JPH06312999A

JPH06312999A - 血液凝固第ｖｉｉｉ因子の分離方法

Info

Publication number: JPH06312999A
Application number: JP5123272A
Authority: JP
Inventors: Shigeru Igarashi; 滋五十嵐; Toru Suzuki; 亨鈴木; Sukekazu Tomono; 丞計伴野; Sadami Sekiguchi; 定美関口; Hisafumi Ito; 尚史伊藤
Original assignee: NIPPON SEKIJIYUUJISHIYA; NIPPON SEKIJUJISHA; Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: NIPPON SEKIJIYUUJISHIYA; NIPPON SEKIJUJISHA; Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1993-04-28
Filing date: 1993-04-28
Publication date: 1994-11-08

Abstract

(57)【要約】【目的】第ＶＩＩＩ因子を含む種々の血漿蛋白質を含
有する溶液から第ＶＩＩＩ因子を直接、特異的且つ効率
的に吸着することのでき、しかも吸着された第ＶＩＩＩ
因子の脱着・回収が容易にできる吸着材を用いて、第Ｖ
ＩＩＩ因子を効率的に分離する方法を提供する。【構成】ポリカチオンを有する分子が水不溶性担体に
結合・固定化されてなる複合体よりなる吸着材に第ＶＩ
ＩＩ因子を吸着させた後に、カルシウムイオンを含む水
溶液を溶出液として用いて第ＶＩＩＩ因子を溶出するこ
とを特徴とする。【効果】本発明に用いる吸着材は第ＶＩＩＩ因子に対
して極めて特異的な吸着挙動を示し、第ＶＩＩＩ因子を
含む種々の血漿蛋白質を含有する溶液から第ＶＩＩＩ因
子を高い収率で吸着、カルシウムイオンを含む水溶液を
溶出液として用いることにより高い選択率と高い収率で
回収することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、血液凝固第ＶＩＩＩ因
子（以後、単に“第ＶＩＩＩ因子”と称す）の分離方法
に関する。さらに詳しくは、第ＶＩＩＩ因子を含む種々
の血漿蛋白質を含有する溶液から第ＶＩＩＩ因子を効率
的に吸着、回収するのに適した、ポリカチオンを有する
分子が水不溶性担体に結合・固定化された複合体よりな
る吸着材に第ＶＩＩＩ因子を吸着させた後、カルシウム
イオンを含む水溶液を溶出液として用い、第ＶＩＩＩ因
子を溶出することにより分離する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】血液凝固は、多種類の因子が複雑に関与
する現象であり、これらの因子の質的あるいは量的な欠
損は出血性疾患として観察される。先天的な出血性疾患
の例として血友病Ａを挙げることができる。血友病Ａ
は、第ＶＩＩＩ因子と呼ばれる蛋白質の欠損によるもの
で、血友病Ａ患者が健常者と変わらない生活を営むため
には、不足している第ＶＩＩＩ因子を補充する必要があ
る。

【０００３】第ＶＩＩＩ因子を補充するために、第ＶＩ
ＩＩ因子濃縮製剤と呼ばれる血漿分画製剤が広く用いら
れている。第ＶＩＩＩ因子濃縮製剤は通常、クリオプレ
シピテートと呼ばれる血漿からの沈澱物を原料とし、フ
ィブリノゲンやフィブロネクチン等の夾雑蛋白質を除去
することにより調製されている。［Ｓ．Ｊ．Ｓｌｉｃｈ
ｔｅｒｅｔａｌ．：Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，Ｖｏ
ｌ．１６，ｐｐ．６１６−６２６（１９７６）］。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】クリオプレシピテート
は、新鮮凍結血漿を低温下で融解することにより生じる
沈澱を遠心分離して得ることができる。しかし、血漿に
含まれる第ＶＩＩＩ因子を１００％とすると、クリオプ
レシピテートでの第ＶＩＩＩ因子の回収率は４０〜５０
％と低値である。さらに、クリオプレシピテート中には
夾雑蛋白質が多く含まれているため、それらの夾雑蛋白
質を除去する必要があり、一般にジエチルアミノエチル
基のような低分子リガンドを水不溶性担体に固定化した
吸着材［Ｃ．Ｍｉｃｈａｌｓｋｉｅｔａｌ．：Ｖｏ
ｘＳａｎｇ，Ｖｏｌ．５５，ｐｐ．２０２−２１０
（１９８８）］が使われることが多いが、この吸着材
は、血液凝固第ＩＸ因子（以後、単に“第ＩＸ因子”と
称す）が第ＶＩＩＩ因子と共存する場合には、第ＩＸ因
子の方をより多く吸着するため、第ＶＩＩＩ因子濃縮製
剤を調製するまでに複雑な精製工程が必要となり、最終
的な製剤における第ＶＩＩＩ因子の回収率は約２０％に
まで低下するという問題点がある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】以上のような問題点を解
決するため、血漿から直接、あるいはクリオプレシピテ
ート分取後の上清から効率よく第ＶＩＩＩ因子を吸着、
回収することのできる吸着材およびそれを用いた第ＶＩ
ＩＩ因子の分離方法の開発が望まれていた。

