JPH06284887A - Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプタイ ドならびに検出法 - Google Patents
Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプタイ ドならびに検出法Info
- Publication number
- JPH06284887A JPH06284887A JP5345753A JP34575393A JPH06284887A JP H06284887 A JPH06284887 A JP H06284887A JP 5345753 A JP5345753 A JP 5345753A JP 34575393 A JP34575393 A JP 34575393A JP H06284887 A JPH06284887 A JP H06284887A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hepatitis
- polynucleotide
- virus
- gene
- hcv
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）を高感度に特異
的に検出する方法の提供。 【構成】 Ｃ型肝炎ウィルス遺伝子ＨＣ−Ｊ１／ＲＮＡ
の全塩基配列を解明したことにもとづいて開発されたも
のであって、ＨＣＶを検出するために直接または間接に
用いられるヌクレオチド、ペプタイドならびにこれを用
いたＨＣＶ検出法。 【効果】 本発明により、ＨＣＶを高感度に特異的に検
出することができる。
的に検出する方法の提供。 【構成】 Ｃ型肝炎ウィルス遺伝子ＨＣ−Ｊ１／ＲＮＡ
の全塩基配列を解明したことにもとづいて開発されたも
のであって、ＨＣＶを検出するために直接または間接に
用いられるヌクレオチド、ペプタイドならびにこれを用
いたＨＣＶ検出法。 【効果】 本発明により、ＨＣＶを高感度に特異的に検
出することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（以
下「ＨＣＶ」と略記する）ＨＣ−Ｊ１の遺伝子、蛋白
質、特異抗体、ならびにこれらを検出する方法に関す
る。
下「ＨＣＶ」と略記する）ＨＣ−Ｊ１の遺伝子、蛋白
質、特異抗体、ならびにこれらを検出する方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】１９８８年カイロン社によって、ＨＣＶ
遺伝子の一部配列が発表されて以来、この配列を基に作
製された遺伝子組替え体抗原、あるいは合成ペプタイド
抗原を用いた抗体測定系が開発され、現在では輸血血液
スクリーニングや患者の診断に用いられるようになって
いる。しかしながら、現在の抗体検査だけでは完全には
ＨＣＶ感染例を検出することはできず、また急性期や慢
性期といった感染後の臨床経過や治療の判定にも不十分
であることが判明しており、ＨＣＶ感染を正確に、そし
て高感度に検出する診断法として、ＨＣＶ遺伝子を検出
する方法も幾つか発表されている。ＨＣＶは非常に変異
に富むウイルスであることから、これらの抗体検出法な
らびに遺伝子検出法はいずれも、これまでに解明されて
いるＨＣＶ株間の配列に共通して保存されている領域を
検出することによって、特異的にＨＣＶ遺伝子の存在を
判定することを意図している。一方、これらのＨＣＶ検
出法はＨＣＶ遺伝子の有無や抗体の有無をスクリーニン
グ的な意義からとらえており、Ｂ型肝炎ウイルスの様に
ウイルスの状態や肝炎の病態の捕捉、予後の推定に応用
される段階には至っておらず、より詳細な情報を得る検
査方法の確立が望まれていた。
遺伝子の一部配列が発表されて以来、この配列を基に作
製された遺伝子組替え体抗原、あるいは合成ペプタイド
抗原を用いた抗体測定系が開発され、現在では輸血血液
スクリーニングや患者の診断に用いられるようになって
いる。しかしながら、現在の抗体検査だけでは完全には
ＨＣＶ感染例を検出することはできず、また急性期や慢
性期といった感染後の臨床経過や治療の判定にも不十分
であることが判明しており、ＨＣＶ感染を正確に、そし
て高感度に検出する診断法として、ＨＣＶ遺伝子を検出
する方法も幾つか発表されている。ＨＣＶは非常に変異
に富むウイルスであることから、これらの抗体検出法な
らびに遺伝子検出法はいずれも、これまでに解明されて
いるＨＣＶ株間の配列に共通して保存されている領域を
検出することによって、特異的にＨＣＶ遺伝子の存在を
判定することを意図している。一方、これらのＨＣＶ検
出法はＨＣＶ遺伝子の有無や抗体の有無をスクリーニン
グ的な意義からとらえており、Ｂ型肝炎ウイルスの様に
ウイルスの状態や肝炎の病態の捕捉、予後の推定に応用
される段階には至っておらず、より詳細な情報を得る検
査方法の確立が望まれていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、新規なＨＣ
Ｖ株の遺伝子の全塩基配列、ならびにこれにコードされ
るアミノ酸配列を明らかにし、従来の検査方法では検出
できなかったＨＣＶ株を特異的に検出し、ＨＣＶ感染状
態ならびにＣ型肝炎の病態をより詳細に診断する方法を
提供しようとするものである。
Ｖ株の遺伝子の全塩基配列、ならびにこれにコードされ
るアミノ酸配列を明らかにし、従来の検査方法では検出
できなかったＨＣＶ株を特異的に検出し、ＨＣＶ感染状
態ならびにＣ型肝炎の病態をより詳細に診断する方法を
提供しようとするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、これまで
に各種ＨＣＶについて５′非翻訳領域、コア領域、エン
ベロープ領域の遺伝子の塩基配列やアミノ酸配列を明ら
かにし（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．６０：１６７−
１７７，１９９０）、ＨＣＶ株間で保存性の高い領域に
関する知見に基づきＨＣＶ抗体検出方法やＨＣＶ−ＲＮ
Ａ検出方法を完成した（特願平２−１５３４０１、特願
平２−１５３４０２）。また一部のＨＣＶ株については
その遺伝子の全塩基配列を明らかにし（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖ
ｉｒｏｌ．７２：２６９７−２７０４，１９９１；Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ１８８：３３１−３４１，１９９２）、構
造蛋白および非構造蛋白のアミノ酸配列に関する発明を
完成した（特願平３−２８７４０２、特願平３−３６０
４４１）。コア領域に存在する型特異的な遺伝子配列か
らなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ポ
リメラーゼチェインリアクション法（以下「ＰＣＲ法」
という）によりＨＣＶ遺伝子の内の特定の遺伝子を増幅
することによって遺伝子型を判別をする従来の方法
（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３：６７３−６７９，１
９９２）により、上述のＨＣＶ株はＩＩＩ型（ＨＣ−Ｊ
６）とＩＶ型（ＨＣ−Ｊ８）であることが判明してい
る。Ｉ型、ＩＩ型についてもＨＣＶ−１（Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：２４５１−
２４５５，１９９１）、ＨＣＶ−Ｊ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：９５２４−９５
２８，１９９０）等の全塩基配列が明らかにされている
が、ウイルスの検出方法の改良や新しい検査手法の確
立、ワクチンの開発などのためには、さらに多くのＨＣ
Ｖ株について全塩基配列、アミノ酸配列の全体を解明す
ることが重要な課題となっている。
に各種ＨＣＶについて５′非翻訳領域、コア領域、エン
ベロープ領域の遺伝子の塩基配列やアミノ酸配列を明ら
かにし（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．６０：１６７−
１７７，１９９０）、ＨＣＶ株間で保存性の高い領域に
関する知見に基づきＨＣＶ抗体検出方法やＨＣＶ−ＲＮ
Ａ検出方法を完成した（特願平２−１５３４０１、特願
平２−１５３４０２）。また一部のＨＣＶ株については
その遺伝子の全塩基配列を明らかにし（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖ
ｉｒｏｌ．７２：２６９７−２７０４，１９９１；Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ１８８：３３１−３４１，１９９２）、構
造蛋白および非構造蛋白のアミノ酸配列に関する発明を
完成した（特願平３−２８７４０２、特願平３−３６０
４４１）。コア領域に存在する型特異的な遺伝子配列か
らなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ポ
リメラーゼチェインリアクション法（以下「ＰＣＲ法」
という）によりＨＣＶ遺伝子の内の特定の遺伝子を増幅
することによって遺伝子型を判別をする従来の方法
（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３：６７３−６７９，１
９９２）により、上述のＨＣＶ株はＩＩＩ型（ＨＣ−Ｊ
６）とＩＶ型（ＨＣ−Ｊ８）であることが判明してい
る。Ｉ型、ＩＩ型についてもＨＣＶ−１（Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：２４５１−
２４５５，１９９１）、ＨＣＶ−Ｊ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：９５２４−９５
２８，１９９０）等の全塩基配列が明らかにされている
が、ウイルスの検出方法の改良や新しい検査手法の確
立、ワクチンの開発などのためには、さらに多くのＨＣ
Ｖ株について全塩基配列、アミノ酸配列の全体を解明す
ることが重要な課題となっている。
【０００５】本発明者らは、Ｉ型ＨＣＶ株ＨＣ−Ｊ１の
部分配列を基に研究を重ね、約９５００塩基からなる遺
伝子の全塩基配列を解明することによって、本発明を完
成した。 すなわち本発明は配列番号１、２および３に
記載された塩基配列を有するＨＣ−Ｊ１遺伝子、これよ
り得られるｃＤＮＡ、および５′末端より３４１番目の
ＡＴＧから始まる翻訳領域にコードされる蛋白質および
部分ポリペプタイドに関する。また本発明はＨＣ−Ｊ１
のＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドからなるプライ
マーおよびプローブ、これを利用して核酸を増幅するこ
とを特徴とするＣ型肝炎ウイルス検出の方法、ならびに
ＨＣ−Ｊ１蛋白質またはこれに特異的な部分ペプタイド
を用いることを特徴とする、Ｃ型肝炎ウイルス特異抗体
の検出方法、およびモノクローナル抗体、ポリクローナ
ル抗体、ならびにこれらを用いるＣ型肝炎ウイルス特異
抗原の検出方法に関する。
部分配列を基に研究を重ね、約９５００塩基からなる遺
伝子の全塩基配列を解明することによって、本発明を完
成した。 すなわち本発明は配列番号１、２および３に
記載された塩基配列を有するＨＣ−Ｊ１遺伝子、これよ
り得られるｃＤＮＡ、および５′末端より３４１番目の
ＡＴＧから始まる翻訳領域にコードされる蛋白質および
部分ポリペプタイドに関する。また本発明はＨＣ−Ｊ１
のＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドからなるプライ
マーおよびプローブ、これを利用して核酸を増幅するこ
とを特徴とするＣ型肝炎ウイルス検出の方法、ならびに
ＨＣ−Ｊ１蛋白質またはこれに特異的な部分ペプタイド
を用いることを特徴とする、Ｃ型肝炎ウイルス特異抗体
の検出方法、およびモノクローナル抗体、ポリクローナ
ル抗体、ならびにこれらを用いるＣ型肝炎ウイルス特異
抗原の検出方法に関する。
【０００６】本発明の塩基配列を有するＲＮＡおよびｃ
ＤＮＡは５−ＮＣ領域、これに続く翻訳領域ならびに
３′ＮＣ領域からなり、また、本発明のアミノ酸配列を
有する蛋白質はこの翻訳領域によってコードされている
ので、該領域に特異的なヌクレオチドまたはアミノ酸配
列を有する限り、ウイルスの変異に由来する本明細書に
具体的な配列の記載のない少数の置換を含むものであっ
ても、本発明の範囲に含まれる。
ＤＮＡは５−ＮＣ領域、これに続く翻訳領域ならびに
３′ＮＣ領域からなり、また、本発明のアミノ酸配列を
有する蛋白質はこの翻訳領域によってコードされている
ので、該領域に特異的なヌクレオチドまたはアミノ酸配
列を有する限り、ウイルスの変異に由来する本明細書に
具体的な配列の記載のない少数の置換を含むものであっ
ても、本発明の範囲に含まれる。
【０００７】本発明において、ＨＣＶの検出は、オリゴ
ヌクレオチドプライマーのペアを用いて特異配列を増幅
する方法を利用して相補的ＤＮＡ（以後「ｃＤＮＡ」と
いう）を増幅させることにより行うことができる。ま
た、オリゴヌクレオチドプローブを用いて、膜に転写し
たＲＮＡやｃＤＮＡとハイブリダイズさせることにより
行うことができる。このとき、酵素、放射性同位元素な
どでオリゴヌクレオチドを標識したプローブを用いるこ
