JPH06347404A - レーザ走査蛍光分光計測方法および装置 - Google Patents
レーザ走査蛍光分光計測方法および装置Info
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- JPH06347404A JPH06347404A JP13731993A JP13731993A JPH06347404A JP H06347404 A JPH06347404 A JP H06347404A JP 13731993 A JP13731993 A JP 13731993A JP 13731993 A JP13731993 A JP 13731993A JP H06347404 A JPH06347404 A JP H06347404A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 検体内の所定の断面より発せられる蛍光の分
光を行なうレーザ走査蛍光分光計測方法および装置を提
供する 【構成】 点光源Ａに集光されたのち発散するレーザ光
ａ２の光路上に色収差を有する対物24レンズを設け、こ
の対物レンズ24により検体10内の点Ｂに集光されたレー
ザ光ａ3 によって、検体10内の蛍光物質11が励起され、
励起された蛍光ｂ1 ，ｂ2 が対物レンズ24によりそれぞ
れ集光される点Ｐ1 ，Ｐ2 を走査するピンホール25を設
ける。点Ｂより発せられた蛍光ｂ1 ，ｂ2 は対物レンズ
24によりそれぞれ異なる点Ｐ1 ，Ｐ2 に集光され、ピン
ホール25を走査することによりこれらの蛍光ｂ1 ，ｂ2
のうちいずれか一方を選択的に通過させ、その通過した
後の蛍光の強度を検出する。また３次元可動ステージ34
を３次元的に走査することにより検体10内の任意の断面
における蛍光を得ることができる。
光を行なうレーザ走査蛍光分光計測方法および装置を提
供する 【構成】 点光源Ａに集光されたのち発散するレーザ光
ａ２の光路上に色収差を有する対物24レンズを設け、こ
の対物レンズ24により検体10内の点Ｂに集光されたレー
ザ光ａ3 によって、検体10内の蛍光物質11が励起され、
励起された蛍光ｂ1 ，ｂ2 が対物レンズ24によりそれぞ
れ集光される点Ｐ1 ，Ｐ2 を走査するピンホール25を設
ける。点Ｂより発せられた蛍光ｂ1 ，ｂ2 は対物レンズ
24によりそれぞれ異なる点Ｐ1 ，Ｐ2 に集光され、ピン
ホール25を走査することによりこれらの蛍光ｂ1 ，ｂ2
のうちいずれか一方を選択的に通過させ、その通過した
後の蛍光の強度を検出する。また３次元可動ステージ34
を３次元的に走査することにより検体10内の任意の断面
における蛍光を得ることができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はレーザ走査蛍光分光計測
方法および装置に関し、詳細には検体内の所定の深さに
おける断面内において発光される蛍光の分光を行なうレ
ーザ走査顕微鏡に関するものである。
方法および装置に関し、詳細には検体内の所定の深さに
おける断面内において発光される蛍光の分光を行なうレ
ーザ走査顕微鏡に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来より生体等の検体内部を無侵襲（非
破壊）的に観察する方法が生物分野、特に医学分野にお
いて強く求められており、放射線を検体に照射すること
によって検体内部の構造体に係る情報を、構造体の放射
線透過率の差に応じた情報として得る放射線撮影方法を
はじめ、種々の方法が開発されている。
破壊）的に観察する方法が生物分野、特に医学分野にお
いて強く求められており、放射線を検体に照射すること
によって検体内部の構造体に係る情報を、構造体の放射
線透過率の差に応じた情報として得る放射線撮影方法を
はじめ、種々の方法が開発されている。
【０００３】ところで、近年、レーザ技術や微弱光検出
の技術等の発達に伴いレーザ光を光源として用いるレー
ザ顕微鏡が開発され、特に反射型レーザ走査顕微鏡は普
及が著しい。この反射型レーザ走査顕微鏡は、点光源よ
り出射し発散するレーザ光を、色消し作用を有する対物
レンズにより試料の所定の深さに集光し、この集光点よ
り反射される光を、再度対物レンズに入射し、上記集光
点と共役な点にこの反射光を集光し、この集光された光
の強度を検出することにより、試料の所定の深さにおけ
る形態にかかる情報を得るものである。この反射型レー
ザ走査顕微鏡において、試料を対物レンズの光軸と垂直
に交わる方向に走査（ステージ走査）し、または光学系
を上記方向に走査（光束走査）することにより、試料の
所定の深さにおける形態的断面情報を得ることができ
