DAKO), goat anti-mouse IgG1-PC5 (CD4-PC5), and for LacNAc glycan staining with specific lectins, either STL-DyLight 488 conjugate (EY labs) diluted 1:100 in staining buffer or a combination of biotinylated UDA (EY laboratories) diluted 1:200 and Streptavidin-Alexa Fluor 488 conjugate (EY laboratories) diluted 1:200.
  • EY labs either STL-DyLight 488 conjugate (EY labs) diluted 1:100 in staining buffer or a combination of biotinylated U
  • the relative expression ratio of cell surface LacNAc in CADM1+CD4+ cells was 1.47-fold and 1.99-fold by STL staining and UDA staining, respectively (Fig. 4a and c).
  • Figure showing the evaluation of candidate compounds STL, UDA, 4-F-GlcNAC, GB1107) as inhibitors of HTLV-1 cell-to-cell infection by cell viability assay. Shown is the cell viability 48 hours after drug treatment of HTLV-1 infected cell lines (C91/PL, MT-2) and non-infected cell lines (Jurkat, Molt-4) with various drug treatment concentrations of candidate compounds (a. STL, b. UDA, c. 4-F-GlcNAc, d. and e. GB1107) as inhibitors of HTLV-1 cell-to-cell infection.
  • candidate compounds STL, UDA, 4-F-GlcNAC, GB1107
  • Human CD4+ T cell-derived HTLV-1-infected and non-infected cell lines were seeded in triplicate (three wells of each cell) on 96-well polystyrene plates at a density of 5 ⁇ 103 cells/well in RPMI1640 medium. They were cultured for 48 hours in the presence or absence of various concentrations of LacNAc-specific lectins STL and UDA, LacNAc biosynthesis metabolic inhibitor 4-F-GlcNAc, and Gal-3 inhibitor GB1107, an in vivo specific ligand of LacNAc, in a 5% CO2 incubator at 37°C.
  • XTT method (2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide) with the XTT Cell Proliferation Kit II (Roche Diagnostics KK, Tokyo).
  • the XTT method uses a bioreduction reaction in which tetrazolium salt is cleaved to formazan dye only in viable cells, and colorimetric analysis is performed based on the correlation between the number of viable cells and the dye.
  • the maximum absorption wavelength was 492 nm and the reference wavelength was 650 nm using a plate reader.
  • Cell viability ⁇ (number of viable cells under drug treatment)/(number of viable cells without treatment) ⁇ x 100 (%) Cell viability was calculated from three independent experiments. For each cell line, a paired t-test (Bonferroni correction) was performed to compare cell viability at each concentration with that without drug treatment (0 ⁇ M). *: P ⁇ 0.0167, ⁇ : P ⁇ 0.003 for significance.
  • the horizontal axis of each graph indicates the drug treatment concentration ( ⁇ M), and the vertical axis indicates cell viability (%). Markers with black circles, white circles, gray diamonds, and white diamonds indicate C91/PL, MT-2, Jurkat, and Molt-4, respectively.
  • GB1107 targets both transactivated Gal-3 in infected cells and Gal-3 constitutively expressed in uninfected CD4+ T cells.
  • Significant cytotoxicity was observed at 10 ⁇ M or more in HTLV-1-infected cell lines (C91/PL, MT-2) and the uninfected cell line Jurkat cells, and at 100 ⁇ M in the uninfected cell line Molt-4.
  • the drug concentrations examined in Figure 6 were determined based on these results.
  • FIG. 1 Evaluation of HTLV-1 cell-cell infection inhibitors (STL, UDA, 4-F-GlcNAC, GB1107) by HTLV-1 infectivity assay. a. 2 ⁇ M STL, b. 0.75 ⁇ M UDA, c. 100 ⁇ M 4-F-GlcNAc, d. 100 ⁇ M GB1107.
  • HTLV-1 infected cell-non-infected cell-to-cell infection experiment system As a model for evaluating HTLV-1 cell-cell infection, an HTLV-1 infected cell-non-infected cell-to-cell infection experiment system was used in which HTLV-1 infected cell lines (C91/PL, MT-2) were co-cultured with a reporter plasmid-transfected non-infected cell line (Jul). The results of the HTLV-1 infectivity assay using HTLV-1 infected cell lines treated for 24 hours with LacNAc-specific lectins a. 2 ⁇ M STL, b. 0.75 ⁇ M UDA, and peracetylated fluorinated glucosamine analog c.
  • HTLV-1-infected cells were cultured for 24 h with or without LacNAc-specific ligands STL (2 ⁇ M), UDA (0.75 ⁇ M), or LacNAc biosynthesis inhibitor 4-F-GlcNAc (100 ⁇ M).
  • Infected cells and Jul cells were co-cultured at 1:1 ratio of 2 ⁇ 105 cells/2 ml/well for 48 h, or Jul cells were co-cultured at 1:1 ratio of 2 ⁇ 105 cells/2 ml/well for 24 h with or without Gal-3 inhibitor GB1107 (100 ⁇ M).
  • HTLV-1-infected cell-to-non-infected cell infection experiment system consisting of HTLV-1-infected cell lines (here, C91/PL or MT-2) as Tax donor cells and non-infected cell line Jul cells (Jurkat cells transfected with pLTR-GL3 plasmid) as acceptor cells.
  • HTLV-1 virus particles budded from HTLV-1-infected cell lines bind to, fuse with, and invade the HTLV-1 virus receptor (a ubiquitous molecular complex present on normal cells) on the surface of the acceptor cell, i.e., non-infected Jul cells, and the Tax protein derived from the particles or reverse transcribed and translated from the viral RNA binds to the tax responsive element (TRE) 21 base pair repeat sequence in the pLTR-GL3 plasmid in the acceptor cell.
  • TRE tax responsive element
  • the pLTR-GL3 plasmid was constructed from pLTR-CAT (Fujisawa J., et al. Proc Natl Acad Sci USA 1985. 82(8): 2277-81.(1985)).
  • a 636 base pair region (-342 to +294) spanning the 5' half of U3, R, and U5 of the HTLV-1 LTR region was PCR amplified with the following primers: Forward: 5'- CTCGAG ATGAGCCCCAAATATCCCCCGG-3' (SEQ ID NO:5); Reverse: 5'- AAGCTT AATGAAAGGGAAAGGGGTG GAACT-3' (SEQ ID NO: 6)
  • the underlined parts are linker sequences.
  • the amplified fragment was digested with restriction enzymes Xho I and Hind III, and the Xho I-Hind III fragment was inserted into pGL2-Basic vector plasmid (GenBank: X65323. Promega Corporation, Madison, WI, USA) to give pLTR-Luc.
  • the reporter firefly luciferase gene and transcription termination signal were replaced with the corresponding sequences of pGL3-Basic vector (GenBank: U47295. Promega Corporation, Madison, WI, USA) to give pLTR-GL3 plasmid.
  • the infectivities were 28.1 ⁇ 4.9 and 37.8 ⁇ 6.1%, respectively, showing 71.9 and 62.2% inhibition of infection.
  • the infectivities were 53.8 ⁇ 4.9 and 27.9 ⁇ 2.4%, respectively, showing 46.2% and 72.1% inhibition of infection.
  • the infectivity was 0.46 ⁇ 0.03 and 0.54 ⁇ 0.02% when the Tax donor cells were C91/PL and MT-2, respectively, showing an infection inhibition effect of 99.5% for both, and infectivity was almost completely lost in both cases.
  • GB1107 when orally administered to a patient, GB1107 is thought to have a cell death effect on HTLV-1-infected CD4+ T cells, which are Tax donor cells, suggesting that sufficient therapeutic effects can be expected even at concentrations lower than 100 ⁇ M.
  • LacNAc-specific lectins STL, UDA
  • LacNAc biosynthesis metabolic inhibitor 4-F-GlcNAc the LacNAc biosynthesis metabolic inhibitor 4-F-GlcNAc
  • Gal-3 inhibitor GB1107 the Gal-3 inhibitor GB1107 were all shown to have inhibitory effects on HTLV-1 infectivity, demonstrating their significance as therapeutic drugs for HTLV-1 infection and HAM.
  • the mechanism of cell-to-cell infection spread is suggested to be related to LacNAc on HTLV-1-infected CD4+ T cells and Gal-3, an endogenous ligand with strong affinity for LacNAc on uninfected CD4+ T cells, i.e., the LacNAc-Gal-3 receptor-ligand interaction (LacNAc-Gal-3 axis) is involved in HTLV-1 infectivity, and inhibition of these molecules can inhibit cell-to-cell infection.
  • the LacNAc-Gal-3 receptor-ligand interaction LacNAc-Gal-3 axis
  • HTLV-1-infected cell lines C91/PL, MT-2) (1 ⁇ 104 ) were stained with the carbocyanine fluorescent dye DiO (green, Ex 484/Em 501 nm) for cell membrane labeling, and uninfected Jurkat cell line (2 ⁇ 104 ) was stained with DiI (red, Ex 550/Em 565 nm) for conjugate formation assessment.
  • Figure 1 shows the inhibitory effect (quantitative evaluation) of 4-F-GlcNAc by HTLV-1 conjugate formation assay.
  • a Inhibition of conjugate formation frequency and conjugate formation rate by 4-F-GlcNAc.
  • b Correlation between the results of HTLV-1 conjugate formation assay and HTLV-1 infectivity assay.
  • Conjugate formation rate (%) ⁇ (Frequency of zygotes with drug treatment)/(Frequency of zygotes without drug treatment) ⁇ 100 Three independent experiments were performed.
  • a is a two-axis graph.
  • the left vertical axis of the bar graph is the axis for the mean conjugate frequency (1/1,000 HTLV-1-infected cells) with error bars indicating the standard deviation.
  • the right vertical axis is a line graph, which similarly indicates the mean conjugate formation rate (%).
  • the error bars of the line graph markers are the standard deviation.
  • the concentration of 4-F-GlcNAc listed on the horizontal axis indicates the concentration of 4-F-GlcNAc treated with HTLV-1-infected cells 48 hours before co-culture with Jurkat.
  • the black and white bars indicate the conjugate frequencies between C91/PL and Jurkat, and between MT-2 and Jurkat, respectively, and the black circle ( ⁇ ) and diamond ( ⁇ ) line graph markers indicate the conjugate formation rates between C91/PL and Jurkat, and between MT-2 and Jurkat, respectively.
  • the results of each concentration of 4-F-GlcNAc treatment were compared to the untreated control (0 ⁇ M) by paired t-test with Bonferroni correction. *: P ⁇ 0.025, ⁇ : P ⁇ 0.005 indicates significance.
  • the conjugate frequency in the untreated control was 472.26 ⁇ 17.00 (/1,000 cells), whereas in the treated control with 50 ⁇ M and 100 ⁇ M it was 385.51 ⁇ 24.00 and 343.81 ⁇ 15.63 (/1,000 cells), respectively, showing a treatment concentration-dependent decrease in the conjugate frequency.
  • the conjugate formation rate was 81.63 ⁇ 5.08% (a decrease of 18.37%) in the untreated control and 72.80 ⁇ 3.19% (a decrease of 27.2%) in the treated control with 50 ⁇ M and 100 ⁇ M, respectively, showing a drug treatment concentration-dependent decrease in the conjugate formation rate, assuming the untreated control to be 100% ⁇ 3.60%.
  • the frequency of conjugates in the untreated control was 411.05 ⁇ 22.44 (/1,000 cells), whereas the frequency of conjugates in the 50 ⁇ M and 100 ⁇ M treatments was 346.21 ⁇ 27.50 and 287.95 ⁇ 16.24 (/1,000 cells), respectively, which decreased in a concentration-dependent manner.
  • the conjugate formation rate was 84.22 ⁇ 6.69% (a 15.78% decrease) in the 50 ⁇ M treatment and 70.05 ⁇ 3.95% (a 29.95% decrease) in the 100 ⁇ M treatment, compared to 100 ⁇ 5.46% in the untreated control, which significantly decreased the conjugate formation rate in a drug concentration-dependent manner.
  • Fig. 6b the data from the HTLV-1 conjugation assay and the HTLV-1 infectivity assay were plotted at the point where the cells and 4-F-GlcNAc treatment concentrations matched.
  • Fig. 6c the results of the HTLV-1 infectivity assay using C91/PL or MT-2 treated with 100 ⁇ M 4-F-GlcNAc (Fig. 6c)
  • data from the HTLV-1 infectivity assay using C91/PL or MT-2 treated with 50 ⁇ M 4-F-GlcNAc are also plotted.
  • Filled circles ( ⁇ ), shaded circles ( ⁇ ), and open circles ( ⁇ ) represent data from conjugation assay using C91/PL and Jurkat cells treated with 0 ⁇ M, 50 ⁇ M, and 100 ⁇ M 4-F-GlcNAc, respectively.
  • the filled diamonds ( ⁇ ), shaded diamonds, and open diamonds ( ⁇ ) respectively represent data for 0 ⁇ M, 50 ⁇ M, and 100 ⁇ M 4-F-GlcNAc treatments in conjugate formation between MT-2 and Jurkat.
  • the two straight lines represent the simple regression equation for conjugate formation between C91/PL and Jurkat (lower graph) and conjugate formation between MT-2 and Jurkat (upper graph).
  • the strong correlation between the results of the infectivity assay and the conjugate formation assay suggested that conjugate formation and contact infection are an inseparable and irreversible process, and that inhibition of the LacNAc-Gal-3 interaction (LacNAc-Gal-3 axis) can inhibit infectivity through inhibition of conjugate formation.
