JPH06317591A - 染色微生物標識を使用したテスト物品及び検定法 - Google Patents

染色微生物標識を使用したテスト物品及び検定法

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JPH06317591A
JPH06317591A JP6013680A JP1368094A JPH06317591A JP H06317591 A JPH06317591 A JP H06317591A JP 6013680 A JP6013680 A JP 6013680A JP 1368094 A JP1368094 A JP 1368094A JP H06317591 A JPH06317591 A JP H06317591A
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JP
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test article
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Allan D Pronovost
ディー．プロノボスト アラン
Gerald L Rowley
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Quidel Corp
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は、生物学的液体サンプル中の分析物
の検定のためのテスト物品及び方法を提供することを目
的とする。 【構成】 上記の検定のためのテスト物品及び方法は、
被検分析物の検出のために可視標識として染色された微
生物を使用することを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、一般的に、生物学的な
液体サンプル中の分析物の検出のための、テスト物品及
び検定法に関する。さらに特に、本発明は、被検分析物
を検出するために可視標識として染色された微生物を使
用するテスト物品及び検定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】生物学的検定における" 標識" としての
色素形生(chromogenic) の及び蛍光染料の使用は、知ら
れている。典型的な検定手順は、染料標識を、生物学的
サンプル中の分析物又は分析物同族体に結合させ、そこ
で、その検定の特定の段階でその染料の存在の有無を視
覚的に測定し、そのサンプル中に最初に存在する分析物
の量と関係付けることができる。多種多様な特異的な検
定手順が存在する。本発明への特定の興味の中で、ある
検定は、標識として天然に着色された又は染色された粒
子を使用し、そこでは、その粒子は、抗体又は他の特異
的な結合物質に結合している。提案された粒子は、染色
されたラテックス・ビーズ、染料を吸収したリポソー
ム、赤血球、金属ゾル、等を含む。このような複合体内
の着色された粒子は、可視マーカーとして役立ち、そこ
では、その粒子の分離、捕獲、又は凝集が、上記の抗体
又は他の特異的な結合物質の結合を通して仲介されてい
る。したがって、特定の検定段階において分離された標
識の量は、そのサンプル中に最初に存在する分析物の量
に関係付けられる。このような抗体- 粒子組成物の各種
の調製方法が提案さてれきた。このような方法は、一般
的に、典型的には、ラテックス・ビーズ、リポソーム等
を染色することにより着色粒子を作り出し、そして典型
的には、受動的吸着又は共有結合により、その着色粒子
を上記抗体に実質的に付着させることを当てにしてい
る。
【０００３】一般的に有用であるが、このような抗体-
粒子組成物の調製方法は、比較的複雑になることがで
き、普通には、免疫検定における使用のための、その粒
子の調製、その粒子の着色、その粒子のその抗体への付
着、その粒子の阻止(blocking)を含む多段階操作を必要
とする。幾つかの粒子、例えば、リポソームは、比較的
不安定であり、保存後又はいくつかのサンプル中での使
用の間、均一な特徴を提供しない。さらに、抗体結合能
の損失が、しばしば、その粒子の付着から生じることが
できる。ときどき、これらの粒子は、特定の用途のため
に選ばれた抗体と両立することができない。しばしば、
抗体は、非有効的に、そして最大の免疫学的応答性のた
めの方向を無視して、その粒子に結合する。改良された
標識付け組成物であって、いずれかの特異性を有する抗
体がある用途のために使用されることを許容するであろ
うものを提供することが必要であろう。この組成物は、
比較的調製が簡単であり、低いコストであり、そして均
一な特徴をもつべきである。特に、この組成物は、適正
な抗体方向、すなわち、Fc領域結合をもつ、有意な程度
の抗体活性を保持し、そして製品の長い保存寿命を提供
するために保存の間及び検定条件下で非常に安定でなけ
ればならない。しかしながら、本発明の方法及び組成物
は、これらの視点のそれぞれ又はいずれかにおいて従来
技術よりも優れたものである必要はないが、むしろ、そ
れらが、本発明が特定の従来技術及び製品に比べて提供
することができる一般的な利点であるということが、理
解されよう。
【０００４】米国特許第4,943,522 号は、標識として固
相の横方向の流れの検定(lateral flow assay)について
記載している。米国特許第4,863,875 号は、染料上のイ
ソシアネート基を通して抗体に供給結合で付着した少な
くとも10の染料分子又はモノマーを含んで成る組成物に
ついて記載している。米国特許第4,861,711 号は、それ
ぞれ別個に吸収パッド内に保持された酵素抗体結合物及
び支持体を使用した固相の横方向の流れの検定について
記載している。米国特許第4,703,017 号は、固相検定装
置であって、固体支持体上のリガンド- 標識結合体の特
異的結合を当てにするものについて記載しており、そこ
ではその標識は、粒子、例えば、リポソーム、又はポリ
マー・マイクロカプセルとして開示されている。米国特
許第4,608,246 号は、標識付け剤として赤血球を使用し
た血液型分類ののための検定について記載している。米
国特許第4,452,886 号は、蛋白質、例えば、抗体及び抗
原への光子吸収又は放出ポリマーの共有結合について記
載している。米国特許第4,373,932 号は、疎水性染料又
は顔料、又はこのような染料又は顔料により被覆された
ポリマー核の水性分散によるリガンドの標識付けについ
て記載している。米国特許第4,313,734 号は、サンプル
中の金属標識含有量の測定によるサンプル分析物の検出
方法について記載している。米国特許第4,169,138 号
は、微生物起源を有することができる、ポリマーへ結合
した非染色微生物を含む可視粒子を使用した免疫検定に
ついて記載している。横方向の流れの検定に関する、U.