る。この断面情報を得ることは、一般にオプティカルセ
クショニングと呼ばれている。
の技術等の発達に伴いレーザ光を光源として用いるレー
ザ顕微鏡が開発され、特に反射型レーザ走査顕微鏡は普
及が著しい。この反射型レーザ走査顕微鏡は、点光源よ
り出射し発散するレーザ光を、色消し作用を有する対物
レンズにより試料の所定の深さに集光し、この集光点よ
り反射される光を、再度対物レンズに入射し、上記集光
点と共役な点にこの反射光を集光し、この集光された光
の強度を検出することにより、試料の所定の深さにおけ
る形態にかかる情報を得るものである。この反射型レー
ザ走査顕微鏡において、試料を対物レンズの光軸と垂直
に交わる方向に走査（ステージ走査）し、または光学系
を上記方向に走査（光束走査）することにより、試料の
所定の深さにおける形態的断面情報を得ることができ
る。この断面情報を得ることは、一般にオプティカルセ
クショニングと呼ばれている。
【０００４】一方、生体等の内部の各種情報を得る試み
があり、生体を透過または反射した透過光または反射光
の吸収を利用するものや、散乱現象を利用するもの、ま
たは蛍光，燐光，化学発光等の発光を利用するものがあ
る。このうちで蛍光を利用するものにあっては、生体組
織中に本来存在している蛍光物質を利用するものと、光
造影剤のように外部より蛍光物質を与えその蛍光物質を
利用するものとがあり、例えば、生体における代謝のメ
カニズムを解明しようとする場合、蛍光物質を生体に与
え、ある代謝の前後で蛍光物質の発光波長帯域における
所定の２波長あるいは３波長の蛍光の強度をフィルタを
介して検出することにより、その代謝に係る蛍光物質の
挙動を明らかにすることができる。
があり、生体を透過または反射した透過光または反射光
の吸収を利用するものや、散乱現象を利用するもの、ま
たは蛍光，燐光，化学発光等の発光を利用するものがあ
る。このうちで蛍光を利用するものにあっては、生体組
織中に本来存在している蛍光物質を利用するものと、光
造影剤のように外部より蛍光物質を与えその蛍光物質を
利用するものとがあり、例えば、生体における代謝のメ
カニズムを解明しようとする場合、蛍光物質を生体に与
え、ある代謝の前後で蛍光物質の発光波長帯域における
所定の２波長あるいは３波長の蛍光の強度をフィルタを
介して検出することにより、その代謝に係る蛍光物質の
挙動を明らかにすることができる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】ところで反射型レーザ
走査顕微鏡は形態的（空間的）なオプティカルセクショ
ニング機能を有しているものの、分光（周波数的）情報
を得ることができない。一方、フィルタを介して蛍光分
光を行なう方法は、通常透過光により行われるものであ
るから、その透過方向の全長に亘る分光情報を得ること
はできるが、所定の深さにおける分光情報を無侵襲で選
択的に得ることはできないい。
走査顕微鏡は形態的（空間的）なオプティカルセクショ
ニング機能を有しているものの、分光（周波数的）情報
を得ることができない。一方、フィルタを介して蛍光分
光を行なう方法は、通常透過光により行われるものであ
るから、その透過方向の全長に亘る分光情報を得ること
はできるが、所定の深さにおける分光情報を無侵襲で選
択的に得ることはできないい。
【０００６】しかし上述した代謝のメカニズムを解明す
るうえで、蛍光物質の挙動を検出するとともに、その蛍
光物質の存する位置を検出することは当然に望まれる。
るうえで、蛍光物質の挙動を検出するとともに、その蛍
光物質の存する位置を検出することは当然に望まれる。
【０００７】本発明は上記事情に鑑みなされたものであ
って、検体内の空間領域および周波数領域のオプティカ
ルセクショニングを行なうレーザ走査蛍光分光計測方法
および装置を提供することを目的とするものである。
って、検体内の空間領域および周波数領域のオプティカ
ルセクショニングを行なうレーザ走査蛍光分光計測方法
および装置を提供することを目的とするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明のレーザ走査蛍光
分光計測方法および装置は、レーザ光を用いて検体内の
所定の深さにおける断面に含まれる蛍光物質を励起し、
色収差を有する対物レンズにより励起された任意の蛍光
物質からの蛍光を、その蛍光の波長ごとに各別の点に集
光せしめ、その集光した各蛍光の強度を選択的に検出す
ることを特徴とするものである。
分光計測方法および装置は、レーザ光を用いて検体内の
所定の深さにおける断面に含まれる蛍光物質を励起し、
色収差を有する対物レンズにより励起された任意の蛍光
