JPH06292573A - 同種又は異種宿主内での活性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌｕｍａｅリパーゼの産生 - Google Patents
同種又は異種宿主内での活性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌｕｍａｅリパーゼの産生Info
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- JPH06292573A JPH06292573A JP3261485A JP26148591A JPH06292573A JP H06292573 A JPH06292573 A JP H06292573A JP 3261485 A JP3261485 A JP 3261485A JP 26148591 A JP26148591 A JP 26148591A JP H06292573 A JPH06292573 A JP H06292573A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 洗剤又は洗浄用組成物で使用するのに適した
リパーゼの製造に関する。 【構成】 Ｐ． ｇｌｕｍａｅ ＰＧ１（ＣＢＳ ３２
２．８９）から単離する活性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｇｌｕｍａｅリパーゼその他の、洗剤系に好ましく適用
できるリパーゼの同種宿主での産生と、特に例えばＢａ
ｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓのような異種宿主での産
生とを開示する。後者には“ヘルパー機能”または“リ
パーゼ特異的な安定化／転位タンパク質”が必要であ
り、そのため、リパーゼ遺伝子と協奏的に発現した場合
にリパーゼの産生及び転位／分泌に係わる中間体の安定
化を促進し得る遺伝子を用いる。宿主は組換え体ＤＮＡ
法で形質転換し、修飾リパーゼは特定部位に突然変異を
誘発する技術か、または通常の突然変異誘発技術によっ
て造することができる。
リパーゼの製造に関する。 【構成】 Ｐ． ｇｌｕｍａｅ ＰＧ１（ＣＢＳ ３２
２．８９）から単離する活性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｇｌｕｍａｅリパーゼその他の、洗剤系に好ましく適用
できるリパーゼの同種宿主での産生と、特に例えばＢａ
ｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓのような異種宿主での産
生とを開示する。後者には“ヘルパー機能”または“リ
パーゼ特異的な安定化／転位タンパク質”が必要であ
り、そのため、リパーゼ遺伝子と協奏的に発現した場合
にリパーゼの産生及び転位／分泌に係わる中間体の安定
化を促進し得る遺伝子を用いる。宿主は組換え体ＤＮＡ
法で形質転換し、修飾リパーゼは特定部位に突然変異を
誘発する技術か、または通常の突然変異誘発技術によっ
て造することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、洗剤又は洗浄用組成物
で使用するのに適したリパーゼの製造に係わる。本発明
は特に、同種又は異種宿主内での効果的なリパーゼ産生
に係わる。本発明はより特定的には、オランダＢａａｒ
ｎのＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕｖｏｏｒ Ｓｃｈｉ
ｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにＣＢＳ ３２２．８９で寄
託されたＰ．ｇｌｕｍａｅ ＰＧ１から単離されるＰｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌｕｍａｅリパーゼの種々の宿
主内での産生に係わる。本明細書では、Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓを表すのにＰ．という略号も使用する。
で使用するのに適したリパーゼの製造に係わる。本発明
は特に、同種又は異種宿主内での効果的なリパーゼ産生
に係わる。本発明はより特定的には、オランダＢａａｒ
ｎのＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕｖｏｏｒ Ｓｃｈｉ
ｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにＣＢＳ ３２２．８９で寄
託されたＰ．ｇｌｕｍａｅ ＰＧ１から単離されるＰｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌｕｍａｅリパーゼの種々の宿
主内での産生に係わる。本明細書では、Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓを表すのにＰ．という略号も使用する。
【０００２】本明細書のＰ．ｇｌｕｍａｅ ＰＧ１に由
来するリパーゼの場合は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇ
ｌｕｍａｅ（別称Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌａｄｉ
ｏｌｉ）並びに緊密な関係をもつＰｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ種、例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ
及びＰ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍが同種宿主と見なさ
れる。これらの細菌の大部分は本出願人の早期公開され
ていない同時係属特許出願ＥＰ−Ａ−４０７ ２２５号
及びＷＯ−Ａ−９１／００９２０号に記述されている。
これらをここで援用する。グラム陰性菌又はグラム陽性
菌並びに下等真核生物であり得る他の微生物は総て異種
宿主と見なすことができる。
来するリパーゼの場合は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇ
ｌｕｍａｅ（別称Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌａｄｉ
ｏｌｉ）並びに緊密な関係をもつＰｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ種、例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ
及びＰ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍが同種宿主と見なさ
れる。これらの細菌の大部分は本出願人の早期公開され
ていない同時係属特許出願ＥＰ−Ａ−４０７ ２２５号
及びＷＯ−Ａ−９１／００９２０号に記述されている。
これらをここで援用する。グラム陰性菌又はグラム陽性
菌並びに下等真核生物であり得る他の微生物は総て異種
宿主と見なすことができる。
【０００３】
【従来の技術】原核生物によって排出される多くのタン
パク質はシグナルペプチドに依存しながら細胞質膜を通
って転位される。これらのタンパク質は、アミノ酸２０
〜４０のＮ末端延長部、即ちプレ配列又はシグナル配列
を有する前駆体分子として細胞内で産生される。この配
列は、タンパク質の転位の後で又は最中に、極めて特異
的なシグナルペプチダーゼによって切り離される。シグ
ナル配列のアミノ酸配列の間には相同が殆ど見られない
が、これらの配列は共通の構造を有する（ｖｏｎＨｅｉ
ｊｎｅ、１９８５）。３つの特徴的部分は、正の電荷を
もつ（ｎ）−領域、疎水性（ｈ）−領域、及び主として
小さい中性残基からなりタンパク質分解開裂部位を含む
（ｃ）−領域である（Ｇｉｅｒａｓｃｈ、１９８９）。
シグナル配列の中には前記長さより遥かに長いものもあ
り、これらは例えばスブチリシンのプレ−プロシグナル
配列と見なすことができる。プレ配列は正規のシグナル
配列と類似の機能を有するが、プロ配列は酵素活性の制
御に関係し、酵素が活性になる前に加水分解されなけれ
ばならない（Ｚｈｕ、１９８８）。
パク質はシグナルペプチドに依存しながら細胞質膜を通
って転位される。これらのタンパク質は、アミノ酸２０
〜４０のＮ末端延長部、即ちプレ配列又はシグナル配列
を有する前駆体分子として細胞内で産生される。この配
列は、タンパク質の転位の後で又は最中に、極めて特異
的なシグナルペプチダーゼによって切り離される。シグ
ナル配列のアミノ酸配列の間には相同が殆ど見られない
が、これらの配列は共通の構造を有する（ｖｏｎＨｅｉ
ｊｎｅ、１９８５）。３つの特徴的部分は、正の電荷を
もつ（ｎ）−領域、疎水性（ｈ）−領域、及び主として
小さい中性残基からなりタンパク質分解開裂部位を含む
（ｃ）−領域である（Ｇｉｅｒａｓｃｈ、１９８９）。
シグナル配列の中には前記長さより遥かに長いものもあ
り、これらは例えばスブチリシンのプレ−プロシグナル
配列と見なすことができる。プレ配列は正規のシグナル
配列と類似の機能を有するが、プロ配列は酵素活性の制
御に関係し、酵素が活性になる前に加水分解されなけれ
ばならない（Ｚｈｕ、１９８８）。
【０００４】タンパク質の転位には前記シグナル配列の
他に、細胞質成分及び膜結合（ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｓ
ｓｏｃｉａｔｅｄ）成分を含む移出手段（ｅｘｐｏｒｔ
ａｐｐａｒａｔｕｓ）も使用される。大腸菌（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に関してはタンパク質の
転位に必要な一組のタンパク質が同定され、そのうちの
幾つかはクローニングされ特性が解明された。これらの
タンパク質は、ＳｅｃＡ（ＰｒｌＤ）（Ｓｃｈｍｉｄ
ｔ、１９８８；Ａｋｉｔａ、１９９０）、ＳｅｃＢ（Ｋ
ｕｍａｍｏｔｏ、１９８９）、ＳｅｃＤ（Ｇａｒｄｅ
ｌ、１９８７）、ＳｅｃＥ（ＰｒｌＧ）（Ｓｃｈａｔ
ｚ、１９８９）、ＳｅｃＹ（ＰｒｌＡ）（Ｃｅｒｒｅｔ
ｔｉ、１９８３；Ｂｉｅｋｅｒ、１９９０）、ＧｒｏＥ
Ｌ（Ｌａｍｉｎｅｔ、１９９０）、トリガー因子（ｔｒ
ｉｇｇｅｒ ｆａｃｔｏｒ）（Ｃｒｏｏｋｅ、１９８
８）である。これらのタンパク質の一部（ＳｅｃＢ、Ｇ
ｒｏＥＬ、トリガー因子）は細胞質中に存在し、前駆体
分子を転位受容状態（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｃ
ｏｍｐｅｔｅｎｔ ｓｔａｔｅ）に維持すベく「分子シ
ャペロン（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｐｅｒｏｎ
ｓ）」として機能する（Ｌｅｃｋｅｒ、１９８９）。１
６ｋｄのＳｅｃＢタンパク質は四量体複合体を形成し、
細胞質ゾルシグナル認識因子であると考えられている
（Ｗａｔａｎａｂｅ、１９８９；Ｌｅｃｋｅｒ、１９９
０）。ＧｒｏＥＬは１４個の同一６５ｋｄサブユニット
からなる環状オリゴマーを形成する。ＧｒｏＥＬはＧｒ
ｏＥＳと一緒に、加水分解可能なＭｇ２＋−ＡＴＰの存
在下で、増殖に不可欠であり且つ熱ショック反応にも関
与するＧｒｏＥ複合体を形成する（Ｌａｍｉｎｅｔ、１
９９０）。トリガー因子は、リボソーム５０Ｓサブユニ
ットに結合し前駆体タンパク質及び細胞質膜と相互に作
用し合う６３ｋｄタンパク質である（Ｃｒｏｏｋｅ、１
９８８；Ｌｉｌｌ、１９８８）。ＳｅｃＡ遺伝子産物は
ＡＴＰアーゼ活性を有する大きな（１０２ｋｄ）内膜結
合タンパク質である（Ｌｉｌｌ、１９８９）。ＳｅｃＹ
（６８ｋｄ）及びＳｅｃＥ（１３．６ｋｄ）は転位を仲
介しながら相互作用することが判明した必須膜タンパク
質である（Ｂｉｅｋｅｒ、１９９０）。
他に、細胞質成分及び膜結合（ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｓ
ｓｏｃｉａｔｅｄ）成分を含む移出手段（ｅｘｐｏｒｔ
ａｐｐａｒａｔｕｓ）も使用される。大腸菌（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に関してはタンパク質の
転位に必要な一組のタンパク質が同定され、そのうちの
幾つかはクローニングされ特性が解明された。これらの
タンパク質は、ＳｅｃＡ（ＰｒｌＤ）（Ｓｃｈｍｉｄ
ｔ、１９８８；Ａｋｉｔａ、１９９０）、ＳｅｃＢ（Ｋ
ｕｍａｍｏｔｏ、１９８９）、ＳｅｃＤ（Ｇａｒｄｅ
ｌ、１９８７）、ＳｅｃＥ（ＰｒｌＧ）（Ｓｃｈａｔ
ｚ、１９８９）、ＳｅｃＹ（ＰｒｌＡ）（Ｃｅｒｒｅｔ
ｔｉ、１９８３；Ｂｉｅｋｅｒ、１９９０）、ＧｒｏＥ
Ｌ（Ｌａｍｉｎｅｔ、１９９０）、トリガー因子（ｔｒ
ｉｇｇｅｒ ｆａｃｔｏｒ）（Ｃｒｏｏｋｅ、１９８
８）である。これらのタンパク質の一部（ＳｅｃＢ、Ｇ
ｒｏＥＬ、トリガー因子）は細胞質中に存在し、前駆体
分子を転位受容状態（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｃ
ｏｍｐｅｔｅｎｔ ｓｔａｔｅ）に維持すベく「分子シ
ャペロン（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｐｅｒｏｎ
ｓ）」として機能する（Ｌｅｃｋｅｒ、１９８９）。１
６ｋｄのＳｅｃＢタンパク質は四量体複合体を形成し、
細胞質ゾルシグナル認識因子であると考えられている
（Ｗａｔａｎａｂｅ、１９８９；Ｌｅｃｋｅｒ、１９９
０）。ＧｒｏＥＬは１４個の同一６５ｋｄサブユニット
からなる環状オリゴマーを形成する。ＧｒｏＥＬはＧｒ
ｏＥＳと一緒に、加水分解可能なＭｇ２＋−ＡＴＰの存
在下で、増殖に不可欠であり且つ熱ショック反応にも関
与するＧｒｏＥ複合体を形成する（Ｌａｍｉｎｅｔ、１
９９０）。トリガー因子は、リボソーム５０Ｓサブユニ
ットに結合し前駆体タンパク質及び細胞質膜と相互に作
用し合う６３ｋｄタンパク質である（Ｃｒｏｏｋｅ、１
９８８；Ｌｉｌｌ、１９８８）。ＳｅｃＡ遺伝子産物は
ＡＴＰアーゼ活性を有する大きな（１０２ｋｄ）内膜結
合タンパク質である（Ｌｉｌｌ、１９８９）。ＳｅｃＹ
（６８ｋｄ）及びＳｅｃＥ（１３．６ｋｄ）は転位を仲
介しながら相互作用することが判明した必須膜タンパク
質である（Ｂｉｅｋｅｒ、１９９０）。
【０００５】最近になって、ＳｅｃＹ相同体が枯草菌
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から単離され
た（Ｓｕｈ、１９９０；Ｎａｋａｍｕｒａ、１９９
０）。これは、グラム陰性菌及びグラム陽性菌の移出手
段が類似していることを示唆するものである。グラム陽
性菌の場合は細胞質膜を通る転位が培養培地中への排出
を意味する。しかしながらグラム陰性菌の場合は、タン
パク質が培養培地中に放出される前に第２の膜も通過し
なければならない。グラム陰性菌の外膜を通して行われ
るタンパク質の転位は、特殊なヘルパータンパク質を必
要とする所与のタンパク質又はタンパク質群に多かれ少
なかれ特異的なものと言える。例えば、Ｘａｎｔｈｏｍ
ｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐａｔｈｏｖａｒ
ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓのプロテアーゼがそうである（Ｌ
ｉｕ、１９９０）。構造遺伝子及びヘルパー遺伝子を大
腸菌中に移して機能発現及び培地中への排出を達成する
のに成功した例もある（ｄ’Ｅｎｆｅｒｔ、１９８７；
Ｓｃｈｉｅｂｅｌ、１９８９）。場合によっては、補足
的転位タンパク質が不要なこともある。Ｎｅｉｓｓｅｒ
ｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＩｇＡプロテアーゼ
（Ｐｏｈｌｎｅｒ、１９８７）及びＳｅｒｒａｔｉａ
ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓのセリンプロテアーゼ（Ｙａｎａ
ｇｉｄａ、１９８６；Ｍｉｙａｚａｋｉ、１９８９）は
その２つの例である。これらの酵素は両方とも、前駆体
を案内して細胞質膜を通過させるＮ末端シグナル配列と
外膜を通る転位を生起させるＣ膜ペプチドとを有するプ
レプロ酵素として産生される。これら２種類の酵素は、
大腸菌からの特殊なヘルパー遺伝子の発現を必要とせず
に、大腸菌によって産生され排出され得る。
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から単離され
た（Ｓｕｈ、１９９０；Ｎａｋａｍｕｒａ、１９９
０）。これは、グラム陰性菌及びグラム陽性菌の移出手
段が類似していることを示唆するものである。グラム陽
性菌の場合は細胞質膜を通る転位が培養培地中への排出
を意味する。しかしながらグラム陰性菌の場合は、タン
パク質が培養培地中に放出される前に第２の膜も通過し
なければならない。グラム陰性菌の外膜を通して行われ
るタンパク質の転位は、特殊なヘルパータンパク質を必
要とする所与のタンパク質又はタンパク質群に多かれ少
なかれ特異的なものと言える。例えば、Ｘａｎｔｈｏｍ
ｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐａｔｈｏｖａｒ
ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓのプロテアーゼがそうである（Ｌ
ｉｕ、１９９０）。構造遺伝子及びヘルパー遺伝子を大
腸菌中に移して機能発現及び培地中への排出を達成する
のに成功した例もある（ｄ’Ｅｎｆｅｒｔ、１９８７；
Ｓｃｈｉｅｂｅｌ、１９８９）。場合によっては、補足
的転位タンパク質が不要なこともある。Ｎｅｉｓｓｅｒ
ｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＩｇＡプロテアーゼ
（Ｐｏｈｌｎｅｒ、１９８７）及びＳｅｒｒａｔｉａ
ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓのセリンプロテアーゼ（Ｙａｎａ
ｇｉｄａ、１９８６；Ｍｉｙａｚａｋｉ、１９８９）は
その２つの例である。これらの酵素は両方とも、前駆体
を案内して細胞質膜を通過させるＮ末端シグナル配列と
外膜を通る転位を生起させるＣ膜ペプチドとを有するプ
レプロ酵素として産生される。これら２種類の酵素は、
大腸菌からの特殊なヘルパー遺伝子の発現を必要とせず
に、大腸菌によって産生され排出され得る。
【０００６】本出願人の同時係属特許出願ＥＰ−Ａ−４
０７ ２２５号には、ＩＰＴＧを任意に用いてＢＹＰＯ
プレート上でｐＵＲ６５０２又はｐＵＲ６５２２により
形質転換した異種グラム陰性宿主Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ ｐｕｔｉｄａＷＣＳ３５８を増殖させたところ、驚
くべき結果が得られたと記述されている。即ち、ｐＵＲ
６５２２（ｌｉｐＡ遺伝子とｔａｃプロモーターの後の
１．５ｋｂ以上の下流フラグメントとの発現可能な組合
わせを含む）の導入によって形質転換したＰ．ｐｕｔｉ
ｄａ ＷＣＳ３５８が有意量のリパーゼを産生する（大
ハロ形成によって立証）のに対し、ｐＵＲ６５０２（ｌ
ｉｐＡ遺伝子とｔａｃプロモーターの後の約７００ｂｐ
以下の下流フラグメントとを含む）を含む株はリパーゼ
を殆ど産生しないことが判明したのである。この発見
は、ＢａｍＨＩ部位を超えて延びるリパーゼ遺伝子の
３’領域によってコードされるリパーゼに特異的な「ヘ
ルパー機能（ｈｅｌｐｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」の存
在を示唆するものである。
０７ ２２５号には、ＩＰＴＧを任意に用いてＢＹＰＯ
プレート上でｐＵＲ６５０２又はｐＵＲ６５２２により
形質転換した異種グラム陰性宿主Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ ｐｕｔｉｄａＷＣＳ３５８を増殖させたところ、驚
くべき結果が得られたと記述されている。即ち、ｐＵＲ
６５２２（ｌｉｐＡ遺伝子とｔａｃプロモーターの後の
１．５ｋｂ以上の下流フラグメントとの発現可能な組合
わせを含む）の導入によって形質転換したＰ．ｐｕｔｉ
ｄａ ＷＣＳ３５８が有意量のリパーゼを産生する（大
ハロ形成によって立証）のに対し、ｐＵＲ６５０２（ｌ
ｉｐＡ遺伝子とｔａｃプロモーターの後の約７００ｂｐ
以下の下流フラグメントとを含む）を含む株はリパーゼ
を殆ど産生しないことが判明したのである。この発見
は、ＢａｍＨＩ部位を超えて延びるリパーゼ遺伝子の
３’領域によってコードされるリパーゼに特異的な「ヘ
ルパー機能（ｈｅｌｐｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」の存
在を示唆するものである。
【０００７】本発明の目的は、微生物を用いてリパーゼ
を産生するための改良された方法を提供することにあ
る。本発明の別の目的は、生来のプロモーターを通常の
方法又は特定部位の突然変異誘発によって有意に最適化
することによりＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌｕｍａｅ
内でのリパーゼの産生を改善することにある。
を産生するための改良された方法を提供することにあ
る。本発明の別の目的は、生来のプロモーターを通常の
方法又は特定部位の突然変異誘発によって有意に最適化
することによりＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌｕｍａｅ
内でのリパーゼの産生を改善することにある。
【０００８】Ｐ．ｇｌｕｍａｅ ＰＧ１に由来するプレ
リパーゼ遺伝子だけでは、異種宿主内で活性リパーゼを
産生するのに必ずしも十分ではないことが判明した。ま
た、このリパーゼ遺伝子の下流のＰ．ｇｌｕｍａｅ Ｐ
Ｇ１には、特にこのリパーゼ遺伝子がＰ．ｐｕｔｉｄａ
のような異種宿主内で発現される場合には細胞外活性リ
パーゼの適当な及び／又は最適な産生に関与する別の遺
伝子が存在することも明らかになった。この研究を続け
た結果、これら２つの遺伝子（即ちリパーゼ及びＯＲＦ
２）はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌｕｍａｅ染色体中
に２遺伝子オペロンの形態で存在することが判明した。
リパーゼ遺伝子だけでは、異種宿主内で活性リパーゼを
産生するのに必ずしも十分ではないことが判明した。ま
た、このリパーゼ遺伝子の下流のＰ．ｇｌｕｍａｅ Ｐ
Ｇ１には、特にこのリパーゼ遺伝子がＰ．ｐｕｔｉｄａ
のような異種宿主内で発現される場合には細胞外活性リ
パーゼの適当な及び／又は最適な産生に関与する別の遺
伝子が存在することも明らかになった。この研究を続け
た結果、これら２つの遺伝子（即ちリパーゼ及びＯＲＦ
２）はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌｕｍａｅ染色体中
に２遺伝子オペロンの形態で存在することが判明した。
【０００９】本明細書では、このヘルパー機能を「ＯＲ
Ｆ２遺伝子産物」又は「リパーゼ特異的安定化／転位タ
ンパク質」として説明する。このタンパク質をコードす
るＤＮＡ配列は「ＯＲＦ２」又は「ＯＲＦ２遺伝子」と
して示す。タンパク質の折り畳みがタンパク質の安定化
及び転位の両方にとって重要な要因であることは理解さ
れよう。
Ｆ２遺伝子産物」又は「リパーゼ特異的安定化／転位タ
ンパク質」として説明する。このタンパク質をコードす
るＤＮＡ配列は「ＯＲＦ２」又は「ＯＲＦ２遺伝子」と
して示す。タンパク質の折り畳みがタンパク質の安定化
及び転位の両方にとって重要な要因であることは理解さ
れよう。
【００１０】ＥＰ−Ａ−３３１ ３７６号（ＡＭＡＮ
Ｏ）には、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｃｅｐａｃｉａＦＥ
ＲＭ−１２−３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−２２９３）に由来
する「リパーゼの産生に関与する遺伝子」が記述されて
いる。但し、この遺伝子のＤＮＡ配列は明らかにされて
おらず、（リパーゼ）タンパク質のアミノ酸配列がこの
遺伝子によってコードされると説明されているだけであ
る。このアミノ配列を、本明細書の図３に示したリパー
ゼ産生グラム陰性菌Ｐ．ｇｌｕｍａｅ ＰＧ１に由来す
るリパーゼ特異的安定化／転位タンパク質のアミノ酸配
列と比較すれば、これらのタンパク質が互いにかなり異
なるものであることは明らかである。これらの異なるタ
ンパク質が互いに同じ機能を有するとは考えられない。
Ｏ）には、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｃｅｐａｃｉａＦＥ
ＲＭ−１２−３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−２２９３）に由来
する「リパーゼの産生に関与する遺伝子」が記述されて
いる。但し、この遺伝子のＤＮＡ配列は明らかにされて
おらず、（リパーゼ）タンパク質のアミノ酸配列がこの
遺伝子によってコードされると説明されているだけであ
る。このアミノ配列を、本明細書の図３に示したリパー
ゼ産生グラム陰性菌Ｐ．ｇｌｕｍａｅ ＰＧ１に由来す
るリパーゼ特異的安定化／転位タンパク質のアミノ酸配