K.特許2,204,398 号;EP 特許306 722 号; 及びEP特許第
276 152 号についても参照のこと。
【０００５】酵素検定及び免疫組織化学染色技術であっ
て、支持体と標的部分に結合した酵素との反応により着
色された染料を作り出すものが知られている。Jonsson
et al., J. Immunol., 4:29-33は、遊離抗原からIgG-抗
原複合体を分離するために固相として黄色ブドウ球菌(S
taphylococcus aureus) バクテリアを使用する放射免疫
検定について記載している。Leuvering and Van de Waa
rt, J. Immunoassay,1:77-91 は、標識として無機ゾル
粒子を使用する免疫検定について記載している。Guesdo
n and Avraneas, J. Immunol. Meth., 39:1-13及びPren
ot and Guesdon, Ann. Virol., 132:529-542は、標識付
け組成物として赤血球を使用する免疫検定について記載
している。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、支持体マトリ
ックス、及びその支持体、マトリックス中にしみ込んだ
標識付け複合体を含んで成るテスト物品であって、その
標識付け複合体がその細胞表面上に特異的結合物質をも
つ染色された微生物を含んで成るものを提供する。本発
明の1 つの態様は、横方向の流れの検定であって、流路
を定める支持体マトリックス; 上記流路に沿って配置さ
れ、かつ、その中にしみ込んだ分析物に特異的な結合物
質をもつサンプル受容領域; その流路に沿って上記のサ
ンプル受容領域から下流に配置され、かつ、その中にし
み込んだ標識付け複合体をもつ標識付け領域であって、
その標識付け複合体がその細胞表面上に上記分析物特異
的結合物質に特異的な結合物質をもつ染色された微生物
を含んで成るもの; そして上記流路に沿って上記の標識
付け領域から下流に配置され、かつ、その中に固定化さ
れた上記分析物に特異的な結合物質をもつ捕獲領域を、
含んで成る検定のためのテスト装置を提供する。請求す
る発明の他の態様は、その細胞表面上に標識付け結合物
質をもつ染色された微生物を含んで成る標識付け複合体
が支持体マトリックス中にしみ込んでいるテスト装置の
製造方法である。非競合的及び競合的構成の両方におけ
る横方向の流れの検定であって、その細胞表面上に特異
的な標識付け結合物質をもつ染色された微生物から本質
的に成る標識付け複合体と、捕獲領域内の捕獲結合物質
との間の結合が、その捕獲領域を通して流れるサンプル
中の分析物の存在により仲介され、上記の標識付け複合
体と、上記の捕獲結合物質との間の結合が、細胞表面に
特異的な標識付け結合物質を通して直接的又は間接的に
影響されるような検定をも提供する。
【０００７】本発明は、生物学的な液体サンプル中の分
析物の検出における使用のために、テスト物品及び検定
法を提供する。このテスト物品及び検定は、そのサンプ
ル中の分析物の同定を可能にする標識付け複合体内で染
色された微生物を使用する。この標識付け複合体は、視
覚的に区別することができそして本明細書中で以降に、
より詳細に記載するように、捕獲領域内で凝集又は集積
したとき、容易に明らかになる色のシグナルを提供する
ことができる。染色された微生物の使用は、横方向の流
れの検定手順における使用及び横方向の流れの検定装置
のために特に貴重であるが、染色された微生物は、多種
多様な他の検定構成(formats) であって例えば米国特許
第5,079,170 号( 引用により本明細書中に取り込む) に
より記載されるようなものにおいても有用である。
【０００８】横方向の検定技術は、一般的に米国特許第
4,943,522 号; 第4,861,711 号; 第4,168,146 号; 第4,
094,647 号; 第4,235,601 号; 第4,361,537 号; 第4,85
7,453 号; 第4,703,017 号; 第4,855,240 号; 第4,775,
636 号; 同時係属中の米国特許出願第07/639,967号、欧
州特許出願第451,800 号; 第158,746 号; 第276,152号;
第306,772 号及び英国特許出願第2,204,398 号( これ
らのそれぞれを引用により本明細書中に取り込む) の中
に記載されている。本発明は、生物学的液体サンプル中
の分析物の検出又は定量に有用なテスト物品及び方法を
提供する。多種多様の分析物、例えば、ヒト絨毛性性腺
刺激ホルモン(human chorionic gonadotropin(hCG)) 、
前立腺特異的抗原(prostate specific antigen(PSA))
、癌胎児性抗原(carcinoembryonic antigen(CEA)) 抗
原特異的免疫グロブリン等を、本発明により検出するこ
とができる。生物学的液体サンプルは、血清、全血、
尿、痰、唾液、汗、血漿等を含むことができる。本明細
書中では、細胞組織の液体均質物をも、生物学的液体と
みなす。
【０００９】一般的に、本発明のテスト物品は、その中
にしみ込んだ標識付け複合体をもつ支持体マトリックス
を含んで成る。本明細書中で以降に使用するが、" しみ
込んだ" とは、浸透又は可逆的な表面付着の状態をさ
す。しみ込んだ物質は、その支持体マトリックス内又は
上に固定化されていないが、その支持体マトリックス上
に置かれた液体中に混合され、又は懸濁されることがで
きる。本テスト物品の支持体マトリックスは、非吸収性
の横方向の流れを作ることができる。" 非吸収性の横方
向の流れ" は、その液体に溶解した又は分散した全ての
成分が、例えば、1 以上の成分を吸収又はしみ込ませる
ことができる物質中で生じるような1 以上の成分の優先
的な保持に対するような、実質的に等しい速度におい
て、そして相対的に弱められないその膜を通しての横方
向の流れを伴って担持されるような液体の流れを意味す
る。
【００１０】支持体マトリックスとしての使用に好適な
典型的な非吸収性物質は、Fairburn, Georgia, USAのPo
rex Technologies Corp.により製造された高密度ポリエ
チレンシート材料である。このシート材料は、40% 空隙
率における0.57g/ccの主要密度、そして1 〜250 マイク
ロメーターの平均細孔直径であって、一般的に3 〜100
マイクロメーターであるものをもつ開口細孔構造をも
つ。本発明における使用のための膜についての最適細孔
直径は、約10〜50μm である。この膜は、典型的には、
厚さ約1 ミル(mil) から約15ミルまで、典型的には、5
から10ミルまでの範囲内にあるが、200 ミル以上の厚さ
にであってもよい。この膜は、一般的に水に不浸透性の
層、例えば、マイラー(mylar) により裏材を付けられる
ことができる。使用されるときは、この裏材は、一般的
に、接着剤、例えば、3M 444の2-側接着剤タイプにより
その膜に固定される。典型的には、水に不浸透性の裏材
を、低い厚さを有する膜のために使用する。あるいは、
その膜が、それ自体の支持であってもよい。他の非吸収
性の膜、例えば、塩化ポリビニル、酢酸ポリビニル、ナ
イロン、酢酸ビニルと塩化ビニルとの共重合体、ポリア
ミド、ポリカーボネート、ポリスチレン等を、使用する
こともできる。
【００１１】吸収性材料、例えば、非処理紙、セルロー
ス混合物、ニトロセルロース、ポリエステル、アクリロ
ニトリル共重合体、レーヨン、ガラス繊維、並びに誘導
体化されたナイロン等を、吸収性又は非吸収性の流れの
どちらかを提供するために支持体マトリックス材料とし
て使用することもできる。非吸収性の流れを提供するた
めに、これらの材料を、吸収性の膜の吸収性の原因であ
る力を阻止することができるブロッキング剤(blocking
剤) により処理することができる。好適なブロッキング
剤は、ウシ血清アルブミン、全ての動物血清、カゼイ
ン、及び脱脂乾燥ミルクを含む。典型的には、この支持
体マトリックスは、流路を定めるであろう。この流路
は、一般的に横方向である。但し、他の配置が許容さ
れ、そしてある態様のために好まれることができる。例
えば、円形の又は半径方向の流路が、複数の分析物の存