【０００６】第ＶＩＩＩ因子は分子量約３０万の蛋白質
であり、そのアミノ酸配列解析から、酸性アミノ酸に富
む領域の存在することが知られている［Ｇ．Ａ．Ｖｅｈ
ａｒｅｔａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３１２，ｐ
ｐ．３３７−３４２（１９８４）］。さらに、血液中で
は分子量１００万〜２，０００万のマルチマー構造を有
するフォンヴィルブランド因子との複合体として存在す
ることが知られている（Ｚ．Ｍ．Ｒｕｇｇｅｒｉｅｔ
ａｌ．：Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．５７、ｐｐ．１１４０
−１１４３（１９８１））。

【０００７】本発明者らは、鋭意研究の結果、このよう
な巨大な分子量を有する蛋白質を効率良く吸着するため
には、陰イオン交換基を多数個有し、かつ十分な長さを
有していて、該複合体と複数点で相互作用することによ
り強固に吸着することが可能な物質を有する吸着材が好
適であることを見出した。さらに、このような吸着材お
よびそれを用いた第ＶＩＩＩ因子の分離方法を開発すべ
く鋭意検討の結果、ポリカチオンを有する分子が水不溶
性担体に結合・固定化してなる複合体よりなる吸着材が
第ＶＩＩＩ因子に対して極めて特異的な吸着挙動を示
し、第ＶＩＩＩ因子を含む種々の血漿蛋白質を含有する
溶液から第ＶＩＩＩ因子を高い選択率と高い収率で吸着
し、溶出液としてカルシウムイオンを含む水溶液を用い
たときに高い収率で第ＶＩＩＩ因子を回収できることを
見い出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成し
たものである。

【０００８】したがって、本発明の１つの、かつ主たる
目的は、第ＶＩＩＩ因子を含む種々の血漿蛋白質を含有
する溶液から第ＶＩＩＩ因子を直接、特異的かつ効率的
に吸着することのでき、しかも、吸着された第ＶＩＩＩ
因子の脱着・回収が容易にできる吸着材を用いて、第Ｖ
ＩＩＩ因子を効率よく分離する方法を提供することであ
る。

【０００９】本発明の上記および他の諸目的、諸特徴、
諸利益は、次に述べる本発明の詳細な説明および添付の
請求範囲の記載から明らかになろう。

【００１０】本発明によれば、ポリカチオンを有する分
子が水不溶性担体に結合・固定化されてなる複合体に第
ＶＩＩＩ因子を吸着させた後、カルシウムイオンを含む
水溶液を溶出液として用い、第ＶＩＩＩ因子を溶出する
ことにより分離することを特徴とする第ＶＩＩＩ因子の
分離方法が提供される。

【００１１】本発明で用いる吸着材に固定化されたポリ
カチオンを有する分子は、分子中に陰イオン交換基を多
数個持つものをいう。陰イオン交換基としては、一級ア
ミノ基、二級アミノ基、三級アミノ基、四級アンモニウ
ム塩基等をあげることができる。これらの陰イオン交換
基の１種類が単独でポリカチオンを有する分子の中に存
在してもよく、また、２種類以上が存在してもかまわな
い。

【００１２】このような分子の例として、側鎖に陰イオ
ン交換基を有する塩基性ビニル単量体の単独重合体、ま
たは該塩基性ビニル単量体と、それと共重合し得るビニ
ル単量体との共重合体を挙げることができる。また、該
塩基性ビニル単量体のかわりに、重合後に陰イオン交換
基をつけることのできる側鎖を有するビニル単量体を用
いることもできる。さらに、リジンやアルギニン等の塩
基性アミノ酸を含むポリペプチドを挙げることができ
る。