  • Drugs that inhibit this mechanism such as HTLV-1 conjugate formation inhibitors, i.e., HTLV-1 cell-cell infection inhibitors, suppress the amount of HTLV-1 provirus by inhibiting infectivity, and are therefore suggested to be therapeutic agents for HTLV-1 infection and HAM in clinical applications.
  • the present invention provides an inhibitor of HTLV-1 cell-cell infection (hereinafter also referred to as the "inhibitor of the present invention") that contains a substance that inhibits the receptor-ligand interaction between LacNAc and Gal-3.
  • LacNAc has a ⁇ -1,4-linked structure between galactose and N-acetylglucosamine, and is added to the end of the N-glycan by the action of two glycosyltransferases, UDP-GlcNAc:betaGal beta-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase 2 (B3GNT2) and beta-1,4-galactosyltransferase 1 (B4GALT1).
  • the term is used to include poly-LacNAc, in which two or more LacNAc molecules are polymerized.
  • the Gal-3 gene is transactivated by the viral protein tax, resulting in high expression of Gal-3 protein that binds to ⁇ -galactoside, and Gal-3 forms a pentamer and forms a lattice structure with LacNAc on the membrane surface.
  • Gal-3 is also weakly and constitutively expressed in uninfected CD4+ T cells, and when infected and uninfected cells form conjugates, they are irreversibly conjugated due to the affinity between LacNAc on the infected cell and Gal-3 on the uninfected cell, and HTLV-1 viral particles colocalized with Gal-3 on the infected cell are transferred to the uninfected cell, resulting in cell-to-cell infection.
  • the term “LacNAc-Gal-3 axis” refers to an interaction based on the receptor-ligand relationship between LacNAc on infected cells and Gal-3 on uninfected cells in cell-to-cell infection. Therefore, the term “substance that inhibits the LacNAc-Gal-3 axis” is not particularly limited as long as it blocks this interaction by some mechanism, and examples of such substances include: (a) a substance that inhibits the expression of LacNAc on the membrane surface, (b) a substance that binds to LacNAc and inhibits the binding between LacNAc and Gal-3; (c) substances that bind to Gal-3 and inhibit the binding between LacNAc and Gal-3, and (d) substances that inhibit the expression of Gal-3.
  • the substance (a) is not particularly limited as long as it can inhibit the expression of LacNAc on membrane protein-bound sugar chains, and may be one that inhibits any stage of the biosynthetic pathway.
  • an inhibitor of either of two glycosyltransferases, B3GNT2 and B4GALT1, which catalyze the reaction of adding LacNAc to a glycan preferably a B3GNT2 inhibitor
  • Agents that metabolically inhibit LacNAc biosynthesis preferably agents that reduce the production of UDP-GlcNAc, which is a substrate for LacNAc biosynthesis, may be mentioned, but are not limited to these.
  • inhibitors of B3GNT2 or B4GALT1 include substances that bind to these enzymes and inhibit their enzymatic activity.
  • the three-dimensional structures of B3GNT2 and B4GALT1 are published in the NCBI and UniProtKB databases (UniProtKB accession No. Q9NY97 and P15291), and inhibitors can be searched for and identified using methods known per se, such as docking methods.
  • examples of substances that bind to these enzymes and inhibit their enzymatic activity include antibodies against the enzymes.
  • the antibodies may be either polyclonal or monoclonal antibodies. These antibodies can be produced according to known methods for producing antibodies or antisera.
  • the isotype of the antibody is not particularly limited, but is preferably IgG, IgM or IgA, and particularly preferably IgG. Furthermore, the antibody is not particularly limited as long as it has at least a complementarity determining region (CDR) for specifically recognizing and binding to B3GNT2 or B4GALT1, and may be a complete antibody molecule, or may be, for example, a fragment such as Fab, Fab', or F(ab') 2 , a genetically engineered conjugate molecule such as scFv, scFv-Fc, a minibody, or a diabody, or a derivative thereof modified with a molecule having a protein stabilizing effect such as polyethylene glycol (PEG).
  • CDR complementarity determining region
  • a substance that inhibits the expression of B3GNT2 or B4GALT1 enzyme proteins can be used as an inhibitor of these enzyme proteins.
  • the substance may act at any stage of the enzyme gene, such as the transcription level, the level of post-transcriptional regulation, the level of translation into protein, or the level of post-translational modification.
  • substances that inhibit the expression of B3GNT2 or B4GALT1 include substances that inhibit the transcription of the enzyme gene (e.g., antigene), substances that inhibit the processing of an initial transcription product into mRNA, substances that inhibit the transport of mRNA into the cytoplasm, substances that inhibit the translation of mRNA into protein (e.g., antisense nucleic acid, miRNA) or that degrade mRNA (e.g., siRNA, ribozyme, miRNA), and substances that inhibit the post-translational modification of an initial translation product.
  • Any substance that acts at any stage can be used, but substances that bind complementarily to mRNA to inhibit translation into protein or degrade mRNA are preferred.
  • Preferred examples of substances that specifically inhibit the translation of an enzyme gene from mRNA to protein include any of the following (i) to (iii): (i) A nucleic acid or a precursor thereof having RNAi activity against the mRNA of an enzyme gene (ii) Antisense nucleic acid to the mRNA of the enzyme gene (iii) Ribozyme Nucleic Acid against Enzyme Gene mRNA
  • the shRNA can be expressed in a T cell-specific manner by using an expression vector in which DNA encoding an shRNA against the mRNA of an enzyme gene is functionally linked downstream of a T cell-specific promoter.
  • Drugs that reduce the production of UDP-GlcNAc, which is a substrate for LacNAc biosynthesis include, but are not limited to, 4-F-GlcNAC and 3-F-GlcNac, in which the 3-position is substituted with fluorine instead of the 4-position (Patent Document 3, supra). 4-F-GlcNAC is preferred.
  • the structural formula of this compound is shown below.
  • the substance (b) may be, for example, an antagonist that binds to LacNAc competitively with the ligand Gal-3.
  • antagonists include lectins that specifically bind to LacNAc, or fragments containing all or a part of its glycan recognition domain.
  • Examples of lectins that specifically bind to LacNAc include Urtica dioica agglutinin (UDA), potato lectin (Solanum Tuberosum lectin (STL)), tomato lectin (Lycopersicon Esculentum lectin (LEL) and the like, which belong to the chitin-binding lectin hevein family, with LEL being advantageous in terms of antigenicity.
  • examples of LacNAc antagonists include free Gal-3 or fragments containing all or a part of its glycan recognition domain. The glycan recognition domain of Gal-3 is about 130 amino acids on the C-terminal side.
  • Gal-3 protein Information on human Gal-3 protein can be obtained, for example, from the NCBI or UniProtKB database (UniProtKB accession No. P17931). Nucleic acid aptamers, small molecules and other agents that bind to LacNAc are included as LacNAc antagonists. Antagonists that bind to LacNAc can also be obtained, for example, by constructing a competitive assay system using LacNAc and Gal-3 and screening a compound library.
  • the substance (b) may be an antibody against LacNAc.
  • the antibody may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. These antibodies may be produced according to a known method for producing antibodies or antisera.
  • the isotype of the antibody is not particularly limited, but is preferably IgG, IgM or IgA, and particularly preferably IgG.
  • the antibody is not particularly limited as long as it has at least a complementarity determining region (CDR) for specifically recognizing and binding to LacNAc, and may be a complete antibody molecule, or a fragment such as Fab, Fab', or F(ab') 2 , a genetically engineered conjugate molecule such as scFv, scFv-Fc, a minibody, or a diabody, or a derivative thereof modified with a molecule having a protein stabilizing effect such as polyethylene glycol (PEG).
  • CDR complementarity determining region
  • (c) Substances that bind to Gal-3 and inhibit the binding of LacNAc to Gal-3
  • Examples of the substance (c) include antagonists that bind to Gal-3 competitively with the receptor LacNAc.
  • Examples of such antagonists include Gal-3 inhibitors that specifically bind to Gal-3 and inhibit interaction with LacNAc.
  • Examples of Gal-3 inhibitors include GB1107, TD139 (Patent Documents 4 and 5), GB1211 (Zetterberg FR. J Med Chem 65: 12626-38 (2022)), GCS-100 (Streetly MJ, Blood 115(19): 3939-48 (2010)), and GR-MD-02 (Girard and Magnani, Trends in Glycoscience and glycotechnology, 30(172): SE211-SE220 (2018)).
  • the structural formulas of GB1107, TD139, GB1211 and GR-MD-02 are shown below.
  • Gal-3 antagonists include nucleic acid aptamers, small molecules, and other agents that bind to Gal-3. Antagonists that bind to Gal-3 can also be obtained, for example, by constructing a competitive assay system using Gal-3 and LacNAc and screening a compound library.
  • the substance (c) may be an antibody against Gal-3.
  • the antibody may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. These antibodies may be produced according to a known method for producing antibodies or antisera.
  • the isotype of the antibody is not particularly limited, but is preferably IgG, IgM or IgA, and particularly preferably IgG.
  • the antibody is not particularly limited as long as it has at least a complementarity determining region (CDR) for specifically recognizing and binding to Gal-3, and may be a complete antibody molecule, or a fragment such as Fab, Fab', or F(ab') 2 , a genetically engineered conjugate molecule such as scFv, scFv-Fc, a minibody, or a diabody, or a derivative thereof modified with a molecule having a protein stabilizing effect such as polyethylene glycol (PEG).
  • CDR complementarity determining region
  • the antibody when an antibody is used as one of the substances (a) to (c), since the antibody is used as a pharmaceutical intended for administration to humans, the antibody (preferably a monoclonal antibody) is an antibody with a reduced risk of exhibiting antigenicity when administered to humans, specifically a fully human antibody, a humanized antibody, a mouse-human chimeric antibody, etc., and a fully human antibody is particularly preferred.
  • Humanized antibodies and chimeric antibodies can be produced by genetic engineering in accordance with standard methods.
  • fully human antibodies can also be produced from human-human (or mouse) hybridomas, but in order to provide large amounts of antibodies stably and at low cost, it is desirable to produce them using human antibody-producing mice or phage display methods.
  • the substance (d) may be one that acts at any stage of the Gal-3 gene, such as the transcription level, the level of post-transcriptional regulation, the level of translation into protein, or the level of post-translational modification.
  • examples of substances that inhibit the expression of Gal-3 include substances that inhibit the transcription of the gene (e.g., antigene), substances that inhibit the processing of an initial transcription product into mRNA, substances that inhibit the transport of mRNA into the cytoplasm, substances that inhibit the translation of mRNA into protein (e.g., antisense nucleic acid, miRNA) or that degrade mRNA (e.g., siRNA, ribozyme, miRNA), and substances that inhibit the post-translational modification of an initial translation product.
  • Any substance that acts at any stage can be used, but a substance that binds complementarily to mRNA to inhibit translation into protein or degrades mRNA is preferred.
  • Preferred examples of substances that specifically inhibit translation of the Gal-3 gene from mRNA to protein include any of the following (i) to (iii): (i) a nucleic acid or a precursor thereof having RNAi activity against the mRNA of the Gal-3 gene (ii) an antisense nucleic acid to the mRNA of the Gal-3 gene; (iii) Ribozyme Nucleic Acid against Gal-3 Gene mRNA
  • the shRNA can be expressed in a T cell-specific manner by using an expression vector in which DNA encoding an shRNA against the Gal-3 gene mRNA is functionally linked downstream of a T cell-specific promoter.
  • Gal-3 has an NWGR motif common to the bcl-2 survival protein family in its glycan recognition domain, so the above substances (c) and (d) are expected to not only inhibit cell-to-cell infection by acting on non-HTLV-1-infected T cells and inhibiting the interaction with LacNAc, but also to induce cell death in HTLV-1-infected cells.
  • GB1107 shows a significant inhibitory effect on cell infection compared to 4-F-GlcNAC at the same concentration, suggesting that it also exerts an inhibitory effect on another mechanism of HTLV-1 infection spread, the division of infected cells.
  • the inhibitor of the present invention can suppress the number of infected cells due to cell-to-cell infection, i.e., the increase in the amount of HTLV-1 provirus, by administering it to asymptomatic HTLV-1 carriers, and therefore can prevent or delay the onset of HTLV-1 infections such as HAM, ATL, and HTLV-1 uveitis (HU).
  • the inhibitor can treat or suppress the progression of the disease by administering it to patients infected with HTLV-1.
  • the inhibitor of the present invention can also be used to suppress the progression and improve the degree of HAM motor disorder by reducing the amount of HTLV-1 provirus. Therefore, the present invention provides an agent for preventing the onset of HTLV-1 infection in asymptomatic carriers, as well as an agent for treating the disease in patients with HTLV-1 infection, including an agent for treating HAM.
  • the inhibitor of the present invention when used as a medicine, it can be administered orally or parenterally to a person in need thereof (i.e., asymptomatic HTLV-1 carriers, HAM patients, etc.) either as a liquid preparation or as a pharmaceutical composition in an appropriate dosage form.
  • a person in need thereof i.e., asymptomatic HTLV-1 carriers, HAM patients, etc.
  • a pharmaceutical composition in an appropriate dosage form.
  • the active ingredient is a protein molecule such as the above-mentioned antibody or a low molecular weight compound
  • it may be administered as it is or as a suitable pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for administration may contain the active ingredient and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • Such a pharmaceutical composition is provided in a dosage form suitable for oral or parenteral administration.
  • an injection is used, and the injection may include dosage forms such as intravenous injection, subcutaneous injection, intradermal injection, intramuscular injection, drip injection, etc.