物質からの蛍光を、その蛍光の波長ごとに各別の点に集
光せしめ、その集光した各蛍光の強度を選択的に検出す
ることを特徴とするものである。
【０００９】すなわち本発明のレーザ走査蛍光分光計測
方法は請求項１に記載したように、点光源に集光された
のち発散するレーザ光を色収差を有する対物レンズによ
り蛍光物質を含む検体内の所定の深さに集光せしめ、こ
の集光されたレーザ光により励起された蛍光を、対物レ
ンズにより、検体内の集光点に対してこの蛍光の波長ご
とに異なる共役な点に集光せしめ、共役な点に集光した
蛍光の強度を、この共役な点ごとに選択的に検出し、検
出された共役な点ごとの蛍光の強度に基づいて、検体内
の所定の深さにおける蛍光分光を計測することを特徴と
するものである。
方法は請求項１に記載したように、点光源に集光された
のち発散するレーザ光を色収差を有する対物レンズによ
り蛍光物質を含む検体内の所定の深さに集光せしめ、こ
の集光されたレーザ光により励起された蛍光を、対物レ
ンズにより、検体内の集光点に対してこの蛍光の波長ご
とに異なる共役な点に集光せしめ、共役な点に集光した
蛍光の強度を、この共役な点ごとに選択的に検出し、検
出された共役な点ごとの蛍光の強度に基づいて、検体内
の所定の深さにおける蛍光分光を計測することを特徴と
するものである。
【００１０】このレーザ走査蛍光分光計側方法におい
て、上記対物レンズと検体のうち少なくとも一方を対物
レンズの光軸方向に移動させて、上記検体内の集光点を
検体の深さ方向に移動することにより、検体内の任意の
深さにおける蛍光分光を計測することもできる。
て、上記対物レンズと検体のうち少なくとも一方を対物
レンズの光軸方向に移動させて、上記検体内の集光点を
検体の深さ方向に移動することにより、検体内の任意の
深さにおける蛍光分光を計測することもできる。
【００１１】ここで上記蛍光物質を含む検体とは、検体
自体がその表面や内部に蛍光物質を有するものに限られ
ず、検体外部より与えられた蛍光物質をその表面や内部
に蛍光物質を包含する検体をも含む意味である。
自体がその表面や内部に蛍光物質を有するものに限られ
ず、検体外部より与えられた蛍光物質をその表面や内部
に蛍光物質を包含する検体をも含む意味である。
【００１２】また上記色収差を有する対物レンズとは、
少なくとも色消し作用を有しないレンズ、すなわち色収
差の発現を極力抑止する目的に用いられるレンズ以外の
レンズをいい、色収差の大きいレンズほど望ましい。
少なくとも色消し作用を有しないレンズ、すなわち色収
差の発現を極力抑止する目的に用いられるレンズ以外の
レンズをいい、色収差の大きいレンズほど望ましい。
【００１３】また、本発明のレーザ走査蛍光分光計測装
置は上記レーザ走査蛍光分光計測方法を実施するための
装置であって請求項３に記載したように、レーザ光源
と、このレーザ光源より出射されたレーザ光を点光源に
集光させる集光レンズと、該集光レンズにより集光され
たのち発散するレーザ光を、蛍光物質を含む検体内の所
定の深さに集光するとともに、この集光されたレーザ光
により励起された蛍光を、検体内の集光点に対して蛍光
の波長ごとに異なる共役な点に集光せしめる、色収差を
有する対物レンズと、この対物レンズにより集光された
蛍光の強度を、蛍光の波長ごとに異なる共役な点におい
て選択的に検出する光検出器と、光検出器により検出さ
れた共役な点ごとの蛍光の強度に基づいて、すなわち波
長の異なる各波長の蛍光の強度に基づいて、検体内の所
定の深さにおける分光情報を計測する分光計測手段とを
備えたことを特徴とするものである。
置は上記レーザ走査蛍光分光計測方法を実施するための
装置であって請求項３に記載したように、レーザ光源
と、このレーザ光源より出射されたレーザ光を点光源に
集光させる集光レンズと、該集光レンズにより集光され
たのち発散するレーザ光を、蛍光物質を含む検体内の所
定の深さに集光するとともに、この集光されたレーザ光
により励起された蛍光を、検体内の集光点に対して蛍光
の波長ごとに異なる共役な点に集光せしめる、色収差を
有する対物レンズと、この対物レンズにより集光された
蛍光の強度を、蛍光の波長ごとに異なる共役な点におい
て選択的に検出する光検出器と、光検出器により検出さ
れた共役な点ごとの蛍光の強度に基づいて、すなわち波
長の異なる各波長の蛍光の強度に基づいて、検体内の所
定の深さにおける分光情報を計測する分光計測手段とを
備えたことを特徴とするものである。
【００１４】ここで上記レーザ走査蛍光分光計測装置に
おいて、検体と少なくとも対物レンズのうち少なくとも
一方を、対物レンズの光軸方向に沿って移動する第１の
移動手段を備えた構成とすることもでき、この移動によ
