JP5367776B2 - Ｃｄ４４表面発現を示している細胞の結合検定法及び単離法 - Google Patents

Description

本発明は、癌疾患の診断および処置のための腫瘍細胞の結合検定法及び単離法、詳しくは腫瘍細胞の細胞障害性の調節（ｍｅｄｉａｔｉｏｎ）、および最も詳しくは細胞障害性反応を引き起こすための手段としての癌疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）の使用（一種類以上の化学療法剤と任意に併用させた状態で）による腫瘍細胞の結合検定法及び単離法に関する。

ヒト白血球に対するモノクローナル抗体の産生は、ＣＤ４４抗原の発見をもたらした。このＣＤ４４抗原は、単鎖のヒアルロン酸（ＨＡ）結合糖タンパク質であり、広範囲に及ぶ正常組織および全ての種類の造血細胞上で発現する。ＣＤ４４抗原は、当初、リンパ球活性化およびリンパ球ホーミングに結びつけて考えられていた。現在、一般に考えられているその生理学的役割として、炎症性遺伝子の活性化、細胞周期の変調、細胞増殖の誘導、分化および発現の誘導、細胞骨格再構成および細胞移動の誘導、ならびにアポトーシスに対する細胞生存／耐性も挙げられる。

ヒトでは、ＣＤ４４の単一遺伝子コピーが第１１染色体の短腕（１１ｐ１３）上に位置している。この遺伝子は、１９個のエクソンを含み、最初の５個が定常、次の９個が可変、その後の３個が定常、さらに最後の２個が可変である。選択的スプライシングによって、１，０００を上回る異なったイソホームを得ることができる。しかし、現在のところ、同定された天然の変異体は数十にすぎない。

ＣＤ４４標準糖タンパク質は、Ｎ末端細胞外（２０アミノ酸長のリーダー配列および膜近位領域（８５アミノ酸長）を含む）領域（２７０アミノ酸長）、膜貫通領域（２１アミノ酸長）、ならびに細胞質尾部（７２アミノ酸長）からなる。細胞外領域は、Ｎ末端に連結モジュールも有する。この領域は、９２アミノ酸長であり、多のＨＡ結合連結タンパク質に対して相同性を示す。ヒトＣＤ４４の形態とマウスＣＤ４４の形態とのあいだに高い相同性がある。そのタンパク質の可変型をエクソン５のカルボキシル基末端に挿入すると発現の際に細胞外に位置する。

ＣＤ４４の血清可溶形も天然に生じ、終止コドン（可変領域内）またはタンパク質分解活性のいずれかに起因し得る。ＴＮＦ−αを含む種々の刺激による細胞の活性化によって、腫瘍細胞によるＣＤ４４受容体の遊離放出が生ずる。この受容体の遊離放出は、腫瘍細胞によっても見られ、それによってＣＤ４４の血清濃度が最高１０倍まで増加する。ＣＤ４４の血清濃度が高いことは、悪性（例外として卵巣癌）であることを示唆している。

ＣＤ４４の標準形態は、分子量約３７ｋＤを有するものとして存在する。翻訳後の修飾は、分子量を８０〜９０ｋＤに増加させる。このような修飾として、アスパラギン残基でのアミノ末端細胞外領域Ｎ結合グリコシル化、細胞外領域のカルボキシ末端でのセリン／スレオニン残基のＯ−結合グリコシル化、およびグリコサミノグリカン付加が挙げられる。スプライス変異体の大きさは、８０〜２５０ｋＤの範囲内にある。

ほ乳類動物の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に位置する多糖類であるＨＡは、主要なＣＤ４４リガンドとして考えられる。しかし、コラーゲン、フィブロネクチン、およびラミニン等のタンパク質にＣＤ４４が結合するという知見も得られている。不活性ＣＤ４４（ＨＡに結合せず）のグリコシル化の度合いは最も高く、活性ＣＤ４４（ＨＡに結合）の場合は最も低く、誘導性ＣＤ４４（サイトカイン、モノクローナル抗体、増殖因子等によって活性化されない限り、ＨＡに結合しないか、結合しても弱い）のグリコシル化の度合いは、活性型と不活性型とのおおよそ中間にある。

ＣＤ４４は、細胞の相互作用、刺激、および環境に左右される複数のシグナル伝達経路を介して、その機能の一部を調節することができる。これらの伝達経路の一部として、ＮＦκＢシグナル伝達カスケード（炎症反応に関連）、Ｒａｓ−ＭＡＲＫシグナル伝達経路（細胞周期および増殖の活性化に関連）、タンパク質のＲｈｏファミリー（細胞骨格再構築および細胞移動に関連）、ならびにＰＩ３−Ｋ関連シグナル伝達経路（細胞生存に関連）が挙げられる。上記機能の全てが主要疾患開始および進行と密接に関係している。ＣＤ４４も種々の付加的な機構によって癌の原因に関係があるとされている。これらの機構として、悪性疾患に関係する受容体に対するＣＤ４４の細胞表面上に存在する細胞表面プロテオグリカンによる増殖因子、ケモカイン、およびサイトカインの提示が挙げられる。また、ＣＤ４４−ＨＡ複合体の内在化後にリソソーム・ヒアウロニダーゼによるＨＡの細胞内分解によって、ＥＣＭを介した新脈管形成の誘導と腫瘍侵襲性の可能性とが潜在的に増加し得る。さらに、生存またはアポトーシスのシグナルの伝達は、標準的または可変的ＣＤ４４受容体を介して生ずることが示されている。ＣＤ４４は、細胞分化および移動に関係することも示唆された。全てではないにしても、これらの機構の多くが環境および細胞に依存しており、さらにいくつかは結果にばらつきが生じた。したがって、何らかの結論が出される前に、より多くの研究をおこなうことが求められている。

癌でのＣＤ４４の潜在的な機能的役割を確認するために、ＣＤ４４の発現を検討して、その受容体が疾患進行と相関するかどうかを判断した。しかし、大部分の種類の腫瘍で得られた知見は矛盾するものであり、このことは研究者間で試薬の組み合わせ、手法、病理学的採点法、および細胞種が異なることによると考えられる。腎細胞癌および非ホジキン（Ｈｏｄｇｋｉｎ）リンパ腫は、例外であると思われる。高ＣＤ４４発現腫瘍を有する患者の生存期間は、その対照となる低または非ＣＤ４４発現腫瘍を有する患者の生存期間よりも一貫して短かった。

癌との関連性により、抗癌療法の開発がＣＤ４４を標的としておこなわれてきた。ＣＤＤの標準型または変異型が腫瘍進行に必要かどうかについての論争が依然としておこなわれている。両方の観点を指示する生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）動物データがあり、また一方では腫瘍型に依存し、さらには細胞型にも依存すると考えられる。異なる治療的アプローチとして、可溶性ＣＤ４４タンパク質、ヒアルロナン・シンターゼｃＤＮＡ、およびヒアルロニダーゼの注射と、ＣＤ４４アンチセンスおよびＣＤ４４特異抗体の使用とが含まれていた。各々のアプローチは、ある程度の成功をもたらしたことから、抗ＣＤ４４癌療法に対するサポートが得られた。

変異体ＣＤ４４特異的モノクローナル抗体および標準ＣＤ４４特異的モノクローナル抗体の産生は、実験的におこなわれてきた。しかし、ほとんどの場合、これらの抗体は固有の生物活性を持たず、むしろ該抗体が認識するＣＤ４４のタイプに対して特異的に結合する。しかし、一部のものは、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）または生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）のいずれかで活性を示す（しかし一般に両方で活性を示すことはない）。いくつかの抗ＣＤ４４抗体が、細胞で生ずる現象を調節することが示された。例えば、ヒト赤血球ルセラン抗原ＣＤ４４標準型に対するマウス抗体Ａ３Ｄ８は、ＣＤ（９−１抗体）およびＣＤ（ＯＫＴ３抗体）調節Ｔ細胞活性化を高めることが示され、別の抗ＣＤ４４抗体は類似の効果を生じた。Ａ３Ｄ８は、単球からのＩＬ−１放出およびＴリンパ球からのＩＬ−２放出もおこなう。興味深いことに、ダウノルビシン、ミトキサントロン、およびエトポシド等の薬剤と併用してＡ３Ｄ８の使用は、第二メッセンジャーであるセラミドの生成を抑制することによって、ＨＬ６０およびＮＢ４ＡＭＬ細胞でのアポトーシス誘導を阻害した。固有の活性を持たずＣＤ４４の同様なエピトープに対するＪ１７３抗体は、薬剤誘導アポトーシスを阻害しなかった。８５〜１１０ｋＤおよび２００ｋＤ形のＣＤ４４に対するＮＩＨ４４−１抗体は、ＣＤ４４の交叉結合または凝集であると著者が推測する経路を介して、Ｔ細胞増殖を増強させた。ひとまとめにして考えると、このような抗体が癌に対するもの（例えば、リンパ球の活性化）ではなく、細胞増殖を誘導するものでもなく、あるいは細胞障害性薬とともに使用した際に癌細胞の薬物誘導死をもたらすこともないことから、これらが癌治療を目的とした用途に適しているという証拠はない。

いくつかの抗ＣＤ４４抗体が生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で抗腫瘍効果を示すということが記載された。抗体１．１ＡＳＭＬ（ＣＤ４４の変異体に対するマウスＩｇＧ１）によってラット膵臓腺癌ＢＳｐ７３ＡＳＭＬのリンパ節および肺転移が減少することが示されている。処置した動物の生存は、同時に増加した。この抗体は、リンパ節コロニー形成前に投与される場合のみに効果的であり、リンパ節での細胞増殖を妨げた。生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での腫瘍細胞に対する抗体の直接的な細胞障害性は見られず、この抗体によって補体媒体細胞障害性または免疫エフェクター細胞機能が高められることはなかった。ヒト細胞に対する抗体の有用性については、記載されていない。

ブレイヤー（Ｂｒｅｙｅｒ）他は、同所移植されたラット膠芽腫の進行を中断させるために、ＣＤ４４に対する市販の抗体を用いることを記載した。ラット膠芽腫細胞株Ｃ６を前頭葉に移植し、１週間後、ラットに対して、脳内注射による抗体処置を３回おこなった。処置されたラットでは、腫瘍の増殖減少が示され、また緩衝液またはイソタイプ対照処置ラットよりも高体重であった。抗体は、細胞外マトリックス成分によって被覆されたカバーガラスに対する生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）細胞接着を阻害することが可能であった。しかし、細胞に対する直接的な細胞障害性効果を有しなかった。この抗体の試験は、ヒト細胞に対してはおこなわれなかった。