  • Such an injection can be prepared according to a known method.
  • the injection can be prepared by dissolving, suspending, or emulsifying the antibody or low molecular weight compound of the present invention or a salt thereof in a sterile aqueous liquid or oily liquid that is usually used for injections.
  • an aqueous liquid for injection for example, physiological saline, an isotonic liquid containing glucose or other adjuvants, etc.
  • solubilizing agent for example, alcohol (e.g., ethanol), polyalcohol (e.g., propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant (e.g., polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)), etc.
  • alcohol e.g., ethanol
  • polyalcohol e.g., propylene glycol, polyethylene glycol
  • nonionic surfactant e.g., polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)
  • an oily liquid for example, sesame oil, soybean oil, etc. are used, and may be used in combination with benzyl benzoate, benzyl alcohol, etc. as a solubilizing agent.
  • the prepared injection solution is preferably filled into a suitable ampule.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (including soft capsules), syrups, emulsions, suspensions, etc.
  • Such compositions are produced by known methods and may contain carriers, diluents, or excipients commonly used in the pharmaceutical field. Examples of carriers and excipients for tablets include lactose, starch, sucrose, and magnesium stearate.
  • parenteral or oral pharmaceutical compositions are advantageously prepared in dosage unit forms that correspond to the dosage of the active ingredient.
  • dosage unit forms include tablets, pills, capsules, and injections (ampoules).
  • Proteinaceous molecules such as antibodies and low molecular weight compounds are usually contained in an amount of 0.1 to 500 mg per dosage unit form, preferably 5 to 100 mg for injections and 10 to 250 mg for other dosage forms.
  • the dosage of the above-mentioned pharmaceutical containing the above-mentioned antibody or other proteinaceous molecule or low molecular weight compound or its salt will vary depending on the subject, symptoms, and route of administration, but for example, a single dose of an antibody or low molecular weight compound is usually about 0.0001 to 20 mg/kg of body weight, and low molecular weight compounds are administered orally or parenterally about 1 to 5 times a day, while antibodies and other proteinaceous molecules are administered by intravenous injection once a day to once every few months. Similar amounts can also be administered in other parenteral and oral administrations. If symptoms are particularly severe, the dosage may be increased according to the symptoms.
  • the active ingredient of the inhibitor of the present invention is a nucleic acid molecule
  • it can be administered orally or parenterally (e.g., intravascular administration, subcutaneous administration, topical application, etc.) as a liquid preparation or as a pharmaceutical composition in an appropriate dosage form to humans or non-human warm-blooded animals (e.g., rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, chickens, etc.; including HTLV-1-infected model animals such as humanized mice), preferably humans.
  • non-human warm-blooded animals e.g., rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, chickens, etc.; including HTLV-1-infected model animals such as humanized mice, preferably humans.
  • a pharmaceutical containing the nucleic acid molecule as an active ingredient can be formulated and administered according to a method known per se. That is, the nucleic acid molecule may be used alone, or may be inserted in a functional manner into an expression vector for suitable mammalian cells, such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, or an adenovirus-associated virus vector.
  • the nucleic acid may be administered as is or together with an adjuvant for promoting uptake, by a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter. Alternatively, it may be aerosolized and administered locally into the trachea as an inhalant.
  • the nucleic acid may be formulated (injectable) alone or together with a carrier such as liposome, and administered intravenously, subcutaneously, or the like.
  • the nucleic acid molecule may be administered per se or as a suitable pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for administration may contain the nucleic acid of the present invention and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • a pharmaceutical composition is provided in a dosage form suitable for oral or parenteral administration.
  • compositions are advantageously prepared in a dosage unit form that matches the dosage of the active ingredient.
  • dosage unit forms include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), etc.
  • the nucleic acid of the present invention is preferably contained in an amount of, for example, about 0.01 to 500 mg per dosage unit form.
  • the dosage of the above-mentioned pharmaceutical containing a nucleic acid molecule as an active ingredient varies depending on the subject, symptoms, administration route, etc., but for example, it is convenient to administer a single dose of the nucleic acid molecule at about 0.0001 to 20 mg/kg body weight by intravenous injection once a day to once every six months. Similar amounts can also be administered in other parenteral and oral administrations. When symptoms are particularly severe, the dosage may be increased according to the symptoms.
  • Gal-3 inhibitors under clinical development such as GB1107, TD139, GB1211, GCS-100, and GR-MD-02 (belapectin) as the active ingredient
  • the dosage and administration methods used in each clinical trial can be used as a reference.
  • Examples of in vivo administration of 4-F-GlcNAc in mice include the following: Sixty mice were given 4-F-GlcNAc intraperitoneally at 100 mg/kg/day for nine consecutive days, with no acute side effects (Cedeno-Laurent F. J Invest Dermatol 132(2):410-20.(2012)). Six- to eight-week-old mice were given 4-F-GlcNAc intraperitoneally at 50-250 mg/kg/day for six days, with anti-inflammatory effects and no toxicity other than limited toxicity at 250 mg/kg/day (Dimitroff CJ. J. Clin Invest 112: 1008-18.(2003)).
  • mice The anti-inflammatory effects at 100 mg/kg/day were observed as inhibition of polylactomine-based PSGL-1 (a ligand for selectins) and reduced migration of infiltrating inflammatory cells.
  • 100 mg/kg/day in mice is equivalent to a human dose of 5,000 mg (5 g)/day, assuming a body weight of 50 kg.
  • mice were also administered 0.25 mg/ml 4-F-GlcNAc in water for 7 days, with an average of 4.5-5.0 ml/day in drinking water, resulting in an oral intake of 2.25-2.5 mg/day.
  • Serum MS-TOF results showed that the average serum concentration was 0.66 ⁇ 0.20 mM (660 ⁇ 200 ⁇ M).
  • IC 10 (10% inhibitory concentration) values of at least 200 ⁇ M or 150 ⁇ M (based on a 36-hour doubling culture).
  • Treatment with 50 ⁇ M 4-F-GlcNAc suppressed P-selectin ligand (PSGL-1) on T cells by 96% (Dimitroff C. Blood 101(2): 602-10. (2003)).
  • Treatment with 10-100 ⁇ M suppressed E-selectin ligand by 50% (Descheny LJ Invest Dermatol 126(9): 2065-2073. (2006)).
  • selectin ligands modified to include LacNAc on O-glycans
  • T cells could be inhibited at concentrations that did not affect T cell growth, which is consistent with the estimated blood concentrations that can be achieved by oral administration to humans.
  • the oral administration of 4-F-GlcNAc to humans can be calculated based on the dosage for mice, with an oral dose of 760 mg/day for a human weighing 50 kg, or approximately 1,500 mg/day for a human weighing 75 kg, resulting in a blood concentration of 100 ⁇ M. This amount generally has a safety factor of about 10 times.
  • oral administration of 4-F-GlcNAc at a dose of 760 mg/day in a human weighing 50 kg, or approximately 1,500 mg/day in a human weighing 75 kg, resulting in a blood concentration of 100 ⁇ M can suppress the LacNAc N-glycan on T cells of HTLV-1-infected individuals at a concentration that does not affect T cell growth, and can serve to inhibit cell-to-cell infection within the bodies of HTLV-1-infected individuals.
  • the oral dosage for humans of the Gal-3 inhibitor GB1107 has not yet undergone clinical trials, so the dosage for mice can be used as a reference for conversion.
  • Gal-3 is expressed in human T cells, macrophages, fibroblasts, epithelial cells, and cancer cells.
  • the dosage of the Gal-3 inhibitor GB1107 for humans can be determined from a report on the administration of GB1107 to a mouse cancer model (Vuong L. Cancer Res 79(7): 1480-92. (2019)).
  • LLC1 mouse Lewis lung carcinoma cells
  • A549 cells were transplanted into CD-1 nude mice
  • LLC1 did not grow at all in the gal3-/- mice, and M2 macrophages were reduced in the body. This shows that Gal-3 is necessary for lung cancer.
  • mice transplanted with human lung cancer A5405 Gal-3 and tumor weight were significantly reduced in the GB1107-treated group.
  • GB1107 was orally administered at 10 mg/kg once a day for consecutive days, and the number of lymphocytes such as CD3 and CD4 did not change from the control group, while the number of CD8 was higher in the treatment group. In terms of a human weighing 50 kg, this can be calculated by orally administering GB1107 at 500 mg/day, or at 750 mg/day for a human weighing 75 kg.
  • LEL is known to be non-toxic (Nachbar MS. J Biol Chem 255(5):2056-61. (1980)) and can be administered intravenously. As there are no similar clinical trials in humans, the results can be calculated based on the administration example in mice.
  • vascular endothelial cells particularly those in the central brain and spinal cord, express LacNAc and are stained with LEL. For this reason, it is being considered to identify damaged areas by visualizing the vascular network in animals using intravenous perfusion of labeled LEL, as well as to develop it for medical imaging purposes. For example, it has been reported that LEL disappeared from the venous blood within two minutes of intravenous injection into mice at 100 ⁇ g/100 ⁇ l, stained the vascular endothelium one minute to one hour later, and was difficult to detect in the same tissue 12 hours later (Robertson RT. Histochem Cell Biol. 143(2):225-34. (2015)).
  • This amount of LEL corresponds to the concentration and amount of 250 mg/250 ml administered intravenously in a human weighing 50 kg.
  • the more appropriate dosage can be evaluated by quantifying Gal-3 mRNA and protein in the target human peripheral blood CD4 positive T cells.
  • the inhibitor of the present invention is the first drug consisting of a compound capable of inhibiting cell-to-cell infection of HTLV-1, and is extremely useful in that it makes it possible to suppress the progression and improve symptoms in HAM patients.

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Abstract

本発明は、N-アセチルラクトサミン（LacNAc）とガレクチン-3（Gal-3）との間の相互作用を阻害する物質を含有する、ヒトT細胞白血病1型ウイルス（HTLV-1）細胞-細胞間感染阻害剤を提供する。

Description

ＨＴＬＶ－１細胞－細胞間感染阻害薬、ＨＴＬＶ－１感染症治療薬、ＨＴＬＶ－１関連脊髄症（ＨＡＭ／ＴＳＰ）治療薬
　本発明は、ヒトT細胞白血病ウイルス1型（HTLV-1）に起因する疾患であるHTLV-1関連脊髄症（HAM/TSP）の治療薬、HTLV-1無症候性キャリアを含むHTLV-1感染者の状態及びHTLV-1に起因する合併症を含むHTLV-1感染症の治療薬、あるいは機序的な呼称としてHTLV-1細胞-細胞間感染阻害薬に関する。より詳細には、本発明はHTLV-1感染者体内におけるHTLV-1プロウイルスあるいはHTLV-1感染者感染細胞の増殖形式であるHTLV-1感染細胞-非感染細胞間感染を阻害する物質及び化合物に関する。
　難治希少疾患である成人T細胞性白血病（Adult T-cell leukemia: ATL）、HTLV-1関連脊髄症（HTLV-1-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis: HAM/TSP、以下、単に「HAM」という場合がある。）の原因であるレトロウイルスHTLV-1は、HTLV-1感染者体内で、ヒトCD4陽性Tリンパ球のDNA中にプロウイルスとして組み込まれて感染し、ヒト体内での細胞分裂ないしクローン拡大と、HTLV-1感染細胞-非感染細胞間感染（HTLV-1 cell-to-cell infection）という主な２つの様式で、感染細胞数、即ちHTLV-1プロウイルス量の体内増加をきたす。また母乳を介した母児感染、精液、血液を介した水平感染で個体間伝播する。
　無症候性キャリアを含めたHTLV-1感染者は、日本で約108万人、世界的には約2,000万人いるとされている。感染細胞が遺伝子変異及び腫瘍化してクローン増殖するATLや、感染細胞の脊髄内浸潤により炎症を起こすHAMはこれら感染者から1～6％程度が発症するとされるが、いまだ根治療法はなく、ATLに関しては生命予後も不良である。無症候性キャリアは治療によるHTLV-1プロウイルス量減量は行われていないが、ATLに進展する高リスクキャリアが存在することは知られている。しかし、HTLV-1感染やHAMに対する治療薬開発や臨床試験はほとんど行われておらず、ATLに対する開発が日本で数件行われているのみである。
　ATLに対しては、HTLV-1感染細胞の60～70％程度に発現している表面マーカーCCR4に対するモノクローナル抗体モガリズマブ（商品名ポテリジオ、協和キリン株式会社）が上市されているが、治療中にクローン交代現象が起こり、根治できない。また、HAMに対するポテリジオの効果を調べる臨床試験が近年行われたが、一度は感染細胞数の減少を認めるもののすぐに元の量に戻ってしまい、上市には至らなかった。HTLV-1感染細胞の表面マーカーを治療標的とする限り、同様の結果が予想される。
　HAMに対しては、炎症を抑えるため対症療法として経口ステロイド、IFN-α注射があるが、HTLV-1プロウイルス量の減少効果は小さく、現状維持が実情である。
　本発明者らは以前、チロシンキナーゼ阻害薬（TKI）がHTLV-1感染細胞特異的に細胞死を誘導することを見出し、抗HTLV-1薬・HAM治療薬として有効であることを示した（例えば、特許文献１を参照）。これは表面マーカーではなくHTLV-1感染特異的なシグナル伝達経路の重要な分子であるABLチロシンキナーゼを標的とするため、クローン交代現象とは無縁であり、投与継続可能な限りHTLV-1感染細胞数を減少させ続けられる可能性がある。
　しかし、上述の通り、感染者体内での感染細胞数（HTLV-1プロウイルス量）増加の機序としては、感染細胞の分裂と、感染細胞-非感染細胞間感染の２つの様式があるため、TKIはHTLV-1感染細胞特異的に細胞死を誘導することで前者を阻止することはできるが、後者には十分対処することができない。従って、HTLV-1の細胞-細胞間感染を阻害する薬剤の開発が求められる。しかし、非感染細胞上のウイルスレセプターはユビキタスな分子の集合体であることが判明しており、治療標的とはしにくい。
　細胞-細胞間感染の新たな構造としてHTLV-1感染CD4陽性T細胞の周囲に、種々の細胞外マトリクス、BST-2/tetherin、Gal-3、CD62、O型糖鎖（O-グリカン）であるシアリルルイスXなどによるバイオフィルム様細胞外ウイルス構造物が存在し、ここにウイルス粒子が付着し、非感染細胞へ移動することにより感染拡大するという機序が判明している（特許文献２、非特許文献１）。
　ガレクチン-3（Gal-3）はβ-ガラクトシドと結合する約130アミノ酸からなる特徴的な糖鎖認識ドメインを有するタンパク質である。Gal-3はHTLV-1感染T細胞でtaxによりトランス活性化され高発現しているが、非感染T細胞でも弱く恒常発現している。Gal-3は膜タンパク質結合糖鎖であるN-アセチルラクトサミン（Galβ1、4GlcNAc、LacNAc）とリガンド-レセプターの関係にあり、Gal-3の5量体とLacNAcとの間で格子を形成することが知られている。しかしながら、HTLV-1感染細胞上の高発現糖鎖は知られておらず、ましてLacNAcと非感染細胞上のGal-3との相互作用（以下、LacNAc-Gal-3 axisと呼称することもある）がHTLV-1感染細胞-非感染細胞間感染に関与するなどということは、本発明者らが発見するまでは全く知られていなかった。
　代謝的LacNAc生合成阻害薬である過アセチル化4-フッ化グルコサミンアナログ（2-acetamido-1,3,6-tri-O-acetyl-4-deoxy-4-fluoroglucopyranose；4-F-GlcNAc）は、白血球内でLacNAc前駆物質であるウリジン-2-リン酸-N-アセチルグルコサミン（uridine diphosphate-N-acetylgulucosamine: UDP-GlcNAc)産生を阻害することにより、白血球上のLacNAc発現低下を示すことが報告されている（特許文献３、非特許文献２）。また、Gal-3阻害薬であるGB1107（3,4-dichlorophenyl 3-deoxy-3-[4(3,4,5-trifluorophenyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl]-1-thio-α-D-galactopyranoside）が特発性肺線維症の治療薬として開発されている（特許文献４、５）。しかし、これらの薬剤をLacNAc-Gal-3 axisを阻害する薬剤として臨床応用するという研究報告や、HTLV-1感染症を標的とした治療薬に用いる研究に関する報告は皆無である。
国際公開第2018/025923号 国際公開第2011/070545号 国際公開第03/093410号 国際公開第2016/120403号 国際公開第2020/248068号
Pais-Correia AM., et al. Nat Med. 2010;16(1): 83-9. doi: 10.1038/nm.2065. Barthel SR, et al. J Biol Chem. 2011;286(24): 21717-31. Epub 2011/04/16. doi: 10.1074/jbc.M110.194597.
