JPH06343469A - デオキシリボ核酸 - Google Patents

デオキシリボ核酸

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JPH06343469A
JPH06343469A JP6134887A JP13488794A JPH06343469A JP H06343469 A JPH06343469 A JP H06343469A JP 6134887 A JP6134887 A JP 6134887A JP 13488794 A JP13488794 A JP 13488794A JP H06343469 A JPH06343469 A JP H06343469A
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Peter Helmut Schreier
ペーター・ヘルムート・シユライアー
Klaus Stenzel
クラウス・シユテンツエル
Guenter Adam
ギユンター・アダム
Edgar Dr Maiss
エトガル・マイス
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Bayer AG
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 新規な組み換えデオキシリボ核酸（ＤＮ
Ａ）、それらを含有するベクターおよび宿主生物、およ
び前記組み換えＤＮＡを含有しかつ有害な生物および植
物の病気に対して増加した耐性を有するトランスジェニ
ック植物に関し、ここで前記組み換えデオキシリボ核酸
（ＤＮＡ）は、次の構成成分、または各場合において同
一の作用を有するＤＮＡを有する構成成分の組み合わせ
から成るか、あるいはこれらの構成成分を含有すること
を特徴とする： （ａ）プラムポックスウイルス（ＰＰＶ）のＲＮＡから
誘導された二本鎖ｃＤＮＡ断片（「断片Ａ」）、および
（ｂ）トマト班点立ち枯れ病ウイルス（ＴＳＷＶ）のＮ
構造遺伝子のＳ ＲＮＡから誘導された二本鎖ｃＤＮＡ
断片（「断片Ｂ」）、これらの組み合わせは、必要に応
じて存在することができる他のＤＮＡ断片に加えて、植
物細胞の中で活性であるプロモーターを含有する。 【効果】 上記トランスジェニック植物は、有害な生物
および植物の病気に対して増加した耐性を有する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、新規な組み換えデオキシリボ核
酸（ＤＮＡ）、それらを含有するベクターおよび宿主生
物、および前記組み換えＤＮＡを含有しかつ有害な生物
および植物の病気に対して増加した耐性を有するトラン
スジェニック植物に関する。ある数のウイルスについ
て、構造遺伝子または非構造遺伝子をこれらのウイルス
から単離しそして、適当な方法において、トランスジェ
ニック植物の中で発現するように誘発させるとき、それ
らは、植物の中で、相同的ウイルスによる場合に対する
増加した耐性を発生するか、あるいは弱毒化および／ま
たは症状の発現の遅延を発生させることが既に示され
た。これは最初にタバコモザイクウイルス(tobacco mos
aic virus)（ＴＭＶ）のコートタンパク質の例を使用し
て実証された（欧州特許出願公開（ＥＰ−Ａ）第０ ２
２３ ４５２号；Ｂｅａｃｈｙら、１９８５；およびＰ
ｗｅｌｌ Ａｂｅｌら、１９８６）。ＴＭＶはトバモウ
イルス（Ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓｅｓ）属に属し、そし
て比較的簡単な構成を有しそして、その遺伝情報のため
に、多数の他の植物ウイルスに似て、プラス鎖の情報を
有する一本鎖ＲＮＡ分子（一本鎖のプラス−センスＲＮ
Ａゲノム）を有する。遺伝情報は多数の同一のサブユニ
ットから成るコートの中にパッケージされている。後
に、匹敵する方法が、また、トマト班点立ち枯れ病ウイ
ルス(tomato spotted wilt virus)（ＴＳＷＶ）の場合
において成功したことを示すことができた。トマト班点
立ち枯れ病ウイルス（ＴＳＷＶ）は本質的に異なり、そ
してブニアビリダエ（Ｂｕｎｉｖｉｒｉｄａｅ）族のト
スポウイルス（Ｔｏｓｐｏｖｉｒｕｓ）属に属する（欧
州特許出願公開（ＥＰ−Ａ）第０ ４２６ １９５号；
Ｇｉｅｌｅｎら、１９９１；Ｄｅ Ｈａａｎら、１９９
２）。トスポウイルス（Ｔｏｓｐｏｖｉｒｕｓ）属は直
径約１００ｎｍの形態学的的に球形の粒子および３成分
から成る一本鎖ＲＮＡゲノムを有するとして分類され、
前記ウイルスは核タンパク質複合体（ヌクレオキャプシ
ド）として脂質コートにより取り囲まれている。
【０００２】３成分から成るゲノムは両センスまたはマ
イナス鎖の情報を有する（マイナスまたは両センスの極
性の一本鎖ＲＮＡ分子、Ｄｅ Ｈａａｎら、１９９
０）。この場合において、トランスジェニック植物にお
ける耐性はトスポウイルス、トマト班点立ち枯れ病ウイ
ルス（＝ＴＳＷＶ）のＮ構造遺伝子を植物の中に転移
し、そこでそれを発現させることに基づく。Ｎ遺伝子生
産物は前述の核タンパク質の複合体である。
【０００３】ＴＭＶコートタンパク質の場合において密
接に関係するトバモウイルスに対する顕著な交差耐性を
証明することができたが、このような交差耐性はＴＳＷ
ＶおよびＮ遺伝子の発現の場合においてこれまで知られ
ていない（Ｄｅ Ｈａａｎら、１９９２；ＭａｃＫｅｎ
ｚｉｅおよびＥｌｌｉｓ、１９９２；Ｓｈｅｎｇ−Ｚｉ
ら、１９９２）。
【０００４】新規な組み換えデオキシリボ核酸（ＤＮ
Ａ）が発見され、これらは、次の構成成分または各場合
において等しい作用をもつＤＮＡを有する成分の組み合
わせから成るか、あるいはそれを含有する： （ａ）プラムポックスウイルス(plum pox virus)（ＰＰ
Ｖ）のＲＮＡから誘導された二本鎖ｃＤＮＡ断片（「断
片Ａ」）、および（ｂ）トマト班点立ち枯れ病ウイルス
（ＴＳＷＶ）のＮ構造遺伝子のＳ ＲＮＡから誘導され
た二本鎖ｃＤＮＡ断片（「断片Ｂ」）、の組み合わせか
ら成るか、あるいはこれらの構成成分を含有し、この組
み合わせは、必要に応じて存在することができる他のＤ
ＮＡ断片に加えて、植物細胞の中で活性であるプロモー
ターを含有することができる。
【０００５】さらに、新規な組み換えＤＮＡをそれらの
ゲノムの中に組み込んで有する（かつこのＤＮＡを発現
する）トランスジェニック植物は有害な生物および植物
の病気に対して増加した耐性を示すことが発見された。
【０００６】トランスジェニック植物は、また、とく
に、断片Ｂを誘導した相同的ＴＳＷウイルスの分離物に
対してばかりでなく、かつまた他のトスポウイルス種に
対して増加した耐性を示す。これは驚くべきことであ
る。なぜなら、技術水準から知られておりかつ天然に存
在するウイルス遺伝子から誘導された組み換えデオキシ
リボ核酸は、対応するトランスジェニック植物において
このような広い作用をもたないからである（Ｄｅ Ｈａ
ａｎら、１９９２；ＭａｃＫｅｎｚｉｅおよびＥｌｌｉ
ｓ、１９９２）。これに加えて、増加した耐性はトスポ
ウイルス属に属さないウイルスに対して観察することが
できることは驚くべきことである。
【０００７】本発明による組み換えＤＮＡにおいて、断
片Ｂは断片Ａの後に（すなわち、３’方向に）位置し、
２つの断片は互いに直接接続されているか、あるいは追
加のＤＮＡ断片（「断片Ｃ」）により接続されている。
本発明によるＤＮＡが完全な転写ユニットを表すとき、
植物において活性であるプロモーターは断片Ａの上流に
配置される。この場合において、断片Ｂのあとにまた
３’未翻訳ＤＮＡが存在し、このＤＮＡは断片Ｂに直接
接続されているか、あるいは追加のＤＮＡ断片（「断片
Ｄ」）を介して接続されている。３’未翻訳ＤＮＡは転
写停止配列（ＴＴＳ）およびポリアデニル化部位を含有
する。
【０００８】用語「転写停止配列」(transcription ter
mination sequence)は、鋳型として働く特定のＤＮＡ配
列からの特定ののポリメラーゼにより、ＲＮＡ合成の終
わりを定め配列であることを意味する。トランスジェニ
ック植物において使用される「キメラ遺伝子」(chimeri
c genes)の場合において、例えば、ノパリンシンターゼ
遺伝子(nopaline synthase gene)（Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ
ら、１９８３）、オクトピンシンターゼ遺伝子(octopin
e synthase gene)（Ｈｅｒｒｅａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ
ら、１９８３）またはＣａＭＶ［ササゲモザイクウイル
ス(cauliflower mosaic virus)］の３５Ｓ転写体（Ｐｉ
ｅｔｒｚａｋら、１９８６）のＴＴＳを使用することが
できる。
【０００９】さらに、用語「ポリアデニル化部位」また
は「ポリアデニル化シグナル」は、好ましくは、一次転
写体の正確なプロセシングおよび一次転写体の３’末端
上の「ポリ−Ａ配列」の転写後の合成を実行する６ヌク
レオチド（例えば、ＡＡＵＡＡＡ）から成る配列を意味
する。
【００１０】これから、結局、完全な転写ユニットは次
のＤＮＡ配置を有することが理解される： （５’）プロモーター−断片Ａ−必要に応じて：断片Ｃ
−断片Ｂ−必要に応じて：断片Ｄ−３’未翻訳ＤＮＡ
（３’）この方法で配置されたＤＮＡは本発明の一部分
である。組み換えＤＮＡの次の配置は、同様に、本発明
の構成部分である： （５’）断片Ａ−必要に応じて：断片Ｃ−断片Ｂ−必要
に応じて：断片Ｄ−３’未翻訳ＤＮＡ（３’）、および
断片Ａ−必要に応じて：断片Ｃ−断片Ｂ−必要に応じ
て：断片Ｄ（３’）、および（５’）プロモーター−断
片Ａ−必要に応じて：断片Ｃ−断片Ｂ（３’）断片Ａは
プラムポックスウイルス（ＰＰＶ）のＲＮＡから誘導さ
れた二本鎖ｃＤＮＡ断片であり、用語「誘導された」は
ｃＤＮＡがウイルスＲＮＡに対して相補的な形態で存在
するＤＮＡであることを意味する。
【００１１】配列識別番号：７で再現されるＤＮＡを断
片Ａとして使用することが好ましい。
【００１２】断片ＢはＳ ＲＮＡから、好ましくはトマ