ＣＤ４４（ＩＭ−７．８．１）に対する抗体の有効性をＣＤ４４ｖ１０（Ｋ９２６）に対する抗体と比較する研究がおこなわれた。高転移性マウス黒色腫Ｂ１６Ｆ１０株（両方のＣＤ４４イソタイプを発現）がマウスに静脈内移植された。２日後から、３日毎に抗体の投与が本研究継続中なされた。両抗体ともに、肺転移の数を、５０％を上回るほど著しく減少させ、２つの抗体間で有効性に有意な差はみられなかった。抗体は、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での増殖に影響を及ぼさず、著者であるザバズキ（Ｚａｂａｄｚｋｉ）他は腫瘍増殖阻害がＣＤ４４とそのリガンドとの相互作用を抗体が阻害することによるものと推測した。ＩＭ−７．８．１を用いた別の研究では、ザバズキ（Ｚａｂａｄｚｋｉ）他は、抗体およびそのＦ（ａｂ’）_２フラグメントがマウスＴ細胞リンパ腫ＬＢによってリンパ節浸潤を阻害することが可能であることを証明した。これは、マウスに対して顕著な延命効果を与えた。ヴァラッハ−ダヤン（Ｗａｌｌａｃｈ−Ｄａｙａｎ）他は、腫瘍を自発的に形成しなＬＢ−ＴＲマウスのリンパ種がＣＤ４４ｖ４−１０によるトランスフェクションによって腫瘍形成能を与えられたことを示した。ＩＭ−７．８．１投与によって、イソタイプ対照抗体と比べて、移植トランスフェクト細胞の腫瘍サイズが減少した。これらの研究のいずれも、この抗体に関するヒトでの有用性については示されなかった。

ＧＫＷ．Ａ３（マウスＩｇＧ２ａ）は、ヒトＣＤ４４に対して特異的であり、ＳＣＩＤマウスでのヒト黒色腫異種移植の形成および転移を妨げる。この抗体を転移性ヒト細胞株ＳＭＭＵ−２と混合して皮下注射した。処置は、その後３週間にわたって続けられた。４週間後、未処置の動物では１００パーセントであるのに比べて、１０匹のマウスのうち１匹のみが注射部位で腫瘍を発生させた。抗体のＦ（ａｂ’）_２フラグメントは、腫瘍形成を同様に阻害することを示したことから、その作用機序が補体または抗体依存性細胞障害に依存しないことが示唆された。初回抗体注射の１週間前に腫瘍細胞を注射した場合、８０パーセントの動物で原発部位に腫瘍が生じた。しかし、留意すべき点は、生存期間が依然として著しく高いということであった。抗体遅延投与が原発腫瘍形成に対して何ら効果を示さなかったことにかかわらず、未処置の動物では存在した肺、腎臓、副腎、肝臓、および腹膜への転移を完全に防いた。この抗体は、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で上記細胞株に対して直接的な細胞障害性をまったく示さないか、あるいはＳＭＭＵ−２細胞の増殖を妨げ、さらに転移または増殖に影響を及ぼすことで腫瘍形成に対して大きな効果を有すると思われる。この抗体の１つの顕著な特徴は、それがＣＤ４４の全てのイソタイプを認識したということであり、このことは治療を目的とした使用の可能性に限界があることを示唆した。

シュトローベル（Ｓｔｒｏｂｅｌ）他は、マウス異種移植モデルでヒト卵巣癌細胞の腹膜移植を阻害するために抗ＣＤ４４抗体（クローン５１５）を用いることを記述している。ヒト卵巣の細胞株３６Ｍ２を、抗ＣＤ４４抗体または対照抗体の存在下で、マウスへ腹腔内移植し、その後の２０日間にわたって処置薬を投与した。５週間後に、抗体処置群の腹膜腔で小結節の数が著しく少なかった。抗ＣＤ４４処置群および対照処置群に由来する小結節の大きさは、同じであり、このことは細胞がひとたび移植されると、抗体は腫瘍増殖に対して何ら効果を示さなかったことを示唆した。細胞を皮下移植した場合も腫瘍増殖に対する効果はなく、抗体それ自体が抗増殖または細胞障害性効果を持たないことを示した。また、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での細胞増殖に対する抗体の効果はみられなかった。

ＶＦＦ−１８（ＢＩＷＡ１ともいう）は、ポリペプチドの３６０〜３７０領域に対して特異的であるＣＤ４４のｖ６変異体に対する高親和性抗体である。この抗体は、１２人の患者の第１相臨床試験で^９９ｍテクネチウム標識複合体として用いられている。この抗体を、頭部および頚部に扁平上皮癌を持つ患者での標的化可能性と安全性とについて、試験した。注射後の４０時間、注射投与量の１４パーセントが腫瘍に取り込まれ、その際、腎臓、脾臓、および骨髄を含む他の器官での蓄積は最小であった。高度に選択的な腫瘍結合は、この抗体の放射免疫療法での役割を示唆している一方で、この抗体の非常に高い親和性が腫瘍のより深い層への浸透を妨げている。ＢＩＷＡ１の適用をさらに制限するものは、マウス抗体の免疫原性（患者１２人中１１人にヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）が生じた）、腫瘍全体に及ぶ異質性の蓄積、および抗体可溶性ＣＤ４４複合体の形成である。ＷＯ０２／０９４８７９は、ＨＡＭＡ応答を克服するために設計されたＶＦＦ−１８のヒト化バージョン（ＢＩＷＡ４と命名）を開示している。ＢＩＷＡ４の抗原結合親和性が親ＶＦＦ１８抗体よりも著しく低いという知見が得られた。驚くべきことに、低親和性ＢＩＷＡ４抗体は、高親和性ＢＩＷＡ８ヒト化ＶＦＦ−８抗体よりも優れた腫瘍取り込み特性を有した。患者３３人に対する第１相臨床試験をおこなうことで、^９９ｍテクネチウム標識および^１８６レニウム標識ＢＩＷＡ４抗体の安全性、耐容性、腫瘍蓄積、および最大許容投与量（^１８６Ｒｅ標識ＢＩＷＡ４の場合）を評価した。^１８６Ｒｅ標識ＢＩＷＡ４の全ての用量で腫瘍反応がみられなかったにみられなかった。しかし、いくつかのものは安定病態を有し、用量規定障害性が６０ｍＣｉ／ｍ^２で生じた。有害事象率は５０〜６５パーセントであり、患者３３人中１２人が深刻な有害事象（血小板減少症、白血球減少症、および発熱）を有すると思われ、またそのうちの６人（全員が^１８６Ｒｅ標識ＢＩＷＡ４による処置を受けた）が処置または経過観察の過程で疾患進行により死亡した。^１８６Ｒｅ標識ＢＩＷＡ４の用量を段階的に増量する第１相試験を患者２０人に対して実施した。口腔粘膜炎および用量規定血小板減少症および白血球減少症が観察され、１人の患者ではＨＡＨＡ反応が出現した。安定病態は、６０ｍＣｉ／ｍ^２という最も高い用量で処置された患者５人にみられた。達成される有効性について安全性および耐容性の両方の面から許容可能であると考えられるにもかかわらず、これらの研究は、臨床試験で他の非放射性同位元素併用生物学的療法に比べて、有害事象率が高い。米国特許出願第２００３／０１０３９８５号は、腫瘍治療を目的として、メイタシオイドを結合させたＶＦＦ−１８のヒト化バージョン（ＢＩＷＡ４と命名）を開示している。ヒト化ＶＦＦ１８抗体（ＢＩＷＡ４）は、毒素（すなわち、ＢＩＷＩ１）を結合した場合に、外陰部ヒト扁平上皮細胞癌、咽頭有棘細胞癌、または乳癌のマウス・モデルで顕著な抗腫瘍効果を示すという知見が得られた。非結合型バージョンであるＢＩＷＡ４は抗腫瘍効果を示さず、また結合型バージョンであるＢＩＷＩ１はヒトでの安全性および有効性に関する証拠を何ら示していない。

ＭａｂＵ３６は、ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂヒト下咽頭癌細胞免疫化ならびに癌および組織特異性に対する選択性によって得られたマウス・モノクローナルＩｇＧ１抗体である。ｃＤＮＡクローニングおよび配列分析を通しての抗原特徴付けは、ケラチノサイト特異的ＣＤ４４スプライス変異体エピカンのｖ６領域をＭａｂＵ３６の標的として特定した。免疫組織化学的検査では、このエピトープが細胞膜に限定されていることが示された。さらに、ＭａｂＵ３６は、頭頚部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）の９４％を強く標識し、またこの腫瘍内で均一な細胞染色がみられた。患者１０人の^９９ｍＴｃ標識ＭａｂＵ３６を検査したところ、ＨＮＳＣＣ癌に対する抗体の選択的蓄積（２日間で２０．４±１２．４パーセント注入量／ｋｇ）がみられ、副作用は報告されていないが、患者２人にＨＡＭＡが発症した。放射性ヨウ素標識マウスＭａｂＵ３６の検査では、患者１８人中、ＨＡＭＡの症例が３件あり、選択的かつ一様なＨＮＳＣＣへの取り込みがみられた。ＭａｂＵ３６の抗原性を低下させるとともにＨＡＭＡの率を低下させるために、キメラ抗体が作られた。キメラおよび本来のマウスＭａｂＵ３６は、いずれもＡＤＤＣ活性を示さなかった。ＭａｂＵ３６が持つ本来の機能活性に関する証拠はみられない。１８６Ｒｅ標識キメラＭａｂＵ３６を用いて、治療薬としてのＭａｂＵ３６の有用性について判断した。この第１相試験では、投薬量増量治験患者１３人に対して、探索量の^９９ｍＴｃ標識キメラＭａｂＵ３６が与えられ、続いて^１８６Ｒｅ標識キメラＭａｂＵ３６が投与された。急性有害事象の報告はなかったが、後処置投与量を制限する骨髄障害性（１．５ＧＢｑ／ｍ^２）が患者３人のうち２人にみられ、また最大許容投与量（１．０ＧＢｑ／ｍ^２）による処置を受けた１人の患者に血小板減少症が認められた。腫瘍サイズに対して多少の効果があったにもかかわらず、これらの効果は処置に対する他感的応答基準を満たすものではなかった。^１８６Ｒｅ標識キメラＭａｂＵ３６に関するさらなる研究は、顆粒球コロニー刺激因子刺激全血返血という戦略を利用して最大耐容活性を２．８Ｇｙに倍化させた。頭頚部に種々の腫瘍を持つ患者９人に対するこの研究で、３人が薬物関連貧血症のために輸血を必要とした。他の障害性として、重度（グレード３）の骨髄障害性および中等度（グレード２）の粘膜炎が挙げられる。安定病態が５人の患者で３〜５ヵ月間達成されたにもかかわらず、客観的腫瘍反応は既報告でなかった。したがって、わかることは、ＭａｂＵ３６が非常に特異的な抗体であるにもかかわらず、抗癌効果を達成するために放射性免疫複合体を必要とすることが障害になって、その有益性が制限されることであり、その理由として、達成される臨床効果に関連して治療に伴う障害性がある。