　本発明の目的は、HTLV-1の細胞-細胞間感染における感染細胞側及び非感染細胞側の重要分子を同定し、それらの相互作用を阻止することによりHTLV-1細胞-細胞間接触感染を阻害し、HTLV-1感染細胞あるいはHTLV-1プロウイルス量増殖を抑制することにより、HAM及びHTLV-1感染症を治療する手段を提供することである。
　本発明者らは、上記の目的を達成すべく、レクチンアレイを用いてHAM患者由来のCD4陽性T細胞膜タンパク質の網羅的糖鎖解析を行った結果、HTLV-1感染CD4陽性T細胞の膜表面に有意に高発現する糖鎖としてLacNAcを同定した。本発明者らは、LacNAcが細胞-細胞間感染に関与するのではないかと考え、感染細胞上に高発現するLacNAcと非感染細胞上に恒常発現が知られているLacNAc特異的リセプターであるGal-3との間のレセプター-リガンド関係に着目した。そこで、HTLV-1感染性アッセイにおいて、感染細胞上のLacNAcを標的にLacNAc特異的レクチンであるSTL、UDA、LELや、LacNAc生合成代謝阻害薬である4-F-GlcNAcで処理するか、あるいは、非感染細胞上のLacNAcリガンドGal-3を標的としてGal-3阻害薬GB1107で処理すると、HTLV-1感染性が阻害された。さらに、細胞接合体形成アッセイにおいて、4-F-GlcNAc処理により接合体形成が阻害された。細胞-細胞間感染阻害と接合体形成阻害は強相関し、いったん接合体形成すると不可逆的に感染する、即ち、接合体形成から細胞-細胞間感染は分割できない一連の過程であることが示唆された。
　本発明者らはこのように、HTLV-1細胞-細胞間感染には、HTLV-1感染CD4陽性T細胞上に高発現する二糖糖鎖LacNAcが標的である非感染CD4陽性T細胞上のGal-3との間のレセプター-リガンド相互作用（LacNAc-Gal-3 axis）が関与すること、本発明の薬剤の作用機序はこの相互作用を阻害することにより接合体形成阻害を介してHTLV-1細胞-細胞間感染を阻害することを明らかにし、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は以下の通りである。
［項１］N-アセチルラクトサミン（LacNAc）とガレクチン-3（Gal-3）との間のリセプター-リガンド相互作用を阻害する物質を含有する、ヒトT細胞白血病1型ウイルス（HTLV-1）細胞-細胞間感染阻害剤。
［項２］LacNAcとGal-3 との間のリセプター-リガンド相互作用を阻害する物質が、
（ａ）LacNAcの膜表面への発現を阻害する物質、
（ｂ）LacNAcに結合し、LacNAcとGal-3との結合を阻害する物質、
（ｃ）Gal-3に結合し、LacNAcとGal-3との結合を阻害する物質、又は
（ｄ）Gal-3の発現を阻害する物質
である、項１に記載の阻害剤。
［項３］前記（ａ）の物質を含有し、且つ該物質が、
（ａ１）UDP-GlcNAc:betaGal beta-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase 2（B3GNT2）
もしくはbeta-1,4-galactosyltransferase 1（B4GALT1）の阻害薬、又は
（ａ２）代謝的LacNAc生合成阻害薬
である、項２に記載の阻害剤。
［項４］前記（ａ２）の阻害薬を含有し、且つ該阻害薬が過アセチル化4-フッ化グルコサミン（4-F-GlcNAc）である、項３に記載の阻害剤。
［項５］前記（ｂ）の物質を含有し、且つ該物質がセイヨウイラクサレクチン（Urtica dioica agglutinin: UDA）又はジャガイモレクチン（Solanum Tuberosum (Potato) lectin: STL）又はトマトレクチン（Lycopersicon Esculentum (Tomato) lectin: LEL）である、項２に記載の阻害剤。
［項６］前記（ｃ）の物質を含有し、且つ該物質が、GB1107、TD139、GB1211、GCS-100、及びGR-MD-02(belapectin)からなる群より選択される、項２に記載の阻害剤。
［項７］HTLV-1関連脊髄症（HAM/TSP）及びHTLV-1感染症の治療用である、項１～６のいずれか一項に記載の阻害剤。
［項８］HTLV-1感染者におけるHTLV-1細胞-細胞間感染を阻害する方法であって、有効量のLacNAcとGal-3 とのリセプター-リガンド相互作用を阻害する物質を、該感染者に投与することを含む、方法。
　本発明によれば、LacNAcとGal-3 との間のリセプター-リガンド相互作用を阻害することでHTLV-1の細胞-細胞間感染を阻害することができ、感染細胞数（HTLV-1プロウイルス量）の増加を抑制することができるので、HTLV-1関連脊髄症（HAM）、HTLV-1感染症の治療に有用である。
HAM患者、無症候キャリア（AC）及び非感染者（NC）由来CD4陽性T細胞膜タンパク質の網羅的糖鎖解析（レクチンアレイによるグライコーム）の結果を示す図である。
　塩析法で抽出したHAM、AC、NC各4例の膜蛋白を蛍光色素Cy3標識し、種々の濃度（2,000, 1,000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25 ng/ml）の検体100 μlを１ウェルに載せ、4℃で17時間インキュベートした。GlycoStation Reader 1200で取得した生画像をGlycoStaion Tools 2.0 software（いずれもGPBioscience KK., 東京。現在は　Glycotechnica　KK, Ltd. 横浜市, に移管）で信号強度に数値化した。低信号強度のデータセットでの比較可能なデータを高信号強度のデータセットで飽和している部分を最小二乗法で補間することにより利用した（Kuno A. Journal of Proteomics & Bioinformatics. 1(2): 68-72.(2008)）。レクチンアレイのダイナミックレンジはこのように統合して、統合ネットレクチン信号強度を解析に用いた。さらに正規化レクチン信号強度を次式のように算出して比較した。
　　平均ネットレクチン信号強度
　　　　= (45種のネット信号強度の総和)/45
　　　　= {45種の（生の信号強度－バックグラウンド)の総和}/45
　　各レクチンの正規化信号強度 
　　　　= (各レクチンのネット信号強度)/(平均ネットレクチン信号強度)×100
レクチン信号強度の高低は特異的親和性を持つ糖鎖発現の高低を意味している。HAM、AC、NC３群比較には全レクチンでシグナル強度が飽和していなかった検体の蛋白濃度250 ng/mlでのデータを規格化し用いた。
　図の横軸はCy3標識正規化レクチンシグナル強度を示す。縦軸はLecChip ver1.0 (GPBioscience)上に搭載されたレクチンである。黒色、灰色、白色のバーはそれぞれ陰性対照（NC）、無症候性キャリア（AC）、HAM患者由来のCD4陽性T細胞膜蛋白のレクチンシグナル強度を示す。スチューデントt検定、ボンフェローニ補正によるHAM、NC間比較で、*: P <0.0167、†: P< 0.0033でそれぞれ有意差があることを示す。
　実線枠内のLEL、STL、UDAのみがHAMで有意に高信号だった。これらはキチン結合性レクチンheveinファミリーで二糖特異性がN-アセチルラクトサミン（LacNAc）である。HAM患者のCD4陽性T細胞膜タンパク質はLacNAc糖鎖が有意に高発現していることが示唆された。
HAM患者、無症候キャリア及び非感染者由来CD4陽性T細胞でのLacNAc発現とLacNAc生合成酵素B3GNT2遺伝子発現、HTLV-1プロウイルス量の関係を示す図である。
a. Enzyme-linked lectin assay (ELLA)によるLacNAcの検証
　STL固相化プレート（STL-immobilized microwell strip, AlerCHECK, Inc., Springvale, MA., U.S.A.）にHAM、AC、NC由来のCD4陽性T細胞膜蛋白各8検体を膜蛋白濃度333.33 μg/mlの等量に調製しPBSで1: 20に希釈した検体50 μlを密封、室温30分間振盪インキュベートした。内因性アビジン/ビオチンをAvidin/biotin Blocking Kit (Thermo Fisher Scientific KK., 東京)でブロッキング後、100 μlの2.5 μM biotinylated UDA（EY laboratories）を入れて密封し室温1時間振盪インキュベートした。1%BSA-PBS中に5 μMに希釈したStreptavidin-Alexa488 conjugate (Thermo Fisher Scientific) をウェルに50 μl加え、密封し37℃1時間振盪インキュベートした。蛍光強度をプレートリーダーTecan Infinite M200 (Tecan Japan Co., Ltd. Tokyo, Japan)でEx 490/Em 525 nmを測定した。なお標準曲線作成のため標準物質N-acetyllactosamine (LacNAc) (Calbiochem, Sigma-Aldrich Japan KK., 東京)を4.0 μM から開始する1: 5希釈系列を作成し使用した。検体中LacNAc濃度は測定した蛍光強度と標準曲線により決定し希釈率から逆算した。検体は独立した３つの実験で各々三重測定し、HAM検体またはAC検体とNC検体間での２群間の比較はマン・ホイットニーU検定、ボンフェローニ補正で行い、P <0.0167を有意、n.s.：有意差なし、とした。HAMとNCの間は有意差がみられ、HAM>AC>NCの順にLacNAc濃度の平均値は高く、レクチンアレイの結果をSTL固相化プレートによるELLA法でも同様に検証できた。
b. LacNAc生合成責任酵素B3GNT2 mRNA発現
　HAM、AC、NC由来のCD4陽性T細胞由来のRNA検体各10例を用いて、LacNAc生合成責任酵素とされるB3GNT2遺伝子（Gene ID: 10678）（Togayachi A. Proc Natl Acad Sci U S A. 104(40):15829-34.(2007)）のmRNA variant 1(NCBI Reference Sequence: NM_006577.6）の発現をqRT-PCRΔΔCt法で検討した。プライマーは
　B3GNT2 mRNA forward, 5’-ACTCGGGGAGGTTAAAGACC-3’ (1515-1534)（配列番号１）; 
　B3GNT2 mRNAreverse, 5’- GCCACAGACTGTCCTGGTATCT-3’ (1589-1610)（配列番号２）;
　GAPDH mRNA transcript variant 2 forward, 5’-GACTAACCCTGCGCTCCTG-3’ (133-151)（配列番号３）; および
　GAPDH mRNA transcript variant 2 reverse, 5’-GCCCAATACGACCAAATCAG-3’ (268-249) （配列番号４）。
塩基配列番号は、参照配列(B3GNT2 mRNA: NM_007313.2; およびGAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), transcript variant 2, mRNA: NM_001256799.2)の番号に一致している。GAPDH mRNAは内在性対照遺伝子として用いている。増幅サイクルは50°C, 2min 1サイクル; 95°C, 10 min 1サイクル; 95°C, 15 secおよび60°C 1 minを40サイクル。HAM検体またはAC検体とNC検体間での２群間の比較はマン・ホイットニーU検定、ボンフェローニ補正で行い、*: P <0.0167で有意、n.s.：有意差なし。ACとNC間では有意差はなかったが、HAMとNC間では有意にHAMでB3GNT2遺伝子発現が高値であった。HAM末梢血HTLV-1感染細胞ではLacNAc生合成酵素のB3GNT2遺伝子高発現によりLacNAc高発現をきたしていることが示唆された。
c. TaqManプローブを用いたリアルタイムPCR絶対法によるHTLV-1プロウイルス量（PVL）測定
　b. と同じ検体のAC、HAM患者由来PBMC各10例で通常のHTLV-1プロウイルス量測定法（Nagai M. J Neurovirol.4(6): 586-93.(1998)）に従って測定した。独立した３つの実験で三重測定し、２群間の比較はマン・ホイットニーU検定、ボンフェローニ補正で行い、*: P <0.05で有意とした。HAM患者検体で有意にACよりもHTLV-1プロウイルス量は高値だった。
d. HAM患者、ACにおけるHTLV-1プロウイルス量とLacNAc生合成酵素B3GNT2 mRNA遺伝子発現の相関関係
　〇: HAM患者、△: ACでの個々のデータを示す。Pearsonの相関係数、P値を図中に示す。Pearsonの相関分析を行った。*: P <0.05で有意差あり。図中の直線は回帰直線である。HAM患者、ACのHTLV-1 PVLのいずれか一方とLacNAc生合成酵素遺伝子B3GNT2 mRNA発現量間では有意な相関はみられなかった。しかしHTLV-1感染者全体（HAM患者、AC合計）ではHTLV-1 PVLとB3GNT2 mRNA発現量間ではピアソンの相関係数 R = 0.54（P = 0.013）と有意な中等度の相関を認めた。このことから、HTLV-1感染によりB3GNT2 mRNA の転写活性化されていることが示唆される。
HTLV-1感染細胞株・非感染細胞株上のLacNAc発現を示すフローサイトメトリー分析結果を示す図である。ａ．STL染色によるFACSヒストグラム。ｂ．UDA染色によるFACSヒストグラム。ｃ．UDA染色による免疫組織化学。