列と比較すれば、これらのタンパク質が互いにかなり異
なるものであることは明らかである。これらの異なるタ
ンパク質が互いに同じ機能を有するとは考えられない。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、最も一般的
に言えば、リパーゼを産生することができる形質転換さ
れた微生物に係わる。この微生物は、少なくとも１種類
の発現可能なリパーゼ遺伝子と、リパーゼ特異的安定化
／転位タンパク質をコードする少なくとも１種類の発現
可能な遺伝子とを含み、これらの遺伝子はいずれか一方
又は両方がリパーゼ産生グラム陰性菌に由来する。本発
明は、本発明の形質転換した微生物を用いてリパーゼを
産生する方法にも係わる。
に言えば、リパーゼを産生することができる形質転換さ
れた微生物に係わる。この微生物は、少なくとも１種類
の発現可能なリパーゼ遺伝子と、リパーゼ特異的安定化
／転位タンパク質をコードする少なくとも１種類の発現
可能な遺伝子とを含み、これらの遺伝子はいずれか一方
又は両方がリパーゼ産生グラム陰性菌に由来する。本発
明は、本発明の形質転換した微生物を用いてリパーゼを
産生する方法にも係わる。
【００１２】
【課題を解決するための手段】リパーゼを産生すること
ができる微生物は発現可能なリパーゼ遺伝子の同種又は
異種宿主であり得る。例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｇｌｕｍａｅをグラム陰性宿主菌として使用する場合
は、好ましくは複数のコピーの形態で存在するその菌自
体の同種リパーゼ遺伝子を使用することができる。しか
しながら、幾つかの洗剤酵素製造業者により好ましい酵
素産生体として使用されているという理由で別の宿主例
えば枯草菌を用いる方が好ましい場合には、Ｐ．ｇｌｕ
ｍａｅに由来するリパーゼ遺伝子が枯草菌に対して異種
のものになる。本発明の形質転換微生物は発現可能なリ
パーゼ遺伝子の他にリパーゼ特異的安定化／転位タンパ
ク質も含む。
ができる微生物は発現可能なリパーゼ遺伝子の同種又は
異種宿主であり得る。例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｇｌｕｍａｅをグラム陰性宿主菌として使用する場合
は、好ましくは複数のコピーの形態で存在するその菌自
体の同種リパーゼ遺伝子を使用することができる。しか
しながら、幾つかの洗剤酵素製造業者により好ましい酵
素産生体として使用されているという理由で別の宿主例
えば枯草菌を用いる方が好ましい場合には、Ｐ．ｇｌｕ
ｍａｅに由来するリパーゼ遺伝子が枯草菌に対して異種
のものになる。本発明の形質転換微生物は発現可能なリ
パーゼ遺伝子の他にリパーゼ特異的安定化／転位タンパ
ク質も含む。
【００１３】形質転換すベき微生物は下記の群から選択
し得る： （ａ）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科のもの、好
ましくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、より好ましくは
Ｐ．ｃｅｐａｃｅａ、Ｐ．ｇｌａｄｉｏｌｉ、Ｐ．ｇｌ
ｕｍａｅ、Ｐ．ｍｅｎｄｏｃｉｎａ、 Ｐ．ｐｕｔｉｄ
ａ及びＰ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ種のものを含むグラム陰性
菌； （ｂ）Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ科、好ましくはＢａｃｉ
ｌｌｕｓ属のものを含むグラム陽性菌； （ｃ）酵母属Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍ
ｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
及びカビ属Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓのものを含む真核生
物、並びに他の下等真核生物。
し得る： （ａ）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科のもの、好
ましくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、より好ましくは
Ｐ．ｃｅｐａｃｅａ、Ｐ．ｇｌａｄｉｏｌｉ、Ｐ．ｇｌ
ｕｍａｅ、Ｐ．ｍｅｎｄｏｃｉｎａ、 Ｐ．ｐｕｔｉｄ
ａ及びＰ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ種のものを含むグラム陰性
菌； （ｂ）Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ科、好ましくはＢａｃｉ
ｌｌｕｓ属のものを含むグラム陽性菌； （ｃ）酵母属Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍ
ｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
及びカビ属Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓのものを含む真核生
物、並びに他の下等真核生物。
【００１４】前記遺伝子のいずれか一方又は両方の由来
源となり得る適当なグラム陰性菌はＰｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｄａｃｅａｅ科のもの、好ましくはＰｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ属、より好ましくはＰ．ｃｅｐａｃｅａ、Ｐ．ｇ
ｌａｄｉｏｌｉ、Ｐ．ｇｌｕｍａｅ、Ｐ．ｍｅｎｄｏｃ
ｉｎａ、 Ｐ．ｐｕｔｉｄａ及びＰ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ
種のものである。
源となり得る適当なグラム陰性菌はＰｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｄａｃｅａｅ科のもの、好ましくはＰｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ属、より好ましくはＰ．ｃｅｐａｃｅａ、Ｐ．ｇ
ｌａｄｉｏｌｉ、Ｐ．ｇｌｕｍａｅ、Ｐ．ｍｅｎｄｏｃ
ｉｎａ、 Ｐ．ｐｕｔｉｄａ及びＰ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ
種のものである。
【００１５】好ましいリパーゼ遺伝子はＰ．ｇｌｕｍａ
ｅ ＰＧ１に由来するリパーゼをコードするか、又はＣ
ｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｓｃｏｓｕｍ ｖａｒ
ｌｉｐｏｌｙｔｉｃｕｍ ＮＲＲＬ Ｂ−３６３７由来
のリパーゼに対する抗血清、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ
ＰＬ−６７９、ＡＴＣＣ ３１３７１もしくはＦＥＲＭ
−Ｐ ３７８３由来のリパーゼに対する抗血清、あるい
はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ
ＩＡＭ １０５７由来のリパーゼに対する抗血清と免疫
交差反応するリパーゼをコードする。
ｅ ＰＧ１に由来するリパーゼをコードするか、又はＣ
ｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｓｃｏｓｕｍ ｖａｒ
ｌｉｐｏｌｙｔｉｃｕｍ ＮＲＲＬ Ｂ−３６３７由来
のリパーゼに対する抗血清、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ
ＰＬ−６７９、ＡＴＣＣ ３１３７１もしくはＦＥＲＭ
−Ｐ ３７８３由来のリパーゼに対する抗血清、あるい
はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ
ＩＡＭ １０５７由来のリパーゼに対する抗血清と免疫
交差反応するリパーゼをコードする。
【００１６】洗剤組成物中のリパーゼの性能はまだ改良
の余地があるため、好ましくは、リパーゼをコードする
遺伝子が野性型リパーゼ遺伝子を修飾したもの、例えば
同時係属特許出願ＥＰ−Ａ−４０７ ２２５号に記載の
ような修飾遺伝子である本発明の微生物を使用する。前
記修飾体は、対応する修飾リパーゼによりリパーゼ特異
的安定化／転位タンパク質の安定化／転位機能が減損す
る事態を伴わずに洗剤又は洗浄システムのリパーゼの効
果を改善すべく、特定部位の突然変異誘発を含む組換え
ＤＮＡ技術によって得ることができる。そこで本発明
は、洗剤システム中でより高い性能を示す修飾リパーゼ
の製造にも係わる。
の余地があるため、好ましくは、リパーゼをコードする
遺伝子が野性型リパーゼ遺伝子を修飾したもの、例えば
同時係属特許出願ＥＰ−Ａ−４０７ ２２５号に記載の
ような修飾遺伝子である本発明の微生物を使用する。前
記修飾体は、対応する修飾リパーゼによりリパーゼ特異
的安定化／転位タンパク質の安定化／転位機能が減損す
る事態を伴わずに洗剤又は洗浄システムのリパーゼの効
果を改善すべく、特定部位の突然変異誘発を含む組換え
ＤＮＡ技術によって得ることができる。そこで本発明
は、洗剤システム中でより高い性能を示す修飾リパーゼ
の製造にも係わる。
【００１７】好ましいリパーゼ特異的安定化／転位タン
パク質は、特にＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌｕｍａｅ
ＰＧ１由来のリパーゼ遺伝子と共に使用する場合に
は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌｕｍａｅ ＰＧ１か
ら単離したリパーゼ特異的安定化／転位タンパク質であ
るが、本質的に同じ安定化／転位活性を有する他のリパ
ーゼ特異的安定化／転位タンパク質を使用することもで
きる。例えば、タンパク質又はその遺伝子が本明細書に
記載のようなＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌｕｍａｅ
ＰＧ１由来のリパーゼ特異的安定化／転位タンパク質又
はその遺伝子と同じか又は実質的な（配列）相同を有す
るようなリパーゼ特異的安定化／転位タンパク質を使用
してもよい。
パク質は、特にＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌｕｍａｅ
ＰＧ１由来のリパーゼ遺伝子と共に使用する場合に
は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌｕｍａｅ ＰＧ１か
ら単離したリパーゼ特異的安定化／転位タンパク質であ
るが、本質的に同じ安定化／転位活性を有する他のリパ
ーゼ特異的安定化／転位タンパク質を使用することもで
きる。例えば、タンパク質又はその遺伝子が本明細書に
記載のようなＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌｕｍａｅ
ＰＧ１由来のリパーゼ特異的安定化／転位タンパク質又
はその遺伝子と同じか又は実質的な（配列）相同を有す
るようなリパーゼ特異的安定化／転位タンパク質を使用
してもよい。
【００１８】また、安定化／転位活性が類似していれ
ば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌｕｍａｅ ＰＧ１に
由来するリパーゼ特異的安定化／転位タンパク質又はそ
のエピトープに対する抗血清との免疫交差反応を起こす
リパーゼ特異的安定化／転位タンパク質を使用すること
もできる。グラム陰性菌によって産生されるリパーゼの
安定化／転位タンパク質をコードする遺伝子はＰＣＲ技
術のような公知の方法によって容易に単離できる。
ば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌｕｍａｅ ＰＧ１に
由来するリパーゼ特異的安定化／転位タンパク質又はそ
のエピトープに対する抗血清との免疫交差反応を起こす
リパーゼ特異的安定化／転位タンパク質を使用すること
もできる。グラム陰性菌によって産生されるリパーゼの
安定化／転位タンパク質をコードする遺伝子はＰＣＲ技
術のような公知の方法によって容易に単離できる。
【００１９】リパーゼ産生方法を改善する方法の１つ
は、プロモーター活性が野性型における活性の少なくと
も２倍になるように、（特にプロモーター内で）転写を
調節する配列であって、遺伝子を２つ含んでいて転写後
にリパーゼ及びリパーゼ特異的安定化／転位タンパク質
両方のポリシストロニックメッセンジャーＲＮＡとなる
オペロンを制御する配列に突然変異を含む微生物を製造
することからなる。別の方法として、これらの遺伝子の
前方にある生来のプロモーター配列を、より強力でより
適切なプロモーター、例えば強力な誘導ｔａｃプロモー
ターで置換することもできる。勿論、これらの方法を組
合わせて使用してもよい。このようにして転写又はプロ
モーター活性をより良く調節すると、リパーゼの産生及
び分泌が増大し得る。
は、プロモーター活性が野性型における活性の少なくと
も２倍になるように、（特にプロモーター内で）転写を
調節する配列であって、遺伝子を２つ含んでいて転写後
にリパーゼ及びリパーゼ特異的安定化／転位タンパク質
両方のポリシストロニックメッセンジャーＲＮＡとなる
オペロンを制御する配列に突然変異を含む微生物を製造
することからなる。別の方法として、これらの遺伝子の
前方にある生来のプロモーター配列を、より強力でより
適切なプロモーター、例えば強力な誘導ｔａｃプロモー
ターで置換することもできる。勿論、これらの方法を組
合わせて使用してもよい。このようにして転写又はプロ
モーター活性をより良く調節すると、リパーゼの産生及
び分泌が増大し得る。
【００２０】後述の実施例で示すように、リパーゼ遺伝
子構造及び／又はそのｍＲＮＡを含む発現プラスミドの
安定性は、（好ましくは宿主と同種の）シグナル配列を
コードする遺伝子フラグメントがリパーゼ遺伝子の前に
存在し、そのとき、前記シグナル配列と前記リパーゼ遺
伝子との間にはリパーゼのシグナル配列のＣ末端部分を
コードする一連のヌクレオチド、好ましくは前記Ｃ末端
部分から数えて４５個以下、より好ましくは２４個以下
のヌクレオチド（特に図２〜６に示したヌクレオチド列
のいずれか１つ）が含まれていると改善され得ることが
判明した。このヌクレオチド列は、宿主細胞と同種のシ
グナル配列のＡＴＧ（開始）コドンによって決定される
読取り枠内にリパーゼ遺伝子が配置されるような多数の
ヌクレオチドを含む。本発明は理論的考察には限定され
ないが、この長さのヌクレオチドによってコードされる
アミノ酸は良好な転位とプレ（プロ）リパーゼからリパ
ーゼへの正確なプロセッシングとにとって重要なのもの
と考えられる。
子構造及び／又はそのｍＲＮＡを含む発現プラスミドの
安定性は、（好ましくは宿主と同種の）シグナル配列を
コードする遺伝子フラグメントがリパーゼ遺伝子の前に
存在し、そのとき、前記シグナル配列と前記リパーゼ遺
伝子との間にはリパーゼのシグナル配列のＣ末端部分を
コードする一連のヌクレオチド、好ましくは前記Ｃ末端
部分から数えて４５個以下、より好ましくは２４個以下
のヌクレオチド（特に図２〜６に示したヌクレオチド列
のいずれか１つ）が含まれていると改善され得ることが
判明した。このヌクレオチド列は、宿主細胞と同種のシ
グナル配列のＡＴＧ（開始）コドンによって決定される
読取り枠内にリパーゼ遺伝子が配置されるような多数の
ヌクレオチドを含む。本発明は理論的考察には限定され
ないが、この長さのヌクレオチドによってコードされる
アミノ酸は良好な転位とプレ（プロ）リパーゼからリパ
ーゼへの正確なプロセッシングとにとって重要なのもの
と考えられる。
【００２１】本発明は、前述のようなリパーゼ産生微生
物の製造方法にも係わる。この方法は、組換えＤＮＡ修
飾方法を用いて微生物を形質転換し、それによってリパ
ーゼをコードする遺伝子の少なくとも１つのコピー及び
リパーゼ特異的安定化／転位タンパク質をコードする遺
伝子の少なくとも１つのコピーの両方を前記微生物中に
導入し、その結果後者の遺伝子がリパーゼ遺伝子の発現
と協奏的に前記微生物中に発現されるようにすることか
らなる。遺伝子コピーの数はベクターの選択又は宿主の
染色体上への複数のコピーの組込みによって調整し得
る。
物の製造方法にも係わる。この方法は、組換えＤＮＡ修
飾方法を用いて微生物を形質転換し、それによってリパ
ーゼをコードする遺伝子の少なくとも１つのコピー及び
リパーゼ特異的安定化／転位タンパク質をコードする遺
伝子の少なくとも１つのコピーの両方を前記微生物中に
導入し、その結果後者の遺伝子がリパーゼ遺伝子の発現
と協奏的に前記微生物中に発現されるようにすることか
らなる。遺伝子コピーの数はベクターの選択又は宿主の
染色体上への複数のコピーの組込みによって調整し得
る。
【００２２】好ましい方法の１つでは、前記遺伝子の両
方を、翻訳後にリパーゼ及びリパーゼ安定化／転位タン
パク質両方のポリシストロニックメッセンジャーＲＮＡ
となる２つの遺伝子を含むオペロンとして導入する。本
発明のリパーゼ産生微生物内でのリパーゼ産生を改善す
る方法の最も直接的な手法は、組換えＤＮＡ技術の使用
であるが、一般的な突然変異によって適切な突然変異を
得ることもできる。
方を、翻訳後にリパーゼ及びリパーゼ安定化／転位タン
パク質両方のポリシストロニックメッセンジャーＲＮＡ
となる２つの遺伝子を含むオペロンとして導入する。本
発明のリパーゼ産生微生物内でのリパーゼ産生を改善す
る方法の最も直接的な手法は、組換えＤＮＡ技術の使用
であるが、一般的な突然変異によって適切な突然変異を
得ることもできる。
【００２３】前記２つの遺伝子は２遺伝子オペロン中で
相互に結合してもよいが、互いに同じ又は異なる強力な
プロモーターの制御下で２つの別個の遺伝子として使用
することもできる。異なるプロモーターを使用する場合
には、これらのプロモーターを同時に誘発することが重
要である。別個の遺伝子として用いる場合は、これらの
遺伝子を同一の又は異なるプラスミド上に存在させる
か、又は宿主の染色体内に存在させ得る。これは、特に
下等真核生物の場合には、同種宿主及び異種宿主の両方
に適用できる。
相互に結合してもよいが、互いに同じ又は異なる強力な
プロモーターの制御下で２つの別個の遺伝子として使用
することもできる。異なるプロモーターを使用する場合
には、これらのプロモーターを同時に誘発することが重
要である。別個の遺伝子として用いる場合は、これらの
遺伝子を同一の又は異なるプラスミド上に存在させる
か、又は宿主の染色体内に存在させ得る。これは、特に
下等真核生物の場合には、同種宿主及び異種宿主の両方
に適用できる。
【００２４】本発明は、（好ましくはリパーゼ産生グラ
ム陰性菌に由来する）リパーゼ特異的安定化／転位タン
パク質をコードするヌクレオチド配列にも係わる。本発
明は特に、図３に示すようなリパーゼ特異的安定化／転
位タンパク質をコードする配列を提供する。ＯＲＦ２遺
伝子はＧ＋Ｃ含量が極めて高い約２００個分の長さのヌ
クレオチド含むことが判明した。これは、後述の実施例
で説明するように、Ｐ．ｇｌｕｍａｅに対して異種であ
ると考えられる宿主では問題を起こすことが明らかにな
った。
ム陰性菌に由来する）リパーゼ特異的安定化／転位タン
パク質をコードするヌクレオチド配列にも係わる。本発
明は特に、図３に示すようなリパーゼ特異的安定化／転
位タンパク質をコードする配列を提供する。ＯＲＦ２遺
伝子はＧ＋Ｃ含量が極めて高い約２００個分の長さのヌ
クレオチド含むことが判明した。これは、後述の実施例
で説明するように、Ｐ．ｇｌｕｍａｅに対して異種であ
ると考えられる宿主では問題を起こすことが明らかにな
った。
【００２５】そこで異種宿主の場合には、Ｇ＋Ｃ含量の
極めて高い遺伝子の部分を、好ましくは、Ｇ＋Ｃ含量及
びコドンの使用態様が宿主内で十分に発現された遺伝子
のＧ＋Ｃ含量及びコドンの使用態様と合致するように修
飾する。実施例で示すように、この操作はリパーゼ特異
的安定化／転位タンパク質の最初の約２００個のアミノ
酸をコードするＯＲＦ２遺伝子の部分を修飾することに
よって達成できる。
極めて高い遺伝子の部分を、好ましくは、Ｇ＋Ｃ含量及
びコドンの使用態様が宿主内で十分に発現された遺伝子
のＧ＋Ｃ含量及びコドンの使用態様と合致するように修
飾する。実施例で示すように、この操作はリパーゼ特異
的安定化／転位タンパク質の最初の約２００個のアミノ
酸をコードするＯＲＦ２遺伝子の部分を修飾することに
よって達成できる。
【００２６】例えば、発現プラスミド及び／又はｍＲＮ
Ａの安定性を改善するためには、前記ヌクレオチド配列
の最初の約２００個のコドンを、これらが本質的に同じ
アミノ酸をコードするように、但し宿主細胞内で極めて
十分に翻訳されるメッセンジャーＲＮＡのＧ＋Ｃ含量と
同じか又はほぼ同じＧ＋Ｃ含量を有するように修飾し得
る。この実施態様の一変形例では、ＯＲＦ２配列全体
が、この配列を発現する意図の宿主細胞中で極めて十分
に翻訳されやすいメッセンジャーＲＮＡのＧ＋Ｃ含量と
実質的に同じＧ＋Ｃ含量を有する。同種宿主の場合に
は、Ｇ＋Ｃ含量の高い配列を置換しても有利であり得
る。
Ａの安定性を改善するためには、前記ヌクレオチド配列
の最初の約２００個のコドンを、これらが本質的に同じ
アミノ酸をコードするように、但し宿主細胞内で極めて
十分に翻訳されるメッセンジャーＲＮＡのＧ＋Ｃ含量と
同じか又はほぼ同じＧ＋Ｃ含量を有するように修飾し得
る。この実施態様の一変形例では、ＯＲＦ２配列全体
が、この配列を発現する意図の宿主細胞中で極めて十分
に翻訳されやすいメッセンジャーＲＮＡのＧ＋Ｃ含量と
実質的に同じＧ＋Ｃ含量を有する。同種宿主の場合に
は、Ｇ＋Ｃ含量の高い配列を置換しても有利であり得
る。
【００２７】本発明は更に、形質転換した微生物によっ
てリパーゼを産生する方法にも係わる。この方法は、前
述のような本発明の形質転換微生物をリパーゼが産生さ
れ且つ好ましくは分泌されるような条件下で培養し、次
いでリパーゼを回収することからなる。
てリパーゼを産生する方法にも係わる。この方法は、前
述のような本発明の形質転換微生物をリパーゼが産生さ
れ且つ好ましくは分泌されるような条件下で培養し、次
いでリパーゼを回収することからなる。
【００２８】本発明は、本発明の微生物によって産生さ
れ且つ好ましくは単離されたリパーゼを含む洗剤又は洗
浄用組成物にも係わる。
れ且つ好ましくは単離されたリパーゼを含む洗剤又は洗
浄用組成物にも係わる。
【００２９】ここで実施例を挙げて本発明をより詳細に
説明する。使用する技術は本質的に、例えばＪ．Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＴ．Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ著Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；第２版（１９８
９）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに記載のもの、又は未公
開同時係属特許出願ＥＰ−Ａ−４０７ ２２５及びＷＯ
−Ａ−９１／００９２０に記載のものである。
説明する。使用する技術は本質的に、例えばＪ．Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＴ．Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ著Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；第２版（１９８
９）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに記載のもの、又は未公
開同時係属特許出願ＥＰ−Ａ−４０７ ２２５及びＷＯ
−Ａ−９１／００９２０に記載のものである。
【００３０】
実施例１Ｐ．ｇｌｕｍａｅ ＰＧ１のＯＲＦ２遺伝子の単離 Ｐ．ｇｌｕｍａｅ ＰＧ１の遺伝子ライブラリーを、大
腸菌１０４６（ｍｅｔ、ｇａｌ、ｌａｃ、ｈｓｄＲ、ｐ
ｈｘ、ｓｕｐＥ、ｈｓｄＭ、ｒｅｃＡ）内に維持されて
いるコスミドベクターｃ２ＲＢ（Ｂａｔｅｓ及びＳｗｉ
ｆｔ，１９８３）中に構築した。ｌｉｐＡ遺伝子を単離
すベく、Ｐ．ｇｌｕｍａｅリパーゼのＮＨ２末端アミノ
酸配列をベースとする放射性標識した混合プローブを用
いて前記ライブラリーをスクリーニングにかけた。この
方法で幾つかの適切なコスミドクローンを得、そのうち
の１つをｐＵＲ６０００と名付けた。このコスミドクロ
ーンから幾つかのサブクローン、特にｐＵＲ６００１、
ｐＵＲ６００２及びｐＵＲ６００６を形成した。これら
のサブクローンも放射性標識した混合プローブとの間で
陽性反応を生じた。これらのプラスミドの形成は未公開
同時係属出願ＥＰ−Ａ−４０７ ２２５号及びＷＯ−Ａ
−９１／００９２０号に詳述されている。これらの特許
出願明細書にはｌｉｐＡ構造遺伝子の完全なヌクレオチ
ド配列も記述されている。この遺伝子は、成熟リパーゼ
に先行する３９個のアミノ酸からなるＮ末端延長部を含
むリパーゼ前駆体をコードすることが判明した。この延
長部は、シグナル配列としては比較的長いと思われた
が、リパーゼの分泌シグナルとして機能すると想定し
た。
腸菌１０４６（ｍｅｔ、ｇａｌ、ｌａｃ、ｈｓｄＲ、ｐ
ｈｘ、ｓｕｐＥ、ｈｓｄＭ、ｒｅｃＡ）内に維持されて