【００１３】側鎖に陰イオン交換基を有する塩基性ビニ
ル単量体としては、一級アミノ基、二級アミノ基、三級
アミノ基、四級アンモニウム塩基を有するビニル単量体
が含まれる。このようなビニル単量体の例としては、そ
れぞれアミノ基を有するアクリル酸誘導体、メタアクリ
ル酸誘導体、アクリル酸アミド誘導体およびメタアクリ
ル酸アミド誘導体、さらには側鎖にピリジル基、イミダ
ゾリル基等の含窒素芳香環基を有するビニル化合物、お
よびアミノ基で置換されたスチレン誘導体等が用いられ
る。具体的な例として、ジメチルアミノエチルアクリレ
ート、ジエチルアミノエチルアクリレート、ジメチルア
ミノプロピルアクリレート、３−ジメチルアミノ−２−
ヒドロキシプロピルアクリレート、３−ジエチルアミノ
−２−ヒドロキシプロピルアクリレート、Ｎ−ジメチル
アミノエチルアクリル酸アミド、Ｎ−ジエチルアミノエ
チルアクリル酸アミド、ジメチルアミノエチルメタアク
リレート、ジエチルアミノエチルメタアクリレート、ジ
エチルアミノプロピルメタアクリレート、３−ジメチル
アミノ−２−ヒドロキシプロピルメタアクリレート、３
−ジエチルアミノ−２−ヒドロキシプロピルメタアクリ
レート、Ｎ−ジメチルアミノエチルメタアクリル酸アミ
ド、Ｎ−ジエチルアミノエチルメタアクリル酸アミド、
および下記化１式

【００１４】

【化１】（ただし、Ｒは−ＣＨ₃または−Ｃ₂Ｈ₅、Ｘは（ＣＨ
₂）_n、ｎは１〜３の整数を表わす。）で示されるスチ
レン誘導体を挙げることができる。また、たとえば、下
記化２式

【００１５】

【化２】のような、重合後にアミノ化のできる側鎖を有するビニ
ル単量体を用いることもできる。

【００１６】上述の塩基性ビニル単量体と共重合し得る
ビニル単量体の例としては、Ｎ−ビニルピロリドン、ア
クリル酸エステル、メタアクリル酸エステル、Ｎ−アル
キルアクリル酸アミド、Ｎ−アルキルメタアクリル酸ア
ミド等を挙げることができる。このようなビニル単量体
で好ましい具体的な例としては、ヒドロキシエチルアク
リレート、ヒドロキシプロピルアクリレート、ヒドロキ
シエチルメタアクリレート、およびヒドキシプロピルメ
タアクリレートを挙げることができる。

【００１７】上に挙げた、ポリカチオンを有する分子の
例のうち、塩基性ビニル単量体として、アミノ基を有す
るアクリル酸誘導体、メタアクリル酸誘導体、アクリル
酸アミド誘導体またはメタアクリル酸アミド誘導体を用
い、塩基性ビニル単量体と共重合し得るビニル単量体と
して、アクリル酸エステル、メタアクリル酸エステル、
Ｎ−アルキルアクリル酸アミドまたはＮ−アルキルメタ
アクリル酸アミドを用いて得られる共重合体が好まし
い。

【００１８】本発明で用いる吸着材に固定化されるポリ
カチオンを有する分子の分子量は、少なくとも１，００
０であるが、１５，０００以上のときに好ましい結果を
与えることが多い。分子量がこれより小さいときには、
第ＶＩＩＩ因子が極めて巨大な蛋白質であるために、該
分子と第ＶＩＩＩ因子との十分な相互作用が期待しにく
い。また、本発明で用いる吸着材は、それを構成するポ
リカチオンを有する分子および水不溶性担体よりなる複
合体１ミリリットルあたりの正電荷密度が１μｅｑ〜２
００μｅｑである。該複合体１ミリリットルあたりの正
電荷密度が１μｅｑ未満の場合には、第ＶＩＩＩ因子が
十分に吸着されず、また、２００μｅｑを越える場合に
は、第ＶＩＩＩ因子の吸着が強くなり溶出が困難になる
ことや他の蛋白質の吸着も多くなる等の問題が生じてく
る。なお、本発明で用いる吸着材を構成する複合体の正
電荷密度は、以下に示す方法により求めたものをいう。
水で膨潤させた吸着材１ミリリットルをプラスチック製
カラムに入れ１規定塩酸、水、１規定水酸化ナトリウム
水溶液の順で洗った後、カラムからの落下液のｐＨが
６．５程度になるまで水で洗う。その後、５０ミリリッ
トルの試験管に吸着材を移して０．０１規定塩酸２０ミ
リリットルを入れて２４時間ゆるやかに振とうする。上
清５ミリリットルを２０ミリリットルの三角フラスコに
移し、フェノールフタレイン水溶液を指示薬として入
れ、０．０１規定水酸化ナトリウム水溶液で、ビュレッ
トを用いて滴定を行うことにより測定し、正電荷密度を
求める。本発明で用いる吸着材を構成する水不溶性担体
は、親水性担体、疎水性担体いずれも使用できるが、疎
水性担体では第ＶＩＩＩ因子以外の蛋白質の該担体への
非特異的吸着が生じるため、親水性担体の方が好ましい
結果を与える。

