JPH0641198A - 抗血液凝固タンパク質とその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 強力なＸａ因子阻害作用を有する抗血液凝固
物質アンテスタチンのＮ末端から１〜５８のアミノ酸と
高い相同性を有し、完全なアンテスタチン分子の有する
Ｘａ因子阻害作用の大部分を保持するタンパク質を構築
し製造し、抗血液凝固剤、医薬として用いる。 【構成】 本タンパク質は固相合成法により合成され
る。また遺伝子工学手法を用い組換えバキュロウイルス
転移ベクターに対応する遺伝子を組込み昆虫細胞に生産
させることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】メキシコヒル（Haementeria officinali
s）の唾液腺に見い出される１５ｋＤａのシステインに
富む（１１９アミノ酸に２０のシステイン）タンパク質
であるアンチスタシンは、ヒトの血液凝固カスケードに
おけるＸａ因子の強力な抑制物質であることが示された
（Tuszynskiら、J. Biol. Chem. ２６２：９７１８−９
７２３（１９８７）；Nuttら、J. Biol. Chem. ２６
３：１０１６２−１０１６７（１９８８））。内因性、
外因性いずれの経路によっても活性化できる、Ｘａ因子
抑制作用があるために、アンチスタシンを抗凝固治療に
用いる可能性が注目されている。さらに、アンチスタシ
ンは、トロンビンに作用するヒルジンやヘパリンのよう
な抗凝固剤よりも早い段階で凝固カスケードを抑制する
ので、より効果的な抗凝固剤となり得る。

【０００２】配列分析によって、アンチスタシンが、大
まかにいえばＮ−末端側の半分とＣ末端側の半分の間で
内部的相同性（アミノ酸の４０％、及びヌクレオチドの
５０％）を持つことが示されている。（Nuttら、J. Bio
l. Chem.２６３：１０１６２−１０１６７（１９８
８）；Hanら、Gene（Amst.）７５：４７−５７（１９８
９））。Ｎ末端側とＣ末端側の双方ともに１０個のシス
テインを含み、どちら側においてもシステイン残基の位
置は保存されている。Ｘａ因子の結合につづいてアンチ
スタシンが切断されることがすでに明らかにされてい
る。この切断はＮ末端側の３４位のａｒｇで生じるが、
Ｘａ因子の結合によって生ずると思われる。（Dunwiddi
eら、J. Biol. Chem. ２６４：１６６９４−１６６９９
（１９８９））。

【０００３】本発明は、アンチスタシンＮ末端の１〜５
８のアミノ酸と高い相同性を有するタンパクの構築と製
造を含む。このタンパクは生体活性を持ち、完全なアン
チスタシン分子の有するＸａ因子抑制作用の大部分を保
持する。

【０００４】本発明には、血液凝固カスケードの途中で
Ｘａ因子を抑制する生物活性のある分子量約６０００ド
ルトンのタンパク、このタンパクの製造方法、このタン
パクを用いた血液凝固抑制方法及び適当な医薬組成物が
含まれる。

【０００５】本発明は、本発明のタンパク質の遺伝子工
学による構築及び組み換えＤＮＡ技術による製造を記述
する。また本発明は、Ｘａ因子抑制作用と生体活性とい
う特性を保持するタンパクの他の変種も含まれる。

【０００６】本発明の好ましいタンパクは以下のアミノ
酸配列：

【表３】 1 5 10 15 Gln Gly Pro Phe Gly Pro Gly Cys Glu Glu Ala Gly Cys Pro Glu 20 25 30 Gly Ser Ala Cys Asn Ile Ile Thr Asp Arg Cys Thr Cys Ser Glu 35 40 45 Val Arg Cys Arg Val His Cys Pro His Gly Phe Gln Arg Ser Arg 50 55 58 Tyr Gly Cys Glu Phe Cys Lys Cys Arg Leu Glu Pro Met 又はその特性と保持した代わりのアミノ酸を有する。

【０００７】本発明のタンパクには、開示されたタンパ
ク質の配列及びその活性を維持しているフラグメント又
はサブユニット、天然の突然変異型、アレリック変異
型、ランダムに起こさせた突然変異型、及び活性を保持
した意図的な配列変異型が含まれる。フラグメント又は
サブユニットとは、たとえば完全なタンパクのＮ末端及
び／又はＣ末端の一部をとりのぞいた部分的配列など
の、完全なタンパクより少ないアミノ酸を含むあらゆる
配列の部分を表わす。

【０００８】また本発明のタンパクには、この精製した
タンパク配列の活性を保持している、開示された組み換
えタンパク配列が含まれる。又、融合タンパク又は発現
ベクター内のポリジーンの発現により生ずるタンパクも
本発明のタンパクに含まれる。又、ペプチド結合により
第２のポリペプチドと結合した、開示されたタンパクに
特徴的な活性を持つポリペプチドを含めてもよい。

【０００９】本発明のタンパクは、ＨＦ切断後のタンパ
クを含んだ溶液の扱いに特に注意をはらいながら、Merr
ifield（J. Am. Chem. Soc.,８５、２１４９（１９６
４））の述べるような固相合成法又はHoughten（Proc.
Natl. Acal. Sci., ８２、５１３２（１９８５））の合
成方法のようなそれに代わり得る他の化学合成法を用い
て製造することができる。

【００１０】固相合成法は、米国特許第４，２４４，９
４６号（１９８２年１月２１日発行、Rivierら）に一般
的に記されるように、保護されたアミノ酸を適当な樹脂
に結合することによりペプチドのＣ末端から開始する。
この記述は本出願書に引用されとりこまれている。この
一般的なタイプの合成方法の例は、米国特許第４，３０
５，８７２号及び第４，３１６，８９１号に記されてい
る。

【００１１】このポリペプチドの合成において、カルボ
キシル末端のアミノ酸は、そのα−アミノ基を適切に保
護して、クロロメチル化したポリスチレン樹脂等に結合
させる。塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸を用いるな
どしてα−アミノ保護基をとりのぞいた後に、合成の次
の段階に進む。開示されている文献に記されているよう
な他の標準的切断試薬及び条件を用いて特定のアミノ保
護基をとりのぞいてもよい。

【００１２】残りのα−アミノ及び側鎖が保護されたア
ミノ酸は、次に樹脂に結合した中間体化合物を得るため
の縮合によって望みの順序で段階的に結合する。合成に
おいて、各アミノ酸を別個につけ加えるかわりに、成長
する固相の鎖につけ加える以前にいくつかのアミノ酸を
相互に結合しておいてもよい。適当な結合試薬の選択
は、この種の技術に従う。

【００１３】２個のアミノ酸、アミノ酸とペプチド、又
はペプチドとペプチドの縮合は、アジド法、混合酸無水
物法、ＤＤＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）法、
活性エステル法（ｐ−ニトロフェニル・エステル法
等）、ＢＯＰ〔ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ
−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム・ヘクサフル
オロリン酸塩〕法、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド・エ
ステル法等）、Woodward試薬Ｋ法のような通常の縮合方
法によって行なうことができる。固相法でペプチド鎖を
延長する場合、ペプチドをＣ末端のアミノ酸で不溶性担
体に結合する。不溶性担体としては、Ｃ末端のアミノ酸
のカルボキシ基と反応して後に容易に切断される結合を
形成する、たとえば、クロロメチル樹脂やブロモメチル
樹脂などのハロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ア
ミノメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂及びｔ−ア
ルキルオキシカルボニル・ヒドラジド樹脂を使うことが
できる。ペプチドの化学合成では一般的に、鎖が完全に
合成された後に最終的にそれがとりのぞかれるまで、適
当な保護基で多様なアミノ酸部分である反応性の側鎖基
を保護する。又一般的に、カルボキシル基で反応する
間、アミノ酸又はフラグメント上のα−アミノ基を保護
し、その後そのα−アミノ保護基を選択的にとりのぞい
てその位置で次の反応が行なわれるようにする。したが
って一般的に、合成の一段階として、側鎖保護基を持つ
様々なアミノ酸残基が、所望の配列でペプチド鎖中に位
置している中間体を作成することになる。後にこれらの
保護基は、精製後所望の最終生成物を生産するために、
一般にはほとんど一度にとりのぞかれる。