　HTLV-1感染ヒトT細胞株（HUT102、C91/PL、及びMT-2）、HTLV-1非感染ヒトT細胞株（Jurkat及びMolt-4）に対し、特異的レクチン染色を行った。LacNAc糖鎖は特異的レクチン染色により染色バッファーに1: 100倍希釈したSTL-DyLight488 conjugate (EY labs)か、1:200倍希釈biotinylated UDA（EY laboratories）と1: 200倍希釈Streptavidin-Alexa Fluor488 conjugate (EY laboratories)の組み合わせのいずれかで染色した。各染色は透過処理を行わず、室温15分インキュベートした。特異的レクチン染色（STLまたはUDAによる）した検体と未染色検体間のLacNAc発現比較は、細胞株を用いて細胞株上のLacNAc相対発現比を次式のように算出した：
　　細胞株での細胞表面LacNAc相対発現比
　　= (特異的レクチン染色した細胞のMFI)/(染色していない細胞のMFI)
またフローサイトメトリー用にUDA染色したものの一部をガラススライドに載せ、DAPIによる各染色を加えてレーザー顕微鏡Leica SP8 microscopeにより同一条件下1,890倍で撮影した。フローサイトメトリー分析はすべてCytoFLEX flowcytometerとCytoExpert software ver.2.0 (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA., U.S.A.)を使用して行った。
　染色/未染色MFI比は感染・非感染細胞両方で陽性だった。これは癌細胞である細胞株ではLacNAc発現していない正常リンパ球と異なりLacNAc発現が陽性であることを示す。
　STLシグナルMFI比はHTLV-1感染細胞と非感染細胞間であまり差はみられないが、LacNAcを示すフローサイトメトリーでのUDAシグナルではHTLV-1感染細胞の方が非感染細胞に比べより高いMFI比を示した。UDAの免疫蛍光顕微鏡所見でも同様だった。STLはLacNAcよりもPoly-LacNAcにより特異的なレクチンである。a～c の所見から、細胞株では特異的レクチン染色で非感染細胞株も含め細胞表面にLacNAcが存在することが示されること、感染細胞株ではより高発現であること、Poly-LacNAcよりもLacNAcの高発現の方がよりHTLV-1感染と関連するということが示唆された。
HAM患者由来末梢血単核球上のLacNAc発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す図である。ａ－ｄ．HTLV-1感染細胞のマーカーCADM1/TSLC1とLacNAc発現（特異的レクチンSTL、UDAにて染色）との関係を示す。ｅ，ｆ．HTLV-1感染細胞のマーカーCADM1/TSLC1の発現度とLacNAc発現（特異的レクチンSTL、UDAにて染色）との関係を示す。
　HAM患者7例のPBMCをマウスモノクローナル抗CADM1抗体（宮崎大学医学部機能制御学講座腫瘍生化学分野森下和広教授の供与による）、ヤギ抗マウスIgG1-PE（Southern Biotech, Birmingham, AL., U.S.A.)、マウスモノクローナル抗ヒトCD4抗体（DAKO）、ヤギ抗マウスIgG1-PC5（CD4-PC5）、および特異的レクチンによるLacNAc糖鎖染色は、染色バッファーに1: 100倍希釈したSTL-DyLight 488 conjugate (EY labs)か、1: 200倍希釈biotinylated UDA（EY laboratories）と1: 200倍希釈Streptavidin-Alexa Fluor488 conjugate (EY laboratories)の組み合わせのいずれかで染色した。各染色は透過処理を行わず、室温15分インキュベートした。臨床検体によるHTLV-1感染細胞、非感染細胞間のLacNAc発現の比較は、HTLV-1感染者由来PBMCを用いてHTLV-1感染細胞上のLacNAc相対発現比を次式のように算出した：
　　HTLV-1感染細胞での細胞表面LacNAc相対発現比
　　　= (CADM1+ 細胞のMFI)/(CADM- 細胞のMFI) 
　　　 （MFI: mean fluorescent intensity）
特異的レクチン染色（STLまたはUDAによる）した検体と未染色検体間のLacNAc発現比較は、細胞株を用いて細胞株上のLacNAc相対発現比を次式のように算出した：
　　細胞株での細胞表面LacNAc相対発現比
　　　　= (特異的レクチン染色した細胞のMFI)/(染色していない細胞のMFI)
CADM1+細胞、CADM1-細胞間のLacNAc相対発現比の比較は対応のある t検定で行った（P <0.05）。
　CADM1+CD4+細胞での細胞表面LacNAc相対発現比はSTL染色、UDA染色でそれぞれ1.47倍、1.99倍（図４a及びc）だった。7例の検討では細胞表面LacNAc相対発現比は両染色ともCADM1-細胞よりもCADM1+細胞で有意に高値だった（P = 0.018、b及びd）。このようにLacNAc染色レベルとCADM1染色レベル、即ちLacNAc発現レベルとHTLV-1感染レベルは平行しているということが示唆される。これはHTLV-1 PVLとB3GNT2 mRNA発現レベルとの強相関を支持している。逆に、STL、UDAいずれの特異的レクチン染色によるLacNAc発現もCADM1-CD4+T細胞すなわち正常CD4+T細胞では明らかに発現していないことを示している。これはN-アセチルラクトサミンが正常CD4+T細胞では発現していないことが既に報告されている（Campos L. Eur J Cancer 28(1):37-41.(1992）ことと一致している。
細胞生存性アッセイによるHTLV-1細胞-細胞間感染阻害薬の候補化合物（STL、UDA、4-F-GlcNAC、GB1107）の評価を示す図である。　a. STL, b. UDA, c. 4-F-GlcNAc, d.およびe. GB1107のHTLV-1細胞-細胞間感染阻害薬の候補化合物の種々の薬剤処理濃度によるHTLV-1感染細胞株（C91/PL, MT-2）、非感染細胞株（Jurkat, Molt-4）に対する薬剤処理48時間後の細胞生存率を示す。
　ヒトCD4陽性T細胞由来のHTLV-1感染細胞株、非感染細胞株をRPMI1640培地中に5×103 個/ウェルの密度で96ウェルポリスチレンプレート上に三重に（各細胞3ウェル）撒いた。LacNAc特異的レクチンSTL, UDA, LacNAc生合成代謝阻害薬4-F-GlcNAc, LacNAcの生体内特異的リガンドであるGal-3阻害薬GB1107の種々の濃度存在下・非存在下で37℃、5%CO2インキュベーターで48時間培養した。その後XTT Cell Proliferation Kit II (Roche Diagnostics K.K., 東京)を用いてXTT法（2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide）による細胞生存性アッセイを行った。XTT法は、テトラゾリウム塩が生細胞のみでホルマザン色素に開裂される生物還元反応を用いて、生細胞数と色素の相関を利用して比色分析する。プレートリーダーにより最大吸収波長492 nm、参照波長650 nmで測定した。薬剤処理による細胞生存率 (%) は次式で算出した：
　　細胞生存率 = {(薬剤処理下での生細胞数)/(処理なしでの生細胞数)}×100 (%)
独立した実験を３回施行して細胞生存率を算出した。各細胞株で薬剤処理なし（0 μM）と各濃度での細胞生存率を対応のある t検定（Bonferroni補正）を行った。*: P < 0.0167、†: P < 0.003で有意。各グラフの横軸は薬剤の処理濃度（μM）、縦軸は細胞生存率（％）を示す。黒丸、白丸、灰色菱形、白菱形のマーカーはそれぞれC91/PL、MT-2、Jurkat、Molt-4を示す。
　LacNAc特異的レクチンであるSTL、UDAで細胞を処理するとa、bで示すようにHTLV-1感染細胞株（C91/PL、MT-2）は5 μMでは細胞毒性がみられた。STL、UDAとも 5 μM処理でHTLV-1感染細胞株両方とも薬剤処理なし（0 μM）と比べ有意に細胞生存率低下を認めた。0.1 μM、1 μM処理では有意差はなかった。
　またcで示すように4-F-GlcNAcはHTLV-1感染細胞株（C91/PL、MT-2）に対する細胞毒性がSTL、UDAに比べて低く、100 μMまで細胞毒性が出現しなかった。本実験dおよびeでは、GB1107は感染細胞上でトランス活性化しているGal-3も、非感染CD4陽性T細胞上にも恒常発現しているGal-3も両方標的とする。HTLV-1感染細胞株（C91/PL、MT-2）、及び非感染細胞株Jurkat細胞では10 μM以上で、非感染細胞株Molt-4では100 μMで有意の細胞毒性がみられた。以上の結果により図６で検討する薬物濃度が決められた。
HTLV-1感染性アッセイによるHTLV-1細胞-細胞間感染阻害薬（STL、UDA、4-F-GlcNAC、GB1107）の評価を示す図である。a. 2 μM STL, b. 0.75 μM UDA, c. 100 μM 4-F-GlcNAc, d. 100 μM GB1107。
　HTLV-1 細胞-細胞間感染の評価モデルとしてのHTLV-1感染細胞株（C91/PL, MT-2）、レポータープラスミドトランスフェクト非感染細胞株（Jul）の共培養によるHTLV-1感染細胞-非感染細胞間感染実験系を用い、LacNAc特異的レクチン　a.2 μM STL、b.0.75 μM UDA、過アセチル化フルオロ化グルコサミンアナログ　c. 100 μM 4-F-GlcNAcで24時間処理したHTLV-1感染細胞株を用いたHTLV-1感染性アッセイ、およびGal-3阻害薬　d.100 μM GB1107で24時間処理した非感染細胞株（レポーター細胞Jul）を用いたHTLV-1感染性アッセイ結果を示す。縦軸は算出したHTLV-1感染性（HTLV-1 infectivity）、横軸にはアッセイに用いたTaxドナー細胞あるいはアクセプター細胞（Jul細胞）を処理した薬剤濃度をそれぞれ示す。横軸上の非感染細胞（Jurkat及びMolt-4）はTaxドナー細胞の陰性対照として用いたものである。黒・白棒は薬剤処理なしの薬剤対照細胞溶解液、薬剤処理ありの細胞溶解液、それぞれの算出した平均HTLV-1感染性を示す。エラーバーは標準偏差である。対応のある t検定により、*: P <0.05 で有意、†: P <0.01で有意であることを示す。
　HTLV-1感染細胞をLacNAcの特異的リガンドSTL 2 μM、UDA 0.75 μM、またはLacNAc生合成阻害薬4-F-GlcNAc 100 μMで添加・非添加24時間培養する。感染細胞：Jul細胞を1: 1で2×105 個/2ml/ウェルで共培養48時間、あるいはJul細胞をGal-3阻害薬GB1107 100 μMで添加・非添加24時間培養後HTLV-1感染細胞株と同様に1: 1で2×105 個/2ml/ウェルで共培養48時間後に、細胞溶解液にルシフェリンを添加処理しルシフェラーゼの化学発光をOne-Glo luciferase assay system（Promega Corporation, Maddison, WI, U.S.A.）と分光光度計Tecan Infinite M200 (Tecan Japan Co., Ltd. 東京)を用いて測定した。薬剤対照（薬剤処理なし）、Taxドナー細胞陰性対照（ドナー細胞を感染細胞（C91/PL, MT-2）から非感染細胞（Jurkat及びMolt-4）へ置き換えてJul細胞と共培養して測定したもの）を用いて結果を比較した。薬剤処理した細胞溶解液のHTLV-1感染性は次式により算出した：
　　HTLV-1 infectivity 
　　 = {(薬剤処理した細胞溶解液のルシフェラーゼ化学発光)/(薬剤対照(薬剤処理なし)の細胞溶解液のルシフェラーゼ化学発光)}×100 (%)
独立した3つの実験で三重測定により行った。
　本実験系は、Taxドナー細胞としてHTLV-1感染細胞株（ここではC91/PLまたはMT-2）、アクセプター細胞として非感染細胞株Jul細胞（Jurkat細胞にpLTR-GL3プラスミドをトランスフェクトした細胞）からなるHTLV-1感染細胞-非感染細胞間感染実験系を用いている。HTLV-1感染細胞株から出芽したHTLV-1ウイルス粒子がアクセプター細胞すなわち非感染細胞であるJul細胞の表面のHTLV-1ウイルス受容体（正常細胞上に存在するユビキタスな分子複合体である）に結合・膜融合・侵入し、粒子由来のあるいはウイルスRNAから逆転写・翻訳されたTax蛋白がアクセプター細胞中のpLTR-GL3プラスミド中のtax responsive element (TRE) 21塩基対リピート配列に結合する。これにより下流に組み込まれているレポーター遺伝子ルシフェラーゼ遺伝子が発現し、HTLV-1感染細胞-非感染細胞間感染（cell-to-cell infection）を評価することができる。このようにしてHTLV-1感染性をみるアッセイである。
　pLTR-GL3プラスミドはpLTR-CAT （Fujisawa J., et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 1985. 82(8): 2277-81.(1985)）から作成した。HTLV-1 LTR領域のU3、R、U5の5’側半分にわたる636塩基対の領域(-342～+294)をXho Iリンカー配列を持つフォワードプライマー、Hind IIIリンカー配列を持つリバースプライマーを用いて次のようなプライマーでPCR増幅した:
　　Forward: 5’-CTCGAGATGAGCCCCAAATATCCCCCGG-3’（配列番号５）;
　　Reverse: 5’-AAGCTTAATGAAAGGGAAAGGGGTG GAACT-3’（配列番号６）
