JPH06343687A

JPH06343687A - 細胞侵入性骨修復材

Info

Publication number: JPH06343687A
Application number: JP5134995A
Authority: JP
Inventors: Kenichi Osaki; 健一大崎; Susumu Nagai; 晋永井; Mikio Koide; 幹夫小出; Takaaki Osawa; 孝明大澤
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 1993-06-04
Filing date: 1993-06-04
Publication date: 1994-12-20

Abstract

(57)【要約】【構成】スポンジ状をなす再線維化アテロコラーゲンを
架橋処理することにより得る、架橋度が３０〜８０％で
ある細胞侵入性骨修復コラーゲン製剤。【効果】物理的強度と耐コラゲナーゼ性を有し、骨再構
成を導く未分化間葉系細胞や骨芽細胞、毛細血管の侵入
を招き、骨再構成を達成することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、骨欠損部に用いられる
細胞侵入性骨修復材。

【０００２】

【従来の技術】骨組織に何らかの異常や欠損が生じた場
合、自己の他部位から採取した骨の移植が好ましいがそ
の供給が困難な場合が多く、人工物をもって代替しよう
とする発想は古くから存在した。それらの人工物にはチ
タニウム，ステンレス等の金属類、ハイドロキシアパタ
イト等のセラミック類がある。しかし、金属類は生体骨
との直接的な接合が得られず、生体骨との間隙に軟組織
が新生して介在するようになる為、長期安定性に欠け
る。また、セラミック類は生体骨との直接的な接合が得
られるか、それ自身の物性がもろく、骨の物理的機能上
問題がある。骨の主たる成分は有機質としてのコラーゲ
ンと、ハイドロキシアパタイトのような無機質である
為、コラーゲン製剤を利用しようとする試みがいくつか
なされている。

【０００３】豚の皮膚由来の凍結乾燥アテロコラーゲン
をγ線照射滅菌したものがコラーゲンフリース（Collag
enfleece）という名称で市販されており、これを実際に
骨再構成に応用しこれを使わなかった場合に比し、骨欠
損部の骨形成が早まったというウルリッチとゲルトラッ
ド（Ulrich Joos & Gertrud Ochs）の報告がある（バイ
オマテリアルス(Biomaterials)：1980.vol.p23-26)。ま
た、『実質的に架橋しないことを特徴とする、無機成
分を除去した骨起源のコラーゲンの精製アテロペプチド
製剤から成る骨コラーゲン粉末、精製アテロペプチド
再構成微線維状皮膚コラーゲン、精製アテロペプチド
再構成微線維状皮膚コラーゲンの凍結乾燥ゲル及び、
上記及びの混合物からなるコラーゲン製剤』を用
いるドナルド・ジー．ウォレスらの方法が特公平３−２
６６１６号で開示されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】再線維化したアテロコ
ラーゲンは、例え異種の動物由来であってもコラーゲン
の免疫活性決定基とでも言うべきテロペプタイド部分が
切断・除去されている為、ヒトの骨組織に対する親和性
は大きいと考えられる。しかしながら、コラーゲン分子
間に架橋を付加しないと、生体内でコラゲナーゼで容易
に分解吸収されるばかりか、ゲルを凍結乾燥したもの
を、３７℃生理食塩水中に浸漬しておくだけでも数時間
以内に溶解することがわかっている。かかるコラーゲン
製剤を骨再構成に応用しようとしても生体内安定性がな
いため所期の目的は達成できない。

【０００５】また一方、γ線をかけたり、ヘキサメチレ
ンジイソシアネートやグルタールアルデヒド等の薬品で
処理するとコラーゲン分子間に架橋が導入され、物性や
耐コラゲナーゼ性が強化できる。例えば、凍結乾燥コラ
ーゲン製剤をヘキサメチレンジイソシアネートで架橋す
ると、コラゲナーゼ溶液（１００unit/ml）に３７℃で
７日浸漬しても形態に変化がみられない。ところがかか
る強固な架橋を導入すると生体内に埋植した場合、コラ
ーゲンに対する異物反応のみが強くあらわれ、貧食細胞
による貧食が認められるようになる。つまり、物性や耐
コラゲナーゼ性の強化と、組織・細胞に対する親和性と
いう生物学的性能向上とは両立が困難な相反する事象で
あり一定期間そこに存在し異物反応がないまま骨再構成
を導くコラーゲン製剤は従来求め得なかった。本発明
は、耐コラゲナーゼ性が強化され、かつ、異物反応を招
かない骨に対する生体適合性の高い、細胞侵入性骨修復
用コラーゲン製剤を提供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明の細胞侵入性骨修
復用コラーゲン製剤は以下の構成によって達成される。（１）スポンジ状をなす再線維化アテロコラーゲンを
架橋処理することにより得られ、架橋度が３０〜８０％
である細胞侵入性骨修復コラーゲン製剤。（２）凍結乾燥によりスポンジ状を形成させる上記
（１）記載の細胞侵入性骨修復用コラーゲン製剤。（３）架橋処理が、熱脱水架橋処理であることを特徴
とする、上記（１）記載の細胞侵入性骨修復用コラーゲ
ン製剤。