在を同時に検出することができるテスト装置のために、
例えば、トキソプラズマ(Toxoplasma gondii) 、風疹ウ
イルス(Rubella virus) 、サイトメガロウイルス(Cytom
egalovirus) 、単純ヘルペス・ウイルス(Herpes simple
x virus)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachom
atis) 、及び梅毒トレポネーマ(treponema pallidum)に
特異的な免疫グロブリンについてのスクリーニングのた
めに又は抗原特異的抗体の検出のために、特に有用であ
る。
【００１２】上記の支持体領域は、しばしば、異なる領
域: サンプル受容領域、標識付け領域及び捕獲領域に分
けられる。この支持体マトリックスは、1 つのテスト物
品の異なる領域内の異なる膜から成ることができる。例
えば、異なる多孔度(porosity)の領域が、上記サンプル
受容領域内の濾過作用及びその下流領域内の非吸収性の
流れを提供することを要求されるであろう。他の組み合
わせが特定の使用のために要求されてもよい。上記のサ
ンプル受容領域は、そのサンプルを本発明のテスト物品
に塗布するための手段を提供する。いくつかの態様にお
いては、このサンプル受容領域は、低い分析物保持速度
をもつであろう。その表面上に蛋白質ブロッキング試薬
を固定化するために上記サンプル受容領域を処理するこ
とは、典型的には、低い保持の性質を提供する。この処
理は、上記血清サンプルの下流の流れのスピードを上げ
る増加湿潤性(wetability)及び吸い上げ作用(wicking a
ction)をも提供する。このサンプル受容領域は、そのサ
ンプルから粒状物を濾過するための手段として役立つこ
ともできる。
【００１３】典型的には、このサンプル受容領域は、分
析物結合物質によりしみ込まされるであろう。一旦その
サンプル受容領域にしみ込まされたら、この分析物結合
物質を、乾燥又は凍結乾燥させることができる。この分
析物結合物質は、被検分析物に選択的に結合するであろ
う化合物である。" 選択的な結合" は、その分析物結合
物質がその液体サンプル中の他の化合物よりもその分析
物により大きなアフィニティーをもつであろうというこ
とを意味する。この結合は、一般的に、必要ではない
が、非共有結合性であろう。
【００１４】典型的には、上記の分析物結合物質は、検
出又は測定されるべき分析物に特異的な抗体である。モ
ノクロナール抗体又は抗原- 特異的なポリクロナール抗
体のどちらかを使用することができる。多くの分析物-
特異的な抗体が商業的に使用可能である。あるいは、熟
練者は、容易に、当業者によく知られた方法により問題
の分析物に対する抗体を調製することができる。例え
ば、Harlow and Lane, "Antibodies, A Laboratory Man
ual", Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring H
arbor NY (1988)(引用により本明細書中に取り込む) を
参照のこと。他の分析物結合物質も使用することができ
る。便利には、その分析物の抗- リガンドである天然の
物質が入手可能である。例えば、ホルモン、例えば、hC
G を測定するときは、精製hCG レセプタ、又はそれらの
結合断片が、その分析物に特異的な分析物結合物質であ
る。熟練者は、特定の分析物のための適切な結合物質を
容易に理解することができる。
【００１５】上記の液体サンプルが、分析物結合物質が
しみ込んだサンプル受容領域上に置かれたとき、その分
析物結合物質がその液体サンプル中で混ざる。この混合
は、そのサンプル中に存在する分析物が結合物質に接触
すること、そして分析物/ 結合物質複合体を形成するこ
とをもたらす。分析物/ 結合物質複合体を含む液体は、
上記固体支持体マトリックスの流路により下流に導かれ
る。標識付け領域は、上記サンプル受容領域から下流の
支持体マトリックスの流路に沿って配置されることがで
きる。標識付け複合体は、この標識付け領域中にしみ込
まされている。この標識付け複合体は、分析物/ 結合物
質複合体に特異的な細胞表面標識付け結合物質をもつ染
色された微生物から成る。この分析物/ 結合物質複合体
が標識付け領域内に流入したとき、標識付け複合体は、
液体サンプル中で混合される。この標識付け結合物質
は、この結合物と結合し、それにより、上記の染色され
た微生物を上記の分析物に結合させる。一般的に、この
標識付け複合体は、標識付け領域内又は上にしみ込まさ
れた後に乾燥又は凍結乾燥されている。
【００１６】染色された微生物は、本技術分野において
先に使用されている標識を超える様々な利点をもってい
る。この微生物は、天然のものであり、そして作るのが
簡単である。複雑な化学合成は、例えば、リポソーム調
製を必要とするものは、全く必要ない。微生物は、当業
者によく知られた多種多様の化合物により染色されるこ
とができる。微生物は、染色のための多くのアミノ基-
含有蛋白質をもっている。微生物死骸は、テスト装置の
製造及び保存の便利な方法である乾燥又は凍結乾燥の条
件下でも安定である。微生物のいくつかの形態は、遺伝
的に非常に安定である、すなわち、カンジダ属(Candid
a) である。いくつかの微生物、例えば、黄色ブドウ球
菌(Staphylococcus aureus) 及びブドウ球菌(Staphyloc
occus)C 又はG 属は、標識付け結合物質として天然に役
立つことができる天然の細胞表面構造物をもっている。
様々な微生物、例えば、黄色ブドウ球菌(Staphylococcu
s aureus) 及びブドウ球菌(Staphylococcus)C 又はG
属、大腸菌(Escherichia coli)、カンジダ・アルビカン
ス(Candida albicans)、又は他の単細胞原核生物又は真
核生物を本発明において使用することがきる。微生物の
選択は、標識付け結合物質として機能することができる
細胞表面特異的結合蛋白質( 例えば、ブドウ球菌のプロ
テインA 又はプロテインG)の天然の存在により決定され
ることができる。微生物の選択に影響を与えることがで
きる他の要因は、支持体マトリックスの細孔サイズに比
較したその微生物のサイズ、利用せきるアミノ基により
変更されることができる検定による必要とされる吸光
度、天然の標識付け結合物質の密度、等である。
【００１７】上記の微生物は、当業者によく知られた手
段によりその生物に適切なものとして培養されることが
できる。一般的に、微生物は、着色微生物を作るために
染色されることに先立って殺されるであろう。上記の生
物は、様々な方法により染色されることができる。グラ
ム染色(Gramstaining) は、よく知られており、そして
バクテリアを染色するための許容される方法である。他
の許容される染料は、Chibacron Brilliant Red 3B-A、
Remazol Brilliant Blue R、Reactive Orange 16、Reac
tive Blue 4 、及びReactive Black 4であり、これらの
それぞれが、Aldrich, Milwaukee, WI及び他の源から入
手可能である。これらの染料にいより生物を染色するこ
とは一般的に、塩基性バッファー、例えば、2 炭酸ナト
リウム、炭酸ナトリウム溶液中で行われる。このバッフ
ァーは、所望のpHに調整されることができる。
【００１８】標識付け複合体の染色された微生物は、分
析物/ 結合物質結合体に特異的な細胞表面標識付け結合
物質をもつことができる。この標識付け結合物質は、上
記分析物、上記分析物結合物質、又は結合により形成さ
れた構造物の露出した領域に特異的であることができ
る。例えば、分析物結合物質がその分析物の天然のレセ
プタである場合には、この標識付け結合物質は、そのホ
ルモン結合部位から離れているレセプタのエピトープに
特異的な抗体であることができる。この細胞表面標識付
け結合物質は、その分析物結合物質に特異的な抗体であ
ることもできる。微生物を染色した後、この抗体を、カ
ップリング剤によりその微生物に化学的に付着させる。
便利には、限定的ではないが、上記の標識付け結合物質