【００１４】α及びｗ側鎖アミノ基を保護するのに用い
られる保護基の例としては、ベンジルオキシカルボニル
基（以後Ｚと略す）、イソニコチニル・オキシカルボニ
ル基（ｉＮＯＣ）、Ｏ−クロロベンジルオキシカルボニ
ル基〔Ｚ（２Ｃｌ）〕、ｐ−ニトロベンジルオキシカル
ボニル基〔Ｚ（ＮＯ₂）〕、ｐ−メトキシベンジルオキ
シカルボニル基〔Ｚ（ＯＭｅ）〕、ｔ−ブトキシカルボ
ニル基（Ｂｏｃ）、ｔ−アミルオキシカルボニル基（Ａ
ｏｃ）、イソボルニルオキシカルボニル基、アダマンチ
ルオキシカルボニル基、２−（４−ビフェニル）−２−
プロピルオキシカルボニル基（Ｂｐｏｃ）、９−フルオ
レニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、メチルスル
ホニルエトキシカルボニル基（Ｍｓｃ）、トリフルオロ
アセチル基、フタリル基、ホルミル基、２−ニトロフェ
ニルスルフェニル基（ＮＰＳ）、ジフェニルホスフィノ
チオイル基（Ｐｐｔ）、ジメチルホスフィノチオイル基
（Ｍｐｔ）等がある。

【００１５】カルボキシ基の保護基の例としては、たと
えば、ベンジルエステル（ＯＢｚｌ）、シクロヘキシル
エステル（Ｃｈｘ）、４−ニトロベンジルエステル（Ｏ
Ｎｂ）、ｔ−ブチルエステル（Ｏｂｕｔ）、４−ピリジ
ルメチルエステル（ＯＰｉｃ）、等がある。アミノ基及
びカルボキシル基以外の官能基を持つアルギニン、シス
テイン及びセリンのような特定のアミノ酸は、必要なら
ば適当な保護基で保護することが望ましい。たとえばア
ルギニン中のグアニジノ基はニトロ基、ｐ−トルエンス
ルフォニル基、ベンジルオキシカルボニル基、アダマン
チルオキシカルボニル基、ｐ−メトキシベンゼンスルホ
ニル基、４−メトキシ−２，６−ジメチルベンゼンスル
ホニル基（Ｍｄｓ）、１，３，５−トリメチルフェニル
スルホニル基（Ｍｔｓ）等で保護できる。システイン中
のチオール基は、ｐ−メトキシベンジル基、トリフェニ
ルメチル基、アセチルアミノメチル基、エチルカルバモ
イル基、４−メチルベンジル基、２，４，６−トリメチ
ルベンジル基（Ｔｍｂ）等で保護でき、セリン中の水酸
基は、ベンジル基、ｔ−ブチル基、アセチル基、テトラ
ヒドロピラニル基等で保護できる。

【００１６】Stewart と Young の“Solid Phase Pepti
de Synthesis”（「固相ペプチド合成」）（Pierce Che
mical Company, Rockford, IL （１９８４））は、ペプ
チド製造過程に関するくわしい情報を記述している。α
−アミノ基保護は１４〜１８ページに、側鎖ブロックは
１８〜２８ページに記されている。アミン、ヒドロキシ
ル及びスルフヒドリルの官能基に対する保護基の表は１
４９〜１５１ページに与えられている。それらの記述は
本明細書に引用されとり込まれている。

【００１７】所望のアミノ酸配列が完成した後、液体Ｈ
Ｆ及び１つ以上のチオ含有スカベンジャーのような試薬
で処理して、中間体ペプチドを樹脂担体から切りはなす
が、試薬はペプチドを樹脂から切りはなすだけでなく、
すべての残っている側鎖保護基も取り除く。ＨＦによる
切断後、タンパク配列をエーテルで洗浄し、大量の希釈
酢酸液にうつし、水酸化アンモニウムでｐＨを約８．０
に調整してかくはんする。

【００１８】望ましくは、ポリペプチド中の残基のアル
キル化（たとえば、メチオニン、システイン及びチロシ
ン残基のアルキル化）をふせぐために、チオクレゾール
とクレゾールのスカベンジャー混合物を用いる。樹脂を
エーテルで洗浄し、可溶化し、かつ分子内の橋かけ結合
を最少にするためにただちに大量の希釈酢酸に移す。２
５０μＭのポリペプチド濃度のものを０．１Ｍ酢酸約２
リットルで希釈する。次にこの溶液をかくはんし、水酸
化アンモニウムでｐＨを８．０に調整する。ｐＨ調整す
るとただちにポリペプチドはそれに適した高次構造をと
る。

【００１９】組み換えＤＮＡ技術 組み換えＤＮＡ技術を本発明のタンパクを生産するのに
用いてもよい。この技術によって、他の細胞、通常は他
の生体からの遺伝情報の一部、すなわちＤＮＡを、それ
を得た生体外で両端を結合することが可能になり、そし
てこの交雑ＤＮＡをもとのＤＮＡがコードするタンパク
を生産することのできる細胞にとりこむことを可能にす
る。遺伝情報、すなわちＤＮＡ又はｍＲＮＡは、分離さ
れて適当なクローニングベクターにとりこまれ、適当な
ホスト細胞に導入される。

【００２０】この技術に有用なクローニングベクター
は、特定の実験的な外来ＤＮＡを含んだＤＮＡ配列を含
む。ベクターは、安定して存在することができてその実
験的ＤＮＡの指示するタンパクを発現することが可能な
ホスト細胞に導入される。クローニングベクターには、
プラスミド、バクテリオファージ、ウイルス及びコスミ
ドが含まれる。発現ベクターとは、適当なホスト内で、
クローニングされた遺伝子のコピーの転写及びそれらの
ｍＲＮＡの翻訳が行なわれるのに必要なＤＮＡ配列であ
る。これらのベクターは、バクテリア、イースト、昆虫
及び哺乳類の細胞等の多様な細胞中で、前核生物又は真
核生物の遺伝子を発現することができる。

【００２１】又タンパクは、多くのウイルス系において
発現できる。適当に構成した発現ベクターは、自律的な
複製をホスト細胞内で行なうための複製起点、選択的遺
伝マーカー、限られた数の有用な制限酵素部位、多いコ
ピー数そして強力なプロモーターを有する。プロモータ
ーは、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合させてＲＮＡ
合成を開始させるＤＮＡ配列であり、強力なプロモータ
ーは、高い頻度でそのような開始を生じさせる。発現ベ
クターには、クローニング・ベクター、修飾されたクロ
ーニング・ベクター及び特に設計したプラスミド又はウ
イルスが含まれるが、これらに限定されるものではな
い。

【００２２】発現のシステム 前核生物は非常にしばしば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の種
々の菌株に代表される。その他、たとえば枯草菌（Baci
llus subtilis）などのバチルス、様々なシュードモナ
ス（Pseudomonas）属、又は他のバクテリア株のような
微生物株を用いてもよい。このような前核生物系におい
ては、複製部位とホストに適合できる種に由来する制御
配列を含むプラスミドベクターを用いる。たとえば大腸
菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、通常、Bolivarら（Ｇｅｎｅ
（１９７７）２：９５）によって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）種から取られたプラスミドであるｐＢＲ３２２の誘
導体を用いて形質転換する。ここに定義する制御配列
は、転写開始をするプロモーターを含み、リボソーム結
合部位の他にオペレーターを有してもよいものだが、こ
れにはβ−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトー
ス（ｌａｃ）プロモーター系（Chang ら、Nature（１９
７７）１９８：１０５６）、トリプトファン（Ｔｒｐ）
プロモーター系（Goeddelら、Nucleic Acid Res.（１９
８０）８：４０５７）、λ−由来Ｐ_Lプロモーター及び
Ｎ−遺伝子リボソーム結合部位（ShimatakeらNature
（１９８１）２９２：１２８）のような一般に用いられ
るプロモーターが含まれる。しかし、前核生物に適合で
き入手可能などんなプロモーター系を用いることもでき
る。

