JPH06335334A - アミノ酸組成、脂肪酸組成の改変された油料作物およびその作出方法 - Google Patents
アミノ酸組成、脂肪酸組成の改変された油料作物およびその作出方法Info
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- JPH06335334A JPH06335334A JP6047058A JP4705894A JPH06335334A JP H06335334 A JPH06335334 A JP H06335334A JP 6047058 A JP6047058 A JP 6047058A JP 4705894 A JP4705894 A JP 4705894A JP H06335334 A JPH06335334 A JP H06335334A
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- oil crop
- acid composition
- amino acid
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- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】ナタネ等の油料作物に種子貯蔵タンパク質をコ
ードする遺伝子のアンチセンスＤＮＡを導入してアミノ
酸組成および／または脂肪酸組成の改変された油料作物
を作出する。 【効果】 本発明により、油料作物の脂肪酸組成および
／またはアミノ酸組成を改変することができる。具体的
には、脂肪酸として、オレイン酸の含量を減少させ、か
つ、リノール酸及びリノレン酸の含量を増加させたり、
あるいは必須アミノ酸であるリジン、メチオニン、シス
テイン等の含量を増加させたりすることにより、所望の
脂肪酸組成および／またはアミノ酸組成を有する栄養価
の高い種子をつける新しい油料作物を提供することがで
きる。
ードする遺伝子のアンチセンスＤＮＡを導入してアミノ
酸組成および／または脂肪酸組成の改変された油料作物
を作出する。 【効果】 本発明により、油料作物の脂肪酸組成および
／またはアミノ酸組成を改変することができる。具体的
には、脂肪酸として、オレイン酸の含量を減少させ、か
つ、リノール酸及びリノレン酸の含量を増加させたり、
あるいは必須アミノ酸であるリジン、メチオニン、シス
テイン等の含量を増加させたりすることにより、所望の
脂肪酸組成および／またはアミノ酸組成を有する栄養価
の高い種子をつける新しい油料作物を提供することがで
きる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、アミノ酸組成、脂肪酸
組成の改変された油料作物およびその作出方法に関し、
詳細には種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子のアン
チセンスＤＮＡを導入して改変された油料作物およびそ
の作出方法に関する。
組成の改変された油料作物およびその作出方法に関し、
詳細には種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子のアン
チセンスＤＮＡを導入して改変された油料作物およびそ
の作出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】油料
作物とは、その種子から油（油脂）が採取可能な作物の
ことであり、従来よりナタネ油、ゴマ油等の食用油とし
て、または各種工業用油を採取する目的で広く栽培が行
われている。例えばブラシカ植物の種子は約６０重量％
の脂質を含有しており、現在世界の多くの場所で油料植
物として栽培されている。また、その搾り粕は高タンパ
ク質であり飼料および肥料として古くから利用されてい
る。
作物とは、その種子から油（油脂）が採取可能な作物の
ことであり、従来よりナタネ油、ゴマ油等の食用油とし
て、または各種工業用油を採取する目的で広く栽培が行
われている。例えばブラシカ植物の種子は約６０重量％
の脂質を含有しており、現在世界の多くの場所で油料植
物として栽培されている。また、その搾り粕は高タンパ
ク質であり飼料および肥料として古くから利用されてい
る。
【０００３】しかし、以前よりナタネ油にはヒトの健康
に有害な作用を有するエルカ酸が、また搾り粕には家畜
に有害なグルコシノレートが含まれていることが知られ
ていた。そのためにこれまでに常用の交雑育種法によっ
てそれらの含量を減少させることに努力が払われてき
た。その結果、カナダでは油中にエルカ酸２重量％未
満、搾り粕１ｇ当たり３０マイクロモル未満のグルコシ
ノレートしか含まない”ダブルロウ”変種が作られた。
に有害な作用を有するエルカ酸が、また搾り粕には家畜
に有害なグルコシノレートが含まれていることが知られ
ていた。そのためにこれまでに常用の交雑育種法によっ
てそれらの含量を減少させることに努力が払われてき
た。その結果、カナダでは油中にエルカ酸２重量％未
満、搾り粕１ｇ当たり３０マイクロモル未満のグルコシ
ノレートしか含まない”ダブルロウ”変種が作られた。
【０００４】更に最近では油の消費量が増加すると共に
市場のニーズも多様化し、高脂質量のみならずその使用
目的により脂肪酸組成の異なった油を望むようになっ
た。例えば、食用には先に述べたエルカ酸の限りない低
減の他に、健康志向にともなって高度不飽和脂肪酸の低
減などが望まれている。それに対して、工業用には高エ
ルカ酸のものや、低級脂肪酸のものや高度不飽和脂肪酸
のものが望まれている。また搾り粕においては、高タン
パク質のものや、必須アミノ酸含量の高いものが要求さ
れている。
市場のニーズも多様化し、高脂質量のみならずその使用
目的により脂肪酸組成の異なった油を望むようになっ
た。例えば、食用には先に述べたエルカ酸の限りない低
減の他に、健康志向にともなって高度不飽和脂肪酸の低
減などが望まれている。それに対して、工業用には高エ
ルカ酸のものや、低級脂肪酸のものや高度不飽和脂肪酸
のものが望まれている。また搾り粕においては、高タン
パク質のものや、必須アミノ酸含量の高いものが要求さ
れている。
【０００５】これらの様々なニーズに答えるためにはこ
れまでの交配育種では手間がかかり、そのうえ種子成分
をそれぞれ一つの目的にあうように意のままに改変する
ことは困難である。つまり、従来の交配育種は方向性の
ない雑多な変異の中から目的の形質を持つものを選び出
し純系を作り挙げるという実に多大な労力と時間を要す
るプロセスであった。またγ線照射やソマクローナル変
異の利用により、栽培種由来の変異体の中から目的の変
異体を得る方法も試みられてきたが、変異処理によって
その他の遺伝子も変異を受けている場合が多く、直ちに
栽培品種とするには障害が多かった。
れまでの交配育種では手間がかかり、そのうえ種子成分
をそれぞれ一つの目的にあうように意のままに改変する
ことは困難である。つまり、従来の交配育種は方向性の
ない雑多な変異の中から目的の形質を持つものを選び出
し純系を作り挙げるという実に多大な労力と時間を要す
るプロセスであった。またγ線照射やソマクローナル変
異の利用により、栽培種由来の変異体の中から目的の変
異体を得る方法も試みられてきたが、変異処理によって
その他の遺伝子も変異を受けている場合が多く、直ちに
栽培品種とするには障害が多かった。
【０００６】これに対して遺伝子操作を用いた組換え植
物の作出は、目的の形質を司る遺伝子のみを対象にして
人工的に改変し導入する方法であるので、極めて方向性
の高い育種法を提供することが可能となる。これは、
１．目的の形質を司る遺伝子を単離し、２．この遺伝子
を目的の組織や部位で発現し得るように改変し、３．か
かる遺伝子を植物体に導入して再生させることによって
初めて達成されるものである。
物の作出は、目的の形質を司る遺伝子のみを対象にして
人工的に改変し導入する方法であるので、極めて方向性
の高い育種法を提供することが可能となる。これは、
１．目的の形質を司る遺伝子を単離し、２．この遺伝子
を目的の組織や部位で発現し得るように改変し、３．か
かる遺伝子を植物体に導入して再生させることによって
初めて達成されるものである。
【０００７】まず上記１として、種子貯蔵物質の生合成
に関与する酵素や貯蔵タンパク質の遺伝子が考えられ
る。種子貯蔵物質はそれを蓄積する植物によって量比は
異なっているが主に脂質、タンパク質、炭水化物があ
る。これらの物質は種子登熟期のほぼ同様の時期、細胞
伸長の時期に生成し蓄積され、その生合成経路は密接に
絡み合っていることが知られている。つまり同じ物質か
らそれぞれの方向へ生合成が進むといった形をとってい
る。ブラシカ植物では、脂質とタンパク質が蓄積される
が、貯蔵脂質の生合成経路に関与する酵素は単離されて
ないのが現状である。一方貯蔵タンパク質であるクルシ
フェリンやナピンの遺伝子は、アラビドプシス（Ｐｌａ
ｎｔ Ｐｈｙｓ．，８７，８５９−８６６，１９８８；
ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１，８０５−８２
０，１９８８）、大根（ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，２０，４６７−４７９，１９９２；Ｇｅｎｅ，９
９，７７−８５，１９９１）、ナタネ（Ｐｌａｎｔ Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５，１９１−２０１，１９８５；Ｐ
ｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１４，６３３−６３
５，１９９０）などでいくつか単離されている。
に関与する酵素や貯蔵タンパク質の遺伝子が考えられ
る。種子貯蔵物質はそれを蓄積する植物によって量比は
異なっているが主に脂質、タンパク質、炭水化物があ
る。これらの物質は種子登熟期のほぼ同様の時期、細胞
伸長の時期に生成し蓄積され、その生合成経路は密接に
絡み合っていることが知られている。つまり同じ物質か
らそれぞれの方向へ生合成が進むといった形をとってい
る。ブラシカ植物では、脂質とタンパク質が蓄積される
が、貯蔵脂質の生合成経路に関与する酵素は単離されて
ないのが現状である。一方貯蔵タンパク質であるクルシ
フェリンやナピンの遺伝子は、アラビドプシス（Ｐｌａ
ｎｔ Ｐｈｙｓ．，８７，８５９−８６６，１９８８；
ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１，８０５−８２
０，１９８８）、大根（ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，２０，４６７−４７９，１９９２；Ｇｅｎｅ，９
９，７７−８５，１９９１）、ナタネ（Ｐｌａｎｔ Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５，１９１−２０１，１９８５；Ｐ
ｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１４，６３３−６３
５，１９９０）などでいくつか単離されている。
【０００８】上記２は、貯蔵タンパク質をコードする遺
伝子のアンチセンスＤＮＡ（アンチセンスオリゴヌクレ
オチド）を導入してその産生を抑え、植物の形質を優性
に改変させるためのＤＮＡ部品の選択と構築である。ナ
タネに関しては、ナピンプロモーターを用いてＤＨＦＲ
遺伝子およびナピンセンス遺伝子からなるキメラ遺伝子
をナタネ導入し発現させた例（Ｓ．Ｅ．Ｒａｄｄｅ，Ｔ
ｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，７５，６８５−６
９４，１９８８）が報告されているが、貯蔵タンパク質
のアンチセンス遺伝子を導入した例はまだ報告されてい
ない。またアンチセンスＤＮＡを導入した例としては、
じゃがいもの澱粉合成酵素の一つであるＡＤＰ−グルコ
ースーピロホスホリラーゼ遺伝子のアンチセンスＤＮＡ
をじゃがいもに導入した時、じゃがいも中の澱粉量が減
少しショ糖含量と一部のタンパク質量が上昇したという
報告がある（ＥＭＢＯ Ｊ．，１１，１２２９−１２３
８，１９９２）。
伝子のアンチセンスＤＮＡ（アンチセンスオリゴヌクレ
オチド）を導入してその産生を抑え、植物の形質を優性
に改変させるためのＤＮＡ部品の選択と構築である。ナ
タネに関しては、ナピンプロモーターを用いてＤＨＦＲ
遺伝子およびナピンセンス遺伝子からなるキメラ遺伝子
をナタネ導入し発現させた例（Ｓ．Ｅ．Ｒａｄｄｅ，Ｔ
ｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，７５，６８５−６
９４，１９８８）が報告されているが、貯蔵タンパク質
のアンチセンス遺伝子を導入した例はまだ報告されてい
ない。またアンチセンスＤＮＡを導入した例としては、
じゃがいもの澱粉合成酵素の一つであるＡＤＰ−グルコ
ースーピロホスホリラーゼ遺伝子のアンチセンスＤＮＡ
