JPH0623762B2

JPH0623762B2 - 免疫性蛋白質の定量方法および定量装置

Info

Publication number: JPH0623762B2
Application number: JP60061661A
Authority: JP
Inventors: 正原; 素弘鳥山; 正勝今城
Original assignee: Horiba Ltd
Current assignee: Horiba Ltd
Priority date: 1985-03-23
Filing date: 1985-03-23
Publication date: 1994-03-30
Anticipated expiration: 2009-03-30
Also published as: JPS61217764A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、全く新規な手段に基く免疫性蛋白質の定量方
法および定量装置、詳しくは、サンプル溶液中に含有さ
れている特定の免疫性蛋白質（ただし、この免疫性蛋白
質とは、抗原−抗体関係にある免疫性蛋白質の一方のみ
を意味する）の量を定量する方法および装置に関するも
のである。

なお、ここに言う免疫性蛋白質とは、上記のように、抗
原（蛋白質）または抗体（蛋白質）の何れをも意味し得
るが、以下、説明の便宜上、被測定免疫性蛋白質が抗原
の場合についてのみ述べることとする。その説明におい
て、『抗原』という用語と『抗体』という用語を入れ換
えることによって、被測定免疫性蛋白質が抗体の場合に
ついても容易に類推可能であろう。

〔従来の技術〕

一般に免疫測定法と呼ばれる免疫性蛋白質の定量方法
（およびそれを実施するための装置）としては、放射性
同位元素を標識剤として用いるＲＩＡ法，色素を標識剤
として用いるＥＩＡ法，螢光物質を標識剤として用いる
螢光標識法などの方法、即ち、被測定免疫性蛋白質（以
下、抗原とする）に対応する抗体に放射性同位元素や酵
素あるいは螢光物質を用いて標識を付した標識抗体を生
成し、その標識抗体にサンプル溶液中の被測定抗原を吸
着させてから、未吸着の標識抗体や他の物質を除去して
標識抗体−被測定抗原の結合体のみを残し、しかる後、
その標識抗体の量を、蛋白質の定量方法として公知のラ
ジオアイソトープ法や吸光法あるいは螢光法によって測
定することにより、サンプル溶液中の被測定抗原を定量
する、という方法が従来から知られている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、上記各種従来方法においては、非常に煩
雑で面倒な手順と長時間を要する抗体への標識操作を行
わねばならず、また、抗体および標識抗体は一回限りし
か使用できないためバッチ的な定量しか行えず、従っ
て、ひとつのサンプルについて数十時間もの長い定量時
間を要すると共に、抗体および標識抗体などの試薬の無
駄が多いという共通の欠点があり、また、ＲＩＡ法で
は、放射性同位元素を標識剤とするために危険性が大き
く、ＥＩＡ法では、巨大な分子から成る色素を標識剤と
するために立体障害などによる免疫反応効率の悪さに起
因して定量感度や精度の悪化を招き、螢光標識法では、
螢光物質を標識剤とするために標識操作時において有機
溶媒を用いざるを得ず、従って、被測定抗原の種類によ
っては適用することはできない場合が多い、というよう
に各方法に固有の欠点もあった。

本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであって、そ
の目的は、比較的簡素かつ安価に構成可能な装置で済
み、迅速に安全にかつ経済的に、しかも、多種類の免疫
性蛋白質に対して感度および精度の良い定量を行える免
疫性蛋白質の定量方法および定量装置を提供せんとする
ことにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明による免疫性蛋白質の定量方法および定量装置
は、基本的には化学ルミネセンス（化学発光反応）とい
う、当該技術分野においては従来は全く留意されていな
かった自然現象を有効利用するという新規なアイデアに
端を発して開発されたものであるので、先ず、その化学
発光反応に係る興味ある現象について説明しておく。

即ち、第８図に示すように、ルミノール（Ｃ_８Ｈ_７Ｎ_３
Ｏ₂）溶液のような被酸化時において化学発光性を示す
物質を含有する溶液ａと、過酸化水素水（Ｈ_２Ｏ_２溶
液）のような酸化性の物質を含有する溶液ｂと、フェリ
シアン化カリウム（Ｋ_３［Ｆｅ（ＣＮ）₆］）溶液のよ
うな触媒溶液ｃとを、反応部ｒを構成するフローセルｆ
ｃへ導入供給して混合させると、前記化学発光性物質は
前記酸化性物質により酸化されてかなり強度の大きい青
色の化学発光ｌ（約４５０ｎｍ）を生じる反応が起こる
ことがよく知られている。なお、前記化学発光性物質と
しては、前記ルミノールの他にルシゲニンやロフィンな
どが、また、前記酸化性物質としては前記過酸化水素の
他に酸素，オゾン，次亜塩素酸などが知られている。