【００２３】本発明の真核生物系において有用な発現系
は、適当な真核生物遺伝子に由来するプロモーターを含
む。たとえばイーストで有用な種類のプロモーターに
は、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Hitzeman ら、
J. Biol. Chem（１９８０）２５５：２０７３）に対す
るプロモーターを含めた解糖酵素の合成に対するプロモ
ーターが含まれる。他のプロモーターとして、エノラー
ゼ遺伝子から得られるプロモーター（Holland, M. J.
ら、J. Biol. Chem.（１９８１）２５６：１３８５）又
はＹＥｐ１３より得られるＬｅｕ２遺伝子（Broach. J.
ら、Gene（１９７８）８：１２１）がある。

【００２４】適当な哺乳類のプロモーターには、ＳＶ４
０（Fiersら、Nature,（１９７８）２７３：１１３）か
らの初期及び後期プロモーター、あるいは、ポリオー
マ、アデノウイルス II、ウシ乳頭腫ウイルス又はトリ肉
腫ウイルス由来のプロモーターのような他のウイルスの
プロモーターが含まれる。適当なウイルス及び哺乳類の
エンハンサーは前掲のものである。植物細胞が発現系と
して用いられる場合にはノパリン合成プロモーターが適
当である（Depicker, A.ら、J. Mol. Appl. Gen.（１９
８２）１：５６１）。

【００２５】タンパクの発現に有用な昆虫の細胞発現系
には、Smith ら（米国特許第４，７４５，０５１号）に
記載の系を修飾したシステムが含まれる。バキュロウイ
スル遺伝子又はバキュロウイルス遺伝子のプロモーター
を有する部分から成るバキュロウイルスＤＮＡを切断
し、少なくともプロモーターを含むＤＮＡフラグメント
を得られる。所望の生成タンパクは、感受性のホスト昆
虫細胞を組み換えバキュロウイルス発現ベクターに感染
させることによって製造するが、ここで発現ベクター
は、バキュロウイルスポリヒドリンプロモーターの転写
制御下にある選択された異種タンパクポリペプチド構造
遺伝子を少なくとも１つ有する組み換えバキュロウイル
スゲノムである。

【００２６】ホストの昆虫細胞中で選択された遺伝子を
発現可能な組み換えバキュロウイルス発現ベクターは、
以下のように作られる、すなわちバキュロウイルスポリ
ヒドリンプロモーター及び同種間組み換えをしやすくす
るための十分な隣接するＤＮＡ配列から成るＤＮＡフラ
グメントを作るためにバキュロウイルスＤＮＡを切断す
ること；バキュロウイルスＤＮＡフラグメントをクロー
ニングビヒクルに挿入して修飾したクローニングベクタ
ーを形成すること；バキュロウイルスポリヒドリンプロ
モーターの転写制御下にあるクローニングされたバキュ
ロウイルスＤＮＡフラグメントの選択された制限部位を
同定すること；バキュロウイルスポリヒドリンプロモー
ターの転写制御下にあるバキュロウイルスＤＮＡフラグ
メント中のその他の制限部位を、修飾したクローニング
ベクターから欠落させること；選択された異種の遺伝子
を唯一の制限部位に挿入して組み換え往復ベクターを形
成すること；組み換えを生じさせるためにバキュロウイ
ルスＤＮＡを接触させて、組み換えバキュロウイルスと
非組み換えバキュロウイルスの混合物を作ること；及び
この混合物から組み換えバキュロウイルス発現ベクター
を単離すること。

【００２７】オリゴヌクレオチドプライマー 所望の配列の別々の鎖にハイブリダイズし、かつ鎖上の
相対的位置にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプ
ライマーを製造するが、その位置とは１つのプライマー
から合成される延長生成物は、鋳型（相補鎖）と分離し
た場合に、他のプライマーが決まった長さの核酸へと延
長するための鋳型のはたらきをすることができるような
鎖上の位置である。プライマーは、たとえば、それぞれ
NarangS. A.ら（Meth. Enzymol. ６８、９０（１９７
９））とBrown, E. L.ら（Meth.Enzymol.６８、１０９
（１９７９））に記述されているホスホトリエステル法
やホスホジエステル法等のあらゆる適切な方法を用い
て、又はそれらの方法の自動化された方法を用いて製造
することができる。そのような自動化された方法のひと
つにおいては、ジエチルホスホロアミダイトを出発物質
に用いて、Beaucageら（Tetrahedron Letters（１９８
１）２２：１８５９-１８６２）に記述されるように合
成することができる。修飾した固体支持体上でオリゴヌ
クレオチドを合成するひとつの方法が、米国特許第４，
４５８，０６６号に記されている。又、生体源から単離
したプライマーを使用することもできる（制限エンドヌ
クレアーゼ消化物など）。

【００２８】ｃＤＮＡライブラリのプロービング ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリをコロニー又はプラーク
ハイブリダイゼーション法を用いてスクリーニングす
る。バクテリアのコロニー（又は組み換えファージ感染
バクテリア）を入れた各プレートを２連のニトロセルロ
ースフィルター（Ｓ＆ＳタイプＢＡ−８５）の上にレプ
リカする。そしてバクテリアコロニースクリーニングの
ために、コロニーを５０μｇ／ｍｌのＡｍｐを含んだＬ
寒天上で３７℃で１４〜１６時間生育させる。バクテリ
アを溶菌させ、プラスミド、あるいはファージＤＮＡを
０．２ＮＮａＯＨ、１．５ＭＮａＣｌ、つづいてｐＨ
７．５の０．５Ｍトリス、１．５ＭＮａＣｌ、さらに２
倍濃度の標準クエン酸塩溶液（２×ＳＳＣ）で各５分間
順次処理することによってフィルターに固定した。フィ
ルターは風乾し、８０℃で２時間加熱し、２連のフィル
ターは、フィルターあたり１０ｍｌのＤＮＡハイブリダ
イゼーションバッファー（５×ＳＳＣ、ｐＨ７．０、５
×デンハルト溶液（ポリビニルピロリジン＋フィコー
ル、及び牛血清アルブミン；１×＝各０．０２％）ｐＨ
７．０のリン酸ナトリウムバッファー、０．２％ＳＤ
Ｓ、２０μｇ／ｍｌpolyＵ及び５０μｇ／ｍｌ変性サケ
精子ＤＮＡ）で４２℃で６〜８時間予備ハイブリダイズ
させる。

【００２９】サンプルは、望みの厳密なコントロールに
もとづく条件下に、キナーゼ処理したプローブとハイブ
リダイズさせる。通常の中程度のストリンジェント条件
では、プローブを含む１〜５ｍｌ／フィルターのＤＮＡ
ハイブリダイゼーションバッファを４２℃で２４〜３６
時間用いる。さらにきびしいストリンジェントコントロ
ールをするには、より高温でより短い時間にする。フィ
ルターは、ＳＳＣ×２、０．２％ＳＤＳ及びｐＨ７のリ
ン酸ナトリウムを用いて、３７℃で各回３０分、４回洗
浄して、その後ＳＳＣ×２及び０．２％ＳＤＳで２回洗
浄し、風乾して２〜３日間−７０℃でオートラジオグラ
フをとる。

【００３０】ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣ
Ｒ）増幅 タンパクをコード化する大量のＤＮＡを、Mullisら（米
国特許第４，８００，１５９号）の記述するポリメラー
ゼチェインリアクション（ＰＣＲ）増幅技術を用いて得
ることができる。１方のプライマーの延長生成物は、他
のプライマーとハイブリダイズさせると、核酸配列の生
成物の鋳型になる。プライマーと鋳型の複合体は、複製
機能を行なう時にプライマーを伸長させるＤＮＡポリメ
ラーゼの基質として働く。両方のプライマー延長物に共
通の領域は、変性されて、くりかえしプライマー延長の
鋳型として働く。