ともできる。ＨＣＶ抗体の検出系としては、上記塩基配
列の適当な部分を宿主細胞に組み込み、発現させた蛋白
質や、化学合成によって作成した部分ペプタイドを常法
によって担体に固定化させて、被検検体と反応させ、し
かるのち酵素などで標識した抗ヒト抗体などで検出する
方法がある。また、モノクローナル抗体やポリクローナ
ル抗体を作成する方法としては、常法に従ってマウス、
ウサギなどに上記蛋白質、またはペプタイドを免疫し、
その血清などから得る、または免疫動物の胸腺細胞をマ
ウスミエローマ細胞等のガン化した細胞と融合させて得
ることができる。ＨＣＶ抗原の検出系としては、上記の
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を常法に
従って担体に固定化し、被検検体と反応させた後、酵素
などで標識した抗体で検出することができる。
ヌクレオチドプライマーのペアを用いて特異配列を増幅
する方法を利用して相補的ＤＮＡ（以後「ｃＤＮＡ」と
いう）を増幅させることにより行うことができる。ま
た、オリゴヌクレオチドプローブを用いて、膜に転写し
たＲＮＡやｃＤＮＡとハイブリダイズさせることにより
行うことができる。このとき、酵素、放射性同位元素な
どでオリゴヌクレオチドを標識したプローブを用いるこ
ともできる。ＨＣＶ抗体の検出系としては、上記塩基配
列の適当な部分を宿主細胞に組み込み、発現させた蛋白
質や、化学合成によって作成した部分ペプタイドを常法
によって担体に固定化させて、被検検体と反応させ、し
かるのち酵素などで標識した抗ヒト抗体などで検出する
方法がある。また、モノクローナル抗体やポリクローナ
ル抗体を作成する方法としては、常法に従ってマウス、
ウサギなどに上記蛋白質、またはペプタイドを免疫し、
その血清などから得る、または免疫動物の胸腺細胞をマ
ウスミエローマ細胞等のガン化した細胞と融合させて得
ることができる。ＨＣＶ抗原の検出系としては、上記の
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を常法に
従って担体に固定化し、被検検体と反応させた後、酵素
などで標識した抗体で検出することができる。
【０００８】
【作用】本発明の遺伝子、ポリヌクレオチド、オリゴヌ
クレオチドは宿主細胞に組み込んで本発明の蛋白質また
はペプタイドを得ることができる。本発明のオリゴヌク
レオチドは、これをプライマーまたはプローブとして使
用して、Ｃ型肝炎ウィルスを検出することができる。本
発明の蛋白質またはペプタイドは、これを用いてＣ型肝
炎特異抗体を検出することができる。また、本発明の蛋
白質またはペプタイドは、これを動物に免疫してモノク
ローナル抗体またはポリクローナル抗体を得ることがで
き、これらの抗体を用いてＣ型肝炎ウィルス特異抗原を
検出することができる。
クレオチドは宿主細胞に組み込んで本発明の蛋白質また
はペプタイドを得ることができる。本発明のオリゴヌク
レオチドは、これをプライマーまたはプローブとして使
用して、Ｃ型肝炎ウィルスを検出することができる。本
発明の蛋白質またはペプタイドは、これを用いてＣ型肝
炎特異抗体を検出することができる。また、本発明の蛋
白質またはペプタイドは、これを動物に免疫してモノク
ローナル抗体またはポリクローナル抗体を得ることがで
き、これらの抗体を用いてＣ型肝炎ウィルス特異抗原を
検出することができる。
【０００９】
【実施例】以下、本発明の実施例について述べるが、も
とより本発明がこれらの実施例に限定されるものではな
い。 実施例１ ＨＣ−Ｊ１株の全塩基配列及びアミノ酸配列を次のよう
にして決定した。
とより本発明がこれらの実施例に限定されるものではな
い。 実施例１ ＨＣ−Ｊ１株の全塩基配列及びアミノ酸配列を次のよう
にして決定した。
【００１０】（１）ＲＮＡ抽出 日本人供血者の血μｌから得た、ＨＣＶ抗体陽性（オー
ソ・ダイアグノスティック・システムズ株式会社のオー
ソＨＣＶＡｂＥＬＩＳＡテストによる）と判定された検
体（ＨＣ−Ｊ１）ならびにＮＡＮＢ型肝炎の感染性を確
認したチンパンジーから得た、ＨＣＶ抗体（−）の検体
（ＨＣ−Ｊ４）より、いずれも次のようにしてＲＮＡを
抽出した。１．８ｍｌの血μｌに１ｍｌのトリス塩酸緩
衝液（１０ 、ｐＨ８．０）を加え、６８×１０３ｒｐ
ｍで１時間遠心した。得られたペレットに２００ Ｎ
ａＣｌ、１０ ＥＤＴＡ、２％（ｗ／ｖ）ドデシル硫
酸ナトリウム（ＳＤＳ）と１ｍｇ／ｍｌのプロテナーゼ
Ｋを含むトリス塩酸緩衝液（５０ 、ｐＨ８．０）を加
え、６０℃１時間加温し、フェノール／クロロホルムで
抽出した後、エタノール沈殿を行い、ＲＮＡを得た。
ソ・ダイアグノスティック・システムズ株式会社のオー
ソＨＣＶＡｂＥＬＩＳＡテストによる）と判定された検
体（ＨＣ−Ｊ１）ならびにＮＡＮＢ型肝炎の感染性を確
認したチンパンジーから得た、ＨＣＶ抗体（−）の検体
（ＨＣ−Ｊ４）より、いずれも次のようにしてＲＮＡを
抽出した。１．８ｍｌの血μｌに１ｍｌのトリス塩酸緩
衝液（１０ 、ｐＨ８．０）を加え、６８×１０３ｒｐ
ｍで１時間遠心した。得られたペレットに２００ Ｎ
ａＣｌ、１０ ＥＤＴＡ、２％（ｗ／ｖ）ドデシル硫
酸ナトリウム（ＳＤＳ）と１ｍｇ／ｍｌのプロテナーゼ
Ｋを含むトリス塩酸緩衝液（５０ 、ｐＨ８．０）を加
え、６０℃１時間加温し、フェノール／クロロホルムで
抽出した後、エタノール沈殿を行い、ＲＮＡを得た。
【００１１】（２）ｃＤＮＡ合成 ＨＣ−Ｊ１血μｌより抽出したＲＮＡを７０℃で１分間
加温し、これを鋳型として１０ユニットの逆転写酵素
（ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｙｓｔｅｍＰｌｕ
ｓ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｊａｐａｎ）及びオリゴヌクレ
オチドプライマー（２０マー）２０ｐｍｏｌを加えて４
２℃、１．５時間反応させｃＤＮＡを得た。プライマー
としてはヨーロッパ特許出願第８８３１０２２．５号に
示されたＨＣＶの塩基配列を参照して合成した＃８
（５′−ＧＡＴＧＣＴＴＧＣＧＧＡＡＧＣＡＡＴＣＡ−
３′）を用いた。
加温し、これを鋳型として１０ユニットの逆転写酵素
（ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｙｓｔｅｍＰｌｕ
ｓ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｊａｐａｎ）及びオリゴヌクレ
オチドプライマー（２０マー）２０ｐｍｏｌを加えて４
２℃、１．５時間反応させｃＤＮＡを得た。プライマー
としてはヨーロッパ特許出願第８８３１０２２．５号に
示されたＨＣＶの塩基配列を参照して合成した＃８
