JPH06230007A - 標識複合体、及びそれを用いる分析法 - Google Patents
標識複合体、及びそれを用いる分析法Info
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- JPH06230007A JPH06230007A JP5019057A JP1905793A JPH06230007A JP H06230007 A JPH06230007 A JP H06230007A JP 5019057 A JP5019057 A JP 5019057A JP 1905793 A JP1905793 A JP 1905793A JP H06230007 A JPH06230007 A JP H06230007A
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- Y10T436/24—Nuclear magnetic resonance, electron spin resonance or other spin effects or mass spectrometry
Abstract
(57)【要約】
【構成】 生体関連物質に標識材を担持させてなり、該
生体関連物質と分析対象物を特異的に結合させ分析対象
物を光学的手段で検出するための標識複合体において、
標識材に下記一般式で示される三核型色素化合物又は該
式中真中の複素環の４位の窒素原子が５位にある異性構
造の化合物を用いる。 【化１】 【化２】 【効果】 この標識複合体は、ストークスシフトが大き
いため、検出において励起光と蛍光の分離が容易で検出
のＳ／Ｎ比が高く、更に、このものは水中での蛍光強度
変化が少なく安定なため、貯蔵安定性に優れた試薬を提
供できる。
生体関連物質と分析対象物を特異的に結合させ分析対象
物を光学的手段で検出するための標識複合体において、
標識材に下記一般式で示される三核型色素化合物又は該
式中真中の複素環の４位の窒素原子が５位にある異性構
造の化合物を用いる。 【化１】 【化２】 【効果】 この標識複合体は、ストークスシフトが大き
いため、検出において励起光と蛍光の分離が容易で検出
のＳ／Ｎ比が高く、更に、このものは水中での蛍光強度
変化が少なく安定なため、貯蔵安定性に優れた試薬を提
供できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、赤色又は近赤外光を用
いた微量分析用の標識複合体に関する。
いた微量分析用の標識複合体に関する。
【０００２】
【従来技術】色素等で標識された微少物質にレーザー光
を照射すると、その物質に起因して、散乱光、吸光、蛍
光、さらには光音響などの情報が得られる。こうした情
報を検出し、高精度かつ高速に微量分析を行なうこと
は、レーザー光を利用した分析法の分野において、広く
知られている。
を照射すると、その物質に起因して、散乱光、吸光、蛍
光、さらには光音響などの情報が得られる。こうした情
報を検出し、高精度かつ高速に微量分析を行なうこと
は、レーザー光を利用した分析法の分野において、広く
知られている。
【０００３】従来レーザー光源としては、アルゴンレー
ザーやヘリウムネオンレーザーに代表されるガスレーザ
ーがもっぱら利用されてきた。しかし、近年半導体レー
ザーが開発され、その安価でありかつ小型で、出力制御
が容易な特徴から、光源としての利用が期待されてい
る。
ザーやヘリウムネオンレーザーに代表されるガスレーザ
ーがもっぱら利用されてきた。しかし、近年半導体レー
ザーが開発され、その安価でありかつ小型で、出力制御
が容易な特徴から、光源としての利用が期待されてい
る。
【０００４】一方、生体関連微量物質を、従来のように
紫外および可視領域の波長を利用して定量する場合は、
通常検体に含まれるフラビン、ピリジン補酵素、および
血清蛋白質などの天然物の固有蛍光（３００〜５００ｎ
ｍ）に基づく、バックグラウンド（ブランク）が高くな
る傾向にある。しかし、赤色又は近赤外領域の光源を利
用できれば、こうした天然物由来のバックグラウンドを
排除することができ、結果的に被測定物質の感度を高く
することができる。
紫外および可視領域の波長を利用して定量する場合は、
通常検体に含まれるフラビン、ピリジン補酵素、および
血清蛋白質などの天然物の固有蛍光（３００〜５００ｎ
ｍ）に基づく、バックグラウンド（ブランク）が高くな
る傾向にある。しかし、赤色又は近赤外領域の光源を利
用できれば、こうした天然物由来のバックグラウンドを
排除することができ、結果的に被測定物質の感度を高く
することができる。
【０００５】しかし、半導体レーザーの発振波長は一般
的には赤色、近赤外領域（６００〜８３０ｎｍ）であ
り、その波長領域で吸光、もしくは励起により蛍光を発
する色素はそれほど多くなく、二核型シアニン系色素が
代表とされる。二核型シアニン系色素を生体関連物質に
標識し、これを用いて微量分析をした例としては、ケ
ー．サウダ，テー．イマサカ（Ｋ．Ｓａｕｄａ，Ｔ．Ｉ
ｍａｓａｋａ）らは、アナル．ケム（Ａｎａｌ．Ｃｈｅ
ｍ．）（１９８６）５８，２６４９−２６５３の論文で
スルホネート基をもつ二核型シアニン色素（例えばイン
ドシアニングリーン）を用いて、血しょう蛋白質を標識
し、高速液体クロマトグラフィーで分析したことを報告
している。
的には赤色、近赤外領域（６００〜８３０ｎｍ）であ
り、その波長領域で吸光、もしくは励起により蛍光を発
する色素はそれほど多くなく、二核型シアニン系色素が
代表とされる。二核型シアニン系色素を生体関連物質に
標識し、これを用いて微量分析をした例としては、ケ
ー．サウダ，テー．イマサカ（Ｋ．Ｓａｕｄａ，Ｔ．Ｉ
ｍａｓａｋａ）らは、アナル．ケム（Ａｎａｌ．Ｃｈｅ
ｍ．）（１９８６）５８，２６４９−２６５３の論文で
スルホネート基をもつ二核型シアニン色素（例えばイン
ドシアニングリーン）を用いて、血しょう蛋白質を標識
し、高速液体クロマトグラフィーで分析したことを報告
している。
【０００６】また、特開平２−１９１６７４には、生体
関連物質に種々のスルホン酸基もしくはスルホネート基
をもつ二核型シアニン系色素を標識して、蛍光検出する
ことが開示されている。
関連物質に種々のスルホン酸基もしくはスルホネート基
をもつ二核型シアニン系色素を標識して、蛍光検出する
ことが開示されている。
【０００７】ところで、蛍光を検出するためには色素に
照射する励起光と分光して信号として取り出す必要があ
る。従って、励起光波長と蛍光波長が離れている程、分
光しやすく、またＳ／Ｎ比が向上する。
照射する励起光と分光して信号として取り出す必要があ
る。従って、励起光波長と蛍光波長が離れている程、分
光しやすく、またＳ／Ｎ比が向上する。
【０００８】しかし従来の二核型シアニン色素に代表さ
れる赤〜近赤外光に吸収をもつ標識複合体は吸収スペク
トルにおける最大ピーク波長と蛍光スペクトルの最大ピ
ーク波長の差（ストークスシフト）が２０ｎｍ〜４０ｎ
ｍ程度で大きくないという問題があった。
れる赤〜近赤外光に吸収をもつ標識複合体は吸収スペク
トルにおける最大ピーク波長と蛍光スペクトルの最大ピ
ーク波長の差（ストークスシフト）が２０ｎｍ〜４０ｎ
ｍ程度で大きくないという問題があった。
【０００９】また、該色素を標識材として抗体などの生
体由来物質などに結合させて複合化した場合、その複合
体はさらに光、熱、湿度、空気中の酸素などの環境因子
により酸化されたり、架橋などの変性が生じやすい。ま
た、特に水中では、加水分解などの変性がさらに加速さ
れるという欠点があった。従って、生体成分の微量分析
を行う際の検出試薬として、これら複合体を利用しよう
としても、貯蔵安定性が悪いことを理由として実用化が
難しい場合があった。
体由来物質などに結合させて複合化した場合、その複合
体はさらに光、熱、湿度、空気中の酸素などの環境因子
により酸化されたり、架橋などの変性が生じやすい。ま
た、特に水中では、加水分解などの変性がさらに加速さ
れるという欠点があった。従って、生体成分の微量分析
を行う際の検出試薬として、これら複合体を利用しよう
としても、貯蔵安定性が悪いことを理由として実用化が
難しい場合があった。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは上記問題
を解決するために種々検討した結果、ある特定の構造の
色素を生体関連物質に標識材として担持させたところ、
吸収スペクトルにおける最大ピーク波長と蛍光スペクト
ルの最大ピーク波長の差が５０ｎｍ〜１００ｎｍと比較
的大きいこと、又その標識複合体が極めて安定であると
いうことを見いだし本発明を完成するに至った。
を解決するために種々検討した結果、ある特定の構造の
色素を生体関連物質に標識材として担持させたところ、
吸収スペクトルにおける最大ピーク波長と蛍光スペクト
ルの最大ピーク波長の差が５０ｎｍ〜１００ｎｍと比較
的大きいこと、又その標識複合体が極めて安定であると
いうことを見いだし本発明を完成するに至った。
【００１１】そして本発明の目的とするところは、上述
の問題点を解決する、ストークスシフトが大きく、分光
が容易でＳ／Ｎ比の向上した、かつ貯蔵安定性に優れた
標識複合体を提供することにある。
の問題点を解決する、ストークスシフトが大きく、分光
が容易でＳ／Ｎ比の向上した、かつ貯蔵安定性に優れた
標識複合体を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成する本発
明は、生体関連物質に標識材を担持させてなり、該生体
関連物質と分析対象物を特異的に結合させ分析対象物を
光学的手段で検出するための標識複合体において、標識
材が下記一般式（Ｉ）または（II）で示される三核型色
素からなることを特徴とする標識複合体である。
明は、生体関連物質に標識材を担持させてなり、該生体
関連物質と分析対象物を特異的に結合させ分析対象物を
光学的手段で検出するための標識複合体において、標識
材が下記一般式（Ｉ）または（II）で示される三核型色
素からなることを特徴とする標識複合体である。
【００１３】
【化４】 （式中、Ｘａ，Ｘｂ，Ｘｃを含み点線で結ばれた環は各
々独立に１〜３個の酸置換若しくは非置換のアルキル、
置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換の
アラルキル基のいずれかに置換された芳香族複素環を示
す。Ｌａ，Ｌｂは１〜６個の置換若しくは非置換メチン
結合よりなるメチン鎖を示し、Ｌａ，Ｌｂのうち１つは
省略され芳香族複素環が直接連結されててもよい。
々独立に１〜３個の酸置換若しくは非置換のアルキル、
置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換の
アラルキル基のいずれかに置換された芳香族複素環を示
す。Ｌａ，Ｌｂは１〜６個の置換若しくは非置換メチン
結合よりなるメチン鎖を示し、Ｌａ，Ｌｂのうち１つは
省略され芳香族複素環が直接連結されててもよい。
【００１４】
【外３】 は酸基を示す。） 又本発明は、生体関連物質が該三核型色素で示される標
識材を担持させてなる上記標識複合体を用い、該標識複
合体と分析対象化合物とを特異的に結合させて分析対象
化合物を光学的手段で検出する分析法である。
識材を担持させてなる上記標識複合体を用い、該標識複
合体と分析対象化合物とを特異的に結合させて分析対象
化合物を光学的手段で検出する分析法である。
【００１５】一般式（Ｉ）または（II）において、スト
−クスシフトの大きさや分光の容易さ等の観点から好ま
し構造としては、Ｘａ，Ｘｂ，Ｘｃを含み点線で結ばれ
た環が、少なくとも１〜２個の窒素原子を有する置換若
しくは非置換の５若しくは６員芳香族複素環又はそれを
含む縮合環であるものである。
−クスシフトの大きさや分光の容易さ等の観点から好ま
し構造としては、Ｘａ，Ｘｂ，Ｘｃを含み点線で結ばれ
た環が、少なくとも１〜２個の窒素原子を有する置換若
しくは非置換の５若しくは６員芳香族複素環又はそれを
含む縮合環であるものである。
【００１６】更に好ましい構造は、三核型色素が下記一
般式（III）で示される化合物又は該式中真中の複素環
の４位の窒素原子が５位にある異性構造の化合物からな
るものである。
般式（III）で示される化合物又は該式中真中の複素環