【００３１】Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼは、この増幅
過程でプライマー伸長を触媒する。酵素はサームス・ア
クアティクス（Thermus aquaticus）から単離された温
度に安定なＤＮＡポリメラーゼである。この酵素は、く
りかえし高い変性温度に上昇させても活性なままである
ので、１度だけ加えればよい。デオキシヌクレオチド３
リン酸塩はプライマー延長の組立て材料となる。

【００３２】核酸配列鎖は、鋳型の特定部位でそれらの
相補する鎖と結合するオリゴヌクレオチドプライマーの
存在下に、二本鎖が分離するまで加熱される。この工程
を、一連の加熱と冷却のサイクル、すなわち鎖を分離す
るための加熱と、プライマーのアニールと伸長のための
冷却をしながら続ける。サイクルをくりかえすたびによ
り多量の鎖のコピーが作られる。増幅によってコード領
域と、制限部位や翻訳シグナル（シグナル配列、開始コ
ドン及び／又は停止コドン）のようなその他すべてのプ
ライマーにコードされた情報が得られる。ＰＣＲのプロ
トコールは、しばしば０．５ｍＬのミクロ遠心管中で１
００μＬのスケールで行なわれる。ＰＣＲのサンプルは
一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡでよい。出発物質が
ＲＮＡの場合、ＰＣＲに先立って第１鎖ｃＤＮＡを作る
ために逆転写酵素を用いる。通常、最適の試行をはじめ
るために、ナノグラム程度のクローニングした鋳型、マ
イクログラム程度までのゲノムＤＮＡ又は２００００個
の標的コピーを選択する。

【００３３】ＰＣＲプライマーはオリゴヌクレオチドで
あり、通常は１５ないし３０の塩基の長さであり、相補
する鋳型鎖の５’末端を限定する配列と相補的である。
鋳型と相補性のない５’延長部をプライマーに加えて、
増幅自体をそれほどさまたげずに、ＰＣＲ増幅後に有用
な種々の操作を生成物に行なうことができる。２つのＰ
ＣＲプライマーはとくに３’末端において相互に相補的
な２個以上の塩基を持たないということが重要である。
プライマーにおいて内部の２次構造はさけなければいけ
ない。

【００３４】Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼが３７〜５５
℃の範囲で活性を持つために、プライマー延長はアニー
リングの段階で起こり、ハイブリッドは安定になる。望
ましくはプライマーの濃度は従来のＰＣＲと等しく、通
常は０．１ないし１μＭの範囲である。標準的ＰＣＲの
プロトコールでは、各デオキシヌクレオチド３リン酸塩
の濃度は、望ましくは約２００μＭである。４つのｄＮ
ＴＰ濃度は、各ｄＮＴＰに関して評価されたＫｍより高
い（１０〜１５μＭ）ことが望ましい。

【００３５】望ましくは、ＰＣＲバッファーは、約５０
０ｍＭの塩化カリウム、１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ
（室温でｐＨ８．３）、１５ｍＭの塩化マグネシウム及
び０．０１％ｗ／ｖのゼラチンから成る。０．８ｍＭの
全ｄＮＴＰ濃度の下に、１．５ないし４ｍＭの範囲で少
しずつ増加させて一連の反応を行なうことにより、特定
の生成物の最高の収量を与えるマグネシウム濃度がわか
るであろう。遊離マグネシウムが過少であるとＰＣＲ生
成物は得られず、過剰であると種々の望ましくない生成
物が生ずることがある。

【００３６】望ましくは、１００μＬの反応量で、２．
０ないし２．５ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼが
よい。酵素は、多くの反応に用いるためのマスターミッ
クスにはじめから加えると便利であり、各試験管にそれ
ぞれ０．５μＬの酵素液を加える際の精度の問題をさけ
ることができる。ＤＮＡ鋳型の増幅を行なう通常のＰＣ
Ｒプロトコールには、１分間の９４℃の変性段階、１分
間３７℃のプライマー再生段階及び２分間の７２℃のプ
ライマー延長段階が含まれる。これにより５００塩基対
の生成物は、２５サイクルで少なくとも１０００００倍
に増幅される。

【００３７】ＤＮＡ変性の際に、サンプルが熱平衡にな
るのに十分な時間を与える必要がある。ほとんどのサン
プルに対して有効な変性温度の実用的な範囲は、９２〜
９５℃であり、標準的な選択としては９４℃である。ふ
つうプライマーアニーリングはまず３７℃で行なって、
生成物の特異性を評価する。好ましくないバンドが観察
される場合には、順次最適になるようにアニーリング温
度を上げなければならない。多くの場合にプライマーア
ニーリング温度の範囲は３７〜５５℃であるが、場合に
よっては延長温度程度の高さにまで上昇するかもしれな
い。プライマーアニーリングとプライマー延長の段階を
ひとつにすると、２段階ＰＣＲ過程になる。

【００３８】ほとんどの適用において、プライマー伸長
は７２℃で十分に生じるので最適化はほとんど必要な
い。２温度ＰＣＲ過程での温度範囲は６５〜７０℃であ
る。酵素濃度が後期サイクルで増幅を制限する場合に
は、延長は、都合よく、サイクル数に比例して増加す
る。通常、２５ないし４５サイクルが特定の標的の大量
増幅（すなわち１００００００倍）に必要とされる。

【００３９】ベクターの構築 所望のコード配列及び制限配列を含む適当なベクターを
構築するのに、この分野で周知の標準的連結及び制限技
術を用いる。単離したプラスミド、ＤＮＡ配列又は合成
オリゴヌクレオチドを切断し、切り整え、そして所望の
形態に再結合する。

【００４０】部位特異的なＤＮＡの切断は、この分野で
周知の条件下で適当な制限酵素（又は諸酵素）で処理す
ることによって行なうが、個々の方法についてはこれら
の市販の制限酵素の製造元が指定する（New England Bi
olabs, Product Catalog参照）。一般に、約１μｇのプ
ラスミド又はＤＮＡ配列は、約２０μｌのバッファー溶
液（３７℃）中の１ユニットの酵素により切断される。
通常、ＤＮＡ基質の完全な加水分解を期すために過剰な
酵素を用いる。インキュベーション時間は、様々に変化
させることができるが、３７℃で約１ないし２時間で十
分である。各インキュベーション後、フェノール／クロ
ロホルムによる抽出によってタンパクを取り除き、その
後セファデックスＧ−５０スピンカラム（商品名）にか
けてもよい。必要ならば、標準的な技術を用いてポリア
クリルアミドゲル又はアガロースゲルにより、切断した
フラグメントのサイズ分離を行なってもよい。サイズ分
離の一般的説明は Methods in Enzymology（１９８０）
６５：４９９−５６０にまとめられている。

【００４１】制限的に切断したフラグメントは、４種の
デオキシヌクレオチド３リン酸塩（ｄＮＴＰ）の存在下
で大腸菌（E.coli）ＤＮＡポリメラーゼＩの大フラグメ
ント（Klenow）と、５０ｍＭトリス、ｐＨ７．６、５０
ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ ＭｇＣｌ₂、６ｍＭ ＤＴＴ及
び５〜１０μＭ ｄＮＴＰ中で１５ないし２５分間２０
ないし２５℃でインキュベーションして処理することに
よって、両端を平滑にしてもよい。Klenowフラグメント
は５’の突出部をうめて二重鎖にするが、４個のｄＮＴ
Ｐの存在下でも、突出した３’一本鎖はとりのぞく。必
要ならば、粘着末端の性質が要求する制限の範囲内でｄ
ＮＴＰの１つ又は選択したｄＮＴＰを用いることによっ
て選択的修復を行なうことができる。Klenow処理の後
に、混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し、エタ
ノールで沈殿してからSephadexＧ−５０スピンカラムに
かける。Ｓ１ヌクレアーゼと適当な条件下で処理する
と、すべての一本鎖部分が加水分解する。