いるコスミドベクターｃ２ＲＢ（Ｂａｔｅｓ及びＳｗｉ
ｆｔ，１９８３）中に構築した。ｌｉｐＡ遺伝子を単離
すベく、Ｐ．ｇｌｕｍａｅリパーゼのＮＨ２末端アミノ
酸配列をベースとする放射性標識した混合プローブを用
いて前記ライブラリーをスクリーニングにかけた。この
方法で幾つかの適切なコスミドクローンを得、そのうち
の１つをｐＵＲ６０００と名付けた。このコスミドクロ
ーンから幾つかのサブクローン、特にｐＵＲ６００１、
ｐＵＲ６００２及びｐＵＲ６００６を形成した。これら
のサブクローンも放射性標識した混合プローブとの間で
陽性反応を生じた。これらのプラスミドの形成は未公開
同時係属出願ＥＰ−Ａ−４０７ ２２５号及びＷＯ−Ａ
−９１／００９２０号に詳述されている。これらの特許
出願明細書にはｌｉｐＡ構造遺伝子の完全なヌクレオチ
ド配列も記述されている。この遺伝子は、成熟リパーゼ
に先行する３９個のアミノ酸からなるＮ末端延長部を含
むリパーゼ前駆体をコードすることが判明した。この延
長部は、シグナル配列としては比較的長いと思われた
が、リパーゼの分泌シグナルとして機能すると想定し
た。
【００３１】約２．２ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントの
上、並びに同時係属特許出願ＥＰ−Ａ−４０７ ２２５
号に記載のｐＵＲ６００１及びｐＵＲ６００２の中に存
在するｌｉｐＡ遺伝子の下流のＤＮＡ配列について更に
研究を進めた結果、ｌｉｐＡ遺伝子のすぐ下流にはＡＴ
Ｇ（開始）コドンが存在することが判明した（位置１５
５９）。このＡＴＧの前には推定上のＲＢＳが存在し、
後には読取り枠（ＯＲＦ２）が存在する。ＢａｍＨＩフ
ラグメントのＯＲＦ２部分には終結コドンが存在してい
なかったため、この読取り枠が下流のＢａｍＨＩ部位を
超えて延びていることは明らかである。
上、並びに同時係属特許出願ＥＰ−Ａ−４０７ ２２５
号に記載のｐＵＲ６００１及びｐＵＲ６００２の中に存
在するｌｉｐＡ遺伝子の下流のＤＮＡ配列について更に
研究を進めた結果、ｌｉｐＡ遺伝子のすぐ下流にはＡＴ
Ｇ（開始）コドンが存在することが判明した（位置１５
５９）。このＡＴＧの前には推定上のＲＢＳが存在し、
後には読取り枠（ＯＲＦ２）が存在する。ＢａｍＨＩフ
ラグメントのＯＲＦ２部分には終結コドンが存在してい
なかったため、この読取り枠が下流のＢａｍＨＩ部位を
超えて延びていることは明らかである。
【００３２】ＯＲＦ２の完全配列を決定するためには、
ｐＵＲ６００６中の或るＳａｃＩＩ部位の存在を使用で
きることが判明した。というのも、制限酵素の分析の結
果、リパーゼ遺伝子の下流にＢａｍＨＩ部位を含む約
１．２ｋｂのＳａｃＩＩフラグメントが存在することが
判明したからである。そこで、プラスミドｐＥＭＢＬ９
（Ｄｅｎｔｅ，Ｌ．ら、１９８３）のマルチプルクロー
ニング部位を、ＳａｃＩＩ部位１つとＥｃｏＲＩ部位及
びＳａｃＩＩ部位間のＢｇｌＩＩ部位１つとを含むＥｃ
ｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントで置換することに
よってプラスミドｐＵＲ６０２６を形成した。ｐＵＲ６
００６の約１．２ｋｂのＳａｃＩＩフラグメントをｐＵ
Ｒ６０２６の単一ＳａｃＩＩ部位にサブクローンして２
つのプラスミドを得た。これらのプラスミドはＳａｃＩ
Ｉフラグメントを互いに異なる向きで有していた（ｐＵ
Ｒ６０１２Ａ及びｐＵＲ６０１２Ｂ、図１参照）。正確
なプラスミド（ｐＵＲ６０１２Ａ）の決定は適当な制限
酵素を用いて後述の実施例５に記載の方法で行った。
ｐＵＲ６００６中の或るＳａｃＩＩ部位の存在を使用で
きることが判明した。というのも、制限酵素の分析の結
果、リパーゼ遺伝子の下流にＢａｍＨＩ部位を含む約
１．２ｋｂのＳａｃＩＩフラグメントが存在することが
判明したからである。そこで、プラスミドｐＥＭＢＬ９
（Ｄｅｎｔｅ，Ｌ．ら、１９８３）のマルチプルクロー
ニング部位を、ＳａｃＩＩ部位１つとＥｃｏＲＩ部位及
びＳａｃＩＩ部位間のＢｇｌＩＩ部位１つとを含むＥｃ
ｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントで置換することに
よってプラスミドｐＵＲ６０２６を形成した。ｐＵＲ６
００６の約１．２ｋｂのＳａｃＩＩフラグメントをｐＵ
Ｒ６０２６の単一ＳａｃＩＩ部位にサブクローンして２
つのプラスミドを得た。これらのプラスミドはＳａｃＩ
Ｉフラグメントを互いに異なる向きで有していた（ｐＵ
Ｒ６０１２Ａ及びｐＵＲ６０１２Ｂ、図１参照）。正確
なプラスミド（ｐＵＲ６０１２Ａ）の決定は適当な制限
酵素を用いて後述の実施例５に記載の方法で行った。
【００３３】このＳａｃＩＩフラグメントの配列分析と
先にｐＵＲ６００１及びｐＵＲ６００２のＢａｍＨＩフ
ラグメントから得た配列データとに基づいて、ＯＲＦ２
は長さが１０６２ｂｐであり（図２〜６参照）、アミノ
酸３５３個のタンパク質をコードする（図７参照）と結
論された。図８は幾つかの制限地図（全部は図示してな
い）と前述の配列データとから推定したｌｉｐＡ遺伝子
の回りの染色体の状態を示している。
先にｐＵＲ６００１及びｐＵＲ６００２のＢａｍＨＩフ
ラグメントから得た配列データとに基づいて、ＯＲＦ２
は長さが１０６２ｂｐであり（図２〜６参照）、アミノ
酸３５３個のタンパク質をコードする（図７参照）と結
論された。図８は幾つかの制限地図（全部は図示してな
い）と前述の配列データとから推定したｌｉｐＡ遺伝子
の回りの染色体の状態を示している。
【００３４】ＯＲＦ２の開始コドンはｌｉｐＡ遺伝子の
終結コドンと重なり合っている（ＴＧＡＴＧ）。ＴＧＡ
コドン及びＡＴＧコドンがこのように重複又は近接する
現象は以前から観察されており（Ｂｒｕｎｅｌ １９８
８，Ｇｉｖｓｋｏｖ １９８８，Ｚｙｌｓｔｒａ １９
８９、Ｎｏｄａ １９９０）、ポリシストロニックｍＲ
ＮＡ上に転写された隣接シストロンの存在を示す。ＯＲ
Ｆ２開始コドンの正面にプロモーター配列は検出されな
かったが、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）として機能し
得る推定上の配列は前述のように存在していた。
終結コドンと重なり合っている（ＴＧＡＴＧ）。ＴＧＡ
コドン及びＡＴＧコドンがこのように重複又は近接する
現象は以前から観察されており（Ｂｒｕｎｅｌ １９８
８，Ｇｉｖｓｋｏｖ １９８８，Ｚｙｌｓｔｒａ １９
８９、Ｎｏｄａ １９９０）、ポリシストロニックｍＲ
ＮＡ上に転写された隣接シストロンの存在を示す。ＯＲ
Ｆ２開始コドンの正面にプロモーター配列は検出されな
かったが、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）として機能し
得る推定上の配列は前述のように存在していた。
【００３５】ＯＲＦ２のコドンの使用態様（位置１５５
９〜２６１７）は図２〜６から明らかなようにＰ．ａｅ
ｆｕｇｉｎｏｓａのコドン優先表（Ｗｅｓｔ及びＩｇｌ
ｅｗｓｋｉ，１９８８）と合致する。全ＯＲＦ２のＧ＋
Ｃ含量は７７％（第３位置のＧ＋Ｃ＝９１．５％）であ
り、これはＰｓｅｕｄｏｍｏｎｂａｃｅａｅに関して一
般的な数値である。しかしながら、８９％という極めて
高いＧ＋Ｃ含量を有する約２００ｂｐ（約１６８０〜約
１８８０）の列は特徴的なものである。この列は、逆方
向反復の存在に起因して、堅固なステム−ループ構造を
形成し得る。この種のステム−ループ構造はｍＲＮＡの
分解を調整し、既に発表されているように示差遺伝子発
現を引き起こす（Ｃｈｅｎ １９８８、Ｂｒａｗｅｒｍ
ａｎ １９９０）。
９〜２６１７）は図２〜６から明らかなようにＰ．ａｅ
ｆｕｇｉｎｏｓａのコドン優先表（Ｗｅｓｔ及びＩｇｌ
ｅｗｓｋｉ，１９８８）と合致する。全ＯＲＦ２のＧ＋
Ｃ含量は７７％（第３位置のＧ＋Ｃ＝９１．５％）であ
り、これはＰｓｅｕｄｏｍｏｎｂａｃｅａｅに関して一
般的な数値である。しかしながら、８９％という極めて
高いＧ＋Ｃ含量を有する約２００ｂｐ（約１６８０〜約
１８８０）の列は特徴的なものである。この列は、逆方
向反復の存在に起因して、堅固なステム−ループ構造を
形成し得る。この種のステム−ループ構造はｍＲＮＡの
分解を調整し、既に発表されているように示差遺伝子発
現を引き起こす（Ｃｈｅｎ １９８８、Ｂｒａｗｅｒｍ
ａｎ １９９０）。
【００３６】従ってこの実施例では、ＯＲＦ２のＤＮＡ
配列とこの配列によってコードされるアミノ酸配列とが
得られる。これらの配列は夫々図２〜６及び７に示し
た。実施例２ ＯＲＦ２遺伝子産生機能 ＯＲＦ２の機能を研究するために、この遺伝子の特異的
失活を実施した。ｐＢＲ３２２のテトラサイクリン耐性
遺伝子をｐＵＲ６０１２Ａ（実施例１参照）の唯一のＢ
ａｍＨＩ部位に挿入することにより、ＯＲＦ２の破壊を
行った（図１参照）。なお、その前にそのベクター及び
その断片の付着端を充填した。得られたプラスミドをｐ
ＵＲ６２００と命名した。このプラスミドは、ｐＵＲ６
０１２中に存在しておりｐＵＲ６０２６（実施例１参
照）のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ挿入断片に由来する
ＢｇｌＩＩ部位を含んでいる。プラスミドｐＵＲ６２０
０をＢｇ１ＩＩで消化し且つＨｉｎｄＩＩＩで部分的に
消化し、消化混合物を、付着端を充填した後にｐＲＺ１
０２（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎら，１９７９）の唯一のＢａ
ｍＨＩ部位中にクローニングした。連結混合物をＥ．ｃ
ｏｌｉ Ｓ１７−１に形質転換し、カナマイシン（２５
ｍｇ／ｌ）及びテトラサイクリン（２５ｍｇ／ｌ）を含
むＬＢ寒天上で平板培養した。得られたコロニーから、
Ｔｃ耐性遺伝子が挿入された染色体ＳａｃＩＩを含む約
２．６ｋｂの挿入体を担う、プラスミドがコードしたｐ
ＵＲ６２０８を単離した。
配列とこの配列によってコードされるアミノ酸配列とが
得られる。これらの配列は夫々図２〜６及び７に示し
た。実施例２ ＯＲＦ２遺伝子産生機能 ＯＲＦ２の機能を研究するために、この遺伝子の特異的
失活を実施した。ｐＢＲ３２２のテトラサイクリン耐性
遺伝子をｐＵＲ６０１２Ａ（実施例１参照）の唯一のＢ
ａｍＨＩ部位に挿入することにより、ＯＲＦ２の破壊を
行った（図１参照）。なお、その前にそのベクター及び
その断片の付着端を充填した。得られたプラスミドをｐ
ＵＲ６２００と命名した。このプラスミドは、ｐＵＲ６
０１２中に存在しておりｐＵＲ６０２６（実施例１参
照）のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ挿入断片に由来する
ＢｇｌＩＩ部位を含んでいる。プラスミドｐＵＲ６２０
０をＢｇ１ＩＩで消化し且つＨｉｎｄＩＩＩで部分的に
消化し、消化混合物を、付着端を充填した後にｐＲＺ１
０２（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎら，１９７９）の唯一のＢａ
ｍＨＩ部位中にクローニングした。連結混合物をＥ．ｃ
ｏｌｉ Ｓ１７−１に形質転換し、カナマイシン（２５
ｍｇ／ｌ）及びテトラサイクリン（２５ｍｇ／ｌ）を含
むＬＢ寒天上で平板培養した。得られたコロニーから、
Ｔｃ耐性遺伝子が挿入された染色体ＳａｃＩＩを含む約
２．６ｋｂの挿入体を担う、プラスミドがコードしたｐ
ＵＲ６２０８を単離した。
【００３７】Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｓ１７−１（ｐＵＲ６２０
８）で二親交配（ｂｉｐａｒｅｎｔａｌ ｍａｔｉｎ
ｇ）し、８０ｍｇ／ｌのテトラサイクリンを補充したＭ
ＭＥプレート（０．２ｇ／ｌ ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、
２ｇ／ｌクエン酸塩−Ｈ２Ｏ、１０ｇ／ｌ Ｋ２ＨＰＯ
４、３．５ｇ／ｌ ＮａＮＨ４ＨＰＯ４・４Ｈ２Ｏ、
０．５％グルコース及び１．５％寒天）においてトラン
ス接合体を選択することにより、ｐＵＲ６２０８をＰ．
ｇｌｕｍａｅ ＰＧ１中に導入した。幾つかのトランス
接合体を、ＭＭＥ−Ｋｍ（１００ｍｇ／ｌ）、ＭＭＥ−
Ｔｃ（８０ｍｇ／ｌ）及びＢＹＰＯ−Ｔｃ（１０ｇ／ｌ
トリプチカーゼペプトン、３ｇ／ｌ酵母抽出物、５ｇ／
ｌ牛肉抽出物、５ｇ／ｌ ＮａＣｌ、７ｇ／ｌ ＫＨ２
ＰＯ４、５０ｍｌ／ｌオリーブオイルエマルジョン、及
び８０ｍｇ／ｌテトラサイクリンを含む１．５％寒天）
の各プレートに移した後に得られた結果に従い、３種の
異なる発現型、即ち（ａ）Ｔｃ耐性，Ｋｍ感受性，Ｌｉ
ｐ−、（ｂ）Ｔｃ耐性，Ｋｍ耐性，Ｌｉｐ−、及び
（ｃ）Ｔｃ耐性，Ｋｍ耐性，ＬｉＰ＋を同定することが
できた。これらの株のサザン分析はそれぞれ、（ａ）の
場合には、二重交叉が起こって、無傷のＯＲＦ２遺伝子
が破壊遺伝子によって置き換えられ、（ｂ）の場合に
は、単一の交叉がＳａｃＩＩ断片の５’領域に起こり、
（ｃ）の場合には、単一の交叉がＳａｃＩＩ断片の３’
領域に起こることを示した。
８）で二親交配（ｂｉｐａｒｅｎｔａｌ ｍａｔｉｎ
ｇ）し、８０ｍｇ／ｌのテトラサイクリンを補充したＭ
ＭＥプレート（０．２ｇ／ｌ ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、
２ｇ／ｌクエン酸塩−Ｈ２Ｏ、１０ｇ／ｌ Ｋ２ＨＰＯ
４、３．５ｇ／ｌ ＮａＮＨ４ＨＰＯ４・４Ｈ２Ｏ、
０．５％グルコース及び１．５％寒天）においてトラン
ス接合体を選択することにより、ｐＵＲ６２０８をＰ．
ｇｌｕｍａｅ ＰＧ１中に導入した。幾つかのトランス
接合体を、ＭＭＥ−Ｋｍ（１００ｍｇ／ｌ）、ＭＭＥ−
Ｔｃ（８０ｍｇ／ｌ）及びＢＹＰＯ−Ｔｃ（１０ｇ／ｌ
トリプチカーゼペプトン、３ｇ／ｌ酵母抽出物、５ｇ／
ｌ牛肉抽出物、５ｇ／ｌ ＮａＣｌ、７ｇ／ｌ ＫＨ２
ＰＯ４、５０ｍｌ／ｌオリーブオイルエマルジョン、及
び８０ｍｇ／ｌテトラサイクリンを含む１．５％寒天）
の各プレートに移した後に得られた結果に従い、３種の
異なる発現型、即ち（ａ）Ｔｃ耐性，Ｋｍ感受性，Ｌｉ
ｐ−、（ｂ）Ｔｃ耐性，Ｋｍ耐性，Ｌｉｐ−、及び
（ｃ）Ｔｃ耐性，Ｋｍ耐性，ＬｉＰ＋を同定することが
できた。これらの株のサザン分析はそれぞれ、（ａ）の
場合には、二重交叉が起こって、無傷のＯＲＦ２遺伝子
が破壊遺伝子によって置き換えられ、（ｂ）の場合に
は、単一の交叉がＳａｃＩＩ断片の５’領域に起こり、
（ｃ）の場合には、単一の交叉がＳａｃＩＩ断片の３’
領域に起こることを示した。
【００３８】タイプ（ａ）のトランス接合体を表わすも
のをＰ．ｇｌｕｍａｅ ＰＧ４と称し、更なる調査に使
用した。ＰＧ４をＢＹＰＯプレート上で１０日間増殖さ
せた後にも清澄化ゾーンは検出されず、長期にインキュ
ベートした後でさえもＰＧ４によって活性リパーゼは産
生されないことが立証されたが、一方では同じ条件下で
ＰＧ１は、約５日後にはリパーゼの形成及び分泌を示唆
する清澄化ゾーンを示した。
のをＰ．ｇｌｕｍａｅ ＰＧ４と称し、更なる調査に使
用した。ＰＧ４をＢＹＰＯプレート上で１０日間増殖さ
せた後にも清澄化ゾーンは検出されず、長期にインキュ
ベートした後でさえもＰＧ４によって活性リパーゼは産
生されないことが立証されたが、一方では同じ条件下で
ＰＧ１は、約５日後にはリパーゼの形成及び分泌を示唆
する清澄化ゾーンを示した。
【００３９】更に、ＰＧ４突然変異株を使用し、Ｐ．ｇ
ｌｕｍａｅの生理機能とタンパク質、特にＬｉｐＡの転
位とに及ぼすＯＲＦ２失活の作用を研究した。０．５％
グルコースまたは０．５％オレイン酸のいずれかを補充
したＰＧ培地（（ＮＨ４）２ＳＯ４） ６ｇ／ｌ、ＫＨ
２ＰＯ４３．５ｇ／ｌ、ＣａＣｌ２０．０２ｇ／ｌ、酵
母抽出物２ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ１ｇ／ｌ及び
微量元素（Ｅｇｌｉ，１００倍）１０ｍｌ／ｌ，ｐＨ
６．５）中でのＰＧ１とＰＧ４の増殖を比較したとこ
ろ、差は全く現われなかった。このことは、炭素源とし
てのグルコースまたはオレイン酸の存在下で、必ずしも
リパーゼが形成されなくとも細菌は増殖し得るという事
実と一致する。
ｌｕｍａｅの生理機能とタンパク質、特にＬｉｐＡの転
位とに及ぼすＯＲＦ２失活の作用を研究した。０．５％
グルコースまたは０．５％オレイン酸のいずれかを補充
したＰＧ培地（（ＮＨ４）２ＳＯ４） ６ｇ／ｌ、ＫＨ
２ＰＯ４３．５ｇ／ｌ、ＣａＣｌ２０．０２ｇ／ｌ、酵
母抽出物２ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ１ｇ／ｌ及び
微量元素（Ｅｇｌｉ，１００倍）１０ｍｌ／ｌ，ｐＨ
６．５）中でのＰＧ１とＰＧ４の増殖を比較したとこ
ろ、差は全く現われなかった。このことは、炭素源とし
てのグルコースまたはオレイン酸の存在下で、必ずしも
リパーゼが形成されなくとも細菌は増殖し得るという事
実と一致する。
【００４０】スキムミルクプレート上でのプロテアーゼ
の分泌も同様である（図９）。これは、ＯＲＦ２遺伝子
産物がＰ．ｇｌｕｍａｅの（脂質）代謝にも共通タンパ
ク質分泌系にも影響しないことを意味しており、ＯＲＦ
２が、リパーゼのみの安定化／転位に極めて特異的であ
ることを示唆するものである。ＰＧ１またはＰＧ４をＰ
Ｇ／オレイン酸培地中で培養した後、かかる培養体のｍ
ＲＮＡをノザン分析したところ、両ケースで、ＬｉｐＡ
遺伝子のＰｖｕＩＩ断片とハイブリダイズし、ヌクレオ
チド７９２〜１４７２（図２〜６）に対応する約１４０
０個のヌクレオチドのｍＲＮＡバンドが存在することが
判った（図１０）。このことは、ＯＲＦ２遺伝子及び存
在し得るいかなるＯＲＦ２遺伝子産物のどちらもｌｉｐ
Ａ遺伝子の転写調節に関与していないことを示唆してい
る。リパーゼ誘導条件、即ちＰＧ／オレイン酸培地中で
ＰＧ４細胞を増殖させたところ、細胞中にも培地中にも
ウェステン分析によってリパーゼは検出されず、一方Ｐ
Ｇ１では、細胞及び培地の両方でリパーゼが検出され
た。
の分泌も同様である（図９）。これは、ＯＲＦ２遺伝子
産物がＰ．ｇｌｕｍａｅの（脂質）代謝にも共通タンパ
ク質分泌系にも影響しないことを意味しており、ＯＲＦ
２が、リパーゼのみの安定化／転位に極めて特異的であ
ることを示唆するものである。ＰＧ１またはＰＧ４をＰ
Ｇ／オレイン酸培地中で培養した後、かかる培養体のｍ
ＲＮＡをノザン分析したところ、両ケースで、ＬｉｐＡ
遺伝子のＰｖｕＩＩ断片とハイブリダイズし、ヌクレオ
チド７９２〜１４７２（図２〜６）に対応する約１４０
０個のヌクレオチドのｍＲＮＡバンドが存在することが
判った（図１０）。このことは、ＯＲＦ２遺伝子及び存
在し得るいかなるＯＲＦ２遺伝子産物のどちらもｌｉｐ
Ａ遺伝子の転写調節に関与していないことを示唆してい
る。リパーゼ誘導条件、即ちＰＧ／オレイン酸培地中で
ＰＧ４細胞を増殖させたところ、細胞中にも培地中にも
ウェステン分析によってリパーゼは検出されず、一方Ｐ
Ｇ１では、細胞及び培地の両方でリパーゼが検出され
た。
【００４１】ＰＧ１及びＰＧ４においてリパーゼをコー
ドするｍＲＮＡの量はおおよそ同じであり、しかも転写
効率に影響し得るリパーゼ遺伝子のヌクレオチド配列の
変更は導入されなかったので、ＯＲＦ２遺伝子産物は
Ｐ．ｇｌｕｍａｅにおけるリパーゼの安定化／転位に不
可欠であると結論し得る。
ドするｍＲＮＡの量はおおよそ同じであり、しかも転写
効率に影響し得るリパーゼ遺伝子のヌクレオチド配列の
変更は導入されなかったので、ＯＲＦ２遺伝子産物は
Ｐ．ｇｌｕｍａｅにおけるリパーゼの安定化／転位に不
可欠であると結論し得る。
【００４２】実施例３Ｐ．ｇｌｕｍａｅ ＰＧ４のリパーゼ産生の相補性 プラスミドｐＵＲ６５００、ｐＵＲ６５０２及びｐＵＲ
６５２２は、同時係属特許出願ＥＰ−Ａ−４０７ ２２
５号の第８０頁〜第８２頁に記載されている。プラスミ
ドｐＥＭ４は、ｐＥＭＢＬ９（前記実施例１参照）のＥ
ｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩのマルチクローニング部位
を、配列： を有する合成ＤＮＡ断片で置き換えることにより得た。
６５２２は、同時係属特許出願ＥＰ−Ａ−４０７ ２２
５号の第８０頁〜第８２頁に記載されている。プラスミ
ドｐＥＭ４は、ｐＥＭＢＬ９（前記実施例１参照）のＥ
ｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩのマルチクローニング部位
を、配列： を有する合成ＤＮＡ断片で置き換えることにより得た。
【００４３】この新たなマルチクローニング部位は、与
えられた順に、ＥｃｏＲＩ（ＧＡＡＴＴＣ）、ＰｓｔＩ
（ＣＴＧＣＡＧ）、ＭｌｕＩ（ＡＣＧＣＧＴ）、Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ（ＡＡＧＣＴＴ）の制限部位を含んだ。プラス
ミドｐＵＲ６０９８は、ｐＵＲ６００６（上記実施例１
及び図８参照）中に存在する約２ｋｂのＰｓｔＩ−Ｍｌ
ｕＩ断片を、２つの同じ制限酵素で消化したｐＥＭ４中
にクローニングすることにより製造した。ｐＵＲ６０９
８由来の約２ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片
を、同じ２つの制限酵素で消化したｐＵＲ６５００中に
クローニングし、ｐＵＲ６５２０を得た。クローニング
処理の宿主としてＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を使用し
た。
えられた順に、ＥｃｏＲＩ（ＧＡＡＴＴＣ）、ＰｓｔＩ
（ＣＴＧＣＡＧ）、ＭｌｕＩ（ＡＣＧＣＧＴ）、Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ（ＡＡＧＣＴＴ）の制限部位を含んだ。プラス
ミドｐＵＲ６０９８は、ｐＵＲ６００６（上記実施例１
及び図８参照）中に存在する約２ｋｂのＰｓｔＩ−Ｍｌ
ｕＩ断片を、２つの同じ制限酵素で消化したｐＥＭ４中
にクローニングすることにより製造した。ｐＵＲ６０９
８由来の約２ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片
を、同じ２つの制限酵素で消化したｐＵＲ６５００中に
クローニングし、ｐＵＲ６５２０を得た。クローニング
処理の宿主としてＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を使用し
た。
【００４４】プラスミドｐＵＲ６５００、ｐＵＲ６５０
２、ｐＵＲ６５２０及びｐＵＲ６５２２を、二親交配に
よってＰ．ｇｌｕｍａｅ ＰＧ４中に個々に導入した。
対照のために、プラスミドｐＵＲ６５００及びｐＵＲ６
５２２を野生型Ｐ．ｇｌｕｍａｅ ＰＧ１中にも同様に
して個々に導入した。
２、ｐＵＲ６５２０及びｐＵＲ６５２２を、二親交配に
よってＰ．ｇｌｕｍａｅ ＰＧ４中に個々に導入した。
対照のために、プラスミドｐＵＲ６５００及びｐＵＲ６
５２２を野生型Ｐ．ｇｌｕｍａｅ ＰＧ１中にも同様に
して個々に導入した。
【００４５】カナマイシン１００ｍｇ／ｌを含むＭＭＥ
−Ｋｍプレートにおいてトランス接合体を選択し、それ
らを、カナマイシン１００ｍｇ／ｌを含み且つ０．５ｍ
Ｍイソプロピル−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含む
または含まないＢＹＰＯ−Ｋｍプレートに移した。３０
℃で１週間インキュベートした後、リパーゼ産生を評価
した（表１及び図１１）。ｐＵＲ６５００、ｐＵＲ６５
２０またはｐＵＲ６５２２を含むＰＧ４の除去実験（ｃ
ｕｒｉｎｇ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）は、相同組換え
による組込みが行われなかったことを示した。
−Ｋｍプレートにおいてトランス接合体を選択し、それ
らを、カナマイシン１００ｍｇ／ｌを含み且つ０．５ｍ
Ｍイソプロピル−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含む
または含まないＢＹＰＯ−Ｋｍプレートに移した。３０
℃で１週間インキュベートした後、リパーゼ産生を評価
した（表１及び図１１）。ｐＵＲ６５００、ｐＵＲ６５
２０またはｐＵＲ６５２２を含むＰＧ４の除去実験（ｃ
ｕｒｉｎｇ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）は、相同組換え
による組込みが行われなかったことを示した。
【００４６】ＰＧ−オレイン酸培地中で増殖させた上記
所与の４種のプラスミドを含むＰＧ４細胞のウェスタン
分析の結果を図１２に与える。図１２には、Ｐ．ｇｌｕ
ｍａｅ由来の染色体ＤＮＡを含まないプラスミドによっ
て形質転換された野生型リパーゼ産生細菌の対照とし
て、ｐＵＲ６５００を含むＰＧ１の結果も表してある。
所与の４種のプラスミドを含むＰＧ４細胞のウェスタン
分析の結果を図１２に与える。図１２には、Ｐ．ｇｌｕ
ｍａｅ由来の染色体ＤＮＡを含まないプラスミドによっ
て形質転換された野生型リパーゼ産生細菌の対照とし
て、ｐＵＲ６５００を含むＰＧ１の結果も表してある。
【００４７】上記実験の結果は、ＯＲＦ２遺伝子をＰＧ
４中において２つの方法で発現させることが可能であ
り、いずれも、Ｐ．ｇｌｕｍａｅにおけるリパーゼの安
定化／転位を媒介するタンパク質を産生する結果となる
ことが判る。
４中において２つの方法で発現させることが可能であ
り、いずれも、Ｐ．ｇｌｕｍａｅにおけるリパーゼの安
定化／転位を媒介するタンパク質を産生する結果となる
ことが判る。
【００４８】一方の方法は、（ｐＵＲ６５２２に由来す
る）ＬｉｐＡ及びＯＲＦ２遺伝子産物の両方をコードす
