DK147946B - Fremgangsmaade til rensning af en urokinaseoploesning - Google Patents

Description

1479A6

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til rensning af en urokinaseopløsning, såsom menneskers urin, med henblik på fremstilling af meget ren urokinase.

Urokinase er et plasminogenaktiverende enzym, der findes i spormængder i menneskers urin og benyttes som et effektivt thrombolytisk middel og som et lægemiddel, der anvendes sammen med anticancermidler. Høj renhed af urokinase , især pyrogenfri urokinase, er påkrævet-, fordi disse lægemidler anvendes ved intravenøs injektion.

Man er for nylig begyndt at anvende affinitetskromatografi som fremgangsmåde til rensning af human urokinase. F. eks. kendes en fremgangsmåde, der som ligand anvender en livsvigtig aminosyre, f.eks. lysin eller ar= 2 147946 ginin [beskrivelsen til de japanske patentansøgninger nr. 441.953/1976, nr. 20.596/1976, nr. 95.183/1976 og nr. 35.481-35.483/1976], metoden, der anvender en urokinaseinhibitor indeholdt i placentavævet som ligand [beskrivelsen til japansk patentansøgning nr. 205.977/1976], og metoden, der anvender p-aminobenzamidin eller p-aminobenzguanidin som ligand [Lass Holmberg et al., Biochimica et Biophysica Acta 445, 215 (1976)].

Det er vanskeligt at udføre en tilfredsstillende rensing af urokinase ved hjælp af nævnte kendte metoder alene.

Det har nu vist sig, at urenheder i den rå urokinase, der opfører sig på samme måde som urokinase på en affinitetskromatografisk adsorbent for urokinase, kan fjernes fra en urokinaseopløsning ved hjælp af en særlig hydrofob adsorbent. Denne rensning kan udføres efter den affinitetskromatografiske proces, men udføres fortrinsvis forud for denne. Herved opnås en tilfredsstillende rensning af urokinase.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at opløsningen bringes i kontakt med en proteinadsorbent, som omfatter en vandopløselig bærer, hvortil der er bundet en forbindelse med den almene formel -NH (CH2) a-Y-CO-NH —^/ I, hvori £ er et helt tal fra 3 til 10, Y er en direkte binding eller -NH-CO-CH2-CH2-, og X er hydrogen eller C^_^-alkoxycarbonyl.

Den ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen benyttede hydrofobe adsorbent har evnen til at adsorbere urenheder i den rå urokinase, der opfører sig på samme måde som urokinase på en affinitetskromatografisk adsorbent, men den hydrofobe adsorbent adsorberer ikke urokinase under procesbetingelserne ved gennemførelsen af fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

147946 3

Den foretrukne fremgangsmåde til rensning af urokinase er den successive anvendelse af den hydrofobe adsorbentsøjle og den affinitetskromatografiske adsorbentsøjle. Den rå urokinaseopløsning med passende saltkoncentration og pH-værdi føres gennem disse søjler i nævnte orden, og efter vask af den affinitetskromatografiske adsorbentsøjle med en passende opløsning, udvindes højrenset urokinase ved eluering fra søjlen.

Den ifølge opfindelsen benyttede hydrofobe adsorbent er et materiale, hvori forbindelsen med formlen I er bundet til en vanduopløselig bærer. Som vanduopløselig bærer kan anvendes ethvert materiale indeholdende en funktionel gruppe, hvortil en endestillet aminogruppe kan kobles. Passende bærere er polysaccharider, såsom agarose, tværbundet dextran og celluloser, polymere, såsom acrylamid, og glasperler. Agarose er den mest foretrukne bærer.

Adsorbenten kan opbygges ved hjælp af kendte processer.

Ved udførelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen påføres urin fra mennesker eller forbehandlet urin fra mennesker på en kolonne, der er pakket med den hydrofobe adsorbent. Afgangsstrømmen føres fortrinsvis gennem kolonnen, der er pakket med den affinitetskromatografiske adsorbent for urokinase.