而して、本発明者らは、かかる化学発光反応の系におい
て、同図中点線ｚで示すように前記触媒溶液ｃに蛋白質
ｄを混入すると前記化学発光ｌの強度が減少（所謂クエ
ンチング）し、しかも、その化学発光ｌの強度減少量は
前記混入蛋白質ｄの広い量範囲（ごく少量の場合からか
なり多量の場合まで）に亘って比例的（直線性が良好）
であり、また、その減少率は少数の例外を除けば蛋白質
の種類の違いによってもあまり左右されない、というこ
とを発見ならびに実験的に確認したのである。更に、本
発明者らは、前記触媒溶液ｃとして、毒性が極めて強い
という難点がある前記フェリシアン化カリウム溶液の代
わりに、銅イオンＣｕ⁺⁺などの金属イオンを含有する溶
液またはヘマチンなどの自然界に存在する金属錯体を含
有する溶液を用いた場合にも、同様の現象が生じること
をも発見ならびに実験的に確認したのである。なお、か
かる現象は、化学発光反応に対する触媒となる溶液中の
金属イオンのうちの前記混入された蛋白質の量に見合う
量の金属イオンまたは金属錯体が、その混入された蛋白
質とでビュレツトを形成してその触媒活性を失うため
に、前記触媒溶液全体としての触媒活性が低下すること
によるものであると推察される。

そこで、本発明者らは、抗原も抗体も蛋白質そのもので
あることに鑑みて、上記した現象を有効に応用すること
により、下記のような免疫性蛋白質（抗原または抗体）
の定量法および定量装置を開発するに至ったのである。

即ち、本第一発明に係る免疫性蛋白質（例えば抗原）の
定量方法は、被測定免疫性蛋白質（抗原）に対して抗原−抗体関係に
ある免疫性蛋白質（抗体）を固定化した免疫アフィニテ
ィークロマトカラム（抗体固定化カラム）内にサンプル
溶液を導入して、前記カラム内に固定化された免疫性蛋
白質（抗体）に対して前記サンプル溶液中の被測定免疫
性蛋白質（抗原）を抗原−抗体反応により捕捉させてか
ら、前記カラム内を洗浄して前記被測定免疫性蛋白質（抗
原）以外の不要な物質を除去した後、前記カラム内に解離溶液を導入して、前記カラム内に固
定化された免疫性蛋白質（抗体）から前記被測定免疫性
蛋白質（抗原）を分離させて前記カラム内から溶出さ
せ、しかる後、被酸化時において化学発光性を示す物質を含
有する溶液と酸化性を有する物質を含有する溶液との化
学発光反応系へ供給される基準触媒溶液に、前記カラム
から溶出させた被測定免疫性蛋白質（抗原）を混入する
ことによる化学発光強度の減少を計測し、もって前記サ
ンプル溶液中の免疫性蛋白質の量を測定する、という手順による手法を採用した点に特徴がある。

また、本第二発明に係る免疫性蛋白質（例えば抗原）の
定量装置は、被酸化時において化学発光性を示す物質を
含有する溶液を化学発光反応部へ所定量ずつ導入供給可
能に構成された第１流路と、酸化性を有する物質を含有
する溶液を前記化学発光反応部へ所定量ずつ導入供給可
能に構成された第２流路と、基準触媒溶液を前記化学発
光反応部へ所定量ずつ導入供給可能に構成された第３流
路と、前記化学発光反応部から発せられる化学発光強度
の減少を計測する化学発光強度計測手段とを設けると共
に、被側定免疫性蛋白質（抗原）に対して抗原−抗体関
係にある免疫性蛋白質（抗体）を固定化した免疫アフィ
ニティークロマトカラム（抗体固定化カラム）、およ
び、そのカラム内にサンプル溶液を導入する状態と、そ
のカラム内に洗浄溶液を導入する状態と、そのカラム内
に解離溶液を導入する状態とに切り替え可能な弁機構を
備えていて、前記カラム内にサンプル溶液を導入してそ
のカラム内に固定化された免疫性蛋白質（抗体）に対し
て前記サンプル溶液中の被測定免疫性蛋白質（抗原）を
抗原−抗体反応により捕捉させてから、前記カラム内を
洗浄して前記被測定免疫性蛋白質以外の不要な物質を除
去した後、前記カラム内に解離溶液を導入してそのカラ
ム内に固定化された免疫性蛋白質（抗体）から前記被測
定免疫性蛋白質（抗原）を分離させてそのカラム内から
溶出させ、そのカラム内から溶出させた被測定免疫性蛋
白質（抗原）を前記第３流路内の基準触媒溶液に混入す
ることによる化学発光強度の減少を計測させ、もって前
記サンプル溶液中の免疫性蛋白質の量が測定可能なよう
に構成された第４流路を、前記第３流路の途中に合流接
続して設け、かつ、前記第３流路における前記第４流路
の合流接続部分の下流側に、加熱手段とそれに続く冷却
手段とを介装し、更に、前記第１流路および第２流路の
途中に恒温化手段を介装してある、という特徴を備えて
いる。

〔作用〕

本発明方法および装置において発揮される作用は次の通
りである。

即ち、上記第一発明方法によれば、被測定免疫性蛋白質
（抗原）に対して抗原−抗体関係にある免疫性蛋白質
（抗体）を固定化した免疫アフィニティークロマトカラ
ム（抗体固定化カラム）を用いるため、サンプル溶液中
の被測定免疫性蛋白質（抗原）が効率良く分離溶出され
るので、従来方法におけるように非常に煩雑で面倒な手
順と長時間を要する標識操作を行なう必要が無く、ま
た、前記カラムに固定化された免疫性蛋白質（抗体）は
反復使用が可能なため連続的な定量が可能となり、従っ
て、ひとつのサンプルに対する定量時間を従来の数十時
間に比べて約１５分程度という極めて短い時間で迅速に
行えるようになると共に、試薬の無駄を非常に少なくで
きるようになった。