は、その微生物の細胞表面上に天然に存在する化合物で
ある。例えば、ブドウ球菌のプロテインA(SPA)は、黄色
ブドウ球菌(Staphylococcus aureus) の多くの株の上に
天然に存在する。SPA は、その抗体の抗原結合部位上を
侵害(encroach)しない抗体分子のF C 領域のための複数
の結合部位をもっている。したがって、上記の分析物結
合物質が抗体であるときは、SPA は、分析物に特異的な
抗体と結合し、そして分析物/ 結合物質結合体を染色さ
れた黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus) に結合さ
せることができる。
【００１９】他の天然の細胞表面標識付け物質は、プロ
テインG である。プロテインG は、β- 溶血性のブドウ
球菌(Staphylococcus)C 又はG 属の細胞壁内に存在す
る。SPA と同様に、プロテインG は、選択的結合を提供
する抗体分子についての高いアフィニティーをもってい
る。上記の染色された微生物に特異的に結合する抗体
は、SPA 又は他の抗体結合化合物と複合体を形成すると
き、標識付け結合物質として使用することもできる。な
ぜならば、SPA は、複数の抗体結合部位をもっているの
で、それは、微生物-特異的抗体と、分析物結合物質と
して使用された分析物特異的抗体との両方に結合するこ
とができる。この抗体/SPA結合体は、次に、染色された
微生物をその分析物と結合する。他の標識付け結合物質
は当業者により理解されるであろう。
【００２０】あるいは、染色された微生物を、特異的な
官能基により誘導体化し、同種の若しくは異種の2 官能
価のカップリング剤(Pierce, Rockford, IL から入手可
能)を使用して抗体又は他の分析物特異的結合物質の供
給結合を可能にし、これらの分析物結合物質を染色され
た微生物に付着させることができる。上記の支持体マト
リックスは、捕獲領域も含む。分析物に特異的な捕獲結
合物質は、この捕獲領域内に固定化されるであろう。典
型的には、抗- 分析物免疫グロブリンが、この捕獲結合
物質である。上記の標識付け結合物質は、特異的に、抗
体、例えば、SPA 又はプロテインG に結合する場合は、
F C 領域を欠いた抗体結合断片( 例えば、F ab又は
F(ab) 2 断片) のみが、この捕獲結合物質として使用さ
れることができる。他の点では、染色された微生物は、
標識付け結合物質と固定化された捕獲結合物質のF C 領
域との間の結合にいより保持されることができる。可視
微生物標識の集積は、視覚的に又は光学検出装置、例え
ば、反射率分析計及びビデオ映像分析、等のいずれかに
より、評価されることができる。可視標識の集積は、捕
獲領域内の標識の存在の有無又は生物学的サンプル中の
分析物の濃度と相関関係のある集積した標識の可視強度
のいずれかを測定することにより評価されることができ
る。上記の集積標識の可視強度と分析物濃度との相関
は、捕獲領域に取り込まれることができるか又は取り込
まれることができない対照標準に対するその可視強度の
比較により行われることができる。光学検出装置は、Qu
idel Reflective Analyzer, Catalog No. QU0801(Quide
l Corp., San Diego, CA) により使用されるものと同様
の手段により、上記の比較を自動的に行うようにプログ
ラムされることができる。視覚的な比較は、その強度と
Quidel Total IgETest Catalog No. 0701( 多段階ELISA
検定) において使用されるような色キーとの視覚的評
価によっても可能である。したがって、分析物濃度を、
本発明により測定することができる。
【００２１】上記の捕獲領域は、吸収性の吸収領域によ
りしばしば接触されている。この吸収領域は、本装置の
マトリックスから過剰のサンプル及び非結合の標識付け
複合体を除去するための手段である。一般的には、この
吸収領域は、吸収材料、例えば、フィルター紙、ガラス
繊維フィルター、等から成ることができ、そしてその検
定が終了するところの時間を示し又は計時期間の最初及
び/ 又は終わりにおいて読まれることができる検定指示
薬の末端を含むことができる。横方向の流れ検定構造を
使用する本発明の態様は、分析物の、1 段階又は多段階
の検出及び/ 又は定量のための手段を提供する。一般的
には、生物学的な液体サンプルが、サンプル受容領域上
に置かれる。支持体マトリックス中にしみ込んだ分析物
結合物質は、この液体サンプルと混ざる。この液体サン
プル中に存在する分析物は、次に、分析物結合物質と結
合し、分析物/ 結合物質結合体を形成する。上記の結合
体は、上記の液体の横方向の流れにより上記標識付け領
域まで担持される。その中にしみ込んだ標識付け複合体
は、その液体と混ざる。この標識付け複合体の標識付け
結合物質は、液体中で結合体と結合し、標識された結合
体を形成する。この標識された結合体は、上記の液体の
横方向の流れにより捕獲領域まで担持される。この標識
された結合体は、液体サンプル中に存在する分析物を標
識として役立つ染色された微生物に結合させる、分析物
- 分析物結合物質- 標識付け結合物質- 染色された微生
物の構造物を含んで成る。
【００２２】上記の標識された結合体は、特異的に分析
物に結合する固定化された捕獲結合物質を含む捕獲領域
に接触する。この分析物含有標識結合体は、その分析物
と捕獲結合物質との間の結合により捕獲領域内に保持さ
れ、これにより、捕獲領域中で染色微生物を濃縮する。
このように保持された染色された微生物は、血清中に存
在する分析物を検出するための視覚的な手段を提供す
る。本発明の他の態様は、サンプル中の分析物の存在を
検出するための非横方向の流れの検定法であって、分析
物を捕獲するための手段及び捕獲された分析物を標識付
けするための手段を含んで成り、その改良が、その細胞
表面上の特異的標識付け結合物質をもつ染色された微生
物から本質的に成る標識付け複合体を含んで成り、上記
の捕獲手段による上記の標識付け複合体の捕獲がその細
胞表面標識付け結合物質を通して直接的又は間接的に仲
介されるような検定法を提供する。染色された微生物の
選択は、限定的ではなく、そして変動してもよい。典型
的には、細胞表面プロテインA をもつ黄色ブドウ球菌(S
taphylococcus aureus) が使用されるであろう。
【００２３】上記のタイプの検定は、一般的には、非横
方向の流れの膜検定である。このタイプの検定において
は、捕獲結合物質は、細孔性膜上に固定化されている。
この固定化された捕獲結合物質が、上記の捕獲手段を提
供する。この捕獲結合物質は、特異的に、検出されるべ
き分析物に結合するが、上記の標識付け複合体とは結合
しない。上記の生物学的液体サンプルは、上記の捕獲結
合物質と接触する膜の上に置かれる。サンプル中の分析
物は、その捕獲結合物質に結合し、一方、残りのサンプ
ルは、その膜を通して流れる。標識付け複合体を含む溶
液を、次に塗布する。この標識付け複合体は、微生物細
胞表面上の標識付け結合物質を通して捕獲された分析物
に結合する。この標識付け複合体は、その捕獲された分
析物及び標識付け結合物質を通してその捕獲結合物質に
結合される。非結合の標識付け複合体は、その膜を通し
て流れる。その膜上の標識付け複合体の集積は、生物学
的液体サンプルが分析物を含んでいることを示す色の変
化により検出される。
【００２４】あるいは、本発明の原理に従って構築され
たテスト装置は、競合的結合構成を使用することができ
る。分析物に結合した標識付け複合体は、捕獲領域中の
捕獲結合物質と可逆的に結合することができる。分析物
が生物学的液体サンプル中に存在する場合には、標識付
け複合体は、捕獲結合物質と置き換えられ、そしてその
捕獲領域の色強度は、その液体サンプルがその捕獲領域
に接触したときに減少するであろう。この色の変化は、
サンプル中の分析物の濃度を測定するための対照標準と
比較されることができる。競合的検定のためのテスト装
置を調製するとき、支持体マトリックス上に固定化され
た捕獲結合物質は、分析物に結合した過剰の標識付け複
合体に晒されるはずである。このようなやり方で、捕獲