Endog frisk urin fra mennesker kan påføres på adsorbenten, men urin fra mennesker forbehandles sædvanligvis ved den gængse metode, før den påføres på søjlen af hydrofob adsorbent. F.eks. opsamles det ved omrøring af urin fra mennesker dannede skum, og et antiskumningsmiddel sættes dertil, hvorpå opløsningen indstilles til pH 8,5 - 9 til dannelse af præcipitater. Den resulterende ovenpå svømmende opløsning kan påføres på søjlen af hydrofob adsorbent. Endvidere kan den ovenpå svømmende opløsning først forbehandles, dvs. at den ovenpå svømtende opløsning kontakteres med diatoméjord, såsom cerit, og efter vaskning af ceritten med vand, elueres adsorberet urokinase med en alkalisk opløsning. Eluatet indeholdende urokinase koncentreres ved hjælp af ultrafiltrering og lyofili-seres.

Ved udførelse af fremgangsmåden til rensning af urokinase indstilles op- 147946 4 løsningen indeholdende den rå urokinase, som fremstilles ud fra urin fra mennesker på den sædvanlige simple måde som ovenfor anført, til en saltkoncentration på 0,2 til 2 M, fortrinsvis fra 0,2 til 1 M. Opløsningen bringes derpå til at strømme gennem den hydrofobe adsorbentsøjle. Urenheder med højere affinitet til den hydrofobe adsorbent end urokinase fjernes ved hjælp af adsorbtionen. Afgangsstrømmen påføres derefter på den affinitetskromatografiske adsorbentsøjle. pH-værdien er ikke kritisk, når den hydrofobe kromatografi udføres, men pH-værdien indstilles sædvanligvis til pH 5,5 - 10, fortrinsvis 6 - 8,5, ved hvilken pH-værdi urokinase er stabil over for inaktivering.

Den ovennævnte metode, som kombinerer hydrofob kromatografi med affinitetskromatografi, er meget fordelagtig til fremstilling af meget ren urokinase. Ved denne kombination kan rækkefølgen vendes om, men ved industrielle processer foretrækkes det at anvende afgangstrømmen fra den hydrofobe kromatografi til affinitetskromatografien.

Til yderligere illustration af opfindelsen anføres de efterfølgende eksempler.

Forbehandling af urin fra mennesker.

Frisk urin fra mennesker blev omrørt, og det resulterende skum blev fraskilt. Et antiskumningsmiddel blev sat til skummet, og pH-værdien blev indstillet til 8,7 ved tilsætning af vandig NaOH. Det resulterende præ-cipitat blev fjernet til opnåelse af den ovenpå svømmende opløsning indeholdende rå urokinase. Denne opløsning omtales i det følgende som "rå urokinaseopløsning A". Efter indstilling af den rå urokinaseopløsning A til pH 5,5 ved tilsætning af vandig HC1, blev opløsningen kontakteret med diatoméjord til adsorbering af urokinase. Den adsorberede urokinase blev elueret med en 3% vandig NHg-oplØsning efter vaskning af dia= tome jorden med vand til fjernelse af urenheder. Eluatet blev ultrafiltreret ved hjælp af hule fibre samt lyofiliseret til opnåelse af pulveret af rå urokinase. Pulveret bestående af den rå urokinase omtales i det følgende som "rå urokinase B".

Eksempel 1.

Til en suspension af 100 ml "Sepharose" (5)4 B (et produkt fra Pharmacia 5 147946 fine Chemicals) i 100 ml vand sattes 200 ml 5% vandig opløsning af CNBr under omrøring. Reaktionen fik lov til at foregå i 10 minutter ved 20°C under tilsætning af vandig NaOH-opløsning med henblik på at holde reaktionsblandingen på pH-værdien 11. Reaktionsblandingen blev derefter filtreret, og den aktiverede "Sepharose" blev vasket med 1,5 liter 0,1 M NaHCOg. Den aktiverede "Sepharose" blev hurtigt suspenderet i en opløsning af ε-aminocapronsyre, som blev fremstillet ved opløsning af 1,31 g ε-aminocapronsyre i 100 ml 0,1 M NaHC03 og derpå indstilling til pH-vær= dien 9,5, og der blev omsat i 16 timer ved 4°C. Reaktionsproduktet blev vasket med 1 liter 0,5 M NaCl og derpå med 1 liter destilleret vand til opnåelse af den modificerede "Sepharose", "Sepharose"-e-aminoca= pronsyre. Til denne modificerede "Sepharose" sattes en anilinopløsning, der blev fremstillet ved opløsning af 400 mg anilin i 250 ml 40% di= methylformamid og indstilling til pH-værdien 4,7. Til blandingen sattes 3 g l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid, HC1 opløst i 5 liter vand, og reaktionen fik lov til at forløbe i 18 timer ved stuetemperatur. Under den første time af reaktionsforløbet blev pH-værdi= en holdt ved pH 4,8 ved tilsætning af 1 N HC1. Reaktionsblandingen blev vasket med 500 ml 0,5 M NaCl og derpå med 500 ml destilleret vand til opnåelse af aidsorbenten til hydrofob kromatografi..·