【０００７】（４）再線維化アテロコラーゲンに、ヘ
リックス含量が０〜８０％である変性コラーゲンを１０
〜５０％混合したことを特徴とする上記（１）〜（３）
記載の細胞侵入性骨修復用コラーゲン製剤。（５）熱脱水架橋が真空下で１１０℃２〜８時間で達
成される上記（１）〜（４）に記載の細胞侵入性骨修復
用コラーゲン製剤。（６）熱脱水架橋処理による架橋度が３０〜８０％、
さらに好ましくは４０〜７０％である上記（１）〜
（５）に記載の細胞侵入性骨修復コラーゲン製剤。

【０００８】本発明のヘリックス含量０〜８０％である
変性コラーゲンは、牛真皮由来のアテロコラーゲンを酸
性溶液に溶解し、これを６０℃で２０分〜２４時間加熱
することによって得られる。ヘリックス含量とはコラー
ゲン特有の三重鎖ヘリックスの含量を意味し、変性コラ
ーゲンではこのヘリックスがランダムコイル化している
ためヘリックス含量が変性度に応じ低下する。このヘリ
ックス含量は円偏光２色性分光計（ＣＤ）や赤外分光光
度計（ＩＲ）で測定することができる。本発明のコラー
ゲン製剤の製造法は、再線維化したアテロコラーゲンを
凍結乾燥し、スポンジ状となったものを真空化１１０
℃、２〜８時間の条件で熱脱水架橋することによって得
られる。この製造法により得られたコラーゲン製剤は、
３０〜８０％の架橋度を有し、さらに好ましくは４０〜
７０％の架橋度を有する。

【０００９】本発明において架橋度は、低い架橋である
とコラゲナーゼで容易に分解吸収され、また高い強固な
架橋を導入すると生体内に埋植した場合コラーゲンに対
する異物反応のみが強くあらわれるため、３０〜８０
％、さらに好ましくは４０〜７０％の架橋度がよい。こ
の様にして得られたコラーゲン製剤は、３７℃生食中に
浸漬しておいても一部溶解するが、のこりの部分は溶解
せずスポンジ構造を維持する。また、動物の骨欠損部
や、それ以外の軟組織に埋植しても少なくとも４週間は
そこに存在し続けることができる。また、本発明におい
て製造方法は、上述した方法が最も好ましいが、架橋度
を上記範囲内に調整できるものであれば、他の方法でも
製造可能である。一方、それを病理組織学的に検索する
と、γ線や薬品で架橋処理したコラーゲン製剤が一様に
貧食細胞浸潤等の異物反応を招いてしまうのに対し本発
明のコラーゲン製剤では、未分化間葉系細胞や骨芽細
胞，毛細血管の侵入が観察されるが、異物反応は認め
ず、生体適合性が高まっていることがわかる。また変性
コラーゲンを混合することにより初期の細胞侵入性をよ
り高めることができると共に非特異的なコラーゲンの負
栄養性石灰沈着も防止できる。

【００１０】本発明における架橋度とは、次の方法で測
定したものをいう。コラーゲン製剤を０.５mM ＨＣｌ
中、４℃,１５〜１６時間撹拌後、3000rpm,１５分間遠
心分離を行ない上清と残渣に分ける。この時の上清をＡ
とする。次に、残渣に８Ｍウレアを加え、６０℃,３０
分間の加熱を行い、3000rpm,１５分間遠心分離し、残渣
と上清に分ける。この時の上清をＢ、残渣をＣとする。
次いで、ＡとＢの液中の蛋白質濃度を測定し、それに各
々の体積を掛けたものをＷ_A，Ｗ_Bとする。また、Ｃの重
量をＷ_Cとする。そして、架橋度＝［（Ｗ_B＋Ｗ_C）／
（Ｗ_A＋Ｗ_B＋Ｗ_C）］×１００とする。以上のように本
発明により一定の物性、耐コラゲナーゼ性を付与し、か
つ異物反応を伴なわずに骨を再構成する細胞のみを誘導
し骨再構成を達成することができる。以下、実施例を示
し本発明を更に詳細に説明する。

