JPH0625298A - 多包虫由来の抗原並びにそれを用いた診断用試薬及び診断方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 多包虫由来の粗抗原物質中に存在する、ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動法によって測定
された分子量が１８キロダルトン及び１６キロダルトン
である特定抗原蛋白質。 【効果】 上記抗原蛋白質は、多包虫症患者で治療を要
する活性型病巣をもつ患者と既に治癒した不活性型病巣
をもつ患者との鑑別のための診断用試薬として有用であ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、多包虫由来の特定抗原
蛋白質、並びにそれを指標として用いる多包虫症患者の
診断用試薬及び診断方法に関する。

【０００２】

【従来の技術と課題】包虫症（エキノコックス症）は、
単包虫症と多包虫症とに分類され、人畜共通寄生蠕虫病
として最も致死率の高い疾病である。このうち、多包虫
症は、北半球全域、即ち、全ヨーロッパから日本を含む
極東地域、アラスカ、カナダ、アメリカ北部で年々患者
の増加が深刻化している。日本では、北海道の一部の地
域に限局された風土病として１９３７年以来知られてい
たが、現在では、北海道全域が汚染されていることが判
明し、一部東北地方での汚染報告もあり、外国同様に年
々深刻化してきている。

【０００３】多包虫の中間宿主は野ネズミであり、終宿
主はキタキツネ、イヌで、小腸に寄生する。ヒトへの感
染は、キタキツネ、イヌが排出した虫卵を何らかのかた
ちで経口摂取して起きる。経口摂取された虫卵は、主に
肝臓に包虫を形成する。包虫は肝臓以外にも肺、脳、脾
臓、骨にも形成される。発育は緩慢であり、潜伏期が１
０年以上におよび、外生出芽による小嚢包の集まりとし
ての多包化が進み、腫瘍様の病巣になり、肝癌と誤診さ
れることが多い。末期には肝障害が進行し、門脈圧亢進
症状を伴って、全身状態が悪化し、肝性昏睡で死亡する
ことが多い。

【０００４】多包虫症は、症状の出現が遅いため、現在
の血清学的検査やＸ線撮影、ＣＴ、肝超音波断層などに
よる検診で、診断がついた時点では、殆ど例外なく手遅
れであると言われている。唯一の根治的治療法である外
科的摘出でも、術後の生存率は非常に低いと言われてい
る。一方、予防は、感染源である虫卵が飲料水・食物に
混入することへの注意、虫卵をばらまく動物との接点を
断つことなどが重要である。しかし、この寄生虫病は、
病巣を作るまで通常１０年以上経過する点で、早期診
断、早期治療が強く叫ばれている。

【０００５】ところで、現在までに、ＷＨＯが評価して
いる唯一の血清学的診断法は、多包虫由来の粗抗原物質
を用いるＥｍ２−ＥＬＩＳＡ法と呼ばれている方法であ
る。しかし、多包虫に感染することにより一旦生じた抗
体は患者体内に長期にわたって保持されるため、この検
査では、多包虫に一度感染したことのある患者は完治し
ていても全例が陽性になるという難点がある。そのた
め、この検査による陽性者全員が治療を必要とする訳は
なく、Ｘ線撮影、超音波検査、ＣＴ、その他煩雑な血清
学的検査を施行した後に、総合的に診断を下しているの
が現状である。実際に、Ｅｍ２−ＥＬＩＳＡ法陽性患者
で開腹手術を施したが、自然治癒していたケースがかな
り報告されている。つまり、治療を要する活性型病巣と
自然治癒した不活性型病巣との鑑別が不可能であること
が指摘され始めている。治療を要する活性型病巣と既に
治癒した不活性型病巣との鑑別は、患者に無用の生命の
危険を伴いかねない外科手術を強要する愚を避けるため
に必要である。