下線部はそれぞれリンカー配列である。増幅した断片を制限酵素Xho I とHind IIIで消化したXho I-Hind III断片をpGL2-Basicベクタープラスミド(GenBank: X65323. Promega Corporation, Madison, WI., U.S.A.) に挿入し、pLTR-Lucとした。レポーターのfirefly luciferase遺伝子と転写ターミネーションシグナルをpGL3-Basic ベクター (GenBank: U47295. Promega Corporation, Madison, WI., U.S.A.) の一致する配列と置換したものをpLTR-GL3プラスミドとした。
　各プロット左側2本の黒い棒グラフで示す薬剤対照（薬剤処理しないもの）および右側2本の黒い棒グラフで示すTaxドナー細胞対照ではHTLV-1感染性の効果はなく、また、右側2本の白い棒グラフで示す薬剤処理した非感染細胞でも感染性は薬剤対照と差はなかった。これらの実験系はHTLV-1感染性評価に問題はなく妥当と考えられた。
　aのHTLV-1感染細胞株2 μM STL処理では、感染性はC91/PL、MT-2でそれぞれ84.7±3.7、83.3±5.9%、即ち15.3%、16.7%の感染阻害効果を示した。それに対しbの0.75 μM UDA処理ではC91/PL、MT-2でそれぞれ感染性28.1±4.9、37.8±6.1％であり71.9、62.2％の著明な感染阻害効果を示した。またcのLacNAc生合成代謝阻害薬4-F-GlcNAc 100 μM処理では感染性はC91/PL、MT-2でそれぞれ53.8±4.9、27.9±2.4％で46.2%、72.1%の感染阻害効果を示した。dのGal-3阻害薬GB1107 100 μMによるアクセプターJul細胞処理では、Taxドナー細胞がC91/PL、MT-2の場合それぞれの感染性は0.46±0.03、0.54±0.02％と両者99.5%の感染阻害効果を示しいずれも感染性はほぼ消失していた。
GB1107のJul細胞処理をさらに種々の濃度で行った感染性アッセイ結果を示す（コントロールの棒グラフは省略、*：P < 0.05, †: P < 0.01で対応のあるt検定で有意）。図６dのように、Gal-3阻害薬GB1107によりアクセプターJul細胞を24時間処理後、同様に a. MT-2と48時間共培養、b. C91/PLと48時間共培養すると、1 μMでは有意差がみられないが、GB1107 25 μM - 50 μMでそれぞれ65.7±24.6％、2.0±0.6％とGB1107処理なしのコントロール（100％）に比べ感染性の著明な低下がみられた。
　患者体内への経口投与時にはTaxドナー細胞であるHTLV-1感染CD4陽性T細胞の細胞死効果も図５で示すように考えられるので、GB1107は100 μMよりも低濃度でも十分な治療効果が期待できることが示唆される。
　このように、LacNAc特異的レクチン（STL、UDA）、LacNAc生合成代謝阻害薬4-F-GlcNAc、Gal-3阻害薬GB1107のいずれもHTLV-1感染性阻害効果が認められ、HTLV-1感染症治療薬、HAM治療薬としての意義があることが示された。要約すると、細胞-細胞間感染拡大の機序として、HTLV-1感染CD4陽性T細胞上のLacNAcと、非感染CD4陽性T細胞上のそれに対し強い親和性を持つ生体内リガンドであるGal-3、即ち即ちHTLV-1感染性にはLacNAc-Gal-3レセプター-リガンド相互作用（LacNAc-Gal-3 axis）がHTLV-1感染性に関与すること、及びこれらの分子を阻害すると細胞-細胞間感染を阻害できることが示唆された。
HTLV-1接合体形成アッセイによる4-F-GlcNAcの阻害効果を示す顕微鏡画像である。　HTLV-1感染細胞株（C91/PL、MT-2）1×104個を細胞膜標識のためカルボシアニン蛍光色素DiO（緑色、Ex 484/Em 501 nm）、非感染細胞株Jurkat　2×104個をDiI（赤色、Ex 550/Em 565 nm）でそれぞれ染色して接合体形成を評価した。37℃、5%CO2インキュベーター内で40分間共培養後に蛍光共焦点顕微鏡BZ-X800、BZ-X800 Viewer software ver.1.2.2、BZ-X800 Analyzer software ver.1.1.1 (Keyence Corporation, Osaka, Japan)を用いて、DiO、DiI、微分干渉法の重ね合わせ画像を取得した。a. 4-F-GlcNAc薬物濃度依存性の接合体形成阻害を示す代表的画像。b, c. 接合体形成の代表的拡大画像。それぞれ接合体2個、3個であることを示す。 　注：DiO: 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate, DiO18(3)。励起波長(Ex) 484/蛍光波長(Em) 501 nm。DiI: 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate, Ex 550/Em 565 nm。
HTLV-1接合体形成アッセイによる4-F-GlcNAcの阻害効果（定量的評価）を示す図である。ａ．4-F-GlcNAcによる接合体形成頻度、接合体形成率の抑制。b. HTLV-1 接合体形成アッセイとHTLV-1感染性アッセイの結果の相関。
　HTLV-1感染細胞（緑色）、非感染細胞（赤色）両細胞が接触している接合体形成（conjugate formation）をImageJ softwareにより数えた。感染細胞が1,000個に達する視野まで含めて数え、接合体頻度（/1,000 HTLV-1感染細胞）を以下の式で定義した：
　　接合体頻度（Conjugate frequency）（/1,000 HTLV-1-infected cells）
　　　= {(接合体形成に関与しているDiO染色細胞の総数)/(視野におけるDiO染色細胞の総数)} × 1,000
　接合体頻度を阻害する薬剤の効果は、薬剤処理なしの接合体頻度と比較した薬剤処理ありの接合体頻度の割合として次式のように定義した：
　　接合体形成率（Conjugate formation rate）（%）
　　　= {(薬剤処理ありの場合の接合体頻度)/(薬剤処理なしの場合の接合体頻度)}×100 
独立した３回の実験を行った。
　aは２軸グラフである。棒グラフの左の縦軸は標準偏差を示すエラーバー付の平均接合体頻度（1/1,000 HTLV-1感染細胞）のための軸である。右の縦軸は折れ線グラフのもので、平均接合体形成率（％）を同様に示す。折れ線グラフマーカーのエラーバーは標準偏差である。横軸に記載されている4-F-GlcNAcの濃度はJurkatとの共培養前の48時間のHTLV-1感染細胞処理濃度を示す。黒色、白抜きの棒グラフはそれぞれC91/PLとJurkat、MT-2とJurkatとの接合体頻度を、また黒丸（●）、菱形（◇）の折れ線グラフマーカーはC91/PLとJurkat、MT-2とJurkatとの接合体形成率を、それぞれ示す。4-F-GlcNAc非処理対照（0 μM）と各濃度処理時結果を対応のある t検定、ボンフェローニ補正で比較した。*: P <0.025、†: P <0.005で有意であることを示す。
　a では、C91/PLとJurkatでの接合体形成時には薬剤（4-F-GlcNAc）非処理対照で接合体頻度472.26±17.00（/1,000 cells）に対し、50 μM処理、100 μM処理で385.51±24.00、343.81±15.63（/1,000 cells）と処理濃度依存性に接合体頻度は減少した。接合体形成率では非処理対照を100%±3.60％とすると、50μM処理で81.63±5.08%（18.37%減少）、100μM処理で72.80±3.19%（27.2％減少）と薬剤処理濃度依存性に接合体形成率低下を認めた。MT-2とJurkatでの接合体形成時には非処理対照で接合体頻度411.05±22.44（/1,000 cells）に対し、50 μM処理、100 μM処理で346.21±27.50、287.95±16.24（/1,000 cells）と同様に濃度依存性に接合体頻度は減少した。接合体形成率では同様に非処理対照を100±5.46%とすると、50μM処理で84.22±6.69%（15.78％減少）、100μM処理で70.05±3.95%（29.95％減少）と、薬剤濃度依存性に接合体形成率を有意に減少させた。
　この結果は4-F-GlcNAcによるLacNAc生合成阻害によりHTLV-1接合体形成が阻害されること、換言するとLacNAc-Gal-3 axisの一部を阻害するとHTLV-1接合体つまり細胞-細胞間接触が阻害されること、逆に言うと接合体形成つまり細胞-細胞間接触にはLacNAcが必要であることを示している。
　bでは、HTLV-1 接合体形成アッセイとHTLV-1感染性アッセイの結果のデータを、細胞と4-F-GlcNAc処理濃度が合致した点にプロットして作成した図である。ここでは4-F-GlcNAc100 μM処理したC91/PLまたはMT-2を用いたHTLV-1感染性アッセイの結果（図６c）に加えて、4-F-GlcNAc 50 μM処理したC91/PLまたはMT-2を用いたHTLV-1感染性アッセイのデータも加えてプロットした。黒塗り丸（●）、黒影付き丸、黒抜き丸（○）はそれぞれC91/PLとJurkatの接合体形成での4-F-GlcNAc 0 μM、50 μM、100 μM処理のデータを示す。塗りつぶし菱形（◆）、影付き菱形、白抜き菱形（◇）はそれぞれ同様にMT-2とJurkatの接合体形成での4-F-GlcNAc 0 μM、50 μM、100 μM処理のデータを示す。プロット中の「r = 0.93」はC91/PLとJurkat、「r = 0.87」はMT-2とJurkatでのスピアマン順位相関係数をそれぞれ示す。2本の直線はそれぞれC91/PLとJurkatとの接合体形成（グラフ下側）、MT-2とJurkatとの接合体形成（グラフ上側）での単回帰式を示す。
　C91/PLとJurkatによる感染性アッセイ、接合体形成アッセイ結果の相関分析、MT-2とJurkatによる両アッセイ結果の相関分析では、Spearmanの順位相関係数はそれぞれr = 0.93（P <0.01）、r = 0.87（P <0.05）と極めて強い相関を認めた。どちらの感染細胞-非感
染細胞の組み合わせでも4-F-GlcNAc薬剤濃度依存性に感染性、接合体形成を阻害することを示している。
　このように、糖鎖LacNAcを抑制する薬剤4-F-GlcNAcを用いた実験結果として、糖鎖がまったく無関係なHTLV-1感染性アッセイの結果とHTLV-1接合体形成アッセイの結果が強相関したということは、HTLV-1細胞-細胞間感染、接合体形成にHTLV-1感染CD4陽性T細胞上で高発現している糖鎖LacNAcが明らかに関与していることを示す。
　また感染性アッセイ、接合体形成アッセイ結果の強相関から、接合体形成と接触感染は一体不可分、不可逆の過程であるということ、LacNAc-Gal-3相互作用（LacNAc-Gal-3 axis）を阻害すると接合体形成阻害を介して感染性阻害できるということが示唆された。このような機序を阻害する薬剤であるHTLV-1接合体形成阻害薬即ちHTLV-1細胞-細胞間感染阻害薬は感染性を阻害することによりHTLV-1プロウイルス量を抑制するので、臨床応用された場合はHTLV-1感染症治療薬、HAM治療薬であることが示唆された。
　本発明は、LacNAcとGal-3 とのリセプター-リガンド相互作用を阻害する物質を含有する、HTLV-1細胞-細胞間感染阻害剤（以下、「本発明の阻害剤」ともいう。）を提供する。
　HTLV-1感染CD4陽性T細胞は、膜表面タンパク質結合糖鎖上にLacNAcエピトープを高発現している。LacNAcはガラクトースとN-アセチルグルコサミンとがβ-1,4-結合した構造を有し、N型糖鎖の末端に、UDP-GlcNAc:betaGal beta-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase 2（B3GNT2）及びbeta-1,4-galactosyltransferase 1（B4GALT1）という2種の糖転移酵素の作用により付加される。本明細書においては、LacNAcが2分子以上重合したpoly-LacNAcも包含する意味で用いられる。
　HTLV-1感染CD4陽性T細胞では、ウイルスタンパク質taxによりGal-3遺伝子がトランス活性化され、β-ガラクトシドと結合するGal-3タンパク質を高発現し、Gal-3は5量体を形成して膜表面でLacNAcと格子構造を形成する。Gal-3は非感染CD4陽性T細胞でも弱く恒常発現しており、感染細胞と非感染細胞とが接合体形成すると、感染細胞上のLacNAcと非感染細胞上のGal-3とのアフィニティにより不可逆的に接合し、感染細胞のGal-3と共局在しているHTLV-1ウイルス粒子が非感染細胞に移行して、細胞-細胞間感染が成立すると考えられる。
　本明細書において「LacNAc-Gal-3 axis」とは、細胞-細胞間感染における感染細胞上のLacNAcと非感染細胞上のGal-3とのレセプター-リガンド関係に基づく相互作用を意味する。従って、「LacNAc-Gal-3 axisを阻害する物質」とは、この相互作用を何らかの機序により遮断する物質であれば特に限定されず、例えば、
（ａ）LacNAcの膜表面への発現を阻害する物質、
（ｂ）LacNAcに結合し、LacNAcとGal-3との結合を阻害する物質、
（ｃ）Gal-3に結合し、LacNAcとGal-3との結合を阻害する物質、及び
（ｄ）Gal-3の発現を阻害する物質
が挙げられる。
（ａ）LacNAcの膜表面への発現を阻害する物質
　前記（ａ）物質としては、膜タンパク質結合糖鎖上にLacNAcが発現するのを阻害し得るものであれば特に制限はなく、その生合成経路のいずれの段階を阻害するものであってよい。例えば、
（ａ１）糖鎖にLacNAcを付加する反応を触媒する２つの糖転移酵素B3GNT2及びB4GALT1の
いずれかの阻害薬、好ましくはB3GNT2阻害薬、
（ａ２）代謝的にLacNAcの生合成を阻害する薬剤、好ましくはLacNAc生合成の基質となるUDP-GlcNAcの産生を低下させる薬剤
等が挙げられるが、それらに限定されない。