【００１１】

【実施例】

（実施例１）熱脱水架橋再線維化アテロコラーゲン−熱
変性コラーゲン複合コラーゲン製剤の作製化粧品用牛アテロコラーゲン（高研(株)）１ｇをpH３の
塩酸水溶液に溶解し０.７２μmのフィルターで濾過して
０.３w/v％の溶液を得る。これに４℃条件で燐酸緩衝液
を加え、３７℃恒温槽に１日浸漬して０.１w/v％の再線
維化アテロコラーゲン（ＦＡＣ）を得る。一方、アテロ
コラーゲン溶液を６０℃、３０分の条件で熱処理後放置
するとヘリックス含量が４０％の熱変性アテロコラーゲ
ン（ＨＡＣ）が得られる。ＦＡＣとＨＡＣをコラーゲン
量の比が９：１となるように混合、攪拌しステンレス製
バットに流し入れ、−３０℃にまで急速凍結した後、−
４０℃/０.１トール未満の真空条件下で凍結乾燥すると
ＦＡＣ−ＨＡＣスポンジが得られる。このＦＡＣ−ＨＡ
Ｃスポンジを５０ミリトール未満の真空条件下で１１０
℃３時間熱脱水架橋して、熱脱水架橋再線維化アテロコ
ラーゲン（ＦＡＣ）−熱変性アテロコラーゲン（ＨＡ
Ｃ）複合コラーゲン製剤を得た。なお以上の操作は全て
無菌雰囲気下で行なった。なお、このものの架橋度は５
８％であった。

【００１２】（比較例１）未架橋コラーゲン製剤の作製実施例１の過程で得られるＦＡＣ−ＨＡＣスポンジを、
架橋が入るような高温やγ線照射処理等一切せず未架橋
コラーゲン製剤を作成した。なお、このものの架橋度は
１０％であった。

【００１３】（比較例２）γ線架橋コラーゲン製剤の作
製実施例１で得られた試料に更に２.０Mradの条件でγ線
照射した。なお、このものの架橋度は９２％であった。

【００１４】（比較例３）ヘキサメチレンジイソシアネ
ート架橋コラーゲン製剤の作製実施例１の過程で得られたＦＡＣ−ＨＡＣスポンジを
０.０１％ヘキサメチレンジイソシアネート／エタノー
ル溶液に２４時間浸漬し、化学架橋を導入した。これを
蒸留水水洗しその後真空下１１０℃２時間の条件で乾燥
した。なお、このものの架橋度は９４％であった。

【００１５】（比較例４）長時間熱脱水架橋コラーゲン
製剤の作製実施例１の過程で得られるＦＡＣ−ＨＡＣスポンジを１
１０℃２４時間又は４８時間又は７２時間のいずれかの
条件で熱脱水架橋した。なお、このものの架橋度は、各
々８２％，８７％，９０％，であった。

【００１６】（比較例５）熱変性アテロコラーゲン不含
の熱脱水架橋再線維化アテロコラーゲン製剤の作製実施例１の過程で得られる線維化アテロコラーゲン容液
をＨＡＣを混ぜないでステンレスバットに注入し、以下
実施例１と同様の条件で凍結乾燥熱脱水架橋をして熱脱
水架橋再線維化アテロコラーゲン製剤を得た。なお、こ
のものの架橋度は６２％であった。

【００１７】（試験例１）大腿骨骨端部埋入法実施例１で作製した試料を家兎の大腿骨骨端部に埋植し
て、骨の再構成を評価した。動物は約３kgの日本白色家
兎を用いた。ペントバルビタールを２５mg/kgB.W.耳介
静脈内投与して、麻酔した後、背位に固定した。膝内側
面より切開を加え、膝蓋骨を脱臼させた。露出させた大
腿骨遠位端部に直径５mmの骨欠損創を作製した。試料
は、実施例１で作製したＦＡＣ−ＨＡＣスポンジの他に
対照として、未架橋コラーゲン製剤（比較例１）、γ線
架橋コラーゲン製剤（比較例２）、ヘキサメチレンジイ
ソシアネート架橋コラーゲン製剤（比較例３）、２４時
間，４８時間又は７２時間熱脱水架橋コラーゲン製剤
（比較例４）または、ＦＡＣスポンジ（比較例５）を使
用した。