をじゃがいもに導入した時、じゃがいも中の澱粉量が減
少しショ糖含量と一部のタンパク質量が上昇したという
報告がある（ＥＭＢＯ Ｊ．，１１，１２２９−１２３
８，１９９２）。
【０００９】上記３は遺伝子導入の手段であるが、例え
ばナタネの場合、プロトプラストにエレクトロポーレー
ションでＤＮＡを導入し培養を経て植物体を再生させる
方法（Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ，５２，１１１−１
１６，１９８７）と、アグロバクテリウムを介してＤＮ
Ａを導入し再生させる方法（特表平１−５００７１８号
公報）等が知られている。
ばナタネの場合、プロトプラストにエレクトロポーレー
ションでＤＮＡを導入し培養を経て植物体を再生させる
方法（Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ，５２，１１１−１
１６，１９８７）と、アグロバクテリウムを介してＤＮ
Ａを導入し再生させる方法（特表平１−５００７１８号
公報）等が知られている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ブラシカ
植物等の油料作物の種子貯蔵タンパク質量およびアミノ
酸組成を改変する目的で検討を重ねた結果、種子貯蔵タ
ンパク質をコードする遺伝子のアンチセンスＤＮＡを導
入することによりかかる目的が達成されるばかりではな
く、予想外にもその脂肪酸量、脂肪酸組成および必須ア
ミノ酸組成をも改変することができることを初めて見い
出し、本発明を完成するに至った。
植物等の油料作物の種子貯蔵タンパク質量およびアミノ
酸組成を改変する目的で検討を重ねた結果、種子貯蔵タ
ンパク質をコードする遺伝子のアンチセンスＤＮＡを導
入することによりかかる目的が達成されるばかりではな
く、予想外にもその脂肪酸量、脂肪酸組成および必須ア
ミノ酸組成をも改変することができることを初めて見い
出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】すなわち本発明の要旨は、種子貯蔵タンパ
ク質をコードする遺伝子のアンチセンスＤＮＡを導入し
て形質転換された油料作物、その作出方法およびそのた
めに使用される組換えベクター並びにその油料作物から
得られる種子に存する。以下本発明につき詳細に説明す
る。本発明における油料作物としては、前述の通り、そ
の種子から油（油脂）を採取できるものであれば、いか
なるものであってもよい。具体的には、ナタネ、ゴマ、
トウゴマ（ヒマ）、エゴマ、ラッカセイ、オリーブ、ダ
イズ、トウモロコシ、アマ、ヒマワリ、アブラヤシ等が
挙げられる。本発明においては、ナタネ、ダイズ、トウ
モロコシが好ましい作物であり、特に好ましいのはナタ
ネである。
ク質をコードする遺伝子のアンチセンスＤＮＡを導入し
て形質転換された油料作物、その作出方法およびそのた
めに使用される組換えベクター並びにその油料作物から
得られる種子に存する。以下本発明につき詳細に説明す
る。本発明における油料作物としては、前述の通り、そ
の種子から油（油脂）を採取できるものであれば、いか
なるものであってもよい。具体的には、ナタネ、ゴマ、
トウゴマ（ヒマ）、エゴマ、ラッカセイ、オリーブ、ダ
イズ、トウモロコシ、アマ、ヒマワリ、アブラヤシ等が
挙げられる。本発明においては、ナタネ、ダイズ、トウ
モロコシが好ましい作物であり、特に好ましいのはナタ
ネである。
【００１２】種子貯蔵タンパク質についても特に制限は
されないが、本発明においてはナピンまたはクルシフェ
リンであることが好ましい。この２種のタンパク質は、
ブラシカ属植物の種子における貯蔵タンパク質の主要な
タンパク質であり、ナタネの場合それぞれ全タンパク質
の約２０％と６０％を占めている。ナピンはブラシカ植
物が生合成する１．７Ｓ貯蔵タンパク質の総称であり、
その中にはアミノ酸配列が部分的に異なるものが数種類
存在している。それらをコードする遺伝子は二十数個の
ジーンファミリーを形成している。しかしそのホモロジ
ーはどの植物間においても各遺伝子間で９０％以上と高
い。一方クルシフェリンは１２Ｓ貯蔵タンパク質の総称
でアミノ酸配列より４種類知られている。それらはナピ
ンと比べて相同性が低く、ある植物種内においてもそれ
ぞれおよそ４０％程度しかない。
されないが、本発明においてはナピンまたはクルシフェ
リンであることが好ましい。この２種のタンパク質は、
ブラシカ属植物の種子における貯蔵タンパク質の主要な
タンパク質であり、ナタネの場合それぞれ全タンパク質
の約２０％と６０％を占めている。ナピンはブラシカ植
物が生合成する１．７Ｓ貯蔵タンパク質の総称であり、
その中にはアミノ酸配列が部分的に異なるものが数種類
存在している。それらをコードする遺伝子は二十数個の
ジーンファミリーを形成している。しかしそのホモロジ
ーはどの植物間においても各遺伝子間で９０％以上と高
い。一方クルシフェリンは１２Ｓ貯蔵タンパク質の総称
でアミノ酸配列より４種類知られている。それらはナピ
ンと比べて相同性が低く、ある植物種内においてもそれ
ぞれおよそ４０％程度しかない。
【００１３】本発明において導入するのは、かかる種子
貯蔵タンパク質をコードする遺伝子のアンチセンスＤＮ
Ａである。従って本発明で導入するアンチセンスＤＮＡ
は、どの種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子に対す
るものであっても良いが、導入したアンチセンスＤＮＡ
の発現したアンチセンスＲＮＡが細胞中に内在する本来
の遺伝子の転写産物とハイブリッドを作ると仮定すれ
ば、それらの塩基配列の相同性が高いほど効率がよいた
め、ジーンファミリー間でも相同性の最も高い部分を用
いることが望ましい。それらの遺伝子はｃＤＮＡでもゲ
ノミックＤＮＡでも、またそれらの全長でも一部でも良
い。例えば種子貯蔵タンパク質としてナピンを使用する
場合、ナピン遺伝子は、Ｒａｓｋ Ｌ．らによって報告
されたｎａｐＡ塩基配列（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，
２６２，１２１９６−１２２０１，１９８６）を基に、
１１１１ｂｐから１７８３ｂｐ程度までを用い、クルシ
フェリンを使用する場合は、Ａ．Ｊ．Ｒｙａｎらによっ
て報告されたｃｒｕＡ塩基配列（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒ
ｅｓ．，１７，３５８４，１９８９）を基に６８０ｂｐ
から１２７８ｂｐまでをＢ．ｎａｐｕｓ等のゲノムＤＮ
Ａを鋳型としてＰＣＲ法により増幅させて単離する。Ｐ
ＣＲ法（Ｓａｉｋｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，４８７
−４９１，１９８８）は、鋳型の熱変性、プライマーと
鋳型のアニーリング及び耐熱性ポリメラーゼによる伸長
方法からなる工程を繰り返すことにより、標的ＤＮＡ領
域を増幅する方法である。即ち、Ｂ．ｎａｐｕｓ ｃ
ｖ．Ｗｅｓｔａｒ等の植物体の葉より、ゲノムＤＮＡ
を、例えばＭｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１１，２
７−３４，１９８８に準じて単離し、このゲノムＤＮＡ
約３００ｎｇを鋳型として用いる。これらの鋳型ＤＮＡ
を熱変成して＋鎖と−鎖の１本鎖に解離し、アニーリン
グした後、耐熱性ポリメラーゼによりＤＮＡを合成する
という工程を２０〜３０回繰り返して該相補鎖ＤＮＡを
増幅する。この増幅させた部分はナピン転写領域の９０
％以上とクルシフェリン転写領域の２５％をカバーす
る。
貯蔵タンパク質をコードする遺伝子のアンチセンスＤＮ
Ａである。従って本発明で導入するアンチセンスＤＮＡ
は、どの種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子に対す
るものであっても良いが、導入したアンチセンスＤＮＡ
の発現したアンチセンスＲＮＡが細胞中に内在する本来
の遺伝子の転写産物とハイブリッドを作ると仮定すれ
ば、それらの塩基配列の相同性が高いほど効率がよいた
め、ジーンファミリー間でも相同性の最も高い部分を用
いることが望ましい。それらの遺伝子はｃＤＮＡでもゲ
ノミックＤＮＡでも、またそれらの全長でも一部でも良
い。例えば種子貯蔵タンパク質としてナピンを使用する
場合、ナピン遺伝子は、Ｒａｓｋ Ｌ．らによって報告
されたｎａｐＡ塩基配列（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，
２６２，１２１９６−１２２０１，１９８６）を基に、
１１１１ｂｐから１７８３ｂｐ程度までを用い、クルシ
フェリンを使用する場合は、Ａ．Ｊ．Ｒｙａｎらによっ
て報告されたｃｒｕＡ塩基配列（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒ
ｅｓ．，１７，３５８４，１９８９）を基に６８０ｂｐ
から１２７８ｂｐまでをＢ．ｎａｐｕｓ等のゲノムＤＮ
Ａを鋳型としてＰＣＲ法により増幅させて単離する。Ｐ
ＣＲ法（Ｓａｉｋｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，４８７
−４９１，１９８８）は、鋳型の熱変性、プライマーと
鋳型のアニーリング及び耐熱性ポリメラーゼによる伸長
方法からなる工程を繰り返すことにより、標的ＤＮＡ領
域を増幅する方法である。即ち、Ｂ．ｎａｐｕｓ ｃ
ｖ．Ｗｅｓｔａｒ等の植物体の葉より、ゲノムＤＮＡ
を、例えばＭｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１１，２
７−３４，１９８８に準じて単離し、このゲノムＤＮＡ
約３００ｎｇを鋳型として用いる。これらの鋳型ＤＮＡ
を熱変成して＋鎖と−鎖の１本鎖に解離し、アニーリン
グした後、耐熱性ポリメラーゼによりＤＮＡを合成する
という工程を２０〜３０回繰り返して該相補鎖ＤＮＡを
増幅する。この増幅させた部分はナピン転写領域の９０
％以上とクルシフェリン転写領域の２５％をカバーす
る。
【００１４】次に上記の遺伝子を導入した発現ベクター
を構築する。例えばナタネ種子でかかる遺伝子を十分量
発現させるためには、ベクター構築の際に特異的なプロ
モーターを用いることが重要となる。また効率良く種子
貯蔵タンパク質の量を減少させるためには、内在する本
来の種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子の発現時
期、発現場所とアンチセンスＤＮＡの発現時期、発現場
所を同じにすることが望ましい。例えば、ナピン遺伝子
やクルシフェリン遺伝子のアンチセンスＤＮＡを導入し
てＢ．ｎａｐｕｓを形質転換する際には、Ｂ．ｎａｐｕ
ｓのナピン遺伝子由来のプロモーターを上記ｎａｐＡの
シークエンスを基に１ｂｐから１１４５ｂｐ程度までを
ＰＣＲ法により増幅して用いればよい。また、この時導
入遺伝子をしてクルシフェリンのアンチセンスＤＮＡを
用いた場合には、クルシフェリンのプロモーターを使用
しても良く、上記ｃｒｕＡのシークエンスを基に１ｂｐ
から７０９ｂｐ程度までを増幅し用いればよい。但しこ
の際、それらの増幅させたプロモーターがシュード遺伝
子でなく実際に種子内で発現しているものであることが
好ましい。
を構築する。例えばナタネ種子でかかる遺伝子を十分量
発現させるためには、ベクター構築の際に特異的なプロ
モーターを用いることが重要となる。また効率良く種子
貯蔵タンパク質の量を減少させるためには、内在する本
来の種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子の発現時
期、発現場所とアンチセンスＤＮＡの発現時期、発現場
所を同じにすることが望ましい。例えば、ナピン遺伝子
やクルシフェリン遺伝子のアンチセンスＤＮＡを導入し
てＢ．ｎａｐｕｓを形質転換する際には、Ｂ．ｎａｐｕ
ｓのナピン遺伝子由来のプロモーターを上記ｎａｐＡの
シークエンスを基に１ｂｐから１１４５ｂｐ程度までを
ＰＣＲ法により増幅して用いればよい。また、この時導
入遺伝子をしてクルシフェリンのアンチセンスＤＮＡを
用いた場合には、クルシフェリンのプロモーターを使用
しても良く、上記ｃｒｕＡのシークエンスを基に１ｂｐ
から７０９ｂｐ程度までを増幅し用いればよい。但しこ
の際、それらの増幅させたプロモーターがシュード遺伝
子でなく実際に種子内で発現しているものであることが
好ましい。
【００１５】更に、効率良く遺伝子の転写を終結させ生
成したＲＮＡを安定させるために、ターミネーターが用
いられる。具体的には、ノパリン合成酵素遺伝子ＮＯＳ
のターミネーター（ｐＢＩ２２１、Ｊｅｆｆｅｒｓｏ
ｎ、ＥＭＢＯ Ｊ．，６，３９０１−３９０７，１９８
７）等が挙げられるが、その他植物細胞内でターミネー
ターとして機能するものであればいずれのものでも良
い。
成したＲＮＡを安定させるために、ターミネーターが用
いられる。具体的には、ノパリン合成酵素遺伝子ＮＯＳ