【００４２】上記のように、オリゴヌクレオチドは、Ma
tteucciら（J. Am. Chem. Soc,（１９８１）１０３：３
１８５）のトリエステル法又は市販の自動化オリゴヌク
レオチドシンセサイザーを用いて製造できる。アニーリ
ングに先だつ、あるいは標識化のための一本鎖のキナー
ゼ処理は、過剰の、たとえば約１０ユニットのポリヌク
レオチドキナーゼを０．１ｎｍｏｌの基質に用いて、５
０ｍＭトリス、ｐＨ７．６、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５
ｍＭジチオスレイトール、１〜２ｍＭ ＡＴＰ、１．７
ｐｍｏｌ³²Ｐ−ＡＴＰ（２．９ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）、
０．１ｍＭスペルミジン及び０．１ｍＭ ＥＤＴＡの存
在下に行なうことができる。

【００４３】連結は、１５〜３０μｌの容量で以下の標
準的条件及び温度で行なう。すなわち、２０ｍＭトリス
−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ
ＤＴＴ、３３μｇ／ｍｌＢＳＡ、１０ｍＭ〜５０ｍＭ
ＮａＣｌ及び１ｍＭ ＡＴＰ、０．３〜０．６（Weis
s）ユニットＴ４ＤＮＡリガーゼ、１４℃（平滑末端の
連結）。分子間の粘着末端結合は、通常、３３〜１００
μｇ／ｍｌの全ＤＮＡ濃度（５〜１００ｎＭ全末端濃
度）で行なう。分子間ブラント末端結合は、（通常１０
〜３０倍の分子数の過剰なリンカーを用いて）１μＭ全
末端濃度で行なう。

【００４４】ベクターフラグメントを用いたベクターの
構築では、一般にベクターフラグメントをバクテリアの
アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）又は小ウシの腸ホス
ファターゼ（ＣＩＡＰ）で処理して、３７℃で３０分間
反応させて、５’リン酸をとりのぞき、ベクターの再結
合をふせぐ。ＢＡＰの加水分解は、ｐＨ８で、約１５０
ｍＭのトリス中、Ｎａ⁺及びＭｇ²⁺の存在下に、ベクタ
ー１μｇあたり１ユニットのＢＡＰを用いて６０℃で約
１時間行なう。ヌクレオチドフラグメントを回収するた
めに、生成物をフェノール／クロロホルムで抽出し、エ
タノール沈殿してSephadexＧ−５０スピン・カラムにか
けて脱塩する。あるいは、好ましくないフラグメントを
さらに酵素で加水分解することによって２重に加水分解
してベクターの再結合をふせぐことができる。

【００４５】配列修飾が必要なｃＤＮＡ又はゲノムＤＮ
Ａ由来のベクターの部分に対しては、部位特異的プライ
マーに対する突然変異誘発を用いる。これは、限られた
所望の変異をもたらすいくつかの不対合をのぞいて突然
変異誘発されるべき１本鎖プラスミド又はファージＤＮ
Ａに相補的な合成ヌクレオチドプライマーを用いて行な
う。つまり、合成オリゴヌクレオチドをファージに相補
的な鎖の合成を指示するプライマーとして用いて、得ら
れた２本鎖ＤＮＡをファージを保持するホストバクテリ
アに形質転換する。形質転換したバクテリアの培養物を
上層寒天中にまいて、ファージを持った１つの細胞から
１プラークを形成させる。

【００４６】理論的には新たなプラークの５０％が、一
本鎖突然変異した形を有するファージを含む。そして５
０％はもとの配列を有する。得られたプラークは、正確
な対合の交雑は可能であるが、不対合によりもとの鎖と
のハイブリダイズは起こらない温度で、キナーゼ処理し
た合成プライマーとハイブリダイズさせる。その後プロ
ーブとハイブリダイズしたプラークをつりあげて培養
し、ＤＮＡを回収する。

【００４７】構築の検証 以下に述べる構築において、プラスミド構成の正しい連
結は、E. coli 遺伝保存センター（E. coli Genetic St
ock Center ）から入手した大腸菌（E. coli）株ＭＭ２
９４（ＣＧＳＣ＃６１３５）又は他の適当なホストを連
結混合物で形質転換することによって、確認される。形
質転換体を、周知のやり方で、アンピシリン、テトラサ
イクリン又は他の抗生物質耐性によって、もしくはプラ
スミド構成のモードにかかわる他のマーカーを用いて選
択する。その後、形質転換体のプラスミドをClewell.
D. B.ら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA（１９６９）６
２：１１５９）の方法で、調製した。その前にクロラム
フェニコール増幅（Clewell.D. B., J. Bacteriol.（１
９７２）１１０：６６７）してもよい。単離したＤＮＡ
を制限酵素分解分析し、かつ／又は、Sanger. F.ら（Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA（１９７７）７４：５４６
３）が述べていてMessingら（Nucleic Acid Res（１９
８１）９：３０９）がさらに説明しているジデオキシ法
によって、あるいはMaxamら（Methods in Euzymology
（１９８０）６５：４９９）の方法によって配列分析す
る。

【００４８】形質転換 用いたホスト細胞に応じて適切な標準的技術を用いて形
質転換を行なう。前核生物や堅固な細胞壁を持つ他の細
胞に対しては、Cohen. S. N.（Proc. Nati. Acad. Sci.
USA（１９７２）６９：２１１０）の記述する塩化カル
シウムを用いたカルシウム処理、又はMariatisら（“Mo
lecular Cloning: A Laboratory Manual”（「分子クロ
ーニング：実験室用マニュアル」）（１９８２）Cold S
pring Harbor Press p.２５４）の述べるＲｂｃＣｌ法
を用いる。一定の植物細胞には、根頭がんしゅ病菌（Ag
robacterium tumefaciens）の感染を用いる（Shaw, C.
H.ら、Gene（１９８３）２３：３１５）。このような細
胞壁のない哺乳類の細胞には、Graham 及び Van der Eb
（Virology（１９７８）５２：５４６）のリン酸カルシ
ウム沈着法が好ましい。イーストへの形質転換は、Van
Solingen P.ら（J.Bacter.（１９７７）１３０：９４
６）及びHsiao, C. L.ら（Proc. Natl. Acad.Sci. USA
（１９７９）７６：３８２９）の方法に従って行なう。

【００４９】実施例１ スポドプテラ・フルギペルダ（Spodptera Frugiperda:
ヨトウガの一種）の細胞におけるＸａ因子抑制物質の生
産 ＮｏｔＩ部位とＳａｌＩ部位にはさまれた、λｇｔ２２
ｃＤＮＡ発現ライブラリ（Hanら、Gene ７５：４７−５
７（１９８９））から取られたアンチスタシン変種２ｃ
ＤＮＡクローンを、ＮｏｔＩ／ＳａｌＩで加水分解し
た。ＮｏｔＩ／ＳａｌＩ制限部位において制限酵素部位
をｐＵＣ１８中間ベクター（Bethesda Reserch Laborat
ories）中にサブクローニングして、中間ベクターＫ５
３８を作った（図２）。

【００５０】Ｋ５３８をＡｖａIIとＨｉｎｄIIIで加水
分解して（図２）、以下のオリゴヌクレオチド配列と連
結させることによって、アンチスタシンＯＲＦの両端で
欠けていた配列を再びおぎなった。すなわち：

【表４】 ｐＢＤ８８−００９−２を以下のように構成した（図
４）。すなわち、ｐＧＥＭ−３Ｚ（Promega Biotec）を
ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩで加水分解した。加水分解したｐ
ＧＥＭ−３ＺをまずオリゴＡ及びオリゴＢと結合させ
て、ＡｖａII、ＨｉｎｄIIIで加水分解した後、前もっ
て加水分解したＫ５３８から得ておいたＡｖａII／Ｈｉ
ｎｄIIIフラグメントに連結した。こうして得たｐＢＤ
８８−００９−２は完全なアンチスタシン変種２ＯＲＦ
を含む。ｐＢＤ８８−００９−２を鋳型として用い、Ｂ
ａｍＨＩクローニング部位、適切な開始を確実にするＫ
ｏｚａｋ配列（Kozak, Nucleic Acids Res. １５：８１
２５−８１４８（１９８７））それにつづく開始コドン
（ＡＴＧ）及び２〜５のアミノ酸残基を含む５’プライ
マー：及び５５〜５８のアミノ酸残基配列、それにつづ
く翻訳停止のための停止コドン（ＴＴＡ）とサブクロー
ニングのためのＢａｍＨＩクローニング部位（ＧＧＡＴ
ＣＣ）を含む３’プライマー：を用いるＰＣＲ増幅を行
なった（図１）。