【００１８】埋植後４週間目に剖検に供し、大腿骨を摘
出し、ホルマリン固定した。２〜３mm位の厚みに切出し
た後、蟻酸−ホルマリン水溶液にし脱灰を行った。脱灰
完了後充分水洗し、試料及び周辺骨組織を病理組織学的
に検索した。結果は以下の通りであった。実施例１で
は、著明な骨の再構成が認められたが、比較例１〜５で
は炎症性細胞の浸潤又はコラーゲンの消失が著明に認め
られ骨の再構成は認められなかった。また、未充填の骨
欠損においても骨の再構成は認められなかった。試料周
辺の病理所見を表１に示す。

【００１９】

【表１】

【００２０】（試練例２）頭蓋頭頂骨埋入法実施例１で作製した試料をラットの頭蓋頭頂骨上に埋植
して骨の再構成を評価した。動物は約７００gのSprague
-Dawlay(SD)系雄性ラットを用いた。ペントバルビター
ルを３３mg/kg B.W腹腔内投与して麻酔した後、腹位に
固定した。開頭し結合組織を剥離し、骨面を露出させ
た。骨膜を除去し頭蓋骨を研磨することにより骨欠損創
を作製した。試料は実施例１の他に対照として比較例１
〜５を使用した。埋植後４週間目に剖検に供し、頭蓋骨
を摘出しホルマリン固定した。２〜３mm位の厚みに切出
した後、蟻酸−ホルマリン水溶液にて脱灰を行った脱灰
完了後充分水洗し、試料及び周辺骨組織を病理組織学的
に検索した。結果は以下の通りであった。実施例１では
著明な骨の再構成が認めれたが比較例１〜５では炎症性
細胞の浸潤又はコラーゲンの消失が著明な認められ骨の
再構成は認められなかった。試料周辺の病理所見を表２
に示す。

【００２１】

【表２】

【００２２】（試験例３）頭蓋骨欠損部移植法実施例１で作製した試料をラットの頭蓋骨内に埋植した
骨の再構成を評価した。動物は約７００gのSprague-Daw
lay(SD)系雄性ラットを用いた。ペントバルビタールを
３３mg/kg B.W腹腔内投与して麻酔した後、腹位に固定
した。開頭し結合組織，骨膜を剥離し、骨面を露出させ
た。頭蓋骨に６×６mmの切込みを入れ頭蓋骨を摘除し、
骨欠損創を作製した。試料は実施例１の他に対照とし
て、比較例１〜５を使用した。埋植後、４週間目に剖検
に供し、頭蓋骨を摘出し、ホルマリン固定した。２〜３
mm位の厚みに切出した後、蟻酸−ホルマリン水溶液にて
脱灰を行った。脱灰完了後充分水洗し、試料及び周辺骨
組織を病理組織学的に検索した。結果は以下の通りであ
った。実施例１では著明な骨の再構成が認めれたが、比
較例１〜５では炎症性細胞の浸潤又はコラーゲンの消失
が著明に認めれ、骨の再構成は認められなかった。試料
周辺の病理所見を表３に示す。

【００２３】

【表３】

【００２４】

【発明の効果】以上詳述したように本発明は、再線維化
アテロコラーゲンに、異物反応を招かずに、物理的強度
と耐コラゲナーゼ性を与える至適な条件で架橋したもの
であるから、骨欠損部に埋植した際にも一定期間必要と
される物理的強度とコラゲナーゼ抵抗性を有すると共に
生体適合性にも優れ、骨再構成を導く未分化間葉系細胞
や骨芽細胞、毛細血管の侵入を招き、骨再構成を達成す
ることができる。また、変性アテロコラーゲンを混合す
ることにより、初期の細胞侵入性をより高め、結果的に
骨再構成を早めることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者大澤孝明神奈川県足柄上郡中井町井ノ口1500番地テルモ株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】スポンジ状をなす再線維化アテロコラー
ゲンを架橋処理することにより得られ、架橋度が３０〜
８０％である細胞侵入性骨修復コラーゲン製剤。