の４位の窒素原子が５位にある異性構造の化合物からな
るものである。
【００１７】
【化５】 （式中、ｒ8 ，ｒ9 ，ｒ10，ｒ11は各々独立に水素原
子、ハロゲン原子、置換若しくは非置換アルキル基、ア
ルコキシル基、置換若しくは非置換アリール基、置換又
は非置換アミノ基を示し、ｒ8 とｒ9 は結合して置換又
は非置換の芳香環を形成してもよい。ｒ6 は繰り返し単
位中独立に、存在しないか又はアルキル置換エチエンを
示しｒ8 又はｒ9 と結合して環状構造をを形成する。ｒ
1 ，ｒ2 は置換若しくは非置換アリール基、又はｒ1 と
ｒ2 が結合した置換若しくは非置換の縮合環を示す。ｒ
3 ，ｒ4 ，ｒ5 は各々独立に、水素原子、置換若しくは
非置換アルキル基、アルキルスルホネート基、アルケニ
ル基、置換若しくは非置換アリール基、又は置換若しく
は非置換アラルキル基を示す。Ｘ1 は酸素原子、硫黄原
子、炭素原子、窒素原子又はセレン原子を示し、炭素原
子、窒素原子の場合には水素原子、置換若しくは非置換
アルキル、置換若しくは非置換アリール又は置換若しく
は非置換アラルキル基のいずれかと結合している。Ｘ2
は酸素原子、硫黄原子又は窒素原子を示し、窒素原子の
場合には、水素原子、置換若しくは非置換アルキル、置
換若しくは非置換アリール、又は置換若しくは非置換ア
ラルキル基のいずれかと結合している。Ｘ3 は酸素原子
又は硫黄原子を示す。ｍ、ｌは０〜３の整数であり、い
ずれか一方は０ではない。） 又は、三核型色素が下記一般式（IV）で示される化合物
又は該式中真中の複素環の４位の窒素原子が５位にある
異性構造の化合物からなるものである。
子、ハロゲン原子、置換若しくは非置換アルキル基、ア
ルコキシル基、置換若しくは非置換アリール基、置換又
は非置換アミノ基を示し、ｒ8 とｒ9 は結合して置換又
は非置換の芳香環を形成してもよい。ｒ6 は繰り返し単
位中独立に、存在しないか又はアルキル置換エチエンを
示しｒ8 又はｒ9 と結合して環状構造をを形成する。ｒ
1 ，ｒ2 は置換若しくは非置換アリール基、又はｒ1 と
ｒ2 が結合した置換若しくは非置換の縮合環を示す。ｒ
3 ，ｒ4 ，ｒ5 は各々独立に、水素原子、置換若しくは
非置換アルキル基、アルキルスルホネート基、アルケニ
ル基、置換若しくは非置換アリール基、又は置換若しく
は非置換アラルキル基を示す。Ｘ1 は酸素原子、硫黄原
子、炭素原子、窒素原子又はセレン原子を示し、炭素原
子、窒素原子の場合には水素原子、置換若しくは非置換
アルキル、置換若しくは非置換アリール又は置換若しく
は非置換アラルキル基のいずれかと結合している。Ｘ2
は酸素原子、硫黄原子又は窒素原子を示し、窒素原子の
場合には、水素原子、置換若しくは非置換アルキル、置
換若しくは非置換アリール、又は置換若しくは非置換ア
ラルキル基のいずれかと結合している。Ｘ3 は酸素原子
又は硫黄原子を示す。ｍ、ｌは０〜３の整数であり、い
ずれか一方は０ではない。） 又は、三核型色素が下記一般式（IV）で示される化合物
又は該式中真中の複素環の４位の窒素原子が５位にある
異性構造の化合物からなるものである。
【００１８】
【化６】 （式中、ｒ19，ｒ20，ｒ21は各々独立に水素原子、ハロ
ゲン原子、置換若しくは非置換アルキル基、アルコキシ
ル基、置換若しくは非置換アリール基、置換若しくは非
置換アミノ基を示し、ｒ19とｒ20は結合して置換又は非
置換の縮合環を形成してもよい。ｒ12とｒ13，ｒ14とｒ
15は置換若しくは非置換アリール基、又はｒ12とｒ13，
ｒ14とｒ15が結合した置換若しくは非置換の縮合環示
す。ｒ16，ｒ 17，ｒ18は各々独立に水素原子、置換若し
くは非置換アルキル基、アルキルスルフォネート基、ア
ルケニル基、置換もしくは非置換アリール基、又は置換
若しくは非置換アラルキル基を示す。Ｘ4 ，Ｘ6 は各々
独立に酸素原子、硫黄原子、炭素原子、窒素原子若しく
はセレン原子を示し、炭素原子、窒素原子の場合には水
素原子、置換若しくは非置換アルキル、置換もしくは非
置換アリール、又は置換若しくは非置換アラルキル基の
いずれかと結合している。Ｘ5 は酸素原子、硫黄原子あ
るいは窒素原子を示し、窒素原子の場合には、水素原
子、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換
アリール、又は置換若しくは非置換アラルキル基のいず
れかと結合している。
ゲン原子、置換若しくは非置換アルキル基、アルコキシ
ル基、置換若しくは非置換アリール基、置換若しくは非
置換アミノ基を示し、ｒ19とｒ20は結合して置換又は非
置換の縮合環を形成してもよい。ｒ12とｒ13，ｒ14とｒ
15は置換若しくは非置換アリール基、又はｒ12とｒ13，
ｒ14とｒ15が結合した置換若しくは非置換の縮合環示
す。ｒ16，ｒ 17，ｒ18は各々独立に水素原子、置換若し
くは非置換アルキル基、アルキルスルフォネート基、ア
ルケニル基、置換もしくは非置換アリール基、又は置換
若しくは非置換アラルキル基を示す。Ｘ4 ，Ｘ6 は各々
独立に酸素原子、硫黄原子、炭素原子、窒素原子若しく
はセレン原子を示し、炭素原子、窒素原子の場合には水
素原子、置換若しくは非置換アルキル、置換もしくは非
置換アリール、又は置換若しくは非置換アラルキル基の
いずれかと結合している。Ｘ5 は酸素原子、硫黄原子あ
るいは窒素原子を示し、窒素原子の場合には、水素原
子、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換
アリール、又は置換若しくは非置換アラルキル基のいず
れかと結合している。
【００１９】
【外４】 は酸基を示す。ｙは０，１，２の整数である。） 生体関連物質としては抗体若しくは抗原又は核酸を用い
ることができる。
ることができる。
【００２０】本発明による標識複合体によれば分析対象
物の半導体レ−ザ−を用いた光学分析において、５０〜
１００nmという高いスト−クスシフトが得られるため、
高いＳ／Ｎ比で分析対象物を検出できる。また、この標
識複合体は保存安定性に優れるため分析試薬としての有
用性が高い。
物の半導体レ−ザ−を用いた光学分析において、５０〜
１００nmという高いスト−クスシフトが得られるため、
高いＳ／Ｎ比で分析対象物を検出できる。また、この標
識複合体は保存安定性に優れるため分析試薬としての有
用性が高い。
【００２１】以下本発明を詳細に説明する。
【００２２】本発明においては標識材として三核型色素
とするものであるが、三核型色素は、主に感光性化合物
の感光剤として、知られた化合物であり、特開昭４８−
５２２２２、特公昭４９−１８８０８、「ＴＨｅ ＣＹ
ＡＮＩＮＥ ＤＹＥＳ ＡＮＤ ＲＥＬＡＴＥＤ ＣＯ
ＭＰＯＵＮＤＳ」（Ｆｒｅｎｃｅｓ．Ｍ．Ｈａｍｅｒ
著）ｐ６１２〜６８４（１９６４）などに記載されてい
る。これら三核型色素は銀塩写真用途としては知られて
いるが、その蛍光特性を利用した生体関連物質の標識材
としては全く知られていない。本発明者らは特定構造の
三核型色素が半導体レ−ザ−による光学分析に極めて有
効であることを見出し本発明を完成するに至ったもので
ある。
とするものであるが、三核型色素は、主に感光性化合物
の感光剤として、知られた化合物であり、特開昭４８−
５２２２２、特公昭４９−１８８０８、「ＴＨｅ ＣＹ
ＡＮＩＮＥ ＤＹＥＳ ＡＮＤ ＲＥＬＡＴＥＤ ＣＯ
ＭＰＯＵＮＤＳ」（Ｆｒｅｎｃｅｓ．Ｍ．Ｈａｍｅｒ
著）ｐ６１２〜６８４（１９６４）などに記載されてい
る。これら三核型色素は銀塩写真用途としては知られて
いるが、その蛍光特性を利用した生体関連物質の標識材
としては全く知られていない。本発明者らは特定構造の
三核型色素が半導体レ−ザ−による光学分析に極めて有
効であることを見出し本発明を完成するに至ったもので
ある。
【００２３】本発明において好適な三核型色素は、三個
の芳香族複素環を少なくとも１つの（ポリ）メチン鎖で
連結した構造（一般式（Ｉ））で表わされる。もしく
は、イオン化した塩の構造（一般式(II)）で表わされ
る。
の芳香族複素環を少なくとも１つの（ポリ）メチン鎖で
連結した構造（一般式（Ｉ））で表わされる。もしく
は、イオン化した塩の構造（一般式(II)）で表わされ
る。
【００２４】Ｘａ，Ｘｂ，Ｘｃはそれぞれ核である環状
構造（芳香族複素環）を形成する。該環状構造は、ヘテ
ロ原子を含む複素環、好ましくは窒素原子を含む五員環
もしくは６員環の複素環式化合物である。
構造（芳香族複素環）を形成する。該環状構造は、ヘテ
ロ原子を含む複素環、好ましくは窒素原子を含む五員環
もしくは６員環の複素環式化合物である。
【００２５】該芳香族複素環には単にポリメチン鎖の炭
素原子２ケ以上の間のブリッジを形成して形成する環式
化学基は含まれない。すなわちこのメチン鎖にブリッジ
された環式化学基は通常炭素環であるが、かかる構造は
ストークスシフトの増大に寄与しないためである。
素原子２ケ以上の間のブリッジを形成して形成する環式
化学基は含まれない。すなわちこのメチン鎖にブリッジ
された環式化学基は通常炭素環であるが、かかる構造は
ストークスシフトの増大に寄与しないためである。
【００２６】また三核型色素を構成する三つの芳香族複
素環はＬａ，Ｌｂで表わされる１〜６個の置換若しくは
非置換メチン結合からなるメチン鎖（メチン結合１個の
場合は炭素原子で連結されメチン鎖を形成しないが便宜
上、メチン鎖と称する。）で連結され、三つの芳香族複
素環による共鳴系を形成する。但しＬａ，Ｌｂのうち１
つは省略され、２つの芳香族複素環が直接連結されてい
てもよい。メチン結合の数は奇数個、偶数個のどちらで
もよい。偶数個では芳香族複素環とシングルボンドかダ
ブルボンドのいずれか一方により連結するが、奇数個で
は両方により連結することになる。メチン鎖の単位は好
ましくは、ダブルボンドを両端に持つような２つのメチ
ン結合である。また、その繰り返し単位の数は３以下、
即ち、メチン結合で６個以下である。メチン鎖がこれ以
上長いと吸収波長が９００nm以上と長くなり過ぎ、化合
物自体も不安定となる。また、ＬａとＬｂがともに存在
しないと芳香族複素環同士が直接連結することとなる
が、この場合は吸収波長が６００nmより短くなるので好
ましくない。
素環はＬａ，Ｌｂで表わされる１〜６個の置換若しくは
非置換メチン結合からなるメチン鎖（メチン結合１個の
場合は炭素原子で連結されメチン鎖を形成しないが便宜
上、メチン鎖と称する。）で連結され、三つの芳香族複
素環による共鳴系を形成する。但しＬａ，Ｌｂのうち１
つは省略され、２つの芳香族複素環が直接連結されてい
てもよい。メチン結合の数は奇数個、偶数個のどちらで
もよい。偶数個では芳香族複素環とシングルボンドかダ
ブルボンドのいずれか一方により連結するが、奇数個で
は両方により連結することになる。メチン鎖の単位は好
ましくは、ダブルボンドを両端に持つような２つのメチ
ン結合である。また、その繰り返し単位の数は３以下、
即ち、メチン結合で６個以下である。メチン鎖がこれ以
上長いと吸収波長が９００nm以上と長くなり過ぎ、化合
物自体も不安定となる。また、ＬａとＬｂがともに存在
しないと芳香族複素環同士が直接連結することとなる
が、この場合は吸収波長が６００nmより短くなるので好
ましくない。
【００２７】一般式（Ｉ）で表わされる化合物は、一般
式（II）のイオン化した塩の構造のものでもよい。塩の
場合は生体関連物質とのイオン結合的な相互作用を期待
する場合に用いられる。一般式（II）中、
式（II）のイオン化した塩の構造のものでもよい。塩の
場合は生体関連物質とのイオン結合的な相互作用を期待
する場合に用いられる。一般式（II）中、
【００２８】
【外５】 は酸基を示すが、これは後述する一般式（IV）中の酸基
と同じである。
と同じである。
【００２９】芳香族複素環の例としては次ぎのものが挙
げられる。
げられる。
【００３０】
【化７】 （式中、Ｒａ，Ｒｂ，Ｒｃ，Ｒｄは、各々独立に水素原
子または置換基を示す。） 置換基の例としては、アルキル基、Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ等の
ハロゲン原子、アルコキシ基、アルキルスルフォネ−ト
基、アルケニル基等が挙げられる。