En affinitetskromatografisk adsorbent blev fremstillet på følgende mådes til en suspension af 20 ml AH-"Sepharose"(r)(et produkt fra Farmacia Fine Chemicals) i 20 ml vand sattes 2 g ravsyreanhydrid, og reaktionen fik lov til at finde sted ved 4°C, idet pH-værdien blev holdt ved 6 ved tilsætning af vandig NaOH. Efter at ændringen af pH-værdien var forbi, blev reaktionen fortsat i yderligere 5 timer. Reaktionsblandingen blev filtreret og vasket med 1 liter vand til opnåelse af den modificerede "Sepha= rose", succinyl-AH-"Sepharose". Til en suspension af den resulterende succinyl-AH-"Sepharose" i 50 ml 401 vandig opløsning af dimethylformamid sattes 430 mg p-aminobenzamidin, HC1, og pH-værdien blev indstillet til 4,8. Til blandingen sattes 1,23 g l-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)-carbodiimid, som var opløst i 2 ml vand, og reaktionen fik lov til at finde sted ved stuetemperatur i 18 timer. Under den første time af reaktionsforløbet blev pH-værdien indstillet til 4,8 ved tilsætning af 1 N HC1. Reaktionsblandingen blev filtreret og vasket med 500 ml 0,5 M NaCl og derpå 500 ml destilleret vand til opnåelse af adsorbenten for urokinase.

6 147946

En kolonne med en diameter på 2,5 cm, der var pakket med den. hydrofobe adsorbent, blev i serie sluttet til en anden kolonne med en diameter på 2,5 cm, son var pakket med 100 ml af den affinitetskromatografiske adsorbent for urokinase. Gennem den hydrofobe adsorbentsøjle førtes en rå urokinaseopløsning indeholdende 10 millioner internationale enheder urokinase, der blev fremstillet ved opløsning af den rå urokinase B i 500 ml 0,2 M NaCl i 0,1 M phosphatpuffer (pH 7,4).

Den hydrofobe adsorbentsøjle blev vasket med 2 liter 0,2 M NaCl i 0,1 M phosphatpuffer (pH 7,4). Afgangsstrømmen fra den hydrofobe adsorbentsøjle blev successivt ført gennem den affinitetskromatografiske adsorbentsøjle. Den hydrofobe adsorbentsøjle blev derpå fjernet, og den af den affinitetskromatografiske adsorbentsøjle adsorberede urokinase blev elueret med 0,1 M acetatpuffer (pH 5,0).

Den urokinaseholdinge fraktion blev ultrafiltreret, dialyseret og filtreret til opnåelse af 8,56 millioner internationale enheder urokinase med en specifik aktivitet på 82.700 internationale enheder/mg protein.

Eksempel 2.

En proteinadsorbent til hydrofob kromatografi blev opbygget på samme måde som anført i eksempel 1 under anvendelse af 500 g n-butyl-p-amino= benzoat i stedet for 400 mg anilin.

En rå urokinaseopløsning indeholdende 10 millioner internationale enheder urokinase, der blev fremstillet ved opløsning af den rå urokinase B i 500 ml 0,4 M NaCl i 0,1 M phosphatpuffer (pH 7,0), blev behandlet på samme måde som anført i eksempel 1 med den undtagelse, at elueringsop-løsningen var 0,1 M acetatpuffer (pH 4,5) i stedet for 0,1 M acetatpuf= fer (pH 5,0). Der blev herved opnået 7,8 millioner internationale enheder renset urokinase med en specifik aktivitet på 95.200 internationale enheder/mg protein.

Feberfremkaldende forsøg blev udført med urokinase opnået i eksemplerne 1 og 2 i overensstemmelse med den japanske farmakopé. Resulta- · terne var negative ved en dosis på 8.000 internationale enheder pr. kg.