【００１９】また、水不溶性担体はポリカチオンを有す
る分子を化学結合により固定化するのに利用できる官能
基を有するものであれば特に限定されない。化学結合は
共有結合によるものが好ましい。該官能基を水不溶性担
体自体が持たない場合でも、適当な化学的修飾によりポ
リカチオンを有する分子の固定化に利用し得る官能基を
生じさせることができるものは、本発明で用いる吸着材
を構成する水不溶性担体として使用することができる。

【００２０】水不溶性担体の形状は、粒子状、繊維状、
中空糸状、膜状等いずれの公知の形状も用い得るが、吸
着材としての取扱い等の点から、粒子状、繊維状のもの
が好ましい。

【００２１】このような水不溶性担体のうち粒子状担体
としては、アガロース系、デキストラン系、セルロース
系等の天然高分子系担体、ポリアクリルアミド系、ポリ
アミド系、ポリエステル系、ポリウレタン系、ビニル化
合物の重合体等の合成高分子系担体を挙げることができ
る。多孔性構造を有する担体を用いると、担体の表面積
が増大するため、固定化されたポリカチオンを有する分
子と、第ＶＩＩＩ因子との接触が容易になり、吸着され
る第ＶＩＩＩ因子の量が増すという良好な結果を与え
る。特に、親水性単量体単位により親水化されたビニル
化合物の重合体が、多孔性構造の担体を作りやすく、ま
た、物理的強度の大きい担体が得やすいため、第ＶＩＩ
Ｉ因子の精製工程に組み入れる時に、好ましい結果を与
える。なかでも、ビニルアルコール単位を有する架橋共
重合体が蛋白質の担体への非特異的吸着が少なくなり、
好ましい結果を与えることが多い。また、繊維状担体と
しては、セルロース系、ポリエステル系等公知の繊維を
用いることができる。繊維状担体を用いる場合には、そ
の繊維が０．０２デニールないし１０デニールの範囲に
あるものがよい。

【００２２】多孔性構造を有する粒子状担体は、排除限
界分子量が１，０００ないし１００，０００，０００の
範囲であり、平均粒子径が５ないし１，０００μｍであ
るものが好ましい。

【００２３】ポリカチオンを有する分子の水不溶性担体
への結合・固定化には、化学結合、特に共有結合による
方法を用いるのがよい。そのためには、通常、固定化酵
素やアフィニティクロマトグラフィーで用いられる公知
の水不溶性担体の活性化方法およびポリカチオンを有す
る分子の固定化方法を用いることができる。［笠井献一
ら：「アフィニティークロマトグラフィー」（株）東京
化学同人発行（１９９１）］。また、必要に応じて水不
溶性担体とポリカチオンを有する分子との間に任意の長
さの分子（スペーサー）を導入して使用することもでき
る。

【００２４】水不溶性担体を活性化して生じる活性基
は、ポリカチオンを有する分子のアミノ基、カルボキシ
ル基、水酸基、チオール基等の活性水素を有する求核反
応基と反応し得る基であり、具体的には、エポキシ基、
トレシル基（ｔｒｅｓｙｌｇｒｏｕｐ）（−Ｏ−ＳＯ
₂−ＣＨ₂−ＣＦ₃）、イミダゾリルカルバメート基、イ
ミドカーボネート基、ホルミル基、ブロモアセチル基、
ハロゲン化トリアジン基などを挙げることができる。

【００２５】本発明では、第ＶＩＩＩ因子を含む種々の
血漿蛋白質を含有する溶液と上述の吸着材とを接触させ
ることにより、吸着材に該溶液中の第ＶＩＩＩ因子を吸
着させる。この時の第ＶＩＩＩ因子を含む種々の血漿蛋
白質を含有する溶液としては、血漿、あるいは血漿から
の生成物としては、前述のクリオプレシピテート、血漿
からクリオプレシピテートを分離除去した後の上清、イ
オン交換樹脂等による適当な処理を施して夾雑成分の一
部または全部を除去した血漿などを挙げることができ
る。

【００２６】本発明で用いる吸着材は、種々の条件下
で、第ＶＩＩＩ因子を含む種々の血漿蛋白質を含有する
溶液の第ＶＩＩＩ因子を吸着することが可能であるが、
通常は常温、常圧での吸着を行うのが、第ＶＩＩＩ因子
の安定性の点からは好ましい。温度は、第ＶＩＩＩ因子
の安定な範囲で行われるが、通常、０〜５０℃で行う。
吸着時間も特に限定はされないが、通常は１０分〜２時
間の範囲で行うが、温度、吸着の方法により、適当な時
間を選択することができる。