子または置換基を示す。） 置換基の例としては、アルキル基、Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ等の
ハロゲン原子、アルコキシ基、アルキルスルフォネ−ト
基、アルケニル基等が挙げられる。
【００３１】次に、Ｌａ，Ｌｂを以下に例示する。
【００３２】
【化８】 （式中、Ｒｅ，Ｒｆは上述Ｒａ〜Ｒｄに加え、アリ−ル
基、アラルキル基等を示し、ｐは０，１，２，３の整数
を示す。） 以上で構成される代表的な化合物としては三核型シアニ
ン色素、三核型メロシアニン色素、三核型ローダシアニ
ン色素、三核型オキソノール色素、三核型スチリル色
素、三核型ベーススチリル色素などが挙げられる。
基、アラルキル基等を示し、ｐは０，１，２，３の整数
を示す。） 以上で構成される代表的な化合物としては三核型シアニ
ン色素、三核型メロシアニン色素、三核型ローダシアニ
ン色素、三核型オキソノール色素、三核型スチリル色
素、三核型ベーススチリル色素などが挙げられる。
【００３３】該三核型色素の好ましい構造として一般式
（III)、 一般式（IV）の構造が挙げられるが、特に一般
式(III) の三核型色素が好ましい。
（III)、 一般式（IV）の構造が挙げられるが、特に一般
式(III) の三核型色素が好ましい。
【００３４】本発明において、アルキル基としては、例
えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プ
ロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｉｓｏ−
ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−アミル基、ｔ−アミル
基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−オクチル基、ｔ−オクチル基
等の炭素数が１〜１２個、特に１〜４個の直鎖状又は分
岐状のものが好ましい。
えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プ
ロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｉｓｏ−
ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−アミル基、ｔ−アミル
基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−オクチル基、ｔ−オクチル基
等の炭素数が１〜１２個、特に１〜４個の直鎖状又は分
岐状のものが好ましい。
【００３５】また置換アルキル基としては、例えば２−
ヒドロキシエチル、２−メトキシエチル、２−エトキシ
エチル、３−ヒドロキシプロピル、３−メトキシプロピ
ル、３−エトキシプロピル、３−クロロプロピル、３−
ブロモプロピル、３−カルボキシプロピル等が挙げられ
る。またアルコキシル基としては例えば、メトキシ、エ
トキシ、プロポキシ、エトキシエチル、メトキシメチル
などが挙げられる。
ヒドロキシエチル、２−メトキシエチル、２−エトキシ
エチル、３−ヒドロキシプロピル、３−メトキシプロピ
ル、３−エトキシプロピル、３−クロロプロピル、３−
ブロモプロピル、３−カルボキシプロピル等が挙げられ
る。またアルコキシル基としては例えば、メトキシ、エ
トキシ、プロポキシ、エトキシエチル、メトキシメチル
などが挙げられる。
【００３６】アルコキシ基としては上記アルキル基と同
様の炭素数、構造のものを挙げることができる。例え
ば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、エトキシエチル
等である。
様の炭素数、構造のものを挙げることができる。例え
ば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、エトキシエチル
等である。
【００３７】置換又は非置換のアリール基としては、例
えば、フェニル、トリル、キシリル、ビフェニル、アミ
ノフェニル、α−ナフチル、β−ナフチル、アントラリ
ル、ピレニル、メトキシフェニル、ジメトキシフェニ
ル、トリメトキシフェニル、エトキシフェニル、ジエト
キシフェニル、クロロフェニル、ジクロロフェニル、ト
リクロロフェニル、ブロモフェニル、ジブロモフェニ
ル、トリブロモフェニル、エチルフェニル、ジエチルフ
ェニル、ニトロフェニル、アミノフェニル、ジメチルア
ミノフェニル、ジエチルアミノフェニル、ジベンジルア
ミノフェニル、ジプロピルアミノフェニル、モルホリノ
フェニル、ピペリジニルフェニル、ピペラジノフェニ
ル、ジフェニルアミノフェニル、アセチルアミノフェニ
ル、ベンゾイルアミノフェニル、アセチルフェニル、ベ
ンゾイルフェニル、シアノフェニル、スルフォホネート
フェニル、カルボキシレートフェニルなどが挙げられ
る。
えば、フェニル、トリル、キシリル、ビフェニル、アミ
ノフェニル、α−ナフチル、β−ナフチル、アントラリ
ル、ピレニル、メトキシフェニル、ジメトキシフェニ
ル、トリメトキシフェニル、エトキシフェニル、ジエト
キシフェニル、クロロフェニル、ジクロロフェニル、ト
リクロロフェニル、ブロモフェニル、ジブロモフェニ
ル、トリブロモフェニル、エチルフェニル、ジエチルフ
ェニル、ニトロフェニル、アミノフェニル、ジメチルア
ミノフェニル、ジエチルアミノフェニル、ジベンジルア
ミノフェニル、ジプロピルアミノフェニル、モルホリノ
フェニル、ピペリジニルフェニル、ピペラジノフェニ
ル、ジフェニルアミノフェニル、アセチルアミノフェニ
ル、ベンゾイルアミノフェニル、アセチルフェニル、ベ
ンゾイルフェニル、シアノフェニル、スルフォホネート
フェニル、カルボキシレートフェニルなどが挙げられ
る。
【００３８】本発明において、アルケニル基としては、
例えば、ビニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、
ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ドデシニルなど
炭素数１〜１０、好ましくは１〜６のものを挙げること
ができる。
例えば、ビニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、
ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ドデシニルなど
炭素数１〜１０、好ましくは１〜６のものを挙げること
ができる。
【００３９】本発明において、置換または非置換のアラ
ルキル基としては例えば、ベンジル、フェネチル、トリ
ルメチル、ヒドロキシベンジル、２−ヒドロキシ−３−
メチルベンジル、２−ヒドロキシ−３−ｔ−ブチルベン
ジルなどを挙げることができ、炭素数としては７〜１９
個、特に７〜１５個のものが好ましい。
ルキル基としては例えば、ベンジル、フェネチル、トリ
ルメチル、ヒドロキシベンジル、２−ヒドロキシ−３−
メチルベンジル、２−ヒドロキシ−３−ｔ−ブチルベン
ジルなどを挙げることができ、炭素数としては７〜１９
個、特に７〜１５個のものが好ましい。
【００４０】一般式(III) 又は一般式（IV）で示される
化合物（標識材）は一般に難水溶性であるので、これら
化合物に水溶性を付与するためにｒ1 〜ｒ21の一つ以上
が極性基を含むことが好ましい。該極性基には、例えば
ヒドロキシ基、アルキルヒドロキシ基、スルホネート
基、アルキルスルホネート基、カルボキシレート基、ア
ルキルカルボキシレート基、４級アンモニウム塩基など
公知のものが含まれる。但し、担体である生体関連物質
が分子量の大きい水溶性の物質である場合は、担持する
標識材が難水溶性であっても標識複合体全体としては水
溶性となるので、上記極性基は必ずしも必要ではない。
生体関連物質は後述するが、このような生体関連物質と
しては例えば、核酸類や抗体や糖蛋白等を挙げることが
できる。
化合物（標識材）は一般に難水溶性であるので、これら
化合物に水溶性を付与するためにｒ1 〜ｒ21の一つ以上
が極性基を含むことが好ましい。該極性基には、例えば
ヒドロキシ基、アルキルヒドロキシ基、スルホネート
基、アルキルスルホネート基、カルボキシレート基、ア
ルキルカルボキシレート基、４級アンモニウム塩基など
公知のものが含まれる。但し、担体である生体関連物質
が分子量の大きい水溶性の物質である場合は、担持する
標識材が難水溶性であっても標識複合体全体としては水
溶性となるので、上記極性基は必ずしも必要ではない。
生体関連物質は後述するが、このような生体関連物質と
しては例えば、核酸類や抗体や糖蛋白等を挙げることが
できる。
【００４１】またｒ1 〜ｒ5 又はｒ12〜ｒ15 は一般式
(III)又は一般式（IV）の化合物が生体由来物質と共有
結合を形成可能にするために、一つ以上の反応性基を含
むことが好ましい。但し、用いる生体関連物質とインタ
−カレ−トする場合や、イオン結合等により担持できる
場合は、必ずしも必要ない。
(III)又は一般式（IV）の化合物が生体由来物質と共有
結合を形成可能にするために、一つ以上の反応性基を含
むことが好ましい。但し、用いる生体関連物質とインタ
−カレ−トする場合や、イオン結合等により担持できる
場合は、必ずしも必要ない。
【００４２】該反応性基としては、イソシアネート、イ
ソチオシアネート、スクシンイミドエステル、スルホス
クシンイミドエステル、イミドエステル、ヒドラジン、
ニトロアリールハライド、ビピリジンジスルフィド、マ
レイミド、チオフタルイミド、酸ハライド、スルホニル
ハライド、アジリジン、アジドニトロフェニル、アジド
アミノ、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド
などの公知の反応性部位を含む。また、これらの反応性
部位は標識材と生体由来物質との結合の立体障害を防ぐ
目的で
ソチオシアネート、スクシンイミドエステル、スルホス
クシンイミドエステル、イミドエステル、ヒドラジン、
ニトロアリールハライド、ビピリジンジスルフィド、マ
レイミド、チオフタルイミド、酸ハライド、スルホニル
ハライド、アジリジン、アジドニトロフェニル、アジド
アミノ、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド
などの公知の反応性部位を含む。また、これらの反応性
部位は標識材と生体由来物質との結合の立体障害を防ぐ
目的で
【００４３】
【化９】 （ｑ＝０，１〜６）などのスペーサ部を介在させてもよ
い。
い。
【００４４】特に上記反応性基として好ましいものは、
イソチオシアネート、スルホスクシンイミドエステル、
スクシンイミドエステル、マレイミドなどである。
イソチオシアネート、スルホスクシンイミドエステル、
スクシンイミドエステル、マレイミドなどである。
【００４５】次に、一般式（IV）中、
【００４６】
【外６】 は酸基で、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオ
ン、過塩素酸塩イオン、ベンゼンスルホン酸塩イオン、
ｐ−トルエンスルホン酸塩イオン、メチル硫酸塩イオ
ン、エチル硫酸塩イオン、プロピル硫酸塩イオン、テト
ラフルオロホウ酸塩イオン、テトラフェニルホウ酸塩イ
オン、ヘキサフルオロリン酸塩イオン、ベンゼンスルフ
ィン酸塩イオン、酢酸塩イオン、トリフルオロ酢酸塩イ
オン、プロピオン酸塩イオン、安息香酸塩イオン、シュ
ウ酸塩イオン、コハク酸塩イオン、マロン酸塩イオン、
オレイン酸塩イオン、ステアリン酸塩イオン、クエン酸
塩イオン、一水素二リン酸塩イオン、二水素一リン酸塩
イオン、ペンタクロロスズ酸塩イオン、クロロスルホン
酸塩イオン、フルオロスルホン酸塩イオン、トリフルオ
ロメタンスルホン酸塩イオン、ヘキサフルオロアンチモ
ン酸塩イオン、モリブテン酸塩イオン、タングステン酸
塩イオン、チタン酸塩イオン、ジルコン酸塩イオンなど
を表わす。
ン、過塩素酸塩イオン、ベンゼンスルホン酸塩イオン、
ｐ−トルエンスルホン酸塩イオン、メチル硫酸塩イオ
ン、エチル硫酸塩イオン、プロピル硫酸塩イオン、テト
ラフルオロホウ酸塩イオン、テトラフェニルホウ酸塩イ
オン、ヘキサフルオロリン酸塩イオン、ベンゼンスルフ