【００５１】 ＰＣＲ増幅は、ＤＮＡサーマルサイクラ
ー（Perkin Elmer Cetus）を用いて、Saikiら（Science
２３９：４８７−４９１（１９８８））に従って、５０
ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭトリスｐＨ８．３、１．５ｍＭ
ＭｇＣｌ₂、０．０１％ゼラチン、２００ｕｍの各デオ
キシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）とＶａｒ２アン
チスタシンを含む１０ｎｇのＤＮＡ鋳型ｐＢＤ８８−０
０９−２、２５ユニットのＴａｑポリメラーゼ（Perkin
Elmer Cetus）、そして５００ｎｇ（０．１ｎｍｏｌ）
の各プライマーを含有する１００μｌ中で行なった。反
応混合物には、蒸発をふせぐために１００μｌの軽鉱物
油（Sigma）を上層した。以下のＰＣＲ増幅プログラム
を用いた、すなわち：最初の鋳型変性段階：９４℃で８
分間、その後：９４℃で２分間、６０℃で３分間、７２
℃で３分間を３０サイクル。完全に反応したＰＣＲをク
ロロホルムで一回抽出して鉱物油をとりのぞき、そして
５μｌを用い、２％アガロースゲル上で分離させ、ＤＮ
Ａをエチジウムブロミド染色後にＵＶ光で可視化した。
残っているＰＣＲプライマーとｄＮＴＰを水でうすめて
Centricon ３０膜（Amicon）に通してとりのぞいた。そ
の後ＰＣＲ生成物を制限酵素ＢａｍＨＩ（Boehringer M
annheim）で加水分解して、クローニング部位を生じさ
せて、ＮＡ−４５イオン交換膜（Schleicher & Scheul
l）を用いてゲル精製した。溶離したＤＮＡをフェノー
ル／クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿させ、遠心
し、再び水に分散させて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Boehri
nger Mannheim）を用いて中間発現ベクターｐＳＰ７３
（Promega）のＢａｍＨＩ部位に結合させてｐＪＤ８８
−０８を形成した。ＢａｍＨＩを用いてｐＪＤ８８−０
８から５８のアミノ酸から成るｃＤＮＡを切り出して、
オートグラファ・カリホルニカ（Autographa californi
ca）の各多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）の発現のベク
ターｐＶＬ９４１（LuckowとSummers, Virology １７
０：３１−３９（１９８９））と結合させて、ｐＷＯ８
８−１２を形成した（図５）。ｐＷＯ８８−１２は、シ
グナルペプチドを有する５８個のアミノ酸分子のアミノ
酸配列を含む（図３にこの配列が示されているが、シグ
ナルペプチドには下線がひかれ、成熟タンパクのＮ末端
のアミノ酸残基は＋１と番号がつけられている）。

【００５２】大腸菌（E. coli）ＨＢ１０１コンピテン
ト細胞（Bethesda Reserch Laboratries）を、組み換え
中間体発現ベクターを用いて、Hanahan（J. Mol. Biol.
１６６：５７７（１９８３））の方法を幾分変更して
形質転換し、Maniatis （“A Cloning Manual”（「ク
ローニング・マニュアル」））（アルカリ溶菌法）が述
べるようにプラスミドＤＮＡの大規模な調製を行なっ
た。インビトロの転写及び翻訳は、本構築体を用いてRi
boprobeシステム（Promega）に述べるように行なった。
インビトロの翻訳生成物は、前記のようにＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥによって分離すると、予測されたサイズのタンパク
生成物が組み換え中間体ベクターにより生産されたこと
がオートラジオグラフで示されたが、これは、遺伝子特
性によって挿入されたアンチスタシン半分子のリーディ
ングフレームが機能している。つまり損傷点突然変異、
欠失、あるいは挿入がないということを示している。

【００５３】昆虫細胞内の発現 ヨトウガの一種（Spodoptera Frugiperda）Ｓｆ９昆虫
細胞（S.frugiperda ATCC No. CRL１７１１）のサナギ
卵巣組織由来のクローン単離した細胞ＩＰＬＢ−Ｓｆ２
１−ＡＥ（Vaughanら、In Vitro（１９７７）１３，２
３１〜））をホスト細胞に用いた。ｐＷＯ８８−１２を
用いてSummersとSmith（Texas Agricultural Experimen
tal Section Bulletin No.１５５５，１９８７）の方法
によってホスト細胞をコトランスフェクトした。ｐＷＯ
８８−１２は、ポリヒドリンプロモーターの下流に挿入
した５８個のアミノ酸タンパク遺伝子を有する。５日後
に、ウイルスを回収して、SummersとSmithにもとづいて
プラークを精製した。組み換えウイルス感染の形態的特
徴を示しているウイルスプラークをウイルスのストック
源とし選んだ。これらの単離した細胞外ウイルス（ＥＣ
Ｖ）を用いてＳｆ９細胞を感染させて、５日間で、分泌
されるタンパクのアッセイができる培養培地が得られ
た。

【００５４】ＩＰＬ−４１基礎培地（J. R. Scientific
Woodland. CA）を２％の加熱失活させたFetal Bovine
Serum（FBS, Gibco, Grand Island, NY）３．３ｇ／ｌ
のYeastolate（商品名、Difco, MI）とともに、１．０
ｇ／ｌのPluronic Ｆ６８（BASF Corporation, Parsipp
any, NJ）を懸濁培養に加えることをのぞけば、静置培
養と懸濁培養の両方に用いた。細胞をかくはんフラスコ
中で１．０×１６⁶個／ｍｌの密度まで生育させて、１
ｍｌで１０⁷のプラーク形成ユニット／ｍｌの力価を持
つウイルスストックを培養液１ｌ当り１０ｍｌの濃度で
加えた。Ｓｆ９細胞の生育とウイルス感染は、培養基中
に溶解した酸素のレベルが過少（空気飽和２０％以下）
と過剰（１００％以上）の場合は悪影響を受けることが
わかった。ウイルスを含んだ培養培地は７２時間から９
６時間収獲される。

【００５５】タンパク発現の検証 培養培地中の活性タンパクの存在は、色素生成基質アッ
セイシステムSpectrozyme Factor Xa（American Diagno
stica）を用いたＸａ因子抑制アッセイで同定した。１
００μｌの５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、０．１５ＭＮ
ａＣｌ、０．１％ＢＳＡ（ＴＢＳＡバッファー）に対し
て１０μｌの培養培地（又は対照のためにはＴＢＳＡバ
ッファー）及び５０μｌのＸａ因子（最終濃度０．５ｎ
Ｍ）を加えて、混合物を２０〜２３℃で３０分間インキ
ュベートした。６０μｌのSpectrozyme Factor Xaを全
サンプルに加えて、Bio Rad model３５５０マイクロプ
レートリーダーを用いて４０５ｎｍでの吸収の増加を測
定することによりタンパクの活性を決定した。感染後４
日で収集した培養培地は、Ｘａ因子抑制作用を持つこと
がわかった。その後これらの培地をCentricon membrane
１０で濃縮し、イムノブロッティングで分析した。濃縮
した培養培地を０．３％ＳＤＳで変性させ、２％（ｖ／
ｖ）２−メルカプトエタノールで還元し、１２％ポリア
クリルアミドゲル（Lammeli, Nature, ２２７：６８０
−６８５（１９７０））上の電気泳動で分離し、製造元
の指示に従ってGene Screenとナイロン膜（NEN/Dupon
t）上に電気的に移動させて、モルモット抗アンチスタ
シン抗血清と、それにつづいて¹²⁵Ｉ−protein A（NEN/
Dupont）とでプローブした。イムノブロットのオートラ
ジオグラフは、Ｘａ因子抑制作用を持つことが示された
培養培地中では、アンチスタシン半分子にあたる６ｋＤ
ａの予測された分子サイズのタンパクのバンドを示した
が、感染していない対照の細胞培養ではバンドを示さな
かった。