り検体内の任意の深さにおける蛍光分光を計測すること
ができる。
おいて、検体と少なくとも対物レンズのうち少なくとも
一方を、対物レンズの光軸方向に沿って移動する第１の
移動手段を備えた構成とすることもでき、この移動によ
り検体内の任意の深さにおける蛍光分光を計測すること
ができる。
【００１５】また上記光検出器としては、例えば、光透
過性を有するＢＲセンサ（感光性たんぱく質バクテリオ
ロドプシンを用いたセンサ）等の薄膜光検出素子を、蛍
光の波長ごとに異なる共役な点が並ぶ方向に複数個積層
したものなどがある。
過性を有するＢＲセンサ（感光性たんぱく質バクテリオ
ロドプシンを用いたセンサ）等の薄膜光検出素子を、蛍
光の波長ごとに異なる共役な点が並ぶ方向に複数個積層
したものなどがある。
【００１６】さらに上記光検出器を上記共役な点の並ぶ
方向に沿って移動する第２の移動手段を備えた構成を採
用することもできる。この場合、光検出器を移動するこ
とによって、上記異なる共役な点を走査することがで
き、これにより各共役な点における光強度を選択的に検
出することができ、光検出器としては上述のように薄膜
光検出素子を複数個積層したものであることを要しな
い。さらにまたこの光検出器としては、上記異なる共役
な点において集光する光を選択的に通過させ得るピンホ
ールと、このピンホールを通過した後の光の強度を検出
する光検出器とからなるものを採用することができる。
この場合ピンホールを通過した後の光は既に選択された
のちの光であるから、その光の強度を検出する光検出器
は、上述の各光検出器のように点において検出するもの
である必要はなく、ある程度の２次元的な広がりを有す
るものであってもよい。
方向に沿って移動する第２の移動手段を備えた構成を採
用することもできる。この場合、光検出器を移動するこ
とによって、上記異なる共役な点を走査することがで
き、これにより各共役な点における光強度を選択的に検
出することができ、光検出器としては上述のように薄膜
光検出素子を複数個積層したものであることを要しな
い。さらにまたこの光検出器としては、上記異なる共役
な点において集光する光を選択的に通過させ得るピンホ
ールと、このピンホールを通過した後の光の強度を検出
する光検出器とからなるものを採用することができる。
この場合ピンホールを通過した後の光は既に選択された
のちの光であるから、その光の強度を検出する光検出器
は、上述の各光検出器のように点において検出するもの
である必要はなく、ある程度の２次元的な広がりを有す
るものであってもよい。
【００１７】また上記検体が対物レンズの光軸に対して
略垂直な方向に相対的に移動し得る構成を採用すること
もでき、この場合、検体の対物レンズの光軸に対して略
垂直な面内の全面に亘って分光情報を得ることができ、
この光軸方向（検体の深さ方向）の所定の深さにおける
上記全面に亘る分光情報に基づいて、検体の３次元分光
情報を再構成することも可能である。
略垂直な方向に相対的に移動し得る構成を採用すること
もでき、この場合、検体の対物レンズの光軸に対して略
垂直な面内の全面に亘って分光情報を得ることができ、
この光軸方向（検体の深さ方向）の所定の深さにおける
上記全面に亘る分光情報に基づいて、検体の３次元分光
情報を再構成することも可能である。
【００１８】
【作用および発明の効果】本発明のレーザ走査蛍光分光
計測方法および装置によれば、レーザ光源より出射され
たレーザ光は集光レンズにより点光源に集光され、その
のち発散する。この発散するレーザ光は色収差を有する
対物レンズにより、蛍光物質を含む検体内の所定の深さ
に位置する一点（集光点）に集光される。この集光点に
存する蛍光物質は、レーザ光により励起され、存する蛍
光物質の種類により所定の発光波長帯域の蛍光が発せら
れる。この集光点より発せられた蛍光は上記対物レンズ
により集光点と共役な点に集光されるが、対物レンズが
色収差を有するため、その共役な点の位置は発せられた
蛍光の波長に応じて異なる位置を示す。この集光する位
置の異なる点にそれぞれ集光した蛍光は、それぞれ集光
した点において集光した蛍光のみを選択的に光検出器に
より検出し、あるいはその集光した光のみをピンホール
により選択的に通過せしめた後の蛍光を光検出器により
検出することにより、検体の所定の深さにおける断面内
の蛍光物質から発せられた蛍光の波長ごとの強度を検出
することができる。ここで上記「集光した光のみ」と
は、集光した光の他に、他の集光点で集光した他の波長
の蛍光の極一部を僅かに含むものではあるが、それら強
度は現に集光した光の強度に較べて無視し得るものであ
る。
計測方法および装置によれば、レーザ光源より出射され