【０００６】また、最近、ベンズイミダゾール系薬物
（アルベンダゾール等）を用いる化学療法によって、完
治した症例、著効を示した症例、全く効果が見られなか
った症例が報告され、化学療法の適用基準となる病態の
指標が探索されている。それ故、患者の病状（病態）を
判断し、活性型病巣と不活性型病巣の有無を確実に鑑別
出来るシステム（診断薬、診断キット、診断システム）
を開発することができれば、外科的療法、化学的療法を
含む治療指針の確立、予後モニタリングが可能となり、
その恩恵は計り知れないものがある。

【０００７】

【発明の開示】本発明者らは、多包虫症患者で活性型病
巣を持つ患者と不活性型病巣を持つ患者とを判断すべ
く、これら患者の血清中の特異性抗体に着目し、多包虫
由来の抗原物質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動後、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に
転写し、それを、多包虫症患者で活性型病巣又は不活性
型病巣を持つ血清と反応させ、或いは多包虫症患者で活
性型病巣を持つ患者の病巣が治癒と共に不活性型病巣に
変わって行く時、経時的にその患者の血清と反応させ、
活性型病巣を持つ患者の血清には存在し、不活性型病巣
を持つ患者の血清には存在しない特異的抗体、または活
性型病巣を持つ時の血清には存在し、治癒と共に不活性
型病巣を持つ時の血清には存在しなくなっていく特異的
抗体の有無を詳細に調べた。

【０００８】その結果、そのような特異的抗体が存在す
ることが判明し、かかる特異的抗体を利用して多包虫由
来の粗抗原物質の中から、治療を要する活性型病巣と既
に治癒した不活性型病巣の鑑別の指標となり得る２種類
の抗原性蛋白質を見い出した。

【０００９】かくして、本発明によれば、 (1) 下記第１表に示すアミノ酸組成を有し且つＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって測定した分
子量が約１８キロダルトンである多包虫由来の蛋白質
（以下、抗原蛋白−Ｉという）。

【００１０】

【表３】 第 １ 表 ────────────────────── アミノ酸 モル％ ────────────────────── アスパラギン酸 ９.８７±０.２０ スレオニン ４.３１±０.１９ セリン ５.９２±０.７３ グルタミン酸 １２.５６±０.２３ グリシン ８.４０±０.３９ アラニン ８.４０±０.２０ バリン ７.０６±０.１５ ¹/₂−シスチン ０.９０±０.０８ メチオニン ２.５２±０.０４ イソロイシン ４.９２±０.１３ ロイシン ９.８４±０.１７ チロシン ３.２４±０.０８ フエニルアラニン ４.２６±０.０８ リシン ５.４９±０.１３ ヒスチジン １.７２±０.１０ アルギニン ４.１８±０.０９ プロリン ５.１７±０.１３ トリプトフアン １.２３±０.０８ ────────────────────── 計 １００.００ ────────────────────── (2) 下記第２表に示すアミノ酸組成を有し且つＳＤＳ−
ポリアクリルアミド電気泳動法によって測定した分子量
が約１６キロダルトンである多包虫由来の蛋白質（以
下、抗原蛋白−ＩＩという）。

【００１１】

【表４】 第 ２ 表 ────────────────────── アミノ酸 モル％ ────────────────────── アスパラギン酸 １０.９３±０.２２ スレオニン ５.００±０.２２ セリン ６.０５±０.７４ グルタミン酸 １２.００±０.２２ グリシン ６.７１±０.３１ アラニン ６.７１±０.１６ バリン ７.７９±０.１６ ¹/₂−シスチン １.０３±０.０９ メチオニン ２.９４±０.０５ イソロイシン ４.９６±０.１３ ロイシン ９.９５±０.１７ チロシン ３.１６±０.０８ フエニルアラニン ４.５３±０.０９ リシン ６.８５±０.１６ ヒスチジン １.６９±０.１０ アルギニン ４.８３±０.１１ プロリン ４.０９±０.１０ トリプトフアン ０.７８±０.０５ ────────────────────── 計 １００.００ ────────────────────── が提供される。

