JPH06500931A - 精製された核酸を細胞試料から調製するカートリッジ、装置および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 精製された核酸を細胞試料から調製するカートリッジ、装置および方法本発明は 、血液試料２組繊細胞、培養細胞等がらゲノムＤＮＡ等の核酸を抽出しＭ製する ためのカートリッジに関し、また、そのようなカートリッジを利用する装置およ び方法に関する。

細胞からＤＮＡを抽出する従来の一般的方法は、先ず細胞全体を完全に溶解し、 酵素を利用してタンパク質を分解し、分解されたタンパク質と脂質をフェノール とクロロフすルムを用いて除去した後に、ＤＮＡをエタノールを用いて析出させ 、こうして抽出されたＤＮＡを懸濁液に戻すというものである。

また、哺乳類の血液からＤＮＡを抽出する処理では、赤血球の溶解と白血球の原 形質膜の溶解か行わわ、白血球の核をそのままとし、その核を遠心分離によって 分離した後に、前記の同様の処理を行うことがある。

固い組織の場合には、その組織を予めばらばらに壊して適当な溶液中で均質化（ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅ）　した後に前記の処理を行う。

しかし、上記のような処理には長い時間か必要でありまた非常に面倒であるので 、多量の細胞試料からゲノムＤＮＡを抽出するには適していない。また、フェノ ール、クロロフォルム等の毒性の溶媒を扱わなければならない。

そこで、“核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ａａｒｃｈ）”の１ ９８９年、第１７巻。

第２０号、第８３９０ページ等にはより簡易な方法が記載されている。その方法 では、細胞を溶解し、遠心分離によって核を分離し、核を溶解し、ＰＬＢとにブ ロテイナーセの混合物でタンパク質を分解するもので、フェノール、クロロフす ルム等の溶媒の使用か回避されている。

本発明の主たる目的は、細胞試料からゲノムＤＮＡ等の核酸を抽出し精製するた めのカートリッジを提供することであり、本カートリッジによれば、従来必要で あった遠心分離操作か不要となり、また、有機溶媒による抽出やＤＮＡの析出、 さらに析出したＤＮＡを懸濁液に戻す（この操作はしばしば長時間を必要とする ）等の操作かすべて不要となるので、ＤＮＡの抽出が極めて容易となる。

本発明の他の目的は、前記カートリッジを利用してゲノムＤＮＡ等の核酸を抽出 しＭ製する装置および方法を提供することである。

上記の目的を達成するために、本発明は、カートリッジであって、核酸を精製す る等のための透析区画と、物質かその透析区画に入りまたそこから出るための入 口／出口手段とを含み、さらに、中央にスロットを有し、縦長で薄い平板なフロ する貫通ダクトを有する２つの端部リングとを含むことを特徴とするカートリッ ジを提供する。

本カートリッジは、生物研究施設において広く使われているカル−セル（ｃａｒ 。

ｕｓｅｌ）　型装置等の既存の生物試料処理装置の標準的チューブに取り付ける のに適した寸法で作成することかできるという利点を有する。

本発明のカートリッジの有利な態様には、さらに、前記支持体によって支持され て前記透析区画を２つの分室に分け、かつ、細胞の核を保持するためのフィルタ か含まれる。そして、前記２つの端部リングの貫通ダクトかそのフィルタの両側 で前記２つの分室にそれぞれ連通する。

前記フィルタは、例えば、１マイクロメ一タ程度の寸法の極めて細かなメツシュ サイズを有するポリエステルフィルムである。

カートリッジの透析区画にこのようなフィルタを設けることにより、溶解した細 胞か透析区画を通過するときに細胞核がこのフィルタ上に選択的に保持されて付 着するので、従来必要であった核を遠心分離する作業が不要となる。

記端部リングの貫通ダクトと連通ずる。

前記フィルタを前記重ね合わされた２つの枠部材の間で固定し、前記２つの端部 リングの貫通ダクトをそのフィルタの両側にそれぞれ連通ずるようにすることか できる。

本発明の他の特徴によれば、前記各端部リングかその一方の端面に、対応する前 記枠部材の短辺部を収容する横断溝を有し、その横断溝にその端部リングの前記 貫通ダクトが連通してその枠部材の短辺部に形成された前記長手方向溝に連通す る。

前記各端部リングがその他方の端側に、隔壁（ｓｅｐｔｕｍ）ないしは、エラス トマ材料からなるディスクを収容する円柱状の空所を育し、そのディスクがその 材料の弾性によって自己シールカ河能であってかつ輪方向に延びる小径のボアを 有し、対応する前記端部リングの貫通ダクトかその空所の底に連通ずるようにす ることかできる。