ィン酸塩イオン、酢酸塩イオン、トリフルオロ酢酸塩イ
オン、プロピオン酸塩イオン、安息香酸塩イオン、シュ
ウ酸塩イオン、コハク酸塩イオン、マロン酸塩イオン、
オレイン酸塩イオン、ステアリン酸塩イオン、クエン酸
塩イオン、一水素二リン酸塩イオン、二水素一リン酸塩
イオン、ペンタクロロスズ酸塩イオン、クロロスルホン
酸塩イオン、フルオロスルホン酸塩イオン、トリフルオ
ロメタンスルホン酸塩イオン、ヘキサフルオロアンチモ
ン酸塩イオン、モリブテン酸塩イオン、タングステン酸
塩イオン、チタン酸塩イオン、ジルコン酸塩イオンなど
を表わす。
【００４７】以下に一般式(III) と(IV)の標識材の具体
例（化合物番号１〜１２）を示すが本発明の標識材はこ
れらの化合物に限定されるものではない。
例（化合物番号１〜１２）を示すが本発明の標識材はこ
れらの化合物に限定されるものではない。
【００４８】
【化１０】
【００４９】
【化１１】 表１に例示した色素の最大吸収波長（ｎｍ）と最大蛍光
波長（ｎｍ）を示す（溶媒メタノール）。
波長（ｎｍ）を示す（溶媒メタノール）。
【００５０】
【表１】 本発明の標識材は赤色〜近赤外域６００〜９００ｎｍの
波長領域で光を吸収し、そのモル吸光度係数εは２０，
０００〜１００，０００ ｌ／ｍｏｌ・ｃｍの範囲にあ
る。
波長領域で光を吸収し、そのモル吸光度係数εは２０，
０００〜１００，０００ ｌ／ｍｏｌ・ｃｍの範囲にあ
る。
【００５１】またこれらの標識材は最大吸収波長から長
波側に約５０〜１００ｎｍ程度シフトした最大蛍光波長
の蛍光を発する。
波側に約５０〜１００ｎｍ程度シフトした最大蛍光波長
の蛍光を発する。
【００５２】本発明にかかる上述標識材の基本骨格であ
る三核型色素は、「ＴＨＥ ＣＹＡＮＩＮＥ ＤＹＥＳ
ＡＮＤ ＲＥＬＡＴＥＤ ＣＯＭＰＯＵＮＤＳ」（Ｆ
ｒｅｎｃｅｓ．Ｍ．Ｈａｍｅｒ著、１９６４）ｐ６１２
〜６８４等に記載されており、任意の方法で製造しうる
ものである。また、生体関連物質と共有結合する官能基
の導入は例えば、三核型シアニンカルボン酸塩に縮合剤
（ＮＮ’ジシクロヘキシルカルボジイミド等）を用いて
スクシンイミド化剤（Ｎ−ヒドロキシスルホサイシンイ
ミドＮａ等）を反応させる等の方法により行うことがで
きる。
る三核型色素は、「ＴＨＥ ＣＹＡＮＩＮＥ ＤＹＥＳ
ＡＮＤ ＲＥＬＡＴＥＤ ＣＯＭＰＯＵＮＤＳ」（Ｆ
ｒｅｎｃｅｓ．Ｍ．Ｈａｍｅｒ著、１９６４）ｐ６１２
〜６８４等に記載されており、任意の方法で製造しうる
ものである。また、生体関連物質と共有結合する官能基
の導入は例えば、三核型シアニンカルボン酸塩に縮合剤
（ＮＮ’ジシクロヘキシルカルボジイミド等）を用いて
スクシンイミド化剤（Ｎ−ヒドロキシスルホサイシンイ
ミドＮａ等）を反応させる等の方法により行うことがで
きる。
【００５３】本発明においては、上記標識体を生体関連
物質に担持させるものであるが、担持させる生体関連物
質の選択は、分析すべき物質又は被検体によって決ま
る。即ち、生体関連物質は被検体に対して、生物学的特
異性を示すものを選択すると、特異的検出が可能にな
る。ここで言う、生体関連物質は天然もしくは合成のペ
プチド、蛋白質、酵素、糖類、レクチン、ウイルス、細
菌、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗原（例えばコンビナント
抗原も含む）抗体などを含む。また臨床病理的に特に有
用な物質としては、以下のものがあげられる。
物質に担持させるものであるが、担持させる生体関連物
質の選択は、分析すべき物質又は被検体によって決ま
る。即ち、生体関連物質は被検体に対して、生物学的特
異性を示すものを選択すると、特異的検出が可能にな
る。ここで言う、生体関連物質は天然もしくは合成のペ
プチド、蛋白質、酵素、糖類、レクチン、ウイルス、細
菌、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗原（例えばコンビナント
抗原も含む）抗体などを含む。また臨床病理的に特に有
用な物質としては、以下のものがあげられる。
【００５４】ＩｇＧ．ＩｇＭ．ＩｇＥなどの免疫グロブ
リン：補体、ＣＲＰ．フェリチン、α1 マイクログロブ
リン、β2 マイクログロブリンなどの血漿蛋白およびそ
れらの抗体：α−フェトプロテイン、癌胎児性抗原（Ｃ
ＥＡ）、前立腺性酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、ＣＡ
１９−９、ＣＡ−１２５などの腫瘍マーカおよびそれら
の抗体：黄体化ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン
（ＦＳＨ）、ヒト繊毛性ゴナドトロビン（ｈＣＧ）、エ
ストロゲン、インスリンなどのホルモン類およびそれら
の抗体：ＨＢＶ関連抗原（ＨＢｓ．ＨＢｅ．ＨＢｃ）．
ＨＩＶ．ＡＴＬなどウイルス感染関連物質およびそれら
の抗体：ジフテリア菌、ボツリヌス菌、マイコプラズ
マ、梅毒トレポネーマなどのバクテリア類およびそれら
の抗体：トキソプラズマ、トリコモナス、リーシュマニ
ア、トリバノゾーマ、マラリア原虫などの原虫類および
それらの抗体：フェニトイン、フェノバルビタールなど
の抗てんかん薬、キニジン、ジゴキシニンなどの心血管
薬、テオフィリンなどの抗喘息薬、クロラムフェニコー
ル、ゲンタマイシンなどの抗生物質などの薬物類および
それらの抗体：その他酵素、菌体外毒素（スチレリジン
Ｏなど）およびそれらの抗体などがあり、検体中の被測
定物質と抗原−抗体反応等を起こす物質が検体の種類に
応じて適宜選択されて使用される。これらは、常法に従
い調製することができる。
リン：補体、ＣＲＰ．フェリチン、α1 マイクログロブ
リン、β2 マイクログロブリンなどの血漿蛋白およびそ
れらの抗体：α−フェトプロテイン、癌胎児性抗原（Ｃ
ＥＡ）、前立腺性酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、ＣＡ
１９−９、ＣＡ−１２５などの腫瘍マーカおよびそれら
の抗体：黄体化ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン
（ＦＳＨ）、ヒト繊毛性ゴナドトロビン（ｈＣＧ）、エ
ストロゲン、インスリンなどのホルモン類およびそれら
の抗体：ＨＢＶ関連抗原（ＨＢｓ．ＨＢｅ．ＨＢｃ）．
ＨＩＶ．ＡＴＬなどウイルス感染関連物質およびそれら
の抗体：ジフテリア菌、ボツリヌス菌、マイコプラズ
マ、梅毒トレポネーマなどのバクテリア類およびそれら
の抗体：トキソプラズマ、トリコモナス、リーシュマニ
ア、トリバノゾーマ、マラリア原虫などの原虫類および
それらの抗体：フェニトイン、フェノバルビタールなど
の抗てんかん薬、キニジン、ジゴキシニンなどの心血管
薬、テオフィリンなどの抗喘息薬、クロラムフェニコー
ル、ゲンタマイシンなどの抗生物質などの薬物類および
それらの抗体：その他酵素、菌体外毒素（スチレリジン
Ｏなど）およびそれらの抗体などがあり、検体中の被測
定物質と抗原−抗体反応等を起こす物質が検体の種類に
応じて適宜選択されて使用される。これらは、常法に従
い調製することができる。
【００５５】本発明において標識材を上記生理活性物質
等の生体関連物質に担持（固定化）させるには以下の公
知の方法が利用できる。
等の生体関連物質に担持（固定化）させるには以下の公
知の方法が利用できる。
【００５６】例えば、ｉ）イオン結合法、ii) 物理吸着
法、iii)共有結合法などが挙げられる。
法、iii)共有結合法などが挙げられる。
【００５７】イオン結合法は、主に正の電荷をもつ標識
材を静電的に蛋白質、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の生体関連物質
に結合させるものである。
材を静電的に蛋白質、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の生体関連物質
に結合させるものである。
【００５８】物理吸着法は、標識材の親油性部と蛋白質
の親油性部との疎水結合を利用する結合法である。
の親油性部との疎水結合を利用する結合法である。
【００５９】イオン結合法、および物理吸着法において
は結合反応工程は簡単であるが、標識材と生体関連物質
との結合力が弱い。
は結合反応工程は簡単であるが、標識材と生体関連物質
との結合力が弱い。
【００６０】一方、共有結合法は、標識材又は生体由来
物質の少なくとも一方に反応性の高い官能基を結合し、
これを介して両者を共有結合するものであり、強固な結
合力が得られる。共有結合法により標識材と生体関連物
質とを結合させる際に、生体関連物質中の結合に関与で
きる官能基としては、遊離のアミノ基、水酸基、リン酸
基、カルボキシル基、システインのスルフヒドリル基、
ヒスチジンのイミダゾール基、チロシンのフェノール
基、セリン，トレオニンの水酸基などである。
物質の少なくとも一方に反応性の高い官能基を結合し、
これを介して両者を共有結合するものであり、強固な結
合力が得られる。共有結合法により標識材と生体関連物
質とを結合させる際に、生体関連物質中の結合に関与で
きる官能基としては、遊離のアミノ基、水酸基、リン酸
基、カルボキシル基、システインのスルフヒドリル基、
ヒスチジンのイミダゾール基、チロシンのフェノール
基、セリン，トレオニンの水酸基などである。
【００６１】これらの官能基は、種々のジアゾニウム
塩、酸アミド、イソシアナート、活性型のハロゲン化ア
ルキル基、活性型のエステル基などと反応する。従っ
て、これらの官能基を標識材に導入することにより、種
々の方法で色素を生体由来物質に担持できる。一方、生
体関連物質、特に蛋白質を含む生体由来物質の高次構造
は、水素結合、疎水結合、イオン結合などの比較的弱い
結合によって保持されているため壊れ易く、従って標識
材との固定化に際しては、高温、強酸、強アルカリなど
の処理を避けて、緩和な条件下に行なうことが望まし
い。
塩、酸アミド、イソシアナート、活性型のハロゲン化ア
ルキル基、活性型のエステル基などと反応する。従っ
て、これらの官能基を標識材に導入することにより、種
々の方法で色素を生体由来物質に担持できる。一方、生
体関連物質、特に蛋白質を含む生体由来物質の高次構造
は、水素結合、疎水結合、イオン結合などの比較的弱い
結合によって保持されているため壊れ易く、従って標識
材との固定化に際しては、高温、強酸、強アルカリなど
の処理を避けて、緩和な条件下に行なうことが望まし
い。
【００６２】緩和な条件下に固定化反応を行う１つの方
法として、標識材と生体関連物質の官能基とに反応する
二官能性の架橋剤を使用することができる。二官能性の
架橋剤としては例えば、一般式Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ′で
表わされるカルボジイミド、一般式ＣＨＯ−Ｒ−ＣＨＯ
で表わされるジアルデヒド、Ｏ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝
Ｏで表わされるジイソシアネート、などがある（Ｒ，
Ｒ′は同一、又は異なる置換、または非置換のアルキル
基、アリール基、アルキルアリール基又は、アリールア
ルキル基である）。
法として、標識材と生体関連物質の官能基とに反応する
二官能性の架橋剤を使用することができる。二官能性の
架橋剤としては例えば、一般式Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ′で
表わされるカルボジイミド、一般式ＣＨＯ−Ｒ−ＣＨＯ
で表わされるジアルデヒド、Ｏ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝
Ｏで表わされるジイソシアネート、などがある（Ｒ，
Ｒ′は同一、又は異なる置換、または非置換のアルキル
基、アリール基、アルキルアリール基又は、アリールア
ルキル基である）。
【００６３】次に、上記のようにして得た、標識材を生
体関連物質に担持させた標識複合体を用いて、特定の目
的物質を分析する方法について述べる。
体関連物質に担持させた標識複合体を用いて、特定の目
的物質を分析する方法について述べる。
【００６４】ターゲット（分析対象物）が一種の細胞も
しくは微生物であるときは、標識複合体が、標識複合体