のターミネーター（ｐＢＩ２２１、Ｊｅｆｆｅｒｓｏ
ｎ、ＥＭＢＯ Ｊ．，６，３９０１−３９０７，１９８
７）等が挙げられるが、その他植物細胞内でターミネー
ターとして機能するものであればいずれのものでも良
い。
【００１６】植物形質転換法としてはアグロバクテリウ
ム法、エレクトロポーレーション法等が挙げられるが、
アグロバクテリウム法を用いる場合には、ｐｌａｎ系列
（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．，１０，２８６−２
９０、１９９１）のプラスミドを、エレクトロポーレー
ション法を用いる場合には、ｐＵＣ系列のプラスミド等
を用いることが好ましい。これらのプラスミドには、選
択マーカー遺伝子としてネオマイシンフォスフォトラン
スフェラーゼ遺伝子またはハイグロマイシンフォスフォ
トランスフェラーゼ遺伝子を含んでいる。その他にクロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、
βーグルクロニダーゼ遺伝子等から選ばれる２つ以上の
外来遺伝子を使用し、かつその一つは目的とする形質転
換体を選択する際に有効の、いわゆる選択マーカー遺伝
子とするのが好ましい。かかる選択マーカーとしては、
ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼが好まし
い。エレクトロポーレーション法では、選択マーカー遺
伝子と他の外来遺伝子を同一のプラスミド中に有するも
のを使用してもよいし、選択マーカー遺伝子を有するプ
ラスミドと他の外来遺伝子を有するプラスミドとを併用
してもよい。
ム法、エレクトロポーレーション法等が挙げられるが、
アグロバクテリウム法を用いる場合には、ｐｌａｎ系列
（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．，１０，２８６−２
９０、１９９１）のプラスミドを、エレクトロポーレー
ション法を用いる場合には、ｐＵＣ系列のプラスミド等
を用いることが好ましい。これらのプラスミドには、選
択マーカー遺伝子としてネオマイシンフォスフォトラン
スフェラーゼ遺伝子またはハイグロマイシンフォスフォ
トランスフェラーゼ遺伝子を含んでいる。その他にクロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、
βーグルクロニダーゼ遺伝子等から選ばれる２つ以上の
外来遺伝子を使用し、かつその一つは目的とする形質転
換体を選択する際に有効の、いわゆる選択マーカー遺伝
子とするのが好ましい。かかる選択マーカーとしては、
ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼが好まし
い。エレクトロポーレーション法では、選択マーカー遺
伝子と他の外来遺伝子を同一のプラスミド中に有するも
のを使用してもよいし、選択マーカー遺伝子を有するプ
ラスミドと他の外来遺伝子を有するプラスミドとを併用
してもよい。
【００１７】かかるプラスミドを油料作物の下胚軸また
はプロトプラストに導入再生することによって、種子貯
蔵タンパク質含量の変化した油料作物を作出することが
できる。アグロバクテリウム法による形質転換法は（特
表平１−５００７１８号公報）に準じて行うことができ
る。
はプロトプラストに導入再生することによって、種子貯
蔵タンパク質含量の変化した油料作物を作出することが
できる。アグロバクテリウム法による形質転換法は（特
表平１−５００７１８号公報）に準じて行うことができ
る。
【００１８】エレクトロポーレーション法においてブラ
シカ植物由来のプロトプラストは次のようにして調製す
ることが出来る。すなわち、無菌培養されたシュートよ
り常法に従い、例えばセルラーゼやペクチナーゼ等の細
胞壁分解酵素を含む等張溶液中に２５〜３０℃で５〜２
０時間酵素処理する。処理終了後濾過して未消化物を除
き、ろ液を遠心分離し、精製されたプロトプラストを得
ることが出来る（特願平４−２７６０６９号）。例えば
ナピン遺伝子やクルシフェリン遺伝子のアンチセンスＤ
ＮＡを導入してＢ．ｎａｐｕｓを形質転換する際には、
Ｂ．ｎａｐｕｓｃｖ． Ｗｅｓｔａｒ由来のプロトプラ
スト６×１０5 個／ｍｌに対し、上記のようにして調製
したナピンアンチセンスＤＮＡ発現ベクター、またはク
ルシフェリンアンチセンスＤＮＡ発現ベクター（例えば
４０〜８０μｇ／ｍｌ）を選抜遺伝子としてネオマイシ
ンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子（例えば４０〜
８０μｇ／ｍｌ）を含み、３０〜２００ｍＭ塩化カリウ
ム、０〜５０ｍＭ塩化マグネシウム、０．２〜０．６Ｍ
マンニトールを含む緩衝液などの液体媒体中に懸濁し、
これに電気パルスを印加してプラスミドをプロトプラス
ト中に導入する。電気パルス処理は、１００〜１０００
μＦのコンデンサーを用いて得られる２００〜１０００
Ｖ／ｃｍの初期電圧の直流パルスで、パルス幅１〜３０
ｍｓｅｃ程度の条件で印加するのが好適である。上述の
ようにして電気パルス処理したプロトプラストを例え
ば、０．０５〜０．５ｍｇ／ｌの２，４−ジクロロフェ
ノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、０．０２〜０．５ｍｇ／ｌ
のナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、０．１〜２．０ｍｇ／ｌ
のベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）及び０．４Ｍグルコ
ースを含むＫＭ液体培地（Ｐｌａｎｔａ，１２６，１０
５−１１０，１９７５）に１０5 個／ｍｌになるように
懸濁し、暗条件下２５℃で培養する。培養後３〜４週間
で、０．５〜１ｍｍφ程度のコロニーが形成される。そ
の際、例えば選択マーカー遺伝子であるネオマイシンフ
ォスフォトランスフェラーゼ遺伝子を導入しておいた場
合、培養開始２週間後にカナマイシンを１０〜５０μｇ
／ｍｌ程度培養液中に添加し、更に培養を続けることで
形質転換細胞の一次選択を効率良く行うことが出来る。
ついでこのコロニーを同濃度のカナマイシンを含んだカ
ルス増殖培地、例えば０．５〜２ｍｇ／ｌの２，４−
Ｄ、０．１〜０．５ｍｇ／ｌのＢＡＰ、１〜５％のソル
ビトール、１〜５％のショ糖、０．５〜２ｇ／ｌのカゼ
イン分解物（ＣＨ）及び０．５〜１％の寒天を含むＭＳ
固形培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ，
１９６２）上で２〜４週間、照明下（１０００〜４００
０ｌｕｘ）、２５℃で培養し、３〜５ｍｍφの緑のカル
スを得る。このカルスをカナマイシンを含まない再分化
培地、例えば０．０１〜０．１ｍｇ／ｌのＮＡＡ、０．
５〜２ｍｇのＢＡＰ、１〜５％のソルビトール、０．５
〜２％のショ糖、０．０５〜０．５ｍｇ／ｌのＣＨ及び
０．５〜１％の寒天を含むＭＳ固形培地Ｒ培地上で、照
明下（１０００〜４０００ｌｕｘ）、２５℃で培養し再
生幼植物を得る。次いでこの幼植物を発根誘導培地、例
えば０．０５〜０．２ｍｇ／ｌのＮＡＡ、０．０１〜
０．０５ｍｇのＢＡＰ、１〜５％のショ糖及び０．２％
のゲルライト（Ｋｅｌｃｏ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ
Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．）を含むＭＳ固
形培地で発根させる。
シカ植物由来のプロトプラストは次のようにして調製す
ることが出来る。すなわち、無菌培養されたシュートよ
り常法に従い、例えばセルラーゼやペクチナーゼ等の細
胞壁分解酵素を含む等張溶液中に２５〜３０℃で５〜２
０時間酵素処理する。処理終了後濾過して未消化物を除
き、ろ液を遠心分離し、精製されたプロトプラストを得
ることが出来る（特願平４−２７６０６９号）。例えば
ナピン遺伝子やクルシフェリン遺伝子のアンチセンスＤ
ＮＡを導入してＢ．ｎａｐｕｓを形質転換する際には、
Ｂ．ｎａｐｕｓｃｖ． Ｗｅｓｔａｒ由来のプロトプラ
スト６×１０5 個／ｍｌに対し、上記のようにして調製
したナピンアンチセンスＤＮＡ発現ベクター、またはク
ルシフェリンアンチセンスＤＮＡ発現ベクター（例えば
４０〜８０μｇ／ｍｌ）を選抜遺伝子としてネオマイシ
ンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子（例えば４０〜
８０μｇ／ｍｌ）を含み、３０〜２００ｍＭ塩化カリウ
ム、０〜５０ｍＭ塩化マグネシウム、０．２〜０．６Ｍ
マンニトールを含む緩衝液などの液体媒体中に懸濁し、
これに電気パルスを印加してプラスミドをプロトプラス
ト中に導入する。電気パルス処理は、１００〜１０００
μＦのコンデンサーを用いて得られる２００〜１０００
Ｖ／ｃｍの初期電圧の直流パルスで、パルス幅１〜３０
ｍｓｅｃ程度の条件で印加するのが好適である。上述の
ようにして電気パルス処理したプロトプラストを例え
ば、０．０５〜０．５ｍｇ／ｌの２，４−ジクロロフェ
ノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、０．０２〜０．５ｍｇ／ｌ
のナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、０．１〜２．０ｍｇ／ｌ
のベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）及び０．４Ｍグルコ
ースを含むＫＭ液体培地（Ｐｌａｎｔａ，１２６，１０
５−１１０，１９７５）に１０5 個／ｍｌになるように
懸濁し、暗条件下２５℃で培養する。培養後３〜４週間
で、０．５〜１ｍｍφ程度のコロニーが形成される。そ
の際、例えば選択マーカー遺伝子であるネオマイシンフ
ォスフォトランスフェラーゼ遺伝子を導入しておいた場
合、培養開始２週間後にカナマイシンを１０〜５０μｇ
／ｍｌ程度培養液中に添加し、更に培養を続けることで
形質転換細胞の一次選択を効率良く行うことが出来る。
ついでこのコロニーを同濃度のカナマイシンを含んだカ
ルス増殖培地、例えば０．５〜２ｍｇ／ｌの２，４−
Ｄ、０．１〜０．５ｍｇ／ｌのＢＡＰ、１〜５％のソル
ビトール、１〜５％のショ糖、０．５〜２ｇ／ｌのカゼ
イン分解物（ＣＨ）及び０．５〜１％の寒天を含むＭＳ
固形培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ，
１９６２）上で２〜４週間、照明下（１０００〜４００
０ｌｕｘ）、２５℃で培養し、３〜５ｍｍφの緑のカル
スを得る。このカルスをカナマイシンを含まない再分化
培地、例えば０．０１〜０．１ｍｇ／ｌのＮＡＡ、０．
５〜２ｍｇのＢＡＰ、１〜５％のソルビトール、０．５
〜２％のショ糖、０．０５〜０．５ｍｇ／ｌのＣＨ及び
０．５〜１％の寒天を含むＭＳ固形培地Ｒ培地上で、照
明下（１０００〜４０００ｌｕｘ）、２５℃で培養し再
生幼植物を得る。次いでこの幼植物を発根誘導培地、例
えば０．０５〜０．２ｍｇ／ｌのＮＡＡ、０．０１〜
０．０５ｍｇのＢＡＰ、１〜５％のショ糖及び０．２％
のゲルライト（Ｋｅｌｃｏ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ
Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．）を含むＭＳ固
形培地で発根させる。
【００１９】この幼植物の葉からゲノムＤＮＡを、例え
ばＭｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｔ．，２１１，２７−３４，
１９８８に準じて単離し、このゲノムＤＮＡ３００ｎｇ
をＰＣＲ法に供することで、種子貯蔵タンパク質をコー
ドする遺伝子に対するアンチセンスＤＮＡの取り込まれ
た形質転換体を二次選択することが出来る。種子貯蔵タ
ンパク質がナピンである場合、用いるプライマーは、例
えば前述のｎａｐＡシークエンス１ｂｐ〜１９ｂｐとＮ
ＯＳのターミネーター中の一部、１５７９ｂｐから１５
９５ｂｐまで（５’−ＧＣＡＴＧＡＣＧＴＴＡＴＴＴＡ
ＴＧ−３’，ｐＣａＭＶＮＥＯ；Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａ
ｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３１９，７９１−７９３，１９８
６：配列表の配列番号５）を用い、種子貯蔵タンパク質
のクルシフェリンである場合、用いるプライマーは例え
ば前述のｃｒｕＡシークエンス１ｂｐから上流１８ｂｐ
と上記ＮＯＳターミネーターの一部を用い、アニーリン
グで増幅させる。
ばＭｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｔ．，２１１，２７−３４，
１９８８に準じて単離し、このゲノムＤＮＡ３００ｎｇ