【００１２】本発明により提供される上記抗原蛋白−Ｉ
及び抗原蛋白−ＩＩを用いて、多包虫症患者の血清中の
抗体を調べると、治療を要する活性型病巣を持つ患者と
治癒した患者又は不活性型病巣を持つ患者では、これら
の抗原に対する特異抗体の応答が全く異なることがわか
った。しかも、抗原蛋白−Ｉに対する抗体応答が認めら
れるが抗原蛋白−ＩＩに対する抗体応答が認められない
患者は、活動型初期の病巣を持っており、更に抗原蛋白
−Ｉのみならず抗原蛋白−ＩＩに対する抗体応答も同時
に認められる患者は、活動型末期の病巣を持っているこ
とが判明した。

【００１３】従って、本発明の抗原蛋白−Ｉ又は−ＩＩ
を用いれば、単に、現在又は過去の多包虫感染の有無の
判定が可能であるばかりでなく、活性型病巣を持つ患者
と既に治癒した患者又は不活性型病巣を持つ患者との判
別が可能となり、しかも抗原蛋白−Ｉと抗原蛋白−ＩＩ
をうまく併用することにより、多包虫症患者の病態の進
行状況をも判定することが可能となる。

【００１４】しかして、本発明の抗原蛋白−Ｉ及び−Ｉ
Ｉを臨床診断に用いた場合の一例を示せば、下記第３表
及び第４表に要約するとおりである。下記表にはＷＨＯ
が評価しているＥｍ２−ＥＬＩＳＡ法の結果も併せて示
す。

【００１５】

【表５】第３表：治療前における抗体応答を指標とする患者の分類 治療前の抗体応答 Em-2 抗原蛋白 症状 治療 患者 抗原 Ｉ ＩＩ ────────────────────────────── １ − − − 健常者 不要 ２ ＋ − − 既往歴有、自然治癒 不要¹⁾ ３ ＋ ＋ − 初期の活動型 要²⁾ ４ ＋ ＋ ＋ 進行型 要³⁾ ────────────────────────────── 注：１）定期的に検査する必要がある。

【００１６】２）軽度。

【００１７】３）重度。

【００１８】

【表６】第４表：治療後における抗体応答を指標とする患者の分類 治療後の抗体応答 抗原蛋白 治療 患者 Ｉ ＩＩ ────────────────────── １ ＋ ＋ 継続 ２ ＋ − 継続 ３ − ＋ 継続 ４ − − 不要¹⁾ ────────────────────── 注：１）定期的に検査する必要がある。

【００１９】上記第３表から明らかなように、活動型初
期の病巣を持つ患者（３）は、抗原蛋白−Ｉに対する抗
体応答は陽性であるが、抗原蛋白−ＩＩに対する抗体応
答は陰性である。また、活動型末期（進行型）の病巣を
持つ患者（４）は、抗原蛋白−Ｉ及び−ＩＩのいずれに
対しても陽性である。これにより、病状の進行状況を判
定でき、外科的治療または投薬を必要とすると診断する
ことができる。しかし、前者の患者において、治療の結
果、抗原蛋白−Ｉに対する抗体応答が認められなくなっ
た場合、または、後者の患者で、抗原蛋白−Ｉ及び抗原
蛋白−ＩＩに対する抗体応答が認められなくなった場合
は、活動型の病巣が無くなり、治癒に向かっていると判
定することができる（第４表参照）。

【００２０】本発明により提供される抗原蛋白−Ｉ及び
抗原蛋白−ＩＩは、例えば、次のようにして調製するこ
とができる。

【００２１】あらかじめ多包虫症患者より得られた多包
虫を、例えば、スナネズミの腹腔内に移植し、数ケ月
後、例えば２ケ月後に開腹し、ぶどうの房状になった多
包虫を取り出す。これにデオキシコール酸（濃度：０.
５〜５％、好ましくは１％）を含むリン酸緩衝生理食塩
水を加え、解剖用のハサミで細かく切り刻み、これをホ
モゲナイズした後、更に、デオキシコール酸を含むリン
酸緩衝生理食塩水を加え、超音波を施し、破砕する。こ
れを多包虫粗抗原溶液（多包虫原頭節抗原）とする。