（５′−ＧＡＴＧＣＴＴＧＣＧＧＡＡＧＣＡＡＴＣＡ−
３′）を用いた。
【００１２】（３）ポリメラーゼチェインリアクション
（ＰＣＲ）によるｃＤＮＡの増幅は次のように行った。
ＤＮＡサーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ
・Ｃｅｔｕｓ）に、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＤＮＡ増幅試薬
キット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ・Ｃｅｔｕｓ）を用
い、Ｓａｉｋｉらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９、４
８７−４９１．１９８８）によって３５サイクルのｃＤ
ＮＡ増幅を行った。
（ＰＣＲ）によるｃＤＮＡの増幅は次のように行った。
ＤＮＡサーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ
・Ｃｅｔｕｓ）に、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＤＮＡ増幅試薬
キット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ・Ｃｅｔｕｓ）を用
い、Ｓａｉｋｉらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９、４
８７−４９１．１９８８）によって３５サイクルのｃＤ
ＮＡ増幅を行った。
【００１３】（４）ｃＤＮＡライブラリーの構築による
Ｊ１、Ｊ４、各５′末端側塩基配列の決定 ｃＤＮＡライブラリーを用いたＨＣ−Ｊ１、ＨＣ−Ｊ４
ゲノムの５′末端側の塩基配列解析は図１、図２に示す
ように、ｃＤＮＡをバクテリオファージλｇｔ１０に挿
入して得たクローンの解析及びｃＤＮＡをＰＣＲにて増
幅して得られたクローンの解析結果の両者を併せて決定
した。図１、図２はＮＡＮＢ型肝炎ウイルスゲノムの
５′末端を制限酵素切断部位とともに示し、使用するプ
ライマーの位置も示す。図中、実線はバクテリオファー
ジλｇｔ１０のライブラリーによるクローンで塩基配列
を決定した範囲を、点線はＰＣＲによるクローンで塩基
配列を決定した範囲を示す。ＨＣ−Ｊ１のｎｔ４５４〜
２１０９の１６５６塩基はプライマー＃８から得たｃＤ
ＮＡをλｇｔ１０ファージベクター（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ）に挿入して得られたクローンφ４１により決定し
た。つぎにこのシークエンスをもとに合成した、ｎｔ８
２４〜８４３の新しいプライマー＃２５（５′−ＴＣＣ
ＣＴＧＴＴＧＣＡＴＡＧＴＴＣＡＣＧ−３′）を用い
て、ＨＣ−Ｊ４のｃＤＮＡライブラリーから順次４つの
ｃＤＮＡクローンφ６０、φ６１、φ６６、φ７５を得
て、上流のｎｔ１８〜８４３の塩基配列を決めた。ＨＣ
−Ｊ４について、さらに上流の５′末端を特定するため
にｎｔ２４６〜２６５のアンチセンスプライマー＃３６
（５′ーＡＡＣＡＣＴＡＣＴＣＧＧＣＴＡＧＣＡＧＴ−
３′）を用いてｃＤＮＡを合成したのち、ターミナルデ
オキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによりｃＤＮ
Ａの５′末端にｄＡ付加を行い、２段階のｏｎｅ−ｓｉ
ｄｅｄＰＣＲ増幅を行った、すなわち、１回目はオリゴ
ｄＴプライマー（２０−ｍｅｒ）とｎｔ１８８〜２０７
のアンチセンスプライマー＃４８（５′−ＧＴＴＧＡＴ
ＣＣＡＡＧＡＡＡＧＧＡＣＣＣ−３′）を用いて３５サ
イクルのＰＣＲ増幅を行い、２回目はそのＰＣＲ産物を
鋳型にしてオリゴｄＴプライマー（２０−ｍｅｒ）とｎ
ｔ１４０〜１６０のアンチセンスプライマー＃１０９
（２１−ｍｅｒ；５′−ＡＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＡＧＡ
ＣＣＡＣＴＡＴ−３′）を用いて３０サイクルのＰＣＲ
を行った。得られたＰＣＲ産物をＭ１３ファージベクタ
ーにサブクローニングした。完全長の５′末端配列を有
すると考えられる６個の独立したクローン、Ｃ８９６
２、Ｃ８９６８、Ｃ８９７０、Ｃ８９７４、Ｃ９０３
４、Ｃ９０３６が得られ、ｎｔ１〜１７の塩基配列を決
定した。
Ｊ１、Ｊ４、各５′末端側塩基配列の決定 ｃＤＮＡライブラリーを用いたＨＣ−Ｊ１、ＨＣ−Ｊ４
ゲノムの５′末端側の塩基配列解析は図１、図２に示す
ように、ｃＤＮＡをバクテリオファージλｇｔ１０に挿
入して得たクローンの解析及びｃＤＮＡをＰＣＲにて増
幅して得られたクローンの解析結果の両者を併せて決定
した。図１、図２はＮＡＮＢ型肝炎ウイルスゲノムの
５′末端を制限酵素切断部位とともに示し、使用するプ
ライマーの位置も示す。図中、実線はバクテリオファー
ジλｇｔ１０のライブラリーによるクローンで塩基配列
を決定した範囲を、点線はＰＣＲによるクローンで塩基
配列を決定した範囲を示す。ＨＣ−Ｊ１のｎｔ４５４〜
２１０９の１６５６塩基はプライマー＃８から得たｃＤ
ＮＡをλｇｔ１０ファージベクター（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ）に挿入して得られたクローンφ４１により決定し
た。つぎにこのシークエンスをもとに合成した、ｎｔ８
２４〜８４３の新しいプライマー＃２５（５′−ＴＣＣ
ＣＴＧＴＴＧＣＡＴＡＧＴＴＣＡＣＧ−３′）を用い
て、ＨＣ−Ｊ４のｃＤＮＡライブラリーから順次４つの
ｃＤＮＡクローンφ６０、φ６１、φ６６、φ７５を得
て、上流のｎｔ１８〜８４３の塩基配列を決めた。ＨＣ
−Ｊ４について、さらに上流の５′末端を特定するため
にｎｔ２４６〜２６５のアンチセンスプライマー＃３６
（５′ーＡＡＣＡＣＴＡＣＴＣＧＧＣＴＡＧＣＡＧＴ−
３′）を用いてｃＤＮＡを合成したのち、ターミナルデ
オキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによりｃＤＮ
Ａの５′末端にｄＡ付加を行い、２段階のｏｎｅ−ｓｉ
ｄｅｄＰＣＲ増幅を行った、すなわち、１回目はオリゴ
ｄＴプライマー（２０−ｍｅｒ）とｎｔ１８８〜２０７
のアンチセンスプライマー＃４８（５′−ＧＴＴＧＡＴ
ＣＣＡＡＧＡＡＡＧＧＡＣＣＣ−３′）を用いて３５サ
イクルのＰＣＲ増幅を行い、２回目はそのＰＣＲ産物を
鋳型にしてオリゴｄＴプライマー（２０−ｍｅｒ）とｎ
ｔ１４０〜１６０のアンチセンスプライマー＃１０９
（２１−ｍｅｒ；５′−ＡＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＡＧＡ
ＣＣＡＣＴＡＴ−３′）を用いて３０サイクルのＰＣＲ