【００２７】吸着の方法については、回分式またはカラ
ム式のどちらでも実施し得る。

【００２８】使用する吸着材の量については、吸着材／
血漿の比の値が低いほど、コストの点から有利である
が、本発明では、吸着材／血漿の容量比の値が１／１０
〜１／１００の範囲で用いることができる。

【００２９】本発明では、上述のようにして吸着材に吸
着された第ＶＩＩＩ因子を、カルシウムイオンを含む水
溶液を溶出液として用いて溶出することにより第ＶＩＩ
Ｉ因子を分離する。溶出後の第ＶＩＩＩ因子を含む溶液
中の第ＶＩＩＩ因子の純度を高めるために、第ＶＩＩＩ
因子を溶出する前に、適当な洗浄液を用いて、第ＶＩＩ
Ｉ因子が吸着された吸着材を洗浄する。この時の洗浄液
としては、吸着された第ＶＩＩＩ因子を失活させたり、
溶出させることなく、かつ、吸着された第ＶＩＩＩ因子
以外の夾雑蛋白質等の不純物を吸着材からできるだけ多
く除去し得るものであれば特に限定されないが、クエン
酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス緩衝液、
イミダゾール緩衝液等の水溶液を用いることができる。
洗浄の効率を上げる目的で、生物学的に許容し得る無機
塩、界面活性剤、有機溶媒類等を添加することができ
る。また、血液凝固系の活性化を防ぐ目的で、抗凝固剤
を添加すると好ましいことが多い。

【００３０】吸着された第ＶＩＩＩ因子を溶出するため
の溶出液中のカルシウムイオンは、塩化カルシウム、臭
化カルシウム、ヨウ化カルシウム、酢酸カルシウム、硝
酸カルシウム等およびグルコン酸、ラクトン酸等の糖酸
の水溶性カルシウム塩から供給されるものを用いること
ができる。カルシウムイオンの濃度は０．０５〜１Ｍで
あり、ｐＨは６〜８の範囲にあるのがよい。

【００３１】本発明で溶出液として用いるカルシウムイ
オンを含む水溶液は、ｐＨの安定性の点から緩衝液であ
ることが好ましい。このような緩衝液の例としては、ｐ
Ｈ６〜８の範囲で緩衝能を有するクエン酸、リン酸、イ
ミダゾール、酢酸およびアミノ酸類を用いて作成される
ものを挙げることができる。

【００３２】また、血漿凝固系が活性化されることによ
る第ＶＩＩＩ因子の損失を防ぐ目的で、適当な抗凝固剤
を添加することは、第ＶＩＩＩ因子の回収率を上げるた
めに好ましい。このような抗凝固剤としては、ヘパリ
ン、アンチトロンビンＩＩＩ、ヒルジン、フサン、蛋白
質分解酵素阻害剤等を挙げることができる。蛋白質分解
酵素阻害剤の具体例としては、ベンズアミジン、トリプ
シンインヒビター、フェニルメチルスルフォニルフロラ
イド等を挙げることができる。また、第ＶＩＩＩ因子と
ポリカチオンを有する分子との相互作用のうち、イオン
交換相互作用を弱める目的で、生物学的に許容し得る無
機塩を添加することができる。このような無機塩の具体
的な例として、塩化ナトリウム、臭化ナトリウム、ヨウ
化ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム、塩化カリウ
ム、臭化カリウム、ヨウ化カリウム、チオシアン酸カリ
ウム等を挙げることができる。さらに、該水溶液には、
第ＶＩＩＩ因子とポリカチオンを有する分子との相互作
用のうち、疎水的相互作用を弱める目的で、生物学的に
許容し得る有機溶媒類および／または界面活性剤を添加
することができる。このような有機溶媒類の具体的な例
として、エタノール、イソプロピルアルコール、エチレ
ングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレング
リコール、ポリプロピレングリコール、酢酸アミル、ア
ルキルフォスフェート、ジアルキルエーテル等を、界面
活性剤の具体的な例として、トリトンＸ−１００、トゥ
イーン８０、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナ
トリウム等を挙げることができる。また、溶出後の第Ｖ
ＩＩＩ因子の安定剤として、アミノ酸類、糖類、糖アル
コール類を添加することができる。

【００３３】第ＶＩＩＩ因子が吸着された吸着材から、
本発明の溶出液を用いて種々の条件下で第ＶＩＩＩ因子
を溶出することが可能であるが、第ＶＩＩＩ因子の安定
性の点から、通常、０℃〜５０℃の範囲で、常圧下で行
う。