結合物質の結合部位は、標識により飽和されるであろう
し、そして生物学的液体中の分析物は、標識付け複合体
が置き換えられているところの捕獲結合物質にのみ結合
するであろう。
【００２５】図1 を参照により、本発明の原理に従って
構築されたテスト物品(2) を説明する。このテスト物品
(2) は、非吸収性の支持体マトリックス(4) 及び横方向
の流れ構造を使用するであろう。熟練者は、異なる検定
構造、吸収性支持体マトリックス、及び他の変更を使用
する他の装置を本発明の染色された微生物による使用の
ために構築することができることを理解するであろう。
支持体マトリックス(4) は、生物学的液体サンプルを受
容し、そしてサンプルを横方向に導くことができる。こ
の支持体マトリックス(4) は、3 つの領域: サンプル受
容領域(6) 、標識付け領域(8) 、及び捕獲領域(10)に分
けられる。支持体マトリックス(4) に接触する吸収領域
(12)も在る。この吸収領域(12)は、生物学的液体サンプ
ルを吸収することができる材料から構築されている。被
検分析物に特異的な分析物結合物質が、サンプル受容領
域(6) 内にしみ込んでいる。この分析物結合物質は、液
体サンプルと混ざり、そしてそのサンプル受容領域(6)
内で分析物/ 結合物質の結合体を形成し、そして標識付
け領域(8) 内に横方向に流れる。
【００２６】標識付け領域(8) 内にしみ込んでいる標識
付け複合体は、上記の液体サンプルと混ざり、そして上
記の結合体と結合し、標識付け結合体を形成する。この
液体サンプルは、横方向の流れを続け、そしてこの標識
付けされた結合体を、固定化された捕獲結合物質をもつ
捕獲領域(10)に移動させる。この標識された結合体内の
分析物は、捕獲領域(10)内の捕獲結合物質と結合し、そ
してその上で固定化される。過剰の液体、非結合の標識
付け複合体等は、捕獲領域(10)を通して吸収領域(12)中
への横方向の流れを続ける。この液体サンプル中に存在
する分析物は、捕獲領域(10)内の染色された微生物から
の色の集積を観察することにより測定される。
【００２７】図2 を参照することにより、競合的結合検
定の実施を通してのサンプル中の分析物の検出のための
本発明の原理に従って構築されたテスト物品(2) を説明
する。このテスト物品(2) は、非吸収性の流れを可能に
する支持体マトリックス(4)及び吸収領域(12)を含んで
成る。この支持体マトリックス(4) は、2 つの領域: サ
ンプル受容領域(6) 及び捕獲領域(10)に分けられる。こ
の捕獲領域(10)は、その上に固定化された捕獲結合物質
をもつ。標識された結合体は、捕獲結合物質に結合す
る。標識された結合体は、分析物結合物質に結合した分
析物であって、次に、染色された微生物を含む標識付け
複合体に結合するもの、を含んで成る。したがって、染
色された微生物が捕獲領域(10)に保持される。液体サン
プルがサンプル受容領域(6) 上に置かれたとき、液体
は、捕獲領域(10)の中に横方向に流れる。この液体中に
存在する分析物は、捕獲結合物質に結合し、そして競合
的に、結合した標識された結合体を置き換える。標識さ
れた結合体が置き換えられるとき、それらは、その液体
と共に吸収領域(12)に横方向に流れる。このようなやり
方で、液体サンプル中の分析物は、捕獲領域中の色強度
の減少を引き起こす。以下の例は、説明により提供され
るものであり、限定により提供されるものではない。
【００２８】
【実施例】例1 本例は、本発明のテスト物品及び方法の効果について説
明する。ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン(hCG) を、既知量
のhCG を含む尿素サンプル中で検出した。この結果は、
本発明の感度と速さを証明した。20% グリセロールを含
むトリプシン大豆ブロス中の、そして液体窒素中で保存
された、黄色ブドウ球菌の種ロット(Cowan I株ATCC 125
98) を、90rpm での回転上、72時間37℃におけるトリプ
シン大豆ブロス中の25mlの接種物を増殖させるために使
用した。接種物の5ml を、トリプシン大豆ブロスのそれ
ぞれ700ml を含む3 つの1 リッター・ボトルを内に置
き、そして90rpm での回転上、48時間37℃において増殖
させた。
【００２９】得られた黄色ブドウ球菌を、Sorvall RC-5
B 遠心分離機上で3000rpm における30分間の遠心分離に
より50mlのコニカル・チューブ内に収穫した。上澄液を
デカントし、そして廃棄した。ペレットをSorvall RT 6
000 rotor 内の50mlコニカル・チューブ内での遠心分離
(3000 rpm 30分間) によりそのペレット容量の10倍のリ
ン酸バッファー生理食塩水((PBS)、0.12M 塩化ナトリウ
ム、0.05M リン酸ナトリウム、0.02% アジ化ナトリウ
ム、pH 7.2) を使用して洗浄した。この細胞を、PBS 中
の1.5%ホルムアルデヒド( 生物に非感染性を与えるため
に使用された) 中の約10% 懸濁液に再懸濁し、おして50
mlのコニカル・チューブ内に入れ、そして1.5 時間回転
させた。得られたホルムアルデヒド固定細胞を、Sorval
l RT 6000遠心分離機内の遠心分離(3000 rpm 30分間)
により収穫した。この細胞を、PBS中の約10% への再懸
濁により洗浄し、そして3000 rpmで30分間遠心分離し
た。上澄液を廃棄し、そして細胞を、PBS 中の約10% に
再懸濁した。この細胞を、水浴内で80℃で18時間インキ
ュベーションすることにより加熱殺菌した。この細胞
を、1 時間氷上に置き、その後、それらを、遠心分離(3
000 rpm 30分間) により回収した。上澄液を廃棄し、そ
してペレットをPBS 中に新たに調製された0.5mg/mlNaBH
4 中の約10% に再懸濁した。室温における15分間のイ
ンキュベーションの後、細胞を、遠心分離(3000 rpm 30
分間) にいより回収した。この上澄液を廃棄し、そして
細胞を、PBS での2 回の遠心分離により洗浄した。この
細胞を、10%に懸濁し、そしてTrisバッファー、50mM、p
H 8.0による遠心分離(3000 rpm 30分間) により1 回洗
浄した。最後に、細胞を、Trisバッファー、50mM、pH
8.0中に懸濁し、そして4 ℃で保存した。細胞が死滅し
ていることを確認するために、生物活性のチェックを、
血液寒天培地上に塗抹された懸濁液のループを48時間増
殖させることにより行った。
【００３０】黄色ブドウ球菌(7.6% の固形分濃度をもつ
9.5ml)を、10mlのCorex チューブ内で10分間、Sorvall
RC-5B 遠心分離機内で10,500rpm における遠心分離によ
りペレット化した。このペレットを、0.10M の2 炭酸ナ
トリウム、炭酸ナトリウムバッファー、pH 9.5中に懸濁
し、そして同じバッファー中での2 回の遠心分離により
洗浄した。このペレットを、最後に、8.74mlの0.10M の
2 炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウムバッファー、pH 9.5
中に懸濁した。Cibacron brilliant red 3B-A(54mg, Al
drich)を、上記の黄色ブドウ球菌懸濁液中に、素早く攪
拌しながら溶解させた。得られた赤い懸濁液を、19 x
1.5mlのEppendorf プラスチック蓋付きチューブ内に、
それぞれに500 μl 、分配し、そして終わりから終わり
まで18時間回転させた。その内容物を、30mlのCorex 遠
心分離チューブにプールし、そしてSorvall RC-SB 内
で、10,500rpm で4 ℃で10分間遠心分離した。このペレ
ットを、19mlの、tris、50mM、pH 8.0中の20% エタノー
ル中に再懸濁し、そして10,500rpm で4 ℃で10分間の遠
心分離により回収した。この上澄を廃棄し、そしてその
ペレットを、その上澄液が無色になるまで、遠心分離に
より3 回以上洗浄した。このペレットを、tris、50mM、
pH 8.0中に再懸濁し、そして遠心分離によりペレット化
した。最後に、染色された黄色ブドウ球菌生成物を、3.