要約すると、ＣＤ４４ｖ６（１．１ＡＳＭＬ）およびＣＤ４４ｖ１０（Ｋ９２６）モノクローナル抗体は、それぞれ、転移性膵臓腺癌を注射されたラットまたは悪性黒色腫を注射されたマウスの転移活性を減少することが示されている。別の抗ＣＤ４４ｖ６抗体（ＶＦＦ−１８とその誘導体）は、メイタンシノイドまたは放射性同位元素に結合される場合のみに、抗腫瘍効果を有することが示された。抗標準ＣＤ４４モノクローナル抗体は、ラット・グリア芽細胞腫（抗ＣＤ４４）による大脳内進行、マウスＴ細胞リンパ腫によるリンパ節浸潤（ＩＭ−７．８．１）を抑制すること、同様にヌードマウス（クローン５１５）でのヒト卵巣癌細胞株の移植、マウス・メラノーマ細胞株の肺転移（ＩＭ−７．８．１）、およびＳＣＩＤマウス（ＧＫＷ．Ａ３）でのヒト・メラノーマ細胞株の転移を阻害することが明らかになった。放射性同位元素結合ＭａｂＵ３６抗ＣＤ４４ｖ６抗体およびその誘導体は、臨床試験で、顕著な障害性を伴う抗腫瘍活性を有した。これらの結果は、彼らを励ますとともに可能性のある癌療法としての抗ＣＤ４４モノクローン抗体の開発を支持したにもかかわらず、ヒト癌に対する有効性、安全性、および適用性に限界があることを示している。
したがって、癌細胞障害性を調節する抗体組成物が単離されるならば、癌細胞上のＣＤ４４の細胞表面発現に対するその親和性の効用として、有益な診断および治療方法が実現されるだろう。

先行特許
特許文献１は、患者腫瘍由来の細胞にＭＨＣ遺伝子を形質移入するプロセスを開示しており、このＭＨＣ遺伝子はその患者の細胞または組織からクローニングすることが可能である。
特許文献２は、ほ乳類の腫瘍性および正常細胞の細胞内構成要素に対して特異的であり、細胞外構成要素に対しては非特異的であるモノクローナル抗体を得る工程と、そのモノクローナル抗体を標識する工程と、標識された抗体と腫瘍性の細胞を殺すための治療を受けたほ乳類の組織とを接触させる工程と、変性腫瘍細胞の細胞内構成要素に対する標識抗体の結合を測定することによって治療の効果を決定する工程とを含むプロセスを開示している。ヒト細胞内抗原に特異的な抗体を調製する際に、特許権者は悪性細胞がそのような抗原の簡便な供給源であることを認めている。
特許文献３は、新規な抗体とその生産方法とを提供する。詳しくは、この特許は、ヒト腫瘍（例えば、大腸および肺の腫瘍）に関連したタンパク質抗原と強固に結合し、その一方で正常細胞への結合の度合いがかなり低いという性質を持つモノクローナル抗体の形成を教示している。

特許文献４は、癌治療のための方法を提供するもので、この方法は、ヒト癌患者から腫瘍組織を外科的に除去すること、腫瘍組織を処理することで腫瘍細胞を得ること、腫瘍細胞に放射線を照射することで、生存可能ではあるが非腫瘍形成性にすること、ならびにこれらの細胞を用いて、原発性腫瘍の再発を妨げると同時に転移を阻止することが可能な患者用アクチンを調製することを含む癌治療の方法を提供する。この特許は、モノクローナル抗体の開発を教示しており、このモノクローナル抗体は腫瘍の表面抗原に対して反応する。第４段落４５行目（以下参照）に記載されているように、特許権者は、ヒト腫瘍形成で有効かつ特異的な免疫治療を示すモノクローナル抗体の開発で自所性の腫瘍細胞を利用する。
特許文献５は、ヒト上皮性悪性腫瘍に特有であり、かつそれが由来する上皮組織に依存しない糖タンパク質抗原を教示している。
特許文献６は、Ｈｅｒ２発現細胞でアポトーシスを誘導する抗Ｈｅｒ２抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ細胞株、上記抗体を用いて癌を処置する方法、および上記抗体を含む医薬組成物に関する。
特許文献７は、精製されたムチン抗原に対するモノクローナル抗体を生産するための新規ハイブリドーマ細胞株を記載している。
特許文献８は、所望の抗原に特異的な抗体を産生するヒトリンパ球を生産する方法、モノクローナル抗体を生産する方法、およびこの方法によって生産されるモノクローナル抗体に関する。この特許は、特に癌の診断および処置に有用な抗ＨＤヒト・モノクローナル抗体の生産に関する。

特許文献９は、抗体、抗体フラグメント、抗体複合体、およびヒト上皮性悪性腫瘍細胞と反応する単鎖免疫毒素に関する。これらの抗体作用が２倍になるメカニズムは、ヒト癌の表面に存在する細胞膜抗原と反応する点で、また抗体は癌細胞内に内在化する能力を持つという点であり、結合の後で、抗体薬物複合体および抗体毒素複合体の形成に特に有用となる。未修飾形態では、抗体もまた、特定の濃度で細胞障害性を発現する。
特許文献１０は、腫瘍の治療および予防に自己抗体を使用することを開示している。ｓかし、この抗体は、老いたほ乳類の抗核抗体である。この場合、自己抗体は、免疫系で見いだされる自然抗体の一種であると考えられる。なぜなら、自己抗体は「老いたほ乳類」に由来し、自己抗体が実際に、処置している患者に由来することを必要とはしない。また、この特許は老いたほ乳類に由来する天然またはモノクローナル抗核自己抗体とモノクローナル抗核自己抗体を産生するハイブリドーマ細胞株とを開示している。
特許文献１１は、ＣＤ４４遺伝子の変異体エクソンｖ６に対する特異的抗体（ＶＦＦ−１８）とその変異体とを開示している。この抗体は、ラットＣＤ４４ｖ６変異体よりもむしろヒトＣＤ４４ｖ６変異体を認識するという点で、コンパレーター抗体をしのぐ改善である。さらに、この抗体は、ＣＤ４４ｖ６発現のための診断アッセイを開示する。この抗体に関して、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）または生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）での作用はみられなかった。
特許文献１２は、ＣＤ４４遺伝子のヒト・エクソン６Ａによりコードされる配列を含む合成ペプチドに対して産生されたモノクローナル抗体Ｖｅｒ３．１を開示している。詳しくは、この抗体はヒトＣＤ４４の９０ｋＤ形に結合せず、ヘルメス（Ｈｅｒｍｅｓ）−３抗体と区別される。ＣＤ４４のｖ６変異体を検出する方法を提供するとともに、この抗原に基づく悪性転換をスクリーニングして評価するための方法を提供する。血清中の抗原の検出に基づいて免疫疾患をスクリーニングするための方法も提供する。

特許文献１３は、４３アミノ酸ペプチドを産生するヒトＣＤ４４変異体６の１２９ｂｐエクソンに結合する特異的抗体を開示している。このモノクローナル抗体は、いくつかのハイブリドーマ細胞株、すなわちＭＡＫ＜ＣＤ４４＞Ｍ−１．１．１２、ＭＡＫ＜ＣＤ４４＞Ｍ−２．４２．３、およびＭＡＫ＜ＣＤ４４＞Ｍ−４．３．１６によって産生される。この抗体は、新規ＣＤ４４ｖ６アミノ酸配列の少なくともヘキサペプチドを含む融合タンパク質から生ずる。さらに、癌診断に使用し得るエクソン６変異体を検出するための免疫アッセイが開示されている。注目すべきことは、開示されたこの抗体の生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）作用および生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）作用はみられない。
特許文献１４は、ＣＤ４４様ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、このポリヌクレオチドおよびその変異体を用いて組み換えタンパク質を作る方法とを開示している。これらのポリペプチドに対して抗体がクレームされているが、具体例はなく、またそのような抗体を分泌する寄託されたクローンもない。ノーザン・ブロットは、いくつかの種類の組織でポリヌクレオチドの出現を示しているが、このポリヌクレオチドの翻訳および発現に付随する証拠は挙げられていない。したがって、このポリペプチドの遺伝子産物に対して作られた抗体（該抗体は生体外または生体内作用を有すると思われる）が存在していたという証拠はなく、また該抗体がヒトの癌疾患に関連していると考えられる証拠もない。
特許文献１５は、ＣＤ４４の変異体エピトープと反応する抗体と該抗体を用いて変異体を同定する方法とを開示している。この変異体をコードする単離ポリペプチドはラット細胞から単離されたもので、この変異体に対する抗体（ｍＡｂ１．１ＡＳＭＬ）は、分子量１２０ｋＤ、１５０ｋＤ、１８０ｋＤ、および２００ｋＤのタンパク質を認識する。モノクローナル抗体１．１ＡＳＭＬの投与は、同系ラットでのラットＢＳｐ７３ＡＳＭＬの増殖および転移を遅らせた。注目すべきことに、１．１ＡＳＭＬは、ＬＣＬＣ９７ヒト大細胞肺癌に対する反応性が欠けていたことに示されるように、ヒト腫瘍を認識しない。ヒト・ホモログはＬＣＬＣ９７から単離されるが、このホモログを認識する等価な抗体は産生されなかった。したがって、ラットＣＤ４４の変異体に特異的な抗体が作られ、ラット腫瘍の増殖および転移に影響を及ぼすことが示された。より具体的には、本発明者らはこの抗体がヒト癌を認識しないことを指摘している。

米国特許第５，７５０，１０２号公報 米国特許第４，８６１，５８１号公報 米国特許第５，１７１，６６５号公報 米国特許第５，４８４，５９６号公報 米国特許第５，６９３，７６３号公報 米国特許第５，７８３，１８６号公報 米国特許第５，８４９，８７６号公報 米国特許第５，８６９，２６８号公報 米国特許第５，８６９，０４５号公報 米国特許第５，７８０，０３３号公報 米国特許第５，９１６，５６１号公報 米国特許第５，６１６，４６８号公報 米国特許第５，８７９，８９８号公報 米国特許第５，９４２，４１７号公報 米国特許第５，８８５，５７５号公報