の生体関連物質と相補的な細胞もしくは微生物の表面上
の特定物質と、抗原、抗体反応、核酸同志の水素結合等
の特異的結合で結合し、このような抗原、抗体もしくは
核酸の量をその系の蛍光量から測定することができる。
しくは微生物であるときは、標識複合体が、標識複合体
の生体関連物質と相補的な細胞もしくは微生物の表面上
の特定物質と、抗原、抗体反応、核酸同志の水素結合等
の特異的結合で結合し、このような抗原、抗体もしくは
核酸の量をその系の蛍光量から測定することができる。
【００６５】蛍光量の測定には、蛍光光度計や蛍光顕微
鏡を用いることができる。また個々の細胞や微生物を流
体系の中で、高速で通過させ励起光を照射して蛍光を観
測して、統計処理には、フロサイトメトリーを使用する
ことができる。
鏡を用いることができる。また個々の細胞や微生物を流
体系の中で、高速で通過させ励起光を照射して蛍光を観
測して、統計処理には、フロサイトメトリーを使用する
ことができる。
【００６６】本発明の標識複合体は赤色〜近赤外域（６
００〜９００nm）に励起波長をもつので赤色光から近赤
外光に発光波長のもつ半導体レーザーを励起光源として
利用できる。
００〜９００nm）に励起波長をもつので赤色光から近赤
外光に発光波長のもつ半導体レーザーを励起光源として
利用できる。
【００６７】また本発明の標識複合体のストークスシフ
トが大きいため一般の二核型シアニン系、ローダミン系
のストークスシフトの小さい標識材で標識した複合体と
組み合せて標識することで１種の波長のレーザーで同時
に２種以上の波長の蛍光を分光して測定できる。
トが大きいため一般の二核型シアニン系、ローダミン系
のストークスシフトの小さい標識材で標識した複合体と
組み合せて標識することで１種の波長のレーザーで同時
に２種以上の波長の蛍光を分光して測定できる。
【００６８】また、溶解した成分、例えば血清などの体
液中に含まれる成分をこれら標識複合材を用いて検出す
ることができる。
液中に含まれる成分をこれら標識複合材を用いて検出す
ることができる。
【００６９】抗原抗体反応を利用して分析する場合は、
標識材を抗原（あるいは抗体）に結合させた複合体と、
測定すべき抗体（標識材を抗体の方につけているなら抗
原）とを、抗原抗体反応させて、抗体（抗原）と結合し
た複合体（Ｂ＝結合型）を抗体（抗原）と結合しなかっ
た複合体（Ｆ＝遊離型）から分離した後（Ｂ／Ｆ分
離）、結合した複合体（Ｂ）の量を蛍光量から決定でき
る。上記に示した抗原抗体反応を利用した手法は“検査
と技術”ｖｏｌ・１６Ｎｏ７（１９８８）に詳しく記載
されている。
標識材を抗原（あるいは抗体）に結合させた複合体と、
測定すべき抗体（標識材を抗体の方につけているなら抗
原）とを、抗原抗体反応させて、抗体（抗原）と結合し
た複合体（Ｂ＝結合型）を抗体（抗原）と結合しなかっ
た複合体（Ｆ＝遊離型）から分離した後（Ｂ／Ｆ分
離）、結合した複合体（Ｂ）の量を蛍光量から決定でき
る。上記に示した抗原抗体反応を利用した手法は“検査
と技術”ｖｏｌ・１６Ｎｏ７（１９８８）に詳しく記載
されている。
【００７０】またＢ／Ｆ分離を容易にするために微粒子
を固定化担体としてサンドイッチアッセイにより検出す
ることもできる。
を固定化担体としてサンドイッチアッセイにより検出す
ることもできる。
【００７１】その原理を模式図１で示す。検出方法を説
明する。測定対象物質５に特異的に結合しうる第１プロ
ーブ（核酸、抗原、抗体など）１と第２プローブ３を選
択し、第１プローブは固定化担体２に担持させ、第２プ
ローブは、標識材４に結合させ標識複合体とする。
明する。測定対象物質５に特異的に結合しうる第１プロ
ーブ（核酸、抗原、抗体など）１と第２プローブ３を選
択し、第１プローブは固定化担体２に担持させ、第２プ
ローブは、標識材４に結合させ標識複合体とする。
【００７２】測定サンプル中に測定対象物質が存在する
と、反応して測定対象物質を介して第１プローブと第２
プローブが結合し結果的に固定化担体に標識複合体が結
合しているという図式になる。
と、反応して測定対象物質を介して第１プローブと第２
プローブが結合し結果的に固定化担体に標識複合体が結
合しているという図式になる。
【００７３】反応後結合しなかった標識複合体（Ｆ）を
Ｂ／Ｆ分離することにより、固体化担体上の標識複合体
の量を蛍光測定により定量することができる。
Ｂ／Ｆ分離することにより、固体化担体上の標識複合体
の量を蛍光測定により定量することができる。
【００７４】また検出時の感度を考慮すると標識複合体
は１分子の生体関連物質（プローブ）に対し２個以上の
標識材が結合していることが望ましい。従って、１分子
の生体関連物質に２個以上の標識材が結合したものと、
１個の標識材が結合したものとが混在する混合系では標
識材と生体関連物質とのモル比は１．５：１以上、特
に、２：１以上が好ましい。生体関連物質として抗体等
を用いる場合は複数の標識材を容易に結合することがで
きるが、生体関連物質として核酸を用いる場合は１級ア
ミノ基を核酸１分子に１個以上導入しそれと標識材を結
合させると、導入個数（即ち標識材の導入個数）に応じ
て測定感度が向上する。
は１分子の生体関連物質（プローブ）に対し２個以上の
標識材が結合していることが望ましい。従って、１分子
の生体関連物質に２個以上の標識材が結合したものと、
１個の標識材が結合したものとが混在する混合系では標
識材と生体関連物質とのモル比は１．５：１以上、特
に、２：１以上が好ましい。生体関連物質として抗体等
を用いる場合は複数の標識材を容易に結合することがで
きるが、生体関連物質として核酸を用いる場合は１級ア
ミノ基を核酸１分子に１個以上導入しそれと標識材を結
合させると、導入個数（即ち標識材の導入個数）に応じ
て測定感度が向上する。
【００７５】蛍光検出する際、界面活性剤を添加するこ
とで蛍光強度を増加させ検出感度を上げることができ
る。界面活性剤としては、アニオン型、ノニオン型、カ
チオン型、両性イオン型などが用いられる、添加量は、
測定溶媒に対し０．０１〜１．０重量％程度が好まし
い。
とで蛍光強度を増加させ検出感度を上げることができ
る。界面活性剤としては、アニオン型、ノニオン型、カ
チオン型、両性イオン型などが用いられる、添加量は、
測定溶媒に対し０．０１〜１．０重量％程度が好まし
い。
【００７６】例えば、ノニオン型のトウィーン２０を
０．１％添加した場合蛍光強度は約５倍増大する。
０．１％添加した場合蛍光強度は約５倍増大する。
【００７７】以下実施例により本発明を更に具体的に説
明する。
明する。
【００７８】
＜標識複合体のスト−クスシフト＞ ［実施例１］抗ヒトＣＲＰヒツジ血清（ＩｇＧ分画）
（Ｃｏｏｐｅｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ．製）
を０．５ｍｇ／ｍｌの濃度となるようｐＨ８．０のリン
酸緩衝液で希釈し抗体溶液を調製した。この抗体溶液７
ｍｌに前記Ｎｏ．４の標識材を０．３ｍｇ、１−エチル
−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミ
ドハイドロクロライド（以下ＷＳＣ）（同仁化学製）
０．０８ｇを加え室温で３時間反応させて標識材−抗体
複合体を生成させた後、セファロース６Ｂを充填したゲ
ル濾過クロマトグラフィーカラムで標識材−抗体複合体
を未反応物より分離精製した。
（Ｃｏｏｐｅｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ．製）
を０．５ｍｇ／ｍｌの濃度となるようｐＨ８．０のリン
酸緩衝液で希釈し抗体溶液を調製した。この抗体溶液７
ｍｌに前記Ｎｏ．４の標識材を０．３ｍｇ、１−エチル
−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミ
ドハイドロクロライド（以下ＷＳＣ）（同仁化学製）
０．０８ｇを加え室温で３時間反応させて標識材−抗体
複合体を生成させた後、セファロース６Ｂを充填したゲ
ル濾過クロマトグラフィーカラムで標識材−抗体複合体
を未反応物より分離精製した。
【００７９】得られた標識材−抗体複合体の吸収スペク
トルを図２に蛍光スペクトルを図３に示す。
トルを図２に蛍光スペクトルを図３に示す。
【００８０】最大吸収波長（λmax ）は６４１ｎｍで最
大蛍光波長（λem）は７３０ｎｍであり、従って、それ
らの波長の差（ストークスシフト）は８９ｎｍであっ
た。尚、表１に記載した標識材自体の最大吸収波長、最
大蛍光波長の値と標識複合体とした場合のそれらの値に
若干の相違があるのは主に測定溶媒の影響と考えられる
（以下の実施例においても同様である。）。
大蛍光波長（λem）は７３０ｎｍであり、従って、それ
らの波長の差（ストークスシフト）は８９ｎｍであっ
た。尚、表１に記載した標識材自体の最大吸収波長、最
大蛍光波長の値と標識複合体とした場合のそれらの値に
若干の相違があるのは主に測定溶媒の影響と考えられる
（以下の実施例においても同様である。）。
【００８１】また、この標識材−抗体複合体の標識材と
抗体との結合割合（モル比）は、１．９：１であった
（標識材と抗体のモル比は紫外可視吸光光度計を用い
て、それぞれ波長λ＝６４１ｎｍおよびλ＝２８０ｎｍ
の吸光度を測定し、これを用いてそれぞれ算出し
た。）。 ［実施例２］抗ヒトＨＣＧモノクローナル抗体（ＺｙＭ
ＥＤ Ｌａｂ．Ｉｎｃ．製品）を０．２５ｍｇ／ｍｌの
濃度となるようにｐＨ７．２のリン酸塩生理食塩水（Ｐ
ＢＳ）で希釈しモノクローナル溶液を調製した。この抗
体溶液７ｍｌに前記Ｎｏ．２の標識材を０．２ｍｇを加
え、２０℃で６ｈｒ攪拌しながら反応させて、標識材−
抗体複合体を生成させた後、セファロース６Ｂを充填し
たゲル濾過クロマトグラフィーカラムで標識材−抗体複
合体を未反応物より分離精製した。
抗体との結合割合（モル比）は、１．９：１であった
（標識材と抗体のモル比は紫外可視吸光光度計を用い
て、それぞれ波長λ＝６４１ｎｍおよびλ＝２８０ｎｍ
の吸光度を測定し、これを用いてそれぞれ算出し
た。）。 ［実施例２］抗ヒトＨＣＧモノクローナル抗体（ＺｙＭ
ＥＤ Ｌａｂ．Ｉｎｃ．製品）を０．２５ｍｇ／ｍｌの
濃度となるようにｐＨ７．２のリン酸塩生理食塩水（Ｐ
ＢＳ）で希釈しモノクローナル溶液を調製した。この抗
体溶液７ｍｌに前記Ｎｏ．２の標識材を０．２ｍｇを加
え、２０℃で６ｈｒ攪拌しながら反応させて、標識材−
抗体複合体を生成させた後、セファロース６Ｂを充填し
たゲル濾過クロマトグラフィーカラムで標識材−抗体複
合体を未反応物より分離精製した。
【００８２】得られた標識材−抗体複合体の最大吸収波
長（λmax ）は６７４で最大蛍光波長（λem）は７５５
ｎｍであった。従って、その差（ストークスシフト）は
８１ｎｍであった。
長（λmax ）は６７４で最大蛍光波長（λem）は７５５
ｎｍであった。従って、その差（ストークスシフト）は
８１ｎｍであった。
【００８３】また、この標識材−抗体複合体の標識材と
抗体との結合割合（モル比）は、２．２：１であった
（標識材と抗体のモル比は紫外可視吸光光度計を用いて
それぞれ波長λ＝６７４ｎｍおよびλ＝２８０ｎｍの吸
光度より算出した。）。 ［実施例３］レクチン・コンカナバリンＡ（Ｅ．Ｙ．ラ
バラトリーズ社）を０．２ｍｇ／ｍｌの濃度となるよう
ｐＨ８．２のリン酸緩衝液で希釈し、レクチン溶液を調
製した。このレクチン溶液１０ｍｌに前記Ｎｏ．３の標
識材０．２ｍｇを室温で３時間反応させた後、セファロ
ース６Ｂを充填したゲル濾過クロマトカラムで標識材−
レクチン複合体を分離精製した。
抗体との結合割合（モル比）は、２．２：１であった
（標識材と抗体のモル比は紫外可視吸光光度計を用いて
それぞれ波長λ＝６７４ｎｍおよびλ＝２８０ｎｍの吸
光度より算出した。）。 ［実施例３］レクチン・コンカナバリンＡ（Ｅ．Ｙ．ラ
バラトリーズ社）を０．２ｍｇ／ｍｌの濃度となるよう
ｐＨ８．２のリン酸緩衝液で希釈し、レクチン溶液を調
製した。このレクチン溶液１０ｍｌに前記Ｎｏ．３の標
識材０．２ｍｇを室温で３時間反応させた後、セファロ
ース６Ｂを充填したゲル濾過クロマトカラムで標識材−
レクチン複合体を分離精製した。
【００８４】得られた標識材−レクチン複合体の最大吸
収波長は６２５ｎｍで最大蛍光波長は７２０ｎｍであっ