を行った。得られたＰＣＲ産物をＭ１３ファージベクタ
ーにサブクローニングした。完全長の５′末端配列を有
すると考えられる６個の独立したクローン、Ｃ８９６
２、Ｃ８９６８、Ｃ８９７０、Ｃ８９７４、Ｃ９０３
４、Ｃ９０３６が得られ、ｎｔ１〜１７の塩基配列を決
定した。
【００１４】一方ＨＣ−Ｊ１の上流のシークエンスは、
ｎｔ１８〜８４３についてはプライマー＃４４（５′−
ＧＧＣＧＡＣＡＣＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＴ−３′）と
＃２５（５′−ＴＣＣＣＴＧＴＴＧＣＡＴＡＧＴＴＣＡ
ＣＧ−３′）を用いたＰＣＲによって得られたクローン
Ｃ２５０３、Ｃ２５０８、及びＣ２５１０によって決め
られた。さらに上流の５′末端は、ＨＣ−Ｊ４と同様の
方法により得られた１６個のクローン、Ｃ８９３１、Ｃ
８９３２、Ｃ８９３５、Ｃ８９３７、Ｃ８９４２、Ｃ８
９４４、Ｃ８９４９、Ｃ８９５０、Ｃ８９５１、Ｃ８９
５４、Ｃ８９５５、Ｃ９０２３、Ｃ９０２６、Ｃ９０３
０、Ｃ９０３１、Ｃ９０３２を用いて、ｎｔ１〜３７の
塩基配列を決めた。次にＨＣ−Ｊ１の５′末端側下流の
塩基配列を決定するため、プライマー＃１４８（５′−
ＴＧＣＡＣＣＴＧＧＡＴＧＡＡＣＴＣＡＡＣ−３′）と
＃１４６（５′−ＡＧＴＡＧＣＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＡ
ＧＣＡ−３′）を用いて３０サイクルのＰＣＲを行っ
た。得られたクローンのＣ１１４４４、Ｃ１１４５０、
Ｃ１１４５１によりｎｔ１９８４〜２５６０の塩基配列
を決定した。
ｎｔ１８〜８４３についてはプライマー＃４４（５′−
ＧＧＣＧＡＣＡＣＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＴ−３′）と
＃２５（５′−ＴＣＣＣＴＧＴＴＧＣＡＴＡＧＴＴＣＡ
ＣＧ−３′）を用いたＰＣＲによって得られたクローン
Ｃ２５０３、Ｃ２５０８、及びＣ２５１０によって決め
られた。さらに上流の５′末端は、ＨＣ−Ｊ４と同様の
方法により得られた１６個のクローン、Ｃ８９３１、Ｃ
８９３２、Ｃ８９３５、Ｃ８９３７、Ｃ８９４２、Ｃ８
９４４、Ｃ８９４９、Ｃ８９５０、Ｃ８９５１、Ｃ８９
５４、Ｃ８９５５、Ｃ９０２３、Ｃ９０２６、Ｃ９０３
０、Ｃ９０３１、Ｃ９０３２を用いて、ｎｔ１〜３７の
塩基配列を決めた。次にＨＣ−Ｊ１の５′末端側下流の
塩基配列を決定するため、プライマー＃１４８（５′−
ＴＧＣＡＣＣＴＧＧＡＴＧＡＡＣＴＣＡＡＣ−３′）と
＃１４６（５′−ＡＧＴＡＧＣＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＡ
ＧＣＡ−３′）を用いて３０サイクルのＰＣＲを行っ
た。得られたクローンのＣ１１４４４、Ｃ１１４５０、
Ｃ１１４５１によりｎｔ１９８４〜２５６０の塩基配列
を決定した。
【００１５】（５）ｃＤＮＡライブラリーの構築による
３′末端側塩基配列の決定 ＨＣ−Ｊ１ゲノムの３′末端側の塩基配列は図３に示す
ように、ＰＣＲにて増幅して得られたクローンの解析結
果により決定した。ｎｔ８２５９〜９１９６の９３８塩
基の配列については各検体をプライマー＃８０（５′−
ＧＡＣＡＣＣＣＧＣＴＧＴＴＴＴＧＡＣＴＣ−３′）お
よび＃６０（５′−ＧＴＴＣＴＴＡＣＴＧＣＣＣＡＧＴ
ＴＧＡＡ−３′）を用いたＰＣＲにかけ、得られたＣ７
３９１、Ｃ７３４３、Ｃ７３７７の３クローンの塩基配
列から決定した。ｎｔ９１５６より下流の３′末端側塩
基配列は以下の方法に従って決定した。すなわち、各検
体より前記（１）記載の方法に従ってＲＮＡを抽出し、
ポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いてＲＮＡの３′末端にポ
リ（Ａ）を付加した。オリゴ（ｄｔ）２０をプライマー
としてｃＤＮＡ合成を行い、得られたｃＤＮＡをテンプ
レートとしてＰＣＲに供した。ＰＣＲは第１段階として
センスプライマーとして各株ｃＤＮＡに特異的な２０マ
ーオリゴヌクレオチドを、アンチセンスプライマーとし
てオリゴ（ｄｔ）２０を用いて行った、次に、得られた
ｃＤＮＡを第２段階ＰＣＲとして第１段階より下流に相
当する特異センスプライマーを、アンチセンスプライマ
ーとしてオリゴ（ｄｔ）２０を用いて行った。２段階の
ＰＣＲで得られた増幅産物にＴ４ＤＮＡポリラーゼを作
用させ両端を平滑にした後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼにて５′末端をリン酸化し、Ｍ１３ｍｐ１９ファー
ジベクターのＨｉｎｃＩＩ部位にサブクローニングして
塩基配列を決定した。
３′末端側塩基配列の決定 ＨＣ−Ｊ１ゲノムの３′末端側の塩基配列は図３に示す
ように、ＰＣＲにて増幅して得られたクローンの解析結
果により決定した。ｎｔ８２５９〜９１９６の９３８塩
基の配列については各検体をプライマー＃８０（５′−
ＧＡＣＡＣＣＣＧＣＴＧＴＴＴＴＧＡＣＴＣ−３′）お
よび＃６０（５′−ＧＴＴＣＴＴＡＣＴＧＣＣＣＡＧＴ
ＴＧＡＡ−３′）を用いたＰＣＲにかけ、得られたＣ７
３９１、Ｃ７３４３、Ｃ７３７７の３クローンの塩基配
列から決定した。ｎｔ９１５６より下流の３′末端側塩
基配列は以下の方法に従って決定した。すなわち、各検
体より前記（１）記載の方法に従ってＲＮＡを抽出し、
ポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いてＲＮＡの３′末端にポ
リ（Ａ）を付加した。オリゴ（ｄｔ）２０をプライマー
としてｃＤＮＡ合成を行い、得られたｃＤＮＡをテンプ
レートとしてＰＣＲに供した。ＰＣＲは第１段階として
センスプライマーとして各株ｃＤＮＡに特異的な２０マ
ーオリゴヌクレオチドを、アンチセンスプライマーとし
てオリゴ（ｄｔ）２０を用いて行った、次に、得られた
ｃＤＮＡを第２段階ＰＣＲとして第１段階より下流に相
当する特異センスプライマーを、アンチセンスプライマ
ーとしてオリゴ（ｄｔ）２０を用いて行った。２段階の
ＰＣＲで得られた増幅産物にＴ４ＤＮＡポリラーゼを作
用させ両端を平滑にした後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼにて５′末端をリン酸化し、Ｍ１３ｍｐ１９ファー
ジベクターのＨｉｎｃＩＩ部位にサブクローニングして
塩基配列を決定した。
【００１６】ＰＣＲに用いた２種類のプライマーと得ら
れたクローンを以下に示す。 ＨＣ−Ｊ１ ＃１００（５′−ＡＡＧＧＣＴＧＣＣＡＴＡＴＧＴＧＧ
ＣＡＡ−３′） ＃９１（５′−ＧＣＣＡＴＡＴＧＴＧＧＣＡＡＧＴＡＣ
ＣＴ−３′） クローン：Ｃ９７０７、Ｃ９７１４、Ｃ９７１９、Ｃ９