【００５６】さらに生化学的特徴づけを行なう目的で、
組み換えタンパクをヘバリン−Sepharoseクロマトグラ
フィーによって部分的に精製した。培養培地は充填前に
充填バッファー（０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む２０
ｍＭのトリス、ｐＨ５．６）で１ないし６倍に希釈し、
充填バッファーで洗浄して、０．１５から０．７５Ｍの
ＮａＣｌで段階的に（０．１５、０．２５、０．３５、
０．４５、０．５５、０．６５、０．７５Ｍ）溶離し
た。活性タンパクは０．１５ＭＮａＣｌで溶出した。溶
離したものを今度は脱塩して濃縮し、Centricon１０膜
を用いて２０ｍＭトリスバッファー、ｐＨ７．４にバッ
ファー交換した。インビボの有効性及び安全性の評価の
ための大量生産をするために、逆相ＨＰＬＣマトリクス
を用いたバッチ法を用いた。バキュロウイルス／Ｓｆ９
細胞から取った無細胞培養培地を０．２２ミクロンのセ
ルロースアセテート膜を通して濾過した。バルクプレッ
プＣ₁₈逆相充填樹脂（Waters社）を５％イソプロパノー
ル（ＩＰＡ）で調整して、前もって５％ＩＰＡに調整し
ておいた濾過した培地と混合した。Ｘａ因子抑制活性物
質のほとんどは、２０％ＩＰＡによって樹脂から十分に
溶離されることがわかった。この段階でのＸａ因子抑制
物質の回収は、出発物質の培地で検出される活性の５０
％であった。溶離したものをさらに調製用等電点電気泳
動で精製した後に、０．１％ＴＦＡ中で５〜３０％の直
線勾配のアセトニトリルにより溶出させるμ−Bonkapak
Ｃ₁₈カラムを用いたＲＰ−ＨＰＬＣを行なった。後に溶
離した方が８０％の活性を有する２つのＸａ因子抑制の
ピークが回収された。この段階でのＸａ因子抑制活性の
全回収率は４７％であった。この２つのＸａ因子抑制ピ
ークは、Ｘａ因子抑制に関して等しく活性があり、前記
のように決定した同等のＩＣ₅₀（０．７３ｎＭ）を有
し、以下のように決定された類似のアミノ酸構成（表
１）を有することがわかった。すなわち、減圧下に６Ｎ
ＨＣｌ、０．１％フェノール中で１１０℃で７０時間タ
ンパクの加水分解を行なった。アミノ酸分析を、メーカ
ー指定の方法によるニンヒドリンポストカラムで検出す
るBeckman Model６３００アミノ酸アナライザーを用い
て行なった。この２つのピークの異なった溶離パターン
は翻訳後の修飾又は凝集によると思われる。

【表５】 表 １ 残 基 理論値 実測値 Var2 (Var1) メジャーピーク マイナーピーク Asx 2 2.3^* 1.93^* 2.27 Thr 2 1.8 1.94 1.96 Scr 3 2.7 2.78 2.68 Glx 8 (7) 7.6 8.05 7.39 Pro 5 5.1 4.60 4.62 Gly 7 (8) 6.5 6.89 6.25 Aln 2 1.9 2.23 2.14 Cys 10 N.D. N.D. N.D. Val 2 (1) 1.9 2.49 2.27 Met 1 N.D. 0.81 0.75 Ile 2 1.9 1.15 1.19 Leu 1 1.4 1.21 1.35 Tyr 1 1.0 1.03 0.97 Phe 3 2.9 2.99 2.78 His 2 2.0 1.77 1.74 Lys 1 1.2 1.13 1.52 Arg 6 (5) 5.0 4.88 4.47 ────────────────────────────────── ＊２つは別々に測定

【００５７】本発明のタンパクは、Ｘａ因子を抑制して
凝固経路を抑制する。Ｘａ因子の抑制は、適当な医薬組
成物用担体、たとえば食塩水と組み合わせて、適当なｐ
Ｈ、たとえば７．４にして、Ｘａ因子がプロトロンビン
からのトロンビンの形成を引き起こすのをこの組成物が
阻害するように、連続静脈内投与あるいはボーラス投与
のいずれかによってこのタンパクを投与することによっ
て行なう。Ｘａ因子抑制作用を持つ本発明のタンパク性
物質は、他の多くのタンパク／ペプチドのように、無毒
性の有機あるいは無機の酸とならばどれとでも薬剤用の
塩を形成する。適当な塩を作る無機酸の例には、塩酸、
臭化水素、硫酸及びリン酸などの酸、そして酸金属塩を
形成するものとしてナトリウム１水素オルトリン酸塩、
及び硫酸水素カリウムなどがあげられる。適当な塩を作
る有機酸の例には、モノ、ジ、及びトリカルボキシル酸
が含まれる。このような酸の例としては、たとえば、酢
酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハ
ク酸、トリフルオロ酢酸、グルタル酸、フマル酸、リン
ゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、マレイン
酸、ヒドロキシマレイン酸、安息香酸、ヒドロキシ安息
香酸、フェニル酢酸、ケイ皮酸、サリチル酸、２−フェ
ノキシ安息香酸のような酸があり、また、メタンスルホ
ン酸や２−ヒドロキシエタンスルホン酸のようなスルホ
ン酸がある。カルボキシ末端のアミノ酸部分の塩には、
あらゆる適当な無機又は有機塩基とともに形成した無毒
性のカルボン酸塩が含まれる。たとえばそれらの塩に
は、アルカリ金属、たとえばナトリウムやカリウムとの
塩；アルカリ土類金属、たとえばカルシウムやマグネシ
ウムとの塩；アルミニウムを含めたIIIＡ族の軽金属と
の塩；そして有機第一、第二、及び第三アミン、たとえ
ば、トリエチルアミンを含めたトリアルキルアミン、プ
ロカイン、ジベンジルアミン、１−エテンアミン、Ｎ，
Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、ジヒドロアビエチ
ルアミン、Ｎ−（低級）アルキル−アルキルピペリジ
ン、及び他のすべての適当なアミンが含まれる。

【００５８】Ｘａ因子抑制作用を持つ本発明のタンパク
質性物質の、抗凝固をおこす用量は、たとえば患者や治
療をうける血栓の状態によっても異なるが、一日に患者
の体重あたりで０．４ｍｇ／ｋｇから５００ｍｇ／ｋｇ
である。個々の患者への適切な用量は簡単に決めること
ができる。好ましくは一日に１ないし４回の投与で、通
常１回の用量として１０ｍｇから２００ｍｇの活性化合
物を投与する。保存血液などの媒質中で血液凝固又はＸ
ａ因子を抑制するのに用いる場合にＸａ因子を抑制する
のに必要となるＸａ因子抑制作用を持つ本発明のタンパ
ク質性物質の濃度は、当業者により容易に決定できる。

【００５９】抗凝固治療とは、様々の血栓の状態、とく
に冠状動脈及び脳血管疾患の治療及び予防を言う。この
分野の経験者は、抗凝固治療の必要な状況を容易に認め
る。ここに「患者」とは、ヒトを含めた霊長類、ヒツ
ジ、ウマ、ウシ、ブタ、犬、ネコ、ネズミ、及びハツカ
ネズミなどの哺乳類を意味する。Ｘａ因子の抑制は、血
栓状態を持つ個々の患者の抗凝固治療に役立つだけでな
く、保存全血液や試験用又は保存用の他の生体サンプル
中の凝固をふせぐなどの血液凝固抑制が必要なあらゆる
場合に役立つ。したがって、Ｘａ因子抑制作用を持つ本
発明のタンパク質性物質は、Ｘａ因子を含む、あるいは
含むと思われる媒質で、血液凝固の抑制が望ましいすべ
ての媒質に加えたり接触させたりすることができる。