【００３４】溶出の方法については、回分式またはカラ
ム式のどちらでも実施し得るが、第ＶＩＩＩ因子溶出の
前段階の洗浄操作も含めた処理を連続して行う場合に
は、カラム式の方が効率的であり、好ましいことが多
い。

【００３５】吸着材を洗浄した後のカルシウムイオンを
含む水溶液を用いた第ＶＩＩＩ因子の溶出方式について
は、ステップワイズ溶出方式、グラジエント溶出方式い
ずれの方式でも実施し得るが、操作性、効率の点から、
ステップワイズ方式の方が好ましいことが多い。

【００３６】

【実施例】以下の実施例において、本発明をさらに詳細
に説明するが、本発明は実施例に何ら限定されるもので
はない。

【００３７】（実施例１）吸着材を下に示すようにして
合成した。

【００３８】まず、水不溶性担体として、ビニルアルコ
ール単位を有する架橋共重合体を下に示すようにして合
成した。酢酸ビニル１００ｇ、トリアリルイソシアヌレ
ート６４．３ｇ、酢酸エチル１００ｇ、ヘプタン１００
ｇ、ポリ酢酸ビニル（重合度５００）７．５ｇおよび
２，２’ーアゾビスイソブチロニトリル３．８ｇよりな
る均一混合液と、ポリビニルアルコール１重量％、リン
酸２水素ナトリウム２水和物０．０５重量％およびリン
酸水素２ナトリウム１２水和物１．５重量％を溶解した
水４００ミリリットルとを混合し、十分撹拌したのち、
６５℃で１８時間、さらに７５℃で５時間加熱撹拌し
て、懸濁重合を行い、粒状架橋共重合体を得た。

【００３９】この架橋共重合体を洗浄後、水酸化ナトリ
ウム４６．５ｇを含むメタノール２リットルと共に４０
℃で１８時間撹拌して、架橋共重合体のケン化反応を行
い、ビニルアルコール単位を有する架橋共重合体よりな
る水不溶性担体を得た。この水不溶性担体の平均粒子径
は１００μｍ、排除限界分子量は２，０００，０００で
あった。

【００４０】次に、ポリカチオンを有する分子として、
次に示すような共重合体を合成した。

【００４１】２ーヒドロキシエチルメタアクリレート
０．８モルとジエチルアミノエチルメタアクリレート
０．２モルを含むエタノール溶液１リットルに、重合開
始剤として２，２’ーアゾビスイソブチロニトリル０．
００５モルを加えて、６０℃で８時間、ラジカル共重合
反応を行った。このようにして得たポリカチオンを有す
る分子の分子量を、ジメチルホルムアミドを溶離液とし
たゲル浸透クロマトグラフィー（カラム：ショウデック
スＡＤ-８０Ｍ／Ｓ，昭和電工（株）製）により求めた
ところ、１８万（ポリエチレングリコール換算）であっ
た。

【００４２】上記のようにして得た水不溶性担体１０ミ
リリットルを１２ミリリットルのジメチルスルフォキシ
ド中に懸濁させ、この懸濁液に、８ミリリットルのエピ
クロロヒドリンと１ミリリットルの５０％水酸化ナトリ
ウム水溶液を加え、３０℃で５時間振とうして、活性基
としてエポキシ基を有する活性化担体を得た。

【００４３】上記のようにして合成したポリカチオンを
有する分子１３５ｍｇを５０％ジメチルホルムアミド水
溶液１３．５ミリリットルに溶解した溶液に、上記のよ
うにして得た活性化担体９ミリリットルを加え、水酸化
ナトリウム水溶液でｐＨを１２に調整した後、４５℃で
２０時間振とうして、２ーヒドロキシエチルメタアクリ
レートとジエチルアミノエチルメタアクリレートとの共
重合体を固定化した吸着材を得た。水酸化ナトリウム水
溶液による滴定から求めた該吸着材１ミリリットルあた
りの正電荷密度は、１１０μｅｑであった。

【００４４】このようにして得られた吸着材を水、１Ｍ
酢酸ナトリウム水溶液、水の順で洗浄した後に、１規定
塩酸を用いてｐＨを７に調整した健常者血漿２０ミリリ
ットルと該吸着材１ミリリットルをプラスチック製試験
管に入れ、１８℃で１時間緩やかに回転しながら撹拌し
て吸着実験を行った。血液凝固第ＶＩＩＩ因子活性測定
用の市販キット（テストチームＦＶＩＩＩ、第一化学薬
品（株）製）を用いて、吸着実験前後の血漿中の血液凝
固第ＶＩＩＩ因子活性を測定したところ、吸着実験後の
血漿中の第ＶＩＩＩ因子活性は、吸着実験前の１０％で
あった。