ト班点立ち枯れ病ウイルス（ＴＳＷＶ）から、好ましく
はＬ３分離物のＮ構造遺伝子から誘導された二本鎖ｃＤ
ＮＡ断片であり、用語「誘導された」はｃＤＮＡがｃＤ
ＮＡがウイルスＲＮＡに対して相補的な形態で存在する
ＤＮＡであることを意味する。
【００１３】配列識別番号：１１で再現されるＤＮＡを
断片Ｂとして使用することが好ましい。
【００１４】断片Ａおよび断片Ｂは互いに対して直接接
続されるか、あるいは好ましくは、二本鎖ＤＮＡ断片Ｃ
により接続される。合成ＤＮＡ断片を断片Ｃとして使用
することができ、このＤＮＡ断片はそれが特定のリーデ
ィングフレームの中に停止コドンを含有しないように選
択され、そして断片Ａおよび断片Ｂが断片Ａにおいて開
始しそして断片Ｂの末端において終わり、こうしてポリ
ペプチドをエンコードする中断されないオープンリーデ
ィングフレームを形成するように、断片Ａおよび断片Ｂ
を接続する。
【００１５】断片Ｃは好ましくは１３４ヌクレオチドま
でを含有することができる。とくに好ましくは、断片Ｃ
は２〜６８ヌクレオチドを含有する。配列識別番号：９
で再現される配列を有する合成ＤＮＡは、断片Ｃとして
非常にとくに好ましい。この断片は、断片Ａにおいて開
始するオープンリーディングフレームを断片Ｂのオープ
ンリーディングフレームととくに有利な方法で接続す
る。
【００１６】植物において活性であるすべてのプロモー
ターは、断片Ａの上流に配置することができるプロモー
ターとして使用のために適当である。これらの中から、
ポリメラーゼＩＩＩのコントロール下にあるものと同様
に、ポリメラーゼＩＩによりコントロールされるものを
特別に述べるために選択することができる。植物病原性
ウイルスから由来するプロモーターは、また、特別に述
べるために選択される。ササゲモザイクウイルス（Ｃａ
ＭＶ）の３５Ｓプロモーターはとくに好ましい。その配
列は配列識別番号：３で再現される。それは好ましくは
断片Ａに直接接続される。
【００１７】植物においてポリアデニル化および転写停
止を生ずるすべての適当な反応領域を３’未翻訳ＤＮＡ
として使用することができ、前記ＤＮＡはポリアデニル
化部位およびＴＴＳシグナルを含有し、そして断片Ｂの
後に位置し、断片Ｄを必要に応じて介在させる。植物病
原性ウイルスからの３’未翻訳ＤＮＡ配列を選択するこ
とが好ましい。配列識別番号：４に描写される配列をも
つ３’未翻訳ＣａＭＶ３５Ｓ ＤＮＡを使用することが
とくに好ましい。
【００１８】前述の断片は、各場合において本発明によ
る組み換えＤＮＡにおいて、同一の作用を有するＤＮＡ
を含有する対応する断片により置換するすることができ
る。同一の作用を有するＤＮＡにおいて、、１または２
以上の塩基、あるいは１または２以上のコドンは失う
か、あるいは他の塩基またはコドンで置換することがで
きるが、それらの作用が本質的に保存される程度に、す
なわち、本発明による断片の組み合わせを植物において
有害な生物および植物の病気に対して増強された耐性に
導く程度に、断片を変更することができる。ストリンジ
ェントの条件下に配列識別番号：１〜１３に従う一本鎖
とハイブリダイゼーションすることができかつ、残りの
断片と組み合わせて、植物における耐性の所望の増加を
生ずる任意のＤＮＡを、同一の作用を有するＤＮＡと考
えるすることができる。同一の作用を有するＤＮＡは、
好ましくは、配列識別番号：１、５、７、９および１１
に従うＤＮＡ配列（参照、配列識別番号：２、６、８、
１０および１２に従うタンパク質配列、同様によく）か
らと、同一のポリペプチド、または「同一の作用を有す
る」ポリペプチド「誘導」することができるＤＮＡであ
る。この場合において、誘導はタンパク質に翻訳するこ
とができるＲＮＡにＤＮＡを転写することができること
を意味する。同一の作用を有するポリペプチドは、それ
らが同一の作用を有する全体の１次配列をもつポリペプ
チドであることを意味するが、耐性の二本鎖ＤＮＡ断片
増加が損失するような方法で２次、３次および４次の構
造を変化しないで個々のアミノ酸を交換することができ
る。配列識別番号：７および１１に従うＤＮＡは、ま
た、プローブとしてを使用して、本発明に従い使用でき
る適当な追加のんｆｇをプラムポックスウイルスまたは
トスポウイルスから単離することができる。これらのプ
ローブを使用して、普通の方法で、断片をまたベクター
または植物のゲノムにおいて検出することができる。
【００１９】本発明に従い、配列識別番号：７または１
１に従う配列、あるいは同一の作用を有する対応するＤ
ＮＡを有する断片ＡまたはＢの少なくとも１つを含有す
る組み換えＤＮＡは好ましい。
【００２０】本発明に従い、配列識別番号：７または１
１に従う配列、あるいは同一の作用を有する対応するＤ
ＮＡを有する断片Ａまたは断片Ｂの両者を含有する組み
換えＤＮＡはとくに好ましい。
【００２１】本発明に従い、同一の作用を有する対応す
るＤＮＡを包含する、配列識別番号：１に従う配列を有
する組み換えＤＮＡは非常にとくに好ましい。配列識別
番号：５に従う配列、または同一の作用を有する対応す
るＤＮＡ組み換えＤＮＡは、完全な転写ユニットとして
非常にとくに好ましい。
【００２２】本発明に従い使用可能な異なる、ならびに
本発明に従いＤＮＡは、配列識別番号：１〜１３の中で
情報の助けにより普通の方法により得ることができる。
これに加えて、本発明に従い使用可能なプラムポックス
ウイルス（ＰＰＶ）のゲノムのｃＤＮＡ断片、ならびに
ＴＳＷウイルスのＳ ＲＮＡゲノムのｃＤＮＡ断片は、
微生物および細胞培養物のドイツ国コレクション（Ｄｅ
ｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏ
ｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒ
ｅｎ）（ＤＳＭ）からＮｏ．ＰＬ−１０８０（ｐＰＰＶ
−ＮＡＴ５’−４）およびＰＬ−１０８１（ｐＴＳＷ
Ｌ３−３０８）で得ることができる。ＣａＭＶの「スト
ラスバーグ分離物」およびＣＭ１８４１分離物（ＡＴＣ
Ｃ Ｎｏ．４５０３１）の異なるｃＤＮＡは、同様に、
Ｎｏ．ＰＬ−１０２９およびＰＬ−１０３３でＤＳＭか
ら入手できる（参照、ＤＳＭ注文リスト、植物ウイルス
群、Ｍｅｓｓｅｗｅｇ １１／１２、Ｗ−３３００ブラ
ウンシュベング、ドイツ国）。
【００２３】プラスミドＰＬ−１０８０およびＰＬ−１
０８１は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の中に（微生物ドイ
ツ国コレクション（ＤＳＭ）、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ
Ｗｅｇ １ｂ、Ｄ−３３００ブラウンシュベング、ド
イツ国において）、特許手続きの目的のための微生物の
寄託の国際的認識ついての規則に従う受託された。
【００２４】 本発明による組み換えＤＮＡは天然に存在しない。それ
は当業者により分子生物学の普通の方法（Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋら、１９８９）の助けにより前の説明の中に含まれ
る情報を使用して、とくに配列識別番号：１〜１３を使
用して得るすることができる。
【００２５】本発明は、また、本発明による組み換えＤ
ＮＡ、例えば、（後述するように）プラスミドｐＳＬＴ
ＳＷＶＬ３およびｐＸＬＴＳＷＶＬ３を含有する、新規
なベクター、とくにプラスミドまたはファージに関す
る。本発明は、また、好ましくはプラスミドの中に組み
込まれた、本発明による組み換えＤＮＡを含有する、新
規な宿主生物、とくに微生物に関する。共通に使用され
る大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびアグロバクテリウム・
ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍ
ｅｆａｃｉｅｎｓ）は微生物として使用するためにとく
に適当である。プラスミドｐＸＬＴＳＷＶＬ３を含有す
るアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）株ＸＬＴ
ＳＷＶＬ３を例として述べるすることができ、これをい
っそう詳細に下に記載する。
【００２６】ベクターおよび微生物の株は、当業者によ
り分子生物学の普通の方法の助けにより、上の説明の中
に含まれる情報、とくに配列識別番号：１〜１３を使用
して得るすることができる。
【００２７】本発明による組み換えＤＮＡは、植物のゲ
ノムの中に挿入するすることができ、その結果これらの
トランスジェニック植物有害な生物および植物の病気に
対していっそう耐性される。
【００２８】トランスジェニック植物の耐性の増強は、
農業および林業、観賞植物および医学的植物の栽培、お
よび植物の育種のために重要である。また、植物の細胞
の培養において、例えば、製剤学的に利用可能な物質の
単離のために、微生物の病害虫、とくに菌類およびウイ
ルスにより感染に対して増強した耐性を示す植物の細胞
を入手可能とすることは有利である。
【００２９】結局、本発明は、また、有害な生物および
植物の病気に対して増加した耐性を有するトランスジェ
ニック植物の細胞（原形質体を包含する）および植物
（植物の部分および種子を包含する）を生産する方法に
関し、この方法は、（ａ）本発明によるＤＮＡを植物の
細胞（原形質体を包含する）のゲノムの中へ１回または
２回以上導入しそして、適当ならば、（ｂ）全体の、形
質転換された植物を形質転換された植物の細胞（原形質
体を包含する）から再生しそして、適当ならば、増殖さ
せ、そして、適当ならば、（ｃ）この方法において得ら
れる親の世代のトランスジェニック植物からか、あるい
はそれから得られたそれ以上の世代から、所望の植物の
部分（種子を包含する）を分離し、そして、（ｄ）適当
ならば、さらに植物を生産するために、トランスジェニ
ック植物のゲノムを他の植物のゲノムと組み合わせ、そ
して子孫を増殖させる、ことを特徴とする。
【００３０】この方法の工程（ａ）、（ｂ）および
（ｃ）は、普通の方法において、既知の方法に従い実施
することができる。
【００３１】本発明によるＤＮＡの１または２以上のコ