たレーザ光は集光レンズにより点光源に集光され、その
のち発散する。この発散するレーザ光は色収差を有する
対物レンズにより、蛍光物質を含む検体内の所定の深さ
に位置する一点（集光点）に集光される。この集光点に
存する蛍光物質は、レーザ光により励起され、存する蛍
光物質の種類により所定の発光波長帯域の蛍光が発せら
れる。この集光点より発せられた蛍光は上記対物レンズ
により集光点と共役な点に集光されるが、対物レンズが
色収差を有するため、その共役な点の位置は発せられた
蛍光の波長に応じて異なる位置を示す。この集光する位
置の異なる点にそれぞれ集光した蛍光は、それぞれ集光
した点において集光した蛍光のみを選択的に光検出器に
より検出し、あるいはその集光した光のみをピンホール
により選択的に通過せしめた後の蛍光を光検出器により
検出することにより、検体の所定の深さにおける断面内
の蛍光物質から発せられた蛍光の波長ごとの強度を検出
することができる。ここで上記「集光した光のみ」と
は、集光した光の他に、他の集光点で集光した他の波長
の蛍光の極一部を僅かに含むものではあるが、それら強
度は現に集光した光の強度に較べて無視し得るものであ
る。
【００１９】上述の作用により得られた、所定の発光波
長帯域を有する蛍光物質の波長ごとの強度に基づいて、
検体内の所定の深さにおける蛍光物質の分光情報、すな
わち空間的オプティカルセクションおよび周波数的オプ
ティカルセクションを得ることができる。
長帯域を有する蛍光物質の波長ごとの強度に基づいて、
検体内の所定の深さにおける蛍光物質の分光情報、すな
わち空間的オプティカルセクションおよび周波数的オプ
ティカルセクションを得ることができる。
【００２０】このような作用効果により例えば代謝の前
後において、検体の特定の位置における蛍光物質の挙動
を追跡することができ、代謝のメカニズムを解明するう
えで有用性が高い。
後において、検体の特定の位置における蛍光物質の挙動
を追跡することができ、代謝のメカニズムを解明するう
えで有用性が高い。
【００２１】
【実施例】以下、図面を用いて本発明のレーザ走査蛍光
分光計測装置について詳細に説明する。
分光計測装置について詳細に説明する。
【００２２】図１は本発明にかかるレーザ走査蛍光分光
計測装置の一例を示す概略ブロック図である。図示のレ
ーザ走査蛍光分光計測装置は、レーザ光ａ1 を出射する
レーザ光源21と、この光源21より出射されたレーザ光ａ
1 を点光源Ａに集光させる集光レンズ22と、集光レンズ
22により点光源Ａに集光されたのち発散するレーザ光ａ
2 を、蛍光物質11を含む検体10内の所定の深さｄの点
（集光点Ｂ）に集光するとともに、集光されたレーザ光
ａ3 により励起された蛍光ｂ1 ，ｂ2 を、検体10内の集
光点Ｂに対して蛍光ｂ1 ，ｂ2 の波長ごとに異なる共役
な点Ｐ1 ，Ｐ2 に集光する、色収差を有する対物レンズ
24とを備えている。さらに蛍光の波長ごとに異なる共役
な点Ｐ1 ，Ｐ2 の並ぶ方向に沿って移動自在であり、対
物レンズ24により集光された蛍光ｂ1 ，ｂ2 の通過を選
択的に許容し得るピンホール25およびこのピンホール25
をその移動自在の方向に移動するピンホール走査手段32
と、ピンホール25の背面側に配され、ピンホール25を選
択的に通過した蛍光ｂ1 またはｂ2 の強度を検出する光
検出器31と、光検出器31により検出された光強度に基づ
いて分光情報を計測する分光計測部40とを備え、また検
体10は３次元可動ステージ34の、対物レンズ24の光軸と
垂直な載置面上に固定されている。３次元可動ステージ
34は、対物レンズ24の光軸と垂直な面（Ｙ−Ｚ面）内に
おいて矢印Ｙ方向、Ｚ方向（図１において紙面に垂直な
方向；図示せず）、および対物レンズ24の光軸と平行な
矢印Ｘ方向の３方向に可動の載置台であって、ステージ
走査手段33により駆動される。
計測装置の一例を示す概略ブロック図である。図示のレ
ーザ走査蛍光分光計測装置は、レーザ光ａ1 を出射する
レーザ光源21と、この光源21より出射されたレーザ光ａ
1 を点光源Ａに集光させる集光レンズ22と、集光レンズ
22により点光源Ａに集光されたのち発散するレーザ光ａ
2 を、蛍光物質11を含む検体10内の所定の深さｄの点
（集光点Ｂ）に集光するとともに、集光されたレーザ光
ａ3 により励起された蛍光ｂ1 ，ｂ2 を、検体10内の集
光点Ｂに対して蛍光ｂ1 ，ｂ2 の波長ごとに異なる共役
な点Ｐ1 ，Ｐ2 に集光する、色収差を有する対物レンズ
24とを備えている。さらに蛍光の波長ごとに異なる共役
な点Ｐ1 ，Ｐ2 の並ぶ方向に沿って移動自在であり、対
物レンズ24により集光された蛍光ｂ1 ，ｂ2 の通過を選