本発明はまた、前記カートリッジを利用することにより細胞試料から核酸を抽出 し精製する装置であって、前記カートリッジ力１表層部リングによってシールさ れた状態で取り付けられる少なくとも１つのチューブと、前記チューブの内側で あって前記カートリッジの外側に透析液を供給するかまたはそこを通過させる手 段と、前記２つの端部リングの貫通ダクトを、吹き込みおよび／または吸い出し による回収手段と、処理すべき試料、処理剤、洗浄剤を供給する手段とに選択的 に接続する接続手段とを含むことを特徴とする装置を提供する。

本装置においては、ＤＮＡ等の核酸の抽出および精製がすべて、本装置のチュー ブ内に取り付けられたカートリッジの中で行われるので、遠心分離操作等のため に本装置からチューブやカートリッジを取り外す必要が全くない。

本装置の有利な態様として、前記カートリッジを前記チューブの内側において２ つの半円柱状部材の間に取り付け、それにより、そのチューブの内側の空所体積 を減らし、その半円柱状部材の各々に前記透析液が通過し得る通路を設けるよう にすることができる。

このような構成によれＣｉ、カートリッジの製造ロストが低下して使用後は廃棄 することが可能となるので、ある試料が他の試料に混じって汚染する等の危険を 避けることができる。

本発明はさらに、細胞核を溶解しタンパク質を分解し核酸を透析して精製するこ とにより細胞試料から精製された核酸を調製する方法であって、細胞から核を分 離して、透析区画内に配置されたフィルタ上に固定する工程と、前記フィルタ上 に固定された前記該をその場において溶解し、不要なタンパク質を核酸から分離 する工程と、所望の核酸以外の成分を前記透析区画からその場における透析によ って除去する工程とを含むことを特徴とする方法を提供する。

本方法の存手１な態様は、さらに、前記透析区画内において前記細胞をその場に おいて予め溶解する工程を含む。

訂記核は＠記透析区画内において前記フィルタに固定されるので、その核を適当 な緩衝剤を使用して洗浄することにより、脂質、その核に付着しているかもしれ ないリポソーム、　＊１Ｊ１すべき核酸以外の核内分子を除去する連続した複数 の工程を含むようにすることかできる。

本方法においては各工程かすべて本発明のカートリッジ内で行われるので、工程 と工程の間にカートリッジに手を加える必要か全くない。

次に、本発明の実施例を図面を参照しつつ詳細に説明するか、それにより本発明 の特徴、詳細、利点か一層明瞭に理解されるであろう。なお、参照する図面は以 下のものである。

図〕は、本発明の原理を明らかにする図である。

図２は、本発明のＤＮＡ抽出用カートリッジの種々の構成要素を示す分解図であ る。

図３は、図２のカートリッジにおいてフィルタと透析膜を支持する１つの枠部材 を示す図である。

図４は、図２のカートリッジにおいて使用される１つの半円柱状補助部材を示す 図である。

図５は、図２のカートリッジを部分的に拡大して示す輪方向断面図である。

図６は、本発明の方法に従ってＤＮＡを抽出する操作を説明する図である。

図１には本発明の原理力１略的に図示されている。

図１において、１０は両端か開いた円筒状のチューブである。本発明のカートリ ッジ１２はこのチューブ１０にシールされた状態で取り付けられる。カートリッ ジ１２は、２つの端部リング１４．１４と、それら端部リング１４．１４の間に 配置される２つの透析膜１６．１６と、フィルタ２０とを含む。２つの透析膜１ ６．１６はそれらの間に一定の透析区画１８を画成し、フィルタ２０かその透析 区画１８を２つの分室２２．２４に分ける。上方の端部リング１４は試料その他 の物質を透析区画１８の第→室２２に供給するための入口ダクト２６を存し、下 方の端部リングＩ４は透析区画】８の第二分室２４に開口してそこから物質を取 り出すための出口ダクト２６を有する。チューブＩＯには、透析液を供給しまた 排出するための供給および排出ダクト２８．３０が設けられる。供給および排出 ダクト２８．３０は各々、チューブ１０内であって透’Ｆｒ１ｉｌ　６．　Ｊ　 ６によって画成された透析区画１８の外側に開口する。