本発明者らは、癌疾患の処置に有用である個々にカスタマイズされた抗癌抗体を選択するためのプロセスに対する「個別的患者特異的抗癌抗体」と題された米国特許第６，１８０，３５７号を既に交付されている。この文献の目的のために、用語「抗体」および「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）を同義的に用いることが可能であり、ハイブリドーマ（例えば、マウスまたはヒト）によって産生される無傷の免疫グロブリン、免疫複合体、および必要に応じて、免疫グロブリン・フラグメント、ならびに組換え体タンパク質に、例えばキメラ化免疫グロブリン、ヒト化免疫グロブリン、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、単鎖抗体、組み換え体免疫グロブリン可変領域（Ｆｖ）、および融合タンパク質が挙げられる。タンパク質の構造または機能に有意な効果を生ずることなく、一部のアミノ酸配列がポリペプチド内で変異し得ることは、当該技術分野で十分に理解されている。抗体の分子内転位では、一般に、主鎖領域の核酸またはアミノ酸配列を修飾し得る。このような修飾の例として、限定されるものではないが、置換（好ましくは保存的置換）、欠失、または付加が挙げられる。さらに、標準的な化学療法のための手段（例えば、放射性核種）と本発明のＣＤＭＡＢとを抱き合わせることは、この発明の範囲内であり、このことから上記化学療法剤の使用に注目する。ＣＤＭＡＢもまた、毒素、細胞障害性部位、酵素（例えば、ビオチン複合酵素）、または造血細胞と結合することができ、それによって抗体複合体が形成される。

この出願は、実質的に、癌疾患修飾モノクローナル抗体をコードするハイブリドーマ細胞株の単離を目的とした‘３５７号特許に教示されたような患者特異的抗癌抗体を生産するための方法を利用する。これらの抗体を、１つの腫瘍に対して特異的に作ることができるので、癌治療をカスタマイズすることが可能となる。この出願の文脈の中で、細胞殺害（細胞障害性）または細胞増殖阻害（細胞増殖抑制性）特性のいずれかを持つ抗癌抗体を以下、細胞障害性という。これらの抗体を癌の病期分類および診断の補助として用いることができ、また原発腫瘍と同様に腫瘍転移を処置するために用いることができる。

個別的抗癌処置の見込みは、患者を管理する方法の変化をもたらす。可能性のある臨床シナリオは、腫瘍試料が提示に得られて積み上げられることである。この試料から、既存の癌疾患修飾抗体パネルにより腫瘍の型を決めることができる。患者の病期分類を従来どおりに行うけれども、利用可能な抗体を患者のさらなる病期分類に用いることができる。患者に対して既存の抗体を用いて迅速な処置を施すことができ、および／または腫瘍に特異的な抗体パネルを、本明細書中に概説された方法を用いることで、あるいは本明細書中に開示されたスクリーニング方法と同時にファージ・ディスプレイ・ライブラリーを用いることを介して、生産することができる。他の腫瘍が処置したものと同様のエピトープのいくつかを所有することが可能であることから、産生された抗体の全てを抗癌抗体ライブラリーに加える。この方法にもとづいて産生される抗体は、該抗体に結合する癌を持つ患者の多くで癌疾患を処置するのに有用であると思われる。

実質的に米国特許第６，１８０，３５７号を用いることで、患者の肺腫瘍生検から得た細胞によるマウスの免疫化の後に、マウス・モノクローナル抗体Ｈ４６０−１６−２を得ることができた。Ｈ４６０−１６−２抗原は、異なる組織由来の広範囲なヒト細胞株の細胞表面上で発現した。乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＢ−２３１）および皮膚癌細胞株Ａ２０５８は、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でＨ４６０−１６−２の細胞障害作用の影響を受けやすい。
培養中のＭＢ−２３１細胞に対するＨ４６０−１６−２細胞障害性の効果は、これらの癌細胞に対する抗腫瘍活性により、マウスに移植した場合にさらに拡大した（Ｓ．Ｎ．１０／６０３，０００に開示）。症状発現前異種移植腫瘍モデルは、治療効力を予測する有効な手段と考えられた。
ヒト乳癌の生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）予防モデルでは、イソタイプ対照抗体（構造およびサイズがＨ４６０−１６−２と同一であったが、ＭＢ−２３１細胞を結合することはできなかった）と比較して、Ｈ４６０−１６−２処置が処置期間中の腫瘍増殖抑制において有意な効果を示した（ｐ＜０．００１）。処置相終了時に、Ｈ４６０−１６−２投与マウスでの腫瘍増殖は、対照群のわずか１．３パーセントであった。治療後追跡期間中、Ｈ４６０−１６−２の処置効果が持続し、処置群での平均腫瘍体積が測定相の終わりまで対照群よりも有意に小さかった。基準の抗体有効性として生存率を使用することで、Ｈ４６０−１６−２での死亡リスクが、処置後７０日目で、抗体バッファ対照群の約７１パーセント（ｐ＝０．２８）であると推定された。これらのデータは、Ｈ４６０−１６−２処置が対照群と比較して延命効果を与えることを示した。体重の減少および臨床的苦痛を含む障害性の兆候を何ら誘導するものではなかったことから、Ｈ４６０−１６−２処置が安全であると考えられた。このように、確立されているヒト乳癌モデルで対照群と比較して、Ｈ４６０−１６−２処置による腫瘍増殖の遅延および生存率の強化が得られたことから、Ｈ４６０−１６−２処置が有効であった。

また、確立された生体内腫瘍モデルでＭＢ−２３１細胞に対する抗腫瘍活性を示した（Ｓ．Ｎ．１０／６０３，０００に概説）。Ｈ４６０−１６−２による処置を標準的化学療法薬であるシスプラチンと比較したところ、シスプラチンおよびＨ４６０−１６−２処置群が、抗体希釈バッファまたはイソタイプ対照抗体のいずれかによって処置された群と比較して、平均腫瘍容積が有意に少なかった（ｐ＜０．００１）。Ｈ４６０−１６−２処置は、腫瘍抑制を調節した。この腫瘍抑制は、シスプラチン化学療法による腫瘍抑制の３分の２であるが、シスプラチンによる処置で観察されたような有意な体重減少（１９．２パーセント）がなく（ｐ＜０．００３）、またシスプラチンによる処置で観察されたような処置関連死２件等の臨床的苦痛もみられなかった。Ｈ４６０−１６−２が抗腫瘍活性およびその最小障害性を示すことから、Ｈ４６０−１６−２が魅力的な抗癌治療薬となった。後処理期間中、Ｈ４６０−１６−２は有意な延命効果を示した（ｐ＜０．０２）。なぜなら、Ｈ４６０−１６−２群で死亡するリスクが、処置後７０日を過ぎたところで、イソタイプ対照抗体群での死亡のリスクの約半分であった。観察された延命効果は、処置後１２０日を過ぎても持続し、Ｈ４６０−１６−２処置群の致死率が６７パーセントであったのに対してイソタイプ対照群およびシスプラチン処置マウスの致死率は１００パーセントがであった。Ｈ４６０−１６−２は、イソタイプ対照抗体群と比較して２６パーセント、腫瘍増殖を遅らせることで、腫瘍抑制を保った。処置後３１日目に、Ｈ４６０−１２−２は、イソタイプ対照群と比較して、腫瘍増殖を４８パーセント減少させることで、腫瘍のサイズを制限した。この腫瘍増殖減少は、処置終了時に観察される４９パーセント減少に匹敵する。確立された乳癌腫瘍モデルでは、これらの結果は、処置相を超えて腫瘍抑制効果を保つＨ４６０−１６−２の可能性を示し、また全身腫瘍組織量を減少せるとともにほ乳類の生存率を高める抗体の能力を示した。

確立された生体内乳癌モデルの有益な効果に加えて、化学療法薬（シスプラチン）と組み合わせたＨ４６０−１６−２処置は、確立した生体前立腺癌モデルではＰＣ−３細胞に対して抗腫瘍活性を呈した。対応のあるｔ−検定を使用して、Ｈ４６０−１６−２とシスプラチンとを組み合わせた処置が、バッファ対照群（ｐ＜０．０００１）、シスプラチン単独による処置（ｐ＝０．００４）、またはＨ４６０−１６−２単独による処置（ｐ＜０．０００１）よりも、処置後、より短時間で腫瘍増殖を抑制する点で有意な効果があった。処置相終了時に、Ｈ４６０−１６−２とともにシスプラチンを与えられたマウスは、バッファ対照群のたった２８．５パーセントしか増殖しなかった。ＰＣ−３・ＳＣＩＤ異種移植モデルに関して、疾患進行の代用指標として、体重を用いることができる。実験した全ての群のマウスで著しい体重減少が生じた。この研究では、全ての群のマウスが処置期間終了までに約２３ないし３５パーセントの体重減少を示した。Ｈ４６０−１６−２を処置した群は、体重減少の度合いが最も低かった（２１．７パーセント）。処置後、４８日目、バッファ対照群と比較してＨ４６０−１６−２およびシスプラチンの処置に関連した体重減少の有意な増大はみられなかった（ｐ＝０．５０４２）。したがって、Ｈ４６０−１６−２とシスプラチンとを組み合わせた処置は、ヒト前立腺癌の十分確立されたモデルでのイソタイプ対照処置群と比較して、腫瘍の増殖が遅れた。

Ｈ４６０−１６−２エピトープが薬物標的であることを実証するために、正常ヒト組織でのＨ４６０−１６−２の発現を事前に測定した（Ｓ．Ｎ．１０／６０３，０００）。この研究を、抗ＣＤ４４抗体、すなわちクローンＬ１７８（Ｓ．Ｎ．１０／６４７，８１８に概説）およびクローンＢＵ７５（本明細書に概説）との比較まで広げた。Ｈ４６０−１６−２によるＩＨＣ染色によれば、組織の大部分がＨ４６０−１６−２の発現に失敗した。これらの組織には、肝臓、腎臓（管状上皮細胞の周辺染色を除く）、心臓、および肺等の重要な臓器が含まれる。組織染色の結果が示すことは、Ｈ４６０−１６−２が種々の細胞型に対しての結合が制限されるが、浸潤マクロファージ、リンパ球、および線維芽細胞への結合を示すことを示唆した。ＢＵ７５抗体は、類似の染色パターンを示した。しかし、顕著な違いが少なくとも１つあった。すなわち、リンパ球の染色は、Ｈ４６０−１６−２と比較して、ＢＵ７５よりも強度が高かった。
Ｈ４６０−１６−２抗原の局在化と、集団（例えば、乳癌患者間）内でのその有病率の決定とが、Ｈ４６０−１６−２の治療的使用の評価と有効な臨床試験の設計とに重要である。癌患者の乳癌腫瘍でのＨ４６０−１６−２抗原発現に対処するために、５０人の乳癌患者から得た腫瘍組織試料のスクリーニングを、Ｈ４６０−１６−２抗原（Ｓ．Ｎ。１０／６０３，０００）の発現に関しておこない、Ｌ１７８（Ｓ．Ｎ．１０．６４７，８１８）と比較した。本研究は、Ｈ４６０−１６−２の染色をＢＵ７５および抗Ｈｅｒ２抗体ｃ−ｅｒｂＢ−２と比較した。本研究の結果は、以前の結果と類似しており、組織試料の６２パーセントがＨ４６０−１６−２抗原に関して陽性に染色され、一方乳癌腫瘍の７２パーセントがＢＵ７５に関して陽性に染色された。患者試料内でのＨ４６０−１６−２の発現は、染色が悪性細胞に限られていることから、癌細胞に対して特異的であることが示された。Ｈ４６０−１６−２は、乳癌患者由来の正常組織試料１０個のうち４つを染色し、一方ＢＵ７５は８つを染色した。Ｈ４６０−１６−２およびＢＵ７５抗原の両方の乳房腫瘍発現は、悪性細胞の細胞膜に主に局在化して現れ、ＣＤ４４が治療にとって好適な標的となった。Ｈ４６０−１６−２発現を、エステロゲンおよびプロゲステロンというホルモンに対する受容体の乳房腫瘍発現にもとづいて、さらに評価した。これらのホルモンは、乳房腫瘍の進行、処置、および予後にとって重要な役割を演じる。Ｈ４６０−１６−２の発現と、エステロゲンまたはプロゲステロンのいずれもの受容体の発現との間で、なんら相関関係は生じなかった。腫瘍細胞の病期、あるいは癌進行の度合いに基づいて腫瘍を分析する場合、ここでもＨ４６０−１６−２抗原発現と腫瘍病期との間に明らかな相関がなかった。同様の結果は、ＢＵ７５で得られた。ｃ−ｅｒｂＢ−２と比較して、Ｈ４６０−１６−２は完全に異なる染色の様相を示しており、Ｈ４６０−１６−２抗原に対して陽性である乳房腫瘍組織の５２パーセントがＨｅｒ２発現に対して陰性であり、今までにない標的療法が乳癌患者に求められていることを示した。Ｈ４６０−１６−２およびＨｅｒ２の両方について陽性である乳房腫瘍組織切片間の染色強度にも違いがあった。ｃ−ｅｒｂＢ−２抗体もまた、正常乳房組織切片の一つを陽性染色した。