また、化学発光性物質含有溶液と酸化性物質含有溶液と
の化学発光反応系へ供給される基準触媒溶液に混入され
たサンプル溶液中の被測定免疫性蛋白質（抗原）の量に
対して、その量がごく少量の場合からかなり多量の場合
までの広い量範囲に亘って良好な直線性をもって比例的
に、しかも、化学発光反応に対してある程度の触媒作用
を有する極く少数の種類のものを除けば、被測定免疫性
蛋白質（抗原）の種類如何に拘わらずほぼ一定の割合
で、その化学発光反応系からの化学発光強度が減少する
ので、前記サンプル溶液中の被測定免疫性蛋白質（抗
原）の定量を、感度ならびに精度良く、かつ、広い測定
範囲で行うことができる。ちなみに、本発明方法を採用
して行った実験によれば、ヒト血清アルブミンの場合に
ついて、５０ｎｇ（絶対量）という従来方法よりも２桁
優れた測定感度が得られた。

更に、本発明方法においては、従来のＲＩＡ法のように
放射性同位元素の標識剤を用いることが無く、また、前
記化学発光反応系に対する触媒溶液として、通常用いら
れる毒性が強いフェリシアン化カリウム溶液の代わり
に、毒性が無い銅イオンなどの金属イオンまたはヘマチ
ンなどの金属錯体を含む溶液を用いているため、安全に
定量操作を行うことができる。

更にまた、本発明方法は、比較的簡素で安価に構成でき
る装置と安価に入手できる試薬で実施でき、しかも、前
述のように標識操作という試料の前処理が不要であると
共に試薬の無駄も少ないので、イニシャルコストもラン
ニングコストも少なくて済み、極めて経済的である。

そして、上記第一発明方法を適用して構成された本第二
発明に係る免疫性蛋白質の定量装置によれば、上記第一発明方法における優れた基本的作用がそのまま
発揮されることは勿論、特に銅イオンなどの金属イオン
またはヘマチンなどの金属錯体を含む基準触媒溶液を化
学発光反応部へ所定量ずつ導入供給可能に構成された第
３流路と、その第３流路内の基準触媒溶液に前記カラム
内から溶出させた被測定免疫性蛋白質を混入することに
よる化学発光強度の減少を計測させ、もって前記サンプ
ル溶液中の免疫性蛋白質の量が測定可能なようにその第
３流路の途中に合流接続された第４流路との合流接続部
分の下流側に、加熱手段とそれに続く冷却手段とを設
け、しかも第１流路および第２流路の途中には、両流路
内の各溶液を一定の温度に保持して化学発光反応の安定
化を図るための共通の恒温化手段を介装するという工夫
を施してあるため、前記加熱手段による加熱作用によっ
て、基準触媒溶液とサンプル溶液中の被測定免疫性蛋白
質との間のビュレット形成反応が速やかに且つ不足無く
充分に行われると共に、前記冷却手段による冷却作用に
よって安定した発光強度計測の上で大きな障害となる流
路内気泡の発生が確実に防止されるのを、安定な基準化
学発光強度を得る上で実質的に寄与できる前記恒温化手
段で助長しながら、より一層精度の良い定量を短時間で
行うことができる。

〔実施例〕

以下、本発明の実施例を図面（第１図ないし第７図）に
基いて説明する。

第１図（イ），（ロ），（ハ），（ニ）および第２図
（イ），（ロ）は本第一発明に係る免疫性蛋白質として
の抗原の定量方法の基本的手順を説明するためのもので
ある。

先ず、第１図（イ）に示すように、被測定抗原（例えば
ヒト血清アルブミン）ＨＳＡに対して抗原−抗体関係に
ある抗体（抗ヒト血清アルブミン）Ａｂ…を固定化した
免疫アフィニティークロマトカラムＣＵ（以下、抗体固
定化カラムと称し、その具体的構成については後述す
る）内に、同図中点線で示すように被測定抗原ＨＳＡ…
等を含有するサンプル溶液Ｄを導入する。

すると、第１図（ロ）に示すように、前記サンプル溶液
Ｄ中の特定の抗原つまり被測定抗原ＨＳＡ…のみが、前
記カラムＣＵ内に固定化された抗体Ａｂ…に対して抗原
−抗体反応により結合して捕捉され、それ以外の不要な
他物質ＸＸ…は前記抗体Ａｂ…には結合しないで遊離し
たままの状態となる。そこでその状態において、同図中
点線で示すように、前記カラムＣＵ内に洗浄溶液Ｅを流
通させる。

すると、第１図（ハ）に示すように、前記カラムＣＵ内
は洗浄されて、前記他物質ＸＸ…は除去され、カラムＣ
Ｕ内には固定化抗体Ａｂ…に捕捉された被測定抗原ＨＳ
Ａ…のみが残ることとなる。そこでその状態において、
同図中点線で示すように、前記カラムＣＵ内に解離溶液
Ｆを流通させる。

すると、第１図（ニ）に示すように、前記カラムＣＵ内
における固定化抗体Ａｂ…から被測定抗原ＨＳＡ…が分
離されて前記解離溶液Ｆ内に溶出する。なお、その分離
溶出された被測定抗原ＨＳＡ…は、同図中点線で示すよ
うに、前記解離溶液Ｆと共に、次に述べる化学発光反応
系Ｑへの基準触媒溶液供給ライン４内の入基準触媒溶液
Ｃに混入されることになる。