本発明における作動は以下の通りである。

先ず、血液等の処理すべぎ試料を血球を適切に溶解するための既知の物質と共に 上方端部リングＩ４の入口ダクト２６から透析区画１８内に導入する。導入され た試料は透析区画１８内のフィルタ２０を通過後、下方端部リング１４の出口ダ クト２６から外に出る。フィルタ２０は薄いポリエテルフィルム等から構成され る。そのポリエテルフィルムには、例えば１マイクロメ一タ程度の厚さであって 、１マイクロメ一タ程度の寸法の極めて細かなメツシュを有するものが採用され るので、溶解された血球の核をその上に保持し付着させることができる。

一種類またはそれ以上の適当な緩衝剤を用いて透析区画１８内を通過させ洗浄し た後、フィルタ２０に付着した核を溶解し、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅｓ） 等を用いてＲＮＡを分解し、さらに、Ｋプロテイナーゼ（Ｋ　ｐｒｏｔｅｉｎａ ｓｅ）等を用いてタンパク質を分解する。さらに、透析区画〕８内に存在するＤ ＮＡをチューブ１０内において透析して精製した後、精製されたＤＮＡを透析区 画１８から上方の入口ダクト２６から空気を吹き込むおよび／または下方の出口 ダクト２６から吸引する等によって回収する。

図２〜図５には本発明のカートリッジの有利な態様が図示されている。

前記のように、本カートリッジＩ２は２つの端部リング１４．１４と２つの透析 膜１６．１６とフィルタ２０とを含む。２つの透析Ｉｔ！１６．１６とフィルタ ２０は縦長の平板な支持体によって支持される。この支持体は、同一形状の２枚 の矩形枠部材３２．３２か重ね合わされて構成される。図３は一方の枠部材３２ を立てた状態で拡大して示す図である。各枠部材３２は、合成材料または硝子繊 維を主体とする複合材料から形成さＬ長手方向に延びる（の長辺部３４．３４と それら長辺部３４，３４を連結する一組の短辺部３６．３６とを含み、その中央 に長手のスロット３８を有する。各枠部材３２の一方の短辺部３６の内側面、す なわち、他方の枠部材３２と対向する側の面には長手方向に延びる溝４０か形成 される。溝４０の両端は枠部材３２の外部とスロット３８とにそれぞれ開口する 。各枠部材３２の外側面に（」析膜１６か固定さ札スロット３８の外縁はその外 面側が図３に破線４２で示されるように面取りされている。

２枚の枠部材３２．３２は溝４０か互いに重ならないように重ね合わされる。

すなわち、先ず、フィルタ２０をその外縁部上方の枠部材３２の内側面に接着し て固定した後に、他方の枠部材３２をその一方の枠部材３２に接着させる。こう して２つの枠部材３２．３２のスロット３８．３８は丁度一致するか、それらは フィルタ２０によって互いに隔てられる。そして、透析膜１６．１６をその外縁 部で枠部材３２．３２の外側面にそれぞれ接着する。

各枠部材３２の溝４０を有する短辺部３６は他方の短辺部３６よりも幅か広いの で、２つの枠部材３２．３２を前記のように組み付けた場合には、一方の枠部材 ３２の溝４０を有する短辺部３６か他方の枠部材３２の溝４０を存しない短辺部 ３６から外側に突き出ることになる。

各端部リングＩ４の形状は大体円柱状であり、枠部材３２．３２に対向する側の 端面には径方向に溝４４か形成される。溝４４には枠部材３２の溝４０を有する 短辺部３６か係合する。

各端部リング１４の他方の端面側には円柱状の空所４６が形成さね、その底面は 溝４４の底面から所定距離だけ離れており、それら両底面の間を小径（直径約２ ｍｍ）のボア４８が連結する。各端部リング１４の空所４６には、エラストマ材 料からなる“隔壁″ないしディスク５０（図５）が嵌め込まれる。ディスク５０ には軸方向に、その材料の弾性によって自ら閉じる極めて細いボア５２か形成さ ね、このボア５２は前記ボア４８に開口する。

各端部リング１４の外周面には全周に渡って溝５４か形成さね、その中にシール リングか取り付けられる。

上側の端部リング１４からは円柱状のスカート部５６か上方に延び出る。スカー ト部５６は、本ＤＮＡ抽出用カートリッジに物質、処理剤（ｒｅａｇｅｎｔ　） の供給手段をつなぎまた同手段を外すときに液滴が落ちるのを防止し、それによ り周囲の表面を汚染しないようにするだめのものである。