７２４、Ｃ９７２６、Ｃ９７３０、Ｃ９７３７、Ｃ９７
３８、Ｃ９７４１、Ｃ９７４２、Ｃ９７４６、Ｃ９９２
５、Ｃ９９３６、Ｃ９９４３、Ｃ９９４５、Ｃ９９４９
れたクローンを以下に示す。 ＨＣ−Ｊ１ ＃１００（５′−ＡＡＧＧＣＴＧＣＣＡＴＡＴＧＴＧＧ
ＣＡＡ−３′） ＃９１（５′−ＧＣＣＡＴＡＴＧＴＧＧＣＡＡＧＴＡＣ
ＣＴ−３′） クローン：Ｃ９７０７、Ｃ９７１４、Ｃ９７１９、Ｃ９
７２４、Ｃ９７２６、Ｃ９７３０、Ｃ９７３７、Ｃ９７
３８、Ｃ９７４１、Ｃ９７４２、Ｃ９７４６、Ｃ９９２
５、Ｃ９９３６、Ｃ９９４３、Ｃ９９４５、Ｃ９９４９
【００１７】（６）ｃＤＮＡライブラリーの構築による
ｎｔ２５６１〜ｎｔ８２１８塩基配列の決定 ｎｔ２５６１から下流の塩基配列は、図４に示すように
ｃＤＮＡをＰＣＲにて増幅して得られたクローンの解析
結果により特定した。ＨＣ−Ｊ１血清から得たＲＮＡに
ついて、種々のアンチセンスプライマーを用いて、前記
（２）および（３）の方法に従ってｃＤＮＡを合成した
のちＰＣＲ増幅を行なった。得られたＰＣＲ産物をＭ１
３ファージベクターにサブクローニングし、得られた複
数クローンのコンセンサスシークエンスから塩基配列を
特定した。各増幅領域について、以下にｃＤＮＡ合成を
用いたプライマーとＰＣＲ増幅に用いたプライマー、お
よび得られたクローンの番号を示す。ｃＤＮＡ作成は、
各領域を増幅するのに用いるアンチセンスプライマーを
用いて行なった。なおアルファベットで示した増幅領域
の各記号は図４に対応する。 領域ａ ｎｔ２４２１−３０４６（６２６ｂｐ） センス ：＃１６０（５´−ＣＡＧＡＡＣＡＴＣＧ
ＴＧＧＡＣＧＴＧＣＡ−３´） アンチセンス： ＃１３（５´−ＡＧＡＡＴＣＣＡＡＡ
ＧＧＧＧＴＣＣＧＡＡ−３´） クローン ：Ｃ１６８３１、Ｃ１６８３２、Ｃ１６８
３３ 領域ｂ ｎｔ２９８９−３９３８（９５０ｂｐ） センス ：＃２７１（５´−ＣＴＣＴＧＧＴＡＴＴ
ＴＧＡＣＡＴＣＡＣＣ−３´） アンチセンス： ＃１４（５´−ＣＴＣＣＡＣＡＧＧＧ
ＡＴＡＡＡＧＴＣＣＡ−３´） クローン ：Ｃ１７２６２、Ｃ１７２６３、Ｃ１７２
６４ 領域ｃ ｎｔ３８９４−４７２３（８３０ｂｐ） センス ：＃２７２（５´−ＴＧＣＡＣＣＣＧＴＧ
ＧＡＧＴＧＧＣＴＡＡ−３´） アンチセンス： ＃１５（５´−ＧＴＣＴＧＧＧＴＧＡ
ＣＡＣＡＣＧＴＡＴＴ−３´） クローン ：Ｃ１６８５６、Ｃ１６８５７、Ｃ１６８
５８ 領域ｄ ｎｔ４６８３−５０５０（３６８ｂｐ） センス ：＃２０９（５´−ＴＴＣＧＡＣＴＣＣＧ
ＴＧＡＴＣＧＡＣＴＧ−３´） アンチセンス：＃２１０（５´−ＧＣＡＴＣＴＡＴＧＴ
ＧＴＧＴＧＡＧＧＣＣ−３´） クローン ：Ｃ１４０９７、Ｃ１４０９８、Ｃ１４１
０４ 領域ｅ ｎｔ４９１４−５７３７（８２４ｂｐ） センス ： ＃２４（５´−ＴＧＴＧＣＴＴＧＧＴ
ＡＴＧＡＧＣＴＣＡＣ−３´） アンチセンス： ＃１６（５´−ＣＴＧＧＴＧＡＣＡＧ
ＣＡＧＣＴＧＴＡＡＡ−３´） クローン ：Ｃ１６９７１、Ｃ１６９７２、Ｃ１６９
７３ 領域ｆ ｎｔ５４４８−６６５５（１２０８ｂｐ） センス ： ＃２２（５´−ＣＧＡＧＡＧＴＴＣＧ
ＡＴＧＡＧＡＴＧＧＡ−３´） アンチセンス： ＃１８（５´−ＡＴＡＣＣＣＧＴＣＡ
ＣＧＴＡＧＴＧＧＡＡ−３´） クローン ：Ｃ１６９９１、Ｃ１６９９３、Ｃ１６９
９４ 領域ｇ ｎｔ６５９１−７４９８（９０８ｂｐ） センス ：＃２７０（５´−ＡＧＧＧＴＧＴＣＴＧ
ＣＡＧＡＧＧＡＡＴＡ−３´） アンチセンス：＃２７４（５´−ＧＡＡＴＡＧＧＡＣＴ
ＣＡＧＣＧＴＣＧＧＡ−３´） クローン ：Ｃ１７４３５、Ｃ１７４３６、Ｃ１７４
３７ 領域ｈ ｎｔ７３２３−８６３５（１３１３ｂｐ） センス ： ＃７２（５´−ＣＧＧＡＡＧＡＡＧＣ
ＧＧＡＣＧＧＴＧＧＴ−３´） アンチセンス： ＃８１（５´−ＣＴＡＧＴＣＡＴＡＧ
ＣＣＴＣＣＧＴＧＡＡ−３´） クローン ：Ｃ１７２２１、Ｃ１７０３２、Ｃ１７０
３３
ｎｔ２５６１〜ｎｔ８２１８塩基配列の決定 ｎｔ２５６１から下流の塩基配列は、図４に示すように
ｃＤＮＡをＰＣＲにて増幅して得られたクローンの解析
結果により特定した。ＨＣ−Ｊ１血清から得たＲＮＡに
ついて、種々のアンチセンスプライマーを用いて、前記
（２）および（３）の方法に従ってｃＤＮＡを合成した
のちＰＣＲ増幅を行なった。得られたＰＣＲ産物をＭ１
３ファージベクターにサブクローニングし、得られた複
数クローンのコンセンサスシークエンスから塩基配列を
特定した。各増幅領域について、以下にｃＤＮＡ合成を
用いたプライマーとＰＣＲ増幅に用いたプライマー、お
よび得られたクローンの番号を示す。ｃＤＮＡ作成は、
各領域を増幅するのに用いるアンチセンスプライマーを
用いて行なった。なおアルファベットで示した増幅領域
の各記号は図４に対応する。 領域ａ ｎｔ２４２１−３０４６（６２６ｂｐ） センス ：＃１６０（５´−ＣＡＧＡＡＣＡＴＣＧ
ＴＧＧＡＣＧＴＧＣＡ−３´） アンチセンス： ＃１３（５´−ＡＧＡＡＴＣＣＡＡＡ
ＧＧＧＧＴＣＣＧＡＡ−３´） クローン ：Ｃ１６８３１、Ｃ１６８３２、Ｃ１６８
３３ 領域ｂ ｎｔ２９８９−３９３８（９５０ｂｐ） センス ：＃２７１（５´−ＣＴＣＴＧＧＴＡＴＴ
ＴＧＡＣＡＴＣＡＣＣ−３´） アンチセンス： ＃１４（５´−ＣＴＣＣＡＣＡＧＧＧ
ＡＴＡＡＡＧＴＣＣＡ−３´） クローン ：Ｃ１７２６２、Ｃ１７２６３、Ｃ１７２
６４ 領域ｃ ｎｔ３８９４−４７２３（８３０ｂｐ） センス ：＃２７２（５´−ＴＧＣＡＣＣＣＧＴＧ
ＧＡＧＴＧＧＣＴＡＡ−３´） アンチセンス： ＃１５（５´−ＧＴＣＴＧＧＧＴＧＡ
ＣＡＣＡＣＧＴＡＴＴ−３´） クローン ：Ｃ１６８５６、Ｃ１６８５７、Ｃ１６８
５８ 領域ｄ ｎｔ４６８３−５０５０（３６８ｂｐ） センス ：＃２０９（５´−ＴＴＣＧＡＣＴＣＣＧ
ＴＧＡＴＣＧＡＣＴＧ−３´） アンチセンス：＃２１０（５´−ＧＣＡＴＣＴＡＴＧＴ
ＧＴＧＴＧＡＧＧＣＣ−３´） クローン ：Ｃ１４０９７、Ｃ１４０９８、Ｃ１４１
０４ 領域ｅ ｎｔ４９１４−５７３７（８２４ｂｐ） センス ： ＃２４（５´−ＴＧＴＧＣＴＴＧＧＴ
ＡＴＧＡＧＣＴＣＡＣ−３´） アンチセンス： ＃１６（５´−ＣＴＧＧＴＧＡＣＡＧ
ＣＡＧＣＴＧＴＡＡＡ−３´） クローン ：Ｃ１６９７１、Ｃ１６９７２、Ｃ１６９
７３ 領域ｆ ｎｔ５４４８−６６５５（１２０８ｂｐ） センス ： ＃２２（５´−ＣＧＡＧＡＧＴＴＣＧ
ＡＴＧＡＧＡＴＧＧＡ−３´） アンチセンス： ＃１８（５´−ＡＴＡＣＣＣＧＴＣＡ
ＣＧＴＡＧＴＧＧＡＡ−３´） クローン ：Ｃ１６９９１、Ｃ１６９９３、Ｃ１６９
９４ 領域ｇ ｎｔ６５９１−７４９８（９０８ｂｐ） センス ：＃２７０（５´−ＡＧＧＧＴＧＴＣＴＧ
ＣＡＧＡＧＧＡＡＴＡ−３´） アンチセンス：＃２７４（５´−ＧＡＡＴＡＧＧＡＣＴ