るポリシストロニックｍＲＮＡから翻訳されるものであ
った。他方の方法は、（ｐＵＲ６５２０に由来する）Ｏ
ＲＦ２のみをコードするｍＲＮＡから翻訳されるもので
あり、一方リパーゼは、（Ｔｃ耐性遺伝子の挿入によっ
てＯＲＦ２が失活されている染色体に由来する）Ｌｉｐ
Ａをコードする別のｍＲＮＡから翻訳された。株Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌｕｍａｅ ＰＧ４（ｐＵＲ６５
２０）は、１９９０年９月１８日付けでｔｈｅ Ｃｅｎ
ｔｒａａｌｕｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅ
ｌｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｂａａｒｎ，オランダに受託番号
ＣＢＳ４０５．９０で寄託されている。
る）ＬｉｐＡ及びＯＲＦ２遺伝子産物の両方をコードす
るポリシストロニックｍＲＮＡから翻訳されるものであ
った。他方の方法は、（ｐＵＲ６５２０に由来する）Ｏ
ＲＦ２のみをコードするｍＲＮＡから翻訳されるもので
あり、一方リパーゼは、（Ｔｃ耐性遺伝子の挿入によっ
てＯＲＦ２が失活されている染色体に由来する）Ｌｉｐ
Ａをコードする別のｍＲＮＡから翻訳された。株Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌｕｍａｅ ＰＧ４（ｐＵＲ６５
２０）は、１９９０年９月１８日付けでｔｈｅ Ｃｅｎ
ｔｒａａｌｕｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅ
ｌｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｂａａｒｎ，オランダに受託番号
ＣＢＳ４０５．９０で寄託されている。
【００４９】実施例４ リパーゼの発現及び分泌の向上 リパーゼがそれ自体のプロモーターによって培養液中で
産生するには、産生率が比較的低い、プロテアーゼ及び
糖脂質などの他の成分が産生されるなどの幾つかの欠点
を有し、これは、洗剤系における用途に適した形態でリ
パーゼを単離する後続処理に悪影響を及ぼす。
産生するには、産生率が比較的低い、プロテアーゼ及び
糖脂質などの他の成分が産生されるなどの幾つかの欠点
を有し、これは、洗剤系における用途に適した形態でリ
パーゼを単離する後続処理に悪影響を及ぼす。
【００５０】上記問題点を小さくする１つの方法は、
（ＬｉｐＡ及びＯＲＦ２の両方を含む）リパーゼオペロ
ンの発現を向上させる（好ましくは誘導可能であり、ま
た好ましくはより強力な）別のプロモーターを使用する
ことである。従って、全リパーゼ及びＯＲＦ２遺伝子が
誘導可能なｔａｃプロモーター下に置かれたプラスミド
ｐＵＲ６５２２を用いて実験を行った。対照として、
Ｐ．ｇｌｕｍａｅ由来の染色体ＤＮＡは含まないが、ｐ
ＵＲ６５２２中に存在するのと同じ発現可能なＫｍ耐性
遺伝子を含むプラスミドｐＵＲ６５００を使用した。
（ＬｉｐＡ及びＯＲＦ２の両方を含む）リパーゼオペロ
ンの発現を向上させる（好ましくは誘導可能であり、ま
た好ましくはより強力な）別のプロモーターを使用する
ことである。従って、全リパーゼ及びＯＲＦ２遺伝子が
誘導可能なｔａｃプロモーター下に置かれたプラスミド
ｐＵＲ６５２２を用いて実験を行った。対照として、
Ｐ．ｇｌｕｍａｅ由来の染色体ＤＮＡは含まないが、ｐ
ＵＲ６５２２中に存在するのと同じ発現可能なＫｍ耐性
遺伝子を含むプラスミドｐＵＲ６５００を使用した。
【００５１】図９に示したように、Ｐ．ｇｌｕｍａｅ
ＰＧ４（ｐＵＲ６５２２）または野生型Ｐ．ｇｌｕｍａ
ｅ ＰＧ１（ｐＵＲ６５２２）によって産生されたリパ
ーゼの量は実際に、Ｐ．ｇｌｕｍａｅ ＰＧ１（ｐＵＲ
６５００）またはＰ．ｇｌｕｍａｅ ＰＧ４（ｐＵＲ６
５００）を用いた同様の実験におけるよりも高かった。
更に、ｐＵＲ６５２２含有株によって産生されたリパー
ゼの精製はより容易と言える。
ＰＧ４（ｐＵＲ６５２２）または野生型Ｐ．ｇｌｕｍａ
ｅ ＰＧ１（ｐＵＲ６５２２）によって産生されたリパ
ーゼの量は実際に、Ｐ．ｇｌｕｍａｅ ＰＧ１（ｐＵＲ
６５００）またはＰ．ｇｌｕｍａｅ ＰＧ４（ｐＵＲ６
５００）を用いた同様の実験におけるよりも高かった。
更に、ｐＵＲ６５２２含有株によって産生されたリパー
ゼの精製はより容易と言える。
【００５２】実施例５ Ｅ．ｃｏｌｉにおけるリパーゼ発現 ｐＵＲ６５０２の約１．８ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を、や
はりＥｃｏＲＩで消化したｐＭＭＢ６７ＥＨ（Ｆｕｒｓ
ｔｅ，１９８６）中にクローニングすることにより、ｐ
ＵＲ６５１８と称されるプラスミドを得た。この断片は
異なる２つの向きで挿入することができたので、（ｔａ
ｃプロモーターに関して）正しい向きを選択する必要が
あった。このために，ＥｃｏＲＩ断片を含むプラスミド
をＢａｍＨＩで消化し、得られた断片をアガロースゲル
電気泳動によって同定した。これで、ＥｃｏＲＩ断片を
所望の向きで担う構築体を決定することができ、これを
ｐＵＲ６５１８と称した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を
プラスミドｐＵＲ６５１８、ｐＵＲ６５２２、ｐＵＲ６
５１８＋ｐＵＲ６５２０で形質転換し、また対照として
ｐＵＲ６５００でも形質転換し、形質転換体を（ＩＰＴ
Ｇを含むまたは含まない）ＢＹＰＯプレート上で増殖さ
せた。
はりＥｃｏＲＩで消化したｐＭＭＢ６７ＥＨ（Ｆｕｒｓ
ｔｅ，１９８６）中にクローニングすることにより、ｐ
ＵＲ６５１８と称されるプラスミドを得た。この断片は
異なる２つの向きで挿入することができたので、（ｔａ
ｃプロモーターに関して）正しい向きを選択する必要が
あった。このために，ＥｃｏＲＩ断片を含むプラスミド
をＢａｍＨＩで消化し、得られた断片をアガロースゲル
電気泳動によって同定した。これで、ＥｃｏＲＩ断片を
所望の向きで担う構築体を決定することができ、これを
ｐＵＲ６５１８と称した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を
プラスミドｐＵＲ６５１８、ｐＵＲ６５２２、ｐＵＲ６
５１８＋ｐＵＲ６５２０で形質転換し、また対照として
ｐＵＲ６５００でも形質転換し、形質転換体を（ＩＰＴ
Ｇを含むまたは含まない）ＢＹＰＯプレート上で増殖さ
せた。
【００５３】形質転換体のいずれにおいても清澄化ゾー
ンは見られず、これは、生物学的に活性なリパーゼが分
泌されなかったことを示す。プラスミドにおける構築エ
ラーまたは欠失を排除するために、プラスミドを単離
し、これに制限酵素分析を実施した。全てのプラスミド
は無傷と見られ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９中で安定性
を維持できた。得られた株を用いた更なる実験を以下に
説明する。
ンは見られず、これは、生物学的に活性なリパーゼが分
泌されなかったことを示す。プラスミドにおける構築エ
ラーまたは欠失を排除するために、プラスミドを単離
し、これに制限酵素分析を実施した。全てのプラスミド
は無傷と見られ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９中で安定性
を維持できた。得られた株を用いた更なる実験を以下に
説明する。
【００５４】Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐＵＲ６５１
８） 一晩培養したものを、ＯＤ６６０が約０．１５になるま
で希釈することにより、ＬＢ培地中でのＥ．ｃｏｌｉ
ＪＭ１０９（ｐＵＲ６５１８）の増殖実験を行った。
１．５時間増殖させた後、ＩＰＴＧを終濃度０．２ｍＭ
になるまで加えてｔａｃプロモーターを誘導し、次いで
更に２時間インキュベートした。誘導しなかった対照培
養体（ｐＵＲ６５１８またはｐＵＲ６５００を含む株；
結果は示さず）と比較し、ＩＰＴＧの添加は、細胞の増
殖に著しく影響した（図１０）。
８） 一晩培養したものを、ＯＤ６６０が約０．１５になるま
で希釈することにより、ＬＢ培地中でのＥ．ｃｏｌｉ
ＪＭ１０９（ｐＵＲ６５１８）の増殖実験を行った。
１．５時間増殖させた後、ＩＰＴＧを終濃度０．２ｍＭ
になるまで加えてｔａｃプロモーターを誘導し、次いで
更に２時間インキュベートした。誘導しなかった対照培
養体（ｐＵＲ６５１８またはｐＵＲ６５００を含む株；
結果は示さず）と比較し、ＩＰＴＧの添加は、細胞の増
殖に著しく影響した（図１０）。
【００５５】ｐＨスタット法によって分析すると、培地
中にリパーゼ活性は検出されなかった。この方法は、ｐ
Ｈ＝９．０及び３０℃で、ｐＨスタット（ＰＨＭ８４
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐＨ計、Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ（コ
ペンハーゲン）製のＡＢＵ８０自動ビュレット及びＴＴ
Ａ６０滴定装置並びにデータ処理のためのＡｐｐｌｅＩ
Ｉコンピュータ）における遊離脂肪酸の形成を追跡する
ことからなる。滴定液は０．０５Ｎ ＮａＯＨ（Ｍｅｒ
ｃｋ製のＴｉｔｒｉｓｏｌ）であった。プローブとして
ｌｉｐＡ遺伝子から誘導したＰｖｕＩＩ断片を使用し、
単離ｍＲＮＡをノザン分析すると、一方は約１４００個
のヌクレオチドで、他方は約２３００個のヌクレオチド
の２つの主バンドが示された（実施例２参照）。プロー
ブとしてＯＲＦ２のＮｒｕＩ断片（ヌクレオチド１８５
４〜２５２４、図２〜６参照）を使用したノザン分析
は、約２３００個のヌクレオチドに対応するバンドを示
した（図１５）。
中にリパーゼ活性は検出されなかった。この方法は、ｐ
Ｈ＝９．０及び３０℃で、ｐＨスタット（ＰＨＭ８４
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐＨ計、Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ（コ
ペンハーゲン）製のＡＢＵ８０自動ビュレット及びＴＴ
Ａ６０滴定装置並びにデータ処理のためのＡｐｐｌｅＩ
Ｉコンピュータ）における遊離脂肪酸の形成を追跡する
ことからなる。滴定液は０．０５Ｎ ＮａＯＨ（Ｍｅｒ
ｃｋ製のＴｉｔｒｉｓｏｌ）であった。プローブとして
ｌｉｐＡ遺伝子から誘導したＰｖｕＩＩ断片を使用し、
単離ｍＲＮＡをノザン分析すると、一方は約１４００個
のヌクレオチドで、他方は約２３００個のヌクレオチド
の２つの主バンドが示された（実施例２参照）。プロー
ブとしてＯＲＦ２のＮｒｕＩ断片（ヌクレオチド１８５
４〜２５２４、図２〜６参照）を使用したノザン分析
は、約２３００個のヌクレオチドに対応するバンドを示
した（図１５）。
【００５６】誘導細胞のウェスタン分析（図１６参照）
からは、細胞内リパーゼが存在したことが判った。図１
４では、強力な細胞溶解を示すＯＤ６６０の著しい減少
が見られた。幾らかのリパーゼが培地中に見られたが、
これは細胞溶解に起因するものであって、細胞内容物の
少なくとも一部分が培地中に放出されたのである。
からは、細胞内リパーゼが存在したことが判った。図１
４では、強力な細胞溶解を示すＯＤ６６０の著しい減少
が見られた。幾らかのリパーゼが培地中に見られたが、
これは細胞溶解に起因するものであって、細胞内容物の
少なくとも一部分が培地中に放出されたのである。
【００５７】更に、５０ｍｌ培養ブロス中に存在する
Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ （ｐＵＲ６５１８）の細胞
を遠心分離によってペレット化し、その細胞ペレットを
１ｍｌの塩溶液（０．９％ｗ／ｖ）中に懸濁させ、次い
でフレンチプレスで処理して細胞を破壊し、得られた物
質を４℃で一晩保存した。そうすると驚ろくべきこと
に、細胞を破壊した直後にはリパーゼ活性は認められな
かったのが、このときにはｐＨスタット法によって少量
のリパーゼ活性を測定することができた。これは、リパ
ーゼｍＲＮＡの対応するタンパク質への翻訳が行われた
が、ただし不活性の形態で産生されたことを立証するも
のである。所定の条件下で、この不活性形態を活性形態
に再生することができると考えられる。
Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ （ｐＵＲ６５１８）の細胞
を遠心分離によってペレット化し、その細胞ペレットを
１ｍｌの塩溶液（０．９％ｗ／ｖ）中に懸濁させ、次い
でフレンチプレスで処理して細胞を破壊し、得られた物
質を４℃で一晩保存した。そうすると驚ろくべきこと
に、細胞を破壊した直後にはリパーゼ活性は認められな
かったのが、このときにはｐＨスタット法によって少量
のリパーゼ活性を測定することができた。これは、リパ
ーゼｍＲＮＡの対応するタンパク質への翻訳が行われた
が、ただし不活性の形態で産生されたことを立証するも
のである。所定の条件下で、この不活性形態を活性形態
に再生することができると考えられる。
【００５８】Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐＵＲ６５２
２） ＯＲＦ２遺伝子がＥ．ｃｏｌｉ中で機能タンパク質とし
て発現されるか決定するために、プラスミドｐＵＲ６５
２２をＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９中に導入した。この形
質転換細胞に上記と同じ実験を実施し、以下の結果を得
た。
２） ＯＲＦ２遺伝子がＥ．ｃｏｌｉ中で機能タンパク質とし
て発現されるか決定するために、プラスミドｐＵＲ６５
２２をＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９中に導入した。この形
質転換細胞に上記と同じ実験を実施し、以下の結果を得
た。
【００５９】ｌｉｐＡから誘導したＰｖｕＩＩプローブ
を使用したノザン分析は、長さ約１４００個及び２６０
０個のヌクレオチドの２つのバンドを検出する結果とな
った。後者のバンドは、ｌｉｐＡ及び全ＯＲＦ２の両方
をコードするのに十分な長さであった。これは、約２６
００〜１８００ヌクレオチドの広いバンドを示した、Ｏ
ＲＦ２から誘導したＮｒｕＩプローブ（図１５）を使用
することにより確証された。
を使用したノザン分析は、長さ約１４００個及び２６０
０個のヌクレオチドの２つのバンドを検出する結果とな
った。後者のバンドは、ｌｉｐＡ及び全ＯＲＦ２の両方
をコードするのに十分な長さであった。これは、約２６
００〜１８００ヌクレオチドの広いバンドを示した、Ｏ
ＲＦ２から誘導したＮｒｕＩプローブ（図１５）を使用
することにより確証された。
【００６０】細胞抽出物のウェスタン分析は、かなりの
量のリパーゼが産生されたことを示した。培地のウェス
タン分析はリパーゼを全く示さなかった（図１６参
照）。この点において、Ｅ．ｃｏｌｉはＰ．ｇｌｕｍａ
ｅとは明らかに異なる。この予想外の結果は、ポリシス
トロニックｍＲＮＡの高度の不安定性及び／またはＥ．
ｃｏｌｉ中でのＯＲＦ２遺伝子メッセンジャーの不十分
な翻訳によって説明され得る。
量のリパーゼが産生されたことを示した。培地のウェス
タン分析はリパーゼを全く示さなかった（図１６参
照）。この点において、Ｅ．ｃｏｌｉはＰ．ｇｌｕｍａ
ｅとは明らかに異なる。この予想外の結果は、ポリシス
トロニックｍＲＮＡの高度の不安定性及び／またはＥ．
ｃｏｌｉ中でのＯＲＦ２遺伝子メッセンジャーの不十分
な翻訳によって説明され得る。
【００６１】Ｅ．ｃｏｌｉ中にＯＲＦ２遺伝子が存在し
ても検出可能な量のリパーゼを培地中に生じる結果とは
ならないが、ｌｉｐＡ遺伝子を含み、且つＯＲＦ２（ｐ
ＵＲ６５２２）を含むかまたはＯＲＦ２（ｐＵＲ６５１
８）を含まないプラスミドを担うＥ．ｃｏｌｉ細胞の増
殖及び溶解において、少なくともウェスタン分析または
ｐＨスタット法によっては検出されないが有意な差が認
められた。ＯＲＦ２遺伝子を含まない細胞は増殖が乏し
くて溶解が速く、これは、リパーゼは産生されたがそれ
がブロックされたか、またはＯＲＦ２遺伝子産物の不在
により細胞膜を破壊したことを示唆する。ＯＲＦ２遺伝
子産物を含む細胞は増殖に停滞を示したのみであり、図
１６に示したように培地中のリパーゼ産物の欠乏から明
らかなように溶解はなかった。
ても検出可能な量のリパーゼを培地中に生じる結果とは
ならないが、ｌｉｐＡ遺伝子を含み、且つＯＲＦ２（ｐ
ＵＲ６５２２）を含むかまたはＯＲＦ２（ｐＵＲ６５１
８）を含まないプラスミドを担うＥ．ｃｏｌｉ細胞の増
殖及び溶解において、少なくともウェスタン分析または
ｐＨスタット法によっては検出されないが有意な差が認
められた。ＯＲＦ２遺伝子を含まない細胞は増殖が乏し
くて溶解が速く、これは、リパーゼは産生されたがそれ
がブロックされたか、またはＯＲＦ２遺伝子産物の不在
により細胞膜を破壊したことを示唆する。ＯＲＦ２遺伝
子産物を含む細胞は増殖に停滞を示したのみであり、図
１６に示したように培地中のリパーゼ産物の欠乏から明
らかなように溶解はなかった。
【００６２】Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐＵＲ６５１
８＋ｐＵＲ６５２０） ポリシストロニックｍＲＮＡの高度の不安定性及び／ま
たはＥ．ｃｏｌｉ中のＯＲＦ２遺伝子メッセンジャーの
不十分な翻訳の（上記示唆された）可能性を試験するた
めに、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９をｐＵＲ６５２０及び
ｐＵＲ６５１８で一緒に形質転換し、これに上記と同じ
実験を実施した。両プラスミドを含む株は増殖に停滞を
示さなかったが、増殖速度は、ｐＵＲ６５００を含む対
照株より幾分小さかった。細胞溶解の徴候は見られなか
った。しかしながら、ＢＹＰＯプレート上でも培地中で
も活性リパーゼは検出されなかった。ＮｒｕＩプローブ
を使用してのノザン分析は、長さ約１２００個のヌクレ
オチドの明らかなバンドを示した（図１５）。
８＋ｐＵＲ６５２０） ポリシストロニックｍＲＮＡの高度の不安定性及び／ま
たはＥ．ｃｏｌｉ中のＯＲＦ２遺伝子メッセンジャーの
不十分な翻訳の（上記示唆された）可能性を試験するた
めに、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９をｐＵＲ６５２０及び
ｐＵＲ６５１８で一緒に形質転換し、これに上記と同じ
実験を実施した。両プラスミドを含む株は増殖に停滞を
示さなかったが、増殖速度は、ｐＵＲ６５００を含む対
照株より幾分小さかった。細胞溶解の徴候は見られなか
った。しかしながら、ＢＹＰＯプレート上でも培地中で
も活性リパーゼは検出されなかった。ＮｒｕＩプローブ
を使用してのノザン分析は、長さ約１２００個のヌクレ
オチドの明らかなバンドを示した（図１５）。
【００６３】培地中のリパーゼのウェスタン分析は陰性
であったが、細胞中ではリパーゼが検出された（図１
６）。ｐＵＲ６５１８、ｐＵＲ６５２２及びｐＵＲ６５
１８＋ｐＵＲ６５２０を用いた上記実験から、以下の結
論が得られる： （１）ノザン分析の結果から見て、Ｅ．ｃｏｌｉ中での
ポリシストロニックｌｉｐＡ／ＯＲＦ２メッセンジャー
の安定性は乏しい、（２）ＯＲＦ２の転写またはＯＲＦ
２ ｍＲＮＡの安定性のいずれかまたは両方はあまり優
れているとは言えない、（３）両メッセンジャーにおけ
るＯＲＦ２の翻訳は、ｍＲＮＡのＯＲＦ２部分に存在す
るＧ＋Ｃの含有量が高い約２００のヌクレオチドの領域
の故に、あまり効率的であるとは言えず、このような高
いＧ＋Ｃ含有量はＥ．ｃｏｌｉにおいては異例である。
であったが、細胞中ではリパーゼが検出された（図１
６）。ｐＵＲ６５１８、ｐＵＲ６５２２及びｐＵＲ６５
１８＋ｐＵＲ６５２０を用いた上記実験から、以下の結
論が得られる： （１）ノザン分析の結果から見て、Ｅ．ｃｏｌｉ中での
ポリシストロニックｌｉｐＡ／ＯＲＦ２メッセンジャー
の安定性は乏しい、（２）ＯＲＦ２の転写またはＯＲＦ
２ ｍＲＮＡの安定性のいずれかまたは両方はあまり優
れているとは言えない、（３）両メッセンジャーにおけ
るＯＲＦ２の翻訳は、ｍＲＮＡのＯＲＦ２部分に存在す
るＧ＋Ｃの含有量が高い約２００のヌクレオチドの領域
の故に、あまり効率的であるとは言えず、このような高
いＧ＋Ｃ含有量はＥ．ｃｏｌｉにおいては異例である。
【００６４】株Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐＵＲ６５
１８）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐＵＲ６５２０）
及びＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐＵＲ６５２２）は、
１９９０年９月１８日付けでｔｈｅ Ｃｅｎｔｒａａｌ
ｕｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒＳｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕ
ｒｅｓ，Ｂａａｒｎ，オランダに受託番号それぞれＣＢ
Ｓ４０６．９０、ＣＢＳ４０７．９０及びＣＢＳ４０
８．９０で寄託されている。
１８）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐＵＲ６５２０）
及びＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐＵＲ６５２２）は、
１９９０年９月１８日付けでｔｈｅ Ｃｅｎｔｒａａｌ
ｕｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒＳｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕ
ｒｅｓ，Ｂａａｒｎ，オランダに受託番号それぞれＣＢ
Ｓ４０６．９０、ＣＢＳ４０７．９０及びＣＢＳ４０
８．９０で寄託されている。
【００６５】実施例６ Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＷＣＳ３５８におけるリパーゼの発
現 株Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＷＣＳ３５８はリパーゼを産生し
ないし、ｌｉｐＡ遺伝子から誘導したＤＮＡプローブと
ハイブリダイズする遺伝子を有するので、これを選択し
た。プラスミドｐＵＲ６５００、ｐＵＲ６５２及びｐＵ
Ｒ６５２２をＰ・ｐｕｔｉｄａ中に二親交配によって導
入し、これによってｐＵＲ６５００を対照として使用し
た（実施例３〜５参照）。
現 株Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＷＣＳ３５８はリパーゼを産生し
ないし、ｌｉｐＡ遺伝子から誘導したＤＮＡプローブと
ハイブリダイズする遺伝子を有するので、これを選択し
た。プラスミドｐＵＲ６５００、ｐＵＲ６５２及びｐＵ
Ｒ６５２２をＰ・ｐｕｔｉｄａ中に二親交配によって導
入し、これによってｐＵＲ６５００を対照として使用し
た（実施例３〜５参照）。
【００６６】Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＷＣＳ３５８（ｐＵＲ
６５０２） ＩＰＴＧを含むＢＨＩ培地中でｐＵＲ６５０２を含むト
ランス接合体を増殖させた後に、上記実施例５に記載し
たｐＨスタット法を用いて活性を測定すると、リパーゼ
活性は検出されなかった。しかしながらＩＰＴＧを含む
ＢＹＰＯプレート上では、長期のインキュベーションの
後に小さな清澄化ゾーンが見られた。これは恐らく、飢
餓及びこれに続く細胞溶解の後にリパーゼが放出された
ためであろう。
６５０２） ＩＰＴＧを含むＢＨＩ培地中でｐＵＲ６５０２を含むト
ランス接合体を増殖させた後に、上記実施例５に記載し
たｐＨスタット法を用いて活性を測定すると、リパーゼ
活性は検出されなかった。しかしながらＩＰＴＧを含む
ＢＹＰＯプレート上では、長期のインキュベーションの
後に小さな清澄化ゾーンが見られた。これは恐らく、飢
餓及びこれに続く細胞溶解の後にリパーゼが放出された
ためであろう。
【００６７】かかるトランス接合体の細胞物質のウェス
タン分析は、Ｅ．ｃｏｌｉ（ｐＵＲ６５１８）と同じ結
果を与えた。即ち、リパーゼは産生されたが分泌されな
かった。これは、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＷＣＳ３５８に
は、ＯＲＦ２遺伝子産物に機能的に関連する遺伝子を発
現する能力が欠如していることを意味する。（通常は、
リパーゼ合成及び脂肪酸代謝に関係するタンパク質の産
生を導入し得る）ＩＰＴＧに加えて脂肪酸も存在する条
件下でさえもＰ．ｐｕｔｉｄａは、ｐＵＲ６５０２中に
存在するリパーゼ遺伝子の発現によって形成されるリパ
ーゼを分泌できない。明らかにこれは、Ｐ．ｐｕｔｉｄ
ａ ＰＧ１由来のＯＲＦ２遺伝子産物、またはＰ．ｐｕ
ｔｉｄａ ＷＣＳ３５８の機能的に等価の産物の不在に
起因している。これは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓにお
いてさえもＯＲＦ２遺伝子産物の機能が全く固有である
ことを意味している。
タン分析は、Ｅ．ｃｏｌｉ（ｐＵＲ６５１８）と同じ結
果を与えた。即ち、リパーゼは産生されたが分泌されな
かった。これは、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＷＣＳ３５８に