Ｈ４６０−１６−２の潜在的かつ治療的な利益を広げるために、種々のヒト癌組織内の抗原の頻度および局在化もまた、既に決定されており（Ｓ．Ｎ．１０／６０３，０００）、またクローンＬ１７８との比較もなされた（Ｓ．Ｎ．１０／６４７，８１８）。これらの腫瘍型の大部分はまた、Ｌ１７８抗原に陽性であった。ヒト乳房腫瘍組織と同様に、Ｈ４６０−１６−２およびＬ１７８の局在化は、腫瘍細胞の膜上で生じた。しかし、Ｈ４６０−１６−２抗体と比較して、Ｌ１７８による実質的に多くの膜局在化があった。また、Ｈ４６０−１６−２およびＬ１７８の両方によって染色された腫瘍型のうち、４３パーセントの組織がＬ１７８抗体によって、より強く染色されることが示された。
文献のＩＨＣデータとの比較に基づいて本明細書中に示したＩＨＣデータに正確に一致するＣＤ４４の形状はないように思われる。ＣＤ４４の標準形は、通常、ヒト脳で発現されるが、Ｈ４６０−１６−２抗原は発現されない。総（ｐａｎ−）ＣＤ４４イソフォームに対する抗体は、肝臓（クッパー細胞）を染色せず、生殖周期の全ての相で子宮内膜腺を陽性に染色する。Ｈ４６０−１６−２抗原は、クッパー細胞上に明らかに存在しており、また生殖周期の分泌子宮内膜腺に存在するだけである。Ｈ４６０−１６−２抗原は、明らかに組織マクロファージに存在し、また変異形Ｖ４／５およびＶ８／９は、しばしばマクロファージ染色を示す。抗ＣＤ４４Ｌ１７８と比較して、類似はしているが異なる結合パターンがＨ４６０−１６−２に見られたことから、Ｈ４６０−１６−２抗原がＣＤ４４の特異エピトープであることをＢＵ７５が示している。

既に概説されたように（Ｓ．Ｎ．１０／６４７，８１８）、追加の生化学データもまた、Ｈ４６０−１６−２によって認識される抗原がＣＤ４４の形状のうちの一つであることを示した。このことは、ＣＤ４４に対して反応性のあるモノクローナル抗体（Ｌ１７８）が免疫沈降によってＨ４６０−１６−２に結合するタンパク質であることを示す研究によって支持された。ウェスタン・ブロッティングによる研究もまた、Ｈ４６０−１６−２によって認識されるＣＤ４４のエピトープがｖ６またはｖ１０に存在しないことを示唆した。Ｈ４６０−１６−２エピトープもまた、炭水化物であることおよび立体配座依存性であることによって区別され、一方多くの抗ＣＤ４４抗体がＣＤ４４のペプチド・タンパク質に向けられている。これらのＩＨＣおよび生化学的結果は、Ｈ４６０−１６−２がＣＤ４４抗原の変異体と結合することを示した。したがって、証拠の優越は、Ｈ４６０−１６−２が、ＣＤ４４の変異体に存在するユニークな炭水化物依存性立体配座的エピトープのライゲーションを介して抗癌作用を調節することを示している。この発明の目的のために、上記エピトープは、ハイブリドーマ細胞株Ｈ４６０−１６−２、その抗原結合フラグメント、またはその抗体複合体にコードされるモノクローナル抗体に結合する能力によって特徴づけられる「ＣＤ４４抗原部位」として定義される。

Ｈ４６０−１６−２抗癌作用の背後にあるメカニズムを説明するために、ヒアルロン酸（ＨＡ）結合アッセイをおこなった。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１がＨＡに対して５０パーセント付着する上で、平均濃度が１．８７（±１．０１）μｇ／ｍｌのＨ４６０−１６−２を必要とすることがわかった。このような結果から、Ｈ４６０−１６−２が、少なくとも部分的に、ＨＡへの結合に関与するＣＤ４４上の領域と相互作用し、それによってＥＣＭを介して新脈管形成または腫瘍侵襲性の下方制御を通してその抗癌効果を解明し得ることが示された。ＨＡ結合アッセイに加え、細胞周期実験を、Ｈ４６０−１６−２生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）および生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）抗癌作用が細胞周期の調節によるものであるかどうかを判断するためにおこなった。２４時間後かつ２０μｇ／ｍｌのＨ４６０−１６−２で、イソタイプ対照群と比較して、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１アポトーシス細胞の数が増加した。この効果はまた、用量依存的であるように思われた。したがって、Ｈ４６０−１６−２の有効性もまた、全体的または部分的に、そのアポトーシス誘導能によるものと言えるかもしれない。

全体として、このデータは、Ｈ４６０−１６−２抗原が癌関連の抗原であり、またヒトで発現され、病理学的に関連した癌標的であることを示している。さらに、このデータは、ヒト癌組織に対するＨ４６０−１６−２抗体の結合も示しており、診断、治療の予知、または予後であるアッセイに適切に利用される。さらに、この抗原の細胞膜局在化は、多くの非悪性細胞で抗原の発現が欠如していることによる細胞の癌状態を表し、さらに、この観察は、診断、治療の予知、または予後であり得るアッセイに使用される、この抗原、その遺伝子または誘導体、そのタンパク質または変異体の使用を可能にする。

他の研究は、抗ＣＤ４４抗体の使用を伴うもので、Ｈ４６０−１６−２によって示されない治療的な可能性に限界がある。Ｈ４６０−１６−２は、生体外および生体内抗腫瘍活性の両方を示す。ＭＡＫ＜ＣＤ４４＞Ｍ−１．１．１２、ＭＡＫ＜ＣＤ４４＞Ｍ−２．４２．３、およびＭＡＫ＜ＣＤ４４＞Ｍ−４．３．１６は、それらに帰する生体外および生体内細胞障害性を持たず、ＶＦＦ−１８およびＭａｂＵ３６は、何ら固有の腫瘍細胞障害性を示さない。また、生体内腫瘍効果を示す他の抗Ｄ４４抗体もまた、Ｈ１４０−６−２では明白ではないある種の制限を有する。例えば、ＡＳＭＬ１．１，Ｋ２９６、抗ＣＤ４４，およびＩＭ−７８．１は、ラット、マウス、異種モデルで増殖するラットおよびマウス腫瘍に対して、それぞれ生体内抗腫瘍活性を示す。Ｈ４６０−１６−２は、ヒト癌モデルで抗腫瘍活性を示す。Ｈ４６０−１６−２はまた、ヒトＣＤ４４に特異的であり、一方ＡＳＭＬ１．１等の抗体はラットＣＤ４４のみを認識する。クローン５１５抗ＣＤ４４抗体は、ヒト卵巣細胞株の腹膜腫瘍移植を阻害するが、腫瘍増殖の防止または阻害をおこなうものではない。Ｈ４６０−１６−２は、ＳＣＩＤマウス異種移植モデルにおけるヒト乳房腫瘍増殖を抑制することができる。ＧＫＷ．Ａ３は、抑制性ではあるが確立されたモデルではないモデルにおいてマウスで増殖するヒト転移黒色腫の腫瘍増殖を阻害する能力を持つ抗ヒトＣＤ４４モノクローナル抗体である。Ｈ４６０−１６−２は、ヒト乳癌の予防的および確立されたマウス異種移植モデルで有意の抗腫瘍活性を示した。したがって、既に説明した抗ＣＤ４４抗体と比較して、Ｈ４６０−１６−２は優れた抗腫瘍特性を有することが、かなり明瞭である。
それは、ＳＣＩＤマウスにおけるヒト乳房腫瘍で生体外および生体内抗腫瘍活性が示され、ヒトＣＤ４４に向けられている。ヒト乳癌の予防的および確立された（より臨床的に関連する）モデルで活性を示すとともに、ヒト前立腺癌の確立されたモデルでシスプラチンによる活性を示す。

全体として、この発明は、投与された際にほ乳類で抗原を発現している癌の全身腫瘍組織量を減少させることが可能であり（したがって疾患進行が遅れる）、また処置を受けたほ乳類の生存期間を延ばすことが可能である治療薬の標的としてのＨ４６０−１６−２抗原の使用を教示している。この発明はまた、ＣＤＭＡＢ（Ｈ４６０−１６−２）およびその誘導体を、それの抗原に対して使用することで、腫瘍を持つほ乳類での癌の全身腫瘍組織量を減少させ、かつこの抗原を発現する腫瘍を持つほ乳類の生存期間を延ばす。また、この発明は、それの抗原に結合した後に、Ｈ４６０−１６−２が、ヒアルロン酸と相互作用する癌細胞の能力と相互作用し得ることであり、また癌細胞のアポトーシスを引き超すこともできることを教示する。さらに、この発明はまた、この抗原を発現する腫瘍を持つほ乳類の診断、治療の予測、および予後に有用であり得る癌細胞でＨ４６０−１６−２抗原の検出を用いることも教示している。