【００２２】次に、この多包虫粗抗原溶液を、例えば、
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた分画
装置(Prep cell Model 491; Bio Rad 社製)にかけ、抗
原蛋白−Ｉ及び抗原蛋白−ＩＩを分離・精製する。この
時のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルのアクリルアミド
の濃度は、４〜２０％、好ましくは１２〜２０％の範囲
内が適当である。

【００２３】あるいは、前記と同様にして得られた多包
虫粗抗原溶液を、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフ
イーあるいはアフイニテイークロマトグラフイーを用い
て精製することもできる。

【００２４】これらの抗原蛋白は、分子量既知の標準蛋
白質を用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法によって測定する時、おのおの分子量は約１８キロダ
ルトン及び約１６キロダルトンであった。

【００２５】また、ニンヒドリン発色分析法によるアミ
ノ酸組成は前記第１表及び第２表に示すとおりであっ
た。

【００２６】さらに、本発明の抗原蛋白−Ｉ及び抗原蛋
白−ＩＩは、遺伝子工学的又はタンパク質工学的に製造
される合成ペプチドであることもできる。

【００２７】本発明の抗原蛋白−Ｉ及び／又は抗原蛋白
−ＩＩは、免疫学的手法によって患者血清中の抗体検出
のための診断用試薬として使用することができる。

【００２８】本発明の抗原蛋白を用いる患者の体液中の
抗体の検出は、免疫学的手法により、具体的には例えば
次の（１）〜（３）に示す方法により行なうことができ
る。

【００２９】(1) 抗原蛋白−Ｉ及び抗原蛋白−ＩＩを、
例えば、リン酸緩衝生理食塩水に溶かし、これを吸着さ
せたポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜を用い
て、イムノブロッティング法で、患者血清を検査する：
まず抗原蛋白−Ｉ及び抗原蛋白−ＩＩをスポットしたＰ
ＶＤＦ膜をブロッキング溶液に浸漬しブロッキングす
る。次に、多包虫症患者の血清をブロッキング溶液で適
当に稀釈した溶液に、ブロッキング済みのＰＶＤＦ膜を
入れ反応させる。反応後、ブロッキング溶液で洗浄し、
ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体をブロッキング
溶液で適当に稀釈した溶液に、多包虫症患者の血清と反
応させたＰＶＤＦ膜を入れ反応させる。反応後、ブロッ
キング溶液で洗浄後、基質溶液に入れ発色させる。反応
後、抗原蛋白−Ｉ及び抗原蛋白−ＩＩのスポットが存在
する場合、抗原蛋白−Ｉ及び抗原蛋白−ＩＩに対する特
異抗体が存在する、つまり、その多包虫症患者が活性型
病巣を持っていると判定し、スポットが見られない場
合、抗原蛋白−Ｉ及び抗原蛋白−ＩＩに対する特異抗体
が存在しない、つまり、その多包虫症患者が不活性型病
巣を持っていると判定する。

【００３０】(2) 抗原蛋白−Ｉ及び抗原蛋白−ＩＩを、
例えば、ＥＬＩＳＡ用９６well plate に吸着させ、患
者の血清を加え、酵素抗体法により、抗体を検出するこ
とができる：まず抗原蛋白−Ｉ及び抗原蛋白−ＩＩを吸
着させたＥＬＩＳＡ用９６well plateの各wellを、ブロ
ッキング溶液で満たしブロッキングする。次に、多包虫
症患者の血清をブロッキング溶液で適当に稀釈した溶液
を、ブロッキング済みのＥＬＩＳＡ用９６well plate
の各wellに入れ反応させる。反応後、ブロッキング溶液
で洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体をブ
ロッキング溶液で適当に稀釈した溶液を、多包虫症患者
の血清と反応させたＥＬＩＳＡ用９６well plateの各w
ellに入れ反応させる。反応後、ブロッキング溶液で洗
浄後、基質溶液に入れ、発色させる。反応後、抗原蛋白
−Ｉ及び抗原蛋白−ＩＩを吸着させたwellで発色が見ら
れた場合、抗原蛋白−Ｉ及び抗原蛋白−ＩＩに対する特
異抗体が存在する、つまり、その多包虫症患者が、活性
型病巣を持っていると判定し、発色が見られない場合、
抗原蛋白−Ｉ及び抗原蛋白−ＩＩに対する特異抗体が存
在しない、つまり、その多包虫症患者が、不活性型病巣
を持っていると判定する。