一方、第２図（イ）に示すように、被酸化時において化
学発光性を示す物質を含有する溶液Ａとしてのルミノー
ル（Ｃ_８Ｈ_７Ｎ_３Ｏ_２）溶液および酸化性を有する物質
を含有する溶液Ｂとしての過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）水
を、化学発光反応部Ｒを構成するフローセルＦｃへ夫々
所定量ずつ混合導入供給するように構成された化学発光
反応系Ｑに対して、基準触媒溶液Ｃとしての銅イオンCu
⁺⁺などの金属イオンを含む溶液のみを基準触媒溶液供給
ライン５を介して所定量ずつ供給し、その状態におい
て、前記化学発光反応部ＲのフローセルＦｃから発せら
れる化学発光Ｌの強度（これを基準化学発光強度Ｖ_０と
する）を、フォトセンサー１，アンプ２，レコーダー３
等から成る化学発光強度計測手段Ｓにより計測する。な
お、このとき、図中想像線で示すように、解離溶液Ｆの
みを前記基準触媒溶液供給ライン５内に混入させるよう
にしてもよい。

次に、第２図（ロ）〔これは前述の第１図（ハ）および
第１図（ニ）の段階に相当する〕に示すように、前記基
準触媒溶液供給ライン４の途中に、前述の第１図（ハ）
の状態（抗原捕捉状態）にある抗体固定化カラムＣＵを
介して、解離溶液Ｆを前記基準触媒溶液供給ライン５内
に導入することにより、前述の第１図（ニ）にも示した
ように、前記カラムＣＵから分離溶出された被測定抗原
ＨＳＡ…を、前記基準触媒溶液供給ライン５内の入基準
触媒溶液Ｃに混入させ、その状態において、前記と同様
にしてフローセルＦｃから発せられる化学発光Ｌの強度
Ｖの変化（減光度）を計測する。

そして、その被測定抗原ＨＳＡ…を基準触媒溶液Ｃ内へ
混入しているとき（減光時）に計測された化学発光強度
Ｖと前記基準化学発光強度Ｖ_０とを比較することによ
り、つまり具体的には、第３図においてハッチングで示
す部分Ｓの積分値を計算して、前記サンプル溶液Ｄ中の
被測定抗原ＨＳＡ…による前記基準触媒溶液Ｃの触媒活
性の低下に基く総減光量を求め、その総減光量から前記
サンプル溶液Ｄ中の被測定抗原ＨＳＡ…の量を定量する
のである。

なお、前記第２図（イ），（ロ）において、Ｐ₁,Ｐ₂,Ｐ
_３は夫々各溶液を移送するための定流量圧送ポンプを示
しており、またＭ₁,Ｍ₂,Ｍ_３は夫々混合コネクターを示
している。

第４図は、上記第一発明方法を適用して構成された本第
二発明に係る免疫性蛋白質としての抗原の定量装置の概
略構成を示している。

図において、Ｉは、前記化学発光性物質含有溶液Ａとし
てのルミノール溶液を化学発光反応部Ｒにおけるフロー
セルＦｃへ所定量ずつ導入供給可能に構成された第１流
路、IIは、前記酸化性物質含有溶液Ｂとしての過酸化水
素水を前記フローセルＦｃへ所定量ずつ導入供給可能に
構成された第２流路、IIIは、前記基準触媒溶液Ｃとし
ての銅イオンＣｕ⁺⁺などの金属イオンを含む溶液を前記
フローセルＦｃへ所定量ずつ導入供給可能に構成された
基準触媒溶液供給ラインとしての第３流路であり、前記
各流路Ｉ，II，IIIには密閉型溶液タンクＴ₁,Ｔ₂,Ｔ_３
および流量調節用ニードルバルブ付きフローメータＵ₁,
Ｕ₂,Ｕ_３が夫々設けられている。そして、前記各流路
Ｉ，II，IIIに対する溶液移送エネルギー源としては、
流体フローに脈流が生じることが無いように、通常用い
られる圧送ポンプの代わりに、それら各流路Ｉ，II，II
Iに共通の調圧器６付きの加圧不活性ガス（例えば窒素
ガス）ボンベ７を用いている。

また、前記化学発光反応部ＲのフローセルＦｃに対して
は、光電子倍増管などのフォトセンサー１，アンプ２，
レコーダー３，インテグレーター４等から成る化学発光
強度計測手段Ｓを設けてある。

そして、前記第３流路IIIの途中には、サンプル溶液Ｄ
から被測定抗原を抽出してその第３流路III内の基準触
媒溶液Ｃに対して混入可能に構成された第４流路IVを合
流接続してある。