をＰＣＲ法に供することで、種子貯蔵タンパク質をコー
ドする遺伝子に対するアンチセンスＤＮＡの取り込まれ
た形質転換体を二次選択することが出来る。種子貯蔵タ
ンパク質がナピンである場合、用いるプライマーは、例
えば前述のｎａｐＡシークエンス１ｂｐ〜１９ｂｐとＮ
ＯＳのターミネーター中の一部、１５７９ｂｐから１５
９５ｂｐまで（５’−ＧＣＡＴＧＡＣＧＴＴＡＴＴＴＡ
ＴＧ−３’，ｐＣａＭＶＮＥＯ；Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａ
ｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３１９，７９１−７９３，１９８
６：配列表の配列番号５）を用い、種子貯蔵タンパク質
のクルシフェリンである場合、用いるプライマーは例え
ば前述のｃｒｕＡシークエンス１ｂｐから上流１８ｂｐ
と上記ＮＯＳターミネーターの一部を用い、アニーリン
グで増幅させる。
【００２０】種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子に
対するアンチセンスＤＮＡの導入が確認された幼植物を
馴化後、温室にて育成することで、３〜６カ月後に種子
を形成される。導入遺伝子の存在は、ゲノミックＤＮＡ
のサザン解析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，９８，５０３−５１７，１９７５）によって確認
できる。例えばゲノムＤＮＡは（Ｗｏｌｂｏｔ ｅｔ
ａｌ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｔ．，２１１，２７−３
４，１９８８）に準じて調整し、その１０μｇを１００
μｌの反応系（組成はＴＯＹＯＢＯ Ｃｏ．による）に
おいて適当な制限酵素で切断する。これを一回エタノー
ル沈殿し７０％エタノールで洗浄、乾燥し再蒸留水１０
μｌに溶かして泳動用色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ）２μｌを加えて０．８％アガロースゲル電
気泳動（ＦＭＣ ＳＥＡＫＥＭＧＴＧ ＡＧＡＲＯＳ
Ｅ，ＴＢＥ緩衝液）で分画する。これをアマシャム社ハ
イボンドＮメンブレン取扱説明書の方法に準じて酸部分
分解、アルカリ変成してハイボンドＮ膜にブロットす
る。膜は４２℃で１時間以上プレハイブリダイゼーショ
ンする（５０％ホルムアミド×４ ＳＳＣＰ（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）１％ ＳＤＳ，０．５％
スキムミルク，０．２５ｍｇ／ｍｌ ウシ精子ＤＮ
Ａ）。プローブは形質転換に使用したプラスミドを上記
と同様に適当な制限酵素で切断し、エタノール沈殿し７
０％エタノールで洗浄、乾燥し再蒸留水５μｌに溶かし
て泳動用色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）
１μｌを加えて０．８％アガロースゲル電気泳動（ＦＭ
Ｃ ＳＥＡＫＥＭ ＧＴＧ ＡＧＡＲＯＳＥ，ＴＢＥ緩
衝液）で分画して、アンチセンスを含んだＤＮＡ断片、
またはその部分断片をアガロースゲルより回収する（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）。そのＤＮＡ断片
のうち２５ｎｇをアマシャム社マルチプライムラベリン
グキットと［α−32Ｐ］ｄＣＴＰにより調整する。熱変
性したプローブをハイブリダイゼーション液（０．１
ｇ，デキストラン硫酸／ｍｌ−プレハイブリ液）に混合
し、プレハイブリダイゼーション液をきった膜にまぶ
し、４２℃で一晩静置する。２×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤ
Ｓ １００ｍｌ中で１５分×２回室温で振とうし、更に
０．１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ １００ｍｌ中で１５
分×２回洗ってプローブの特異的な結合をオートラジオ
グラフィで検出する。
対するアンチセンスＤＮＡの導入が確認された幼植物を
馴化後、温室にて育成することで、３〜６カ月後に種子
を形成される。導入遺伝子の存在は、ゲノミックＤＮＡ
のサザン解析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，９８，５０３−５１７，１９７５）によって確認
できる。例えばゲノムＤＮＡは（Ｗｏｌｂｏｔ ｅｔ
ａｌ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｔ．，２１１，２７−３
４，１９８８）に準じて調整し、その１０μｇを１００
μｌの反応系（組成はＴＯＹＯＢＯ Ｃｏ．による）に
おいて適当な制限酵素で切断する。これを一回エタノー
ル沈殿し７０％エタノールで洗浄、乾燥し再蒸留水１０
μｌに溶かして泳動用色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ）２μｌを加えて０．８％アガロースゲル電
気泳動（ＦＭＣ ＳＥＡＫＥＭＧＴＧ ＡＧＡＲＯＳ
Ｅ，ＴＢＥ緩衝液）で分画する。これをアマシャム社ハ
イボンドＮメンブレン取扱説明書の方法に準じて酸部分
分解、アルカリ変成してハイボンドＮ膜にブロットす
る。膜は４２℃で１時間以上プレハイブリダイゼーショ
ンする（５０％ホルムアミド×４ ＳＳＣＰ（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）１％ ＳＤＳ，０．５％
スキムミルク，０．２５ｍｇ／ｍｌ ウシ精子ＤＮ
Ａ）。プローブは形質転換に使用したプラスミドを上記
と同様に適当な制限酵素で切断し、エタノール沈殿し７
０％エタノールで洗浄、乾燥し再蒸留水５μｌに溶かし
て泳動用色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）
１μｌを加えて０．８％アガロースゲル電気泳動（ＦＭ
Ｃ ＳＥＡＫＥＭ ＧＴＧ ＡＧＡＲＯＳＥ，ＴＢＥ緩
衝液）で分画して、アンチセンスを含んだＤＮＡ断片、
またはその部分断片をアガロースゲルより回収する（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）。そのＤＮＡ断片
のうち２５ｎｇをアマシャム社マルチプライムラベリン
グキットと［α−32Ｐ］ｄＣＴＰにより調整する。熱変
性したプローブをハイブリダイゼーション液（０．１
ｇ，デキストラン硫酸／ｍｌ−プレハイブリ液）に混合
し、プレハイブリダイゼーション液をきった膜にまぶ
し、４２℃で一晩静置する。２×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤ
Ｓ １００ｍｌ中で１５分×２回室温で振とうし、更に
０．１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ １００ｍｌ中で１５
分×２回洗ってプローブの特異的な結合をオートラジオ
グラフィで検出する。
【００２１】種子における種子貯蔵タンパク質をコード
する遺伝子に対するアンチセンスＤＮＡの発現は、種子
全タンパク質を常法、例えばＮａｔｕｒｅ，２２７，６
８０−６８５，１９７０に準じてサンプルバッファー
（６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８，２％
ＳＤＳ，１０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，５％２−メルカ
プトエタノール，０．０００１％ ブロモフェノールブ
ルー）１００μｌ／種子１粒を加えて抽出し、そのうち
１５μｇをＳＤＳ Ｐｏｌｙａｃｒｉｌａｍｉｄｅ Ｇ
ｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｌｅｓｉｓ（Ｎａｔｕｒ
ｅ，２２７，６８０−６８５，１９７０）により分画す
る。このゲルを一晩クマシー染色（０．２５％クマシー
ブリリアントブルー，４５％エタノール，１０％酢酸）
した後脱色液（エタノール：酢酸：水＝２５：８：６
５）につけて適度なバンドの濃さまで脱色することによ
り行うことができる。ナピン遺伝子のアンチセンスＤＮ
Ａを導入してＢ．ｎａｐｕｓを形質転換した際には、ナ
ピンタンパク質はこの方法により４ｋＤ付近にα鎖が、
９ｋＤ付近にβ鎖が分画される。クルシフェリン遺伝子
のアンチセンスＤＮＡを導入した際には、クルシフェリ
ンタンパク質は２０ｋＤ付近に３〜４本のα鎖が、３０
ｋＤ付近に３〜４本のβ鎖が分画される。これらのバン
ドの濃さを非形質転換体のものと比較することによりナ
ピンやクルシフェリン含量の変化を推定し、ナピンアン
チセンスＤＮＡ、クルシフェリンアンチセンスＤＮＡの
発現の確認、及び発現の程度を判定することが出来る。
上記のようにして得られた本発明の油料作物は、アミノ
酸組成及び／または脂肪酸組成が栄養的に有利に改変さ
れる。例えば、リノ−ル酸，リノレン酸等の不飽和脂肪
酸含量を増加させたり、リジン、メチオニン、システイ
ン等の必須アミノ酸の含量を増加させることにより、油
料作物の栄養価を高めることが可能である。
する遺伝子に対するアンチセンスＤＮＡの発現は、種子
全タンパク質を常法、例えばＮａｔｕｒｅ，２２７，６
８０−６８５，１９７０に準じてサンプルバッファー
（６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８，２％
ＳＤＳ，１０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，５％２−メルカ
プトエタノール，０．０００１％ ブロモフェノールブ
ルー）１００μｌ／種子１粒を加えて抽出し、そのうち
１５μｇをＳＤＳ Ｐｏｌｙａｃｒｉｌａｍｉｄｅ Ｇ
ｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｌｅｓｉｓ（Ｎａｔｕｒ
ｅ，２２７，６８０−６８５，１９７０）により分画す
る。このゲルを一晩クマシー染色（０．２５％クマシー
ブリリアントブルー，４５％エタノール，１０％酢酸）
した後脱色液（エタノール：酢酸：水＝２５：８：６
５）につけて適度なバンドの濃さまで脱色することによ
り行うことができる。ナピン遺伝子のアンチセンスＤＮ
Ａを導入してＢ．ｎａｐｕｓを形質転換した際には、ナ
ピンタンパク質はこの方法により４ｋＤ付近にα鎖が、
９ｋＤ付近にβ鎖が分画される。クルシフェリン遺伝子
のアンチセンスＤＮＡを導入した際には、クルシフェリ
ンタンパク質は２０ｋＤ付近に３〜４本のα鎖が、３０
ｋＤ付近に３〜４本のβ鎖が分画される。これらのバン
ドの濃さを非形質転換体のものと比較することによりナ
ピンやクルシフェリン含量の変化を推定し、ナピンアン
チセンスＤＮＡ、クルシフェリンアンチセンスＤＮＡの
発現の確認、及び発現の程度を判定することが出来る。
上記のようにして得られた本発明の油料作物は、アミノ
酸組成及び／または脂肪酸組成が栄養的に有利に改変さ
れる。例えば、リノ−ル酸，リノレン酸等の不飽和脂肪
酸含量を増加させたり、リジン、メチオニン、システイ
ン等の必須アミノ酸の含量を増加させることにより、油
料作物の栄養価を高めることが可能である。
【００２２】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、
本発明はその要旨を越えない限り以下に制約されるもの
ではない。 実施例 １ ベクターの構築（ｐＮＡＫＭ）（図１参
照） ナピンプロモーター及びナピン遺伝子の一部をｎａｐＡ
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，１２１９６−１
２２０１，１９８７）のシークエンスを基にＰＣＲ法で
単離した。まず、Ｂ．ｎａｐｕｓ ｃｖ． Ｗｅｓｔａ
ｒの葉からＣＴＡＢ法（Ｆｏｃｕｓ，１２，１３−１
５，１９８９）によりゲノムＤＮＡを抽出する。すなわ
ち、乳鉢に入れた葉約５ｇに液体窒素を適当量加え乳棒
を用いてよく摺り潰す。それにＤＮＡ抽出液（２％ Ｃ
ＴＡＢ、１．４Ｍ ＮａＣｌ、０．２％ ２−メルカプ
トエタノール、２０ｍＭ ＥＤＴＡおよび１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８））を１５ｍｌ加えて更に摺
り潰し、抽出物をポリプロピレン性のチューブに移して
６５℃で１時間以上、ときどき振とうしながら放置す
る。それに抽出液と等量のフェノール（１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）および１ｍＭ ＥＤＴＡで飽和
したもの）：クロロホルム：イソアミルアルコール＝２
５：２４：１を加えてよく混合し、１５０００ｒｐｍで
１５分遠心分離する（ＫＵＢＯＴＡ，ＫＲ−２００００
Ｔ）。上清を別の遠心管にとり、その２／３容のイソプ
ロパノールを加えて３０分以上室温に静置した後、１４