【００３１】(3) 抗原蛋白−Ｉ及び抗原蛋白−ＩＩを、
例えば、ラテックス粒子に吸着させ、患者の血清を加
え、凝集反応が見られた場合、抗原蛋白−Ｉ及び抗原蛋
白−ＩＩに対する特異抗体が存在する、つまり、その多
包虫症患者が、活性型病巣を持っていると判定し、凝集
反応が見られない場合、抗原蛋白−Ｉ及び抗原蛋白−Ｉ
Ｉに対する特異抗体が存在しない、つまり、その多包虫
症患者が、不活性型病巣を持っていると判定する。

【００３２】本発明による診断用試薬は、通常の免疫学
的検査法に用いられる任意の形態であることができる。
例えば、ＰＶＤＦ膜に吸着させたもの、あるいはＥＬＩ
ＳＡ用９６well plateに吸着させたもの、あるいはラ
テックス粒子に物理的又は化学的に吸着させたものなど
であることができる。

【００３３】次に、本発明を実施例によってさらに具体
的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではな
い。

【００３４】

【実施例】

実施例１：抗原蛋白−Ｉ及び抗原蛋白−ＩＩの分離・精
製 日本において発見された多包虫症患者より得られた多包
虫を、スナネズミ腹腔内に移植した。２ケ月後に凍結処
理済みの動物体内から、ぶどうの房状になった多包虫を
取り出した。まず、１％デオキシコール酸を含むリン酸
緩衝生理食塩水を加え、解剖用のハサミで細かく切り刻
み、これをホモゲナイズした後、更に、デオキシコール
酸を含むリン酸緩衝生理食塩水を加え、超音波処理を施
し破砕した。これを多包虫粗抗原溶液とした。なお、デ
オキシコール酸を含むリン酸緩衝生理食塩水の組成は以
下のとおりである。

【００３５】

【表７】 次に、この多包虫粗抗原溶液をＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を用いた分画装置(Bio Rad 社製：Pre
p cell Model 491 )を用い、抗原蛋白−Ｉ及び抗原蛋白
−ＩＩを分離・精製した。

【００３６】まず、多包虫症粗抗原蛋白１ｍｌとサンプ
ル処理液１ｍｌを混合し、１００℃で５分間加熱処理し
た。なお、サンプル処理液は以下のとおりである。

【００３７】

【表８】 サンプル処理液 蒸留水 １.４ｍｌ ０.５ M Tris/HCl (pH6.8) ２.０ｍｌ Ｇlycerol ２.０ｍｌ １０％ ＳＤＳ ２.０ｍｌ ２−Mercaptoethanol ０.２ｍｌ ０.０５％ Ｂromophenol blue ０.４ｍｌ 次に、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行っ
たが、そのときに用いたポリアクリルアミドゲルまたは
泳動用バッファーの組成は次のとおりである。