【００４５】次に、吸着実験後の吸着材をプラスチック
製カラムに移し、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭ
イミダゾール、５ｍＭフェニルメチルスルフォニルフロ
ライドおよび１％トリトンＸー１００を含む水溶液（ｐ
Ｈ７）２ミリリットルで３回吸着材を洗浄した。この時
の洗浄液の温度は１２〜１５℃であった。

【００４６】その後、０．３Ｍ塩化カルシウム、１０ｍ
Ｍイミダゾール、５ｍＭフェニルメチルスルフォニルフ
ロライドおよび１％トリトンＸー１００を含む水溶液
（ｐＨ７）２ミリリットルを２回用いて、第ＶＩＩＩ因
子を溶出した。この時の溶出液の温度は１２〜１５℃で
あった。溶出液中に含まれる第ＶＩＩＩ因子活性を測定
したところ、吸着実験に用いた血漿中の８９％の第ＶＩ
ＩＩ因子が回収されていた。

【００４７】この吸着・溶出実験を１６回行ったとこ
ろ、吸着率は８９±１％、溶出率は８９±３％であっ
た。

【００４８】（参考例１）実施例１で用いた吸着材を用
いて健常者血漿３ミリリットルに対して、吸着材の量を
０．１ｇから０．６ｇまで変えて、第ＶＩＩＩ因子と第
ＩＸ因子の吸着挙動を調べた。

【００４９】第ＶＩＩＩ因子と第ＩＸ因子の吸着率は、
それぞれ下に記すようになった。吸着材０．１ｇの時１３％、１６％（第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子の順。以下同じ）吸着材０．２ｇの時３２％、２９％吸着材０．３ｇの時６８％、４５％吸着材０．４ｇの時９０％、５２％吸着材０．５ｇの時９２％、６０％吸着材０．６ｇの時９５％、６５％なお、第ＶＩＩＩ因子と第ＩＸ因子の吸着率は、吸着実
験後の血漿中に残存するそれぞれの活性を測定すること
により求めた。第ＶＩＩＩ因子の活性測定は、実施例１
と同様の方法により行った。また、第ＩＸ因子の活性
は、Ｈａｒｄｉｓｔｙ一段法［Ｒ．Ｍ．Ｈａｅｍｏｒｒ
ｈ．，Ｖｏｌ．７，ｐｐ．２１５（１９６２）］により
測定した。

【００５０】（比較例１）実施例１の吸着実験後の吸着
材をプラスチック製カラムに移し、１０ｍＭクエン酸ナ
トリウム水溶液（ｐＨ７．４）２ミリリットルで３回洗
浄した。その後に、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１％リ
ジン、１Ｍ塩化ナトリウム、２０％エチレングリコー
ル、１％トリトンＸー１００を含む水溶液（ｐＨ６）２
ミリリットルを２回用いて、第ＶＩＩＩ因子を溶出させ
た。溶出液中に含まれる第ＶＩＩＩ因子活性を測定した
ところ、吸着実験に用いた血漿中の６９％の第ＶＩＩＩ
因子が回収されていた。

【００５１】（実施例２）実施例１の吸着実験後の洗浄
操作を行った吸着材を、０．０４Ｍ塩化カルシウム、１
０ｍＭイミダゾール、５ｍＭフェニルメチルスルフォニ
ルフロライドおよび１％トリトンＸー１００を含む水溶
液（ｐＨ７）２ミリリットルで２回洗浄した。この時の
溶出液中の第ＶＩＩＩ因子と第ＩＸ因子の測定をしたと
ころ、０．０４Ｍ塩化カルシウムを含む水溶液の分画に
は、第ＶＩＩＩ因子はほとんど存在せず、第ＩＸ因子の
大部分が溶出されていた。０．３Ｍ塩化カルシウムを含
む水溶液の分画には、実施例１で示したように吸着実験
に用いた第ＶＩＩＩ因子の約９０％が溶出され、第ＩＸ
因子は若干の夾雑が認められた。以上のように、第ＶＩ
ＩＩ因子と第ＸＩ因子のほぼ完全な分離が可能であっ
た。なお、第ＩＸ因子は、免疫拡散法によりその抗原量
を測定した。

【００５２】（比較例２）実施例１の吸着実験後の洗浄
操作を行った吸着材を用いて、０．１５Ｍ塩化ナトリウ
ム、１０ｍＭイミダゾール、５ｍＭフェニルメチルスル
フォニルフロライドおよび１％トリトンＸー１００を含
む水溶液（ｐＨ７）から、０．５Ｍ塩化ナトリウム、１
０ｍＭイミダゾール、５ｍＭフェニルメチルスルフォニ
ルフロライドおよび１％トリトンＸー１００を含む水溶
液（ｐＨ７）までの直線グラジエント溶出を行った。第
ＶＩＩＩ因子と第ＩＸ因子の溶出位置はほぼ一致してお
り、塩化ナトリウムのグラジエントでは、第ＶＩＩＩ因
子と第ＩＸ因子の分離はできなかった。