た。従って、その差（ストークスシフト）は９５ｎｍで
あった。
収波長は６２５ｎｍで最大蛍光波長は７２０ｎｍであっ
た。従って、その差（ストークスシフト）は９５ｎｍで
あった。
【００８５】また、この複合材レクチンのモル比は３．
７：１であった（標識材およびレクチンのモル比は紫外
可視吸光光度計でそれぞれλ＝６２５ｎｍおよびλ＝２
８０ｎｍの波長での吸光度より算出した。）。 ［実施例４］Ｍ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡ（７２４９ｂ
ａｓｅ）（宝酒造ＫＫ．製）０．１ｍｇを５ｍｍｏｌリ
ン酸塩緩衝液（ｐＨ６）５ｍｌで希釈し、ＤＮＡ溶液と
した。前記Ｎｏ．２の標識材０．１ｍｇを５ｍｌの蒸留
水に溶解し、この色素溶液にＤＮＡ溶液５ｍｌを攪拌し
ながらゆっくり滴下し、さらに室温で２時間攪拌し、Ｄ
ＮＡ−標識材複合体を生成させた。
７：１であった（標識材およびレクチンのモル比は紫外
可視吸光光度計でそれぞれλ＝６２５ｎｍおよびλ＝２
８０ｎｍの波長での吸光度より算出した。）。 ［実施例４］Ｍ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡ（７２４９ｂ
ａｓｅ）（宝酒造ＫＫ．製）０．１ｍｇを５ｍｍｏｌリ
ン酸塩緩衝液（ｐＨ６）５ｍｌで希釈し、ＤＮＡ溶液と
した。前記Ｎｏ．２の標識材０．１ｍｇを５ｍｌの蒸留
水に溶解し、この色素溶液にＤＮＡ溶液５ｍｌを攪拌し
ながらゆっくり滴下し、さらに室温で２時間攪拌し、Ｄ
ＮＡ−標識材複合体を生成させた。
【００８６】上記ＤＮＡ−標識材複合体溶液にさらに４
０ｍｌのエタノールを加え、ＤＮＡ−標識材複合体を沈
殿させ、フィルタで分別した後、数回エタノールで洗浄
した。洗浄したＤＮＡ−標識材複合体は、２ｍｌの前記
リン酸塩緩衝液（ｐＨ６）中に再び溶解させた。得られ
た標識材のＤＮＡに対する結合量は、ＤＮＡ１μｇ当り
０．５μｇであった（標識材およびＤＮＡの濃度は紫外
可視吸光光度計を用いて、それぞれ波長λ＝６６８ｎｍ
およびλ＝２６０ｎｍの吸光度より算出した。）。
０ｍｌのエタノールを加え、ＤＮＡ−標識材複合体を沈
殿させ、フィルタで分別した後、数回エタノールで洗浄
した。洗浄したＤＮＡ−標識材複合体は、２ｍｌの前記
リン酸塩緩衝液（ｐＨ６）中に再び溶解させた。得られ
た標識材のＤＮＡに対する結合量は、ＤＮＡ１μｇ当り
０．５μｇであった（標識材およびＤＮＡの濃度は紫外
可視吸光光度計を用いて、それぞれ波長λ＝６６８ｎｍ
およびλ＝２６０ｎｍの吸光度より算出した。）。
【００８７】また、このＤＮＡ−標識材複合体の最大吸
収波長は６６８ｎｍ、最大蛍光波長は７５５ｎｍであ
り、それらの波長の差（ストークスシフト）は８７ｎｍ
であった。 ［実施例５］モデル標的核酸Ｍ１３ｍｐ１８ｓｓＤＮＡ
の塩基配列に部分的に相補的な塩基配列を有する２０量
体オリゴヌクレオチドを、ＡＢＩ社製３８１Ａ、ＤＮＡ
自動合成基で合成した。その後、通常のアミダイド試薬
の代わりにミリジェン社製、Ｎ−ＭＭＴ−ヒキサノール
アミンリンカーを用いて５′末端に１級アミンを導入し
た。ＣＰＧ−サポートからの切り出し、脱保護（１級ア
ミノ基の保護基であるモノメトキシトリトル基を含
む）、高速液体クロマトグラフィーによる精製は所定の
プロトコールに従った。
収波長は６６８ｎｍ、最大蛍光波長は７５５ｎｍであ
り、それらの波長の差（ストークスシフト）は８７ｎｍ
であった。 ［実施例５］モデル標的核酸Ｍ１３ｍｐ１８ｓｓＤＮＡ
の塩基配列に部分的に相補的な塩基配列を有する２０量
体オリゴヌクレオチドを、ＡＢＩ社製３８１Ａ、ＤＮＡ
自動合成基で合成した。その後、通常のアミダイド試薬
の代わりにミリジェン社製、Ｎ−ＭＭＴ−ヒキサノール
アミンリンカーを用いて５′末端に１級アミンを導入し
た。ＣＰＧ−サポートからの切り出し、脱保護（１級ア
ミノ基の保護基であるモノメトキシトリトル基を含
む）、高速液体クロマトグラフィーによる精製は所定の
プロトコールに従った。
【００８８】上記オリゴヌクレオチド２００μｇ、１Ｍ
炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝９．０）１００μｌ、水
７００μｌを混合溶解した後、あらかじめ２００μｌの
ジメチルホルムアミドに溶解しておいた前記Ｎｏ．３の
標識材２ｍｇを攪拌下ゆっくりと添加した。室温で２４
時間反応させたところ、高速液体クロマトグラフィー上
で核酸のピークが減少し、新たに核酸と標識材の吸収を
合わせ持ったピークが出現したので、反応液をゲル濾過
カラム（ファルマシア社製 ＮＡＰ−５０）で粗精製し
た後、高速液体クロマトグラフィーで精製した。１７５
μｇの核酸−標識材複合体を得た。得られた標識複合体
の核酸と標識材のモル比は、核酸１分子に１級アミノ基
１個を導入していることから１：１となる。
炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝９．０）１００μｌ、水
７００μｌを混合溶解した後、あらかじめ２００μｌの
ジメチルホルムアミドに溶解しておいた前記Ｎｏ．３の
標識材２ｍｇを攪拌下ゆっくりと添加した。室温で２４
時間反応させたところ、高速液体クロマトグラフィー上
で核酸のピークが減少し、新たに核酸と標識材の吸収を
合わせ持ったピークが出現したので、反応液をゲル濾過
カラム（ファルマシア社製 ＮＡＰ−５０）で粗精製し
た後、高速液体クロマトグラフィーで精製した。１７５
μｇの核酸−標識材複合体を得た。得られた標識複合体
の核酸と標識材のモル比は、核酸１分子に１級アミノ基
１個を導入していることから１：１となる。
【００８９】また、このＤＮＡ−標識複合体の最大吸収
波長は６２５ｎｍ、最大蛍光波長は７２０ｎｍであり、
それらの波長の差（スト−クスシフト）は９５ｎｍであ
った。 ［実施例６］モデル標的核酸Ｍ１３ｍｐ１８ｓｓＤＮＡ
の塩基配列に部分的に相補的な塩基配列を有する２０量
体オリゴヌクレオチドを、ＡＢＩ社製３８１Ａ、ＤＮＡ
自動合成装置で合成した。その後、通常のアミダイド試
薬の代わりにデオキシウリジル酸誘導体モノマー（図
４）を用いて上記２０量体オリゴヌクレオチドの５′側
に１級アミノ基を有するデオキシウリジル酸誘導体を１
０個、同様にＤＮＡ自動合成装置によって付加した。Ｃ
ＰＧ−サポートからの切り出し、脱保護（１級アミノ基
の保護基であるトリフルオロアセチル基を含む）、高速
液体クロマトグラフィーによる精製は定法により行なっ
た。
波長は６２５ｎｍ、最大蛍光波長は７２０ｎｍであり、
それらの波長の差（スト−クスシフト）は９５ｎｍであ
った。 ［実施例６］モデル標的核酸Ｍ１３ｍｐ１８ｓｓＤＮＡ
の塩基配列に部分的に相補的な塩基配列を有する２０量
体オリゴヌクレオチドを、ＡＢＩ社製３８１Ａ、ＤＮＡ
自動合成装置で合成した。その後、通常のアミダイド試
薬の代わりにデオキシウリジル酸誘導体モノマー（図
４）を用いて上記２０量体オリゴヌクレオチドの５′側
に１級アミノ基を有するデオキシウリジル酸誘導体を１
０個、同様にＤＮＡ自動合成装置によって付加した。Ｃ
ＰＧ−サポートからの切り出し、脱保護（１級アミノ基
の保護基であるトリフルオロアセチル基を含む）、高速
液体クロマトグラフィーによる精製は定法により行なっ
た。
【００９０】１級アミノ基を結合した上記オリゴヌクレ
オチド２００μｇ、１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝
９．０）１００μｌ、水７００μｌを混合溶解した後、
あらかじめ２００μｌのジメチルホルムアミドに溶解し
ておいた前記Ｎｏ．３の標識材２ｍｇを攪拌下ゆっくり
と添加した。４０℃で２４時間反応させたところ、高速
液体クロマトグラフィー上で核酸のピークが減少し、新
たに核酸と標識材の吸収を合わせ持ったピークが出現し
たので、反応液をゲル濾過カラム（ファルマシア社製
ＮＡＰ−５０）で粗精製した後、高速液体クロマトグラ
フィーで精製した。３５０μｇの核酸−標識材複合体を
得た。この核酸−標識材複合体の６２８ｎｍにおける吸
収は実施例５に示した核酸−標識材複合体の吸収に較べ
約１０倍の強度を有していた。これは、本実施例では核
酸１分子に１級アミノ基１０個を導入しているため、こ
の標識複合体の核酸と標識材のモル比は１：１０となる
のに対し、実施例５のそれが１：１であるためである。
オチド２００μｇ、１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝
９．０）１００μｌ、水７００μｌを混合溶解した後、
あらかじめ２００μｌのジメチルホルムアミドに溶解し
ておいた前記Ｎｏ．３の標識材２ｍｇを攪拌下ゆっくり
と添加した。４０℃で２４時間反応させたところ、高速
液体クロマトグラフィー上で核酸のピークが減少し、新
たに核酸と標識材の吸収を合わせ持ったピークが出現し
たので、反応液をゲル濾過カラム（ファルマシア社製
ＮＡＰ−５０）で粗精製した後、高速液体クロマトグラ
フィーで精製した。３５０μｇの核酸−標識材複合体を
得た。この核酸−標識材複合体の６２８ｎｍにおける吸
収は実施例５に示した核酸−標識材複合体の吸収に較べ
約１０倍の強度を有していた。これは、本実施例では核
酸１分子に１級アミノ基１０個を導入しているため、こ
の標識複合体の核酸と標識材のモル比は１：１０となる
のに対し、実施例５のそれが１：１であるためである。
【００９１】また、該ＤＮＡ−標識複合体の最大吸収波
長は６２８ｎｍで最大蛍光波長は７２０ｎｍであり、そ
れらの波長差（ストークスシフト）は９２ｎｍであっ
た。 ［実施例７］実施例１で調製した抗体溶液７ｍｌに前記
Ｎｏ．１２色素０．３ｍｇ、ＷＳＣ０．０８ｇを加え
て、室温で３時間反応させて、標識材−抗体複合体を生
成させた後、セファロース６Ｂを充填したゲル濾過クロ
マトグラフィーで標識材−抗体複合体を分離精製した。
長は６２８ｎｍで最大蛍光波長は７２０ｎｍであり、そ
れらの波長差（ストークスシフト）は９２ｎｍであっ
た。 ［実施例７］実施例１で調製した抗体溶液７ｍｌに前記
Ｎｏ．１２色素０．３ｍｇ、ＷＳＣ０．０８ｇを加え
て、室温で３時間反応させて、標識材−抗体複合体を生
成させた後、セファロース６Ｂを充填したゲル濾過クロ
マトグラフィーで標識材−抗体複合体を分離精製した。
【００９２】得られた標識材−抗体複合体の最大吸収波
長（λmax ）は７８０ｎｍで最大蛍光波長（λem）は８
３５ｎｍであり、そのストークスシフトは５５ｎｍであ
った。
長（λmax ）は７８０ｎｍで最大蛍光波長（λem）は８
３５ｎｍであり、そのストークスシフトは５５ｎｍであ
った。
【００９３】また、この標識材−抗体複合体の標識材と
抗体との結合割合（モル比）は、１．９：１であった
（標識材と抗体のモル比は紫外可視吸光光度計を用い
て、それぞれ波長λ＝７８０ｎｍおよびλ＝２８０ｎｍ
の吸光度より算出した。）。 ［比較例１］従来の二核型の代表的な色素（二核型シア
ニン色素）の化学構造を次に示す。
抗体との結合割合（モル比）は、１．９：１であった
（標識材と抗体のモル比は紫外可視吸光光度計を用い
て、それぞれ波長λ＝７８０ｎｍおよびλ＝２８０ｎｍ
の吸光度より算出した。）。 ［比較例１］従来の二核型の代表的な色素（二核型シア
ニン色素）の化学構造を次に示す。
【００９４】
【化１２】 実施例１で調製した抗体溶液７ｍｌに上記色素０．３ｍ
ｇ、ＷＳＣ０．０８ｇを加えて、室温で３時間反応させ
て、標識材−抗体複合体を生成させた後、セファロース
６Ｂを充填したゲル濾過クロマトグラフィーで標識材−
抗体複合体を分離精製した。
ｇ、ＷＳＣ０．０８ｇを加えて、室温で３時間反応させ
て、標識材−抗体複合体を生成させた後、セファロース
６Ｂを充填したゲル濾過クロマトグラフィーで標識材−
抗体複合体を分離精製した。
【００９５】得られた標識材−抗体複合体の最大吸収波
長（λmax ）は７８５ｎｍで最大蛍光波長（λem）は８
１５ｎｍであり、そのストークスシフトは３０ｎｍにす
ぎなかった。
長（λmax ）は７８５ｎｍで最大蛍光波長（λem）は８
１５ｎｍであり、そのストークスシフトは３０ｎｍにす
ぎなかった。
【００９６】また、この標識材−抗体複合体の標識材と
抗体との結合割合（モル比）は、１．５：１であった