ピーを含有するトランスジェニック植物の細胞（原形質
体を包含する）および植物（植物の部分および種子を包
含する）、ならびに前述の方法により得られた、このよ
うな形質転換された植物の細胞および植物は、同様に、
本発明に包含される。
【００３２】（ａ）有害な生物および植物の病気に対す
るプレートの耐性を増加するための本発明による組み換
えＤＮＡの使用、（ｂ）有害な生物および植物の病気に
対して増強された耐性を有する植物の細胞、植物、植物
の部分および植物の増殖材料を生産するための本発明に
よる組み換えＤＮＡの使用、（ｃ）増殖材料を生産しか
つ新規な植物およびそれらの増殖材料を生産するための
本発明によるトランスジェニック植物（植物の部分およ
び植物の種子を包含する）の使用、は、また、本発明の
一部分である。
【００３３】それぞれ、配列識別番号：２または６に従
うタンパク質を含有するか、あるいは、適当ならば、ア
ミノ末端において切頭された、それぞれ、配列識別番
号：２または６に従うタンパク質を含有する植物（植物
の細胞、植物の部分および増殖材料）は、また、本発明
の一部分である。
【００３４】本発明による組み換えＤＮＡを植物または
植物の細胞の遺伝物質の中に挿入するのために、ある数
の異なる方法が利用可能である。ＤＮＡの転移は、普通
の方法およびよく知られている方法に従い実施すること
ができ、当業者は各場合において困難なく適当な方法を
確認することができるであろう。植物を形質転換するた
めに使用すべき、本発明によるＤＮＡは、植物および
３’未翻訳領域において活性である適当なプロモーター
を含有しなくてはならない。配列識別番号：５に従う組
み換えＤＮＡはとくに適当である。
【００３５】双子葉および単子葉の植物のゲノムの中に
外来ＤＮＡを転移するために広い適用可能性をもつとく
に好適なベクターとして、アグロバクテリウム・ツメフ
ァシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆ
ａｃｉｅｎｓ）のＴｉプラスミドが入手可能である。本
発明によるＤＮＡを調節ＤＮＡ配列と一緒に、適当なＴ
ｉプラスミド（例えば、Ｚａｍｂｒｙｓｋｉら、１９８
３）のＴ ＤＮＡの中に挿入し、そして植物の感染、植
物の部分または植物の組織、例えば、葉のディスク、
茎、胚軸、子葉または分裂組織、あるいはそれらから誘
導された組織、例えば、２次胚およびカルスの感染によ
るか、あるいは原形質体をアグロバクテリウム・ツメフ
ァシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆ
ａｃｉｅｎｓ）と同時培養することによって転移する。
【００３６】別法はＤＮＡを植物の原形質体の中で（例
えば、Ｈａｉｎら、１９８５；Ｋｒｅｎｓら、１９８
２；Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら、１９８４）ポリカチオン
またはカルシウムの塩およびポリエチレングリコールの
存在下にインキュベーションすることである。
【００３７】ＤＮＡの吸収は、また、電場（エレクトロ
ポレイション）（例えば、Ｆｒｏｍｍら、１９８６）を
使用することによって促進することができる。
【００３８】ＤＮＡは、また、既知の方法で、植物の花
粉により導入することができ、ここでＤＮＡを収容する
物理的に加速された粒子で花粉を「衝撃」する（参照、
欧州特許出願公開（ＥＰ−Ａ）第０ ２７０ ３５６
号）。
【００３９】プレートを、既知の方法で、適当な栄養培
地を使用して再生する（例えば、ＮａｇｙおよびＭａｌ
ｉｇａ、１９７６）。
【００４０】本発明による方法の好ましい実施態様にお
いて（欧州特許出願公開（ＥＰ−Ａ）第１１６ ７１８
号の方法に従う）、本発明による組み換えＤＮＡを、単
離された形態で、適当な中間体の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）のベクター、例えば、ｐＧＶ７００またはｐＧＶ７
１０（参照、欧州特許出願公開（ＥＰ−Ａ）第１１６７
１８号）、あるいは好ましくはリポーター遺伝子、例え
ば、ｎｐＩＩ（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら、
１９８３）またはｈｐｔ（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｌｚｅｎ
ら、１９８６）をさらに含有するそれらの誘導体の中に
クローニングする。
【００４１】この方法において構成されたプラスミド
を、普通の方法（例えば、Ｖａｎ Ｈａｕｔｅら、１９
８３）により、例えば、ｐＧＶ３８５０を含有するアグ
ロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）またはそれらの
誘導体の中に転移する。別法として、本発明によるＤＮ
Ａをバイナリーベクター、例えば、ｐＧＶ００１または
ｐＧＶ００２（例えば、ＫｏｎｃｚおよびＳｃｈｅｌ
ｌ、１９８６）の中でクローニングし、次いで、前述し
たように、適当な癌腫菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ）株の中に転移させる（ＫｏｎｃｚおよびＳｃｈｅｌ
ｌ、１９８６）。植物に転移可能な形態で組み換えＤＮ
Ａを含有する、生ずる癌腫菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ）株を、引き続いて植物の形質転換のために使用す
る。
【００４２】他の好ましい実施態様において、組み換え
ＤＮＡを、適当ならば、植物の細胞のためのリポーター
遺伝子、例えば、カナマイシン耐性（例えば、Ｈｅｒｒ
ｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら、１９８３）またはヒグロ
マイシン耐性（ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｌｚｅｎ、１９８
６）、好ましくはｐＬＧＶ ｎｅｏ ２１０３（Ｈａｉ
ｎら、１９８５）、ｐＭＯＮ１９（Ｆｒａｌｅｙ Ｒ．
Ｔ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ８０、４８０３（１９８３））、ｐＡＫ１００３、
ｐＡＫ２００４（Ｖｅｌｔｅｎ Ｊ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ
ｏｕｒｎ．Ｖｏｌ．３、２７２３（１９８４））または
ｐＧＳＳＴ ｎｅｏ ３（ｐＧＳＳＴ３）（欧州特許出
願公開（ＥＰ−Ａ）第１８９ ７０７号）を含有する他
のプラスミドと一緒に、普通の方法において直接の遺伝
子の転移により、植物の原形質体の中に転移させる。こ
れに関して、１または２以上のプラスミドは円形の形態
で存在することができるが、線状の形態が好ましい。リ
ポーター遺伝子を含有するプラスミドを使用するとき、
カナマイシン耐性の原形質体を次いで組み換えＤＮＡの
発現について検査する。別の場合（リポーター遺伝子を
使用しない）において、生ずるカルスを組み換えＤＮＡ
の発現について試験する（普通の方法を使用するスクリ
ーニング）。
【００４３】トランスジェニック植物または植物の細胞
は、既知の方法に従い、例えば、葉のディスクの形質転
換（例えば、Ｈｏｒｓｈら、１９８５）により、再生す
る植物の原形質体または細胞培養物をアグロバクテリウ
ム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）と同時培養すること（例え
ば、Ｍａｒｔｏｎら、１９７９、Ｈａｉｎら、１９８
５）によるか、あるいは直接のＤＮＡのトランスフェク
ションにより生産される。生ずる形質転換された植物
は、リポーター遺伝子の発現について選択することによ
り、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏの硫酸カナマイシンのリ
ン酸化（例えば、Ｒｅｉｓｓら、１９８４；Ｓｃｈｒｅ
ｉｅｒら、１９８５）によるか、あるいはノザンブロッ
ト分析およびウェスタンブロット分析によるノパリンシ
ンターゼ（Ａｅｒｔｓら、１９８３に従う）または本発
明による組み換えＤＮＡの発現により検出される。組み
換えＤＮＡの遺伝子産生物は、また、特定の抗体を使用
して既知の方法で形質転換された植物において検出する
ことができる（Ａｄａｍら、１９８７、１９９１）。
【００４４】形質転換された植物の細胞を、各場合にお
いて適当な栄養培地を使用して通常方法に従い、培養し
かつ再生して全植物を形成する。
【００４５】形質転換された植物の細胞および形質転換
された植物の両者は、本発明によるＤＮＡを含有しかつ
本発明の構成部分を含有し、有害な生物および植物の病
気に対して、とくに線虫類、植物病原性菌類およびウイ
ルス類に対して、かなり高度の耐性を示す。
【００４６】本発明に従い、表現「植物」は全植物およ
び植物の部分、例えば、葉、種子、塊茎、切断物などを
意味する。「植物の細胞」は、原形質体、細胞系、植物
のカルスなどを包含する。「増殖材料」は、植物、植物
の部分、例えば、例えば、葉、種子、塊茎、切断物な
ど、ならびにトランスジェニック植物および植物の細胞
の増殖に使用することができ、そして結局同様に本発明
の一部分である植物の細胞を意味する。
【００４７】実際には、すべての植物は、本発明による
組み換えＤＮＡの組み込み（形質転換）により病害虫に
対する増強された耐性を付与することができる植物の中
に含められる。
【００４８】当然、栽培植物、例えば、森林の植物、例
えば、トウヒ、モミ、ダグラスモミ、マツ、カラマツ、
ブナノキおよびオーク、ならびに栄養および原料を提供
する植物、例えば、穀類（とくにコムギ、ライムギ、オ
オムギ、カラスムギ、キビ、イネおよびトウモロコ
シ）、ジャガイモ、マメ科の植物（例えば、豆類およ
び、とくに、アルファルファおよびダイズ）、野菜（と
くにキャベツ種およびトマト）、果実（とくにリンゴ、
ナシ、サクランボ、ブドウ、かんきつ類、パイナップル
およびバナナ）、ギネアアブラヤシ、チャ、カカオおよ
びコーヒー、タバコ、サイザルおよびワタの場合におい
て、ならびに医学的植物、例えば、ローウォルフィアお