【００３８】

【表９】 ポリアクリルアミドゲル 分離ゲル 濃縮ゲル (２０％Ｔ) (４％Ｔ) Ａcrylamide/bis １３.３３ｍｌ ０.６５ｍｌ (30％ T/2.67％C) 蒸留水 １.６１５ｍｌ ３.１ｍｌ １.５ M Tris/HCl (pH8.8) ５ｍｌ − ０.５ M Tris/HCl (pH6.8) − １.２５ｍｌ １０％過硫酸アンモニウム ５０μｌ ２５μｌ ＴＥＭＥＤ ５μｌ ５μｌ 泳動用バッファー Tris(hydroxymethyl)aminoethane ３.０ｇ Ｇlycine １４.４ｇ ＳＤＳ １.０ｇ 蒸留水 １.０ｌ 熱処理した多包虫粗抗原溶液をポリアクリルアミドゲル
の上部にのせ、４０ｍＡの条件で下方に電気泳動をしな
がら、ゲルの下部より分離した物質を回収した。得られ
た各フラクションを平板状ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル（ＴＥＦＣＯ社製：０１−１１３）を用いて電気泳
動にかけた。この時、分子量が既知である標準蛋白質
（Ｂio Ｒad社製：１６１−０３０５）を同時に電気泳
動しておいた。更に、ＰＶＤＦ膜に転写した。転写の条
件は、１５０ｍＡで１時間で行った。ブロッティング溶
液の組成は以下のとおりである。

【００３９】

【表１０】 ブロッティング溶液 Tris(hydroxymethyl)aminoethane ３.０２ｇ Ｇlycine １４.４ｇ Ｍethanil ２００ｍｌ 蒸留水 ２ｌ 転写後、ＰＶＤＦ膜を以下の組成をもつブロッキング溶
液に室温で１時間浸漬し、ブロッキングした。

【００４０】

【表１１】 ブロッキング溶液 Ｃasein １０ｇ ＮaＣl ８.７７ｇ Tris（hydroxymethyl)aminoethane ２.４２３ｇＨＣl（１Ｎ） ６ｍｌ 蒸留水 １ｌ 次に、多包虫症の活性型病巣を持つ患者の血清を前述の
ブロッキング溶液で５０倍稀釈した溶液に、ブロッキン
グしたＰＶＤＦ膜を入れ、室温で１時間振盪した。反応
後、ブロッキング溶液で洗浄し、ペルオキシダーゼ標識
抗ヒトＩｇＧ抗体を前述のブロッキング溶液で１０００
倍稀釈した溶液に、多包虫症の活性型病巣を持つ患者の
血清と反応させたＰＶＤＦ膜を入れ、室温で１時間で振
盪した。反応後、ブロッキング溶液で洗浄後、基質溶液
に入れ、３７℃で３０分間反応して発色させた。基質溶
液の組成は以下のとおりである。

【００４１】基質溶液 Ａ液 ８０％ Ｅthanol １００ｍｌ 4-Chloro-1-naphtol ０.２ｇ Ｂ液 ０.１Ｍリン酸バッファー Ａ液４ｍｌ＋Ｂ液１６ｍｌ＋Ｈ₂Ｏ₂ ４μｌを基質溶液
とする。

【００４２】このようにして得られた結果より、分子量
が既知である標準蛋白質から、分子量約１８キロダルト
ンの抗原蛋白−Ｉ及び分子量約１６キロダルトンの抗原
蛋白−ＩＩを含むフラクションを調べ、回収した。

【００４３】実施例２：抗原蛋白−Ｉ及び抗原蛋白−Ｉ
Ｉのアミノ酸組成の決定 実施例１で得られた抗原蛋白−Ｉ及び抗原蛋白−ＩＩを
前述と同様に、ＴＥＦＣＯ社製の平板状ＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル（２０％）を用いて電気泳動にかけ、
更に、ＰＶＤＦ膜に転写した。転写後のＰＶＤＦ膜の一
部を切り取り、ブロッキング溶液に室温で１時間浸漬
し、多包虫症の活性型病巣を持つ患者の血清を前述のブ
ロッキング溶液で５０倍稀釈した溶液に、ブロッキング
したＰＶＤＦ膜を入れ、室温で１時間振盪した。反応
後、ブロッキング溶液で洗浄し、ペルオキシダーゼ標識
抗ヒトＩｇＧ抗体を前述のブロッキング溶液で１０００
倍稀釈した溶液に、多包虫症の活性型病巣を持つ患者の
血清と反応させたＰＶＤＦ膜を入れ、室温で１時間で振
盪した。反応後、ブロッキング溶液で洗浄後、基質溶液
に入れ、３７℃で３０分間反応して発色させた。このよ
うにして得られた結果より、抗原蛋白−Ｉ及び抗原蛋白
−ＩＩの位置を調べ、残りのＰＶＤＦ膜で抗原蛋白−Ｉ
及び抗原蛋白−ＩＩの存在する部分を切り出し、アミノ
酸組成を求めた。