択的に許容し得るピンホール25およびこのピンホール25
をその移動自在の方向に移動するピンホール走査手段32
と、ピンホール25の背面側に配され、ピンホール25を選
択的に通過した蛍光ｂ1 またはｂ2 の強度を検出する光
検出器31と、光検出器31により検出された光強度に基づ
いて分光情報を計測する分光計測部40とを備え、また検
体10は３次元可動ステージ34の、対物レンズ24の光軸と
垂直な載置面上に固定されている。３次元可動ステージ
34は、対物レンズ24の光軸と垂直な面（Ｙ−Ｚ面）内に
おいて矢印Ｙ方向、Ｚ方向（図１において紙面に垂直な
方向；図示せず）、および対物レンズ24の光軸と平行な
矢印Ｘ方向の３方向に可動の載置台であって、ステージ
走査手段33により駆動される。
【００２３】なお分光計測部40は、ピンホール走査手段
32およびステージ走査手段33の各走査を制御する走査コ
ントローラ41と、この走査コントローラ41より出力され
る走査位置を示す制御信号と光検出器31により検出され
た光強度とに基づいて、検体10内の蛍光分光を行なうデ
ータ処理装置42とにより構成される。
32およびステージ走査手段33の各走査を制御する走査コ
ントローラ41と、この走査コントローラ41より出力され
る走査位置を示す制御信号と光検出器31により検出され
た光強度とに基づいて、検体10内の蛍光分光を行なうデ
ータ処理装置42とにより構成される。
【００２４】また点光源Ａと対物レンズ24との間にビー
ムスプリッタ23が配されて、蛍光ｂ1 ，ｂ2 の進行方向
が変えられ、蛍光ｂ1 ，ｂ2 の集光点Ｐ1 ，Ｐ2 の位置
を点光源Ａと分離している。
ムスプリッタ23が配されて、蛍光ｂ1 ，ｂ2 の進行方向
が変えられ、蛍光ｂ1 ，ｂ2 の集光点Ｐ1 ，Ｐ2 の位置
を点光源Ａと分離している。
【００２５】次に本実施例の作用について説明する。
【００２６】レーザ光源21より出射されたレーザ光ａ1
は、集光レンズ22により点光源Ａに集光したのち発散す
る光ａ2 とされる。この発散するレーザ光ａ2 は集光レ
ンズ22の光軸に対して約45度に配されたビームスプリッ
タ23を透過し、色収差を有する対物レンズ24に入射す
る。対物レンズ24は入射したレーザ光ａ2 を収束する光
ａ3 とし、この収束する光ａ3 を検体10内の所定の深さ
ｄに位置する集光点Ｂに集光する。この集光点Ｂに存す
る蛍光物質10は、レーザ光ａ3 により励起され、所定の
スペクトル幅（λ1 〜λ2 ）の蛍光ｂが発せられる。こ
の蛍光ｂのうち波長λ1 の蛍光をｂ1 とし波長λ2 の蛍
光をｂ2 とすると、集光点Ａより発せられた蛍光ｂ1 ，
ｂ2 はそれぞれ上記対物レンズ24に入射し、ビームスプ
リッタ23により反射されて進行方向を変える。
は、集光レンズ22により点光源Ａに集光したのち発散す
る光ａ2 とされる。この発散するレーザ光ａ2 は集光レ
ンズ22の光軸に対して約45度に配されたビームスプリッ
タ23を透過し、色収差を有する対物レンズ24に入射す
る。対物レンズ24は入射したレーザ光ａ2 を収束する光
ａ3 とし、この収束する光ａ3 を検体10内の所定の深さ
ｄに位置する集光点Ｂに集光する。この集光点Ｂに存す
る蛍光物質10は、レーザ光ａ3 により励起され、所定の
スペクトル幅（λ1 〜λ2 ）の蛍光ｂが発せられる。こ
の蛍光ｂのうち波長λ1 の蛍光をｂ1 とし波長λ2 の蛍
光をｂ2 とすると、集光点Ａより発せられた蛍光ｂ1 ，
ｂ2 はそれぞれ上記対物レンズ24に入射し、ビームスプ
リッタ23により反射されて進行方向を変える。
【００２７】ここで蛍光ｂ1 ，ｂ2 は波長（周波数）が
異なるため、対物レンズ24により、それぞれ異なる点Ｐ
1 ，Ｐ2 に収束される。この収束される点Ｐ1 ，Ｐ2 の
位置はそれぞれ蛍光ｂ1 ，ｂ2 の集光点Ａに対する共役
な位置である。
異なるため、対物レンズ24により、それぞれ異なる点Ｐ
1 ，Ｐ2 に収束される。この収束される点Ｐ1 ，Ｐ2 の
位置はそれぞれ蛍光ｂ1 ，ｂ2 の集光点Ａに対する共役
な位置である。
【００２８】ここで、走査コントローラ41より出力され
た制御信号によりピンホール走査手段32がピンホール25
を矢印Ｙ方向に走査し、まず最初にピンホール25の孔の
位置が収束点Ｐ2 と一致するように調整される。このよ
うにピンホール25が調整されることによって、ピンホー
ル25を通過し得るのは収束点Ｐ2 に収束する波長λ2の
蛍光ｂ2 のみ（実際には収束点Ｐ2 で収束しない波長λ
1 の蛍光ｂ1 も極僅か通過するが、強度的には無視し得
るものである。）である。
た制御信号によりピンホール走査手段32がピンホール25
を矢印Ｙ方向に走査し、まず最初にピンホール25の孔の