０００ｒｐｍで２０分遠心分離して、上澄みを捨て沈殿
を得る。これに適当量の７０％エタノールを加えて沈殿
を洗浄した後、乾燥させる。この沈殿を１ｇ／ｍｌ塩化
セシウム加えたＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．０）および１ｍＭ ＥＤＴＡ）７５０μｌに溶か
し、１０ｍｇ／ｍｌ臭化エチジウムを一滴加えて１００
０００ｒｐｍで一晩遠心する（ＢＥＣＫＭＡＮ，ＴＬ−
１００）。バンド部分を回収し、ｎ−ブタノールで臭化
エチジウムを除いて透析膜（三光純薬）に移し、水中で
脱塩する。さらに、エタノール沈殿（３０ｍＭ 酢酸ナ
トリウム存在下に２．５容のエタノールを加え、１５０
００ｒｐｍ １５分冷却遠心分離し沈殿を回収する）に
よりゲノムＤＮＡを回収し、１μｇ／ｍｌになるように
ＴＥ溶液で溶かす。
本発明はその要旨を越えない限り以下に制約されるもの
ではない。 実施例 １ ベクターの構築（ｐＮＡＫＭ）（図１参
照） ナピンプロモーター及びナピン遺伝子の一部をｎａｐＡ
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，１２１９６−１
２２０１，１９８７）のシークエンスを基にＰＣＲ法で
単離した。まず、Ｂ．ｎａｐｕｓ ｃｖ． Ｗｅｓｔａ
ｒの葉からＣＴＡＢ法（Ｆｏｃｕｓ，１２，１３−１
５，１９８９）によりゲノムＤＮＡを抽出する。すなわ
ち、乳鉢に入れた葉約５ｇに液体窒素を適当量加え乳棒
を用いてよく摺り潰す。それにＤＮＡ抽出液（２％ Ｃ
ＴＡＢ、１．４Ｍ ＮａＣｌ、０．２％ ２−メルカプ
トエタノール、２０ｍＭ ＥＤＴＡおよび１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８））を１５ｍｌ加えて更に摺
り潰し、抽出物をポリプロピレン性のチューブに移して
６５℃で１時間以上、ときどき振とうしながら放置す
る。それに抽出液と等量のフェノール（１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）および１ｍＭ ＥＤＴＡで飽和
したもの）：クロロホルム：イソアミルアルコール＝２
５：２４：１を加えてよく混合し、１５０００ｒｐｍで
１５分遠心分離する（ＫＵＢＯＴＡ，ＫＲ−２００００
Ｔ）。上清を別の遠心管にとり、その２／３容のイソプ
ロパノールを加えて３０分以上室温に静置した後、１４
０００ｒｐｍで２０分遠心分離して、上澄みを捨て沈殿
を得る。これに適当量の７０％エタノールを加えて沈殿
を洗浄した後、乾燥させる。この沈殿を１ｇ／ｍｌ塩化
セシウム加えたＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．０）および１ｍＭ ＥＤＴＡ）７５０μｌに溶か
し、１０ｍｇ／ｍｌ臭化エチジウムを一滴加えて１００
０００ｒｐｍで一晩遠心する（ＢＥＣＫＭＡＮ，ＴＬ−
１００）。バンド部分を回収し、ｎ−ブタノールで臭化
エチジウムを除いて透析膜（三光純薬）に移し、水中で
脱塩する。さらに、エタノール沈殿（３０ｍＭ 酢酸ナ
トリウム存在下に２．５容のエタノールを加え、１５０
００ｒｐｍ １５分冷却遠心分離し沈殿を回収する）に
よりゲノムＤＮＡを回収し、１μｇ／ｍｌになるように
ＴＥ溶液で溶かす。
【００２３】このゲノムＤＮＡ３００ｎｇをＰＣＲ法に
供した。この時、プライマーはｎａｐＡ（Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，１２１９６−１２２０１，１
９８７）の１から１９ｂｐの１９塩基（５’−ＡＡＧＣ
ＴＴＴＣＴＴＣＡＴＣＧＧＴＧＡ−３’：配列表の配列
番号１）と、１１２５から１１４５ｂｐの２１塩基
（５’−ＣＡＡＧＡＴＴＡＡＡＡＡＣＡＴＡＣＡＣＧＡ
−３’：配列表の配列番号２）の相補鎖配列をナピンプ
ロモーター用に、また１１１１から１１３１ｂｐの２０
塩基（５’−ＣＴＣＡＴＣＡＡＴＡＣＡＡＡＣＡＡＧＡ
Ｔ−３’：配列表の配列番号３）と、１７６３から１７
８３ｂｐの２０塩基（５’−ＴＡＴＧＴＡＡＧＧＴＴＴ
ＴＡＴＣＴＡＧＧ−３’：配列表の配列番号４）の相補
鎖配列をナピンアンチセンス用に用いた。ＰＣＲ法はＰ
ｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡ Ｔｈ
ｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ機を用い、同社のＧｅｎｅ−
ＡｍｐＫｉｔのプロトコールにより試薬を混合し、反応
液１００μｌを、ナピンプロモーター用には熱変性９４
℃で１分、アニーリングは５２℃で２分、耐熱性ポリメ
ラーゼによる伸長反応は７２℃で３分のサイクルを３０
回、ナピンアンチセンス用にはアニーリング温度を５０
℃にして行った。反応液の１／２０量をアガロースゲル
電気泳動で分析し増幅したバンドを検出した。プロモー
ターは約１．１ｋｂ，ナピンアンチセンスは約０．７ｋ
ｂのバンドとなる。
供した。この時、プライマーはｎａｐＡ（Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，１２１９６−１２２０１，１
９８７）の１から１９ｂｐの１９塩基（５’−ＡＡＧＣ
ＴＴＴＣＴＴＣＡＴＣＧＧＴＧＡ−３’：配列表の配列
番号１）と、１１２５から１１４５ｂｐの２１塩基
（５’−ＣＡＡＧＡＴＴＡＡＡＡＡＣＡＴＡＣＡＣＧＡ
−３’：配列表の配列番号２）の相補鎖配列をナピンプ
ロモーター用に、また１１１１から１１３１ｂｐの２０
塩基（５’−ＣＴＣＡＴＣＡＡＴＡＣＡＡＡＣＡＡＧＡ
Ｔ−３’：配列表の配列番号３）と、１７６３から１７
８３ｂｐの２０塩基（５’−ＴＡＴＧＴＡＡＧＧＴＴＴ
ＴＡＴＣＴＡＧＧ−３’：配列表の配列番号４）の相補
鎖配列をナピンアンチセンス用に用いた。ＰＣＲ法はＰ
ｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡ Ｔｈ
ｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ機を用い、同社のＧｅｎｅ−
ＡｍｐＫｉｔのプロトコールにより試薬を混合し、反応
液１００μｌを、ナピンプロモーター用には熱変性９４
℃で１分、アニーリングは５２℃で２分、耐熱性ポリメ
ラーゼによる伸長反応は７２℃で３分のサイクルを３０
回、ナピンアンチセンス用にはアニーリング温度を５０
℃にして行った。反応液の１／２０量をアガロースゲル
電気泳動で分析し増幅したバンドを検出した。プロモー
ターは約１．１ｋｂ，ナピンアンチセンスは約０．７ｋ
ｂのバンドとなる。
【００２４】これらのＤＮＡ断片をエタノール沈殿で回
収し、ｐＵＣ１９プラスミドのＨｉｎｃII及びＳｍａＩ
にそれぞれクローニングした（ｐＮａｐ，ｐＮＡＳ）。
次に、ｐＮＡＳ１０μｇをＸｂａＩ，ＫｐｎＩで切断し
（ＴＹＯＢＯの添付したバファーを用い、１００μｌの
スケールで３７℃３時間反応）、１％ ＳｅａｋｅｍＧ
ＴＧアガロース（ＦＭＣ）ゲル電気泳動（１×ＴＢＥバ
ッファー，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ）で分画（ＭＵＰＩＤ，コスモバイオ，１
００Ｖ，３０分）し、ゲルを０．５μｇ／ｌ臭化エチジ
ウムで染色してナピンアンチセンス部分を切出し、透析
膜に移して４℃１２０ｍＡで１時間の電気泳動によりＤ
ＮＡを回収した。これに等容量のフェノールを加えて振
とうし、層を分離して水層を回収する。更にクロロホル
ムなどでこのＤＮＡ断片を精製し、エタノール沈殿後５
μｌの水に溶かした。このうちの１μｌと同じ酵素で処
理し回収したｐＮａｐ２μｌをＴＡＫＡＲＡライゲーシ
ョンキット（ＴＡＫＡＴＲＡの処方による３０μｌ）を
用いて連結した（４℃一晩）。
収し、ｐＵＣ１９プラスミドのＨｉｎｃII及びＳｍａＩ
にそれぞれクローニングした（ｐＮａｐ，ｐＮＡＳ）。
次に、ｐＮＡＳ１０μｇをＸｂａＩ，ＫｐｎＩで切断し
（ＴＹＯＢＯの添付したバファーを用い、１００μｌの
スケールで３７℃３時間反応）、１％ ＳｅａｋｅｍＧ
ＴＧアガロース（ＦＭＣ）ゲル電気泳動（１×ＴＢＥバ
ッファー，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ）で分画（ＭＵＰＩＤ，コスモバイオ，１
００Ｖ，３０分）し、ゲルを０．５μｇ／ｌ臭化エチジ
ウムで染色してナピンアンチセンス部分を切出し、透析
膜に移して４℃１２０ｍＡで１時間の電気泳動によりＤ
ＮＡを回収した。これに等容量のフェノールを加えて振
とうし、層を分離して水層を回収する。更にクロロホル
ムなどでこのＤＮＡ断片を精製し、エタノール沈殿後５
μｌの水に溶かした。このうちの１μｌと同じ酵素で処
理し回収したｐＮａｐ２μｌをＴＡＫＡＲＡライゲーシ
ョンキット（ＴＡＫＡＴＲＡの処方による３０μｌ）を
用いて連結した（４℃一晩）。
【００２５】この１０μｌを大腸菌コンピテントセルＤ
Ｈ５α（ＢＲＬ）に形質転換し（Ｉｎｏｕｅ，Ｇｅｎ
ｅ，９６，２３−２９，１９９０）、アンピシリン５０
μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｉｎｇ）上でプラスミドを持つコロニーを選抜し
た。これらのコロニーに由来する１ｍｌ培養液（ＬＢ培
地）からＤＮＡをアルカリＳＤＳ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｉｎｇ）で調製し、その１／５０量をＨｉｎ
ｄIII、ＫｐｎＩ 各１Ｕ（ＴＯＹＯＢＯ）で切断して
（１０μｌ反応系 ＲＮａｓｅ０.５μｇ／ｍｌを含む
３７℃３０分）、１.８ｋｂのバンドを生じるクローン
を選んだ。このプラスミドはナピンプロモーターの後に
ナピン遺伝子の一部が逆向きに連結されている。ターミ
ネーターはｐＢＩ２２１由来のＮＯＳのものを用いた
（ＴＯＹＯＢＯ）。
Ｈ５α（ＢＲＬ）に形質転換し（Ｉｎｏｕｅ，Ｇｅｎ
ｅ，９６，２３−２９，１９９０）、アンピシリン５０
μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｉｎｇ）上でプラスミドを持つコロニーを選抜し
た。これらのコロニーに由来する１ｍｌ培養液（ＬＢ培
地）からＤＮＡをアルカリＳＤＳ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｉｎｇ）で調製し、その１／５０量をＨｉｎ
ｄIII、ＫｐｎＩ 各１Ｕ（ＴＯＹＯＢＯ）で切断して
（１０μｌ反応系 ＲＮａｓｅ０.５μｇ／ｍｌを含む
３７℃３０分）、１.８ｋｂのバンドを生じるクローン
を選んだ。このプラスミドはナピンプロモーターの後に
ナピン遺伝子の一部が逆向きに連結されている。ターミ
ネーターはｐＢＩ２２１由来のＮＯＳのものを用いた
（ＴＯＹＯＢＯ）。
【００２６】ｐＢＩ２２１ １０μｇをＳａｃＩで切断
し（ＴＯＹＯＢＯの添付したバファーを用い、１２０μ
ｌのスケールで３７℃一晩反応）、フェノール及びクロ
ロホルムでこのＤＮＡ断片を精製し、エタノールで沈殿
後、２０μｌの水に溶かした。このうち８μｌをＴＡＫ
ＡＲＡブランテイングキット（ＴＡＫＡＲＡの処方によ
る１０μｌスケール）を用いてＤＮＡ断片の両端を平滑
末端にした。この反応液から平滑端ＤＮＡ断片を精製回
収し、５μｌの水に溶かして、そのうち２μｌをＫｐｎ
Ｉリンカー（ＴＯＹＯＢＯ）１μｌとＴＡＫＡＲＡライ
ゲーションキットを用いて連結した。ＫｐｎＩリンカー
を接続した断片を更に精製回収し、水５μｌに溶解して
その全量をＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで切断し、ベクタ
ー部分とＮＯＳのターミネーター部分を含むＤＮＡ断片
を上記のように精製した。
し（ＴＯＹＯＢＯの添付したバファーを用い、１２０μ
ｌのスケールで３７℃一晩反応）、フェノール及びクロ
ロホルムでこのＤＮＡ断片を精製し、エタノールで沈殿
後、２０μｌの水に溶かした。このうち８μｌをＴＡＫ
ＡＲＡブランテイングキット（ＴＡＫＡＲＡの処方によ
る１０μｌスケール）を用いてＤＮＡ断片の両端を平滑
末端にした。この反応液から平滑端ＤＮＡ断片を精製回
収し、５μｌの水に溶かして、そのうち２μｌをＫｐｎ
Ｉリンカー（ＴＯＹＯＢＯ）１μｌとＴＡＫＡＲＡライ
ゲーションキットを用いて連結した。ＫｐｎＩリンカー
を接続した断片を更に精製回収し、水５μｌに溶解して
その全量をＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで切断し、ベクタ
ー部分とＮＯＳのターミネーター部分を含むＤＮＡ断片
を上記のように精製した。
【００２７】この断片０．１μｇと先のナピンプロモー
ター及びナピンアンチセンスを含んだＤＮＡ断片０．１
μｇとを連結した（ｐＮＡＡＳ）。エレクトロポーレー
ション法で形質転換を行う場合にはこのプラスミドを用
いる。アグロバクテリウム法に用いるプラスミドは次の
ように構築した。大腸菌選択マーカーにテトラサイクリ