よびジギタリスの場合において耐性を生成することがと
くに要求されている。ジャガイモ、トマト、マメ科の植
物およびウリ目（Ｃｕｒｃｕｂｉｔａｚｅａｅ）はとく
に好ましいものとして述べることができる。
【００４９】動物の病害虫、例えば、昆虫類、ダニおよ
び線虫類、ならびに微生物の病害虫、例えば、植物病原
性菌類、細菌類およびウイルス類を、本発明により増強
された耐性を達成できる病害虫（有害な生物および植物
の病気を引き出す生物）として述べることができる。特
別に述べるために選択されるものは、植物損傷性線虫類
および微生物の病害虫、とくに植物病原性菌類およびウ
イルス類である。
【００５０】有害な昆虫は、とくに次の目の昆虫を包含
する：直翅目（Ｏｒｔｈｏｐｔｅｒａ）、革翅目（Ｄｅ
ｒｍａｐｔｅｒａ）、等脚目（Iｓｏｐｏｄａ）、シミ
目（Ｔｈｙｓａｎｕｒａ）、半翅目（Ｈｅｔｅｒｏｐｔ
ｅｒａ）、同翅目（Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ）、鱗翅目（Ｌ
ｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）、鞘翅目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒ
ａ）、膜翅目（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ）および倍脚綱
（Ｄｉｐｌｏｐｏｄａ）。
【００５１】有害なダニは、とくに次のものを包含す
る：ホコリダニ種（Ｔａｒｓｏｎｅｍｕｓ ｓｐ
ｐ.）、ミカンリンゴハダニ種（Ｐａｎｏｎｙｃｈｕｓ
ｓｐｐ.）およびナミハダニ種（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈ
ｕｓ ｓｐｐ.）。
【００５２】植物寄生線虫には次のものが包含される:
ネグサレセンチユウ種（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｓ
ｐｐ.）、ラドホルス・シミリス（Ｒａｄｏｐｈｏｌｕ
ｓｓｉｍｉｌｉｓ）、ナミクキセンチユウ（Ｄｉｔｙｌ
ｅｎｃｈｕｓ ｄｉｐｓａｃｉ）、ミカンネセンチユウ
（Ｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ ｓｅｍｉｐｅｎｅｔｒａｎ
ｓ）、シストセンチユウ種（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｓ
ｐｐ.）、グロボデラ種（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｓｐ
ｐ．）、ネコブセンチユウ種（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ
ｓｐｐ.）、アフエレンコシデス種（Ａｐｈｅｌｅｎ
ｃｈｏｉｄｅｓｓｐｐ.）、ロンギドルス種（Ｌｏｎｇ
ｉｄｏｒｕｓ ｓｐｐ.）、クシフイネマ種（Ｘｉｐｈ
ｉｎｅｍａ ｓｐｐ.）およびトリコドルス種（Ｔｒｉ
ｃｈｏｄｏｒｕｓ ｓｐｐ.）。
【００５３】微生物の病害虫は、とくに、次の植物病原
性真菌を包含する：プラスモジオフォロミセテス(Ｐｌ
ａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒｏｍｙｃｅｔｅｓ)、卵菌類
（Ｏｏｍｙｃｅｔｅｓ）、キトリジオミセテス(Ｃｈｙ
ｔｒｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ)、接合菌類(Ｚｙｇｏｍｙ
ｃｅｔｅｓ）、嚢子菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）、
担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）、および不
完全菌類（Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｅｔｅｓ）。
【００５４】植物病原性細菌は、とくに次のものを包含
する：シュードモナダセエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａ
ｃｅａｅ）、リゾビアセエ（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａ
ｅ）、エンテロバクレリアセエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉａｃｅａｅ）、コリネバクテリアセエ（Ｃｏｒｙ
ｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）およびストレプトマイ
セタセエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）。
【００５５】ウイルスの病気は、とくに次のものを包含
する：モザイクの、萎縮性および黄色化のウイルスによ
る病気、およびトスポウイルスにより引き出されるウイ
ルスの病気。
【００５６】上に列挙した一般名に含まれるウイルス、
真菌および細菌の病気のいくつかの原因となる因子は次
の通りであるが、これらに限定されない：オオムギの黄
色萎縮性ウイルス（ＢＹＤＶ）、ジャガイモのウイルス
Ｙ（ＰＶＹ）、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）、
スイカモザイクウイルス（ＷＭＶ）、トリステザ（ｔｒ
ｉｓｔｅｚａ）ウイルス、タバコモザイクウイルス（Ｔ
ＭＶ）、タバコ壊死ウイルス（ＴＮＶ）、ビート壊死性
黄色化葉脈ウイルス（ＢＮＹＶＶ）および、とくに、ト
マト班点立ち枯れ病ウイルス（ＴＳＷウイルス）、すべ
てのトスポウイルス、タバコモザイクウイルス（ＴＭ
Ｖ）および他のトバモウイルス、およびタバコラットル
（ｒａｔｔｌｅ）ウイルスおよび他のトブラウイルス
（ｔｏｂｒａｖｉｒｕｓｅｓ）。
【００５７】キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａ
ｓ）種、例えば、キサントモナス・オリザエ（Ｘａｎｔ
ｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ）；シュードモナス・ラ
クリマンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｌａｃｈｒｙｍ
ａｎｓ）；エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）種、例え
ば、エルウィニア・アミロボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍ
ｙｌｏｖｏｒａ）；ピチウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ）種、例
えば、ピチウム・ウルチマム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｕｌｔ
ｉｍｕｍ）；フィトフトラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒ
ａ）種、例えば、フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐ
ｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）；シュ
ードペロノスポラ（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒ
ａ）種、例えば、シュードペロノスポラ・フムリ（Ｐｓ
ｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｈｕｍｕｌｉ）また
はシュードペロノスポラ・クベンス（Ｐｓｅｕｄｏｐｅ
ｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｃｕｂｅｎｓｉｓ）；プラスモパ
ラ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ）種、例えば、プラスモパラ
・ヴィチコラ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌ
ａ）；ペロノスポラ（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ）種、例
えば、ペロノスポラ・ピシ（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ
ｐｉｓｏ）またはＰ・ブラシカ（Ｐ．ｂｒａｓｓｉｃａ
ｅ）；エリシフェ（Ｅｒｙｓｉｐｐｈｅ）種、例えば、
エリシフェ・グラミニス（Ｅｒｙｓｉｐｐｈｅ ｇｒａ
ｍｉｎｉｓ）；スフェロテカ（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃ
ａ）種、例えば、スフェロテカ・フリギネア（Ｓｐｈａ
ｅｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｌｉｇｉｎｅａ）；ポドスフェ
ラ（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ）種、例えば、ポドスフェ
ラ・ロイコトリチャ（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ ｌｅｕ
ｃｏｔｒｉｃｈａ）；ヴェンチュリア（Ｖｅｎｔｕｒｉ
ａ）種、例えば、ヴェンチュリア・インエクアリス（Ｖ
ｅｎｔｕｒｉａ ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ）；ピレノフォ
ラ（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）種、例えば、ピレノフォ
ラ・テレス（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ ｔｅｒｅｓ）ま
たはＰ．グラミネ（Ｐ．ｇｒａｍｉｎｅａ）；（コニデ
ィア（Ｃｏｎｉｄｉａ）型：ドレチュスレラ（Ｄｒｅｃ