即ち、この第４流路IVは、洗浄溶液Ｅを収容するオープ
ン型タンクＴ_５と、その洗浄溶液Ｅを所定量ずつ移送す
るための定流量圧送式第１ポンプＰａと、その第１ポン
プＰａの下流側に位置して定容量（この例では５０μ
）サンプリングループＫと吸引／吐出用注射器Ｗとを
備えている７方コックから成る第１弁機構８と、その第
１弁機構８に接続された被測定抗原を含有するサンプル
溶液Ｄを収容するオープン型タンクＴ_４と、前記第１弁
機構８の流出部から前記第３流路IIIと第４流路IVとの
合流部へ至る流路の途中に介装され６方コックから成る
第２弁機構９と、その第２弁機構９に接続された免疫ア
フィニティークロマトカラム（抗体固定化カラム）ＣＵ
と、解離溶液Ｆを収容するオープン型タンクＴ_６と、そ
の解離溶液Ｆを前記第２弁機構９へ所定量ずつ移送する
ための定流量圧送式第２ポンプＰｂとから成り、前記各
弁機構８，９を夫々適宜状態に切り換える（詳しくは第
６図を用いて後で説明する）ことによって、前記サンプ
リングループＫ内に所定量（５０μ）のサンプル溶液
Ｄを吸引する状態，そのサンプリングループＫ内のサン
プル溶液Ｄを洗浄溶液Ｅによって前記抗体固定化カラム
ＣＵへ押し流して導入すると共にその洗浄溶液Ｅによっ
て前記抗体固定化カラムＣＵ内を洗浄する状態，前記抗
体固定化カラムＣＵ内に解離溶液Ｆを流通させて前記第
３流路IIIと第４流路IVとの合流部へ導入する状態等に
切り替え可能に構成してある。

更に、前記第１流路Ｉおよび第２流路IIの途中には、そ
れら流路Ｉ，II内の各溶液を一定の温度に保持して化学
発光反応の安定化を図るための共通の恒温化手段１０
（例えば約２５℃程度の恒温水バスなど）を介装してあ
り、また、前記第３流路IIIにおける前記第４流路IVの
合流接続部分の下流側には、高温水バスなどの加熱手段
１１（例えば約９５℃）とそれに続く低温水バスなどの
冷却手段１２（例えば約０℃）とを介装することによ
り、前記加熱手段１１による加熱手段によって、その第
３流路IIIにおいて前記基準触媒溶液Ｃとそれに混入さ
れたサンプル溶液Ｄ中の被測定抗体との間のビュレツト
形成反応が速やかに且つ不足無く充分に行われると共
に、前記冷却手段１２による冷却作用によって、安定し
た発光強度計測の上で大きな障害となる流路内気泡の発
生が確実に防止されるように構成してある。

なお、前記化学発光反応部Ｒ，第１流路Ｉ，第２流路I
I，第３流路IIIおよび第４流路IV等における配管部分
は、全てテフロン（ポリ四弗化エチレン：デュポン社商
標）で構成すると共に、配管内での試料の拡散を防止す
るために、全ての配管の内径をかなり小径のもの（例え
ば0.5mm 以下）に構成するのが望ましい。

また、同第４図中、Ｍ₁,Ｍ₂,Ｍ_３は夫々混合コネクター
を示している。

第５図は、前記免疫アフィニティークロマトカラム（抗
体固定化カラム）ＣＵの具体的構成例を示すものであ
り、例えば雌ネジ部から成る配管接続部分１３Ａ，１３
Ｂとフィルター部材１３Ｃ，１３Ｄとを両端部に備えた
筒体１３の内部に、被測定抗原に対して抗原−抗体関係
にある抗体を表面に固定化した多数のガラスビーズ１４
…が充填されている。この抗体固定化ガラスビーズ１４
は次のようにして調製される。即ち、多孔質のガラスビ
ーズを、ＨＣｌ，ＨＮＯ_３溶液等で洗浄してから、１％
濃度のγ−グリシドキシプロピルトリメトキシシランを
作用させてグリシドキシ型ガラスビーズとし、次に、ｐ
Ｈ３のＨＣｌ溶液を作用させてジオール型ガラスビース
とし、更に、過ヨウ素酸ナトリウムを作用させてアルデ
ビド型ガラスビーズとし、そして、そのアルデビド型ガ
ラスビーズに所定の抗体を結合させてイミン型結合抗体
固定化ガラスビーズとし、それに水素化ホウ素ナトリウ
ムを作用させて抗体固定化ガラスビーズを生成するので
ある。

第６図（イ），（ロ），（ハ），（ニ），（ホ）は、上
記のように構成された抗原定量装置による定量操作手順
を説明するためのものである。

即ち、先ず、前記第４流路IVにおける第１弁機構８を第
６図（イ）に示す状態として、前記吸引／吐出用注射器
Ｗに対する吸引（引き）操作を行い、前記サンプリング
ループＫ内に所定量（この場合は５０μ）のサンプル
溶液Ｄを吸入する。

次に、前記第４流路IVにおける第２ポンプＰｂを作動さ
せると共に第２弁機構９を第６図（ロ）に示す状態とし
て、前記第３流路IIIへ解離溶液Ｆのみを供給し、その
状態において、つまり、前記化学発光反応部Ｒのフロー
セルＦｃに対して実質的に基準触媒溶液Ｃのみを供給し
ている状態において、前記フローセルＦｃから発せられ
る化学発光Ｌの強度（基準化学発光強度Ｖ_０）即ちゼロ
点を、前記化学発光強度計測手段Ｓにより計測する。

なお、上記第６図（イ）および第６図（ロ）に示した操
作手順は前後してもよい。

続いて、前記第２ポンプＰｂを停止させる一方前記第１
ポンプＰａを作動させると共に、前記第１弁機構８およ
び第２弁機構９を第６図（ハ）に示す状態に切り換え
て、洗浄溶液Ｅを前記サンプリングループＫ内を通過す
るように流動させることにより、そのサンプリングルー
プＫ内のサンプル溶液Ｄを前記抗体固定化カラムＣＵ内
へ供給し、そのサンプル溶液Ｄ中の特定の抗原つまり被
測定抗原を前記カラムＣＵ内に固定化された抗体に対し
て抗原−抗体反応により結合させ、その後更に洗浄溶液
Ｅを前記カラムＣＵ内を通過するように流動させること
により、そのカラムＣＵ内に残存している被測定抗原以
外の他物質を除去排出する。