（標識材と抗体のモル比は紫外可視吸光光度計を用い
て、それぞれ波長λ＝７８５ｎｍおよびλ＝２８０ｎｍ
の吸光度より算出した。）。 ［比較例２］従来のポリメチン鎖がブリッジした二核型
シアニン色素の化学構造を次に示す。
抗体との結合割合（モル比）は、１．５：１であった
（標識材と抗体のモル比は紫外可視吸光光度計を用い
て、それぞれ波長λ＝７８５ｎｍおよびλ＝２８０ｎｍ
の吸光度より算出した。）。 ［比較例２］従来のポリメチン鎖がブリッジした二核型
シアニン色素の化学構造を次に示す。
【００９７】
【化１３】 実施例１で調製した抗体溶液７ｍｌに上記色素０．３ｍ
ｇ、ＷＳＣ０．０８ｇを加えて、室温で３時間反応させ
て、標識材−抗体複合体を生成させた後、セファロース
６Ｂを充填したゲル濾過クロマトグラフィーで標識材−
抗体複合体を分離精製した。
ｇ、ＷＳＣ０．０８ｇを加えて、室温で３時間反応させ
て、標識材−抗体複合体を生成させた後、セファロース
６Ｂを充填したゲル濾過クロマトグラフィーで標識材−
抗体複合体を分離精製した。
【００９８】得られた標識材−抗体複合体の最大吸収波
長（λmax ）は７８２ｎｍで最大蛍光波長（λem）は８
１０ｎｍであり、そのストークスシフトは２８ｎｍにす
ぎなかった。
長（λmax ）は７８２ｎｍで最大蛍光波長（λem）は８
１０ｎｍであり、そのストークスシフトは２８ｎｍにす
ぎなかった。
【００９９】また、この標識材−抗体複合体の標識材と
抗体との結合割合（モル比）は、１．７：１であった
（標識材と抗体のモル比は紫外可視吸光光度計を用い
て、それぞれ波長λ＝７８２ｎｍおよびλ＝２８０ｎｍ
の吸光度より算出した。）。
抗体との結合割合（モル比）は、１．７：１であった
（標識材と抗体のモル比は紫外可視吸光光度計を用い
て、それぞれ波長λ＝７８２ｎｍおよびλ＝２８０ｎｍ
の吸光度より算出した。）。
【０１００】上記実施例１〜７で示されるように本発明
の３核型色素を標識材とした標識複合体の最大吸収波長
と最大蛍光波長との波長差（ストークスシフト）６０ｎ
ｍ以上であったのに対して、比較例１，２で示した二核
型シアニン系色素や特定ローダミン系色素に代表され
る、赤色〜近赤外光に吸収をもつ色素のストークスシフ
トは２０ｎｍ〜４０ｎｍにすぎず、本発明の標識複合体
によれば分光容易であり、高いＳ／Ｎ比で分析対象物の
検出が可能であることが判る。 ＜標識複合体の保存安定性＞標識複合体の保存安定性を
調べるために以下の実験を行った。
の３核型色素を標識材とした標識複合体の最大吸収波長
と最大蛍光波長との波長差（ストークスシフト）６０ｎ
ｍ以上であったのに対して、比較例１，２で示した二核
型シアニン系色素や特定ローダミン系色素に代表され
る、赤色〜近赤外光に吸収をもつ色素のストークスシフ
トは２０ｎｍ〜４０ｎｍにすぎず、本発明の標識複合体
によれば分光容易であり、高いＳ／Ｎ比で分析対象物の
検出が可能であることが判る。 ＜標識複合体の保存安定性＞標識複合体の保存安定性を
調べるために以下の実験を行った。
【０１０１】上記 実施例１〜７、比較例１〜２で調製
した標識複合体を所定の濃度に１０ｍｍｏｌリン酸塩緩
衝液（ｐＨ７．２）で調整し、この標識複合体の溶液を
１０℃で遮光下、３日間保存した。
した標識複合体を所定の濃度に１０ｍｍｏｌリン酸塩緩
衝液（ｐＨ７．２）で調整し、この標識複合体の溶液を
１０℃で遮光下、３日間保存した。
【０１０２】保存安定性テストの開始時および終了時の
吸光度および蛍光強度を所定の波長で測定し、開始時の
吸光度および蛍光強度を１００としたときの終了時の吸
光度及び蛍光強度の割合を算出した。
吸光度および蛍光強度を所定の波長で測定し、開始時の
吸光度および蛍光強度を１００としたときの終了時の吸
光度及び蛍光強度の割合を算出した。
【０１０３】
【表２】 表２で示したように本発明に係る標識複合体の水中での
吸光度変化及び蛍光強度変化は比較品よりも小さく、本
発明の標識複合体は保存安定性に優れていた。蛍蛍施例
１〜７で示されるように本発明の標識複合体は最大吸収
波長と最大蛍光波長との波長差（ストークスシフト）６
０ｎｍ以上である。
吸光度変化及び蛍光強度変化は比較品よりも小さく、本
発明の標識複合体は保存安定性に優れていた。蛍蛍施例
１〜７で示されるように本発明の標識複合体は最大吸収
波長と最大蛍光波長との波長差（ストークスシフト）６
０ｎｍ以上である。
【０１０４】比較例１，２で示した二核型シアニン系色
素や特定ローダミン系色素に代表される、赤色〜近赤外
光に吸収をもつ色素のストークスシフトが２０ｎｍ〜４
０ｎｍであるのに比べ大きい。
素や特定ローダミン系色素に代表される、赤色〜近赤外
光に吸収をもつ色素のストークスシフトが２０ｎｍ〜４
０ｎｍであるのに比べ大きい。
【０１０５】
【発明の効果】以上説明したように、本発明の標識複合
体は、ストークスシフトが大きいため、検出において励
起光と蛍光の分離が容易で、Ｓ／Ｎ比が向上し、従っ
て、生体関連物質の分析対象物に対する特異性が同じで
も検出感度も向上する。また、ストークスシフトが小さ
い標識複合体（例えばシアニン複合体）と本発明の標識
複合体と組合せれば、レーザー等の一波長の励起光源で
同時に２種以上の蛍光波長の信号が検出できる。更に、
本発明の標識複合体は水中での蛍光強度変化が少なく、
安定なため、微量分析に応用する場合、貯蔵安定性に優
れた試薬を提供できる。
体は、ストークスシフトが大きいため、検出において励
起光と蛍光の分離が容易で、Ｓ／Ｎ比が向上し、従っ
て、生体関連物質の分析対象物に対する特異性が同じで
も検出感度も向上する。また、ストークスシフトが小さ
い標識複合体（例えばシアニン複合体）と本発明の標識
複合体と組合せれば、レーザー等の一波長の励起光源で
同時に２種以上の蛍光波長の信号が検出できる。更に、
本発明の標識複合体は水中での蛍光強度変化が少なく、
安定なため、微量分析に応用する場合、貯蔵安定性に優
れた試薬を提供できる。
【図１】本発明の標識材を担持させたプローブを用いた
サンドイッチアッセイにより測定対象物質を検出する原
理を示した模式図である。
サンドイッチアッセイにより測定対象物質を検出する原
理を示した模式図である。
【図２】本発明の実施例１において得られた標識材ー抗
体複合体の吸収スペクトルを示す。
体複合体の吸収スペクトルを示す。
【図３】本発明の実施例１において得られた標識材ー抗
体複合体の蛍光スペクトルを示す。
体複合体の蛍光スペクトルを示す。
【図４】本発明の実施例６において、核酸１モルに標識
材１０モルを担持させるために用いたデオキシウリジル
酸誘導体モノマーの化学構造を示す。
材１０モルを担持させるために用いたデオキシウリジル
酸誘導体モノマーの化学構造を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年１２月２７日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正内容】
【化１】 （式中、Ｘａ，Ｘｂ，Ｘｃを含み点線で結ばれた環は各
々独立に１〜３個の酸素原子、硫黄原子、窒素原子及び
／又はセレン原子を構成原子とする非置換又は、置換若
しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアリー
ル、置換若しくは非置換のアラルキル基のいずれかに置
換された芳香族複素環を示す。Ｌａ，Ｌｂは１〜６個の
置換若しくは非置換メチン結合からなるメチン鎖を示
し、Ｌａ，Ｌｂのうち１つは省略され芳香族複素環が直
接連結されててもよい。
々独立に１〜３個の酸素原子、硫黄原子、窒素原子及び
／又はセレン原子を構成原子とする非置換又は、置換若
しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアリー
ル、置換若しくは非置換のアラルキル基のいずれかに置
換された芳香族複素環を示す。Ｌａ，Ｌｂは１〜６個の
置換若しくは非置換メチン結合からなるメチン鎖を示
し、Ｌａ，Ｌｂのうち１つは省略され芳香族複素環が直
接連結されててもよい。
【外１】 は酸基を示す。）
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項７
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１２】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成する本発
明は、生体関連物質に標識材を担持させてなり、該生体
関連物質と分析対象物を結合させ分析対象物を光学的手
段で検出するための標識複合体において、標識材が下記
一般式（Ｉ）または（II）で示される三核型色素からな
ることを特徴とする標識複合体である。
明は、生体関連物質に標識材を担持させてなり、該生体
関連物質と分析対象物を結合させ分析対象物を光学的手
段で検出するための標識複合体において、標識材が下記
一般式（Ｉ）または（II）で示される三核型色素からな
ることを特徴とする標識複合体である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１４】
【外３】 は酸基を示す。） 又本発明は、生体関連物質が該三核型色素で示される標
識材を担持させてなる上記標識複合体を用い、該標識複
合体と分析対象化合物とを結合させて分析対象化合物を
光学的手段で検出する分析法である。
識材を担持させてなる上記標識複合体を用い、該標識複
合体と分析対象化合物とを結合させて分析対象化合物を
光学的手段で検出する分析法である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５３】本発明においては、上記標識体を生体関連
物質に担持させるものであるが、担持させる生体関連物
質の選択は、分析すべき物質又は被検体によって決ま
る。また、生体関連物質は被検体に対して、生物学的特
異性を示すものを選択すると、特異的検出が可能にな
る。ここで言う、生体関連物質は天然もしくは合成のペ
プチド、蛋白質、酵素、糖類、レクチン、ウイルス、細
菌、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗原（例えばコンビナント
抗原も含む）抗体などを含む。また臨床病理的に特に有
用な物質としては、以下のものがあげられる。
物質に担持させるものであるが、担持させる生体関連物
質の選択は、分析すべき物質又は被検体によって決ま
る。また、生体関連物質は被検体に対して、生物学的特
異性を示すものを選択すると、特異的検出が可能にな
る。ここで言う、生体関連物質は天然もしくは合成のペ
プチド、蛋白質、酵素、糖類、レクチン、ウイルス、細
菌、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗原（例えばコンビナント
抗原も含む）抗体などを含む。また臨床病理的に特に有
用な物質としては、以下のものがあげられる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０５
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１０５】
【発明の効果】以上説明したように、本発明の標識複合
体は、ストークスシフトが大きいため、検出において励
起光と蛍光の分離が容易で、Ｓ／Ｎ比が向上し、検出感
度も向上する。また、ストークスシフトが小さい標識複
合体（例えばシアニン複合体）と本発明の標識複合体と
組合せれば、レーザー等の一波長の励起光源で同時に２
種以上の蛍光波長の信号が検出できる。更に、本発明の
標識複合体は水中での蛍光強度変化が少なく、安定なた
め、微量分析に応用する場合、貯蔵安定性に優れた試薬
を提供できる。
体は、ストークスシフトが大きいため、検出において励
起光と蛍光の分離が容易で、Ｓ／Ｎ比が向上し、検出感
度も向上する。また、ストークスシフトが小さい標識複
合体（例えばシアニン複合体）と本発明の標識複合体と
組合せれば、レーザー等の一波長の励起光源で同時に２
種以上の蛍光波長の信号が検出できる。更に、本発明の
標識複合体は水中での蛍光強度変化が少なく、安定なた
め、微量分析に応用する場合、貯蔵安定性に優れた試薬