ｈｓｌｅｒａ）、ｓｙｓ：ヘルミントスポリウム（Ｈｅ
ｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ））；コクリオボルス
（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ）種、例えば、コクリオボ
ルス・サチブス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ ｓａｔｉ
ｖｕｓ）（コニディア（Ｃｏｎｉｄｉａ）型：ドレチュ
スレラ（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ）、ｓｙｎ：ヘルミント
スポリウム（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ））；
ウロミセス（Ｕｒｏｍｙｃｅｔｓ）種、ウロミセス・ア
ペンディクラツス（Ｕｒｏｍｙｃｅｔｓ ａｐｐｅｎｄ
ｉｃｕｌａｔｕｓ）；プクシニア（Ｐｕｃｃｉｎｉａ）
種、例えば、プクシニア・レコンディタ（Ｐｕｃｃｉｎ
ｉａ ｒｅｃｏｎｄｉｔｉａ）；チレチア（Ｔｉｌｌｅ
ｔｉａ）種、例えば、チレチア・カリエス（Ｔｉｌｌｅ
ｔｉａ ｃａｒｉｅｓ）；ウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇ
ｏ）種、例えば、ウスチラゴ・ヌダ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ
ｎｕｄａ）またはウスチラゴ・アヴェナエ（Ｕｓｔｉ
ｌａｇｏ ａｖｅｎａｅ）；ペリクラリア（Ｐｅｌｌｉ
ｃｕｌａｒｉａ）種、例えば、ペリクラリア・ササキイ
(Ｐｅｌｌｉｃｕｌａｒｉａ ｓａｓａｋｉ)；ピリクラ
リア（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ）種、例えば、ピリクラ
リア・オリザエ（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａ
ｅ）；フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種、例えば、フ
サリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏ
ｒｕｍ）；ハイイロカビ（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）種、例え
ば、ボツリティス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉ
ｎｅｒｅａ）；セプトリア（Ｓｅｐｔｏｒｉａ）種、例
えば、セプトリア・ノドルム（Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｎｏ
ｄｏｒｕｍ）；レプトスフェリア（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａ
ｅｒｉａ）種、例えば、レプトスフェリア・ノドルム
（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ）；セ
ルコスポラ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ）種、例えば、セル
コスポラ・カネッセンス（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｃａ
ｎｅｓｃｅｎｓ）；アルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒ
ｉａ）種、例えば、アルテルナリア・ブラシカ（Ａｌｔ
ｅｒｎａｒｉａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ）；およびシュー
ドセルコスポレラ（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒｅ
ｌｌａ）種、例えば、シュードセルコスポレラ・ヘルポ
トリコイデス（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒｅｌｌ
ａ ｈｅｒｐｏｔｒｉｃｈｏｉｄｅｓ）。さらに、ヘル
ミントスポリウム・カルボヌム（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓ
ｐｏｒｉｕｍｃａｒｂｏｎｕｍ）を列挙することができ
る。
【００５８】文献： Adam G., Chagas C.M., Lesemann D.E.; (1987) J. of
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【００５９】１．組み換えＤＮＡの構成および癌腫菌
（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の中への形質転換：既
に説明したように、本発明はプロモーターのコントロー
ル下にありかつ３’末端の配列を含有する、新規な組み
換えＤＮＡ、とくに組み換えキメラ遺伝子（配列識別番
号：１）に関する。ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（５’
領域）（配列識別番号：３）およびＣａＭＶ３５Ｓ転写
体の３’未翻訳領域（配列識別番号：４）をここで例と
して使用する（Ｔｏｅｐｆｅｒら、１９８７および欧州
特許出願公開（ＥＰ−Ａ）第０ ２２３ ４５２号）。
ここで使用する全体の例は、配列識別番号：５に示され
ている。本発明によるＤＮＡ（キメラ遺伝子）（配列識
別番号：１）は、特定の配列に接合されたいくつかの片
から成る。それはプラムポックスウイルス（ＰＰＶ）か
ら誘導された１５２塩基対の二本鎖ｃＤＮＡ断片から成
る（Ｍａｉｓｓら、１９８９）。これはウイルスのＲＮ
Ａ配列に位置１−１５２において対応する（配列識別番
号：７）（Ｍａｉｓｓら、１９８９）。この断片におい
て、オープンリーディングフレームが開始し、これは合
成ｃＤＮＡ断片（配列識別番号：９）を介してＴＳＷＶ
のＮ遺伝子のＬ３分離物のｃＤＮＡ断片に接続されてい
る（Ｍａｉｓｓら、１９９１）（配列識別番号：１
１）。この接続は、中断なしに９５６塩基対の全体の長
さを有しかつ「配列識別番号：１」の位置９９２におい
て終わるオープンリーディングフレームが発生するよう
なものである。ＴＳＷＶの３’非翻訳領域の引き続くｃ
ＤＮＡ配列（配列識別番号：１１）は、合成配列（配列
識別番号：１３）を介してＣａＭＶの３５Ｓ転写体の
３’領域（配列識別番号：４）に接続されている（Ｔｏ
ｅｐｆｅｒら、１９８７）。
【００６０】この構成はよく知られている方法により実
施し、そしてその詳細は記載されている（Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、１９８
９）。
【００６１】詳細な手順は次の通りであった：商業的に
入手可能なプラスミドｐＣａＭＶＣＮ（ファーマシア）
からの長さ４５４塩基対のＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ
断片を商業的に入手可能なプラスミドｐＴ７Ｔ３ １９
Ｕ（ファーマシア）の中にクローニングし、そしてｐＴ
７Ｔ ３５Ｓと表示した。この新規なプラスミドをＳａ
ｌＩで切断し、そして突起する末端をフィルインし、次
いでこのＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断した。次いで、プラ
スミドｐＰＰＶ−ＮＡＴ ５’４（Ｍａｉｓｓら、１９
８９；Ｍａｉｓｓら、１９９２）からのＤｒａＩ／Ｅｃ
ｏＲＩ断片（長さ５７２塩基対）を、こうして調製した
プラスミドの中にクローニングした。この断片はＰＰＶ
の５’末端のｃＤＮＡコピーを含有する。
【００６２】合成オリゴヌクレオチド５′−ＴＧＴＧＴ
ＴＧＡＧＴＴＴＴＴＡＴＡＴＴＴＴＣＣＴＣＴＣＣＡＡ
ＡＴＧＡＡＡ−３′（配列識別番号：１４）（これは非
コーディング鎖に対して相補的である）を使用して、Ｃ
ａＭＶ３５Ｓプロモーター配列の３’末端（５’
−．．．ＡＧＡＧＧ−３’）（配列識別番号：１５）
を、ｉｎ ｖｉｔｒｏの突然変異誘発の助けにより、Ｐ
ＰＶ配列のｃＤＮＡの極端５’末端（５’−ＡＡＡＡＴ
ＡＴ．．．．−３’）（配列識別番号：１６）に結合し
た。生ずる新規なプラスミドをｐ３５Ｓと表示した。長
さ５９８塩基対のＨｉｎｃＩＩ断片をこのプラスミドか
ら分離し、そして前以てＳｍａＩおよびＨｉｎｃＩＩで
切断した、商業的に入手可能なｐｌｍＴ７Ｔ３ １９Ｕ
の中にクローニングした。生ずるプラスミドをｐＴ７Ｔ
３ １９ＵＰＰＶＬと表示する。このプラスミドをＥｃ
ｏＲＶおよびＳａｌＩで切断し、そして長さ２３９塩基
対の断片を単離した。この断片をｐＲＴ１０１（Ｔｏｅ
ｐｆｅｒら、１９８７）のＥｃｏＲＶ、ＸｈｏＩ部位の
中にクローニングした。
【００６３】ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片をプラス
ミドｐＴＳＷＶ−Ｌ３／３０８（Ｍａｉｓｓら、１９９
１）から分離した。末端をフィルインし、そしてベクタ
ーｐＲＴ１０１（（Ｔｏｅｐｆｅｒら、１９８７）のＳ
ｍａＩ切断部位の中に挿入した。このプラスミドは、挿
入された断片を正しい向きで含有し、ｐＳＴＳＷＶＬ３
と表示した。長さ８６８塩基対のＲｓａＩ／ＢａｍＨＩ
断片をこのプラスミドから分離し、そしてＳｍａＩおよ
びＢａｍＨＩで切断した、前述のｐＳＬの中にクローニ
ングした。生ずる新規なプラスミドをｐＳＬＴＳＷＶＬ
３と表示した。全体のキメラ遺伝子およびＣａＭＶ（３
５Ｓ）の５’および３’未翻訳領域を含有する、長さ１
７１６塩基対の断片を、この後者のプラスミドからＨｉ
ｎｄＩＩＩを使用して分離することができる。この断片
を、ＨｉｎｄＩＩＩで切断したプラスミドｐＸＬ２２２
（Ｌａｎｄｓｍａｎｎら、１９８８）の中にクローニン
グした。生ずるプラスミドをｐＸＬＴＳＷＶＬ３と表示
した。このプラスミド（ｐＸＬＴＳＷＶＬ３）を、アグ
ロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａ
ｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４の中に移動化またはトラン
スフェクションした。癌腫菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ）のこの新しい株をＸＬＴＳＷＶＬ３と表示しし
た。
【００６４】２．トランスジェニック植物の生産、およ
びこれらの植物の中のキメラ遺伝子の発現の検出 癌腫菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＸＬＴＳＷＶＬ
３株を、植物の細胞または植物の部分の形質転換のため
に使用した。カナマイシンを含有する培地上でマーカー
および選択遺伝子（同時に転移されたカナマイシン耐性
遺伝子）を使用して、トランスジェニック植物を選択
下。２１の個々の候補を、キメラ遺伝子を発現する能力
に基づいて選択した。これはまずｍＲＮＡのレベルにお
ける遺伝子のペプチドを決定することを含んだ。このた
めに、トランスジェニック植物から単離された全体のＲ
ＮＡを、逆転写酵素および合成ヌクレオチド５’−ＧＴ
ＣＡＧＴ ＧＧＣ ＴＣＣ ＡＡＴ ＣＣＴ ＧＴＣ
ＴＧＡ ＡＧ−５’（配列識別番号：１７）を使用して
ｃＤＮＡに翻訳し、そしてキメラ遺伝子のｍＲＮＡの存
在を第２合成オリゴヌクレオチド５’−ＴＧＴ ＧＧＡ
ＧＡＡ ＴＴＣＧＡＧ ＣＴＣ ＧＧＴ ＡＣ−３’
（配列識別番号：１８）およびポリメラーゼ連鎖反応
（ポリメラーゼ連鎖反応；ＭｕｌｌｉｓおよびＦａｌｏ
ｏｎａ、１９８７）の助けにより増幅し、そして長さ３
２８塩基対の断片として同定した。
【００６５】遺伝子の発現が前述の方法で検出された２
１のトランスジェニック植物を、次に、特定の抗体を使
用してキメラ遺伝子生産物の生産について試験した（Ｅ
ＬＩＳＡ）（Ａｄａｍら、１９８７；１９９１）。候補
ＸＬ４、ＸＬ８、ＸＬ１１、ＸＬ１４、ＸＬ１５および
ＸＬ１９は測定可能なシグナルを与え、そして最初の、
情報の病態生理学的実験のために選択した。
【００６６】詳細には、植物の形質転換を次のようにし
て実施した。
【００６７】２．１ 癌腫菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ）の形質転換 葉のディスク（Ｈｏｒｓｃｈら、１９８５）をタバコの
形質転換のために使用した。この目的に、無菌のシュー
トの培養物からの長さ約２〜３普通の方法の葉を直径約
１ｃｍのディスクに打ち抜き、そして２４時間培養した
癌腫菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の培養物（これ
が１０ｍＭ ＭｇＳＯ４を吸収した後）と一緒に、２０
ｍｌのＭＳ培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏ
ｇ、１９６５）中で、２６℃において約６０時間インキ
ュベーションした。引き続いて。葉のディスクを１００
０μｇ／ｍｌのクラフォランを含有するＭＳ培地の中で
３×洗浄し、次いで０．５μｇ／ｍｌ ＮＡＡ（ナフチ
ル酢酸）、０．５μｇ／ｍｌＢＡＰ（ベンジルアミノプ
リン）および２％スクロース（「カルス誘発培地」）お
よび適当な選択剤（例えば、硫酸カナマイシン）を含有
するＭＳプレート上に横たえ、そして２６℃においてイ
ンキュベーションした。各場合において、葉のディスク
を新鮮なカルス誘発培地に移した。いったん小さいカル
スを区別することができたとき、それらをシュート誘発
培地に移した。前記シュート誘発培地はカルス誘発培地
に相当するが、０．２μｇ／ｍｌ ＮＡＡおよび０．５
μｇ／ｍｌ ＢＡＰを含有する。いったん再生されたシ
ュートが２〜３ｃｍの長さに到達したとき、根の誘発の
ために、それらを１％スクロースを含有するが、ホルモ
ンを含有しないＭＳ培地に移し、そして無菌の条件下に
２４〜２６℃において培養した（１２時間の光（１００
０〜３００ルックス）、１２時間の暗所で）。４〜６週
後、シュートの培養物を新鮮な培地に移し、植物に成長
させ、引き続いて温室の中で適当な条件下に培養した。
【００６８】ジャガイモ植物を形質転換するために、切
取った葉のディスクを癌腫菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ）の懸濁液の中でインキュベーションした後、暗所
でさらに２日間インキュベーションした。次いで、１．
６％グルコース、５ｍｇ／ｌＮＡＡ、０．１ｍｇ／ｌ
ＢＡＰ、５００ｍｌのクラフォランおよび適当な選択剤
を含有するＭＳプレート上で、葉のディスクを１６時間
の照明で８日間インキュベーションした。引き続いて、
１．６％グルコース、２．０ｍｇ／ｌゼアチンリボシ
ド、０．０２ｍｇ／ｌ ＮＡＡ、０．０２ｍｇ／ｌ Ｇ
Ａ３（ジベレリン酸）および５００ｍｇ／ｌクラフォラ
ンを含有するＭＳプレートに、葉のディスクを移した。
いったん葉のディスクを１４日間インキュベーションし
たとき、それらを新鮮なプレートに移した。最初のカル
スは約６〜７週後に現れた。３％スクロースおよび０．
５ｍｇ／ｌカルベニシリンを含有するＭＳ培地が中に存
在する２５０ｍｌのガラスフラスコに、現れたシュート
を移した。最初の根は約１４日後に現れた。植物を引き
続いて温室の中で適当な条件下に栽培した。
【００６９】トマトを前述の方法に本質的にしたがって
形質転換した。
【００７０】ＤＮＡ（Ｄｅｌｌａｐｏｒｔａら、１９８
３）およびＲＮＡ（Ｇｏｏｄａｌｌら、１９９０および
ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ、１９８
７）を、生ずる植物から、標準の方法により分離した。
転移された遺伝子の組み込みおよび数をＤＮＡ分析
（「サザンブロット」）により決定し、そして転写の量
をＲＮＡ分析（ＶａｎｋａｎおよびＦｉｌｉｐｏｗｉｃ
ｚ、１９８８；ＧｏｏｄａｌｌおよびＦｉｌｉｐｏｗｉ
ｃｚ、１９８９；Ｓｔｅｉｎｅｃｋｅら、１９９２に従
う「ＲＮアーゼ保護」）により決定することができた。
【００７１】２．２ 原形質体の分離およびＰＥＧ仲介
形質転換 無菌培養からの４〜８週齢のニコチアナ・タバクム（Ｎ
ｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）ＳＲ１の葉を切断
し、蒸留Ｈ2Ｏで清浄にし、そして０．０５％ＳＤＳ溶
液の中に入れて細菌の汚染を防止した。ＳＤＳを無菌Ｈ
2Ｏで２回洗浄して除去し、次いで葉をＫ３培地（５０
０ｍｇ／ｌクラフォラン、１ｍｇ／ｌＮＡＡ、０．２ｍ
ｇ／ｌカイネチン）の中で１０分間平衡化した。中央の
肋を除去した後、葉を１〜２ｃｍ2の大きさの片に切っ
た。葉肉の原形質体を分離するために、葉片を無菌の１
リットルのフラスコの中の３０ｍｌのセルラーゼおよび
マゼロザイムを含有する酵素溶液（Ｋ３培地中の１．５
％セルラーゼ、０．５％マゼロザイム）に添加し、そし
てわずかの真空に１０分間暴露した。引き続いて２７℃
において１６時間暗所でインキュベーションした後、こ
の混合物を３０分間７５ｒｐｍで震盪した。次いで原形
質体の懸濁液を２５０および１００μｍの孔直径の鋼の
篩に通過させ、そして濾液を１２ｍｌの遠心管に分割
し、そしてヘティチ・ユニバーサル（Ｈｅｔｔｉｃｈ
Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）２Ｓ遠心機の中で６５０ｒｐｍで
５分間遠心した。下相を沈降物と一緒に１００μｍのガ
ラス毛管で吸引し、そして原形質体を１０ｍｌのＫ３培
地で洗浄し、そして培地を遠心（上を参照）反復した後
再びもう一度吸引した。引き続いて、原形質体をＷ５培
地（１５４ｍＭ ＮａＣｌ、１２５ｍＭ ＣａＣｌ2×
Ｈ2Ｏ、５ｍＭ グルコース、５ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ
５．６）の中に取り、フチュ−ロウゼンタル（Ｆｕｃｈ
ｓ−Ｒｏｚｅｎｔｈａｌ）計数チャンバーの中で計数
し、次いでＷ５培地の中に３０分間放置した。原形質体
を６５０ｒｐｍで５分間遠心することによって分離し、
次いで沈降物をＭａＭｇ溶液（４５０ｍＭマンニトー
ル、１５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．１％ＭＥＳ、ｐＨ６）
の中に懸濁させ、この懸濁液の濃度を１〜３×１０6原
形質体／ｍｌに調節した。次いで、原形質体を直接トラ
ンスフェクションするか、あるいはそれらを冷蔵庫の中
に４時間まで貯蔵することができた。形質転換のため
に、原形質体を水浴の中で４５℃において５分の熱衝撃
にかけ、その間時々撹拌し、次いで氷／水の中に４５秒
間入れることによって室温に直ちに冷却した。引き続い
て、０．３５ｍｌの体積のアリコートの原形質体の懸濁
液を１０ｍｌの遠心管の中に入れ、次いで５０μｌのＤ
ＮＡ溶液を各管に添加した。０．３５ｍｌのＰＥＧ溶液
（１００ｍＭ Ｃａ（ＮＯ3）2×４Ｈ2Ｏ、４００ｍＭ
マンニトール、４０％ＰＥＧ４０００、ｐＨ７〜９）
を１０分後滴々添加し、次いでさらに２０分後にペトリ
皿に移し、その間にすべての試料を５分間撹拌した。４
ｍｌのＫ３培地を滴々添加した後、原形質体を２７℃に
おいて暗所で６〜４８時間栽培した。インキュベーショ
ン後、原形質体を１２ｍｌの遠心管に移し、遠心管に洗
浄のために海水を満たし、次いで６５０ｒｐｍで３分間
遠心した。上澄み液を１ｍｌに除去し、次いで原形質体
を再懸濁させ、そしてエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏ
ｒｆ）管の中に移した。１３０００ｒｐｍ（バイオフー
グ）で１分間遠心しそして上澄み液を注意して除去した
後、原形質体を関係する抽出緩衝液の中に取った。
【００７２】本発明によるＤＮＡは前述の方法により調
製された原形質体の中に首尾よく導入された。
【００７３】３．本発明によるトランスジェニック植物
の増加した耐性の実施例 ３．１ 植物病原性菌類に対する増強された耐性 ２（上の）に列挙したトランスジェニックタバコ植物Ｘ
Ｌ４、ＸＬ８、ＸＬ１１、ＸＬ１４、ＸＬ１５およびＸ
Ｌ１９を自殖させ、そしてＸＬ４の子孫を次の試験のた