は、ＯＲＦ２遺伝子産物に機能的に関連する遺伝子を発
現する能力が欠如していることを意味する。（通常は、
リパーゼ合成及び脂肪酸代謝に関係するタンパク質の産
生を導入し得る）ＩＰＴＧに加えて脂肪酸も存在する条
件下でさえもＰ．ｐｕｔｉｄａは、ｐＵＲ６５０２中に
存在するリパーゼ遺伝子の発現によって形成されるリパ
ーゼを分泌できない。明らかにこれは、Ｐ．ｐｕｔｉｄ
ａ ＰＧ１由来のＯＲＦ２遺伝子産物、またはＰ．ｐｕ
ｔｉｄａ ＷＣＳ３５８の機能的に等価の産物の不在に
起因している。これは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓにお
いてさえもＯＲＦ２遺伝子産物の機能が全く固有である
ことを意味している。
【００６８】Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＷＣＳ３５８（ｐＵＲ
６５２２） ｐＵＲ６５２２を導入した後に得られたトランス接合体
の幾つかをＢＹＰＯ−Ｋｍ−ＩＰＴＧプレート上に移し
た。３０℃で約５日間インキュベートした後、１０個の
コロニーのうち４つにおいて清澄化ゾーンが見られた。
これら４つのリパーゼ陽性コロニーをｂｒａｉｎ−ｈｅ
ａｒｔ−ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ）培地（ＤＩＦＣＯ
製）上で培養し、ＩＰＴＧを加える（終濃度０．２ｍ
Ｍ）ことにより誘導した。上記４つの誘導株のうちの１
つを更に調査し、ｐＨスタット法から、活性形態のリパ
ーゼを分泌したことが判った。
６５２２） ｐＵＲ６５２２を導入した後に得られたトランス接合体
の幾つかをＢＹＰＯ−Ｋｍ−ＩＰＴＧプレート上に移し
た。３０℃で約５日間インキュベートした後、１０個の
コロニーのうち４つにおいて清澄化ゾーンが見られた。
これら４つのリパーゼ陽性コロニーをｂｒａｉｎ−ｈｅ
ａｒｔ−ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ）培地（ＤＩＦＣＯ
製）上で培養し、ＩＰＴＧを加える（終濃度０．２ｍ
Ｍ）ことにより誘導した。上記４つの誘導株のうちの１
つを更に調査し、ｐＨスタット法から、活性形態のリパ
ーゼを分泌したことが判った。
【００６９】この株のウェスタン分析は、細胞抽出物及
び培地の両方においてリパーゼの存在を確証した。従っ
てＰ．ｐｕｔｉｄａ ＷＣＳ３５８は、Ｅ．ｃｏｌｉと
は対照的に、ポリシストロニックメッセンジャーからＯ
ＲＦ２遺伝子を翻訳し、活性リパーゼを分泌することが
できる。しかしながら、１０株中たった４株のみしか細
胞外活性リパーゼを産生できなかったので、更なる改善
の見込みがある（実施例８参照）。
び培地の両方においてリパーゼの存在を確証した。従っ
てＰ．ｐｕｔｉｄａ ＷＣＳ３５８は、Ｅ．ｃｏｌｉと
は対照的に、ポリシストロニックメッセンジャーからＯ
ＲＦ２遺伝子を翻訳し、活性リパーゼを分泌することが
できる。しかしながら、１０株中たった４株のみしか細
胞外活性リパーゼを産生できなかったので、更なる改善
の見込みがある（実施例８参照）。
【００７０】実施例７ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓにおけるリパーゼ
の発現 グラム陰性菌は酵素の大規模生産に最も適した細菌では
ないので、ＯＲＦ２が、グラム陽性菌、即ちＢａｃｉｌ
ｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓにおけるｌｉｐＡ遺伝子産物
の産生に良い影響を及ぼすか試験することにした。全リ
パーゼ遺伝子に加えてＯＲＦ２遺伝子を含むプラスミド
ｐＵＲ６７８５を構築した。これは以下のように行なっ
た： （１）（同時係属特許出願ＥＰ−Ａ−４０７ ２２５号
に記載のｌｉｐＡ及びＯＲＦ２の一部分を含む）ｐＵＲ
６００２の約２．１ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片
を、複製開始点を含む前述のｐＵＲ６０１２ＡのＥｃｏ
ＲＩ−ＢａｍＨＩ単離断片に連結することにより、プラ
スミドｐＵＲ６０１６を得、（２）（同時係属特許出願
ＥＰ−Ａ−４０７ ２２５号に記載の合成リパーゼ遺伝
子の５’部分を含む）ｐＵＲ６０３８の約０．５ｋｂの
ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片を、ｐＵＲ６０１６の複製開
始点を含むＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ単離断片に連結するこ
とにより、プラスミドｐＵＲ６７８１を得、（３）（部
分合成／部分野生型ｌｉｐＡ遺伝子及び野生型ＯＲＦ２
全遺伝子を含む）ｐＵＲ６７８１の約２．５ｋｂのＥｃ
ｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、ｐＭＳ５１の複製開始
点を含むＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ単離断片中に連結
することにより、ｐＵＲ６７８３を得た。プラスミドｐ
ＭＳ５１は、ｐＵＣ９（Ｊ．Ｎｏｒｒａｎｄｅｒら，１
９８３）のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩマルチクローニ
ング部位を、配列： を有し、ＥｃｏＲＩ部位、ＢｓｔＥＩＩ部位（ＧＧＴＮ
ＡＣＣ）、ＲＢＳ（ＧＧＡＧＧ）、ＥｃｏＲＩ（ＧＡＡ
ＴＴＣ）及び残りのＨｉｎｄＩＩＩ部位のものと相容性
の付着端を含む合成ＤＮＡ断片で置き換えることにより
得た。
の発現 グラム陰性菌は酵素の大規模生産に最も適した細菌では
ないので、ＯＲＦ２が、グラム陽性菌、即ちＢａｃｉｌ
ｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓにおけるｌｉｐＡ遺伝子産物
の産生に良い影響を及ぼすか試験することにした。全リ
パーゼ遺伝子に加えてＯＲＦ２遺伝子を含むプラスミド
ｐＵＲ６７８５を構築した。これは以下のように行なっ
た： （１）（同時係属特許出願ＥＰ−Ａ−４０７ ２２５号
に記載のｌｉｐＡ及びＯＲＦ２の一部分を含む）ｐＵＲ
６００２の約２．１ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片
を、複製開始点を含む前述のｐＵＲ６０１２ＡのＥｃｏ
ＲＩ−ＢａｍＨＩ単離断片に連結することにより、プラ
スミドｐＵＲ６０１６を得、（２）（同時係属特許出願
ＥＰ−Ａ−４０７ ２２５号に記載の合成リパーゼ遺伝
子の５’部分を含む）ｐＵＲ６０３８の約０．５ｋｂの
ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片を、ｐＵＲ６０１６の複製開
始点を含むＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ単離断片に連結するこ
とにより、プラスミドｐＵＲ６７８１を得、（３）（部
分合成／部分野生型ｌｉｐＡ遺伝子及び野生型ＯＲＦ２
全遺伝子を含む）ｐＵＲ６７８１の約２．５ｋｂのＥｃ
ｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、ｐＭＳ５１の複製開始
点を含むＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ単離断片中に連結
することにより、ｐＵＲ６７８３を得た。プラスミドｐ
ＭＳ５１は、ｐＵＣ９（Ｊ．Ｎｏｒｒａｎｄｅｒら，１
９８３）のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩマルチクローニ
ング部位を、配列： を有し、ＥｃｏＲＩ部位、ＢｓｔＥＩＩ部位（ＧＧＴＮ
ＡＣＣ）、ＲＢＳ（ＧＧＡＧＧ）、ＥｃｏＲＩ（ＧＡＡ
ＴＴＣ）及び残りのＨｉｎｄＩＩＩ部位のものと相容性
の付着端を含む合成ＤＮＡ断片で置き換えることにより
得た。
【００７１】（４）ｐＵＲ６７８３由来の（合成ＲＢＳ
の後ろに前記ｌｉｐＡ遺伝子及び前記ＯＲＦ２遺伝子を
含む）約２．５ｋｂのＢｓｔＥＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断
片を、プラスミドベクターｐＭＳ４８（欧州特許出願Ｅ
Ｐ−Ａ−１５７ ４４１号参照）の複製開始点を含むＢ
ｓｔＥＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片に連結し、プラスミド
ｐＵＲ６７８５を得た。
の後ろに前記ｌｉｐＡ遺伝子及び前記ＯＲＦ２遺伝子を
含む）約２．５ｋｂのＢｓｔＥＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断
片を、プラスミドベクターｐＭＳ４８（欧州特許出願Ｅ
Ｐ−Ａ−１５７ ４４１号参照）の複製開始点を含むＢ
ｓｔＥＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片に連結し、プラスミド
ｐＵＲ６７８５を得た。
【００７２】安定プラスミドｐＵＲ６７７３（同時係属
特許出願ＥＰ−Ａ−４０７ ２２５号に記載のもの）ま
たはｐＵＲ６７８５のいずれかを含む形質転換Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＤＢ１０５（ｓｐｏ−）
をＢＹＰＯプレート上で増殖させた。Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＤＢ１０５（ｐＵＲ６７７３）株
は、１９９０年１０月１７日付けでｔｈｅ Ｃｅｎｔｒ
ａａｌｕｂｕｒｅａｕｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕ
ｌｔｕｒｅｓ，Ｂａａｒｎ，オランダに寄託されてい
る。約５日後、ｐＵＲ６７７３を含むコロニーは清澄化
ゾーンを与えなかったが、ｐＵＲ６７８５を含むコロニ
ーは顕著な清澄化ゾーンを示したことが判った（図１７
参照）。
特許出願ＥＰ−Ａ−４０７ ２２５号に記載のもの）ま
たはｐＵＲ６７８５のいずれかを含む形質転換Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＤＢ１０５（ｓｐｏ−）
をＢＹＰＯプレート上で増殖させた。Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＤＢ１０５（ｐＵＲ６７７３）株
は、１９９０年１０月１７日付けでｔｈｅ Ｃｅｎｔｒ
ａａｌｕｂｕｒｅａｕｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕ
ｌｔｕｒｅｓ，Ｂａａｒｎ，オランダに寄託されてい
る。約５日後、ｐＵＲ６７７３を含むコロニーは清澄化
ゾーンを与えなかったが、ｐＵＲ６７８５を含むコロニ
ーは顕著な清澄化ゾーンを示したことが判った（図１７
参照）。
【００７３】カナマイシン２５ｍｇ／ｌを補充したＬＢ
培地中で一晩、株を増殖させた後に得られた細胞物質の
ウェスタン分析は、ｐＵＲ６７７３またはｐＵＲ６７８
５のいずれかを含むＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ細胞がリパーゼを含むことを示した。Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ｐＵＲ６７８５）の上清を調査
すると、ウェスタン分析によってリパーゼの存在が検出
された。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ｐＵＲ
６７７３）は、ＬＢ培養液中で増殖させると極めて迅速
に溶解することから、産生株として容認し得ないと立証
された。
培地中で一晩、株を増殖させた後に得られた細胞物質の
ウェスタン分析は、ｐＵＲ６７７３またはｐＵＲ６７８
５のいずれかを含むＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ細胞がリパーゼを含むことを示した。Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ｐＵＲ６７８５）の上清を調査
すると、ウェスタン分析によってリパーゼの存在が検出
された。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ｐＵＲ
６７７３）は、ＬＢ培養液中で増殖させると極めて迅速
に溶解することから、産生株として容認し得ないと立証
された。
【００７４】Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ｐ
ＵＲ６７８５）株を実験室用発酵器内で、Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓによるグアーα−ガラクトシダ
ーゼの産生及び排出（Ｏｖｅｒｂｅｅｋｅら，１９９
０）に使用するのと同一の条件下に培養し、約４８時間
後に試料を採取した。この試料を１０−１０倍まで希釈
し、希釈物を、カナマイシン２５ｍｇ／ｌを含むＢＹＰ
Ｏプレートに移した。驚くベきことには、３７℃で約１
週間インキュベートした後、１０％未満のコロニーしか
清澄化ゾーンを示さなかった。この観察の後、優れた産
生株及び非産生株の両方からプラスミドを単離し、これ
に制限酵素分析を実施した。この結果から、非産生株に
おけるプラスミドは、ＯＲＦ２のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ
断片に元来は位置する約０．４ｋｂのＤＮＡ断片を失っ
ていたことが判った（図１８参照）。この断片は、Ｇ＋
Ｃ含有量が極めて高い前述の約２００ｂｐと重複した。
従って、このＧ＋Ｃに富むＤＮＡ断片を、実施例８に記
載するように、少なくともＢａｃｉｌｌｉにおいてより
安定な合成断片と置き換えることが推奨される。
ＵＲ６７８５）株を実験室用発酵器内で、Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓによるグアーα−ガラクトシダ
ーゼの産生及び排出（Ｏｖｅｒｂｅｅｋｅら，１９９
０）に使用するのと同一の条件下に培養し、約４８時間
後に試料を採取した。この試料を１０−１０倍まで希釈
し、希釈物を、カナマイシン２５ｍｇ／ｌを含むＢＹＰ
Ｏプレートに移した。驚くベきことには、３７℃で約１
週間インキュベートした後、１０％未満のコロニーしか
清澄化ゾーンを示さなかった。この観察の後、優れた産
生株及び非産生株の両方からプラスミドを単離し、これ
に制限酵素分析を実施した。この結果から、非産生株に
おけるプラスミドは、ＯＲＦ２のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ
断片に元来は位置する約０．４ｋｂのＤＮＡ断片を失っ
ていたことが判った（図１８参照）。この断片は、Ｇ＋
Ｃ含有量が極めて高い前述の約２００ｂｐと重複した。
従って、このＧ＋Ｃに富むＤＮＡ断片を、実施例８に記
載するように、少なくともＢａｃｉｌｌｉにおいてより
安定な合成断片と置き換えることが推奨される。
【００７５】実施例８ ＯＲＦ２遺伝子の５’末端におけるＧＣ富領域の置き換
え Ｅ．ｃｏｌｉ及びＰ．ｐｕｔｉｄａにおいてＯＲＦ２と
組み合わせたリパーゼ遺伝子の発現が困難であることを
示した実施例５〜６で得られた結果は、ＯＲＦ２のＧ＋
Ｃに富む部分がかかる問題点の原因であることを強く示
唆している。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓに対
しては前記実施例においてこのことが立証されている。
かかる問題点を解消する解決策は、ＯＲＦ２のＧ＋Ｃに
富むＤＮＡ断片の少なくとも一部分を、実質的に同じア
ミノ酸をコードするがＧ＋Ｃ含有量がより少ない断片で
置き換えることであろう。従って、（１）問題の宿主の
好ましいコドンの使用とより一致しており及び／または
（２）ステム−ループ構造の形成の可能性を低下させる
コドンを使用することとした。好ましい変更は、ＯＲＦ
２を、問題の宿主の好ましいコドン使用に完全に適合さ
せることであろう。ＯＲＦ２遺伝子のこのような断片を
合成するのに使用される方法は、合成ｌｉｐＡ遺伝子の
ための同時係属特許出願ＥＰ−Ａ−４０７ ２２５号に
記載のものと実質的に同じである。このような合成配列
の例を図１９，２０に与える。
え Ｅ．ｃｏｌｉ及びＰ．ｐｕｔｉｄａにおいてＯＲＦ２と
組み合わせたリパーゼ遺伝子の発現が困難であることを
示した実施例５〜６で得られた結果は、ＯＲＦ２のＧ＋
Ｃに富む部分がかかる問題点の原因であることを強く示
唆している。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓに対
しては前記実施例においてこのことが立証されている。
かかる問題点を解消する解決策は、ＯＲＦ２のＧ＋Ｃに
富むＤＮＡ断片の少なくとも一部分を、実質的に同じア
ミノ酸をコードするがＧ＋Ｃ含有量がより少ない断片で
置き換えることであろう。従って、（１）問題の宿主の
好ましいコドンの使用とより一致しており及び／または
（２）ステム−ループ構造の形成の可能性を低下させる
コドンを使用することとした。好ましい変更は、ＯＲＦ
２を、問題の宿主の好ましいコドン使用に完全に適合さ
せることであろう。ＯＲＦ２遺伝子のこのような断片を
合成するのに使用される方法は、合成ｌｉｐＡ遺伝子の
ための同時係属特許出願ＥＰ−Ａ−４０７ ２２５号に
記載のものと実質的に同じである。このような合成配列
の例を図１９，２０に与える。
【００７６】Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ及び
Ｅ．ｃｏｌｉにおける（部分）合成ＯＲＦ２遺伝子の構
築と同様に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈ
ａ及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのような他
の宿主細胞においてもこれを構築することができる。勿
論、種々の宿主細胞に対して、優先される所定のコドン
は変えることができ、結果的に、多数の合成断片を製造
することができる。
Ｅ．ｃｏｌｉにおける（部分）合成ＯＲＦ２遺伝子の構
築と同様に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈ
ａ及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのような他
の宿主細胞においてもこれを構築することができる。勿
論、種々の宿主細胞に対して、優先される所定のコドン
は変えることができ、結果的に、多数の合成断片を製造
することができる。
【００７７】実施例９ ＧＣ含有量がより低い部分合成ｌｉｐＢ遺伝子の構築 同時係属特許出願ＥＰ−Ａ−４０７ ２２５号の実施例
３に記載のカセット系を使用し、合成オリゴヌクレオチ
ドから出発して図１９及び図２０に表したＤＮＡ配列を
組み立てた。図１９に示した配列をプラスミドｐＵＲ６
６００中にクローニングしてプラスミドｐＥＴ２５を得
た。ｐＵＲ６６００は合成リパーゼ遺伝子を含むｐＥＭ
ＢＬ９の誘導体であり、前記特許出願の実施例３に記載
のものである。プラスミドｐＵＲ６０１２ＡをＰｖｕＩ
及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、配列： を有する合成オリゴヌクレオチドの存在下に再度連結
し、プラスミドｐＥＴ３３を得た。
３に記載のカセット系を使用し、合成オリゴヌクレオチ
ドから出発して図１９及び図２０に表したＤＮＡ配列を
組み立てた。図１９に示した配列をプラスミドｐＵＲ６
６００中にクローニングしてプラスミドｐＥＴ２５を得
た。ｐＵＲ６６００は合成リパーゼ遺伝子を含むｐＥＭ
ＢＬ９の誘導体であり、前記特許出願の実施例３に記載
のものである。プラスミドｐＵＲ６０１２ＡをＰｖｕＩ
及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、配列： を有する合成オリゴヌクレオチドの存在下に再度連結
し、プラスミドｐＥＴ３３を得た。
【００７８】Ａ．発現プラスミドｐＵＲ６５２３及びｐ
ＵＲ６５２４の構築 ｐＥＴ２５の約４３０ｂｐのＰｖｕＩ／ＢａｍＨＩ断片
とＥｃｏＲＩ／ＰｖｕＩリンカー： とを一緒に、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化したｐＥ
Ｔ３３ベクター中に連結し、ｐＥＴ３５を得た。部分合
成ｌｉｐＢ遺伝子を含むこのプラスミドから、ＥｃｏＲ
Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（約１０８０ｂｐ）をプラスミ
ドｐＭＭＢ６７ＥＨ（アンピシリン耐性）及びｐＵＲ６
５００（カナマイシン耐性）中にクローニングし、それ
ぞれｐＵＲ６５２３及び６５２４を得た。これらのプラ
スミドにおける部分合成ｌｉｐＢ遺伝子の発現は、誘導
可能なｔａｃプロモーターの制御下にある。
ＵＲ６５２４の構築 ｐＥＴ２５の約４３０ｂｐのＰｖｕＩ／ＢａｍＨＩ断片
とＥｃｏＲＩ／ＰｖｕＩリンカー： とを一緒に、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化したｐＥ
Ｔ３３ベクター中に連結し、ｐＥＴ３５を得た。部分合
成ｌｉｐＢ遺伝子を含むこのプラスミドから、ＥｃｏＲ
Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（約１０８０ｂｐ）をプラスミ
ドｐＭＭＢ６７ＥＨ（アンピシリン耐性）及びｐＵＲ６
５００（カナマイシン耐性）中にクローニングし、それ
ぞれｐＵＲ６５２３及び６５２４を得た。これらのプラ
スミドにおける部分合成ｌｉｐＢ遺伝子の発現は、誘導
可能なｔａｃプロモーターの制御下にある。
【００７９】Ｂ．発現プラスミドｐＵＲ６５２５の構築 ｐＥＴ３３の約４４０ｂｐのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ断片を、同じ酵素で消化したｐＥＴ２５ベクター中に
連結した。得られたプラスミドをｐＥＴ３７と命名し
た。このプラスミドは、約２１６０ｂｐのＥｃｏＲＩ／
ＨｉｎｄＩＩＩ断片上に合成リパーゼ遺伝子とこれに続
く部分合成ｌｉｐＢ遺伝子とを含んでいた。このＥｃｏ
ＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片を発現ベクターｐＵＲ６５０
０中に連結し、誘導可能なｔａｃプロモーターの後ろに
両遺伝子があるプラスミドｐＵＲ６５２５を得た。
Ｉ断片を、同じ酵素で消化したｐＥＴ２５ベクター中に
連結した。得られたプラスミドをｐＥＴ３７と命名し
た。このプラスミドは、約２１６０ｂｐのＥｃｏＲＩ／
ＨｉｎｄＩＩＩ断片上に合成リパーゼ遺伝子とこれに続
く部分合成ｌｉｐＢ遺伝子とを含んでいた。このＥｃｏ
ＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片を発現ベクターｐＵＲ６５０
０中に連結し、誘導可能なｔａｃプロモーターの後ろに
両遺伝子があるプラスミドｐＵＲ６５２５を得た。
【００８０】実施例１０ Ｐ．ｇｌｕｍａｅ ＰＧ４の相補性 ＰＧ４株にｐＵＲ６５２４またはｐＵＲ６５２５を導入
し、細胞を０．５ｍＭのＩＰＴＧを補ったＢＹＰＯプレ
ート上で増殖させたところ、リパーゼ産生表現型が得ら
れた。この結果は実施例３に一致し、部分合成ｌｉｐＢ
遺伝子が機能することを証明する。
し、細胞を０．５ｍＭのＩＰＴＧを補ったＢＹＰＯプレ
ート上で増殖させたところ、リパーゼ産生表現型が得ら
れた。この結果は実施例３に一致し、部分合成ｌｉｐＢ
遺伝子が機能することを証明する。
【００８１】更に、Ｐ． ｇｌｕｍａｅ ＰＧ４（ｐＵ
Ｒ６５２２）及びＰＧ４（ｐＵＲ６５２５）のリパーゼ
産生レベルの比較から、後者の方が多くのリパーゼを産
生することが判明した。このことは、野生型のリパーゼ
遺伝子、及びｌｉｐＢ遺伝子の一部をＧ＋Ｃ含有率のよ
り低い合成フラグメントによって置き換えることがリパ
ーゼ産生レベルに正の影響を及ぼすことを示唆してい
る。このようにして、実施例４に述べた以上の産生促進
も可能となる。
Ｒ６５２２）及びＰＧ４（ｐＵＲ６５２５）のリパーゼ
産生レベルの比較から、後者の方が多くのリパーゼを産
生することが判明した。このことは、野生型のリパーゼ
遺伝子、及びｌｉｐＢ遺伝子の一部をＧ＋Ｃ含有率のよ
り低い合成フラグメントによって置き換えることがリパ
ーゼ産生レベルに正の影響を及ぼすことを示唆してい
る。このようにして、実施例４に述べた以上の産生促進
も可能となる。
【００８２】実施例１１ Ｅ． ｃｏｌｉでのリパーゼ発現 Ｅ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９にｐＵＲ６５２５を導入
し、この細胞株を０．２ｍＭのＩＰＴＧ及び２５μｇ／
ｍｌのカナマイシンを補ったＢＹＰＯ培地上で増殖させ
たところ、３７℃で一晩インキュベーション後に清澄化
ゾーンが視覚的に確認できた。０．２ｍＭのＩＰＴＧ、
１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２５μｇ／ｍｌの
カナマイシンを補ったＢＹＰＯ培地上で増殖させた、ｐ
ＵＲ６５０３＋ｐＵＲ６５２３を含むＥ． ｃｏｌｉ
ＪＭ１０９に関しても同様の結果が得られた。
し、この細胞株を０．２ｍＭのＩＰＴＧ及び２５μｇ／