次に、前記第１ポンプＰａを停止させる一方前記第２ポ
ンプＰｂを再び作動させると共に、前記第２弁機構９を
第６図（ニ）に示す状態に切り換えて、解離溶液Ｆを前
記抗体固定化カラムＣＵ内を通過するように流動させる
ことにより、そのカラムＣＵ内における固定化抗体から
被測定抗原を前記解離溶液Ｆ内に分離溶出させ、その分
離溶出した被測定抗原をその解離溶液Ｆと共に前記化学
発光反応部Ｒへの基準触媒溶液供給ラインとしての第４
流路IV内における基準触媒溶液Ｃに混入させる。そし
て、その状態において、つまり、前記化学発光反応部Ｒ
のフローセルＦに対して前記基準触媒溶液Ｃと被測定抗
原を含有する解離溶液Ｆとの混合溶液を供給している状
態（減光時）において、前記フローセルＦから発せられ
る化学発光Ｌの強度Ｖを前記計測手段Ｓにより計測し、
前記基準化学発光強度Ｖ_０をベースとして前記インテグ
レーター４により算出された総減光量から、前記所定量
のサンプル溶液Ｄ中の抗原量を定量するのである。

そして最後に、前記第２ポンプＰｂを停止させると共に
前記第１弁機構８を第６図（ホ）に示す状態に切り換え
て、前記吸引／吐出用注射器Ｗに対する吐出（押し）操
作を行い、その注射器Ｗ内のサンプル溶液Ｄを排出して
次の定量に備えるのである。

次に、上記のように構成された抗原定量装置を用いて行
った試験結果について記載しておく。

試験状態の要目の概略は次の通りである。

〔試薬〕

全ての試薬は市販の特級品が用いられた。

化学発光性物質含有溶液Ａ 0.1mol/dm³のホウ酸と0.1mol/dm³の水酸化カリウムとを
含むｐＨ10.2の緩衝溶液(Buff-I)で希釈して、1.0 ×10
^-4mol/dm^３のルミノール溶液を調製した。

酸化性物質含有溶液Ｂ 0.3 重量％の過酸化水素水を純水で希釈して5.0 ×10^-4
mol/dm^３の過酸化水素水を調製した。

基準触媒溶液Ｃ 2.0 ×10^-2mol/dm^３の銅イオンＣｕ⁺⁺のストツク溶液を
前記緩衝溶液(Buff-I)で希釈して、2.0 ×10^-6mol/dm^３
のＣｕ⁺⁺溶液を調製した。

洗浄溶液Ｅこれはサンプル溶液Ｄに対する緩衝溶液にもなるもの、
リン酸カリウム（ＫＨ_２ＰＯ_４）とリン酸ナトリウム
（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）との混合溶液に、前記抗体固定化カ
ラムＣＵにおける試料溶出時においてそのカラムＣＵに
よるイオン的な試料吸着を抑制するために若干の塩化カ
リウムを添加して、ｐＨ7.2 の洗浄用リン酸緩衝溶液(B
uff-II)を調整した。

サンプル溶液Ｄ試料抗原を前記リン酸緩衝溶液(Buff-II)で希釈した。

解離溶液Ｆ（グリシン−ＨＣｌ）溶液や（酒石酸−酒石酸ナトリウ
ム）溶液についても試してみたが、ｐＨ２．５の（ＨＣ
ｌ−ＫＣｌ）溶液が最適であったため、これを用いた。

〔装置の調整〕全ての配管の内径を0.5mm に統一した。

全ての溶液Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅを１cm³/min で移送す
るように、加圧不活性ガスボンベ７および調圧器６，流
量調節用ニードルバルブ付きフローメータＵ₁,Ｕ₂,
Ｕ_３，定流量圧送式ポンプＰａ，Ｐｂ等を調整した。

恒温化手段１０を２５℃に、加熱手段１１を９５℃
（0.64ｍ）に、冷却手段１２を０℃（0.40ｍ）に保持し
た。

フローセルＦ内での溶液滞留時間を3.4secに調整し
た。

〔試験結果〕ヒト血清アルブミンの場合について、５０ｎｇ（絶対
量）という優れた測定感度が得られた。

ひとつのサンプルについて約１５分という短時間で定
量可能であった。

恒温化手段１０，加熱手段１１および冷却手段１２を
用いることは、安定な基準化学発光強度Ｖ_０を得る上で
非常に有効な手段であることが確認された。

第６図は本第二発明に係る抗原定量装置の別実施例を示
している。

これは、前記第４図ないし第６図に示した装置における
定量に必要なほぼすべての操作を自動的に行えるよう
に、コントローラー１３と、複数のサンプル溶液Ｄ_１…
……Ｄ_ｎを順次自動的に切り替え供給するためのオート
サンプラー１４とを設け、かつ、洗浄溶液Ｅおよび解離
溶液Ｆをも加圧不活性ガスボンベ７を用いて移送するよ
うに構成したものである。

即ち、前記オートサンプラー１４は、サンプリングルー
プＫと逆止弁１５および吸引ポンプＰ_ｗとを備えた吸引
／排出流路１６を有する６方コックから成る第２弁機構
９に、多段切り替え弁１７を介して複数のサンプル溶液
Ｄ_１…………Ｄ_ｎを夫々収容する複数のオープン型タン
クＴ₄₁…………Ｔ_4nを接続して構成されている。