ン抵抗性遺伝子及びスペクチノマイシン抵抗性遺伝子
を、植物選択用マーカーにノパリン抵抗性遺伝子を持つ
プラスミド（ｐＫＭ４２４；Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒ
ｅｐ．，１０，２８６−２９０，１９９１；ｐＬＡＮ４
２１の目的遺伝子部分（３５ＳP −ＧＵＳ−ＮＯＳT ）
をマルチクローニングサイトと交換したもの）をＨｉｎ
ｄIII，ＥｃｏＲＩで切断し、フェノール処理及びエタ
ノール沈殿によりＤＮＡを精製する。同じ酵素処理をし
たｐＮＡＡＳプラスミドからナピンプロモーターとナピ
ンアンチセンスを含むＤＮＡ断片を回収し、先のｐＫＭ
４２４と連結させる（ｐＮＡＫＭ）。
ター及びナピンアンチセンスを含んだＤＮＡ断片０．１
μｇとを連結した（ｐＮＡＡＳ）。エレクトロポーレー
ション法で形質転換を行う場合にはこのプラスミドを用
いる。アグロバクテリウム法に用いるプラスミドは次の
ように構築した。大腸菌選択マーカーにテトラサイクリ
ン抵抗性遺伝子及びスペクチノマイシン抵抗性遺伝子
を、植物選択用マーカーにノパリン抵抗性遺伝子を持つ
プラスミド（ｐＫＭ４２４；Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒ
ｅｐ．，１０，２８６−２９０，１９９１；ｐＬＡＮ４
２１の目的遺伝子部分（３５ＳP −ＧＵＳ−ＮＯＳT ）
をマルチクローニングサイトと交換したもの）をＨｉｎ
ｄIII，ＥｃｏＲＩで切断し、フェノール処理及びエタ
ノール沈殿によりＤＮＡを精製する。同じ酵素処理をし
たｐＮＡＡＳプラスミドからナピンプロモーターとナピ
ンアンチセンスを含むＤＮＡ断片を回収し、先のｐＫＭ
４２４と連結させる（ｐＮＡＫＭ）。
【００２８】このプラスミドをアグロバクテリウムＥＨ
Ａ１０１株に形質転換させる。ＥＨＡ１０１のシングル
コロニーを一晩ＹＥＢ培地（０．１％ Ｙｅａｓｔ ｅ
ｘｔｒａｃｔ，０．５％ Ｂｅｅｆ ｅｘｔｒａｃｔ，
０．５％ Ｐｅｐｔｏｎｅ及び０．５％ Ｓｕｃｒｏｓ
ｅ（ｐＨ７．０））で培養し、その１ｍｌを２５μｇ／
ｍｌのカナマイシン（Ｋｍ）、１２．５μｇ／ｍｌのク
ロラムフェニコール（Ｃｍ）、２５μｇ／ｍｌのスペク
チノマイシン（Ｓｐ）及び１μｇ／ｍｌのテトラサイク
リン（Ｔｃ）を含んだＹＥＢ培地に加えて、３０℃５〜
６時間培養する。その培養液を４０００ｒｐｍ、５分遠
心分離し、その沈殿に２０ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ８）を加え洗浄する。回収した沈殿を４０
０μｌのＹＥＢ培地に懸濁し、この懸濁液９０μｌと先
のプラスミド（ｐＮＡＫＭ）１０ｎｇ／１０μｌを合わ
せて−１１０℃で５分、３７℃で２５分処理する。これ
にＹＥＢ４００μｌ加えて、３０℃で一晩振とう培養す
る。この培養液を５０μｌを５０μｇ／ｍｌのカナマイ
シン（Ｋｍ）、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール
（Ｃｍ）、５０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシン（Ｓ
ｐ）及び２μｇ／ｍｌのテトラサイクリン（Ｔｃ）を含
んだＹＥＢ寒天培地にまいて３０℃二晩培養し、プラス
ミドを含んだコロニーを選択する（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ）。これらのコロニーに由来する１ｍｌ培養液（Ｙ
ＥＢ培地）からＤＮＡをアルカリＳＤＳ法（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｉｎｇ）で調製し、その全量をＨｉｎ
ｄIII、ＥｃｏＲＩ 各１Ｕ（ＴＯＹＯＢＯ）で切断し
て（１０μｌ反応系 ＲＮａｓｅ０．５μｇ／ｍｌを含
む３７℃３０分）、２．１ｋｂのバンドを生じるクロー
ンを選んだ。
Ａ１０１株に形質転換させる。ＥＨＡ１０１のシングル
コロニーを一晩ＹＥＢ培地（０．１％ Ｙｅａｓｔ ｅ
ｘｔｒａｃｔ，０．５％ Ｂｅｅｆ ｅｘｔｒａｃｔ，
０．５％ Ｐｅｐｔｏｎｅ及び０．５％ Ｓｕｃｒｏｓ
ｅ（ｐＨ７．０））で培養し、その１ｍｌを２５μｇ／
ｍｌのカナマイシン（Ｋｍ）、１２．５μｇ／ｍｌのク
ロラムフェニコール（Ｃｍ）、２５μｇ／ｍｌのスペク
チノマイシン（Ｓｐ）及び１μｇ／ｍｌのテトラサイク
リン（Ｔｃ）を含んだＹＥＢ培地に加えて、３０℃５〜
６時間培養する。その培養液を４０００ｒｐｍ、５分遠
心分離し、その沈殿に２０ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ８）を加え洗浄する。回収した沈殿を４０
０μｌのＹＥＢ培地に懸濁し、この懸濁液９０μｌと先
のプラスミド（ｐＮＡＫＭ）１０ｎｇ／１０μｌを合わ
せて−１１０℃で５分、３７℃で２５分処理する。これ
にＹＥＢ４００μｌ加えて、３０℃で一晩振とう培養す
る。この培養液を５０μｌを５０μｇ／ｍｌのカナマイ
シン（Ｋｍ）、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール
（Ｃｍ）、５０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシン（Ｓ
ｐ）及び２μｇ／ｍｌのテトラサイクリン（Ｔｃ）を含
んだＹＥＢ寒天培地にまいて３０℃二晩培養し、プラス
ミドを含んだコロニーを選択する（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ）。これらのコロニーに由来する１ｍｌ培養液（Ｙ
ＥＢ培地）からＤＮＡをアルカリＳＤＳ法（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｉｎｇ）で調製し、その全量をＨｉｎ
ｄIII、ＥｃｏＲＩ 各１Ｕ（ＴＯＹＯＢＯ）で切断し
て（１０μｌ反応系 ＲＮａｓｅ０．５μｇ／ｍｌを含
む３７℃３０分）、２．１ｋｂのバンドを生じるクロー
ンを選んだ。
【００２９】実施例 ２ 形質転換とアンチセンスナピ
ンＤＮＡの導入されたカルスの選択及び再生Ｂ ．ｎａｐｕｓ ｃｖ． Ｗｅｓｔａｒの種子を、１０
％過酸化水素水で２５分処理して乾燥させ、ＭＳ寒天培
地上で照明下（１０００〜４０００ｌｕｘ）２〜３週間
培養する。その無菌下胚軸を２〜５ｍｍの長さに切断
し、前培養培地（Ｂ５−Ｖｉｔａｍｉｎｅ；Ｇａｍｂｏ
ｒｇ ｅｔ ａｌ，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．，５
０，１５１−１５８，１９６８、１ｍｇ／ｌ ２，４−
Ｄ、３％ Ｓｕｃｒｏｓｅ及び０．７％ Ａｇａｒｏｓ
ｅを含むＭＳ寒天培地上に適当量のタバコ培養細胞ＢＹ
−２を敷き詰め滅菌漉紙をかぶせた培地）上に置いて、
明所下一晩前培養する。ｐＮＡＫＭプラスミドを有した
アグロバクテリウムの１コロニーを、抗生物質を含むＹ
ＥＢ液体培地５ｍｌ中で３０℃一晩培養する。この培養
液を３０００ｒｐｍ、１０分遠心分離し、３％のショ糖
を含むＭＳ液体培地で一回洗浄した後、同じＭＳ培地に
懸濁する。このアグロバクテリウム懸濁液に先の前培養
した下胚軸を入れて、２５℃で５〜２０分振とう培養す
る。この溶液を濾過し、下胚軸のみ無菌ペーパータオル
上で余分なアグロバクテリウムを取り除き、元の前培養
培地上で三晩同時培養し、下胚軸にアグロバクテリウム
を感染させる。この後、下胚軸を除菌培地（Ｂ５−Ｖｉ
ｔａｍｉｎｅ、１ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄ、３％ Ｓｕｃ
ｒｏｓｅ、０．７％ Ａｇａｒｏｓｅ及び５００ｍｇ／
ｌＣａｒｂｅｎｉｃｉｌｉｎｅ（Ｃｂ）を含んだＭＳ寒
天培地）上に移して三日培養して、アグロバクテリウム
の増殖を抑える。
ンＤＮＡの導入されたカルスの選択及び再生Ｂ ．ｎａｐｕｓ ｃｖ． Ｗｅｓｔａｒの種子を、１０
％過酸化水素水で２５分処理して乾燥させ、ＭＳ寒天培
地上で照明下（１０００〜４０００ｌｕｘ）２〜３週間
培養する。その無菌下胚軸を２〜５ｍｍの長さに切断
し、前培養培地（Ｂ５−Ｖｉｔａｍｉｎｅ；Ｇａｍｂｏ
ｒｇ ｅｔ ａｌ，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．，５
０，１５１−１５８，１９６８、１ｍｇ／ｌ ２，４−
Ｄ、３％ Ｓｕｃｒｏｓｅ及び０．７％ Ａｇａｒｏｓ
ｅを含むＭＳ寒天培地上に適当量のタバコ培養細胞ＢＹ
−２を敷き詰め滅菌漉紙をかぶせた培地）上に置いて、
明所下一晩前培養する。ｐＮＡＫＭプラスミドを有した
アグロバクテリウムの１コロニーを、抗生物質を含むＹ
ＥＢ液体培地５ｍｌ中で３０℃一晩培養する。この培養
液を３０００ｒｐｍ、１０分遠心分離し、３％のショ糖
を含むＭＳ液体培地で一回洗浄した後、同じＭＳ培地に
懸濁する。このアグロバクテリウム懸濁液に先の前培養
した下胚軸を入れて、２５℃で５〜２０分振とう培養す
る。この溶液を濾過し、下胚軸のみ無菌ペーパータオル
上で余分なアグロバクテリウムを取り除き、元の前培養
培地上で三晩同時培養し、下胚軸にアグロバクテリウム
を感染させる。この後、下胚軸を除菌培地（Ｂ５−Ｖｉ
ｔａｍｉｎｅ、１ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄ、３％ Ｓｕｃ
ｒｏｓｅ、０．７％ Ａｇａｒｏｓｅ及び５００ｍｇ／
ｌＣａｒｂｅｎｉｃｉｌｉｎｅ（Ｃｂ）を含んだＭＳ寒
天培地）上に移して三日培養して、アグロバクテリウム
の増殖を抑える。
【００３０】次にこれらの下胚軸を一次選択培地（Ｂ５
−Ｖｉｔａｍｉｎｅ、３ｍｇ／ｌＢＡＰ、１ｍｇ／ｌ
Ｚｅａｔｉｎｅ、２％ Ｓｕｃｒｏｓｅ、０．７％ Ａ
ｇａｒｏｓｅ、３０ｍｇ／ｌ Ｋｍ及び５００ｍｇ／ｌ
Ｃｂを含むＭＳ寒天培地）上に移して２週間培養す
る。これによりアグロバクテリウムの感染したｐＮＡＫ
Ｍプラスミドを持った形質転換植物細胞のみ分裂増殖し
て緑色のカルスを形成することができる。
−Ｖｉｔａｍｉｎｅ、３ｍｇ／ｌＢＡＰ、１ｍｇ／ｌ
Ｚｅａｔｉｎｅ、２％ Ｓｕｃｒｏｓｅ、０．７％ Ａ
ｇａｒｏｓｅ、３０ｍｇ／ｌ Ｋｍ及び５００ｍｇ／ｌ
Ｃｂを含むＭＳ寒天培地）上に移して２週間培養す
る。これによりアグロバクテリウムの感染したｐＮＡＫ
Ｍプラスミドを持った形質転換植物細胞のみ分裂増殖し
て緑色のカルスを形成することができる。
【００３１】更にこれらの下胚軸を二次選択培地（一次
選択培地のＳｕｃｒｏｓｅ含量を２％から１％に減少さ
せた培地）上に移し、３週間培養する。この時形質転換
したカルスは更に大きくなり、次にこのカルス部分のみ
を発芽培地（二次選択培地よりＫｍを除き、Ｃｂを５０
０ｍｇ／ｌ〜２５０ｍｇ／ｌに減少させたもの）に移
す。再生した芽は伸長培地（０．１ｍｇ／ｌ ＢＡＰ、
２５０ｍｇ／ｌ Ｃｂ及び０．７％ Ａｇａｒｏｓを含
むＢ５寒天培地）上で成長させ、次に発根培地に移した
後馴化させる。
選択培地のＳｕｃｒｏｓｅ含量を２％から１％に減少さ
せた培地）上に移し、３週間培養する。この時形質転換
したカルスは更に大きくなり、次にこのカルス部分のみ
を発芽培地（二次選択培地よりＫｍを除き、Ｃｂを５０
０ｍｇ／ｌ〜２５０ｍｇ／ｌに減少させたもの）に移
す。再生した芽は伸長培地（０．１ｍｇ／ｌ ＢＡＰ、
２５０ｍｇ／ｌ Ｃｂ及び０．７％ Ａｇａｒｏｓを含
むＢ５寒天培地）上で成長させ、次に発根培地に移した
後馴化させる。
【００３２】これらの再生植物体からゲノムＤＮＡを調
製し、導入したプラスミドの１部をプライマーとしたＰ
ＣＲを行うアンチセンスナピンＤＮＡの導入された植物
を更に選抜した。ゲノムＤＮＡをＭｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅ
ｎｅｔ．，２１１，２７−３４，１９８８に準じて、次
のように調製する。カナマイシン耐性植物５０〜１００
ｍｇを緩衝液（１５％ ショ糖、５０ｍＭ トリス−塩
酸（ｐＨ８）、５０ｍＭ ＮａＥＤＴＡ及び５００ｍＭ
塩化ナトリウム）中で摩砕し、核分画を遠心分離す
る。これを界面活性剤（１．５％ ＳＤＳ、２０ｍＭ
トリス−塩酸（ｐＨ８）及び１０ｍＭ ＥＤＴＡ）で処
理し、遊離した核内成分を０．６容のイソプロパノール
で沈殿させて核酸を得、これを７０％エタノールで洗浄
後乾燥させてゲノム分画とする。この分画３００ｎｇを
ＰＣＲ法に供した。この時プライマーはナピンプロモー
ター部分の１ｂｐから上流１９塩基（配列表の配列番号
１）と、ＮＯＳターミネーターの１５７９ｂｐから１５
９５ｂｐまで（配列表の配列番号５：ｐＣａＭＶＮＥ
Ｏ；Ｆｒｏｍｍ，Ｎａｔｕｒｅ，３１９，７９１−７９
３，１９８６）の相補鎖配列を用いた。ＰＣＲは熱変性
が９４℃で１分、アニーリングが４５℃で２分、伸長反
応を７２℃３分で行った。反応後反応液１０μｌをアガ
ロースゲル電気泳動で分析し、増幅したバンドを検出し
た。ＰＣＲ法で導入遺伝子が確認された植物体を鉢上げ
したところ、３〜６ヶ月後に種子を形成した。
製し、導入したプラスミドの１部をプライマーとしたＰ