本カートリッジには、各々略半円柱状の２つの補助部材５８．５８を設けること かできる。各補助部材５８は適当なブラスチフクを用いて形成された中実のもの であってよく、自身を貫通する貫通路６０を有する。２つの補助部材５８，５８ はそれぞわ、本カートリッジがチューブ１０内に取り付けられるときに枠部材３ ２．３２の両側に配置さねへその結果、チューブ１０内の空所の体積を減少させ るので、チューブ１０を満たすためにその中に供給すべき透析液の量を効果的に 減少させることかできる。

図２〜図５に示されたカートリッジは以下のように使用される。

本カートリッジを図１に示されるように円筒状チューブ１０にシールされた状態 で取り付けた後、上方の端部リング１４のディスクないし”隔壁″５０のボア５ ２に注射針を差し込んで、枠部材３２．３２に固定された透析膜１６．１６によ って画成された透析区画１８内に試料、処理剤、洗浄液を導入する。針から押し 出された物質は、上方の端部リング１４のボア４８と枠部材３２の短辺部３６の 溝４０とを通過した後に透析区画１８内に入り、フィルタ２０を通過する。この 物質を排出するには、下方の端部リング１４のディスクないし“隔壁＃５０のボ ア５２に注射針を差し込んで透析区画１８からそれを吸い出せばよい。

血液試料からのゲノムＤＮＡの抽出は、図６に示されるように以下の手順に従っ て行われる。

先ず、カートリッジに１０ｍ１のＰＢＳを注入して洗浄し、洗浄後ＰＢＳを排出 する。次いで、１０ｍｆの血球溶解物質と混合された１　０ｒｒ＋４の血液試料 をカートリッジに注入する。その溶解物質としては、例えば、雑誌“核酸研究′ の前記論文に記載されたショ糖とトリトン（Ｔｒｉ　ｔｏｎ）の混合物を使用す る。混合血液試料は４℃で１時間半インキュベートする。その後血液試料をカー トリッジから排出し、血球の核だけをフィルタ２０に付着したまま残す。そして 、ＰＢＳによる洗浄作業を２回行い（各回ともＰＢＳ１０ｍｌを使用）、さらに 、核溶解用の物質１．　５ｍＡ’をにプロテイナーゼ０．　５ｍｉ＋と共にカー トリッジに注入する。

その後カートリッジを５５℃で１時間インキュベートする。

さらに、チューブ１−０の内側であってかつカートリッジの透析膜１６．１６に べて残物は除去される。その後、透析区画１８に空気を吹き込むおよび／または 吸い出すことにより精製されたＤＮＡを回収する。

上記の透析操作を常温で行えば約２０時間かかるか、本方法においては高い温度 で行うので操作時間か大幅に短縮される。

ＤＮＡはその他にも、培養細胞や、予め破壊して均質化された組織からも抽出す ることができる。何れの場合にも、カートリッジのフィルタ２０上に核を付着さ せるのが存利である。そのようにすれば、その後で適当な緩衝剤を使用して連続 的に洗浄作業を行うことにより、脂質、核に結合したリポソーム、ヒストンの一 部を含む核タンパク質等を効果的に除去することかできるからである。

フィルタ２０の洗浄は、１％のトリトンＸ−１００を含む溶液を使用して始める ことかできる。それによ頃血液産物の残り物はフィルタ２０からすべて除去さね 、また、核はその外側の脂質の膜から完全に分離される。ヒストンの一部も除去 される。

次に、高イオン強度の溶液（２ＭのＮａＣ１等）で洗浄することにより、残った ＲＮＡの殆どすべてをある種のタンパク質と共に核から除去する。

さらに、前記のように、核を溶解するための物質を０．５ｍｌのにプロテイナー ゼと共にカートリッジに注入し、こうして残ったＤＮＡを透析して精製する。

前記の精製操作を行うことにより、ある種の細胞のＤＮＡを極めて純粋な状態で 取り出すことかできる。

本発明１ｉ　ＤＮＡを分解し除去することによりＲＮＡを抽出し精製することに も適用するができる。もっとも、ＲＮＡはＤＮＡより小さいので、もつと小さな 孔の透析膜を使用する必要かあり、そのため、透析の効率が下がり精製度も低下 することかある。ＤＮＡの分解にＣ転前記のりボヌクレアーゼの替わりにデオキ シリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ　）等を使用した酵素作用や、超音波剪断等の 機械作用を利用することができる。