【００４４】抗原蛋白−Ｉ及び抗原蛋白−ＩＩの吸着し
たＰＶＤＦ膜を蒸留水で３回洗浄後、６Ｎ ＨＣｌ（４
％チオグリコール酸添加）、減圧シール下、１１０℃で
２２時間加水分解処理した。濃縮乾固後、全量を７０μ
ｌに、調製、５０μｌを日立社製のアミノ酸分析計Ｌ−
８５００（ニンヒドリン発色、特殊アミノ酸分析法）に
注入、分析した。

【００４５】その結果は、下記第５表及び第６表に示す
とおりである。

【００４６】

【表１２】 第５表：抗原蛋白−Ｉのアミノ酸組成 ────────────────────── アミノ酸 モル％ ────────────────────── アスパラギン酸 ９.８７ スレオニン ４.３１ セリン ５.９２ グルタミン酸 １２.５６ グリシン ８.４０ アラニン ８.４０ バリン ７.０６ ¹/₂−シスチン ０.９０ メチオニン ２.５２ イソロイシン ４.９２ ロイシン ９.８４ チロシン ３.２４ フエニルアラニン ４.２６ リシン ５.４９ ヒスチジン １.７２ アルギニン ４.１８ プロリン ５.１７ トリプトフアン １.２３ ────────────────────── 計 １００.００ ──────────────────────

【００４７】

【表１３】 第６表：抗原蛋白−ＩＩのアミノ酸組成 ────────────────────── アミノ酸 モル％ ────────────────────── アスパラギン酸 １０.９３ スレオニン ５.００ セリン ６.０５ グルタミン酸 １２.００ グリシン ６.７１ アラニン ６.７１ バリン ７.７９ ¹/₂−シスチン １.０３ メチオニン ２.９４ イソロイシン ４.９６ ロイシン ９.９５ チロシン ３.１６ フエニルアラニン ４.５３ リシン ６.８５ ヒスチジン １.６９ アルギニン ４.８３ プロリン ４.０９ ────────────────────── トリプトフアン ０.７８ ────────────────────── 計 １００.００ 実施例３：健常者及び多包虫症患者血清を用いたイムノ
ブロッティング 実施例１と同様にして得られた抗原蛋白−Ｉ及び抗原蛋
白−ＩＩをＰＶＤＦ膜にスポットし、健常者及び多包虫
症患者の血清と反応させるイムノブロッティングを行っ
た。まず抗原蛋白−Ｉ及び抗原蛋白−ＩＩをスポットし
たＰＶＤＦ膜をブロッキング溶液に浸漬した。次に、健
常者及び多包虫症患者の血清を前述のブロッキング溶液
で５０倍稀釈した溶液に、ブロッキングしたＰＶＤＦ膜
を入れ、１時間振盪した。反応後、ブロッキング溶液で
洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体を前述
のブロッキング溶液で１０００倍稀釈した溶液に、多包
虫症の活性型病巣を持つ患者の血清と反応させたＰＶＤ
Ｆ膜を入れ、１時間振盪した。反応後、ブロッキング溶
液で洗浄後、基質溶液に入れ、３７℃で３０分間反応し
て発色させた。反応後、多包虫粗抗原、抗原蛋白−Ｉ及
び抗原蛋白−ＩＩのスポットが存在する部分を調べた。
下記第７表にその結果を示す。