もし患者が治療の最初の過程に対して不応性であるか、もしくは転移が生ずる場合、再処置のために腫瘍に対して特異的な抗体を産生するプロセスを繰り返すことができる。さらに、抗癌抗体を、その患者から得た赤血球と結合させ、転移の処置を目的として再注入することができる。転移癌に対してはほとんど有効な処置がなく、また転移は通常、死に到る転帰不良の前兆となる。しかし、一般に転移癌はかなり血管化しており、赤血球細胞による抗癌抗体の送達は腫瘍部位での抗体の濃縮化作用を持つことができる。転移前であっても、大部分の癌細胞はその生存を宿主血液供給に依存しており、赤血球細胞に結合した抗癌抗体は、同様に原発部位（ｉｎ ｓｉｔｕ）の腫瘍に対して効果的であると考えられる。あるいは、抗体を他の血液原細胞（例えば、リンパ球、マクロファージ、単球、またはナチュラルキラー細胞）に結合させてもよい。

抗体には５つのクラスがあり、各々がその重鎖によって与えられる機能に関連づけられている。一般に、むき出しの抗体（ｎａｋｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）による癌殺害が抗体依存型細胞調節細胞障害性（ＡＤＣＣ）または補体依存型細胞障害性（ＣＤＣ）のいずれかによって調節されると考えられる。例えば、マウスＩｇＭおよびＩｇＧ２ａ抗体は、補体系のＣ−１成分を結合することで、ヒト補体を活性化させることができ、それによって腫瘍溶解をもたらし得る補体活性化の古典的経路が活性化される。ヒト抗体に関しては、補体活性化抗体のほとんどが概ねＩｇＭおよびＩｇＧ１である。ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ３イソタイプのマウス抗体は、単球、マクロファージ、顆粒球、およびある種のリンパ球による細胞殺害に到るＦｃ受容体を持つ細胞障害性細胞の補充の際に有効である。ＩｇＧ１およびＩｇＧ３イソタイプのヒトの抗体は、ＡＤＣＣを調節する。

抗体調節癌殺害についての他の可能性のあるメカニズムは、細胞膜内での種々の化学結合の加水分解を触媒する働きをおこなう抗体ならびにそれに関連した糖タンパク質または糖脂質（いわゆる触媒抗体）の使用を介するものであってもよい。

抗体調節細胞殺害の機序として、さらに２つの機序があり、これらはより広く受けている。第１の機序は、癌細胞にある推定抗原に対して身体が免疫応答するようにさせるワクチンとしての抗体の使用である。第２は、成長受容体を標的にし、該受容体の機能に干渉し、あるいは受容体の機能が効果的に失われるように下流制御する抗体の使用である。

したがって、本発明の目的は、ハイブリドーマ細胞株と、該ハイブリドーマ細胞がコードする対応の単離モノクローナル抗体およびその抗原結合フラグメントを単離するために、癌細胞に関して細胞障害性である一方で同時に非癌細胞に対しては相対的に非障害性である特定個人に由来する細胞から癌疾患修飾抗体を生産する方法を利用することである。
本発明のさらなる目的は、ＰＴＡ−４６２１としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされる単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに対して特異的に結合するＣＤ４４抗原性部位を発現する細胞の有無を決定するために、ＰＴＡ−４６２１としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされる単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを利用する方法を教示することである。
本発明のさらなる目的は、ＣＤ４４抗原性部位に特異的に結合する抗体である、ＰＴＡ−４６２１としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされた単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの使用を介した癌疾患を有する患者の生存を高める方法を教示することである。
本発明の目的は、ＣＤＭＡＢおよびその抗原結合フラグメントを教示することである。

本発明のさらなる目的は、細胞障害性がＡＤＣＣを介して調節（ｍｅｄｉａｔｅ）されるＣＤＭＡＢを生産することである。
本発明のさらに別の目的は、細胞障害性がＣＤＣを介して調節（ｍｅｄｉａｔｅ）されるＣＤＭＡＢを生産することである。
本発明のさらなる目的は、細胞障害性が細胞化学結合の加水分解触媒能の作用であるＣＤＭＡＢを生産することである。
本発明のさらに別の目的は、癌の診断、予後、およびモニタリングのための結合アッセイに有用であるＣＤＭＡＢを生産することである。
本発明の他の目的および利点は、この発明の特定の実施形態が図示および例示によって示される以下の説明から明らかになる。

本特許または出願書類は、カラー仕上げの図面を少なくとも１つ含む。カラー図面を有するこの特許または出願書類の写しは、申請および必要な手数料を支払うことで特許庁から得られる。
正常ヒト組織アレイから得た扁桃組織切片上でＨ４６０−１６−２（Ａ）および抗ＣＤ４４（ＢＵ７５）抗体（Ｂ）により得られた結合パターンを示す典型的な顕微鏡写真。Ｈ４６０−１６−２に比べてＢＵ７５のほうがリンパ球を強く、かつ広範囲に染色している。両抗体とも胚中心（緑色矢印）では、より薄く染色された。倍率は２００倍である。 乳癌腫瘍（浸潤性腺管癌）に結合したＨ４６０−１６−２の典型的な顕微鏡写真。パネル内の黄色および橙色矢印は、それぞれ間質細胞と悪性細胞シートとを示している。倍率は１００倍である。 ヒト乳癌組織アレイから得たパジェット病乳房組織切片上でＨ４６０−１６−２（Ａ）および抗ＣＤ４４（ＢＵ７５）抗体（Ｂ）により得られた結合パターンを示す典型的な顕微鏡写真。ＢＵ７５によって悪性細胞が膜染色されたのに対して、Ｈ４６０−１６−２ではネガティブ染色であった。倍率は４００倍である。 ヒト乳癌組織アレイから得た乳房組織切片由来の髄様癌上でＨ４６０−１６−２（Ａ）および抗Ｈｅｒ２（ｃ−ｅｒｂＢ−２）抗体（Ｂ）により得られた結合パターンを示す典型的な顕微鏡写真。Ｈ４６０−１６−２によって悪性細胞が強く膜染色されたのに対して、抗Ｈｅｒ２ではネガティブ染色であった。倍率は２００倍である。 確立したＰＣ−３前立腺癌モデルでの腫瘍増殖に対するＨ４６０−１６−２、シスプラチン、Ｈ４６０−１６−２＋シスプラチン、または緩衝液対照の効果。破線は、抗体が投与されていた期間を示す。データ点は、平均値±ＳＥＭを表す。 確立されたＰＣ−３前立腺癌モデルでの体重に対するＨ４６０−１６−２、シスプラチン、Ｈ４６０−１６−２＋シスプラチンまたは緩衝液対照群の効果。 ヒアルロン酸（ＨＡ）に結合するＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞に対するＨ４６０−１６−２、ＢＵ７５（陽性対照）またはイソタイプ対照の効果。 ２４時間処置後のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の細胞周期分布に対するＨ４６０−１６−２またはイソタイプ対照の効果。

ハイブリドーマ細胞株Ｈ４６０−１６−２は、ブダペスト条約に従って、寄託番号ＰＴＡ−４６２１として２００３年１１月１１日付で米国菌培養収集所（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， １０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ２０１１０−２２０９）に寄託された。３７ＣＦＲ１．８０８に従って、この寄託者は、寄託された材料の公衆に対する利用可能性に課された全ての制限が特許付与によって変更不能に取り除かれることを保証する。

抗体産生：
Ｈ４６０−１６−２モノクローナル抗体の産生を、週に２回回収および再播種しながらハイブリドーマをＣＬ−１０００フラスコ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｏａｋｖｉｌｌｅ， ＯＮ）で培養することによって、おこなった。この抗体を、プロテインＧセファローズ４ファスト・フロー（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｂａｉｅ ｄ’Ｕｒｆｅ， ＱＣ）による標準的な抗体精製法に従って、精製した。ヒト、ヒト化、キメラ化、またはマウス抗体であるモノクローナル抗体を利用することは、この発明の範囲内である。

正常ヒト組織染色
ＩＨＣ研究が既にヒトのＨ４６０−１６−２抗原分布を特徴づけるためにおこなわれており（Ｓ．Ｎ．１０／６０３，００）、またＬ１７８と比較されている（Ｓ．Ｎ．１０／６４７，８１８）。したがって、本研究は、このＨ４６０−１６−２抗原は、生化学的方法で既に決定されたＣＤ４４の癌変異体であると考えられることから、Ｈ４６０−１６−２を、ＣＤ４４（ＢＵ７５）に対して向けられた別の抗体と比較することである。ヒト正常器官組織アレイ（Ｉｍｇｅｎｅｘ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を用いて、５９個の正常ヒト組織に対する抗体の結合をおこなった。全ての一次抗体（Ｈ４６０−１６−２；ＢＵ７５抗ＣＤ４４（ＢＩＯＣＡＮ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．， Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ， ＯＮ）；およびマウスＩｇＧ_１陰性対照（Ｄａｋｏ， Ｔｏｒｏｎｔｏ， ＯＮ）を抗体希釈緩衝液（Ｄａｋｏ， Ｔｏｒｏｎｔｏ， ＯＮ）で５μｇ／ｍｌの濃度（以前の最適化ステップで最適濃度であることがわかった）に希釈した。陰性対照抗体は、製造元によって全てのほ乳類組織に対して陰性であることがわかっている。ＩＨＣに関する方法は、以下の通りである。

組織切片をオーブンで５８℃、１時間加熱することで、脱パラフィン化し、コプリン（Ｃｏｐｌｉｎ）ジャー内でキシレンに５回（各々４分）浸すことで、脱ろうした。一連の段階エタノール洗浄（１００％〜７５％）で処理した後、切片を水で再水和した。スライドを１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６）（Ｄａｋｏ， Ｔｏｒｏｎｔｏ， Ｏｎｔａｒｉｏ）に浸し、続いて、電子レンジ（高、中、および低電力レベルにそれぞれ５分間設定）にかけ、最後に冷ＰＢＳに浸した。次に、スライドを３パーセントの過酸化水素水に６分間浸し、ＰＢＳで３回（各々５分間）洗い、乾燥させ、室温で５分間、ユニバーサル（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）ブロッキング溶液（Ｄａｋｏ， Ｔｏｒｏｎｔｏ， Ｏｎｔａｒｉｏ）とともにインキュベートした。Ｈ４６０−１６−２、ＢＵ７５、またはイソタイプ対照抗体（黒色アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコースオキシダーゼ（ほ乳類組織に存在せず、また該組織で誘導することはできない酵素）に対する抗体）を、その作用濃度（各抗体に対して５μｇ／ｍｌ）まで、抗体希釈緩衝液（Ｄａｋｏ， Ｔｏｒｏｎｔｏ， Ｏｎｔａｒｉｏ）に希釈して、室温で１時間にわたってインキュベートした。スライドをＰＢＳで５分間、それぞれ洗った。一次抗体の免疫活性を、供給元（Ｄａｋｏ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｔｏｒｏｎｔｏ， Ｏｎｔａｒｉｏ）の指示通りに３０分間、室温でＨＲＰ結合二次抗体によって、検出／視覚化した。このステップの後、スライドをＰＢＳで各々、５分間、３回にわたって洗浄し、室温で１０分間、免疫ペルオキシダーゼ染色用のＤＡＢ（３，３‘−ジアミノベンジジンテトラヒドラクロリド、Ｄａｋｏ， Ｔｏｒｏｎｔｏ， Ｏｎｔａｒｉｏ）発色基質を添加することで、呈色反応を生じさせた。スライドを水道水で洗うことで、呈色反応を停止させた。マイヤーのヘマトキリシン（Ｍｅｙｅｒ’ｓ Ｈｅｍａｔｏｘｌｉｎ）（Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｏａｋｖｉｌｌｅ， ＯＮ）を用いて対比染色した後、スライドを段階的なエタノール（７５〜１００％）によって脱水し、キシレンによって透徹させた。封入剤（Ｄａｋｏ Ｆａｒａｍｏｕｎｔ， Ｔｏｒｏｎｔｏ， Ｏｎｔａｒｉｏ）を用いて、スライドにカバースリップを載せた。スライドの顕微鏡検査をアキソバート（Ａｘｉｓｏｖｅｒｔ）２００（Ｚｅｉｓｓ Ｃａｎａｄａ， Ｔｏｒｏｎｔｏ， ＯＮ）を用いておこない、このスライドをノーザン・イクリプス・イメージング・ソフトウェア（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ， ＯＮ）を用いて保存した。結果の読み取り、記録、および解析は、病理学者がおこなった。