78mlの、tris、50mM、pH 8.0中に懸濁し、懸濁液中13.5
% の固形分濃度にし、そして4 ℃で保存した。
【００３１】95μl のCibacron Brilliant Red 3B-A 染
色された黄色ブドウ球菌(13.5%懸濁液) を、265 μl
の、tris、50mM、pH 8.0中の10% ポリビニルピロリドン
中に希釈した。希釈された黄色ブドウ球菌の328 μl
を、両面テープ(444,3M)を使用して、マイラー・シート
により裏材を付けた、1.8 x 4.8 cm片のSontera 商標登
録スパンレースの(spunlaced) 100%アクリル・ファイバ
ー(Dupont)に塗布した。黄色ブドウ球菌がしみ込んだこ
のSontara 商標登録を、微生物を含む液体が均一に拡が
ることを可能にするため、20分間放置した。このSonter
a 商標登録の片を、冷凍庫内に置き、そして-70 ℃で60
分間で凍結させ、次に、10ミリトール(millitorr) にお
いて21時間凍結乾燥させた(Virtis Freezemobile 12)。
【００３２】マウスのモノクロナール抗体抗-hCG、サブ
クラス2a(9.44mg/ml,20 μl)を、3000μl の、tris、50
mM、pH 8.0中の10mg/ml のメチル化BSA 中に希釈した。
2846μl の部分を、3M接着剤444 を使用して、マイラー
・シートにより裏材を付けた、7.0 x 10.7 cm 片のSont
ara 商標登録スパンレースの100%アクリル・ファイバー
(Dupont)に塗布した。抗体がしみ込んだこのSontara 商
標登録を、この液体が均一に拡がることを可能にするた
め、20分間放置した。このSontera 商標登録の片を、冷
凍庫内に置き、そして-70 ℃で60分間で凍結させ、次
に、10ミリトール(millitorr) において21時間凍結乾燥
させた(Virtis Freezemobile 12)。
【００３３】抗-hCGのウサギF(ab' ) 2 断片、6.0mg/ml
を、ペンの中に入れ、そしてニトロセルロース(AE99,小
孔径8 μ、Schleicher and Schnell) 上の線の上に、SE
780XY プロッター(Asea Brown Boveri) を使用して、
0.5 秒/cm のペン・スピードで、スポットした。10分間
の風乾の後、このスポットしたニトロセルロースを、tr
is、50mM、pH 8.0中の10mg/ml のメチル化BSA 中に浸漬
し、そしてそのニトロセルロースの残りがそれが非吸収
性となるようブロックするために15分間、浸漬インキュ
ベートした。次に、それを、吸い取り紙(blotter absor
bent)(ED 939,Ahlstrom) の2 つの片の間で、5 分間、
吸い取り乾燥させ、次に強制換気オーブン内で45℃で10
分間乾燥させた。この乾燥ひたニトロセルロースを、両
面接着テープ(444,3M)により被覆されたマイラー・シー
トにより裏材を付けた。それを、相対湿度13% において
乾燥室内で保存した。3mm 幅のテスト・ストリップを、
同時係属中の特許出願USSN 07/847,487"RedBlood Cell
Separation Means for Specific Binding Assays"中に
開示された方法により、標識付け領域として使用された
染色された黄色ブドウ球菌を含むSontara 商標登録の膜
から、サンプル受容領域として使用されたマウスのモノ
クロナール抗-hCGを含むSontara 商標登録の膜から、そ
して抗-hCGのウサギF(ab' ) 2断片をもつ上記のニトロ
セルロース捕獲領域から、組み立てた。プールされたオ
スの尿中で調製された30μl の尿サンプルの検量物(cal
ibrator)を、上記の3mm hCG テスト・ストリップのサン
プル受容領域に塗布した。ニトロセルロース捕獲領域上
の最初に見えるピンク色の線の時間を、記録した( 表
1)。
【００３４】 表1 検量物(mIU/ml) 最初に見えるシグナルの時間 実験A 0 観察せず 0 観察せず 200 1 分53秒 200 2 分 6秒 1000 1 分 8秒 1000 1 分 6秒実験B 0 観察せず 0 観察せず 150 10分48秒 150 11分31秒 1000 1分40秒 1000 1分45秒 実験A の捕獲領域は、染色された黄色ブドウ球菌を含む
Sontara 商標登録の標識付け領域から、4mm 離れて配置
されていた。実験B の捕獲領域は、染色された黄色ブド
ウ球菌を含むSontara 商標登録の標識付け領域から、9m
m 離れて配置されていた。上記の結果は、標識として染
色された黄色ブドウ球菌を使用する本発明のテスト物品
及び方法が、免疫検定において分析物を検出するため
の、感度の高いそして正確な手段を提供することを証明
している。
【００３５】例2 本例は、尿サンプル中のhCG の検出のための可視免疫検
定における標識として染色された大腸菌(E.coli)を使用
する免疫検定テスト物品の構築を説明している。大腸菌
(E.coli)を、回転機上で37℃で72時間、栄養ブロス(Dif
co Laboratories, Detroit MI)中で、好気的に増殖させ
た。この培養液を、次に、1:25の割合で新たな培地に移
した。このバクテリアを、回転機上でさらに24時間、37
℃で培養した。バクテリア含有培地の一部を、以下に記
載するようなモノクロナール抗体の生産のために保存し
た。次に、この培養液を、遠心分離により収穫した。上
澄をデカントし、そして廃棄した。この細胞を、熱殺菌
し、氷上で冷却し、そして次に遠心分離により回収し
た。ペレットを、そのペレット容量の10倍のリン酸バッ
ファー生理食塩水((PBS)、0.12M 塩化ナトリウム、0.05
M リン酸ナトリウム、0.02% アジ化ナトリウム、pH 7.
2) を使用して洗浄した。この大腸菌(E.coli)を、PBS
中の1.5%ホルムアルデヒド中の約10% 懸濁液に再懸濁
し、そして50mlのコニカル・チューブ内に入れ、そして
1.5 時間回転させた。得られたホルムアルデヒド固定細
胞を、遠心分離により収穫した。この固定された細胞
を、PBS 中の約10% への再懸濁により洗浄し、そして遠
心分離した。上澄液を廃棄し、そして細胞を、PBS 中の
約10% に再懸濁した。上澄液を廃棄し、そしてペレット
をPBS 中に新たに調製された0.5mg/ml NaBH 4 中の約10
% に再懸濁した。インキュベーションの後、細胞を、遠
心分離により回収した。この上澄液を廃棄し、そして細
胞を、PBS での2 回の遠心分離により洗浄した。この細
胞を、10% に再懸濁し、そしてPBS 中の遠心分離により
1 回洗浄した。最後に、細胞を、Trisバッファー、50m
M、pH 8.0中に懸濁し、そして4 ℃で保存した。細胞が
死滅していることを確認するために、生物活性のチェッ
クを、栄養培地上に塗抹された懸濁液のループを48時間
増殖させることにより行った。
【００３６】上記の固定化された大腸菌(E.coli)を、遠
心分離によりペレット化し、そして0.10M の2 炭酸ナト
リウム、炭酸ナトリウムバッファー、pH 9.5中に懸濁し
た。Remazol Brilliant Blue R (Aldrich)を、上記細胞
懸濁液中に、溶解した。得られた懸濁液を、12時間回転
させた。この細胞を、遠心分離によりペレット化し、そ
して、19mlの、tris、50mM、pH 8.0中の20% エタノール
中に再懸濁した。この上澄を廃棄し、そしてそのペレッ
トを、その上澄液が無色になるまで、遠心分離により洗
浄した。このペレットを、tris、50mM、pH 8.0中に再懸
濁し、そして遠心分離によりペレット化した。最後に、
染色された大腸菌(E.coli)を、4.5ml の、tris、50mM、
pH 8.0中に懸濁し、懸濁液中11.0% の固形分濃度にし、
そして4℃で保存した。大腸菌(E.coli)に対するネズミ
のモノクロナール抗体を、Harlow and Lane, Antibodie
s, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laborat
ory, Cold Spring Harbor NY( 先に、引用により本明細
書中に取り込んでいる) 中に記載されたような標準的な
技術により調製した。上記の保存された微生物の部分
は、マウス又は他の動物の免疫化のための抗原を提供す
る。この収穫された抗体を、次に、過剰の精製されたブ
ドウ球菌のプロテインA(SPA)を含む溶液中で混合した。
得られた抗体/SPA複合体を、染色された大腸菌(E.coli)
と混合する。抗体は、大腸菌(E.coli)と結合し、SPA に