ＣＲを行うアンチセンスナピンＤＮＡの導入された植物
を更に選抜した。ゲノムＤＮＡをＭｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅ
ｎｅｔ．，２１１，２７−３４，１９８８に準じて、次
のように調製する。カナマイシン耐性植物５０〜１００
ｍｇを緩衝液（１５％ ショ糖、５０ｍＭ トリス−塩
酸（ｐＨ８）、５０ｍＭ ＮａＥＤＴＡ及び５００ｍＭ
塩化ナトリウム）中で摩砕し、核分画を遠心分離す
る。これを界面活性剤（１．５％ ＳＤＳ、２０ｍＭ
トリス−塩酸（ｐＨ８）及び１０ｍＭ ＥＤＴＡ）で処
理し、遊離した核内成分を０．６容のイソプロパノール
で沈殿させて核酸を得、これを７０％エタノールで洗浄
後乾燥させてゲノム分画とする。この分画３００ｎｇを
ＰＣＲ法に供した。この時プライマーはナピンプロモー
ター部分の１ｂｐから上流１９塩基（配列表の配列番号
１）と、ＮＯＳターミネーターの１５７９ｂｐから１５
９５ｂｐまで（配列表の配列番号５：ｐＣａＭＶＮＥ
Ｏ；Ｆｒｏｍｍ，Ｎａｔｕｒｅ，３１９，７９１−７９
３，１９８６）の相補鎖配列を用いた。ＰＣＲは熱変性
が９４℃で１分、アニーリングが４５℃で２分、伸長反
応を７２℃３分で行った。反応後反応液１０μｌをアガ
ロースゲル電気泳動で分析し、増幅したバンドを検出し
た。ＰＣＲ法で導入遺伝子が確認された植物体を鉢上げ
したところ、３〜６ヶ月後に種子を形成した。
【００３３】実施例 ３ 完熟種子におけるアンチセン
スナピンＤＮＡの発現の確認 完熟種子の半粒にタンパク質抽出用サンプルバファー
（６２．５ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ６．８）、２％ Ｓ
ＤＳ及び１０％グリセロール）１００μｌを加え、摩砕
して遠心分離した後、上澄みの１部を（全タンパク質量
１５μｇ分）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分子量別に分画
する。このゲルを一晩クマシー染色した後、脱色してナ
ピン含量を調べた。ナピンの減少量は画像解析（画像解
析システム，ＭＫＳＩＰＳ）によりナピンのバンドの量
とナピン以外のタンパク質、例えばクルシフェリンのバ
ンドの量との相対値の変化によって定量した。つまり、
ナピン含量が減少すると、ナピンのバンドの量／クルシ
フェリンのバンドの量の値は小さくなる。また残りの半
粒の種子は播種培地（３％ショ糖を含んだＭＳ寒天培
地）上で発芽させ、その苗からゲノムＤＮＡを抽出し、
実施例２と同様のＰＣＲ法により導入遺伝子の次代への
遺伝を確認した。これにより、ナピン含量の減少と導入
遺伝子の存在の相関関係が確認された。表１にＳＤＳ−
ＰＡＧＥの画像解析結果とＰＣＲによる導入遺伝子の有
無との関係を示す。表中、Ｗｅｓｔａｒ１〜８は形質転
換していないＢ．ｎａｐｕｓ ｃｖ． Ｗｅｓｔａｒの
完熟種子を同様に処理したコントロールである。
スナピンＤＮＡの発現の確認 完熟種子の半粒にタンパク質抽出用サンプルバファー
（６２．５ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ６．８）、２％ Ｓ
ＤＳ及び１０％グリセロール）１００μｌを加え、摩砕
して遠心分離した後、上澄みの１部を（全タンパク質量
１５μｇ分）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分子量別に分画
する。このゲルを一晩クマシー染色した後、脱色してナ
ピン含量を調べた。ナピンの減少量は画像解析（画像解
析システム，ＭＫＳＩＰＳ）によりナピンのバンドの量
とナピン以外のタンパク質、例えばクルシフェリンのバ
ンドの量との相対値の変化によって定量した。つまり、
ナピン含量が減少すると、ナピンのバンドの量／クルシ
フェリンのバンドの量の値は小さくなる。また残りの半
粒の種子は播種培地（３％ショ糖を含んだＭＳ寒天培
地）上で発芽させ、その苗からゲノムＤＮＡを抽出し、
実施例２と同様のＰＣＲ法により導入遺伝子の次代への
遺伝を確認した。これにより、ナピン含量の減少と導入
遺伝子の存在の相関関係が確認された。表１にＳＤＳ−
ＰＡＧＥの画像解析結果とＰＣＲによる導入遺伝子の有
無との関係を示す。表中、Ｗｅｓｔａｒ１〜８は形質転
換していないＢ．ｎａｐｕｓ ｃｖ． Ｗｅｓｔａｒの
完熟種子を同様に処理したコントロールである。
【００３４】
【表１】
【００３５】実施例 ４ 完熟種子中の全タンパク質含
量の測定 実施例３で抽出した全種子タンパク質溶液を、Ｂｉｏ−
Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ
Ｌａｂｓ．）でタンパク質定量する。再蒸留水７９９
μｌに２００μｌの試薬を加え、その中にサンプル１μ
ｌを添加して３０分室温で放置した後、５９５ｎｍの吸
光度を測定する。この結果ナピン含量の減少と全タンパ
ク質含量には相関は認められなかった（図２）。
量の測定 実施例３で抽出した全種子タンパク質溶液を、Ｂｉｏ−
Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ
Ｌａｂｓ．）でタンパク質定量する。再蒸留水７９９
μｌに２００μｌの試薬を加え、その中にサンプル１μ
ｌを添加して３０分室温で放置した後、５９５ｎｍの吸
光度を測定する。この結果ナピン含量の減少と全タンパ
ク質含量には相関は認められなかった（図２）。
【００３６】実施例 ５ 完熟種子中のタンパク質のア
ミノ酸組成の解析 ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりナピン含量の減少した種子の残
り半粒を７個分集め、適当量のアセトンを加えて摩砕す
る。その摩砕物を遠心分離し沈殿を乾燥させて２００μ
ｌの７０％蟻酸を加え、タンパク質を溶解させる。遠心
分離後上清５０μｌを乾燥させて、１１０℃ＨＣｌ蒸気
中窒素下で２４時間加水分解する。これにクエン酸緩衝
液を１００μｌ加え、遠心分離した上清２０μｌをアミ
ノ酸分析にかけた。コントロールとして形質転換してい
ないＢ．ｎａｐｕｓ ｃｖ． Ｗｅｓｔａｒの完熟種子
を同様にしてアミノ酸分析を行った。その結果、アンチ
センスナピンＤＮＡを導入することにより全タンパク質
のアミノ酸組成が変化しており、またそのアミノ酸組成
はナピン減少分をクルシフェリンタンパク質が補ったと
仮定した時のアミノ酸組成と類似していた。表２に形質
転換体種子のアミノ酸分析の結果を示す。なお、表中の
アミノ酸はすべて１文字記号で表した。
ミノ酸組成の解析 ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりナピン含量の減少した種子の残
り半粒を７個分集め、適当量のアセトンを加えて摩砕す
る。その摩砕物を遠心分離し沈殿を乾燥させて２００μ
ｌの７０％蟻酸を加え、タンパク質を溶解させる。遠心
分離後上清５０μｌを乾燥させて、１１０℃ＨＣｌ蒸気
中窒素下で２４時間加水分解する。これにクエン酸緩衝
液を１００μｌ加え、遠心分離した上清２０μｌをアミ
ノ酸分析にかけた。コントロールとして形質転換してい
ないＢ．ｎａｐｕｓ ｃｖ． Ｗｅｓｔａｒの完熟種子
を同様にしてアミノ酸分析を行った。その結果、アンチ
センスナピンＤＮＡを導入することにより全タンパク質
のアミノ酸組成が変化しており、またそのアミノ酸組成
はナピン減少分をクルシフェリンタンパク質が補ったと
仮定した時のアミノ酸組成と類似していた。表２に形質
転換体種子のアミノ酸分析の結果を示す。なお、表中の
アミノ酸はすべて１文字記号で表した。
【００３７】
【表２】
【００３８】実施例 ６ 完熟種子中の脂質含量と脂肪
酸組成の解析 ＳＤＳ−ＰＡＧＥでナピン含量の減少が認められた半粒
の種子１０個分を集め、５ｍｌのクロロホルム：メタノ
ール＝３：１溶液を加えて摺り潰し、上澄みを遠心管に
移す。この操作を３回繰り返して、全部の上澄みを集め
て室温で２０分放置する。これに再蒸留水５ｍｌ、クロ
ロホルム５ｍｌを加えて攪拌し、４℃、３０００ｒｐ
ｍ、２０分遠心分離する。下層のクロロホルム層を梨型
フラスコに移して、適当量のエタノールを加えながら３
０℃で減圧乾燥させる。抽出乾燥物に５０ｎｍｏｌのペ
ンタデカン酸メチル（Ｃ15:0）と２．５％硫酸含有メタ
ノール２ｍｌを加えて、８０℃で２時間メチル化する。
その後ヘキサン２ｍｌを加え、攪拌静置して上層のヘキ
サン層を別のチューブに取り、減圧乾固させる（Ｔｈｅ
ｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，８０，２４１−２４
５，１９９０）。この乾固物にヘキサン１００μｌを加
えて、そのうち２μｌをＧＣで脂肪酸分析にかけた（Ｇ
Ｃ−９Ａ，Ｓｈｉｍａｚｕ Ｃｏ．；５０ｍ×０．２５
ｍｍφ×０．２５μＭｆｉｌｍ Ｃｙａｒｎｏｐｒｏｐ
ｙｌ ２３ ｃｏｌｕｍｎ，ＴＯＹＯ ＫＡＳＥＩ Ｋ
ＯＧＹＯ Ｃｏ．１８５℃，１ｍｌ／ｍｉｎ Ｈｅ；Ｉ
ｎｊｅｃｔｏｒ，２００℃）。コントロールとして形質
転換していないＢ．ｎａｐｕｓ ｃｖ． Ｗｅｓｔａｒ
の種子５粒分から同様に脂肪酸を抽出し分析し比較した
ところ、ナピン含量の減少した形質転換体の種子は全脂
肪酸量に変化はなかったが、オレイン酸が減少しその分
リノール酸とリノレン酸が増加していた（図３）。
酸組成の解析 ＳＤＳ−ＰＡＧＥでナピン含量の減少が認められた半粒
の種子１０個分を集め、５ｍｌのクロロホルム：メタノ
ール＝３：１溶液を加えて摺り潰し、上澄みを遠心管に
移す。この操作を３回繰り返して、全部の上澄みを集め
て室温で２０分放置する。これに再蒸留水５ｍｌ、クロ
ロホルム５ｍｌを加えて攪拌し、４℃、３０００ｒｐ
ｍ、２０分遠心分離する。下層のクロロホルム層を梨型
フラスコに移して、適当量のエタノールを加えながら３
０℃で減圧乾燥させる。抽出乾燥物に５０ｎｍｏｌのペ
ンタデカン酸メチル（Ｃ15:0）と２．５％硫酸含有メタ
ノール２ｍｌを加えて、８０℃で２時間メチル化する。
その後ヘキサン２ｍｌを加え、攪拌静置して上層のヘキ
サン層を別のチューブに取り、減圧乾固させる（Ｔｈｅ
ｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，８０，２４１−２４
５，１９９０）。この乾固物にヘキサン１００μｌを加
えて、そのうち２μｌをＧＣで脂肪酸分析にかけた（Ｇ
Ｃ−９Ａ，Ｓｈｉｍａｚｕ Ｃｏ．；５０ｍ×０．２５
ｍｍφ×０．２５μＭｆｉｌｍ Ｃｙａｒｎｏｐｒｏｐ
ｙｌ ２３ ｃｏｌｕｍｎ，ＴＯＹＯ ＫＡＳＥＩ Ｋ
ＯＧＹＯ Ｃｏ．１８５℃，１ｍｌ／ｍｉｎ Ｈｅ；Ｉ
ｎｊｅｃｔｏｒ，２００℃）。コントロールとして形質
転換していないＢ．ｎａｐｕｓ ｃｖ． Ｗｅｓｔａｒ
の種子５粒分から同様に脂肪酸を抽出し分析し比較した
ところ、ナピン含量の減少した形質転換体の種子は全脂
肪酸量に変化はなかったが、オレイン酸が減少しその分
リノール酸とリノレン酸が増加していた（図３）。
【００３９】実施例 ７ 後代の植物体におけるアンチ
センスナピンＤＮＡの発現の確認 実施例２で再生した植物体（Ｔ0 世代）に形成された種
子（Ｔ1 世代）を播種し、これより形成された種子（Ｔ
2 世代）のナピン含量を実施例３と同様に調べたとこ
ろ、Ｔ1 種子と同様ナピン含量が減少していた。また同
様に実施例５に従って脂肪酸組成を測定したところ、オ
レイン酸の減少とリノール酸、リノレン酸の増加が認め
られた。
センスナピンＤＮＡの発現の確認 実施例２で再生した植物体（Ｔ0 世代）に形成された種
子（Ｔ1 世代）を播種し、これより形成された種子（Ｔ
2 世代）のナピン含量を実施例３と同様に調べたとこ
ろ、Ｔ1 種子と同様ナピン含量が減少していた。また同
様に実施例５に従って脂肪酸組成を測定したところ、オ
レイン酸の減少とリノール酸、リノレン酸の増加が認め
られた。
【００４０】以上のように、アンチセンスナピンＤＮＡ
をブラシカ植物に導入することにより種子中のアミノ酸
組成及び脂肪酸組成を改変させることが可能であり、か
かる形質は後代まで遺伝されることが確認された。
をブラシカ植物に導入することにより種子中のアミノ酸
組成及び脂肪酸組成を改変させることが可能であり、か
かる形質は後代まで遺伝されることが確認された。
【００４１】実施例 ８ ベクターの構築（ｐＮＡＣＲ
Ｕ）（図１参照） 形質転換、アンチセンスクルシフェ
リンＤＮＡの導入されたカルスの選択及び発現 クルシフェリン遺伝子の一部をｃｒｕＡ（Ｎｕｃ．Ａｃ
ｉｄ Ｒｅｓ．，１７，３５８４，１９８９）のシーク
エンスを基に前述のＰＣＲ法で単離した。この時、プラ
イマーはクリシフェリンアンチセンス用としてｃｒｕＡ
の６８０から７００ｂｐの２１塩基（５′−ＡＡＡＡＡ
ＣＣＡＣＡＡＣＡＡＣＴＡＡＧＴＡ−３′：配列表の配
列番号６）と、１２６１ｂｐから１２７８ｂｐの１８塩
基（５′−ＣＡＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＧＡＡ−