【００４８】

【表１４】 第７表：多包虫に対する特異抗体の検出 ─────────────────────────────────── 被検者 治療の イムノブロッティングの結果 外科的並びに薬剤 前後 （特異抗体の有無） 治療の必要性 粗抗原 Ｉ ＩＩ ─────────────────────────────────── 健常者 １ − − − ２ − − − ３ ＋ − − ４ − − − ５ ＋ − − 患者 ６ 治療前 ＋ ＋＋ ＋＋ 要 ７ 治療前 ＋ ＋ − 要 ８ 治療前 ＋ ＋＋ ＋＋ 要 ９ 治療前 ＋ ＋ ＋ 要 １０ 治療前 ＋ ＋ − 要 １１ 治療前 ＋ ＋＋ − 要 １２ 治療前 ＋ ＋＋ ＋＋ 要 １３ 治療前 ＋ ＋ ＋ 要 １４ 治療前 ＋ ＋＋ ＋＋ 要 １５ 治療前 ＋ ＋＋ ＋ 要 １６ 治療前 ＋ ＋＋ ＋ 要 １７ 治療前 ＋ ＋ − 要 １８ 治療前 ＋ ＋ − 要 １９ 治療前 ＋ ＋＋ ＋ 要 ２０ 治療前 ＋ ＋＋ ＋＋ 要 ２１ 治療前 ＋ ＋＋ ＋ 要 ２２ 治療前 ＋ − − 不要（自然治癒）¹⁾ ２３ 治療前 ＋ − − 不要（自然治癒）¹⁾ ２４ 治療前 ＋ ＋＋ ＋＋ 要 治療後 ＋ ＋ ＋ 要 治療後 ＋ ＋ − 要 治療後 ＋ − − 不要¹⁾ ２５ 治療前 ＋ ＋ ＋ 要 治療後 ＋ − − 不要¹⁾ ─────────────────────────────────── １） 定期的に検査を続けた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 北国 秀三郎 岐阜県可児市若葉台８−55

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記表に示すアミノ酸組成を有し且つＳ
   ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって測定
   した分子量が約１８キロダルトンである多包虫由来の蛋
   白質。 【表１】 ────────────────────── アミノ酸 モル％ ────────────────────── アスパラギン酸 ９.８７±０.２０ スレオニン ４.３１±０.１９ セリン ５.９２±０.７３ グルタミン酸 １２.５６±０.２３ グリシン ８.４０±０.３９ アラニン ８.４０±０.２０ バリン ７.０６±０.１５ ¹/₂−シスチン ０.９０±０.０８ メチオニン ２.５２±０.０４ イソロイシン ４.９２±０.１３ ロイシン ９.８４±０.１７ チロシン ３.２４±０.０８ フエニルアラニン ４.２６±０.０８ リシン ５.４９±０.１３ ヒスチジン １.７２±０.１０ アルギニン ４.１８±０.０９ プロリン ５.１７±０.１３ トリプトフアン １.２３±０.０８ ────────────────────── 計 １００.００ ──────────────────────
2. 【請求項２】 下記表に示すアミノ酸組成を有し且つＳ
   ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法によって測定した
   分子量が約１６キロダルトンである多包虫由来の蛋白
   質。 【表２】 ────────────────────── アミノ酸 モル％ ────────────────────── アスパラギン酸 １０.９３±０.２２ スレオニン ５.００±０.２２ セリン ６.０５±０.７４ グルタミン酸 １２.００±０.２２ グリシン ６.７１±０.３１ アラニン ６.７１±０.１６ バリン ７.７９±０.１６ ¹/₂−シスチン １.０３±０.０９ メチオニン ２.９４±０.０５ イソロイシン ４.９６±０.１３ ロイシン ９.９５±０.１７ チロシン ３.１６±０.０８ フエニルアラニン ４.５３±０.０９ リシン ６.８５±０.１６ ヒスチジン １.６９±０.１０ アルギニン ４.８３±０.１１ プロリン ４.０９±０.１０ トリプトフアン ０.７８±０.０５ ────────────────────── 計 １００.００ ──────────────────────
3. 【請求項３】 請求項１又は２記載の蛋白質よりなるこ
   とを特徴とする多包虫症患者診断用試薬。
4. 【請求項４】 請求項１又は２記載の蛋白質を用い被検
   者の体液中の該蛋白質抗原に対する抗体を免疫学的に検
   出することを特徴とする多包虫症患者の診断方法。