結合した染色粒子を作り出す。この SPAに結合した染色
大腸菌(E.coli)を、遠心分離により、非結合の抗体及び
SPA から分離する。
【００３７】上記の染色されたSPA が結合した大腸菌
(E.coli)を、tris、50mM、pH 8.0中の10% ポリビニルピ
ロリドン中に懸濁した。この大腸菌(E.coli)の456 μl
の部分を、両面テープ(444,3M)を使用して、マイラー・
シートにより裏材を付けた、2.0 x 6.0 cm片のSontera
商標登録スパンレースの100%アクリル・ファイバー(Dup
ont)に塗布した。大腸菌(E.coli)がしみ込んだこのSont
ara 商標登録を、この液体が均一に拡がることを可能に
するため、20分間インキュベートした。このSontera 商
標登録の片を、冷凍庫内に置き、そして-70 ℃で60分間
で凍結させ、次に、10ミリトールにおいて21時間凍結乾
燥させた(Virtis Freezemobile 12)。マウスのモノクロ
ナールの抗-hCGを、7.0 x 10.7 cm 片のSontara 商標登
録に塗布し、サンプル受容領域としての使用のために先
の例1 中で説明したように凍結乾燥した。ウサギの抗-h
CGのF(ab' ) 2 断片(6.0mg/ml)を、ペンの中に入れ、そ
してニトロセルロース(AE99,小孔径8 μ、Schleicher a
nd Schnell) 上の線の上に、SE 780 XY プロッター(Ase
a Brown Boveri) を使用して、0.5 秒/cm のペン・スピ
ードで、スポットした。10分間の風乾の後、このスポッ
トしたニトロセルロースを、tris、50mM、pH 8.0中の10
mg/ml のメチル化BSA 中に浸漬し、そしてそのニトロセ
ルロースの残をブロックするために15分間、浸漬インキ
ュベートした。次に、それを、吸い取り紙(ED 939, Ahl
strom)の2 つの片の間で、5 分間、吸い取り乾燥させ、
次に強制換気オーブン内で45℃で10分間乾燥させた。こ
の乾燥したニトロセルロースを、両面接着テープ(444,3
M)により被覆されたマイラー・シートにより裏材を付け
た。それを、相対湿度13% において乾燥室内で保存し
た。
【００３８】3mm 幅のテスト・ストリップを、同時係属
中の特許出願USSN 07/847,487"RedBlood Cell Separati
on Means for Specific Binding Assays"中に開示され
た方法により、標識付け領域として染色された大腸菌
(E.coli)を含むSontara 商標登録の膜から、サンプル受
容領域としてマウスのモノクロナール抗-hCGを含むSont
ara 商標登録の膜から、そして抗-hCGのウサギF(ab' )
2 断片をもつ上記のニトロセルロース捕獲領域から、組
み立てた。
【００３９】例3 本例は、血清中の癌胎児性抗原(carcinoembryonic)の検
出のためのテスト物品の製造について説明する。このテ
スト物品は、本検定中の可視標識として染色されたブド
ウ球菌C 属を使用する。ブドウ球菌C 属細胞を、TYT-グ
ルコース培地中37℃で培養する。この細胞を、遠心分離
により収穫し、そして2 サイクルの遠心分離により洗浄
し、そして10mMTris-0.15 M NaCl 中のそのペレットの
懸濁液を、HCl でpH 7.5に調整する。この細胞を、加熱
殺菌し、そして生物活性を、血液寒天上の塗抹の培養に
よりチェックする。この細胞が生物活性のないことを確
認した後、この細胞を、遠心分離により2回洗浄し、そ
して0.10M の、2 炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム・バ
ッファー、pH 9.5の溶液中に再懸濁する。Cibacron Bri
lliant Red 3B-A を、この溶液中に溶解し、そしてその
細胞を、18時間インキュベートする。この細胞を、遠心
分離によりペレット化し、そして19mlの、tris、50mM、
pH 8.0中の20% エタノール中に再懸濁する。この上澄
を、廃棄し、そしてそのペレットを、その上澄が無色に
なるまで遠心分離により洗浄した。このペレットを、tr
is、50mM、pH 8.0中再懸濁し、そして遠心分離によりペ
レット化した。最後に、染色された細胞を、4.0ml の、
tris、50mM、pH 8.0中に懸濁し、懸濁液中12.5% の固形
分濃度にし、そして4 ℃で保存した。この染色されたブ
ドウ球菌C 属を、PBS 中の遠心分離により2 回洗浄し、
そして、0.06% の固形分濃度において、0.02% アジ化ナ
トリウムを含む3%メチル化BSA/PBS 中に再懸濁する。
【００４０】8 μ小孔径のニトロセルロース膜を、以下
のように調製した。この膜を、チャート記録計に張り、
そして抗-CEA Fab断片を、50mM Tris 、pH 8.0中の10mg
/mlにおける線内に計量配分する。この抗-CEA線が、本
装置の捕獲領域を定める。上記の染色された細胞懸濁液
を、上記の抗-CEA線に約1cm 離れて平行な上記の膜に塗
布した。マウス抗-CEA IgG抗体を、上記の抗-CEA Fab断
片線の位置と反対側の上の上記の染色された細胞懸濁液
に約1cm 離れて平行な上記の膜に塗布した。次に、この
ニトロセルロース膜を、5mg/ml mBSA を含む、50mM Tri
s マレイン酸塩バッファー、pH 7.0を含むトレー内に、
室温で5 分間置く。この膜を、過剰の液体を除去するた
めに吸い取り、対流オーブン内で45℃で5 分間乾燥し、
そして本装置を組み立てるまで、室温でデシケーター内
で保存した。。次に、この膜を、10 x 7.5 mm の長方形
であって、それぞれに、抗-CEA抗体線( サンプル受容領
域) 、染色されたブドウ球菌C 属線( 標識付け領域) 、
及び抗-CEA Fab線( 捕獲領域) を含むもの、に切断す
る。これまで述べた発明は、明瞭さ及び理解の目的のた
めに、説明及び例により、いくぶん詳細に記載したけれ
ども、付属の請求の範囲の範囲内で変更及び修正を行う
ことができることは明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の原理に従って構築されたテスト物品に
ついて説明している。
【図２】競合的結合検定の実施を通してのサンプル中の
分析物の検出のための、本発明の原理に従って構築され
たテスト物品について説明している。
【符号の説明】
２…テスト物品 ４…非吸収性支持体マトリックス ６…サンプル受容領域(zone) ８…標識付け領域 １０…捕獲領域 １２…吸収領域
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジェラルド エル．ロウリー アメリカ合衆国，カリフォルニア 92128, サン ディエゴ，324，ストーニー ピー ク ドライブ 11767

Claims (38)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 支持体マトリックス; 及びその支持体マ
    トリックス内にしみ込んだ標識付け複合体を含んで成る
    テスト物品であって、その標識付け複合体がその細胞表
    面上に、特異的な標識付け結合物質をもつ染色された微
    生物を含んで成るもの。
  2. 【請求項２】 前記の染色された微生物が、前記の特異
    的な標識付け結合物質を提供する天然の細胞表面レセプ
    タをもつ、請求項１に記載のテスト物品。
  3. 【請求項３】 前記の微生物が、黄色ブドウ球菌(Staph
    ylococcus aureus)であり、そして前記の特異的な標識
    付け結合物質が、プロテインA である、請求項２に記載
    のテスト物品。
  4. 【請求項４】 前記の特異的な標識付け結合物質が、前
    記の細胞表面に直接的に結合している免疫グロブリンで
    ある、請求項１に記載のテスト物品。
  5. 【請求項５】 前記の標識付け複合体が、前記の支持体
    マトリックス内で凍結乾燥されている、請求項１に記載
    のテスト物品。
  6. 【請求項６】 前記の支持体マトリックスが、液体サン
    プルの非吸収性の流れを導く固体マトリックスである、
    請求項１に記載のテスト物品。
  7. 【請求項７】 前記の支持体マトリックスが、液体サン
    プルの吸収性の流れを導く固体マトリックスである、請
    求項１に記載のテスト物品。
  8. 【請求項８】 前記の支持体マトリックスが、ポリエス
    テル、アクリロニトリル共重合体、レーヨン、ガラス繊
    維、セルロース、及びそれらの混合物から成る織物(fab