【００６０】Ｘａ因子抑制作用を持つ本発明のタンパク
質性基質は、経口投与につづいて腸を経ても失活しない
が、出願者らは、たとえば皮下、静脈内、筋肉内などの
非経口の投与、デポー注射による投与、あるいは植込み
製剤を勧める。

【００６１】非経口投与のためには、Ｘａ因子抑制作用
のある本発明のタンパク質性基質を、水や油などの無菌
の液体に場合によって表面活性剤及び他の薬剤用の佐剤
を加えた薬剤用担体とともに、生理的に受容し得る希釈
剤中に溶解又は懸濁させた注射用服用量を投与してもよ
い。この調製に用いることのできる油の例は石油、動物
性油、植物性油、又は合成油があり、たとえばラッカセ
イ油、大豆油、そして鉱油である。一般に、水、塩類溶
液、デキストロース水溶液及び関連した糖溶液、エタノ
ール、そしてプロピレングリコール又はポリエチレング
リコールのようなグリコールは、とりわけ注射用溶液に
対しては好ましい液体担体である。

【００６２】Ｘａ因子抑制作用を持つ本発明のタンパク
質性物質は、活性成分の持続的放出を可能とするように
処方されているデポー注射又は植込み製剤の形態で投与
できる。活性成分はペレット又は小さいシリンダーに圧
縮して、デポー注射又は植込み剤として皮下又は筋肉内
に内植する。内植には、生物分解のポリマーや合成シリ
コン、たとえばSilastic（商品名）、シリコンゴム又は
他の Dow-Corning Corporation製のポリマーなどの不活
性物質を用いてもよい。このタンパクは単独で用いても
他のタンパクと組み合わせて用いてもよい。たとえば、
このタンパクは、組織プラスミノーゲン活性化因子を介
した血栓再血流効果を促進する。このタンパクは、まず
血栓の形成後に投与して、その後に組織プラスミノーゲ
ン活性化因子又は他のプラスミノーゲン活性化因子を投
与するとよい。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＰＣＲによるタンパクｃＤＮＡ分子の構成の計
画及びプライマー配列を示す図である。

【図２】中間体ベクターＫ５３８の構築を示す図であ
る。

【図３】シグナルペプチドを有するＸａ因子抑制物質の
アミノ酸配列を示す図である。

【図４】中間ベクターｐＢＤ８８−００９−２の構築を
示す図である。

【図５】発現ベクターｐＷＯ８８−１２を示す図であ
る。

【図６】アンチスタシン変異体２ｃＤＮＡクローンを示
す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/12 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ // Ｃ０７Ｋ 99:00 (72)発明者 ジュウ−シエング ツン アメリカ合衆国，08512 ニュージャーシ ィ，クランバリー，ポラク コート １ (72)発明者 メルヴィン シルバークラング アメリカ合衆国，07631 ニュージャーシ ィ，インゲルウッド，ヒルサイド アヴェ ニュー 21 (72)発明者 サイモン ダブリユ．ロウ アメリカ合衆国，07023 ニュージャーシ ィ，ファンウッド，グレンウッド ロード 50 (72)発明者 ジョン イー．マーク アメリカ合衆国，08550 ニュージャーシ ィ，プリンストン ジャンクション，リチ ャード コート ４

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｘａ因子を抑制し、およそその分子量が
   約６０００ドルトンである精製タンパク質。
2. 【請求項２】 以下のアミノ酸組成： 【表１】アミノ酸 範 囲 Ａｓｘ ２ Ｔｈｒ ２ Ｓｅｒ ３ Ｇｌｘ ７−８ Ｐｒｏ ５ Ｇｌｙ ７−８ Ａｌａ ２ Ｃｙｓ １０ Ｖａｌ １−２ Ｍｅｔ １ Ｉｌｅ ２ Ｌｅｕ １ Ｔｙｒ １ Ｐｈｅ ３ Ｈｉｓ ２ Ｌｙｓ １ Ａｒｇ ５−６ 又はその特性を保持した置換アミノ酸を有する請求項１
   のタンパク質。
3. 【請求項３】 以下の配列： 【表２】 1 5 10 15 Gln Gly Pro Phe Gly Pro Gly Cys Glu Glu Ala Gly Cys Pro Glu 20 25 30 Gly Ser Ala Cys Asn Ile Ile Thr Asp Arg Cys Thr Cys Ser Glu 35 40 45 Val Arg Cys Arg Val His Cys Pro His Gly Phe Gln Arg Ser Arg 50 55 58 Tyr Gly Cys Glu Phe Cys Lys Cys Arg Leu Glu Pro Met 又はその特性を保持した置換アミノ酸を有する請求項２
   のタンパク質。
4. 【請求項４】 有効量の請求項１のタンパクを含有す
   る、血液凝固抑制用医薬組成物。
5. 【請求項５】 ａ）ジシクロヘキシルカルボジイミドの
   存在下に、Ｂｏｃ−保護したプロリンを、Ｏ−Ｐａｍ樹
   脂に付着させたメチオニンと結合させること； ｂ）適当な中和剤でプロリンを中和すること； ｃ）プロリンを脱保護すること； ｄ）アミノ酸を順次結合、中和、及び脱保護して、５８
   個のアミノ酸から成るタンパクを生成すること； ｅ）ＨＦでタンパクを切断すること； ｆ）酢酸の希釈溶液にタンパクを移すこと；及び ｇ）その溶液を攪拌することから成る、請求項３のタン
   パクの製造方法。
6. 【請求項６】 有効量の請求項４の混合物を哺乳類に投
   与することを含む、哺乳類の血液凝固抑制方法。
7. 【請求項７】 Ｘａ因子を抑制するために請求項１のタ
   ンパクを投与すること、及び、その後組織プラスミノー
   ゲン賦活剤又は他のプラスミノーゲン賦活剤を投与する
   ことから成る、患者の血栓形成後の血栓溶解による再灌
   流を達成する方法。
8. 【請求項８】 請求項３のタンパクに対するコーディン
   グＤＮＡを持つ遺伝子。
9. 【請求項９】 請求項８のＸａ因子抑制タンパク遺伝子
   又はその一部をバキュロウイルスゲノムに導入すること
   のできる組み換えバキュロウイルス転移ベクターであっ
   て、バキュロウイルスゲノムの一部、バクテリアの複製
   起点、及びバキュロウイルスプロモーターの転写コント
   ロール下にＸａ因子をコードするＤＮＡ配列から成る転
   移ベクター。
10. 【請求項１０】 プロモーターがポリヒドリン遺伝子プ
    ロモーターである請求項９の組み換えバキュロウイルス
    転移ベクター。
11. 【請求項１１】 Ｘａ因子抑制物質をコード化するＤＮ
    Ａ配列がポリヘドリン遺伝子の少なくとも２つのコドン
    と融合して翻訳されるように続き、少なくともその一方
    のコドンが開始コドンである、請求項１０の組み換えバ
    キュロウイルス転移ベクター。
12. 【請求項１２】 Ｘａ因子抑制物質をコード化するＤＮ
    Ａ配列がｐＷＯ８８−１２である、請求項１１の組み換
    えバキュロウイルス転移ベクター。
13. 【請求項１３】 バキュロウイルスプロモーターの転写
    コントロール下にＸａ因子抑制物質をコード化するＤＮ
    Ａ配列を少なくとも１つ有する組み換えバキュロウイル
    スゲノムである組み換えバキュロウイルス発現ベクター
    を感受性のホスト昆虫細胞に感染させること；適当な条
    件下に感染した細胞を増殖させること；及び培養培地か
    らポリペプチドを回収すること；から成る請求項３のポ
    リペプチドの製造方法。
14. 【請求項１４】 ホスト細胞がスポドプテラ・フルギペ
    ルダの細胞である請求項１３の方法。