表１は、一連の正常ヒト組織をＨ４６０−１６−２およびＢＵ７５抗ＣＤ４４染色した結果をまとめたものである。Ｈ４６０−１６−２による組織染色は、以前に記述したもの（Ｓ．Ｎ．１０／６０３，０００）に類似している。ここで再び言及しておくべきことは、この抗原が通常は肝臓、腎臓、および肺等の重要器官の細胞に存在しないことである。Ｈ４６０−１６−２抗体は、マクロファージおよびリンパ球に結合し、それらの存在は切片状のいくつかの器官で観察される。しかし、ＢＵ７５抗ＣＤ４４抗体によってリンパ球がより強く染色されていた（図１）。

Ｈ４６０−１６−２に対して陽性であった組織もまた、通常、ＢＵ７５抗ＣＤ４４に対して陽性であった（しばしば、強度がより高い）。Ｈ４６０−１６−２に対して陰性であった組織もまた、ＢＵ７５抗ＣＤ４４に対し、食道およびリンパ節の一試料等のいくつかの例外はあるが、概して陰性であった。これらの結果は、Ｈ４６０−１６−２が、ＢＵ７５およびＣＤ４４抗体によって認識されるより小さな群の組織に結合し、組織内での染色強度もまた、しばしばより低くなる。これらの結果は、Ｈ４６０−１６−２の抗原は、正常組織では広範に発現されるものではなく、その上、この抗体は限られた数のヒト組織に特異的である。また、Ｈ４６０−１６−２はＣＤ４４のエピトープに特異的であり、これはこれらのＩＨＣ研究で使用されるＢＵ７５によって認識されるものとは異なる変異体である。

ヒト乳癌腫瘍組織染色
以前のＩＨＣ研究は、Ｈ４６０−１６−２抗体がヒト癌を認識する可能性があったかどうかについてＨ４６０−１６−２抗原とヒト乳癌との癌関連性を決定するために（Ｓ．Ｎ．１０／６０３，０００）、またそれがどのようにして抗ＣＤ４４染色とＬ１７８とを比較するか（Ｓ。Ｎ．１０／６４７，８１８）についておこなわれた。現在のところ、比較は、ＢＵ７５抗ＣＤ４４染色、ｃ−ｅｒｂＢ−２抗Ｈｅｒ２、および黒色アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコースオキシダーゼに特異的な抗体（ほ乳類組織に存在も誘導もされない酵素（負の対照））についておこなった。５０人の乳癌患者に由来する一群の乳癌組織と、乳癌患者の非新生乳房組織由来の試料１０個とを用いた（Ｉｍｇｅｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）。各々の患者について、年齢、性別、対癌米国合同委員会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ、ＡＪＣＣ）腫瘍病期、リンパ節、エストロゲン受容体（ＥＲ）、およびプロゲステロン受容体（ＥＲ）状態に関する情報が提供された。実施例５からのＩＨＣの手順に従った。全ての抗体を作用濃度５μｇ／ｍｌで使用し、例外として抗Ｈｅｒ２の濃度を１．５μｇ／ｍｌで使用した。

表２および表３は、それぞれ乳癌組織群のＨ４６０−１６−２およびＢＵ７５抗ＣＤ４４抗体染色をまとめたものである。各々の群は、患者５０人から得た腫瘍試料から構成されるものであった。概して、試験した患者５０人の６２パーセントが、ＢＵ７５抗ＣＤ４４に関しては７３パーセントであるのに対して、Ｈ４６０−１６−２抗原については陽性であった。Ｈ４６０−１６−２およびＢＵ７５抗ＣＤ４４が同一組織を染色した例では、該試料の４５パーセントがＨ４０−１６−２と比較して、ＢＵ７５抗ＣＤ４４での染色強度が高かった。Ｈ４６０−１６−２およびＢＵ７５抗原に関して、乳癌患者由来の正常乳房組織試料１０個のうち、それぞれ４個および８個が陽性であった。エストロゲン受容体状態とプロゲステロン受容体状態とのあいだに、何ら明確な相互関係は認められなかった。それはまた、より高い腫瘍病期によってＨ４６０−１６−２およびＣＤ４４抗原の陽性発現が大きくなる傾向にあるとは思われなかった。

Ｈ４６０−１６−２染色は、図２に示すように、正常細胞と比較して、癌細胞に対して特異的であり、間質細胞が明らかに陰性であり、かつ悪性細胞シートがかなり陽性であった。Ｈ４６０−１６−２抗原により見られる細胞局在化のパターンは、大多数の例で細胞膜に限定された。ＢＵ７５ＣＤ４４抗体は、より多くの乳癌試料を染色し、Ｈ４６０−１６−２と比較して細胞質局在化よりも膜の度合いが高かった（表４）。ＢＵ７５抗ＣＤ４４はまた、パジェット病の悪性細胞を染色したが、このことはＨ４６０−１６−２の例では見られなかった（図３）。Ｈ４６０−１６−２染色に対して陽性であった乳癌患者由来の正常組織試料もまた、ＢＵ７５抗ＣＤ４４染色に対して陽性であった。

ｃ−ｅｒｂＢ−２と比較して、Ｈ４６０−１６−２は、相対的に異なる染色の様相を示した。ここでは、Ｈ４６０−１６−２抗原に対して陽性であった３１個の乳癌腫瘍組織試料のうち１６個がＨｅｒ２発現に関して陰性であり、依然として満たされていない標的治療薬が乳癌患者にとって必要であることが示されている（表５、図４）。Ｈ４６０−１６−２およびＨｅｒ２の両方に対して陽性であった乳房腫瘍組織切片間に染色強度の違いもあった。すなわち、Ｈ４６０−１６−２抗原に対して高度に陽性であったいくつかの乳房腫瘍組織は、Ｈｅｒ２に対しては中程度に陽性であったのみであり、その逆もまたしかりであり、Ｈ４６０−１６−２抗原が乳癌患者の異なる集団を治療的に標的化することを説明している。ｃ−ｅｒｂＢ−２抗体もまた、正常乳房組織切片の一つを陽性に染色した。

これらの結果は、Ｈ４６０−１６−２に対する抗原が乳癌患者のほぼ２／３で発現されることを示唆している。また、Ｈ４６０−１６−２処置に適したこれらの大部分が抗Ｈｅｒ２処置に適するものではなかったと思われる。染色パターンは、患者試料において、抗体が悪性細胞に対して高度に特異的であり、Ｈ４６０−１６−２抗原が細胞膜に局在化することでそれが魅惑的な薬となり得る標的となることを示した。同様ではあるが、よりいっそう限定されたＨ４６０−１６−２対ＢＵ７５抗ＣＤ４４抗体の染色は、ＣＤ４４のより制限された変異体であるＨ４６０−１６−２エピトープの可能性を再び示す。

生体内ＰＣ−３確立化学療法組み合わせ腫瘍実験
図５および６を参照すると、６ないし８週齢の雄ＳＣＩＤマウスに、１００万個のＰＣ−３ヒト前立腺ガン細胞を含む１００マイクロリットルの生理食塩水を首筋に皮下注射することで、移植した。腫瘍の増殖を、毎週、カリパスを用いて測定した。集団の大部分が移植後２１日目で腫瘍容積８０ｍｍ^３（範囲５０〜１３０ｍｍ^３）に達した時点で、４通りの処理群の各々に、マウス８匹を無作為に割り当てた。Ｈ４６０−１６−２抗体、化学治療薬シスプラチン、Ｈ４６０−１６−２とシスプラチンとの組み合わせ、あるいは緩衝液対照を、２．７ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４、１３７ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４を含む希釈剤によりストック濃度を希釈した後、３００マイクロリットルの容量で、抗体またはシスプラチンをそれぞれ１５または６ｍｇ／ｋｇで、腹腔内投与した。次に、Ｈ４６０−１６−２または緩衝液対照を第一週目は一週あたり４回投与し、その後一週あたり３回投与し、移植後４１日目まで同様のやり方で、合計１１回分投薬した。シスプラチン投与は、抗体処置期間の第０日目、５日目、１０日目、および１５日目におこなった。腫瘍増殖を、移植後４８日目または個々の動物がＣＣＡＣエンドポイントに達するまで、ほぼ７日毎にカリパスを用いて測定した。動物の体重を研究期間中記録した。研究終了時、全ての動物をＣＣＡＣガイドラインに沿って安楽死させた。

対応のあるｔ検定を用いて、シスプラチンまたはＨ４６０−１６−２とシスプラチンとの組み合わせによる後処理腫瘍全身腫瘍組織量の減少（図５）がみられた。４８日目（処理後７日目）において、シスプラチンおよびＨ４６０−１６−２を処置することで、バッファ対照（ｐ＜０．０００１）、シスプラチン処理単独（ｐ＝０・００４）、またはＨ４６０−１６−２処理単独（ｐ＜０．０００１）よりも、処理期間終了間もない腫瘍の増殖を抑制するのに、よりいっそう有意な効果がえられた。ＰＣ−３は前立腺癌の悪液質モデルであり、体重の減少に伴って、異種移植モデルでの全身腫瘍組織量および疾患進行の増加が生ずる。図６に示す平均体重減少に示されるように、全ての群のマウスで、顕著な体重減少がみられた。この研究では、全ての群のマウスが処置期間終了までに約２３ないし３５パーセントの体重減少を示した。Ｈ４６０−１６−２で処置した群は、体重減少の度合いが最も低かった（２１．７パーセント）。処置終了の直後、対照群と比較して、Ｈ４６０−１６−２にシスプラチンを加えての処置に関連した体重のさらなる顕著な減少はみられなかった（ｐ＝０．５０４２）。したがって、Ｈ４６０−１６−２にシスプラチンを加えたものは、ヒト乳癌疾患の周知モデルで、緩衝液対照群と比較して、腫瘍全身腫瘍組織量を低下させた。これらの結果は、ヒトを含むほ乳類の癌治療に対するこの抗体の薬理学的および製薬学的利点を示唆している。