ＣＡＧＣＧＴＣＧＧＡ−３´） クローン ：Ｃ１７４３５、Ｃ１７４３６、Ｃ１７４
３７ 領域ｈ ｎｔ７３２３−８６３５（１３１３ｂｐ） センス ： ＃７２（５´−ＣＧＧＡＡＧＡＡＧＣ
ＧＧＡＣＧＧＴＧＧＴ−３´） アンチセンス： ＃８１（５´−ＣＴＡＧＴＣＡＴＡＧ
ＣＣＴＣＣＧＴＧＡＡ−３´） クローン ：Ｃ１７２２１、Ｃ１７０３２、Ｃ１７０
３３
【００１８】（７）塩基配列及びアミノ酸配列の決定 以上の方法により得られた各領域のコンセンサスシーク
エンスを基に、ＨＣ−Ｊ１ゲノムの全配列に相当するｃ
ＤＮＡ塩基配列を配列番号２のように決定した。また、
これよりゲノムＲＮＡの塩基配列を配列番号１のように
決定した。ＨＣ−Ｊ１ゲノムによりコードされるアミノ
酸配列は、特許出願平３−１９６１７５に示されるＨＣ
Ｖのオープンリーディングフレームより配列番号３に示
される配列であると特定された。
エンスを基に、ＨＣ−Ｊ１ゲノムの全配列に相当するｃ
ＤＮＡ塩基配列を配列番号２のように決定した。また、
これよりゲノムＲＮＡの塩基配列を配列番号１のように
決定した。ＨＣ−Ｊ１ゲノムによりコードされるアミノ
酸配列は、特許出願平３−１９６１７５に示されるＨＣ
Ｖのオープンリーディングフレームより配列番号３に示
される配列であると特定された。
【００１９】
【効果】本発明はＣ型肝炎ウィルス遺伝子ＨＣ−Ｊ１／
ＲＮＡの全塩基配列を解明したことにもとづくものであ
って、ＨＣＶの改良された検査方法を開発したものであ
り、本発明のヌクレオチドやペプタイドは、直接または
間接にこの検査方法に供することができる。
ＲＮＡの全塩基配列を解明したことにもとづくものであ
って、ＨＣＶの改良された検査方法を開発したものであ
り、本発明のヌクレオチドやペプタイドは、直接または
間接にこの検査方法に供することができる。
【００２０】
【００２１】
【００２２】
【図１】は、ＨＣ−Ｊ１ゲノムの５´末端側塩基配列を
決定する方法。
決定する方法。
【図２】は、ＨＣ−Ｊ４ゲノムの５´末端側塩基配列を
決定する方法。上記両図中、実線はバクテリオファージ
λｇｔ１０のライブラリーによって得たクローンで塩基
配列を決定した範囲、点線はＰＣＲによって得たクロー
ンで塩基配列を決定した範囲を各々示し、クローン名は
線の横に、使用したプライマーは線の上に示した。
決定する方法。上記両図中、実線はバクテリオファージ
λｇｔ１０のライブラリーによって得たクローンで塩基
配列を決定した範囲、点線はＰＣＲによって得たクロー
ンで塩基配列を決定した範囲を各々示し、クローン名は
線の横に、使用したプライマーは線の上に示した。
【図３】は、ＨＣ−Ｊ１ゲノムの３´末端側塩基配列を
決定する方法。図中、点線はＰＣＲによって得たクロー
ンで塩基配列を決定した範囲を示し、クローン名を線の
横に、使用したプライマーを線の上に示した。
決定する方法。図中、点線はＰＣＲによって得たクロー
ンで塩基配列を決定した範囲を示し、クローン名を線の
横に、使用したプライマーを線の上に示した。
【図４】は、ＨＣ−Ｊ１ゲノムのｎｔ２５６１〜ｎｔ８
２１８塩基配列を決定する方法。図中、四角はＰＣＲに
よって得たクローンで塩基配列を決定した領域を示し、
各領域の範囲を塩基番号により示した。
２１８塩基配列を決定する方法。図中、四角はＰＣＲに
よって得たクローンで塩基配列を決定した領域を示し、
各領域の範囲を塩基番号により示した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/576 Ｚ 8310−2Ｊ // Ｃ１２Ｑ 1/70 7823−4Ｂ
Claims (17)
- 【請求項１】配列番号１記載の塩基配列を有するポリヌ
クレオチド。 - 【請求項２】請求項１記載のポリヌクレオチドと相補的
な塩基配列を有するポリヌクレオチド - 【請求項３】Ｃ型肝炎ウィルス遺伝子ＨＣ−Ｊ１／ＲＮ
Ａである請求項１記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項４】Ｃ型肝炎ウィルス遺伝子ＨＣ−Ｊ１／ＲＮ
Ａと相補的な塩基配列を有するＨＣ−Ｊ１／ＲＮＡＣで
ある請求項２記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項５】配列番号２記載の塩基配列を有するポリヌ
クレオチド。 - 【請求項６】請求項５記載のポリヌクレオチドと相補的
な塩基配列を有するポリヌクレオチド。 - 【請求項７】Ｃ型肝炎ウィルス遺伝子ＨＣ−Ｊ１／ｃＤ
ＮＡである請求項５記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項８】Ｃ型肝炎ウィルス遺伝子ＨＣ−Ｊ１／ＤＮ
ＡＣである請求項６記載のポリヌクレオチド - 【請求項９】請求項３、４、７または８記載の遺伝子の
一部に特異性を有するオリゴヌクレオチド。 - 【請求項１０】請求項３または４、７ないし９記載の遺
伝子またはオリゴヌクレオチドを宿主細胞に組み込んで
得られる蛋白質またはペプタイド。 - 【請求項１１】配列番号３記載のＣ型肝炎ウィルス蛋白
質ＨＣ−Ｊ１／Ｐｒｏｔｅｉｎ。 - 【請求項１２】配列番号３記載の蛋白質を構成する部分
ペプタイド。 - 【請求項１３】請求項９記載のオリゴヌクレオチドから
なるプライマーまたはプローブ。 - 【請求項１４】請求項１３記載のプライマーを用いて核
酸を増幅することを特徴とするＣ型肝炎ウイルス検出方
法。 - 【請求項１５】請求項１０ないし１２記載の蛋白質また
はペプタイドを用いることを特徴とするＣ型肝炎ウイル
ス特異抗体の検出方法。 - 【請求項１６】請求項１０ないし１２記載の蛋白質また
はペプタイドを動物に免疫して得られるモノクローナル
抗体またはポリクローナル抗体。 - 【請求項１７】請求項１６記載の抗体を用いることを特
徴とするＣ型肝炎ウイルス特異抗原の検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5345753A JPH06284887A (ja) | 1992-12-10 | 1993-12-10 | Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプタイ ドならびに検出法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP36070592 | 1992-12-10 | ||
| JP4-360705 | 1992-12-10 | ||