３′：配列表の配列番号７）の相補鎖配列を用いた以外
は、全てナビン遺伝子の一部を単離する場合に準じた。
クルシフェリンアンチセンスは約０．６ｋｂのバンドと
なる。このＤＮＡ断片を回収しｐＵＣ１９プラスミドの
ＳｍａＩにクローニングした（ｐＣＡＳ）。つぎにｐＣ
ＡＳ１０μｇをナビンアンチセンスの場合と同様の処理
をしてナビンプロモーターとＮＯＳのターミネーターの
間に連結した（ｐＣＲＡＳ）。エレクトロポーレーショ
ン法で形質転換を行う場合にはこのプラスミドを用い
る。アグロバクテリウム法に用いるプラスミドは次のよ
うに構築した。ｐＣＲＡＳプラスミドからナビンプロモ
ーターとクルシフェリンアンチセンスを含むＤＮＡ断片
を前述のｐＫＭ４２４とＨｉｎｄＩＩＩ，ＥｃｏＲＩサ
イトで連結させる（ｐＣＡＫＭ）。このプラスミドをア
グロバクテリウムＥＨＡ１０１株に前述の方法に準じて
形質転換させた。
Ｕ）（図１参照） 形質転換、アンチセンスクルシフェ
リンＤＮＡの導入されたカルスの選択及び発現 クルシフェリン遺伝子の一部をｃｒｕＡ（Ｎｕｃ．Ａｃ
ｉｄ Ｒｅｓ．，１７，３５８４，１９８９）のシーク
エンスを基に前述のＰＣＲ法で単離した。この時、プラ
イマーはクリシフェリンアンチセンス用としてｃｒｕＡ
の６８０から７００ｂｐの２１塩基（５′−ＡＡＡＡＡ
ＣＣＡＣＡＡＣＡＡＣＴＡＡＧＴＡ−３′：配列表の配
列番号６）と、１２６１ｂｐから１２７８ｂｐの１８塩
基（５′−ＣＡＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＧＡＡ−
３′：配列表の配列番号７）の相補鎖配列を用いた以外
は、全てナビン遺伝子の一部を単離する場合に準じた。
クルシフェリンアンチセンスは約０．６ｋｂのバンドと
なる。このＤＮＡ断片を回収しｐＵＣ１９プラスミドの
ＳｍａＩにクローニングした（ｐＣＡＳ）。つぎにｐＣ
ＡＳ１０μｇをナビンアンチセンスの場合と同様の処理
をしてナビンプロモーターとＮＯＳのターミネーターの
間に連結した（ｐＣＲＡＳ）。エレクトロポーレーショ
ン法で形質転換を行う場合にはこのプラスミドを用い
る。アグロバクテリウム法に用いるプラスミドは次のよ
うに構築した。ｐＣＲＡＳプラスミドからナビンプロモ
ーターとクルシフェリンアンチセンスを含むＤＮＡ断片
を前述のｐＫＭ４２４とＨｉｎｄＩＩＩ，ＥｃｏＲＩサ
イトで連結させる（ｐＣＡＫＭ）。このプラスミドをア
グロバクテリウムＥＨＡ１０１株に前述の方法に準じて
形質転換させた。
【００４２】続いて、二次選択時のプライマーとしてク
ルシフェリン塩基配列の１ｂｐから上流１８ｂｐ（配列
表の配列番号７）と、ＮＯＳターミネーターの１５７９
ｂｐから１５９５ｂｐまで（前述）を用いた他は、実施
例２と同様にして、形質転換、アンチセンスクルシフェ
リンＤＮＡの導入されたカルスの選択及び再生を行っ
た。
ルシフェリン塩基配列の１ｂｐから上流１８ｂｐ（配列
表の配列番号７）と、ＮＯＳターミネーターの１５７９
ｂｐから１５９５ｂｐまで（前述）を用いた他は、実施
例２と同様にして、形質転換、アンチセンスクルシフェ
リンＤＮＡの導入されたカルスの選択及び再生を行っ
た。
【００４３】実施例 ９ 完熟種子中のタンパク質のア
ミノ酸組成の解析 ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりクルシフェリン含量の減少した
種子の残り半粒を８個分集め、ナビンアンチセンスＤＮ
Ａを導入した種子と同様にしてアミノ酸分析を行った。
その結果、アンチセンスクルシフェリンＤＮＡを導入す
ることにより全タンパク質のアミノ酸組成が変化して、
必須アミノ酸であるＣｙｓ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ含量が増加
していた。表３に形質転換体種子のアミノ酸分析の結果
を示す。
ミノ酸組成の解析 ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりクルシフェリン含量の減少した
種子の残り半粒を８個分集め、ナビンアンチセンスＤＮ
Ａを導入した種子と同様にしてアミノ酸分析を行った。
その結果、アンチセンスクルシフェリンＤＮＡを導入す
ることにより全タンパク質のアミノ酸組成が変化して、
必須アミノ酸であるＣｙｓ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ含量が増加
していた。表３に形質転換体種子のアミノ酸分析の結果
を示す。
【００４４】
【表３】
【００４５】
【発明の効果】本発明により、油料作物の脂肪酸組成お
よび／またはアミノ酸組成を改変することができる。具
体的には、脂肪酸としてオレイン酸の含量を減少させ、
かつ、リノール酸及びリノレン酸の含量を増加させた
り、あるいは必須アミノ酸であるリジン、メチオニン、
システイン等の含量を増加させたりすることにより、所
望の脂肪酸組成および／またはアミノ酸組成を有する栄
養価の高い種子をつける新しい油料作物を提供すること
ができる。
よび／またはアミノ酸組成を改変することができる。具
体的には、脂肪酸としてオレイン酸の含量を減少させ、
かつ、リノール酸及びリノレン酸の含量を増加させた
り、あるいは必須アミノ酸であるリジン、メチオニン、
システイン等の含量を増加させたりすることにより、所
望の脂肪酸組成および／またはアミノ酸組成を有する栄
養価の高い種子をつける新しい油料作物を提供すること
ができる。
【００４６】
配列番号：１ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AAGCTTTCTT CATCGGTGA 19
【００４７】配列番号：２ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CAAGATTAAA AACATACACG A 21
【００４８】配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTCATCAATA CAAACAAGAT 20
【００４９】配列番号：４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TATGTAAGGT TTTATCTAGG 20
【００５０】配列番号：５ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GCATGACGTT ATTTATG 17
【００５１】配列番号：６ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AAAAACCACA ACAACTAAGT A 21
【００５２】配列番号：７ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CACTGATGAG TCCTGGAA 18
【図１】本発明の実施例１および実施例８で作成したベ
クターの構築を表す図面である。
クターの構築を表す図面である。
【図２】Ｂ．ｎａｐｕｓ ｃｖ． Ｗｅｓｔａｒの種子
中における全タンパク質含量を表す図面である。図中、
Ｗは天然種子を、Ｔは形質転換した種子をそれぞれ表
す。
中における全タンパク質含量を表す図面である。図中、
Ｗは天然種子を、Ｔは形質転換した種子をそれぞれ表
す。
【図３】Ｂ．ｎａｐｕｓ ｃｖ． Ｗｅｓｔａｒの種子
中における脂肪酸組成を表す図面である。図中、○は天
然種子を、●は形質転換した種子をそれぞれ表す。
中における脂肪酸組成を表す図面である。図中、○は天
然種子を、●は形質転換した種子をそれぞれ表す。
Claims (17)
- 【請求項１】 種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子
のアンチセンスＤＮＡを導入して形質転換された油料作
物。 - 【請求項２】 種子貯蔵タンパク質がナピンであること
を特徴とする請求項１記載の油料作物。 - 【請求項３】 形質転換が種子のアミノ酸組成及び脂肪
酸組成の改変であることを特徴とする請求項２記載の油
料作物。 - 【請求項４】 脂肪酸組成の改変が、オレイン酸、リノ
ール酸及びリノレン酸の含量の改変であることを特徴と
する請求項３記載の油料作物。 - 【請求項５】 脂肪酸組成の改変が、リノール酸及びリ
ノレン酸の含量の増加による改変であることを特徴とす
る請求項３記載の油料作物。 - 【請求項６】 種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子
がｎａｐＡ塩基配列で表されることを特徴とする請求項
１記載の油料作物。 - 【請求項７】 アンチセンスＤＮＡが、配列表の配列番
号３および４で表される塩基配列の相補鎖配列をプライ
マーとして得られた合成ＤＮＡであることを特徴とする
請求項１記載の油料作物。 - 【請求項８】 種子貯蔵タンパク質がクルシフェリンで
あることを特徴とする請求項１記載の油料作物。 - 【請求項９】 形質転換が種子のアミノ酸組成の改変で
あることを特徴とする請求項８記載の油料作物。 - 【請求項１０】 アミノ酸組成の改変が、リジン、メチ
オニンおよびシステインの含量の改変であることを特徴
とする請求項９記載の油料作物。 - 【請求項１１】 アミノ酸組成の改変が、リジン、メチ
オニンおよびシステインの含量の増加による改変である
ことを特徴とする請求項９記載の油料作物。 - 【請求項１２】 種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝
子がｃｒｕＡ塩基配列で表されることを特徴とする請求
項１記載の油料作物。 - 【請求項１３】 アンチセンスＤＮＡが、配列表の配列
番号６および７で表される塩基配列の相補鎖配列をプラ
イマーとして得られた合成ＤＮＡであることを特徴とす
る請求項１記載の油料作物。 - 【請求項１４】 種子特異的に発現するプロモーターの
下流に油料作物の種子貯蔵タンパク質遺伝子のアンチセ
ンスＤＮＡを導入してなるベクター。 - 【請求項１５】 請求項１４に記載のベクターおよび油
料作物の下胚軸もしくはプロトプラストを液体媒体に懸
濁して油料作物を形質転換し、カルスを形成させ、該カ
ルスから植物体を再生させることを特徴とする形質転換
された油料作物の作出方法。 - 【請求項１６】 請求項１４に記載のベクターおよび油
料作物の下胚軸もしくはプロトプラストを液体媒体に懸
濁して油料作物を形質転換することを特徴とする、油料
作物のアミノ酸組成および／または脂肪酸組成を改変す
る方法。 - 【請求項１７】 請求項１記載の油料作物から得られる
種子。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6047058A JPH06335334A (ja) | 1993-03-31 | 1994-03-17 | アミノ酸組成、脂肪酸組成の改変された油料作物およびその作出方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5-73806 | 1993-03-31 | ||
| JP7380693 | 1993-03-31 | ||
| JP6047058A JPH06335334A (ja) | 1993-03-31 | 1994-03-17 | アミノ酸組成、脂肪酸組成の改変された油料作物およびその作出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06335334A true JPH06335334A (ja) | 1994-12-06 |
Family
ID=26387209
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6047058A Pending JPH06335334A (ja) | 1993-03-31 | 1994-03-17 | アミノ酸組成、脂肪酸組成の改変された油料作物およびその作出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06335334A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008515406A (ja) * | 2004-10-06 | 2008-05-15 | ユーティーアイ リミテッド パートナーシップ | 植物におけるオレオシン発現のモジュレーションの方法 |
-
1994
- 1994-03-17 JP JP6047058A patent/JPH06335334A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008515406A (ja) * | 2004-10-06 | 2008-05-15 | ユーティーアイ リミテッド パートナーシップ | 植物におけるオレオシン発現のモジュレーションの方法 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20040518 |