    ric)である、請求項１に記載のテスト物品。
  9. 【請求項９】 前記の織物が、その織物に非吸収性を与
    えるために、ブロッキング剤で処理されている、請求項
    ８に記載のテスト物品。
  10. 【請求項１０】 流路を定める支持体マトリックス; そ
    の流路に沿って配置され、かつ、その中にしみ込んだ分
    析物に特異的な分析物結合物質をもつ、サンプル受容領
    域であって、分析物/ 結合物質の結合体が、その分析物
    を上記のサンプル受容領域へ塗布することにより形成さ
    れているもの;上記流路に沿って上記のサンプル受容領
    域から下流に配置され、かつ、その中にしみ込んだ標識
    付け複合体をもつ標識付け領域であって、この標識付け
    複合体が、その細胞表面上に上記の結合体に特異的な標
    識付け結合物質をもつ、染色された微生物を含んで成る
    もの; 及び、上記流路に沿って上記の標識付け領域から
    下流に配置され、かつ、その中に固定化された上記の分
    析物に特異的な捕獲結合物質をもつ捕獲領域、を含んで
    成るテスト物品。
  11. 【請求項１１】 前記のサンプル受容領域内の分析物結
    合物質が、その分析物に特異的なIgG 抗体である、請求
    項１０に記載のテスト物品。
  12. 【請求項１２】 前記の抗体が、抗-hCGである、請求項
    １１に記載のテスト物品。
  13. 【請求項１３】 前記の標識付け領域内の標識付け複合
    体が、染色された黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aure
    us) であり、そして前記の標識付け結合物質が、プロテ
    インA である、請求項１１に記載のテスト物品。
  14. 【請求項１４】 前記の捕獲領域内の捕獲結合物質が、
    その分析物に特異的な抗体又は抗体断片であり、かつ、
    それがプロテインA に結合しないようにF C領域を欠い
    ている、請求項１３に記載のテスト物品。
  15. 【請求項１５】 前記の標識付け結合物質が、その細胞
    表面に直接的に結合されている免疫グロブリンでる、請
    求項１０に記載のテスト物品。
  16. 【請求項１６】 前記の分析物結合物質が、前記のサン
    プル受容領域内で凍結乾燥されている、請求項１０に記
    載のテスト物品。
  17. 【請求項１７】 前記の標識付け複合体が、前記の標識
    付け領域内で凍結乾燥されている、請求項１０に記載の
    テスト物品。
  18. 【請求項１８】 前記の捕獲結合物質が、前記の捕獲領
    域内で乾燥されているが、凍結乾燥されていない、請求
    項１０に記載のテスト物品。
  19. 【請求項１９】 前記の支持体マトリックスが、液体サ
    ンプルの非吸収性の流れを導く固体マトリックスであ
    る、請求項１０に記載のテスト物品。
  20. 【請求項２０】 前記の支持体マトリックスが、液体サ
    ンプルの吸収性の流れを導く固体マトリックスである、
    請求項１０に記載のテスト物品。
  21. 【請求項２１】 前記の支持体マトリックスが、ポリエ
    ステル、アクリロニトリル共重合体、レーヨン、ガラス
    繊維、セルロース、及びそれらの混合物から成る織物で
    ある、請求項１０に記載のテスト物品。
  22. 【請求項２２】 前記の織物が、その織物に非吸収性を
    与えるために、ブロッキング剤で処理されている、請求
    項２１に記載のテスト物品。
  23. 【請求項２３】 テスト物品の製造方法であって、支持
    体マトリックス内に、その細胞表面上に特異的な標識付
    け結合物質をもつ染色された微生物を含んで成る標識付
    け複合体をしみ込ませることを含んで成るような方法。
  24. 【請求項２４】 前記の標識付け複合体が、前記の支持
    体マトリックス内で凍結乾燥されている、請求項２３に
    記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記の染色された微生物が、黄色ブド
    ウ球菌(Staphylococcus aureus) であり、そして前記の
    特異的な標識付け結合物質が、プロテインAである、請
    求項２３に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記の特異的な標識付け結合物質が、
    その細胞表面に直接的に結合されている免疫グロブリン
    である、請求項２３に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 前記の支持体マトリックスが、液体サ
    ンプルの非吸収性の流れを導く固体マトリックスであ
    る、請求項２３に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 前記の支持体マトリックスが、液体サ
    ンプルの吸収性の流れを導く固体マトリックスである、
    請求項２３に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 前記の支持体マトリックスが、ポリエ
    ステル、アクリロニトリル共重合体、レーヨン、ガラス
    繊維、セルロース、及びそれらの混合物から成る織物で
    ある、請求項２３に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 前記の織物が、その織物に非吸収性を
    与えるために、ブロッキング剤で処理されている、請求
    項２９に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 改良された横方向の流れの検定法であ
    って、標識付け複合体と捕獲領域内の捕獲結合物質との
    間の結合が、その捕獲領域を通って流れるサンプル中の
    分析物の存在により仲介され、その改良が、その細胞表
    面上に特異的標識付け結合物質をもつ染色された微生物
    から本質的に成る標識付け複合体の使用を含んで成り、
    その標識付け複合体とその捕獲結合物質との間の結合が
    その細胞表面の標識付け結合物質を通して直接的に又は
    間接的に行われるようなタイプの検定法。
  32. 【請求項３２】 前記の捕獲領域を通してのサンプルの
    流れが、分析物- 標識付け複合体の結合体をその捕獲物
    質へ結合することをもたらし、それにより、標識が、そ
    のサンプル中の分析物の量に比例してその捕獲領域内に
    集積する、請求項３１に記載の検定法。
  33. 【請求項３３】 前記の捕獲領域を通してのサンプルの
    流れが、分析物をその捕獲結合物質へ結合することをも
    たらし、それにより、その捕獲領域内で先に結合した標
    識付け複合体が、競合的に置き換えられ、そのサンプル
    中の分析物の量に比例して標識の消耗をもたらす、請求
    項３１に記載の検定法。
  34. 【請求項３４】 前記の染色された微生物が、前記の特
    異的な標識付け結合物質を提供する天然の細胞表面レセ
    プタをもつ、請求項３１に記載の検定法。
  35. 【請求項３５】 前記の染色された微生物が、黄色ブド
    ウ球菌(Staphylococcus aureus) であり、そして前記の
    特異的な標識付け結合物質が、プロテインAである、請
    求項３４に記載の検定法。
  36. 【請求項３６】 前記の特異的な標識付け結合物質が、
    その細胞表面に直接的に結合されている免疫グロブリン
    である、請求項３１に記載の検定法。
  37. 【請求項３７】 サンプル中の分析物の存在を測定する
    ための検定法であって、その分析物を捕獲する手段及び
    捕獲された分析物を標識付けするための手段を含んで成
    り、その改良が、その細胞表面上に特異的標識付け結合
    物質をもつ染色された微生物から本質的に成る標識付け
    複合体を含んで成り、上記の捕獲手段によるその標識付
    け複合体の捕獲がその細胞表面の標識付け結合物質を通
    して直接的に又は間接的に仲介されるような検定法。
  38. 【請求項３８】 前記の微生物が、黄色ブドウ球菌(Sta
    phylococcus aureus) であり、そして前記の標識付け結
    合物質が、プロテインA である、請求項３３に記載の検
    定法。
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