めに選択した。植物病原性真菌ボトリチス・シンセラ
（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｃｅｒａ）を試験のための
病原体として使用した。
【００７４】（ａ）試験の説明 タバコ植物を２３℃および７０〜８０％の相対大気湿度
において、実験を開始するまで、温室の中で成長させ
た。水および肥料を要求に従い供給する。接種につい
て、６〜８週齢の植物の葉を、病原体の胞子懸濁液でし
たたり落ちてぬれるまで、噴霧した。引き続いて、植物
を病原体にとって好適な条件下に、すなわち、２０℃お
よび１００％の相対大気湿度においてインキュベーショ
ンした。４日後、植物の健康な状態を感染した葉面積の
百分率に基づいて確認した。区別を葉の段階の間で行っ
た（葉１＝最も古い葉、葉６＝最も若い葉）。
【００７５】 ３．２ ウイルスに対する増加した耐性 ２（上の）に列挙したトランスジェニックタバコ植物Ｘ
Ｌ４、ＸＬ８、ＸＬ１１、ＸＬ１４、ＸＬ１５およびＸ
Ｌ１９を自殖させ、そしてＸＬ８（ＸＬ８．２８）の子
孫を次の試験のために選択した。
【００７６】種々のトスポウイルス、および他の族のウ
イルスを試験病原体として使用した。
【００７７】（ａ）試験の説明 タバコ植物を２３℃および７０〜８０％の相対大気湿度
において、実験を開始するまで、温室の中で成長させ
た。水および肥料を要求に従い供給する。
【００７８】明瞭なウイルスの症状を示す１次的に感染
した葉材料の３ｇを、ＴＳＷＶ分離物Ｌ３（ＤＳＭ Ｎ
ｏ．ＰＶＯ１８２）で前以て３週感染させたタバコ植物
（ニコチアナ・ルスチカ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｒｕｓ
ｔｉｃａ）Ｌ）から収穫し、次いで乳鉢の中で３０ｍｌ
の標準の緩衝液（０．２％ポリビニルピロリドン分子量
１００００および０．２％（ｗ／ｖ）Ｎａ2ＣＯ3を含有
する０．１Ｍ Ｎａ−Ｋリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．０）
中で均質化した。この材料を希釈しないで、そして標準
の緩衝液中で１：２５希釈して、使用し、次いで０．１
ｍｌ／葉を各場合において、機械的にすりつぶして、約
８〜１０週齢の被験植物の３枚の葉の各々に適用した。
被験植物は前以て研磨剤（カーボランダム、６００メッ
シュ）でダスチングしてあり、そしていったん接種を行
ったとき、木管から引いた水（ｍａｉｎｓ ｗａｔｅ
ｒ）ですすいだ。
【００７９】接種後５日から１４日の期間にわたって、
等級スキームを使用して植物上の症状の発展を視的に評
価した。症状は感染した葉上にそして組織的に非感染の
葉の両者に現れた。
【００８０】段階０＝症状なし。
【００８１】段階１＝温和な症状、葉上の環状のスポッ
ト（壊死） 段階２＝高度の症状、葉脈の黄色化、モザイク、胴枯病
のしるし。
【００８２】等級づけの値を使用して平均の等級づけの
値を解明し、次いでこれを対照植物の等級づけの値に関
係づけた。
【００８３】植物の耐性をさらに定量するために、ＴＳ
ＷＶアクリルアミドゲルの量を決定するために、三重抗
体サンドイッチ（ＴＡＳ）ＥＬＩＳＡ法を使用した。こ
のために、グレイナー（Ｇｒｅｉｎｅｒ）マイクロタイ
タープレート（６５５００１）を０．１ｍｌ／ウェルの
ポリクローナル抗血清（ＤＳＭ Ｎｏ．ＡＳ−０１０
５、５μｇ／ｍｌ）で被覆した。標準のＥＬＩＳＡ緩衝
液を使用して、１次的におよび２次的に感染した被験植
物の葉から１：３０および１：５００の希釈物のプレス
ジュースを調製した。プレートの３ウェルを各場合にお
いて各試料（０．１ｍｌ）で負荷し、次いでプレートを
４℃において一夜インキュベーションした。プレートを
ＰＢＳ−ツイーンで３回洗浄した後、２つのモノクロー
ナル抗体４Ｆ２および２Ｂ６（Ａｄａｍら、１９９１）
の１：１０００希釈物の０．１ｍｌを各ウェルに添加
し、そしてプレートを３７℃において３時間インキュベ
ーションした。プレートをＰＢＳ−ツイーンで３回洗浄
した後、ウサギ抗マウスＩｇＧ接合体（ＤＡＫ ダイア
グノスチカ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）ＧｍｂＨ、Ｎ
ｏ．Ｄ３１４）の１：１０００希釈物の０．１ｍｌ／ウ
ェルに添加し、次いでプレートを３７℃において３時間
インキュベーションした。プレートをＰＢＳ−ツイーン
で３回洗浄した後、基質のｐ−ニトロフェニルホスフェ
ート（１ｍｇ／ｍｌ）を添加し、そして４０５ｎｍにお
ける吸光を３０分後および１時間後にフォトメーターで
測定した。吸光値を使用して平均の吸光を決定し、次い
でこれを対照の測定値に関係づけた。結果は、トランス
ジェニック植物が症状をもたないが、対照植物は高度の
症状を示すことを実証する。これに加えて、モノクロー
ナル抗体（Ｍａｂ ２Ｂ６）との反応により検出され
た、トランスジェニック植物におけるＴＳＷＶ抗原の量
は対照植物におけるより顕著に低いことが発見された。
【００８４】 種々の他のトスポウイルス分離物を使用するＸＬ４．２
４トランスジェニック植物のバイオテスト （ａ）試験の説明 トランスジェニック植物ＸＬ４（ＸＬ４．２４）のホモ
接合体の子孫を、それらが４葉段階に到達するまで、養
殖した。
【００８５】植物をランダムに２０のグループに集め、
そして種々のトスポウイルスで感染したタバコ植物から
のホモジネートで機械的に接種した。次のウイルス分離
物を接種に使用した：ＴＳＷＶ−ナンキンマメ＝ＳＡ０
５（ＤＳＭ Ｎｏ．ＰＶ−０２０５）；ＩＮＳＶ（ＤＳ
Ｍ Ｎｏ．ＰＶ−０２８０）；ＩＮＳＶ（ＤＳＭ Ｎ
ｏ．ＰＶ−０２８１）。接種物の分離に使用した植物は
前以て１０〜１４日に接種しそして、電子顕微鏡の発見
に基づいて、他のウイルスによる汚染を含有しなかっ
た。接種物を調製するために、標準ＤＳＭ接種緩衝液
（ＤＳＭ植物ウイルスカタログ）を使用し、均質化は乳
鉢と乳棒を使用して１：３０（ｇ／ｍｌ）の比において
実施した。ガラスのスパチュラを使用して、接種物を磨
砕して、カーボランダム（６００メッシュ）でダスチン
グした被験植物の葉の上に配置した。各被験植物の２枚
の最も古い２次の葉を接種した。接種後、感染した葉を
木管から引いた水（ｍａｉｎｓ ｗａｔｅｒ）ですすい
だ。植物を引き続いて前述の培養条件下にインキュベー
ションし、そして各日に症状について視的に等級づけ
た。対照として、非形質転換ニコチアナ・タバクム
（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）植物を同一の方法で成長させ、
そして種々の分離物で接種した。
【００８６】実験の最終の等級づけを接種後１週および
３週における２回の観察により実施した：評価が異なる
場合、好適さに劣る評価を採用した。結果を表１に要約
する。首尾よい感染後、ＴＳＷＶ−ナンキンマメ（ＳＡ
−０５）分離物は感染した葉上に局所的壊死を発生しそ
して、新しく形成した、葉の変形および組織的に感染し
た葉上の壊死を含む、高度の組織的症状を発生したが、
２つのＩＮＳＶ分離物は接種した葉上の局所的壊死のみ
を発生し、新しく形成した葉への組織的な広がりは起こ
らなかった。ＴＳＷＶ−ナンキンマメの場合において等
級づけを実施したとき、組織的に感染した被験植物およ
び局所的な一次的症状のみを示したものの両者は首尾よ
く感染したと取った。なぜなら、実験において後者の場
合、組織的症状は遅延したのみでありそして経時的に現
れたからである。２つのＩＮＳＶ分離物の場合におい
て、局所的一次的症状の出現は首尾よい感染として取っ
た。 ブニアウイルス族に属さないウイルス分離物を使用する
ＸＬ４．２４トランスジェニック植物のバイオテスト （ａ）試験の説明 トランスジェニック植物ＸＬ４（ＸＬ４．２４）のホモ
接合体の子孫を、それらが４葉段階に到達するまで、養
殖した。
【００８７】植物をランダムに２０のグループに集め、
そして種々のウイルスで感染したタバコ植物からのホモ
ジネートで機械的に接種した。次のウイルス分離物を接
種に使用した：ＴＭＶ（ＤＳＭ Ｎｏ．ＰＶ−００５
５）およびタバコラトル（ｒａｔｔｌｅ）ウイルス（Ｄ
ＳＭ Ｎｏ．ＰＶ−００４３）。接種物の分離に使用し
た植物は前以て１０〜１４日に接種しそして、電子顕微
鏡の発見に基づいて、他のウイルスによる汚染を含有し
なかった。接種物を調製するために、標準ＤＳＭ接種緩
衝液（ＤＳＭ植物ウイルスカタログ）を使用し、均質化
は乳鉢と乳棒を使用して１：３０（ｇ／ｍｌ）の比にお
いて実施した。ガラスのスパチュラを使用して、接種物
を磨砕して、カーボランダム（６００メッシュ）でダス
チングした被験植物の葉の上に配置した。各被験植物の
２枚の最も古い２次の葉を接種した。接種後、感染した
葉を木管から引いた水（ｍａｉｎｓ ｗａｔｅｒ）です
すいだ。植物を引き続いて前述の培養条件下にインキュ
ベーションし、そして各日に症状について視的に等級づ
けた。対照として、非形質転換ニコチアナ・タバクム
（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）植物を同一の方法で成長させ、
そして種々の分離物で接種した。
【００８８】実験の最終の等級づけを接種後１週および
３週における２回の観察により実施した：評価が異なる
場合、好適さに劣る評価を採用した。両者のウイルスに
より感染は対照において一次的感染した葉上に局所的壊
死を発生させ、ＴＲＶによりそれは、また、高度の症状
を発生させた。ＴＭＶの場合において、有意により低い
局所的病変がトランスジェニックＸＬ４．２４植物にお
いて観察された。タバコラトルウイルスの場合におい
て、対照の１４％は一次に感染した葉上に壊死を有した
が、８６％はまた組織的症状を示した。対照的に、トラ
ンスジェニック植物の２８％は感染を完全に含まず、３
６％は単に壊死を有し、そして３６％のみは同様によく
組織的症状を有した。
【００８９】３．３ 植物病原性線虫類に対する増強さ
れた耐性 （ａ）試験の説明 トランスジェニックタバコ植物（ＸＬ４）を２３℃およ
び７０〜８０％の相対大気湿度において、実験を開始す
るまで、成長させた。移植後、植物を土の中で成長させ
て、根系をとくによく発育させた。水および肥料を要求