を提供できる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｄ 277/34 277/36 401/14 7602−4Ｃ 403/14 7602−4Ｃ 413/14 7602−4Ｃ 417/06 9051−4Ｃ 417/14 9051−4Ｃ (72)発明者 福井 哲朗 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キヤ ノン株式会社内 (72)発明者 岡本 尚志 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キヤ ノン株式会社内 (72)発明者 山本 伸子 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キヤ ノン株式会社内
Claims (8)
- 【請求項１】 生体関連物質に標識材を担持させてな
り、該生体関連物質と分析対象物を特異的に結合させ分
析対象物を光学的手段で検出するための標識複合体にお
いて、標識材が下記一般式（Ｉ）または（II）で示され
る三核型色素からなることを特徴とする標識複合体。 【化１】 （式中、Ｘａ，Ｘｂ，Ｘｃを含み点線で結ばれた環は各
々独立に１〜３個の酸素原子、硫黄原子、窒素原子及び
／又はセレン原子を構成原子とする非置換又は、置換若
しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアリー
ル、置換若しくは非置換のアラルキル基のいずれかに置
換された芳香族複素環を示す。Ｌａ，Ｌｂは１〜６個の
置換若しくは非置換メチン結合からなるメチン鎖を示
し、Ｌａ，Ｌｂのうち１つは省略され芳香族複素環が直
接連結されててもよい。 【外１】 は酸基を示す。） - 【請求項２】 一般式（Ｉ）または（II）中、Ｘａ，Ｘ
ｂ，Ｘｃを含み点線で結ばれた環が、少なくとも１〜２
個の窒素原子を有する置換若しくは非置換の５若しくは
６員芳香族複素環又はそれを含む縮合環であることを特
徴とする請求項１に記載の標識複合体。 - 【請求項３】 三核型色素が下記一般式（III）で示さ
れる化合物又は該式中真中の複素環の４位の窒素原子が
５位にある異性構造の化合物からなることを特徴とする
請求項２に記載の標識複合体。 【化２】 （式中、ｒ8 ，ｒ9 ，ｒ10，ｒ11は各々独立に水素原
子、ハロゲン原子、置換若しくは非置換アルキル基、ア
ルコキシル基、置換若しくは非置換アリール基、置換又
は非置換アミノ基を示し、ｒ8 とｒ9 は結合して置換又
は非置換の芳香環を形成してもよい。ｒ6は繰り返し単
位中独立に、存在しないか又はアルキル置換エチエンを
示しｒ8 又はｒ9 と結合して環状構造をを形成する。ｒ
1 ，ｒ2 は置換若しくは非置換アリール基、又はｒ1 と
ｒ2 が結合した置換若しくは非置換の縮合環を示す。ｒ
3 ，ｒ4 ，ｒ5 は各々独立に、水素原子、置換若しくは
非置換アルキル基、アルキルスルホネート基、アルケニ
ル基、置換若しくは非置換アリール基、又は置換若しく
は非置換アラルキル基を示す。Ｘ1 は酸素原子、硫黄原
子、炭素原子、窒素原子又はセレン原子を示し、炭素原
子、窒素原子の場合には水素原子、置換若しくは非置換
アルキル、置換若しくは非置換アリール又は置換若しく
は非置換アラルキル基のいずれかと結合している。Ｘ2
は酸素原子、硫黄原子又は窒素原子を示し、窒素原子の
場合には、水素原子、置換若しくは非置換アルキル、置
換若しくは非置換アリール、又は置換若しくは非置換ア
ラルキル基のいずれかと結合している。Ｘ3 は酸素原子
又は硫黄原子を示す。ｍ、ｌは０〜３の整数であり、い
ずれか一方は０ではない。） - 【請求項４】 三核型色素が下記一般式（IV）で示され
る化合物又は該式中真中の複素環の４位の窒素原子が５
位にある異性構造の化合物からなることを特徴とする請
求項２に記載の標識複合体。 【化３】 （式中、ｒ19，ｒ20，ｒ21は各々独立に水素原子、ハロ
ゲン原子、置換若しくは非置換アルキル基、アルコキシ
ル基、置換若しくは非置換アリール基、置換若しくは非
置換アミノ基を示し、ｒ19とｒ20は結合して置換又は非
置換の縮合環を形成してもよい。ｒ12とｒ13，ｒ14とｒ
15は置換若しくは非置換アリール基、又はｒ12とｒ13，
ｒ14とｒ15が結合した置換若しくは非置換の縮合環示
す。ｒ16，ｒ 17，ｒ18は各々独立に水素原子、置換若し
くは非置換アルキル基、アルキルスルフォネート基、ア
ルケニル基、置換もしくは非置換アリール基、又は置換
若しくは非置換アラルキル基を示す。Ｘ4 ，Ｘ6 は各々
独立に酸素原子、硫黄原子、炭素原子、窒素原子若しく
はセレン原子を示し、炭素原子、窒素原子の場合には水
素原子、置換若しくは非置換アルキル、置換もしくは非
置換アリール、又は置換若しくは非置換アラルキル基の
いずれかと結合している。Ｘ5 は酸素原子、硫黄原子あ
るいは窒素原子を示し、窒素原子の場合には、水素原
子、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換
アリール、又は置換若しくは非置換アラルキル基のいず
れかと結合している。 【外２】 は酸基を示す。ｙは０，１，２の整数である。） - 【請求項５】 生体関連物質が抗体または抗原である請
求項１〜４のいずれかに記載の標識複合体。 - 【請求項６】 生体関連物質が核酸である請求項１〜４
のいずれかに記載の標識複合体。 - 【請求項７】 請求項１〜６のいずれかに記載の標識複
合体を用い、該標識複合体と分析対象物とを特異的に結
合させて分析対象物を光学的手段で検出する分析法。 - 【請求項８】 光学的手段による検出が蛍光検出であっ
て、蛍光検出する際、標識複合体を結合させた分析対象
物を含有する測定溶媒に界面活性剤を添加させて分析対
象物を検出する請求項７に記載の分析法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP01905793A JP3260884B2 (ja) | 1993-02-05 | 1993-02-05 | 標識複合体、それを用いる分析法、生体関連物質の検出および定量の方法 |
| EP94101720A EP0609894B1 (en) | 1993-02-05 | 1994-02-04 | Labeled complex and method of analysis therewith |
| DE69430644T DE69430644T2 (de) | 1993-02-05 | 1994-02-04 | Markierter Komplex und ihn verwendendes analytisches Verfahren |
| US08/605,624 US5719027A (en) | 1993-02-05 | 1996-02-22 | Labeled complex and method of analysis therewith |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP01905793A JP3260884B2 (ja) | 1993-02-05 | 1993-02-05 | 標識複合体、それを用いる分析法、生体関連物質の検出および定量の方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06230007A true JPH06230007A (ja) | 1994-08-19 |
| JP3260884B2 JP3260884B2 (ja) | 2002-02-25 |
Family
ID=11988806
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP01905793A Expired - Fee Related JP3260884B2 (ja) | 1993-02-05 | 1993-02-05 | 標識複合体、それを用いる分析法、生体関連物質の検出および定量の方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5719027A (ja) |
| EP (1) | EP0609894B1 (ja) |
| JP (1) | JP3260884B2 (ja) |
| DE (1) | DE69430644T2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH09104825A (ja) * | 1995-06-07 | 1997-04-22 | Carnegie Mellon Univ | シアニンと他の蛍光色素とをカップリングさせることにより形成される共鳴エネルギー伝達が可能な大きなストークスシフトを有する蛍光標識用複合体 |
| US5679516A (en) * | 1993-10-04 | 1997-10-21 | Canon Kabushiki Kaisha | Process for detecting nucleic acid by capillary electrophoresis |
| JP2008096437A (ja) * | 1995-05-19 | 2008-04-24 | Molecular Probes Inc | メロシアニン染料タンパク質染色 |
| JP2012047684A (ja) * | 2010-08-30 | 2012-03-08 | Konica Minolta Holdings Inc | 蛍光測定方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5571388A (en) * | 1984-03-29 | 1996-11-05 | Li-Cor, Inc. | Sequencing near infrared and infrared fluorescense labeled DNA for detecting using laser diodes and suitable labels thereof |
| US6060598A (en) * | 1990-05-15 | 2000-05-09 | Hyperion, Inc. | Fluorescence immunoassays using fluorescent dyes free of aggregation and serum binding |
| US5919922A (en) * | 1990-05-15 | 1999-07-06 | Hyperion, Inc. | Fluorescent dyes free of aggregation and serum binding |
| US5880287A (en) * | 1990-05-15 | 1999-03-09 | Hyperion, Inc. | Polyoxyhydrocarbyl related products and methods for fluorescence assays |
| US5922618A (en) * | 1996-03-04 | 1999-07-13 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Dye-labeled antibody conjugate and preparation method thereof |
| JP3625250B2 (ja) * | 1998-05-14 | 2005-03-02 | 松下電器産業株式会社 | 色素標識重合抗体およびその製造方法 |
| GB9712524D0 (en) * | 1997-06-16 | 1997-08-20 | Nycomed Imaging As | Method |
| EP0936651B1 (en) | 1998-02-12 | 2004-08-11 | Canon Kabushiki Kaisha | Method for manufacturing electron emission element, electron source, and image forming apparatus |
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