| JP5345753A JPH06284887A (ja) | 1992-12-10 | 1993-12-10 | Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプタイ ドならびに検出法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06284887A true JPH06284887A (ja) | 1994-10-11 |
Family
ID=26578093
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5345753A Pending JPH06284887A (ja) | 1992-12-10 | 1993-12-10 | Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプタイ ドならびに検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06284887A (ja) |
-
1993
- 1993-12-10 JP JP5345753A patent/JPH06284887A/ja active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5428145A (en) | Non-A, non-B, hepatitis virus genome, polynucleotides, polypeptides, antigen, antibody and detection systems | |
| US7728121B2 (en) | Hepatitis-C virus type 4, 5 and 6 | |
| HU220204B (hu) | HCV polipeptidek és HCV polinukleotidok, ilyen polinukleotidokat tartalmazó vektorok és ezekkel transzformált gazdasejtek, valamint HCV fertőzés kimutatására szolgáló diagnosztikumok és immunvizsgálati készlet | |
| JPH05500155A (ja) | Ｎａｎｂｖの診断用薬 | |
| JPH09187285A (ja) | 新規のｈｃｖ分離株 | |
| CA2111108A1 (en) | Hepatitis c diagnostics and vaccines | |
| JPH06107687A (ja) | 抗ウイルス剤 | |
| EP0423239A1 (en) | Post-transfusion, non-a, non-b hepatitis virus and antigens | |
| EP0532258A2 (en) | Oligonucleotides and determination system of HCV genotypes | |
| EP0633320A1 (en) | Oligonucleotides of HCV, primers ND probes therefrom, method of determining HCV genotypes and method of detecting HVC in samples | |
| TWI240005B (en) | Methods for detecting an HBV-derived nucleic acid target sequence | |
| JP2002027990A (ja) | Ｃ型肝炎ウイルスのｎｓ３領域からの組換え抗原 | |
| EP0532167A2 (en) | Non-A, Non-B Hepatitis virus genome, polynucleotides, polypeptides, antigen, antibody and detection systems | |
| CA2055149A1 (en) | Non-a, non-b hepatitis virus related antigen, antibody, detection systems, polynucleotides and polypeptides | |
| JPS61500053A (ja) | Ａ肝炎ウィルス配列順を表すｃＤＮＡの生成 | |
| Petrik et al. | High throughput PCR detection of HCV based on semiautomated multisample RNA capture | |
| US5061623A (en) | Peptides comprising an immunogenic site of poliovirus and dnas containing nucleotide sequences coding for these peptides | |
| JPH0928386A (ja) | 非ａ非ｂ非ｃ非ｄ非ｅ型肝炎試薬及びそれらの使用方法 | |
| JPH06319563A (ja) | Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子、オリゴヌクレオチド、並びにｃ型 肝炎ウイルス遺伝子型判定方法 | |
| JP2598596B2 (ja) | Ｃ型肝炎ウイルスの蛋白質に由来するポリペプチド、該ポリペプチドを含有するテストキットおよびｃ型肝炎ウイルス感染予防ワクチン | |
| JPH06284887A (ja) | Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプタイ ドならびに検出法 | |
| JP4080995B2 (ja) | 日本人からのｅ型肝炎ウイルスに由来するポリヌクレオチドプローブおよびプライマー、それらを有するチップ、それらを有するキット、並びにそれらによるｅ型肝炎ウイルスを検出する方法 | |
| EP1010759B1 (en) | Non-b non-c non-g hepatitis virus gene, polynucleotide, polypeptide, virion, method for separating virion, and method for detecting virus | |
| JP3268502B2 (ja) | 非ａ非ｂ型肝炎ウイルス関連ポリヌクレオチド、ポリペプ タイド | |
| US6849431B2 (en) | Non-B, non-C, non-G hepatitis virus gene, polynucleotide, polypeptide, virus particle, method for isolating virus particle, and method for detecting virus |