ヒアルロン酸（ＨＡ）結合アッセイ
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（既に、ＦＡＣＳ分析によってＨ４６０−１６−２抗原（ＣＤ４４）が発現されるのが示された）を、組織培養プレートから得た使用済み培地を吸引し、ＰＢＳで洗い、各プレートに解離緩衝液５ｍＬを添加し、細胞が離れるまで３７℃で細胞をインキュベートした後に、解離させた。次に、細胞を計数し、５０ｍｌ管に移した。細胞を１，２００ｒｐｍで５分間遠心し、培地に懸濁することで１〜５００万細胞／ｍｌが得られた。次に１ｍｌを２ｍｌの深いウェルの各々のウェルに添加した。このプレートを１２００ｒｐｍで５分間遠心し、プレートをペーパータオル上で逆さまにすることで過剰な上清を取り除いた。次に、深いウェルプレートをゆっくりとボルテックスし、細胞ペレットを除去し、この細胞ペレットを破壊した。１ｍｌのＨ４６０−１６−２、ＢＵ７５（陽性対照、ＢＩＯＣＡＮ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．， Ｍｉｓｓｉｓａｕｇａ， ＯＮ）またはイソタイプ陰性対照（１０７．３、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｈｉｅｎｃｅｓ， Ｏａｋｖｉｌｌｅ， ＯＮ）抗体を各ウェルに添加し、次に穏やかにボルテックスをかけることで混合した。次に、プレートを３７℃で２時間インキュベートした。しばらくして、４８ウェルプレートを、３７℃で１〜２時間にわたり１ウェルあたり４ｍｇ／ｍｌＨＡストック溶液３００μｌでインキュベーションすることによって、ＨＡで被覆した。インキュベーション後、過剰のＨＡを吸引除去し、層流フード内でプレートを完全に空気乾燥させた。抗体細胞インキュベーションを完了させた後、１２００ｒｐｍ、５分間で再び細胞をペレット状にした。深いウェルをペーパータオル上で逆さまにすることで、上清を取り除いた。深いウェルを再びボルテックスすることで、細胞ペレットを解離させ、各々のウェルに対して、２μＭカルセイン含有ＰＢＳ（ＭｇＣｌ_２およびＣａＣｌ_２を含む）１．２ｍｌを添加した。細胞を再懸濁させ、２５０μｌ／ウェルをＨＡ被覆プレートに移した。次に、ＨＡ被覆プレートを３７℃で２時間インキュベートすることで、付着させた。インキュベーション後、付着していない細胞を吸引により取り除いた。次に、いっさいの付着していない細胞または細胞の塊を取り除くために、各ウェルをＰＢＳ（ＭｇＣｌ_２およびＣａＣｌ_２を含む）によって２〜３回洗った。プレートの読み取りをパーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）ＨＴＳ７０００蛍光プレートリーダーでおこない、データをマイクロソフト・エクセル（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ）で分析し、さらに結果の一覧を表６または図７に示した。実験を別々に６回おこなって得た平均値からなる結果によって、平均で１．８７（±１．０１）μｇ／ｍｌのＨ４６０−１６−２が、ＨＡに対するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の結合を５０％減少させるのに必要であることが明らかになった（図７）。ＨＡに結合しているＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対するＨ４６０−１２の効果は、用量依存的であり、２０μｇ／ｍｌのＨ４６０−１６−２によって、ＨＡに対する細胞結合の減少が６０％を超えた（図７）。これらの結果は、Ｈ４６０−１６−２が、少なくとも部分的に、ＨＡへの結合に関与するＣＤ４４上の領域と相互関係し、その結果、血管形成の下流制御を介した抗癌効果またはＥＣＭを介した腫瘍侵襲性を解明することができた。

細胞周期アッセイ
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の細胞周期に対するＨ４６０−１６−２の効果を、ＦＡＣＳ分析を用いて評価した。Ｈ４６０−１６−２で抗体（０、０．２、２．０、２０μｇ／ｍＬ）またはイソタイプ対照（クローン１０７．３、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）を、２４、４８、および７２時間にわたって、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞とインキュベートした。処置および未処置の細胞をヨウ化プロピジウムで染色し、単一の細胞をフローサイトメトリで分析することで、相対的なＤＮＡ含有量を見積もった。取得したデータ・セットを、低二倍体染色を示している細胞と同様に単細胞母集団上でゲーティングすることで、ＢＤセルクエスト（ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ）を用いて分析した。この分析後、Ｈ４６０−１６−２で２４時間処理した細胞では、周期性を示す細胞の割合が全体的に減少することが示されるとともに、ｓｕｂ−Ｇ_１集団の用量依存的増加とを示した。ｓｕｂ−Ｇ_１集団に現れた細胞は、細胞膜の完全性が失われたことによるＤＮＡの損失があり、アポトーシスを起こした細胞の集団を現す場合がある（図８）。このデータは、Ｈ４６０−１６−２がＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞周期に対する効果を有し、またこの効果がアポトーシス細胞の数を用量依存的に増加させた。

証拠の優越性によって示されることは、Ｈ４６０−１６−２がＣＤ４４変異体上に存在する炭水化物依存性立体構造エピトープのライゲーションを介して抗癌効果を調節すること、またこのエピトープは少なくとも部分的にＨＡに対するＣＤ４４変異体の結合に関与することである。対応する細胞で、このエピトープに対してＨ４６０−１６−２の結合がアポトーシスを誘導するという証拠もある。Ｓ．Ｎ．１０／７１３，４５１では、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞等の発現細胞から同種抗原を免疫沈降させる際に、Ｈ４６０−１６−２抗体を用いることでことができることが示されている。さらに、限定されるものではないがＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡ、またはＩＨＣによって示される技術を用いて、４６０−１６−２抗体に特異的に結合するＣＤ４４抗原性部位を発現する細胞および／または組織の検出でＨ４６０−１６−２抗体を使用し得ることを示すことができるかもしれない。

したがって、免疫沈降したＨ４６０−１６−２抗原は、そのようなＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡ、またはＩＨＣアッセイを用いて、そのような細胞または組織に対するＨ４６０−１６−２の結合を阻害することができる。さらに、Ｈ４６０−１６−２抗体と同様に、他の抗ＣＤ４４抗体を使用してＣＤ４４抗体の他の形態を免疫沈降および単離することが可能であり、またこの抗原を用いて同一タイプのアッセイを持ち手抗原を発現する細胞または組織に対するそれらの抗体の結合を阻害させることもできる。また、示すことができたことは、ＣＤ４４の全ての形態（すなわち、ｐａｎ−ＣＤ４４抗体）を認識する抗ＣＤ４４抗体を使用してその同種抗原を単離するならば、その抗原はまた、Ｈ４６０−１６−２抗原が該抗原を発現する細胞または組織に対して結合することを阻害することができ、それによって上記抗原を発現する細胞および組織上のＣＤ４４のエピトープに対するＨ４６０−１６−２の結合も示される。あるいは、Ｈ４６０−１６−２およびｐａｎ−ＣＤ４４抗体の比較を、両抗体が存在する競合結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、細胞ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ，あるいはその他のアッセイで比較することもまた、上記抗原を発現する細胞および組織上のＣＤ４４のエピトープに対するＨ４６０−１６−２の結合を示すことができる。

この明細書で指摘した全ての特許および刊行物は、本発明が属する技術分野の当業者のレベルを示す。全ての特許および刊行物を、あたかも個々の刊行物が具体的かつ個々に参照によって援用されるかのように、同一の程度に参照によって本明細書中に援用する。本発明の特定の形態を例示する一方で、本明細書中に記載または示した構成要素の特定の形態または配置に限定されないことが理解される。種々の変更が本発明の範囲から逸脱することなく可能であり、また本発明が明細書に示し、かつ記載したものに限定されるものではないと考えられることは、当業者にとって明らかである。当業者は、本発明に固有のものと同様に、目的を実施すること、また上記した結果および利点を得ることに、本発明が十分に適していることを容易に理解する。本明細書に記載したいっさいのオリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、生物学的に関連した化合物、方法、手順、および技術は、例示を意図したものであって範囲を限定することを意図したものではない。ここでの変更および他の用途は、当業者が想到するものであり、本発明の精神の範囲内に包含されるとともに添付した請求の範囲によって定義される。本発明の説明を特定の好ましい実施形態と関連させておこなったが、理解すべきことは、請求項に記載された通りの本発明はそのような特定の実施形態に過度に制限されるべきではないということである。実際、当業者に明らかである本発明を実行するための上記した態様の種々の変更は、別紙の請求の範囲の範囲内にあることを意図している。

Claims (4)

1. ヒト腫瘍から選択された組織試料中の癌細胞の存在を測定する結合検定法であって、
   前記ヒト腫瘍由来の組織試料を生体外において提供するステップと、
   ＰＴＡ−４６２１としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマにより産生される、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供するステップと、
   抗悪性腫瘍薬シスプラチンを提供するステップと、
   前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント及び抗悪性腫瘍薬シスプラチンの組合せを前記組織試料と接触させるステップと、ならびに、
   前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと前記組織試料との結合を測定するステップと、
   を有し、
   それにより前記組織試料中での前記癌細胞の存在を示す、
   ことを特徴とする結合検定法。
2. 前記ヒト腫瘍組織試料が、前立腺に由来する腫瘍から得たものである、ことを特徴とする請求項１に記載の結合検定法。
3. ヒト腫瘍から選択された組織試料中の癌細胞を単離またはスクリーニングする方法であって、
   前記ヒト腫瘍由来のヒト試料を生体外で提供するステップと、
   ＰＴＡ−４６２１としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマにより産生される、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供するステップと、
   抗悪性腫瘍薬シスプラチンを提供するステップと、
   前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント及び抗悪性腫瘍薬シスプラチンの組合せを前記組織試料と接触させるステップと、ならびに、
   前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと前記組織試料との結合を測定するステップと、
   を有し、
   それにより前記癌細胞が前記結合によって単離され、前記組織中での前記癌細胞の存在が確認される、
   ことを特徴とする方法。
4. 前記ヒト腫瘍組織試料が、前立腺に由来する腫瘍から得たものである、ことを特徴とする請求項３に記載の方法。

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