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．精製された核酸を細胞から調製するためのカートリッジであって、核酸を精 製する等のための透析区画（１８）と、物質かその透析区画に入りまたそこから 出るための入口／出口手段（２６）とを含み、さらに中央にスロットを有し、綻 長で薄い平板な支持体（３２）と、前記支持体の両面に固定されてそれらの間に 前記透析区画を画成する一組の透析膜（１６）と、 前記支持体の長手方向の両端に設けられ、各々前記透析区画に開口する貫通ダク ト（４８）を有する２つの端部リング（１４）とを含むことを特徴とするカート リッジ。
2. ２．さらに、前記支持体によって支持されて前記透析区画を２つの分室（２２， ２４）に分け、かつ、前記細胞の核を保持するためのフィルタ（２０）を含み、 前記２つの端部リングの貫通ダクト（４８）かそのフィルタ（２０）の両側で前 記２つの分室にそれぞれ連通する請求項１のカートリッジ。
3. ３．前記フィルタ（２０）が、１マイクロメータ程度の寸法の極めて細かなメッ シュサイズを有するポリエステルフィルムである請求項２のカートリッジ。
4. ４．前記支持体が互いに重ね合わされた２つの矩形の伜部材（３２）からなり、 各枠部材がその一方の短辺部（３６）の内側面に長手方向に延びる溝（４０）を 有し、その溝がその一方の端で前記透析区画（１８）に開口し他方の端で対応す る前記端部リングの貫通ダクト（４８）と連通する請求項１〜３の何れかのカー トリッジ。
5. ５．前記枠部材（３２）および前記端部リング（１４）が、合成材料または硝子 繊維を主体とする複合材料からなる請求項４のカートリッジ。
6. ６．前記各枠部材（３２）の内縁部の中で、対応する前記透析膜（１６）が固定 される面であるその枠部材の外側面に近接する部分が面取りされている請求項４ または請求項５のカートリッジ。
7. ７．前記フィルタ（２０）か前記重ね合わされた２つの枠部材（３２）の間で固 定される、請求項４〜６の何れかと組み合わされた請求項２のカートリッジ。
8. ８．前記各端部リング（１４）がその一方の端面に、対応する前記枠部材（３２ ）の短辺部と係合する横断溝（４４）を有し、その横断溝にその端部リングの前 記貫通ダクト（４８）が連通してその枠部材の短辺部に形成された前記長手方向 溝（４０）に連通する請求項４〜７の何れかのカートリッジ。
9. ９．前記各端部リング（１４）がその他方の端側に、エラストマ材料からなるデ ィスク（５０）を収容する円柱状の空所（４６）を有し、そのディスクがその材 料の弾性による自己シールが可能であってかつ軸方向に延びる小径のボアを有し 対応する前記端部リングの貫通ダクト（４８）がその空所の底に連通する請求項 ８のカートリッジ。
10. １０．前記各端部リング（１４）がその外周面に設けられる円環伏のシールリン グを含む請求項１〜９の何れかのカートリッジ。
11. １１．請求項１〜１０の何れかのカートリッジを利用して、精製された核酸を細 胞から調製するための装置であって、 前記カートリッジが前記端部リングによってシールされた状態で取り付けられる 少なくとも１つのチューブ（１０）と、前記チューブの内側であってかつ前記カ ートリッジの外側に透析液を供給するかまたはそこを通過させる手段（２８，３ ０）と、前記２つの端部リングの貫通ダクトを、吹き込みおよび／または吸い出 しによる回収手段と、処理すべき試料，処理剤，洗浄剤を供給する手段とに選択 的に接続する接続手段と を含むことを特徴とする装置。
12. １２．前記カートリッジか前記チューブの内側において２つの半円柱状部材（５ ８）の間に取り付けられ、それにより、そのチューブの内側の空所体積が域少し 、その半円柱状部材の各々が前記透析液が通過し得る通路（６０）を有する請求 項１１の装置。
13. １３．細胞核を溶解しタンパク質を分解し核酸を透析して精製することにより細 胞から精製された核酸を調製する方法であって、細胞から核を分離して、透析区 画内に配置されたフィルタ上に固定する工程と、 前記フィルタ上に固定された前記核をその場において溶解し、不要なタンパク質 を核酸から分離する工程と、 所望の核酸以外の成分を前記透析区画からその場における透析によって除去する 工程と を含むことを特徴とする方法。
14. １４．さらに、前記透析区画内において前記細胞をその場において予め溶解する 工程を含む請求項１３の方法。
15. １５．さらに、前記フィルタ上に固定された前記核を適当な緩衝剤を使用して洗 浄することにより、脂質、前記核に付着したリボソーム，前記所望の核酸以外の 核内分子を除去する連続した工程を含む請求項１３または請求項１４の方法。
16. １６．前記透析工程が、約６０℃等の高温において行われる請求項１３〜１５の 何れかの方法。