　B3GNT2又はB4GALT1の阻害薬としては、例えば、これらの酵素に結合してその酵素活性を阻害する物質が挙げられる。例えば、B3GNT2及びB4GALT1の立体構造はNCBIやUniProtKBデータベースで公開されており（UniProtKB accession No. Q9NY97及びP15291）、ドッキング法など自体公知の手法を用いて阻害薬を探索・同定することができる。あるいは、これらの酵素に結合してその酵素活性を阻害する物質として、当該酵素に対する抗体を挙げることができる。該抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。これらの抗体は、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。抗体のアイソタイプは特に限定されないが、好ましくはIgG、IgMまたはIgA、特に好ましくはIgGが挙げられる。また、該抗体は、B3GNT2又はB4GALT1を特異的に認識し結合するための相補性決定領域（CDR）を少なくとも有するものであれば特に制限はなく、完全抗体分子の他、例えばFab、Fab'、F(ab’) 2等のフラグメント、scFv、scFv-Fc、ミニボディー、ダイアボディー等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、あるいはポリエチレングリコール（PEG）等のタンパク質安定化作用を有する分子等で修飾されたそれらの誘導体などであってもよい。
　あるいは、別の実施態様においては、B3GNT2又はB4GALT1の阻害薬としてこれらの酵素タンパク質の発現を阻害する物質を用いることができる。当該物質は、酵素遺伝子の、転写レベル、転写後調節のレベル、タンパク質への翻訳レベル、翻訳後修飾のレベル等のいかなる段階で作用するものであってもよい。従って、B3GNT2又はB4GALT1の発現を阻害する物質としては、例えば、該酵素遺伝子の、転写を阻害する物質（例、アンチジーン）、初期転写産物からmRNAへのプロセッシングを阻害する物質、mRNAの細胞質への輸送を阻害する物質、mRNAからタンパク質への翻訳を阻害するか（例、アンチセンス核酸、miRNA）あるいはmRNAを分解する（例、siRNA、リボザイム、miRNA）物質、初期翻訳産物の翻訳後修飾を阻害する物質などが含まれる。いずれの段階で作用するものであっても用いることができるが、mRNAに相補的に結合してタンパク質への翻訳を阻害するかあるいはmRNAを分解する物質が好ましい。
　酵素遺伝子のmRNAからタンパク質への翻訳を特異的に阻害する（あるいはmRNAを分解する）物質として、以下の(i)～(iii)のいずれかのものが好ましく例示される。
(i) 酵素遺伝子のmRNAに対してRNAi活性を有する核酸もしくはその前駆体
(ii) 酵素遺伝子のmRNAに対するアンチセンス核酸
(iii) 酵素遺伝子のmRNAに対するリボザイム核酸
　好ましい一実施態様においては、酵素遺伝子のmRNAに対するshRNAをコードするDNAをT細胞特異的プロモーターの下流に機能的に連結した発現ベクターを用いることで、T細胞特異的に該shRNAを発現させることができる。
　LacNAc生合成の基質となるUDP-GlcNAcの産生を低下させる薬剤としては、例えば、4-F-GlcNACや、4位の代わりに3位がフッ素で置換された3-F-GlcNac等（上記特許文献３）を挙げることができるが、それらに限定されない。好ましくは4-F-GlcNACである。該化合物の構造式を以下に示す。
（ｂ）LacNAcに結合し、LacNAcとGal-3との結合を阻害する物質
　前記（ｂ）の物質としては、例えば、リガンドであるGal-3と競合的にLacNAcに結合するアンタゴニストであってもよい。そのようなアンタゴニストとしては、例えば、LacNAcに特異的に結合するレクチン、又はその糖鎖認識ドメインの全部もしくは一部を含むフラグメントを挙げることができる。LacNAcに特異的に結合するレクチンとしては、キチン結合性レクチンheveinファミリーに属する、セイヨウイラクサレクチン（Urtica dioica agglutinin; UDA）、ジャガイモレクチン（Solanum Tuberosum lectin; STL）、トマトレクチン（Lycopersicon Esculentum lectin; LEL）等が挙げられるが、抗原性の観点からはLELが有利であり得る。あるいは、LacNAcアンタゴニストとして、遊離のGal-3又はその糖鎖認識ドメインの全部もしくは一部を含むフラグメントが挙げられる。Gal-3の糖鎖認識ドメインは、C末端側の約130アミノ酸である。ヒトGal-3タンパク質の情報は、例えば、NCBIやUniProtKBデータベースから取得することができる（UniProtKB accession No. P17931）。LacNAcに結合する核酸アプタマー、小分子および他の作用物質は、LacNAcアンタゴニストとして含まれる。LacNAcに結合するアンタゴニストは、例えば、LacNAcとGal-3とを用いた競合アッセイ系を構築し、化合物ライブラリーをスクリーニングすることにより取得することもできる。
　別の一実施態様において、前記（ｂ）の物質は、LacNAcに対する抗体であり得る。該抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。これらの抗体は、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。抗体のアイソタイプは特に限定されないが、好ましくはIgG、IgMまたはIgA、特に好ましくはIgGが挙げられる。また、該抗体は、LacNAcを特異的に認識し結合するための相補性決定領域（CDR）を少なくとも有するものであれば特に制限はなく、完全抗体分子の他、例えばFab、Fab'、F(ab’) 2等のフラグメント、scFv、scFv-Fc、ミニボディー、ダイアボディー等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、あるいはポリエチレングリコール（PEG）等のタンパク質安定化作用を有する分子等で修飾されたそれらの誘導体などであってもよい。
（ｃ）Gal-3に結合し、LacNAcとGal-3との結合を阻害する物質
　前記（ｃ）の物質としては、例えば、レセプターであるLacNAcと競合的にGal-3に結合するアンタゴニストを挙げることができる。そのようなアンタゴニストとしては、例えば、Gal-3に特異的に結合してLacNAcとの相互作用を阻害するGal-3阻害薬が挙げられる。Gal-3阻害薬としては、例えば、GB1107、TD139（特許文献４、５）、GB1211 (Zetterberg FR. J Med Chem 65: 12626-38 (2022))、GCS-100 (Streetly MJ, Blood 115(19): 3939-48 (2010))、及びGR-MD-02（Girard and Magnani, Trends in Glycoscience and glycotechnology, 30(172): SE211-SE220 (2018)）等を挙げることができる。GB1107、TD139、GB1211及びGR-MD-02の構造式を以下に示す。
　Gal-3に結合する核酸アプタマー、小分子および他の作用物質は、Gal-3アンタゴニストとして含まれる。Gal-3に結合するアンタゴニストは、例えば、Gal-3とLacNAcとを用いた競合アッセイ系を構築し、化合物ライブラリーをスクリーニングすることにより取得することもできる。
　別の一実施態様において、前記（ｃ）の物質は、Gal-3に対する抗体であり得る。該抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。これらの抗体は、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。抗体のアイソタイプは特に限定されないが、好ましくはIgG、IgMまたはIgA、特に好ましくはIgGが挙げられる。また、該抗体は、Gal-3を特異的に認識し結合するための相補性決定領域（CDR）を少なくとも有するものであれば特に制限はなく、完全抗体分子の他、例えばFab、Fab'、F(ab’) 2等のフラグメント、scFv、scFv-Fc、ミニボディー、ダイアボディー等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、あるいはポリエチレングリコール（PEG）等のタンパク質安定化作用を有する分子等で修飾されたそれらの誘導体などであってもよい。
　前記（ａ）～（ｃ）の物質として抗体を使用する場合、当該抗体はヒトを投与対象とする医薬品として使用されることから、該抗体（好ましくはモノクローナル抗体）はヒトに投与した場合に抗原性を示す危険性が低減された抗体、具体的には、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、マウス－ヒトキメラ抗体などであり、特に好ましくは完全ヒト抗体である。ヒト化抗体およびキメラ抗体は、常法に従って遺伝子工学的に作製することができる。また、完全ヒト抗体は、ヒト－ヒト（もしくはマウス）ハイブリドーマより製造することも可能ではあるが、大量の抗体を安定に且つ低コストで提供するためには、ヒト抗体産生マウスやファージディスプレイ法を用いて製造することが望ましい。
（ｄ）Gal-3の発現を阻害する物質
　前記（ｄ）の物質としては、Gal-3遺伝子の、転写レベル、転写後調節のレベル、タンパク質への翻訳レベル、翻訳後修飾のレベル等のいかなる段階で作用するものであってもよい。従って、Gal-3の発現を阻害する物質としては、例えば、該遺伝子の、転写を阻害する物質（例、アンチジーン）、初期転写産物からmRNAへのプロセッシングを阻害する物質、mRNAの細胞質への輸送を阻害する物質、mRNAからタンパク質への翻訳を阻害するか（例、アンチセンス核酸、miRNA）あるいはmRNAを分解する（例、siRNA、リボザイム、miRNA）物質、初期翻訳産物の翻訳後修飾を阻害する物質などが含まれる。いずれの段階で作用するものであっても用いることができるが、mRNAに相補的に結合してタンパク質への翻訳を阻害するかあるいはmRNAを分解する物質が好ましい。
　Gal-3遺伝子のmRNAからタンパク質への翻訳を特異的に阻害する（あるいはmRNAを分解する）物質として、以下の(i)～(iii)のいずれかのものが好ましく例示される。
(i) Gal-3遺伝子のmRNAに対してRNAi活性を有する核酸もしくはその前駆体
(ii) Gal-3遺伝子のmRNAに対するアンチセンス核酸
(iii) Gal-3遺伝子のmRNAに対するリボザイム核酸
　好ましい一実施態様においては、Gal-3遺伝子のmRNAに対するshRNAをコードするDNAをT細胞特異的プロモーターの下流に機能的に連結した発現ベクターを用いることで、T細胞特異的に該shRNAを発現させることができる。
　Gal-3は、糖鎖認識ドメイン中にbcl-2サバイバルタンパク質ファミリー共通のNWGRモチーフを有することから、前記（ｃ）又は（ｄ）の物質は、HTLV-1非感染T細胞に作用してLacNAcとの相互作用を阻害して細胞-細胞間感染を阻害するだけでなく、HTLV-1感染細胞に対して細胞死を誘導する効果が期待できる。実際に、後述の実施例においても、GB1107は同濃度の4-F-GlcNACに比べて顕著な細胞感染抑制効果を示すことから、感染細胞の分裂というもう１つのHTLV-1の感染拡大機序に対しても阻害効果を発揮していることが示唆される。
　本発明の阻害剤は、無症候HTLV-1キャリアに投与することにより、細胞-細胞間感染による感染細胞数、即ちHTLV-1プロウイルス量増加を抑制することができるので、HAM、ATL、HTLV-1ブドウ膜炎（HU）等のHTLV-1感染症の発症を予防又は遅延することができる。また、HTLV-1感染症患者に投与することにより該疾患を治療し又は進展を抑制することができる。特に、HAM患者の運動障害度は自然経過で緩徐に増悪し、運動障害度はHTLV-1プロウイルス量と相関することが知られているので、本発明の阻害剤は、HTLV-1プロウイルス量減少によるHAM運動障害度の進展抑制及び改善にも用いることができる。
　従って、本発明はこのようにHAMの治療薬を含め、無症候性キャリアからHTLV-1感染症への発症予防及びHTLV-1感染症患者における該疾患の治療剤を提供する。
　本発明の阻害剤を医薬として用いる場合は、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、その必要のあるヒト（即ち、無症候HTLV-1キャリア、HAM患者等）に対して、経口的または非経口的に投与することができる。
　有効成分が上記の抗体などのタンパク性分子や低分子化合物の場合、それ自体を投与してもよいし、または適当な医薬組成物として投与してもよい。投与に用いられる医薬組成物としては、当該有効成分と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであってもよい。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
　非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記本発明の抗体もしくは低分子化合物またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート80、HCO-50（polyoxyethylene（50 mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。
　経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
　上記の非経口用または経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）が挙げられる。抗体などのタンパク性分子や低分子化合物は、投薬単位剤形当たり通常0.1～500 mg、とりわけ注射剤では5～100 mg、その他の剤形では10～250 mg含有されていることが好ましい。