ｍｌのカナマイシンを補ったＢＹＰＯ培地上で増殖させ
たところ、３７℃で一晩インキュベーション後に清澄化
ゾーンが視覚的に確認できた。０．２ｍＭのＩＰＴＧ、
１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２５μｇ／ｍｌの
カナマイシンを補ったＢＹＰＯ培地上で増殖させた、ｐ
ＵＲ６５０３＋ｐＵＲ６５２３を含むＥ． ｃｏｌｉ
ＪＭ１０９に関しても同様の結果が得られた。
【００８３】上記タンパク質またはその機能性突然変異
体をコードする他の合成遺伝子もリパーゼ産生の促進に
用い得ると理解される。
体をコードする他の合成遺伝子もリパーゼ産生の促進に
用い得ると理解される。
【００８４】実施例１２ プレリパーゼのリーダー配列のＣ末端に位置するアミノ
酸の役割決定 先に述べた、本出願の同時係属出願であるヨーロッパ特
許出願第ＥＰ−Ａ−４０７ ２２５号には、成熟リパー
ゼをコードする遺伝子フラグメントよりスブチリシンプ
レプロ配列またはα−アミラーゼプレ配列をコードする
遺伝子フラグメントの方が上流に位置する発現プラスミ
ドはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓでもその他の
Ｂａｃｉｌｌｕｓ株でも安定に維持され得ないことを開
示した。しかし、スブチリシンＢＰＮ′プレ配列の下流
に位置する３９個のコドンから成る長いプレ配列の少な
くとも最後の（即ちＣ末端に位置する）７個のコドンの
下流に位置する成熟リパーゼ遺伝子を用いれば、Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓにおいて安定に維持され
る発現プラスミドを生成することが可能であった。その
うえ、細胞外でのリパーゼ活性を検出することができ
た。
酸の役割決定 先に述べた、本出願の同時係属出願であるヨーロッパ特
許出願第ＥＰ−Ａ−４０７ ２２５号には、成熟リパー
ゼをコードする遺伝子フラグメントよりスブチリシンプ
レプロ配列またはα−アミラーゼプレ配列をコードする
遺伝子フラグメントの方が上流に位置する発現プラスミ
ドはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓでもその他の
Ｂａｃｉｌｌｕｓ株でも安定に維持され得ないことを開
示した。しかし、スブチリシンＢＰＮ′プレ配列の下流
に位置する３９個のコドンから成る長いプレ配列の少な
くとも最後の（即ちＣ末端に位置する）７個のコドンの
下流に位置する成熟リパーゼ遺伝子を用いれば、Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓにおいて安定に維持され
る発現プラスミドを生成することが可能であった。その
うえ、細胞外でのリパーゼ活性を検出することができ
た。
【００８５】本発明によればこの実施例は、Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓでのリパーゼ産生を、ＯＲＦ
２遺伝子と、同種シグナル配列及び該配列に続くリパー
ゼ遺伝子の少なくとも成熟リパーゼをコードする部分を
含むＤＮＡフラグメントとの両方を含むプラスミドを上
記宿主に導入することによって促進することに係わる。
この宿主を形質転換する一方法として、同時係属出願第
ＥＰ−Ａ−４０７ ２２５号の第６４ページで言及した
プラスミドｐＵＲ６７６６、ｐＵＲ６７６７、ｐＵＲ６
７６８またはｐＵＲ６７７３を、この宿主において安定
に維持され得るＯＲＦ２の発現プラスミドである第二の
発現プラスミドと共に導入することを挙げることができ
る。この方法は、先の実施例３及び５に述ベた実験に類
似する。あるいは他の場合には、ｌｉｐＡ遺伝子産物と
ＯＲＦ２遺伝子産物との両方をコードするポリシストロ
ニックｍＲＮＡを介して二遺伝子オペロン由来のｌｉｐ
Ａ及びＯＲＦ２を発現し得るＢａｃｉｌｌｕｓ宿主の発
現プラスミドを導入することによってＢａｃｉｌｌｕｓ
宿主の形質転換を行ない得る。例えば、プラスミドｐＵ
Ｒ６７６６、ｐＵＲ６７６７及びｐＵＲ６７６８中に存
在する合成リパーゼ遺伝子は、（１）同種Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ遺伝子のリーダー配列、（２）
場合によってはリパーゼリーダー配列のＣ末端の一部、
（３）リパーゼをコードするＤＮＡフラグメント、
（４）終止コドン、（５）ＯＲＦ２、（６）終止コド
ン、及び好ましくは（７）転写ターミネーターをこの順
序で含むＤＮＡフラグメントによって置き換えることが
できる。当然ながら、起こり得るリパーゼの増量または
リパーゼ発現の増進を調べるのに、成熟リパーゼをコー
ドする野生型遺伝子フラグメントに替えてその修飾体を
用いることも可能である。このことは、ＯＲＦ２及びリ
ーダー配列、またはその一部の修飾体にも該当する。
ｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓでのリパーゼ産生を、ＯＲＦ
２遺伝子と、同種シグナル配列及び該配列に続くリパー
ゼ遺伝子の少なくとも成熟リパーゼをコードする部分を
含むＤＮＡフラグメントとの両方を含むプラスミドを上
記宿主に導入することによって促進することに係わる。
この宿主を形質転換する一方法として、同時係属出願第
ＥＰ−Ａ−４０７ ２２５号の第６４ページで言及した
プラスミドｐＵＲ６７６６、ｐＵＲ６７６７、ｐＵＲ６
７６８またはｐＵＲ６７７３を、この宿主において安定
に維持され得るＯＲＦ２の発現プラスミドである第二の
発現プラスミドと共に導入することを挙げることができ
る。この方法は、先の実施例３及び５に述ベた実験に類
似する。あるいは他の場合には、ｌｉｐＡ遺伝子産物と
ＯＲＦ２遺伝子産物との両方をコードするポリシストロ
ニックｍＲＮＡを介して二遺伝子オペロン由来のｌｉｐ
Ａ及びＯＲＦ２を発現し得るＢａｃｉｌｌｕｓ宿主の発
現プラスミドを導入することによってＢａｃｉｌｌｕｓ
宿主の形質転換を行ない得る。例えば、プラスミドｐＵ
Ｒ６７６６、ｐＵＲ６７６７及びｐＵＲ６７６８中に存
在する合成リパーゼ遺伝子は、（１）同種Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ遺伝子のリーダー配列、（２）
場合によってはリパーゼリーダー配列のＣ末端の一部、
（３）リパーゼをコードするＤＮＡフラグメント、
（４）終止コドン、（５）ＯＲＦ２、（６）終止コド
ン、及び好ましくは（７）転写ターミネーターをこの順
序で含むＤＮＡフラグメントによって置き換えることが
できる。当然ながら、起こり得るリパーゼの増量または
リパーゼ発現の増進を調べるのに、成熟リパーゼをコー
ドする野生型遺伝子フラグメントに替えてその修飾体を
用いることも可能である。このことは、ＯＲＦ２及びリ
ーダー配列、またはその一部の修飾体にも該当する。
【００８６】参考文献 Ｂａｔｅｓ， Ｐ．Ｆ． ａｎｄ Ｓｗｉｆｔ， Ｒ．
Ａ．， Ｇｅｎｅ， ２６， １３７−１４６ （１９
８３） Ｂｉｅｋｅｒ， Ｋ．Ｌ． ａｎｄ Ｓｉｌｈａｖｙ，
Ｔ．Ｊ．， Ｃｅｌｌ， ６１， ８３３−８４２
（１９９０） Ｅ． ｃｏｌｉでのタンパク質転位の際、ＰｒｌＡ（Ｓ
ｅｃＹ）とＰｒｌＧ（ＳｅｃＥ）とは直接作用し合い、
連続的に機能する。
Ａ．， Ｇｅｎｅ， ２６， １３７−１４６ （１９
８３） Ｂｉｅｋｅｒ， Ｋ．Ｌ． ａｎｄ Ｓｉｌｈａｖｙ，
Ｔ．Ｊ．， Ｃｅｌｌ， ６１， ８３３−８４２
（１９９０） Ｅ． ｃｏｌｉでのタンパク質転位の際、ＰｒｌＡ（Ｓ
ｅｃＹ）とＰｒｌＧ（ＳｅｃＥ）とは直接作用し合い、
連続的に機能する。
【００８７】Ｂｒａｗｅｒｍａｎ， Ｇ．， ＴＩＢＴ
ＥＣＨ， ８， １７１−１７３ （１９８９） ｍＲＮＡ崩壊の機構。
ＥＣＨ， ８， １７１−１７３ （１９８９） ｍＲＮＡ崩壊の機構。
【００８８】Ｂｒｕｎｅｌ， Ｆ． ａｎｄ Ｄａｖｉ
ｓｏｎ， Ｊ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １
７０， ４９２４−４９３０ （１９８８） バニレートデメチラーゼをコードするＰｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ遺伝子のクローニング及び配列決定。
ｓｏｎ， Ｊ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １
７０， ４９２４−４９３０ （１９８８） バニレートデメチラーゼをコードするＰｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ遺伝子のクローニング及び配列決定。
【００８９】Ｃｈｅｎ， Ｃ．−Ｙ．Ａ．， Ｂｅａｔ
ｔｙ， Ｊ．Ｔ．， Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ． ａｎｄ
Ｂｅｌａｓｃｏ， Ｊ．Ｇ．， Ｃｅｌｌ， ５２，
６０９−６１９ （１９８８） インターシストロニックなステム−ループ構造はパフｍ
ＲＮＡの安定化に必要な、しかし不十分なｍＲＮＡ崩壊
ターミネーターとして機能する。
ｔｙ， Ｊ．Ｔ．， Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ． ａｎｄ
Ｂｅｌａｓｃｏ， Ｊ．Ｇ．， Ｃｅｌｌ， ５２，
６０９−６１９ （１９８８） インターシストロニックなステム−ループ構造はパフｍ
ＲＮＡの安定化に必要な、しかし不十分なｍＲＮＡ崩壊
ターミネーターとして機能する。
【００９０】Ｃｒｏｏｋｅ， Ｅ．， Ｇｕｔｈｒｉ
ｅ， Ｂ．， Ｌｅｃｋｅｒ， Ｓ．，Ｌｉｌｌ，
Ｒ． ａｎｄ Ｗｉｃｋｎｅｒ， Ｗ．， Ｃｅｌｌ，
５４，１００３−１０１１ （１９８８） プロＯｍｐＡは精製したＥ． ｃｏｌｉトリガー因子で
か、またはイヌシグナル認識粒子で膜転位に関し安定化
する。
ｅ， Ｂ．， Ｌｅｃｋｅｒ， Ｓ．，Ｌｉｌｌ，
Ｒ． ａｎｄ Ｗｉｃｋｎｅｒ， Ｗ．， Ｃｅｌｌ，
５４，１００３−１０１１ （１９８８） プロＯｍｐＡは精製したＥ． ｃｏｌｉトリガー因子で
か、またはイヌシグナル認識粒子で膜転位に関し安定化
する。
【００９１】Ｄｅｎｔｅ， Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １
１， １６４５−１６５５ （１９８３） ｄ’Ｅｎｆｅｒｔ， Ｃ．， Ｒｙｔｅｒ， Ａ． ａ
ｎｄ Ｐｕｇｓｌｅｙ，Ａ．Ｐ．， ＥＭＢＯ Ｊ．，
６， ｎｏ． １１， ３５３１−３５３８（１９８
７） リポタンパク質プルラナーゼの産生、表面配置及び分泌
のための、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ
ｅ遺伝子のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉでのクロ
ーニング及び発現。
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １
１， １６４５−１６５５ （１９８３） ｄ’Ｅｎｆｅｒｔ， Ｃ．， Ｒｙｔｅｒ， Ａ． ａ
ｎｄ Ｐｕｇｓｌｅｙ，Ａ．Ｐ．， ＥＭＢＯ Ｊ．，
６， ｎｏ． １１， ３５３１−３５３８（１９８
７） リポタンパク質プルラナーゼの産生、表面配置及び分泌
のための、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ
ｅ遺伝子のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉでのクロ
ーニング及び発現。
【００９２】ｄ’Ｅｎｆｅｒｔ， Ｃ． ａｎｄ Ｐｕ
ｇｓｌｅｙ， Ａ．Ｐ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．， １７１， ｎｏ． ７， ３６７３−３６７９
（１９８９） Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのｐｕｌ
Ｓ遺伝子はプルラナーゼ分泌に必要な外膜リポタンパク
質をコードする。
ｇｓｌｅｙ， Ａ．Ｐ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．， １７１， ｎｏ． ７， ３６７３−３６７９
（１９８９） Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのｐｕｌ
Ｓ遺伝子はプルラナーゼ分泌に必要な外膜リポタンパク
質をコードする。
【００９３】Ｆｕｅｒｓｔｅ， Ｐ． ｅｔ ａｌ．，
Ｇｅｎｅ， ４８， １１９−１３１ （１９８６） Ｇｉｖｓｋｏｖ， Ｍ．， Ｏｌｓｅｎ， Ｌ． ａｎ
ｄ Ｍｏｌｉｎ， Ｓ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．， １７０， ５８５５−５８６２ （１９８８） Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来の細
胞外ホスホリパーゼＡ１の遺伝子のＥｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉでのクローニング及び発現。
Ｇｅｎｅ， ４８， １１９−１３１ （１９８６） Ｇｉｖｓｋｏｖ， Ｍ．， Ｏｌｓｅｎ， Ｌ． ａｎ
ｄ Ｍｏｌｉｎ， Ｓ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．， １７０， ５８５５−５８６２ （１９８８） Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来の細
胞外ホスホリパーゼＡ１の遺伝子のＥｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉでのクローニング及び発現。
【００９４】Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ， Ｒ．Ａ． ｅｔ
ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．， １７
７， ６５−７２ （１９７９） Ｋｕｍａｍｏｔｏ， Ｃ．Ａ． ａｎｄ Ｎａｕｌｔ，
Ａ．Ｋ．， Ｇｅｎｅ， ７５， １６７−１７５
（１９８９） Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉタンパク質輸送遺伝
子ｓｅｃＢの特性評価。
ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．， １７
７， ６５−７２ （１９７９） Ｋｕｍａｍｏｔｏ， Ｃ．Ａ． ａｎｄ Ｎａｕｌｔ，
Ａ．Ｋ．， Ｇｅｎｅ， ７５， １６７−１７５
（１９８９） Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉタンパク質輸送遺伝
子ｓｅｃＢの特性評価。
【００９５】Ｌａｍｉｎｅｔ， Ａ．Ａ．， Ｚｉｅｇ
ｅｌｈｏｆｆｅｒ， Ｔ．， Ｇｅｏｒｇｏｐｏｕｌｏ
ｓ， Ｃ． ａｎｄ Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ， Ａ．，
ＥＭＢＯ Ｊ．， ９， ｎｏ． ７， ２３１５−
２３１９ （１９９０） Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ熱ショックタンパク
質ＧｒｏＥＬ及びＧｒｏＥＳはβラクタマーゼ前駆体の
折り畳みを調節する。
ｅｌｈｏｆｆｅｒ， Ｔ．， Ｇｅｏｒｇｏｐｏｕｌｏ
ｓ， Ｃ． ａｎｄ Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ， Ａ．，
ＥＭＢＯ Ｊ．， ９， ｎｏ． ７， ２３１５−
２３１９ （１９９０） Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ熱ショックタンパク
質ＧｒｏＥＬ及びＧｒｏＥＳはβラクタマーゼ前駆体の
折り畳みを調節する。
【００９６】Ｌｅｃｋｅｒ， Ｓ．Ｈ．， Ｌｉｌｌ，
Ｒ．， Ｚｉｅｇｅｌｈｏｆｆｅｒ， Ｔ．， Ｇｅ
ｏｒｇｏｐｏｕｌｏｓ， Ｃ．， Ｂａｓｓｆｏｒｄ，
Ｊｒ．， Ｐ．Ｊ．， Ｋｕｍａｍｏｔｏ， Ｃ．
Ａ． ａｎｄ Ｗｉｃｋｎｅｒ，Ｗ．， ＥＭＢＯ
Ｊ．， ８， ｎｏ． ９， ２７０３−２７０９
（１９８９） Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの三つの純粋シャペ
ロンタンパク質（ＳｅｃＢ、トリガー因子及びＧｒｏＥ
Ｌ）はｉｎ ｖｉｔｒｏで前駆タンパク質との可溶複合
体を構成する。
Ｒ．， Ｚｉｅｇｅｌｈｏｆｆｅｒ， Ｔ．， Ｇｅ
ｏｒｇｏｐｏｕｌｏｓ， Ｃ．， Ｂａｓｓｆｏｒｄ，
Ｊｒ．， Ｐ．Ｊ．， Ｋｕｍａｍｏｔｏ， Ｃ．
Ａ． ａｎｄ Ｗｉｃｋｎｅｒ，Ｗ．， ＥＭＢＯ
Ｊ．， ８， ｎｏ． ９， ２７０３−２７０９
（１９８９） Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの三つの純粋シャペ
ロンタンパク質（ＳｅｃＢ、トリガー因子及びＧｒｏＥ
Ｌ）はｉｎ ｖｉｔｒｏで前駆タンパク質との可溶複合
体を構成する。
【００９７】Ｌｅｃｋｅｒ， Ｓ．Ｈ．， Ｄｒｉｅｓ
ｓｅｎ， Ａ．Ｊ．Ｍ． ａｎｄ Ｗｉｃｋｎｅｒ，
Ｗ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， ９， ２３０９−２３１４
（１９９０） プロＯｍｐＡは転位前に二次及び三次構造を含み、Ｓｅ
ｃＢタンパク質との会合によって集合から防護される。
ｓｅｎ， Ａ．Ｊ．Ｍ． ａｎｄ Ｗｉｃｋｎｅｒ，
Ｗ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， ９， ２３０９−２３１４
（１９９０） プロＯｍｐＡは転位前に二次及び三次構造を含み、Ｓｅ
ｃＢタンパク質との会合によって集合から防護される。
【００９８】Ｌｉｌｌ， Ｒ．， Ｃｒｏｏｋｅ，
Ｅ．， Ｇｕｔｈｒｉｅ， Ｂ． ａｎｄ Ｗｉｃｋｎ
ｅｒ， Ｗ．， Ｃｅｌｌ， ５４， １０１３−１０
１８ （１９８８） “トリガー因子サイクル”はリボソームと、プレ分泌タ
ンパク質と、形質膜とを含む。
Ｅ．， Ｇｕｔｈｒｉｅ， Ｂ． ａｎｄ Ｗｉｃｋｎ
ｅｒ， Ｗ．， Ｃｅｌｌ， ５４， １０１３−１０
１８ （１９８８） “トリガー因子サイクル”はリボソームと、プレ分泌タ
ンパク質と、形質膜とを含む。
【００９９】Ｌｉｕ， Ｙ．Ｎ．， Ｔａｎｇ， Ｊ．
Ｌ．， Ｃｌａｒｋｅ， Ｂ．Ｒ．，Ｄｏｗ， Ｊ．
Ｍ． ａｎｄ Ｄａｎｉｅｌｓ， Ｍ．Ｊ．， Ｍｏ
ｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．， ２２２， ４３３−
４４０ （１９９０） 多目的広宿主域クローニングベクター及び該ベクター
の、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ
ｐａｔｈｏｖａｒ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓの細胞外プロ
テアーゼ遺伝子の特性評価への使用。
Ｌ．， Ｃｌａｒｋｅ， Ｂ．Ｒ．，Ｄｏｗ， Ｊ．
Ｍ． ａｎｄ Ｄａｎｉｅｌｓ， Ｍ．Ｊ．， Ｍｏ
ｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．， ２２２， ４３３−
４４０ （１９９０） 多目的広宿主域クローニングベクター及び該ベクター
の、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ
ｐａｔｈｏｖａｒ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓの細胞外プロ
テアーゼ遺伝子の特性評価への使用。
【０１００】Ｍｉｙａｚａｋｉ， Ｈ．， Ｙａｎａｇ
ｉｄａ， Ｎ．， Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ， Ｓ． ａ
ｎｄ Ｂｅｐｐｕ， Ｔ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．，６５６６−６５７２ （１９８９） Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓセリンプロテ
アーゼの前駆体の特性評価、及びこの前駆体の、Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ外膜を透過して排出される
際のＣＯＯＨ末端処理。
ｉｄａ， Ｎ．， Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ， Ｓ． ａ
ｎｄ Ｂｅｐｐｕ， Ｔ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．，６５６６−６５７２ （１９８９） Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓセリンプロテ
アーゼの前駆体の特性評価、及びこの前駆体の、Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ外膜を透過して排出される
際のＣＯＯＨ末端処理。
【０１０１】Ｎａｋａｍｕｒａ， Ｋ．， Ｎａｋａｍ
ｕｒａ， Ａ．， Ｔａｋａｍａｔｓｕ， Ｈ．， Ｙ
ｏｓｈｉｋａｗａ， Ｈ． ａｎｄ Ｙａｍａｎｅ，
Ｋ．，Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０７， ６０３−
６０７ （１９９０） Ｅ． Ｃｏｌｉ ＳｅｃＹと同種のＢａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ遺伝子のクローニング及び特性評価。
ｕｒａ， Ａ．， Ｔａｋａｍａｔｓｕ， Ｈ．， Ｙ
ｏｓｈｉｋａｗａ， Ｈ． ａｎｄ Ｙａｍａｎｅ，
Ｋ．，Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０７， ６０３−
６０７ （１９９０） Ｅ． Ｃｏｌｉ ＳｅｃＹと同種のＢａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ遺伝子のクローニング及び特性評価。
【０１０２】Ｎｏｄａ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ．
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７２，２７０４−２７０
９ （１９９０） Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓの
プロトカテクエート４，５−ジオキシゲナーゼ遺伝子の
分子クローニング。
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７２，２７０４−２７０
９ （１９９０） Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓの
プロトカテクエート４，５−ジオキシゲナーゼ遺伝子の
分子クローニング。
【０１０３】Ｊ． Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．， Ｇｅｎｅ， ２６， １０１−１０６ （１９
８３） Ｏｖｅｒｂｅｅｋｅ， Ｎ．， Ｔｅｒｍｏｒｓｈｕｉ
ｚｅｎ， Ｇ．Ｈ．Ｍ．， Ｇｉｕｓｅｐｐｉｎ，
Ｍ．Ｌ．Ｆ．， Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ， Ｄ．Ｒ．ａｎ
ｄ Ｖｅｒｒｉｐｓ， Ｃ．Ｔ．， Ａｐｐｌ． ａｎ
ｄ Ｅｎｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， １４２９−１
４３４ （１９９０） Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓによるＣｙａｍｏ
ｐｓｉｓ ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂａ（Ｇｕａｒ）由
来のαガラクトシダーゼの分泌。
ｌ．， Ｇｅｎｅ， ２６， １０１−１０６ （１９
８３） Ｏｖｅｒｂｅｅｋｅ， Ｎ．， Ｔｅｒｍｏｒｓｈｕｉ
ｚｅｎ， Ｇ．Ｈ．Ｍ．， Ｇｉｕｓｅｐｐｉｎ，
Ｍ．Ｌ．Ｆ．， Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ， Ｄ．Ｒ．ａｎ
ｄ Ｖｅｒｒｉｐｓ， Ｃ．Ｔ．， Ａｐｐｌ． ａｎ
ｄ Ｅｎｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， １４２９−１
４３４ （１９９０） Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓによるＣｙａｍｏ
ｐｓｉｓ ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂａ（Ｇｕａｒ）由
来のαガラクトシダーゼの分泌。
【０１０４】Ｓｃｈａｔｚ， Ｐ．Ｊ．， Ｒｉｇｇ
ｓ， Ｐ．Ｄ．， Ｊａｃｑ， Ａ．，Ｆａｔｈ，
Ｍ．Ｊ． ａｎｄ Ｂｅｃｋｗｉｔｈ， Ｊ．， ＧＥ
Ｎ． ＆ＤＥＶ．， ３， １０３５−１０４４ （１
９８９） ｓｅｃＥ遺伝子はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉで
のタンパク質輸送に必要な膜内在性タンパク質をコード
する。
ｓ， Ｐ．Ｄ．， Ｊａｃｑ， Ａ．，Ｆａｔｈ，
Ｍ．Ｊ． ａｎｄ Ｂｅｃｋｗｉｔｈ， Ｊ．， ＧＥ
Ｎ． ＆ＤＥＶ．， ３， １０３５−１０４４ （１
９８９） ｓｅｃＥ遺伝子はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉで
のタンパク質輸送に必要な膜内在性タンパク質をコード
する。
【０１０５】Ｓｃｈｉｅｂｅｌ， Ｅ．， Ｓｃｈｗａ
ｒｚ， Ｈ． ａｎｄ Ｂｒａｕｎ，Ｖ．， Ｊ． ｏ
ｆ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６４， ｎｏ． ２
７，１６３１１−１６３２０ （１９８９） Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓの溶血素の細
胞下位置、及び唯一の分泌。
ｒｚ， Ｈ． ａｎｄ Ｂｒａｕｎ，Ｖ．， Ｊ． ｏ
ｆ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６４， ｎｏ． ２
７，１６３１１−１６３２０ （１９８９） Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓの溶血素の細
胞下位置、及び唯一の分泌。
【０１０６】Ｓｃｈｍｉｄｔ， Ｍ．Ｇ．， Ｒｏｌｌ
ｏ， Ｅ．Ｅ．， Ｇｒｏｄｂｅｒｇ， Ｊ． ａｎｄ
Ｏｌｉｖｅｒ， Ｄ．Ｂ．， Ｊ． ｏｆ Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ．， ３４０４−３４１４ （１９８８） Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおけるタンパク質
輸送を防止するｓｅｃＡ遺伝子及びｓｅｃＡ（ｔｓ）変
異株のヌクレオチド配列。
ｏ， Ｅ．Ｅ．， Ｇｒｏｄｂｅｒｇ， Ｊ． ａｎｄ
Ｏｌｉｖｅｒ， Ｄ．Ｂ．， Ｊ． ｏｆ Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ．， ３４０４−３４１４ （１９８８） Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおけるタンパク質
輸送を防止するｓｅｃＡ遺伝子及びｓｅｃＡ（ｔｓ）変
異株のヌクレオチド配列。
【０１０７】Ｓｕｈ， Ｊ．−Ｗ．， Ｂｏｙｌａｎ，
Ｓ．Ａ．， Ｔｈｏｍａｓ， Ｓ．Ｍ．， Ｄｏｌａ
ｎ， Ｋ．Ｍ．， Ｏｌｉｖｅｒ， Ｄ．Ｂ． ａｎｄ
Ｐｒｉｃｅ， Ｃ．Ｗ．， Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．， ４（２）， ３０５−３１４ （１９９
０） Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｓｅｃＹ同
種遺伝子の単離：Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａの共通タンパク
質輸送路の形跡。
Ｓ．Ａ．， Ｔｈｏｍａｓ， Ｓ．Ｍ．， Ｄｏｌａ
ｎ， Ｋ．Ｍ．， Ｏｌｉｖｅｒ， Ｄ．Ｂ． ａｎｄ
Ｐｒｉｃｅ， Ｃ．Ｗ．， Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．， ４（２）， ３０５−３１４ （１９９
０） Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｓｅｃＹ同
種遺伝子の単離：Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａの共通タンパク
質輸送路の形跡。
【０１０８】Ｗａｔａｎａｂｅ， Ｍ． ａｎｄ Ｂｌ
ｏｂｅｌ， Ｇ．， Ｃｅｌｌ， ５８， ６９５−７
０５ （１９８９） ＳｅｃＢはＥ． ｃｏｌｉでのタンパク質輸送のための
細胞質ゾルシグナル認識因子として機能する。
ｏｂｅｌ， Ｇ．， Ｃｅｌｌ， ５８， ６９５−７
０５ （１９８９） ＳｅｃＢはＥ． ｃｏｌｉでのタンパク質輸送のための
細胞質ゾルシグナル認識因子として機能する。
【０１０９】Ｗｅｓｔ， Ｓ．Ｅ．Ｈ． ａｎｄ Ｉｇ
ｌｅｗｓｋｉ， Ｂ．Ｈ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．， １６， ９３２３−９３３５ （１
９８８） Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａでのコ
ドン使用。
ｌｅｗｓｋｉ， Ｂ．Ｈ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．， １６， ９３２３−９３３５ （１
９８８） Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａでのコ
ドン使用。
【０１１０】Ｚｈｕ， Ｘ．， Ｏｔｈａ， Ｙ．，
Ｊｏｒｄａｎ， Ｆ． ａｎｄ Ｉｎｏｕｙｅ，
Ｍ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３３９， ４８３−４８４
（１９８９） スブチリシンのプロ配列は分子間処理において変性スブ
チリシンの再生を導き得る。
Ｊｏｒｄａｎ， Ｆ． ａｎｄ Ｉｎｏｕｙｅ，
Ｍ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３３９， ４８３−４８４
（１９８９） スブチリシンのプロ配列は分子間処理において変性スブ
チリシンの再生を導き得る。
【０１１１】Ｚｙｌｓｔｒａ， Ｇ．Ｊ．， Ｏｌｓｅ
ａｎ， Ｒ．Ｈ． ａｎｄ Ｂａｌｌｏｕ， Ｄ．
Ｐ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７１， ５
９１５−５９２１ （１９８９） Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａの、プロトカ
テクエート３，４−ジオキシゲナーゼのα及びβサブユ
ニットの遺伝子の遺伝体制及び配列。
ａｎ， Ｒ．Ｈ． ａｎｄ Ｂａｌｌｏｕ， Ｄ．
Ｐ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７１， ５
９１５−５９２１ （１９８９） Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａの、プロトカ
テクエート３，４−ジオキシゲナーゼのα及びβサブユ
ニットの遺伝子の遺伝体制及び配列。
【０１１２】
【図１】ｐＵＲ６０２６、ｐＵＲ６０１２及びｐＵＲ６
２００の構成経路の概略的説明図である。Ｅ＝ＥｃｏＲ
Ｉ、Ｈ＝ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｓ＝ＳａｃＩＩ、Ａ＝Ａｖａ
Ｉ、ＢＩＩ＝ＢｇｌＩＩ、Ｂ＝ＢａｍＨＩ。
２００の構成経路の概略的説明図である。Ｅ＝ＥｃｏＲ
Ｉ、Ｈ＝ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｓ＝ＳａｃＩＩ、Ａ＝Ａｖａ
Ｉ、ＢＩＩ＝ＢｇｌＩＩ、Ｂ＝ＢａｍＨＩ。
【図２】リパーゼ酵素をコードするｌｉｐＡ遺伝子（共
に下線を引いた位置４８３−ＡＴＧからＧＴＧ−１５５
６まで）と、ＯＲＦ２遺伝子（共に上方に線を引いた位
置１５５９−ＡＴＧからＧＧＴ−２６１７まで）とを含
むＰ． ｇｌｕｍａｅ染色体ＤＮＡフラグメントのヌク
レオチド配列を示す説明図である。
に下線を引いた位置４８３−ＡＴＧからＧＴＧ−１５５
６まで）と、ＯＲＦ２遺伝子（共に上方に線を引いた位
置１５５９−ＡＴＧからＧＧＴ−２６１７まで）とを含
むＰ． ｇｌｕｍａｅ染色体ＤＮＡフラグメントのヌク
レオチド配列を示す説明図である。
【図３】同上。
【図４】同上。
【図５】同上。
【図６】同上。図２〜図６は本来一続きの図である。
【図７】図２〜図６のヌクレオチド配列から推定され
る、ＯＲＦ２遺伝子によってコードされたタンパク質の
アミノ酸配列を示す説明図である。
る、ＯＲＦ２遺伝子によってコードされたタンパク質の
アミノ酸配列を示す説明図である。
【図８】Ｐ． ｇｌｕｍａｅリパーゼ遺伝子付近の染色
体状態を示す概略的説明図である。Ｅ＝ＥｃｏＲＩ、Ｓ
＝ＳａｃＩＩ、ＳＩ＝ＳａｌＩ、Ｐ＝ＰｓｔＩ、Ｃ＝Ｃ
ｌａＩ、Ｍ＝ＭｌｕＩ、Ｂ＝ＢａｍＨＩ。
体状態を示す概略的説明図である。Ｅ＝ＥｃｏＲＩ、Ｓ
＝ＳａｃＩＩ、ＳＩ＝ＳａｌＩ、Ｐ＝ＰｓｔＩ、Ｃ＝Ｃ
ｌａＩ、Ｍ＝ＭｌｕＩ、Ｂ＝ＢａｍＨＩ。
【図９】プロテアーゼ産生を測定した、Ｐ． ｇｌｕｍ
ａｅ ＰＧ１（野生型）、ＰＧ４及びＰＧＴ８９（ＰＧ
１のプロテアーゼネガティブなＴｎ５突然変異体、ヨー
ロッパ特許出願第ＥＰ−Ａ−４０７ ２２５号参照）の
コロニーが生じたスキムミルクプレート（１０％のスキ
ムミルクを補ったＬＢ寒天培地）の説明図である。
ａｅ ＰＧ１（野生型）、ＰＧ４及びＰＧＴ８９（ＰＧ
１のプロテアーゼネガティブなＴｎ５突然変異体、ヨー
ロッパ特許出願第ＥＰ−Ａ−４０７ ２２５号参照）の
コロニーが生じたスキムミルクプレート（１０％のスキ
ムミルクを補ったＬＢ寒天培地）の説明図である。
【図１０】１６Ｓ（１５００ヌクレオチド）及び２３Ｓ
（２９００ヌクレオチド）のリボソームＲＮＡが認めら
れる、Ｐ． ｇｌｕｍａｅ ＰＧ１及びＰＧ４のノザン
法分析の結果を示す説明図である。レーン１：ＰＧ１、
レーン２：ＰＧ４。
（２９００ヌクレオチド）のリボソームＲＮＡが認めら
れる、Ｐ． ｇｌｕｍａｅ ＰＧ１及びＰＧ４のノザン
法分析の結果を示す説明図である。レーン１：ＰＧ１、
レーン２：ＰＧ４。
【図１１】プラスミド； １＝ｐＵＲ６５００ ２＝ｐＵＲ６５０２ ３＝ｐＵＲ６５２０ ４＝ｐＵＲ６５２２ を含むＰ． ｇｌｕｍａｅ ＰＧ４コロニーが生じた
（１００ｍｇ／ｌのカナマイシン及び０．５ｍＭのＩＰ
ＴＧを補った）ＢＹＰＯプレートの説明図である。
（１００ｍｇ／ｌのカナマイシン及び０．５ｍＭのＩＰ
ＴＧを補った）ＢＹＰＯプレートの説明図である。
【図１２】ウェスタン法分析の結果を示す説明図であ
る。 レーン１：ＰＧ１（ｐＵＲ６５００） 細胞 レーン２：ＰＧ１（ｐＵＲ６５００） 上澄み レーン３：ＰＧ４（ｐＵＲ６５００） 細胞 レーン４：ＰＧ４（ｐＵＲ６５００） 上澄み レーン５：基準の成熟リパーゼ レーン６：ＰＧ４（ｐＵＲ６５０２） 上澄み レーン７：ＰＧ４（ｐＵＲ６５０２） 細胞 レーン８：ＰＧ４（ｐＵＲ６５２０） 細胞 レーン９：ＰＧ４（ｐＵＲ６５２０） 上澄み レーン１０：ＰＧ４（ｐＵＲ６５２２） 細胞 レーン１１：ＰＧ４（ｐＵＲ６５２２） 上澄み レーン１２：基準の成熟リパーゼ
る。 レーン１：ＰＧ１（ｐＵＲ６５００） 細胞 レーン２：ＰＧ１（ｐＵＲ６５００） 上澄み レーン３：ＰＧ４（ｐＵＲ６５００） 細胞 レーン４：ＰＧ４（ｐＵＲ６５００） 上澄み レーン５：基準の成熟リパーゼ レーン６：ＰＧ４（ｐＵＲ６５０２） 上澄み レーン７：ＰＧ４（ｐＵＲ６５０２） 細胞 レーン８：ＰＧ４（ｐＵＲ６５２０） 細胞 レーン９：ＰＧ４（ｐＵＲ６５２０） 上澄み レーン１０：ＰＧ４（ｐＵＲ６５２２） 細胞 レーン１１：ＰＧ４（ｐＵＲ６５２２） 上澄み レーン１２：基準の成熟リパーゼ
【図１３】Ｐ． ｇｌｕｍａｅコロニー； １＝ＰＧ１（ｐＵＲ６５００） ２＝ＰＧ１（ｐＵＲ６５２２） ３＝ＰＧ４（ｐＵＲ６５００） ４＝ＰＧ４（ｐＵＲ６５２２） が生じた（１００ｍｇ／ｌのカナマイシン及び０．５ｍ
ＭのＩＰＴＧを補った）ＢＹＰＯプレートの説明図であ
る。
ＭのＩＰＴＧを補った）ＢＹＰＯプレートの説明図であ
る。
【図１４】異なるプラスミド構成を含むＥ． ｃｏｌｉ
ＪＭ１０９の増殖曲線を示すグラフである。異なる細
胞株を２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを補ったＬＢ培地で
一晩培養した培養物を製造し、その際Ｅ． ｃｏｌｉ
ＪＭ１０９（ｐＵＲ６５１８＋ｐＵＲ６５２０）の場合
のみＬＢ培地に２５ｍｇ／ｌのカナマイシンと１００ｍ
ｇ／ｌのアンピシリンとを補った。得られた培養物を、
同じ抗生物質を含有する７５ｍｌの新鮮ＬＢ培地中でＯ
Ｄ６６０が約０．１５となるまで稀釈した後、時間の経
過に従って増殖を追跡した。９０分間の増殖後、ＩＰＴ
Ｇを最終濃度が０．２ｍＭとなるように添加することに
よってプロモーターを誘導した。
ＪＭ１０９の増殖曲線を示すグラフである。異なる細
胞株を２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを補ったＬＢ培地で
一晩培養した培養物を製造し、その際Ｅ． ｃｏｌｉ
ＪＭ１０９（ｐＵＲ６５１８＋ｐＵＲ６５２０）の場合
のみＬＢ培地に２５ｍｇ／ｌのカナマイシンと１００ｍ
ｇ／ｌのアンピシリンとを補った。得られた培養物を、
同じ抗生物質を含有する７５ｍｌの新鮮ＬＢ培地中でＯ
Ｄ６６０が約０．１５となるまで稀釈した後、時間の経
過に従って増殖を追跡した。９０分間の増殖後、ＩＰＴ
Ｇを最終濃度が０．２ｍＭとなるように添加することに
よってプロモーターを誘導した。
【図１５】プラスミド； レーン１：ｐＵＲ６５１８ レーン２：ｐＵＲ６５１８＋ｐＵＲ６５２０ レーン３：ｐＵＲ６５２２ を含むＥ． ｃｏｌｉ株由来のｍＲＮＡのノザン法分析
の結果を示す説明図である。 Ａのプローブ＝ＰｖｕＩＩフラグメント（位置７９２か
ら１４７２まで） Ｂのプローブ＝ＮｒｕＩフラグメント（位置１８５７か
ら２５２６まで）
の結果を示す説明図である。 Ａのプローブ＝ＰｖｕＩＩフラグメント（位置７９２か
ら１４７２まで） Ｂのプローブ＝ＮｒｕＩフラグメント（位置１８５７か
ら２５２６まで）
【図１６】異なるプラスミドを含むＥ． ｃｏｌｉ株の
ウェスタン法分析の結果を示す説明図である。細胞及び
上澄みは、細菌Ｅ． ｃｏｌｉを図１４の説明に述べた
諸条件下に増殖させた後に得た。 レーン１：ｐＵＲ６５１８ 細胞 レーン２：ｐＵＲ６５２２ 細胞 レーン３：ｐＵＲ６５１８＋ｐＵＲ６５２０ 細胞 レーン４：基準の成熟リパーゼ レーン５：ｐＵＲ６５００ 細胞 レーン６：空き レーン７：ｐＵＲ６５００ 上澄み レーン８：ｐＵＲ６５１８ 上澄み レーン９：ｐＵＲ６５２２ 上澄み レーン１０：ｐＵＲ６５１８＋ｐＵＲ６５２０ 上澄み
ウェスタン法分析の結果を示す説明図である。細胞及び
上澄みは、細菌Ｅ． ｃｏｌｉを図１４の説明に述べた
諸条件下に増殖させた後に得た。 レーン１：ｐＵＲ６５１８ 細胞 レーン２：ｐＵＲ６５２２ 細胞 レーン３：ｐＵＲ６５１８＋ｐＵＲ６５２０ 細胞 レーン４：基準の成熟リパーゼ レーン５：ｐＵＲ６５００ 細胞 レーン６：空き レーン７：ｐＵＲ６５００ 上澄み レーン８：ｐＵＲ６５１８ 上澄み レーン９：ｐＵＲ６５２２ 上澄み レーン１０：ｐＵＲ６５１８＋ｐＵＲ６５２０ 上澄み
【図１７】プラスミド； １＝ｐＵＲ６７７２ ２＝ｐＵＲ６７７３ ３＝ｐＵＲ６７８５ を含むＢ． ｓｕｂｔｉｌｉｓコロニーが生じた（２５
ｍｇ／ｌのカナマイシンを補った）ＢＹＰＯプレートの
説明図である。
ｍｇ／ｌのカナマイシンを補った）ＢＹＰＯプレートの
説明図である。
【図１８】リパーゼを産生するＢ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ
コロニー（ｌｉｐ＋）及びリパーゼネガティブとなった
Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓコロニー（ｌｉｐ−）から単離
したｐＵＲ６７８５の制限酵素分析の結果を示す説明図
である。 レーン１：ｌｉｐ＋ ＢｓｔＥＩＩ及びＨｉｎｄＩＩ
Ｉで消化 レーン２：ｌｉｐ− ＢｓｔＥＩＩ及びＨｉｎｄＩＩ
Ｉで消化 レーン３：マーカーＡ レーン４：マーカーＢ レーン５：ｌｉｐ＋ ＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩで消化 レーン６：ｌｉｐ− ＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩで消化
コロニー（ｌｉｐ＋）及びリパーゼネガティブとなった
Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓコロニー（ｌｉｐ−）から単離
したｐＵＲ６７８５の制限酵素分析の結果を示す説明図
である。 レーン１：ｌｉｐ＋ ＢｓｔＥＩＩ及びＨｉｎｄＩＩ
Ｉで消化 レーン２：ｌｉｐ− ＢｓｔＥＩＩ及びＨｉｎｄＩＩ
Ｉで消化 レーン３：マーカーＡ レーン４：マーカーＢ レーン５：ｌｉｐ＋ ＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩで消化 レーン６：ｌｉｐ− ＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩで消化
【図１９】二遺伝子オペロン由来のｌｉｐＡ遺伝子及び
ＯＲＦ２遺伝子をコードする構成中の（Ｇ＋Ｃ含有率の
高いＤＮＡ片鎖を含む、位置１５４５から２１９９まで
の）対応する野生型Ｐ． ｇｌｕｍａｅ染色体フラグメ
ントと置き換え得る、考えられる合成ＰｓｔＩ−Ｂａｍ
ＨＩフラグメントのヌクレオチド配列を示す説明図であ
る。（ここに示した配列はリパーゼの最後の四つのアミ
ノ酸と、ＯＲＦ２の最初の２１４のアミノ酸とをコード
する。）
ＯＲＦ２遺伝子をコードする構成中の（Ｇ＋Ｃ含有率の
高いＤＮＡ片鎖を含む、位置１５４５から２１９９まで
の）対応する野生型Ｐ． ｇｌｕｍａｅ染色体フラグメ
ントと置き換え得る、考えられる合成ＰｓｔＩ−Ｂａｍ
ＨＩフラグメントのヌクレオチド配列を示す説明図であ
る。（ここに示した配列はリパーゼの最後の四つのアミ
ノ酸と、ＯＲＦ２の最初の２１４のアミノ酸とをコード
する。）
【図２０】分離プロモーターの後にＯＲＦ２遺伝子を含
む構成中の（Ｇ＋Ｃ含有率の高いＤＮＡ片鎖を含む）野
生型Ｐ． ｇｌｕｍａｅ染色体ＯＲＦ２遺伝子フラグメ
ントの５′部分と置き換え得る、考えられる合成Ｅｃｏ
ＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントのヌクレオチド配列を示
す説明図である。
む構成中の（Ｇ＋Ｃ含有率の高いＤＮＡ片鎖を含む）野
生型Ｐ． ｇｌｕｍａｅ染色体ＯＲＦ２遺伝子フラグメ
ントの５′部分と置き換え得る、考えられる合成Ｅｃｏ
ＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントのヌクレオチド配列を示
す説明図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年３月１７日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＵＲ６０２６、ｐＵＲ６０１２及びｐＵＲ６
２００の構成経路の概略的説明図である。Ｅ＝ＥｃｏＲ
Ｉ、Ｈ＝ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｓ＝ＳａｃＩＩ、Ａ＝Ａｖａ
Ｉ、ＢＩＩ＝ＢｇｌＩＩ、Ｂ＝ＢａｍＨＩ。
２００の構成経路の概略的説明図である。Ｅ＝ＥｃｏＲ
Ｉ、Ｈ＝ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｓ＝ＳａｃＩＩ、Ａ＝Ａｖａ
Ｉ、ＢＩＩ＝ＢｇｌＩＩ、Ｂ＝ＢａｍＨＩ。
【図２】リパーゼ酵素をコードするｌｉｐＡ遺伝子（共
に下線を引いた位置４８３−ＡＴＧからＧＴＧ−１５５
６まで）と、ＯＲＦ２遺伝子（共に上方に線を引いた位
置１５５９−ＡＴＧからＧＧＴ−２６１７まで）とを含
むＰ． ｇｌｕｍａｅ染色体ＤＮＡフラグメントのヌク
レオチド配列を示す説明図である。
に下線を引いた位置４８３−ＡＴＧからＧＴＧ−１５５
６まで）と、ＯＲＦ２遺伝子（共に上方に線を引いた位
置１５５９−ＡＴＧからＧＧＴ−２６１７まで）とを含
むＰ． ｇｌｕｍａｅ染色体ＤＮＡフラグメントのヌク
レオチド配列を示す説明図である。
【図３】リパーゼ酵素をコードするｌｉｐＡ遺伝子（共
に下線を引いた位置４８３−ＡＴＧからＧＴＧ−１５５
６まで）と、ＯＲＦ２遣伝子（共に上方に線を引いた位
置１５５９−ＡＴＧからＧＧＴ−２６１７まで）とを含
むＰ． ｇｌｕｍａｅ染色体ＤＮＡフラグメントのヌク
レオチド配列を示す説明図である。
に下線を引いた位置４８３−ＡＴＧからＧＴＧ−１５５
６まで）と、ＯＲＦ２遣伝子（共に上方に線を引いた位
置１５５９−ＡＴＧからＧＧＴ−２６１７まで）とを含
むＰ． ｇｌｕｍａｅ染色体ＤＮＡフラグメントのヌク
レオチド配列を示す説明図である。
【図４】リパーゼ酵素をコードするｌｉｐＡ遣伝子（共
に下線を引いた位置４８３−ＡＴＧからＧＴＧ−１５５
６まで）と、ＯＲＦ２遺伝子（共に上方に線を引いた位
置１５５９−ＡＴＧからＧＧＴ−２６１７まで）とを含
むＰ． ｇｌｕｍａｅ染色体ＤＮＡフラグメントのヌク
レオチド配列を示す説明図である。
に下線を引いた位置４８３−ＡＴＧからＧＴＧ−１５５
６まで）と、ＯＲＦ２遺伝子（共に上方に線を引いた位
置１５５９−ＡＴＧからＧＧＴ−２６１７まで）とを含
むＰ． ｇｌｕｍａｅ染色体ＤＮＡフラグメントのヌク
レオチド配列を示す説明図である。
【図５】リパーゼ酵素をコードするｌｉｐＡ遺伝子（共
に下線を引いた位置４８３−ＡＴＧからＧＴＧ−１５５
６まで）と、ＯＲＦ２遺伝子（共に上方に線を引いた位
置１５５９−ＡＴＧからＧＧＴ−２６１７まで）とを含
むＰ． ｇｌｕｍａｅ染色体ＤＮＡフラグメントのヌク
レオチド配列を示す生物の形態の説明図である。
に下線を引いた位置４８３−ＡＴＧからＧＴＧ−１５５
６まで）と、ＯＲＦ２遺伝子（共に上方に線を引いた位
置１５５９−ＡＴＧからＧＧＴ−２６１７まで）とを含
むＰ． ｇｌｕｍａｅ染色体ＤＮＡフラグメントのヌク
レオチド配列を示す生物の形態の説明図である。
【図６】リパーゼ酵素をコードするｌｉｐＡ遺伝子（共
に下線を引いた位置４８３−ＡＴＧからＧＴＧ−１５５
６まで）と、ＯＲＦ２遺伝子（共に上方に線を引いた位
置１５５９−ＡＴＧからＧＧＴ−２６１７まで）とを含
むＰ． ｇｌｕｍａｅ染色体ＤＮＡフラグメントのヌク
レオチド配列を示す電気泳動の説明図である。図２〜図
６は本来一続きの図である。
に下線を引いた位置４８３−ＡＴＧからＧＴＧ−１５５
６まで）と、ＯＲＦ２遺伝子（共に上方に線を引いた位
置１５５９−ＡＴＧからＧＧＴ−２６１７まで）とを含
むＰ． ｇｌｕｍａｅ染色体ＤＮＡフラグメントのヌク
レオチド配列を示す電気泳動の説明図である。図２〜図
６は本来一続きの図である。
【図７】図２〜図６のヌクレオチド配列から推定され
る、ＯＲＦ２遺伝子によってコードされたタンパク質の
アミノ酸配列を示す生物の形態の説明図である。
る、ＯＲＦ２遺伝子によってコードされたタンパク質の
アミノ酸配列を示す生物の形態の説明図である。
【図８】Ｐ． ｇｌｕｍａｅリパーゼ遺伝子付近の染色
体状態を示す電気泳動の説明図である。Ｅ＝ＥｃｏＲ
Ｉ、Ｓ＝ＳａｃＩＩ、ＳＩ＝ＳａｌＩ、Ｐ＝ＰｓｔＩ、
Ｃ＝ＣｌａＩ、Ｍ＝ＭｌｕＩ、Ｂ＝ＢａｍＨＩ。
体状態を示す電気泳動の説明図である。Ｅ＝ＥｃｏＲ
Ｉ、Ｓ＝ＳａｃＩＩ、ＳＩ＝ＳａｌＩ、Ｐ＝ＰｓｔＩ、
Ｃ＝ＣｌａＩ、Ｍ＝ＭｌｕＩ、Ｂ＝ＢａｍＨＩ。
【図９】プロテアーゼ産生を測定した、Ｐ． ｇｌｕｍ
ａｅ ＰＧ１（野生型）、ＰＧ４及びＰＧＴ８９（ＰＧ
１のプロテアーゼネガティブなＴｎ５突然変異体、ヨー
ロッパ特許出願第ＥＰ−Ａ−４０７ ２２５号参照）の
コロニーが生じたスキムミルクプレート（１０％のスキ
ムミルクを補ったＬＢ寒天培地）の生物の形態の写真で
ある。
ａｅ ＰＧ１（野生型）、ＰＧ４及びＰＧＴ８９（ＰＧ
１のプロテアーゼネガティブなＴｎ５突然変異体、ヨー
ロッパ特許出願第ＥＰ−Ａ−４０７ ２２５号参照）の
コロニーが生じたスキムミルクプレート（１０％のスキ
ムミルクを補ったＬＢ寒天培地）の生物の形態の写真で
ある。
【図１０】１６Ｓ（１５００ヌクレオチド）及び２３Ｓ
（２９００ヌクレオチド）のリボソームＲＮＡが認めら
れる、Ｐ． ｇｌｕｍａｅ ＰＧ１及びＰＧ４のノザン
法分析の結果を示す電気泳動の写真である。レーン１：
ＰＧ１、レーン２：ＰＧ４。
（２９００ヌクレオチド）のリボソームＲＮＡが認めら
れる、Ｐ． ｇｌｕｍａｅ ＰＧ１及びＰＧ４のノザン
法分析の結果を示す電気泳動の写真である。レーン１：
ＰＧ１、レーン２：ＰＧ４。
【図１１】プラスミド； １＝ｐＵＲ６５００ ２＝ｐＵＲ６５０２ ３＝ｐＵＲ６５２０ ４＝ｐＵＲ６５２２ を含むＰ． ｇｌｕｍａｅ ＰＧ４コロニーが生じた
（１００ｍｇ／ｌのカナマイシン及び０．５ｍＭのＩＰ
ＴＧを補った）ＢＹＰＯプレートの生物の形態の写真で
ある。
（１００ｍｇ／ｌのカナマイシン及び０．５ｍＭのＩＰ
ＴＧを補った）ＢＹＰＯプレートの生物の形態の写真で
ある。
【図１２】ウェスタン法分析の結果を示す電気泳動の写
真である。 レーン１：ＰＧ１（ｐＵＲ６５００） 細胞 レーン２：ＰＧ１（ｐＵＲ６５００） 上澄み レーン３：ＰＧ４（ｐＵＲ６５００） 細胞 レーン４：ＰＧ４（ｐＵＲ６５００） 上澄み レーン５：基準の成熟リパーゼ レーン６：ＰＧ４（ｐＵＲ６５０２） 上澄み レーン７：ＰＧ４（ｐＵＲ６５０２） 細胞 レーン８：ＰＧ４（ｐＵＲ６５２０） 細胞 レーン９：ＰＧ４（ｐＵＲ６５２０） 上澄み レーン１０：ＰＧ４（ｐＵＲ６５２２） 細胞 レーン１１：ＰＧ４（ｐＵＲ６５２２） 上澄み レーン１２：基準の成熟リパーゼ