位置が収束点Ｐ2 と一致するように調整される。このよ
うにピンホール25が調整されることによって、ピンホー
ル25を通過し得るのは収束点Ｐ2 に収束する波長λ2の
蛍光ｂ2 のみ（実際には収束点Ｐ2 で収束しない波長λ
1 の蛍光ｂ1 も極僅か通過するが、強度的には無視し得
るものである。）である。
【００２９】このようにピンホール25を通過した蛍光ｂ
2 は、その強度が光検出器31により検出され、光電変換
されたのちの電気信号がデータ処理装置42に出力され
る。
2 は、その強度が光検出器31により検出され、光電変換
されたのちの電気信号がデータ処理装置42に出力され
る。
【００３０】ここで走査コントローラ41より出力された
制御信号によりステージ走査手段33がステージ34をＹ−
Ｚ平面内で駆動し、それにより検体10の深さｄにおける
Ｙ−Ｚ断面の蛍光ｂ2 の強度が得られる。データ処理装
置42は走査コントローラ41の制御信号と蛍光ｂ2 の強度
とからＹ−Ｚ断面における蛍光ｂ2 の強度分布を算出す
る。
制御信号によりステージ走査手段33がステージ34をＹ−
Ｚ平面内で駆動し、それにより検体10の深さｄにおける
Ｙ−Ｚ断面の蛍光ｂ2 の強度が得られる。データ処理装
置42は走査コントローラ41の制御信号と蛍光ｂ2 の強度
とからＹ−Ｚ断面における蛍光ｂ2 の強度分布を算出す
る。
【００３１】次いで、走査コントローラ41より出力され
た制御信号によりピンホール走査手段32がピンホール25
を矢印Ｙ方向に走査し、ピンホール25の孔の位置が収束
点Ｐ1 と一致するように調整され、上述の収束点Ｐ2 の
場合と同様の作用により、検体10の深さｄにおけるＹ−
Ｚ断面の蛍光ｂ1 の強度分布が算出される。
た制御信号によりピンホール走査手段32がピンホール25
を矢印Ｙ方向に走査し、ピンホール25の孔の位置が収束
点Ｐ1 と一致するように調整され、上述の収束点Ｐ2 の
場合と同様の作用により、検体10の深さｄにおけるＹ−
Ｚ断面の蛍光ｂ1 の強度分布が算出される。
【００３２】上述の作用により検体10の所定の断面の蛍
光ｂ1 ，ｂ2 の強度分布を得たのち、走査コントローラ
41の制御によりステージ走査手段33がステージ34を矢印
Ｘ方向に移動する。これによりレーザ光ａ3 の集光点Ｂ
の位置を、検体10の深さ方向（矢印Ｘ方向）に任意に移
動することができ、任意の深さにおけるＹ−Ｚ断面の蛍
光ｂ1 ，ｂ2 の強度分布を得ることができる。
光ｂ1 ，ｂ2 の強度分布を得たのち、走査コントローラ
41の制御によりステージ走査手段33がステージ34を矢印
Ｘ方向に移動する。これによりレーザ光ａ3 の集光点Ｂ
の位置を、検体10の深さ方向（矢印Ｘ方向）に任意に移
動することができ、任意の深さにおけるＹ−Ｚ断面の蛍
光ｂ1 ，ｂ2 の強度分布を得ることができる。
【００３３】このように本実施例のレーザ走査蛍光分光
計測装置によれば、検体の任意の深さにおける断面の情
報（空間的オプティカルセクション）を得ることができ
るとともに、その断面における蛍光の分光情報（周波数
的オプティカルセクション）を得ることができる。
計測装置によれば、検体の任意の深さにおける断面の情
報（空間的オプティカルセクション）を得ることができ
るとともに、その断面における蛍光の分光情報（周波数
的オプティカルセクション）を得ることができる。
【００３４】本実施例のレーザ走査蛍光分光計測装置に
より得られた蛍光ｂ1 ，ｂ2 の空間的・周波数的分布
は、例えば検体におけるある反応系の反応過程におい
て、上記２つの蛍光ｂ1 ，ｂ2 のうち一方が吸収される
場合、その反応の前後に上記２つの蛍光ｂ1 ，ｂ2 の強
度分布を計測し、その分布の各点において強度比を求め
ることにより強度比の分布を得、その分布に基づいて上
記反応系に支配される支配度の分布として定量化され、
生体などの代謝等の反応メカニズムを解明するうえで非
常に有用である。
より得られた蛍光ｂ1 ，ｂ2 の空間的・周波数的分布
は、例えば検体におけるある反応系の反応過程におい
て、上記２つの蛍光ｂ1 ，ｂ2 のうち一方が吸収される
場合、その反応の前後に上記２つの蛍光ｂ1 ，ｂ2 の強
度分布を計測し、その分布の各点において強度比を求め
ることにより強度比の分布を得、その分布に基づいて上
記反応系に支配される支配度の分布として定量化され、
生体などの代謝等の反応メカニズムを解明するうえで非
常に有用である。
【図１】本発明にかかるの実施例の概略を示すブロック
図
図