　上記の抗体などのタンパク性分子もしくは低分子化合物またはその塩を含有する上記医薬の投与量は、投与対象、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、抗体もしくは低分子化合物を1回量として、通常0.0001～20 mg/kg体重程度、低分子化合物であれば１日１～５回程度、経口または非経口で、抗体などのタンパク性分子であれば１日～数ヶ月に１回、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
　本発明の阻害剤の有効成分が核酸分子である場合、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは非ヒト温血動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、ニワトリなど；ヒト化マウス等のHTLV-1感染モデル動物を含む）、好ましくはヒトに対して、経口的または非経口的（例、血管内投与、皮下投与、外用など）に投与することができる。
　当該核酸分子を有効成分とする医薬は、自体公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。即ち、核酸分子を単独で用いてもよいし、あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当な哺乳動物細胞用の発現ベクターに機能可能な態様で挿入することもできる。該核酸は、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することができる。あるいは、エアロゾル化して吸入剤として気管内に局所投与することもできる。
　さらに、体内動態の改良、半減期の長期化、細胞内取り込み効率の改善を目的に、前記核酸を単独またはリポソームなどの担体とともに製剤（注射剤）化し、静脈、皮下等に投与してもよい。
　核酸分子は、それ自体を投与してもよいし、または適当な医薬組成物として投与してもよい。投与に用いられる医薬組成物としては、本発明の核酸と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであってよい。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
　上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）等が挙げられる。本発明の核酸は、例えば、投薬単位剤形当たり通常0.01～500mg程度含有されていることが好ましい。
　核酸分子を有効成分とする上記医薬の投与量は、投与対象、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、核酸分子を１回量として、通常0.0001～20 mg/kg体重程度を、1日～６ヶ月に１回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
　GB1107、TD139、GB1211、GCS-100、GR-MD-02(belapectin)等の臨床開発中のGal-3阻害薬を有効成分として用いる場合は、各臨床試験での用法・用量を参考にすることができる。
　以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これらは単なる例示であって本発明の範囲を何ら限定するものではない。
　LacNAc生合成代謝阻害薬、過アセチル化4-フッ化グルコサミン4-F-GlcNAcのヒトへの経口投与は臨床試験がまだ行われていない。N-グリカン中のLacNAc合成抑制に関する研究は少ないが、O-グリカン中のLacNAc合成抑制に関する研究は比較的多く行われているので、O-グリカン中のLacNAc研究に用いられた動物への投与方法を参考に実際のヒトへの投与方法を検討できる。
　マウスin vivo での4-F-GlcNAc投与実例は以下のようなものがある。
　マウス60頭に4-F-GlcNAc 100 mg/kg/日を腹腔内注射で9日間連続行い、急性期の副作用はなかった（Cedeno-Laurent F. J Invest Dermatol 132(2):410-20.(2012)）。また6～8週齢のマウスに4-F-GlcNAc 50～250 mg/kg/日腹腔内投与を6日間行い、抗炎症効果を認め、250 mg/kg/日で限定的な毒性以外に毒性はなかった（Dimitroff CJ. J. Clin Invest 112: 1008-18.(2003)）。100 mg/kg/日での抗炎症効果がポリラクトミンの骨格を持つPSGL-1（セレクチンのリガンド）の阻害、炎症細胞浸潤の遊走減少として観察された。マウス100 mg/kg/日はヒトでは体重50kgとして5,000 mg (5 g)/日の投与量に相当する。
　またマウス4頭に4-F-GlcNAc 0.25 mg/ml 水溶液を7日間投与し平均4.5～5.0 ml/日飲水し経口摂取量2.25～2.5 mg/日だった。血清のMS-TOF結果から血清中平均濃度は0.66± 0.20 mM（660±200 μM）だった。実験的自己免疫性脳脊髄炎疾患群に薬剤無投与群では疾患発生90%発病、40％死亡が、投与群では82%発病、0%死亡であった。投与群ではTh1/Th17応答が抑制されていた。マウスの体重20gとして上記例では摂取量2.0 mgは体重の1/10,000程度に相当し、体重50kgのヒトでは5 g/日の投与量となる。概算すると体重50kgとして760 mg/日、75kgとして約1,500 mg/日投与で血中濃度100 μMとなる。
　4-F-GlcNAcの白血病細胞細胞死のIC50は34 μMである（Sharma M. Carbohydr. Res. 198, 205-221.(1990))。この文献ではマウスに200 mg/kg/日投与し毒性があった。これは体重50 kgのヒトでは10 g/日の摂取量に相当する。この量を副作用出現の最低摂取量とすると、前出の投与量であれば安全率10倍程度と考えられる。
　また、ヒトT細胞のビトロでの生長阻害試験でIC10（10％発育阻止濃度）は少なくとも200 μM未満または150 μMだった（36時間の倍加時間培養による）。4-F-GlcNAc 50 μM処理でT細胞上P-セレクチンリガンド（PSGL-1）を96%抑制した（Dimitroff C. Blood 101(2): 602-10. (2003)）。また10～100 μMでE-セレクチンリガンドを50％抑制した（Descheny L.J Invest Dermatol 126(9): 2065-2073. (2006)）。
　このようにT細胞の生長には影響しない濃度で、T細胞上の（O-グリカン上のLacNAcを含む修飾された）セレクチンリガンドを抑制することができることを観察しており、これは概算したヒトへの経口投与量で実現できる血中濃度と一致している。
　ヒトへの臨床試験は4-F-GlcNAcではまだ報告がなく、類似化合物であるN-アセチルグルコサミン（GlcNAc）で1件のみ報告されている（Tomonaga A. Exp Ther Med. 12(3):1481-1489.(2016)）。これは健常人75名を3群に分け、偽薬、500または1000 mg（0.5または1.0 g）/日投与し副作用は観察されず、軟骨の保護作用を観察したというものである。
　4-F-GlcNAcのヒトへの経口投与はマウスへの投与量を参考に、ヒト体重50kgとして760 mg/日、75kgとして約1,500 mg/日で血中濃度100 μMとなる経口投与量とすることができる。この量は概ね安全率10倍程度である。
　我々が標的とするT細胞上のN-グリカンのLacNAcは同様な血中濃度で抑制できると考えられるので、4-F-GlcNAcの経口投与はヒト体重50 kgとして760 mg/日、75 kgとして約1,500 mg/日で血中濃度100 μMとなる経口投与量として投与し、T細胞の生長には影響しない濃度で、HTLV-1感染者T細胞上N-グリカンのLacNAcを抑制し、HTLV-1感染者体内での細胞-細胞間感染阻害に供することができる。
　Gal-3阻害薬GB1107のヒトへの経口投与量も、4-F-GlcNAc同様臨床試験がまだないのでマウスへの投与量を参考に換算することができる。
　Gal-3はヒトのT細胞、マクロファージ、線維芽細胞、上皮細胞、癌細胞などで発現している。Gal-3阻害薬GB1107のヒトへの投与量は、マウス担癌モデルにGB1107を投与した報告のデータが参考になる（Vuong L. Cancer Res 79(7): 1480-92. (2019)）。マウスLewis肺癌細胞（LLC1）2.5×105個をgal3－/-C57B1/6マウス、ヒト肺癌細胞株A549細胞を3×106個をCD-1ヌードマウスに移植したところ、gal3－/-マウスでは全くLLC1は生長せず、体内でM2マクロファージが減少していた。このように肺癌にはGal-3が必要であることがわかる。またヒト肺癌A545移植マウスではGB1107投与群でGal-3、腫瘍重量などが著減していた。GB1107は10 mg/kg１日１回連日経口投与でCD3、CD4等のリンパ球は対照群と変化なくCD8は投与群で多かった。体重50 kgのヒトに換算すると、GB1107 500 mg/日、75 kgなら750 mg/日経口投与連日で投与することができる。
　GB1107 はクリアランスがやや低いことが判明しており(1.2 ml/min/kg静脈注射でT1/2=4.5 時間) 経口投与で高利用率である（F = 75%）。またGB1107のマウスのGal-3の親和性は38倍低いとされる（前出Vuong L論文）が、ヒトGal-3への平衡解離定数（Kd）は37 nMと高親和性である（Zetterberg FR. Chem Med Chem 13(2):133-137 (2018)）。以上を考慮すると上記に算出した量よりも大幅に低用量でよい可能性がある。より適切な経口投与量は目的とするヒト末梢血CD4陽性T細胞でのGal-3のmRNA、蛋白の定量で評価することができる。
　LacNAc特異的キチン結合性レクチンheveinファミリーをLacNAc-Gal-3相互作用阻害目的に使用する際には、LELは非毒性であることが知られており（Nachbar MS. J Biol Chem 255(5):2056-61. (1980)）、静脈注射用の投与薬として使用できる。ヒトでの臨床試験は同様にないのでマウスでの投与例を参考に換算できる。
　血管内皮細胞特に脳脊髄の中枢での血管内皮細胞はLacNAcが発現し、LELで染色されることが知られている。このことから標識したLELを静脈灌流し動物で血管網可視化による損傷部位同定、また医療用画像目的の開発等が検討されている。例えばマウスにLEL 100 μg/100 μl を静脈注射2分以内に静脈血から消失し、１分後から1時間後には血管内皮を染色しており、12時間後に同組織でも検出困難となったことが報告されている（Robertson RT. Histochem Cell Biol.143(2):225-34.(2015)）。
　このLELの量は体重50kgのヒトでは250 mg/250 ml で点滴静注する濃度と量に相当する。実施例１，２の他の薬剤と同様により適切な投与量は目的とするヒト末梢血CD4陽性T細胞でのGal-3のmRNA、蛋白の定量で評価することができる。
　本発明の阻害剤は、HTLV-1の細胞-細胞間感染を阻害し得る初めての化合物からなる薬剤であり、HAM患者における症状の進展抑制及び改善を可能にする点で非常に有用である。
　本出願は、2022年11月2日付で日本国に出願された特願2022-176781を基礎としており、ここで参照することによりその内容全体が本明細書中に組み込まれる。

Claims (8)

  1. 　N-アセチルラクトサミン（LacNAc）とガレクチン-3（Gal-3）との間のリセプター-リガンド相互作用を阻害する物質を含有する、ヒトT細胞白血病1型ウイルス（HTLV-1）細胞-細胞間感染阻害剤。
  2. 　LacNAcとGal-3 との間のリセプター-リガンド相互作用を阻害する物質が、
    （ａ）LacNAcの膜表面への発現を阻害する物質、
    （ｂ）LacNAcに結合し、LacNAcとGal-3との結合を阻害する物質、
    （ｃ）Gal-3に結合し、LacNAcとGal-3との結合を阻害する物質、又は
    （ｄ）Gal-3の発現を阻害する物質
    である、請求項１に記載の阻害剤。
  3. 　前記（ａ）の物質を含有し、且つ該物質が、
    （ａ１）UDP-GlcNAc:betaGal beta-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase 2（B3GNT2）
    もしくはbeta-1,4-galactosyltransferase 1（B4GALT1）の阻害薬、又は
    （ａ２）代謝的LacNAc生合成阻害薬
    である、請求項２に記載の阻害剤。
  4. 　前記（ａ２）の阻害薬を含有し、且つ該阻害薬が過アセチル化4-フッ化グルコサミン（4-F-GlcNAc）である、請求項３に記載の阻害剤。
  5. 　前記（ｂ）の物質を含有し、且つ該物質がセイヨウイラクサレクチン（UDA）、ジャガイモレクチン（STL）、又はトマトレクチン（LEL）である、請求項２に記載の阻害剤。
  6. 　前記（ｃ）の物質を含有し、且つ該物質が、GB1107、TD139、GB1211、GCS-100、及びGR-MD-02 (belapectin)からなる群より選択される、請求項２に記載の阻害剤。
  7. 　HTLV-1関連脊髄症（HAM）及びHTLV-1感染症の治療用である、請求項１～６のいずれか一項に記載の阻害剤。
  8. 　HTLV-1感染者におけるHTLV-1細胞-細胞間感染を阻害する方法であって、有効量のLacNAc-Gal-3 間相互作用を阻害する物質を、該感染者に投与することを含む、方法。
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