また、前記洗浄溶液Ｅを収容するタンクＴ_５および前記
解離溶液Ｆを収容するタンクＴ_６はこの場合は密封型に
構成され、その流出流路には流量調節用ニードルバルブ
付きフローメータＵ₄，Ｕ₅が夫々が介装されている。そ
して、５個の流量調節用ニードルバルブ付きフローメー
タＵ₁,Ｕ₂,Ｕ₃,Ｕ₄,Ｕ_５と前記多段切り替え弁１７およ
び吸引ポンプＰ_ｗは、前記コントローラー１３により、
所定のシーケンスに従って自動制御されるように構成さ
れている。その他の構成は前述の実施例のものと同様で
ある。

なお、前記各実施例においては、化学発光性物質含有溶
液Ａとしてルミノール溶液を、酸化性物質含有溶液Ｂと
して過酸化水素水を、そして、基準触媒溶液Ｃとして銅
イオンなどの金属イオンを含有する溶液を夫々採用した
ものを示したが、前記化学発光性物質含有溶液Ａとして
は、前記ルミノールの代わりにルシゲニンやロフィンな
どを、前記酸化性物質含有溶液Ｂとしては、前記過酸化
水素の代わりに次亜塩素酸などを、また、前記基準触媒
溶液Ｃとしては、前記金属イオン含有溶液の代わりにヘ
マチンなどの金属錯体を含有する溶液を用いてもよい。

また、本発明方法および装置により、未知量の免疫性蛋
白質の定量を行うに際しては、それに先立つキャリブレ
ーションとして、既知量の同種の免疫性蛋白質の定量を
行っておき、その結果を比較参照するようにすれば、よ
り一層精度のよい定量を行えることは言うまでもない。

〔発明の効果〕

以上詳述したところから明らかなように、本第一発明方
法に係る免疫性蛋白質の定量方法によれば、免疫アフィ
ニティークロマトカラムを用いてサンプル溶液中の被測
定免疫性蛋白質を効率良く分離溶出するようにしたた
め、従来方法におけるように非常に煩雑で面倒な手順と
長時間を要する標識操作を行なう必要が無く、また、前
記カラムに固定化された免疫性蛋白質は反復使用が可能
なため連続的な定量が可能となり、従って、ひとつのサ
ンプルに対する定量時間を約１５分程度の短い時間で迅
速に行えるようになると共に、試薬の無駄を極めて少な
くでき、また、化学発光反応に対してある程度の触媒作
用を有する極く少数の種類のものを除けば、被測定免疫
性蛋白質（抗原）の種類如何に拘わらずほぼ一定の割合
で、その化学発光反応系からの化学発光強度が減少する
ので、前記サンプル溶液中の被測定免疫性蛋白質（抗
原）の定量を、感度ならびに精度良く、かつ、広い測定
範囲で行うことができ、更に、従来のＲＩＡ法のように
放射性同位元素の標識剤を用いることが無く、また、前
記化学発光反応系に対する触媒溶液として毒性が無い銅
イオンなどの金属イオンまたはヘマチンなどの金属錯体
を含む溶液を用いているため、安全に定量操作を行うこ
とができる、という種々の優れた効果が発揮される。更
にまた、本発明方法は、比較的簡素で安価に構成できる
装置と安価に入手できる試薬で実施可能であり、しか
も、前述のように標識操作という試料の前処理が不要で
あると共に試薬の無駄も少ないので、イニシャルコスト
もランニングコストも少なくて済み、極めて経済的であ
る、という効果も発揮される。

また、上記第一発明方法を適用して構成された本第二発
明に係る免疫性蛋白質の定量装置によれば、上記第一発
明方法における優れた基本的作用がそのまま発揮される
ことは勿論、特に銅イオンなどの金属イオンまたはヘマ
チンなどの金属錯体を含む基準触媒溶液を化学発光反応
部へ所定量ずつ導入供給可能に構成された第３流路と、
その第３流路内の基準触媒溶液に前記カラム内から溶出
させた被測定免疫性蛋白質を混入することによる化学発
光強度の減少を計測させ、もって前記サンプル溶液中の
免疫性蛋白質の量が測定可能なようにその第３流路の途
中に合流接続された第４流路との合流接続部分の下流側
に、加熱手段とそれに続く冷却手段とを設け、しかも第
１流路および第２流路の途中には、両流路内の各溶液を
一定の温度に保持して化学発光反応の安定化を図るため
の共通の恒温化手段を介装するという工夫を施してある
ため、前記加熱手段による加熱作用によって、基準触媒
溶液とサンプル溶液中の被測定免疫性蛋白質との間のビ
ュレット形成反応が速やかに且つ不足無く充分に行われ
ると共に、前記冷却手段による冷却作用によって安定し
た発光強度計測の上で大きな障害となる流路内気泡の発
生が確実に防止されるのを、安定な基準化学発光強度を
得る上で実質的に寄与できる前記恒温化手段で助長しな
がら、より一層精度の良い定量を短時間で行うことがで
きる、という効果も発揮される。