に従い供給した。１５ｃｍの高さである植物を、メロイ
ドギネ・インコグニタ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｉｎ
ｃｏｇｎｉｔａ）（ＬＩＩ）の生活可能な新しくふ化し
た幼虫をピペットで土の表面上に約３００匹の幼虫／１
００ｍｌの土体積の割合で均一に接種した。接種後４週
に、各根系上の虫瘤の数を決定することによって、等級
づけを行った。
【００９０】野生型植物に比較して、トランスジェニッ
ク植物は線虫類に対する増加した耐性を示した。
【００９１】このテキストにおいて、％値は、特記しな
い限り、重量により、そして希釈は、特記しない限り、
体積部（例えば、１：２５）による。
【００９２】本発明の主な特徴および態様は、次の通り
である。
【００９３】１．次の構成成分： （ａ）プラムポックスウイルス（ＰＰＶ）のＲＮＡから
誘導された二本鎖ｃＤＮＡ断片（「断片Ａ」）、および
（ｂ）トマト班点立ち枯れ病ウイルス（ＴＳＷＶ）のＮ
構造遺伝子のＳ ＲＮＡから誘導された二本鎖ｃＤＮＡ
断片（「断片Ｂ」）、の組み合わせから成るか、あるい
はこれらの構成成分を含有し、この組み合わせは、必要
に応じて存在することができる他のＤＮＡ断片に加え
て、植物細胞の中で活性でありかつ組み換えＤＮＡ断片
の転写を調節するプロモーターを含有することができる
ことを特徴とする、組み換えデオキシリボ核酸（ＤＮ
Ａ）。
【００９４】２．断片Ｂが断片Ａの後に（すなわち、
３’方向に）位置する、上記第１項記載のＤＮＡ。
【００９５】３．断片Ａが配列識別番号：７に記載する
配列を有するＤＮＡであるか、あるいは同一の作用を有
するＤＮＡである、上記第１項記載のＤＮＡ。
【００９６】４．断片Ｂが配列識別番号：１１に記載す
る配列を有するＤＮＡであるか、あるいは同一の作用を
有するＤＮＡである、上記第１項記載のＤＮＡ。
【００９７】５．配列識別番号：７および配列識別番
号：１１に記載するＤＮＡ断片の組み合わせ、または同
一の作用を有するＤＮＡの組み合わせを含有するか、あ
るいはこのような組み合わせから成る、上記第１項記載
のＤＮＡ。
【００９８】６．植物において活性であるプロモーター
を含有する、上記第１項記載のＤＮＡ。
【００９９】７．プロモーターとして、ＣａＭＶ ３５
Ｓプロモーター配列を有するＤＮＡ、または同一の作用
を有するＤＮＡを含有する、上記第１項記載のＤＮＡ。
【０１００】８．断片Ａおよび断片Ｂが１３４塩基対ま
でを有する合成ｃＤＮＡ断片（「断片Ｃ」）を介して連
鎖しており、後者の断片が断片Ａにおいて開始するオー
プンリーディングフレームを断片Ｂに接続する、上記第
１項記載のＤＮＡ。
【０１０１】９．ＡおよびＢのｃＤＮＡ断片が配列識別
番号：９に従う配列を有する合成ＤＮＡ断片を介する
か、あるいは同一の作用を有するＤＮＡを介して接続さ
れている、上記第１項記載のＤＮＡ断片。
【０１０２】１０．断片Ｂ後に、１〜３０塩基対を有す
る二本鎖ＤＮＡ断片（「断片Ｄ」）、または同一の作用
を有するＤＮＡを含有する、上記第１項記載のＤＮＡ。
【０１０３】１１、断片Ｂ後に、配列識別番号：１３に
従う二本鎖ＤＮＡ断片、または同一の作用を有するＤＮ
Ａを含有する、上記第１項記載のＤＮＡ。
【０１０４】１２．断片Ｂの直ぐ後に存在するか、ある
いは二本鎖ＤＮＡ断片（断片Ｄ）を介して断片Ｂに接続
されている３’未翻訳ＤＮＡを含有する、上記第１項記
載のＤＮＡ。
【０１０５】１３．断片Ｂの直ぐ後に存在するか、ある
いは二本鎖ＤＮＡ断片（断片Ｄ）を介して断片Ｂに接続
されている３’未翻訳ＤＮＡを含有し、前記３’未翻訳
ＤＮＡが配列識別番号：４に従う配列を有する、上記第
１項記載のＤＮＡ。
【０１０６】１４．配列識別番号：１に記載する配列を
有するＤＮＡ、または同一の作用を有するＤＮＡから成
るか、あるいはこの配列を含有する、上記第１項記載の
ＤＮＡ。
【０１０７】１５．配列識別番号：５に記載する配列を
有するＤＮＡ、または同一の作用を有するＤＮＡから成
るか、あるいはこの配列を含有する、上記第１項記載の
ＤＮＡ。
【０１０８】１６．上記第１項記載のＤＮＡを含有する
ウイルスまたは原核生物のＤＮＡ。 １７．上記第１項記載のＤＮＡを含有する植物のＤＮ
Ａ。
【０１０９】１８．上記第１項記載のＤＮＡを含有する
ベクター。
【０１１０】１９．上記第１項記載のＤＮＡを含有する
宿主生物。
【０１１１】２０．有害な生物または植物の病気に対し
て増加した耐性を有する植物、植物の部分および植物の
細胞（増殖物質を含む）を生産するための上記第１項記
載の組み換えＤＮＡの使用。
【０１１２】２１．上記第１項記載の組み換えＤＮＡ
を、普通の方法により、植物の細胞または部分のゲノム
の中に挿入し、必要に応じて植物の細胞再生して植物を
生成し、前記植物を必要に応じて増殖させ、そして、必
要に応じて、他の植物を生産するために、トランスジェ
ニック植物のゲノムを他の植物のゲノムと組み合わせ、
そして子孫を増殖させることを特徴とする、トランスジ
ェニック植物の細胞および植物を生産する方法。
【０１１３】２２．上記第１項記載の組み換えＤＮＡを
含有する、トランスジェニック植物の細胞、植物および
それらの部分、ならびに増殖物質。
【０１１４】２３．配列識別番号：２または６のタンパ
ク質を含有する、トランスジェニック植物の細胞、植物
およびそれらの部分、ならびに増殖物質。
【０１１５】
【表１】
【０１１６】
【表２】
【０１１７】
【表３】
【０１１８】
【表４】
【０１１９】
【表５】
【０１２０】
【表６】
【０１２１】
【表７】
【０１２２】
【表８】
【０１２３】
【表９】
【０１２４】
【表１０】
【０１２５】
【表１１】
【０１２６】
【表１２】
【０１２７】
【表１３】
【０１２８】
【表１４】
【０１２９】
【表１５】
【０１３０】
【表１６】
【０１３１】
【表１７】
【０１３２】
【表１８】
【０１３３】
【表１９】
【０１３４】
【表２０】
【０１３５】
【表２１】
【０１３６】
【表２２】
【０１３７】
【表２３】
【０１３８】
【表２４】
フロントページの続き (72)発明者 ギユンター・アダム ドイツ38118ブラウンシユバイク・ビーデ バインシユトラーセ23 (72)発明者 エトガル・マイス ドイツ38126ブラウンシユバイク・ニーチ エシユトラーセ26

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 次の構成成分： （ａ）プラムポックスウイルス（ＰＰＶ）のＲＮＡから
    誘導された二本鎖ｃＤＮＡ断片（「断片Ａ」）、および
    （ｂ）トマト班点立ち枯れ病ウイルス（ＴＳＷＶ）のＮ
    構造遺伝子のＳ ＲＮＡから誘導された二本鎖ｃＤＮＡ
    断片（「断片Ｂ」）、の組み合わせから成るか、あるい
    はこれらの構成成分を含有し、この組み合わせは、必要
    に応じて存在することができる他のＤＮＡ断片に加え
    て、植物細胞の中で活性でありかつ組み換えＤＮＡ断片
    の転写を調節するプロモーターを含有することができる
    ことを特徴とする、組み換えデオキシリボ核酸（ＤＮ
    Ａ）。
  2. 【請求項２】 断片Ｂが断片Ａの後に（すなわち、３’
    方向に）位置する、請求項１のＤＮＡ。
  3. 【請求項３】 断片Ａが配列識別番号：７に記載する配
    列を有するＤＮＡであるか、あるいは同一の作用を有す
    るＤＮＡである、請求項１のＤＮＡ。
  4. 【請求項４】 断片Ｂが配列識別番号：１１に記載する
    配列を有するＤＮＡであるか、あるいは同一の作用を有
    するＤＮＡである、請求項１のＤＮＡ。
  5. 【請求項５】 配列識別番号：７および配列識別番号：
    １１に記載するＤＮＡ断片の組み合わせ、または同一の
    作用を有するＤＮＡの組み合わせを含有するか、あるい
    はこのような組み合わせから成る、請求項１のＤＮＡ。
  6. 【請求項６】 植物において活性であるプロモーターを
    含有する、請求項１のＤＮＡ。
  7. 【請求項７】 断片Ａおよび断片Ｂが１３４塩基対まで
    を有する合成ｃＤＮＡ断片（「断片Ｃ」）を介して連鎖
    しており、後者の断片が断片Ａにおいて開始するオープ
    ンリーディングフレームを断片Ｂに接続する、請求項１
    のＤＮＡ。
  8. 【請求項８】 断片Ｂ後に、１〜３０塩基対を有する二
    本鎖ＤＮＡ断片（「断片Ｄ」）、または同一の作用を有
    するＤＮＡを含有する、請求項１のＤＮＡ。
  9. 【請求項９】 断片Ｂの直ぐ後に存在するか、あるいは
    二本鎖ＤＮＡ断片（断片Ｄ）を介して断片Ｂに接続され
    ている３’未翻訳ＤＮＡを含有する、請求項１のＤＮ
    Ａ。
  10. 【請求項１０】 配列識別番号：１に記載する配列を有
    するＤＮＡ、または同一の作用を有するＤＮＡから成る
    か、あるいはこの配列を含有する、請求項１のＤＮＡ。
  11. 【請求項１１】 請求項１のＤＮＡを含有するベクタ
    ー。
  12. 【請求項１２】 請求項１の組み換えＤＮＡを、普通の
    方法により、植物の細胞または部分のゲノムの中に挿入
    し、必要に応じて植物の細胞再生して植物を生成し、前
    記植物を必要に応じて増殖させ、そして、必要に応じ
    て、他の植物を生産するために、トランスジェニック植
    物のゲノムを他の植物のゲノムと組み合わせ、そして子
    孫を増殖させることを特徴とする、トランスジェニック
    植物の細胞および植物を生産する方法。
  13. 【請求項１３】 請求項１の組み換えＤＮＡを含有す
    る、トランスジェニック植物の細胞、植物およびそれら
    の部分、ならびに増殖物質。
  14. 【請求項１４】 配列識別番号：２または６のタンパク
    質を含有する、トランスジェニック植物の細胞、植物お
    よびそれらの部分、ならびに増殖物質。
JP6134887A 1993-05-28 1994-05-26 デオキシリボ核酸 Pending JPH06343469A (ja)

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