10 検体 11 蛍光物質 21 レーザ光源 22 集光レンズ 23 ビームスプリッタ 24 対物レンズ 25 ピンホール 31 光検出器 32 ピンホール走査手段 33 ステージ走査手段 34 ３次元可動ステージ 40 分光計測部 41 走査コントローラ 42 データ処理装置 50 ＣＲＴ
Claims (6)
- 【請求項１】 点光源に集光されたのち発散するレーザ
光を、色収差を有する対物レンズにより、蛍光物質を含
む検体内の所定の深さに集光せしめ、 該集光されたレーザ光により励起された蛍光を、前記対
物レンズにより、前記検体内の集光点に対して該蛍光の
波長ごとに異なる共役な点に集光せしめ、 該集光した蛍光の強度を、該共役な点ごとに選択的に検
出し、 該検出された共役な点ごとの蛍光の強度に基づいて、前
記検体内の所定の深さにおける蛍光分光を計測すること
を特徴とするレーザ走査蛍光分光計測方法。 - 【請求項２】 前記対物レンズと前記検体のうち少なく
とも一方を該対物レンズの光軸方向に移動させて、前記
検体内の集光点を前記検体の深さ方向に移動し、前記検
体内の任意の深さにおける蛍光分光を計測することを特
徴とする請求項１記載のレーザ走査蛍光分光計測方法。 - 【請求項３】 レーザ光源と、 該レーザ光源より出射されたレーザ光を点光源に集光さ
せる集光レンズと、 該集光レンズにより集光されたのち発散するレーザ光
を、蛍光物質を含む検体内の所定の深さに集光するとと
もに、該集光されたレーザ光により励起された蛍光を、
前記検体内の集光点に対して蛍光の波長ごとに異なる共
役な点に集光する、色収差を有する対物レンズと、 該対物レンズにより集光された蛍光の強度を、該蛍光の
波長ごとに異なる共役な点ごとに選択的に検出する光検
出器と、 該光検出器により検出された共役な点ごとの蛍光の強度
に基づいて、前記検体内の所定の深さにおける分光情報
を計測する分光計測手段とを備えたことを特徴とするレ
ーザ走査蛍光分光計測装置。 - 【請求項４】 前記検体と少なくとも前記対物レンズの
うち少なくとも一方を、該対物レンズの光軸方向に沿っ
て移動する第１の移動手段を備え、該検体内の任意の深
さにおける蛍光分光を計測することを特徴とする請求項
３記載のレーザ走査蛍光分光計測装置。 - 【請求項５】 前記光検出器を、前記蛍光の波長ごとに
異なる共役な点の並ぶ方向に沿って移動する第２の移動
手段を備えたことを特徴とする請求項３または請求項４
記載のレーザ走査蛍光分光計測装置。 - 【請求項６】 前記光検出器が、ピンホールと、該ピン
ホールを通過した光の強度を検出する光検出器とからな
ることを特徴とする請求項５記載のレーザ走査蛍光分光
計測装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13731993A JPH06347404A (ja) | 1993-06-08 | 1993-06-08 | レーザ走査蛍光分光計測方法および装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13731993A JPH06347404A (ja) | 1993-06-08 | 1993-06-08 | レーザ走査蛍光分光計測方法および装置 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06347404A true JPH06347404A (ja) | 1994-12-22 |
Family
ID=15195905
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13731993A Pending JPH06347404A (ja) | 1993-06-08 | 1993-06-08 | レーザ走査蛍光分光計測方法および装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06347404A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104375268A (zh) * | 2014-11-26 | 2015-02-25 | 宁波江丰生物信息技术有限公司 | 一种明场和荧光均可扫描的光学结构 |
-
1993
- 1993-06-08 JP JP13731993A patent/JPH06347404A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104375268A (zh) * | 2014-11-26 | 2015-02-25 | 宁波江丰生物信息技术有限公司 | 一种明场和荧光均可扫描的光学结构 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20020129 |