【図面の簡単な説明】

第１図ないし第７図は本発明の実施例を示し、第１図
（イ），（ロ），（ハ），（ニ）および第２図（イ），
（ロ）は本第一発明に係る免疫性蛋白質の定量方法の手
順の説明図、第３図は計測例のグラフ、第４図は本第二
発明に係る免疫性蛋白質の定量装置の全体概略構成図、
第５図は要部の拡大縦断側面図、第６図（イ），
（ロ），（ハ），（ニ），（ホ）はその装置による定量
操作手順の説明図、そして、第７図は別実施例の免疫性
蛋白質の定量装置の全体概略構成図である。また、第８図は本発明の背景技術の説明図を示してい
る。Ａ……化学発光性物質含有溶液、Ｂ……酸化性物質含有
溶液、Ｃ……基準触媒溶液、Ｄ……被測定免疫性蛋白質
を含有するサンプル溶液、Ｅ……洗浄溶液、Ｆ……解離
溶液、Ｖ_０……基準化学発光強度、Ｖ……化学発光強度
（減光時）、Ｑ……化学発光反応系、Ｉ……第１流路、
II……第２流路、III……第３流路、IV……第４流路、
ＣＵ……免疫アフィニティークロマトカラム（抗体固定
化カラム）、Ｓ……化学発光強度計測手段、７……加圧
不活性ガスボンベ、８，９……弁機構、１０……恒温化
手段、１１……加熱手段、１２……冷却手段。

フロントページの続き (56)参考文献特公昭57−17257（ＪＰ，Ｂ２) 波多野博行、堀正剛、六鹿栄治村上文子著液体クロマトグラフィーとその応用 1974年９月10日発行株式会社講談社 59ページ図３、５江頭暁著液体クロマトグラフィー機器と分析例 1977年４月20日発行三共出版株式会社 217ページ図３、74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】サンプル溶液中の免疫性蛋白質の量を測定
する方法であって、被測定免疫性蛋白質に対して抗原−抗体関係にある免疫
性蛋白質を固定化した免疫アフィニティークロマトカラ
ム内にサンプル溶液を導入して、前記カラム内に固定化
された免疫性蛋白質に対して前記サンプル溶液中の被測
定免疫性蛋白質を抗原−抗体反応により捕捉させてか
ら、前記カラム内を洗浄して前記被測定免疫性蛋白質以外の
不要な物質を除去した後、前記カラム内に解離溶液を導入して、前記カラム内に固
定化された免疫性蛋白質から前記被測定免疫性蛋白質を
分離させて前記カラム内から溶出させ、しかる後、被酸化時において化学発光性を示す物質を含
有する溶液と酸化性を有する物質を含有する溶液との化
学発光反応系へ供給される基準触媒溶液に、前記カラム
から溶出させた被測定免疫性蛋白質を混入することによ
る化学発光強度の減少を計測し、もって前記サンプル溶
液中の免疫性蛋白質の量を測定する、という手順によることを特徴とする免疫性蛋白質の定量
方法。
【請求項２】サンプル溶液中の免疫性蛋白質の量を測定
する装置であって、被酸化時において化学発光性を示す物質を含有する溶液
を化学発光反応部へ所定量ずつ導入供給可能に構成され
た第１流路と、酸化性を有する物質を含有する溶液を前
記化学発光反応部へ所定量ずつ導入供給可能に構成され
た第２流路と、基準触媒溶液を前記化学発光反応部へ所
定量ずつ導入供給可能に構成された第３流路と、前記化
学発光反応部から発せられる化学発光強度の減少を計測
する化学発光強度計測手段とを設けると共に、被側定免
疫性蛋白質に対して抗原−抗体関係にある免疫性蛋白質
を固定化した免疫アフィニティークロマトカラム、およ
び、そのカラム内にサンプル溶液を導入する状態と、そ
のカラム内に洗浄溶液を導入する状態と、そのカラム内
に解離溶液を導入する状態とに切り替え可能な弁機構を
備えていて、前記カラム内にサンプル溶液を導入してそ
のカラム内に固定化された免疫性蛋白質に対して前記サ
ンプル溶液中の被測定免疫性蛋白質を抗原−抗体反応に
より捕捉させてから、前記カラム内を洗浄して前記被測
定免疫性蛋白質以外の不要な物質を除去した後、前記カ
ラム内に解離溶液を導入してそのカラム内に固定化され
た免疫性蛋白質から前記被測定免疫性蛋白質を分離させ
てそのカラム内から溶出され、そのカラム内から溶出さ
せた被測定免疫性蛋白質を前記第３流路内の基準触媒溶
液に混入することによる化学発光強度の減少を計測さ
せ、もって前記サンプル溶液中の免疫性蛋白質の量が測
定可能なように構成された第４流路を、前記第３流路の
途中に合流接続して設け、かつ、前記第３流路における
前記第４流路の合流接続部分の下流側に、加熱手段とそ
れに続く冷却手段とを介装し、更に、前記第１流路およ
び第２流路の途中に恒温化手段を介装してあることを特
徴とする免疫性蛋白質の定量装置。
【請求項３】前記第１流路，第２流路および第３流路に
おける溶液移送エネルギー源として加圧不活性ガスボン
ベを用いている特許請求の範囲第(2)項に記載の免疫性
蛋白質の定量装置。
【請求項４】前記化学発光反応部，第１流路，第２流
路，第３流路および第４流路等における配管部分を全て
ポリ四弗化エチレン製としてある特許請求の範囲第(2)
または第(3)項に記載の免疫性蛋白質の定量装置。