真である。 レーン１：ＰＧ１（ｐＵＲ６５００） 細胞 レーン２：ＰＧ１（ｐＵＲ６５００） 上澄み レーン３：ＰＧ４（ｐＵＲ６５００） 細胞 レーン４：ＰＧ４（ｐＵＲ６５００） 上澄み レーン５：基準の成熟リパーゼ レーン６：ＰＧ４（ｐＵＲ６５０２） 上澄み レーン７：ＰＧ４（ｐＵＲ６５０２） 細胞 レーン８：ＰＧ４（ｐＵＲ６５２０） 細胞 レーン９：ＰＧ４（ｐＵＲ６５２０） 上澄み レーン１０：ＰＧ４（ｐＵＲ６５２２） 細胞 レーン１１：ＰＧ４（ｐＵＲ６５２２） 上澄み レーン１２：基準の成熟リパーゼ
【図１３】Ｐ． ｇｌｕｍａｅコロニー； １＝ＰＧ１（ｐＵＲ６５００） ２＝ＰＧ１（ｐＵＲ６５２２） ３＝ＰＧ４（ｐＵＲ６５００） ４＝ＰＧ４（ｐＵＲ６５２２） が生じた（１００ｍｇ／ｌのカナマイシン及び０．５ｍ
ＭのＩＰＴＧを補った）ＢＹＰＯプレートの生物の形態
の写真である。
ＭのＩＰＴＧを補った）ＢＹＰＯプレートの生物の形態
の写真である。
【図１４】異なるプラスミド構成を含むＥ． ｃｏｌｉ
ＪＭ１０９の増殖曲線を示すグラフである。異なる細
胞株を２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを補ったＬＢ培地で
一晩培養した培養物を製造し、その際Ｅ． ｃｏｌｉ
ＪＭ１０９（ｐＵＲ６５１８＋ｐＵＲ６５２０）の場合
のみＬＢ培地に２５ｍｇ／ｌのカナマイシンと１００ｍ
ｇ／ｌのアンピシリンとを補った。得られた培養物を、
同じ抗生物質を含有する７５ｍｌの新鮮ＬＢ培地中でＯ
Ｄ６６０が約０．１５となるまで稀釈した後、時間の経
過に従って増殖を追跡した。９０分間の増殖後、ＩＰＴ
Ｇを最終濃度が０．２ｍＭとなるように添加することに
よってプロモーターを誘導した。
ＪＭ１０９の増殖曲線を示すグラフである。異なる細
胞株を２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを補ったＬＢ培地で
一晩培養した培養物を製造し、その際Ｅ． ｃｏｌｉ
ＪＭ１０９（ｐＵＲ６５１８＋ｐＵＲ６５２０）の場合
のみＬＢ培地に２５ｍｇ／ｌのカナマイシンと１００ｍ
ｇ／ｌのアンピシリンとを補った。得られた培養物を、
同じ抗生物質を含有する７５ｍｌの新鮮ＬＢ培地中でＯ
Ｄ６６０が約０．１５となるまで稀釈した後、時間の経
過に従って増殖を追跡した。９０分間の増殖後、ＩＰＴ
Ｇを最終濃度が０．２ｍＭとなるように添加することに
よってプロモーターを誘導した。
【図１５】プラスミド； レーン１：ｐＵＲ６５１８ レーン２：ｐＵＲ６５１８＋ｐＵＲ６５２０ レーン３：ｐＵＲ６５２２ を含むＥ． ｃｏｌｉ株由来のｍＲＮＡのノザン法分析
の結果を示す電気泳動の写真である。 Ａのプローブ＝ＰｖｕＩＩフラグメント（位置７９２か
ら１４７２まで） Ｂのプローブ＝ＮｒｕＩフラグメント（位置１８５７か
ら２５２６まで）
の結果を示す電気泳動の写真である。 Ａのプローブ＝ＰｖｕＩＩフラグメント（位置７９２か
ら１４７２まで） Ｂのプローブ＝ＮｒｕＩフラグメント（位置１８５７か
ら２５２６まで）
【図１６】異なるプラスミドを含むＥ． ｃｏｌｉ株の
ウェスタン法分析の結果を示す電気泳動の写真である。
細胞及び上澄みは、細菌Ｅ． ｃｏｌｉを図１４の説明
に述べた諸条件下に増殖させた後に得た。 レーン１：ｐＵＲ６５１８ 細胞 レーン２：ｐＵＲ６５２２ 細胞 レーン３：ｐＵＲ６５１８＋ｐＵＲ６５２０ 細胞 レーン４：基準の成熟リパーゼ レーン５：ｐＵＲ６５００ 細胞 レーン６：空き レーン７：ｐＵＲ６５００ 上澄み レーン８：ｐＵＲ６５１８ 上澄み レーン９：ｐＵＲ６５２２ 上澄み レーン１０：ｐＵＲ６５１８＋ｐＵＲ６５２０ 上澄み
ウェスタン法分析の結果を示す電気泳動の写真である。
細胞及び上澄みは、細菌Ｅ． ｃｏｌｉを図１４の説明
に述べた諸条件下に増殖させた後に得た。 レーン１：ｐＵＲ６５１８ 細胞 レーン２：ｐＵＲ６５２２ 細胞 レーン３：ｐＵＲ６５１８＋ｐＵＲ６５２０ 細胞 レーン４：基準の成熟リパーゼ レーン５：ｐＵＲ６５００ 細胞 レーン６：空き レーン７：ｐＵＲ６５００ 上澄み レーン８：ｐＵＲ６５１８ 上澄み レーン９：ｐＵＲ６５２２ 上澄み レーン１０：ｐＵＲ６５１８＋ｐＵＲ６５２０ 上澄み
【図１７】プラスミド； １＝ｐＵＲ６７７２ ２＝ｐＵＲ６７７３ ３＝ｐＵＲ６７８５ を含むＢ． ｓｕｂｔｉｌｉｓコロニーが生じた（２５
ｍｇ／ｌのカナマイシンを補った）ＢＹＰＯプレートの
生物の形態の写真である。
ｍｇ／ｌのカナマイシンを補った）ＢＹＰＯプレートの
生物の形態の写真である。
【図１８】リパーゼを産出するＢ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ
コロニー（ｌｉｐ＋）及びリパーゼネガティブとなった
Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓコロニー（ｌｉｐ−）から単離
したｐＵＲ６７８５の制限酵素分析の結果を示す電気泳
動の写真である。 レーン１：ｌｉｐ＋ ＢｓｔＥＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ
で消化 レーン２：ｌｉｐ− ＢｓｔＥＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ
で消化 レーン３：マーカーＡ レーン４：マーカーＢ レーン５：ｌｉｐ＋ ＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩで消化 レーン６：ｌｉｐ− ＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩで消化
コロニー（ｌｉｐ＋）及びリパーゼネガティブとなった
Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓコロニー（ｌｉｐ−）から単離
したｐＵＲ６７８５の制限酵素分析の結果を示す電気泳
動の写真である。 レーン１：ｌｉｐ＋ ＢｓｔＥＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ
で消化 レーン２：ｌｉｐ− ＢｓｔＥＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ
で消化 レーン３：マーカーＡ レーン４：マーカーＢ レーン５：ｌｉｐ＋ ＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩで消化 レーン６：ｌｉｐ− ＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩで消化
【図１９】二遺伝子オペロン由来のｌｉｐＡ遺伝子及び
ＯＲＦ２遺伝子をコードする構成中の（Ｇ＋Ｃ含有率の
高いＤＮＡ片鎖を含む、位置１５４５から２１９９まで
の）対応する野生型Ｐ． ｇｌｕｍａｅ染色体フラグメ
ントと置き換え得る、考えられる合成ＰｓｔＩ−Ｂａｍ
ＨＩフラグメントのヌクレオチド配列を示す説明図であ
る。（ここに示した配列はリパーゼの最後の四つのアミ
ノ酸と、ＯＲＦ２の最初の２１４のアミノ酸とをコード
する。）
ＯＲＦ２遺伝子をコードする構成中の（Ｇ＋Ｃ含有率の
高いＤＮＡ片鎖を含む、位置１５４５から２１９９まで
の）対応する野生型Ｐ． ｇｌｕｍａｅ染色体フラグメ
ントと置き換え得る、考えられる合成ＰｓｔＩ−Ｂａｍ
ＨＩフラグメントのヌクレオチド配列を示す説明図であ
る。（ここに示した配列はリパーゼの最後の四つのアミ
ノ酸と、ＯＲＦ２の最初の２１４のアミノ酸とをコード
する。）
【図２０】分離プロモーターの後にＯＲＦ２遺伝子を含
む構成中の（Ｇ＋Ｃ含有率の高いＤＮＡ片鎖を含む）野
生型Ｐ． ｇｌｕｍａｅ染色体ＯＲＦ２遺伝子フラグメ
ントの５′部分と置き換え得る、考えられる合成Ｅｃｏ
ＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントのヌクレオチド配列を示
す説明図である。
む構成中の（Ｇ＋Ｃ含有率の高いＤＮＡ片鎖を含む）野
生型Ｐ． ｇｌｕｍａｅ染色体ＯＲＦ２遺伝子フラグメ
ントの５′部分と置き換え得る、考えられる合成Ｅｃｏ
ＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントのヌクレオチド配列を示
す説明図である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９
【補正方法】変更
【補正内容】
【図９】
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１０】
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１１】
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１２】
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１３
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１３】
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１５
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１５】
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１６
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１６】
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１７
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１７】
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１８
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１８】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 9/20 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 9/20 Ｃ１２Ｒ 1:40） (Ｃ１２Ｎ 9/20 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:40） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 15/55 Ｃ１２Ｒ 1:38） (72)発明者 コルネリス・セオドラス・フエルリプス オランダ国、3142・カー・ベー・マースル イス、ハヘドールン・18 (72)発明者 クリステイアーン・フツセール オランダ国、2907．ベー・イエー・カペ レ・アー／デー・エイツセル、ミヌーセル フ・77
Claims (21)
- 【請求項１】少なくとも１つの発現可能なリパーゼ遺伝
子と、リパーゼ特異的安定化／転位タンパク質をコード
する少なくとも１つの発現可能な遺伝子とを含み、これ
らの遺伝子のいずれか一方又は両方がリパーゼ産生グラ
ム陰性菌に由来したものである、リパーゼを産生するこ
とができる形質転換した微生物。 - 【請求項２】グラム陰性菌がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａ
ｃｅａｅ科のもの、好ましくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
属、より好ましくはＰ．ｃｅｐａｃｅａ、Ｐ．ｇｌａｄ
ｉｏｌｉ、Ｐ．ｇｌｕｍａｅ、Ｐ．ｍｅｎｄｏｃｉｎ
ａ、 Ｐ．ｐｕｔｉｄａ及びＰ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ種の
ものである請求項１に記載の微生物。 - 【請求項３】リパーゼ特異的安定化／転位タンパク質
が、図７の配列を有するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌ
ｕｍａｅ ＰＧ１に由来するタンパク質と本質的に同じ
リパーゼ特異的安定化／転位活性を有する請求項１又は
２に記載の微生物。 - 【請求項４】リパーゼ特異的安定化／転位タンパク質又
はその遺伝子が本明細書に記載のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ ｇｌｕｍａｅ ＰＧ１に由来するリパーゼ特異的安
定化／転位タンパク質又はその遺伝子と同じか又は実質
的相同を有する請求項１から３のいずれか一項に記載の
微生物。 - 【請求項５】リパーゼ特異的安定化／転位タンパク質
が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌｕｍａｅ ＰＧ１に
由来するリパーゼ特異的安定化／転位タンパク質又はそ
のエピトープに対する抗血清との免疫交差反応を起こす
請求項３に記載の微生物。 - 【請求項６】下記の群： （ａ）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科のもの、好
ましくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、より好ましくは
Ｐ．ｃｅｐａｃｅａ、Ｐ．ｇｌａｄｉｏｌｉ、Ｐ．ｇｌ
ｕｍａｅ、Ｐ．ｍｅｎｄｏｃｉｎａ、 Ｐ．ｐｕｔｉｄ
ａ及びＰ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ種のものを含むグラム陰性
菌； （ｂ）Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ科、好ましくはＢａｃｉ
ｌｌｕｓ属のものを含むグラム陽性菌； （ｃ）酵母属Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍ
ｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
及びカビ属Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓのものを含む真核生
物並びに他の下等真核生物から選択される請求項１から
５のいずれか一項に記載の微生物。 - 【請求項７】プロモーター活性が野性型における活性の
少なくとも２倍になるように、特にプロモーター配列内
で転写を調節し且つ遺伝子を２つ含むオペロンを制御す
る配列内に１つ又は複数の突然変異を含み、前記オペロ
ンが転写後にリパーゼ及びリパーゼ特異的安定化／転位
タンパク質両方のポリシストロニックメッセンジャーＲ
ＮＡとなる請求項１から６のいずれか一項に記載の微生
物。 - 【請求項８】リパーゼ又はその遺伝子がＰｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ ｇｌｕｍａｅ ＰＧ１由来のリパーゼ又はそ
の遺伝子と同じであるか又は実質的相同を有する請求項
１から７のいずれか一項に記載の微生物。 - 【請求項９】リパーゼがＣｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｖ
ｉｓｃｏｓｕｍ ｖａｒ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃｕｍ Ｎ
ＲＲＬ Ｂ−３６３７由来のリパーゼに対する抗血清、
Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ＰＬ−６７９、ＡＴＣＣ ３
１３７１もしくはＦＥＲＭ−Ｐ ３７８３由来のリパー
ゼに対する抗血清、又はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌ
ｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＩＡＭ １０５７由来のリパーゼ
に対する抗血清、並びに同時係属特許出願ＥＰ−Ａ−４
０７ ２２５号に記載のような改良された突然変異リパ
ーゼに対する抗血清との免疫交差反応を起こす請求項１
から８のいずれか一項に記載の微生物。 - 【請求項１０】リパーゼをコードする遺伝子が野性型リ
パーゼ遺伝子を修飾したものであり、この修飾が、洗剤
又は洗浄システムのリパーゼの効果を改善すべく、特定
部位の突然変異誘発を含む組換えＤＮＡ技術によって得
られる請求項１から９のいずれか一項に記載の微生物。 - 【請求項１１】修飾がリパーゼ特異的安定化／転位タン
パク質の安定化／転位機能を損うものではない請求項１
０に記載の微生物。 - 【請求項１２】リパーゼ遺伝子の前に宿主と同種のシグ
ナル配列が存在し、このシグナル配列と前記リパーゼ遺
伝子との間にリパーゼのシグナル配列のＣ末端部分をコ
ードする一連のヌクレオチド、好ましくは４５個以下、
より好ましくは２４個以下のヌクレオチドが含まれてい
るか、又はアミノ酸をコードする一連ヌクレオチドであ
って図２〜６に示すヌクレオチド列と同じかもしくは本
質的に類似したヌクレオチド列が含まれており、このヌ
クレオチド列が、宿主細胞と同種のシグナル配列のＡＴ
Ｇ（開始）コドンによって決定される読取り枠内にリパ
ーゼ遺伝子が配置されるような多数のヌクレオチドを含
んでいる請求項１から１１のいずれか一項に記載の微生
物。 - 【請求項１３】組換えＤＮＡ修飾方法を用いて微生物を
形質転換し、それによってリパーゼをコードする遺伝子
の少なくとも１つのコピー及びリパーゼ特異的安定化／
転位タンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つの
コピーの両方を前記微生物内に導入し、その結果後者の
遺伝子がリパーゼ遺伝子の発現と協奏して前記微生物中
に発現されるようにすることからなる請求項１から１２
のいずれか一項に記載のリパーゼ産生微生物の製造方
法。 - 【請求項１４】前記遺伝子の両方を、遺伝子を２つ含み
翻訳後にリパーゼ及びリパーゼ安定化／転位タンパク質
双方のポリシストロニックメッセンジャーＲＮＡとなる
オペロンとして導入する請求項１３に記載の方法。 - 【請求項１５】突然変異を一般的な突然変異によって得
る請求項７に記載の方法。 - 【請求項１６】好ましくはリパーゼ産生グラム陰性菌に
由来するリパーゼ特異的安定化／転位タンパク質をコー
ドするヌクレオチド配列。 - 【請求項１７】図７に示すようなリパーゼ特異的安定化
／転位タンパク質をコードする請求項１６に記載のヌク
レオチド配列。 - 【請求項１８】ヌクレオチド配列の最初の約２００個の
コドンが本質的に同じアミノ酸をコードするが、当該宿
主細胞内で極めて十分に翻訳されるメッセンジャーＲＮ
ＡのＧ＋Ｃ含量と同じか又はほぼ同じＧ＋Ｃ含量を有す
る請求項１６又は１７に記載の配列。 - 【請求項１９】前記配列を発現するための宿主細胞中で
極めて十分に翻訳されるメッセンジャーＲＮＡのＧ＋Ｃ
含量及びコドンの使用態様と実質的に同じＧ＋Ｃ含量及
びコドンの使用態様を有する請求項１６から１８のいず
れか一項に記載の配列。 - 【請求項２０】形質転換した微生物によってリパーゼを
産生する方法であって、請求項１から１２のいずれか一
項に記載の微生物をリパーゼが産生され且つ好ましくは
分泌されるような条件下で培養し、次いでリパーゼを回
収することからなる方法。 - 【請求項２１】請求項１から１２のいずれか一項に記載
の微生物によって産生されたリパーゼを含む洗剤又は洗
浄用組成物。
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP19900307440 EP0407225A1 (en) | 1989-07-07 | 1990-07-06 | Enzymes and enzymatic detergent compositions |
| PCT/EP1990/001138 WO1991000920A2 (en) | 1989-07-07 | 1990-07-09 | Process for preparing a protein by a fungus transformed by multicopy integration of an expression vector |
| NL90/01138 | 1990-10-17 | ||
| NL90307440.9 | 1990-10-17 | ||
| EP90202772 | 1990-10-17 | ||
| NL90202772.1 | 1990-10-17 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06292573A true JPH06292573A (ja) | 1994-10-21 |
Family
ID=27222760
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3261485A Pending JPH06292573A (ja) | 1990-07-06 | 1991-07-05 | 同種又は異種宿主内での活性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌｕｍａｅリパーゼの産生 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0464922A1 (ja) |
| JP (1) | JPH06292573A (ja) |
| CA (1) | CA2046249A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US5429950A (en) * | 1992-03-30 | 1995-07-04 | Genencor International, Inc. | Heterologous gene expression in bacillus subtilis: fusion approach |
| US5454971A (en) * | 1992-05-27 | 1995-10-03 | Showa Denko K.K. | Alkaline lipase, method for producing the same, microorganism producing the same and detergent composition containing alkaline lipase |
| EP0652958A1 (en) * | 1992-07-23 | 1995-05-17 | Genencor International, Inc. | Cloning and expression of a lipase modulator gene from pseudomonas pseudoalcaligenes |
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| BE1009650A5 (fr) * | 1995-10-12 | 1997-06-03 | Genencor Int | Systeme d'expression, vecteur et cellule transformee par ce vecteur. |
| WO1999055885A2 (en) * | 1998-04-28 | 1999-11-04 | Axys Pharmaceuticals, Inc. | Novel serine protease capable of selective cleavage of insulin-like growth factor binding protein |
| CN108707574B (zh) * | 2018-05-29 | 2019-06-25 | 山东大学苏州研究院 | 一株产脂肪酶工程菌、其构建方法和应用 |
| CN109897842B (zh) * | 2019-03-25 | 2020-12-11 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 淀粉酶突变体zdamya及其编码基因和应用 |
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| JP3079276B2 (ja) * | 1988-02-28 | 2000-08-21 | 天野製薬株式会社 | 組換え体ｄｎａ、それを含むシュードモナス属菌及びそれを用いたリパーゼの製造法 |
| GB8915658D0 (en) * | 1989-07-07 | 1989-08-23 | Unilever Plc | Enzymes,their production and use |
| DK336889D0 (da) * | 1989-07-07 | 1989-07-07 | Novo Nordisk As | Polypeptider |
-
1991
- 1991-06-26 EP EP19910201627 patent/EP0464922A1/en not_active Withdrawn
- 1991-07-04 CA CA 2046249 patent/CA2046249A1/en not_active Abandoned
- 1991-07-05 JP JP3261485A patent/JPH06292573A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2046249A1 (en) | 1992-01-07 |
| EP0464922A1 (en) | 1992-01-08 |
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