【００５３】

【発明の効果】本発明の血液凝固第ＶＩＩＩ因子の分離
方法では、第ＶＩＩＩ因子を吸着する際にポリカチオン
を有する分子を固定化した吸着材を用いているため、低
分子化合物をリガンドとして用いた従来の吸着材と比べ
ると、第ＶＩＩＩ因子との相互作用がより特異的にな
り、クリオプレシピテートを経由する従来の方法による
ことなく、血漿をそのまま用いても第ＶＩＩＩ因子を高
率に吸着することができる。また、そのために、吸着材
に吸着される第ＩＸ因子が少ないので、第ＶＩＩＩ因子
と第ＩＸ因子の分離に効果のあるカルシウムイオンを洗
浄液および溶出液に用いても、血液凝固系の活性化のお
それがほとんどない。そのため、第ＶＩＩＩ因子の効率
的な分離が可能となる。このように、本発明の血液凝固
第ＶＩＩＩ因子の分離方法は、血液凝固第ＶＩＩＩ因子
製剤の製造における寄与が著しく大きい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者伴野丞計東京都渋谷区広尾４丁目１番31号日本赤十字社血漿分画センター開発研究部内 (72)発明者関口定美北海道札幌市西区山の手２条２丁目３番37 号北海道赤十字血液センター内 (72)発明者伊藤尚史静岡県富士市鮫島２番地の１旭化成工業株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ポリカチオンを有する分子が水不溶性担
体に結合・固定化されてなる複合体に、血液凝固第ＶＩ
ＩＩ因子を吸着させた後、カルシウムイオンを含む水溶
液を溶出液として用い、血液凝固第ＶＩＩＩ因子を溶出
することにより分離することを特徴とする血液凝固第Ｖ
ＩＩＩ因子の分離方法。
【請求項２】ポリカチオンを有する分子の分子量が少
なくとも１，０００であり、該複合体１ミリリットルあ
たりの正電荷密度が１μｅｑ〜２００μｅｑである吸着
材を用いることを特徴とする請求項１に記載の血液凝固
第ＶＩＩＩ因子の分離方法。
【請求項３】ポリカチオンを有する分子が、側鎖に陰
イオン交換基を有する塩基性ビニル単量体の単独重合体
または該塩基性ビニル単量体とそれと共重合し得るビニ
ル単量体との共重合体であることを特徴とする請求項１
または２に記載の血液凝固第ＶＩＩＩ因子の分離方法。
【請求項４】塩基性ビニル単量体が、それぞれアミノ
基を有するアクリル酸誘導体、メタアクリル酸誘導体、
アクリル酸アミド誘導体およびメタアクリル酸アミド誘
導体から選ばれてなるものであることを特徴とする請求
項３に記載の血液凝固第ＶＩＩＩ因子の分離方法。
【請求項５】塩基性ビニル単量体と共重合し得るビニ
ル単量体が、Ｎ−ビニルピロリドン、アクリル酸エステ
ル、メタアクリル酸エステル、Ｎ−アルキルアクリル酸
アミドおよびＮ−アルキルメタアクリル酸アミドから選
ばれてなるものであることを特徴とする請求項３に記載
の血液凝固第ＶＩＩＩ因子の分離方法。
【請求項６】水不溶性担体が、多孔性構造を有する天
然高分子または合成高分子よりなる粒子状担体であるこ
とを特徴とする請求項１ないし５のいずれかに記載の血
液凝固第ＶＩＩＩ因子の分離方法。
【請求項７】水不溶性担体が、多孔性構造を有する粒
子状担体であり、排除限界分子量が１，０００〜１０
０，０００，０００であり、平均粒子径が５〜１，００
０μｍであることを特徴とする請求項１ないし６のいず
れかに記載の血液凝固第ＶＩＩＩ因子の分離方法。
【請求項８】粒子状担体が、ビニルアルコール単位を
有する架橋共重合体よりなることを特徴とする請求項６
または７に記載の血液凝固第ＶＩＩＩ因子の分離方法。
【請求項９】カルシウムイオンを含む水溶液中のカル
シウムイオン濃度が０．０５〜１Ｍであり、ｐＨが６〜
８であることを特徴とする請求項１ないし８のいずれか
に記載の血液凝固第ＶＩＩＩ因子の分離方法。