JPH06217763A - アグロバクテリウム・リゾゲネス ｍａｆｆ０３−０１７２４株の形質転換用菌の調整法 - Google Patents
アグロバクテリウム・リゾゲネス ｍａｆｆ０３−０１７２４株の形質転換用菌の調整法Info
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- JPH06217763A JPH06217763A JP5013389A JP1338993A JPH06217763A JP H06217763 A JPH06217763 A JP H06217763A JP 5013389 A JP5013389 A JP 5013389A JP 1338993 A JP1338993 A JP 1338993A JP H06217763 A JPH06217763 A JP H06217763A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 アグロバクテリウム・リゾゲネス ＭＡＦＦ
０３−１７２４株に外来ＤＮＡを導入する効率をあげる
為の形質転換用菌の調製法を改善する。 【構成】 エレクトロポレーション法によって、国内産
アグロバクテリウム・リゾゲネス ＭＡＦＦ０３−１７
２４株に外来ＤＮＡを導入し、形質転換するために必要
な菌の調製工程において、該菌株を２〜１０個のバッフ
ル付きのフラスコを用いて培養し、更に該菌株培養物を
１０％グリセロール液で洗浄時に、１０ｍｌの駒込ピペ
ットで１０〜１００回入念に吸引・排出を繰り返して培
養物中の凝集塊を分散することによって、外来ＤＮＡの
導入効率が高い形質転換用菌を調製することができる。
０３−１７２４株に外来ＤＮＡを導入する効率をあげる
為の形質転換用菌の調製法を改善する。 【構成】 エレクトロポレーション法によって、国内産
アグロバクテリウム・リゾゲネス ＭＡＦＦ０３−１７
２４株に外来ＤＮＡを導入し、形質転換するために必要
な菌の調製工程において、該菌株を２〜１０個のバッフ
ル付きのフラスコを用いて培養し、更に該菌株培養物を
１０％グリセロール液で洗浄時に、１０ｍｌの駒込ピペ
ットで１０〜１００回入念に吸引・排出を繰り返して培
養物中の凝集塊を分散することによって、外来ＤＮＡの
導入効率が高い形質転換用菌を調製することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、植物に毛状根を誘発す
る細菌アグロバクテリウム・リゾゲネス ＭＡＦＦ０３
−０１７２４株に、外来の有用遺伝子のＤＮＡを導入す
る効率をあげるための形質転換用菌の調製法に関する。
る細菌アグロバクテリウム・リゾゲネス ＭＡＦＦ０３
−０１７２４株に、外来の有用遺伝子のＤＮＡを導入す
る効率をあげるための形質転換用菌の調製法に関する。
【０００２】
【従来の技術】アグロバクテリウム・リゾゲネスは、双
子葉植物に毛状根を誘発する植物病原土壌細菌で、菌体
内に毛状根を誘発する巨大プラスミド（Ｒｉプラスミ
ド）を保有していることが知られている。Ｒｉプラスミ
ド上には、植物細胞に移行して染色体ＤＮＡに安定して
挿入される断片（Ｔ−ＤＮＡ）が存在し、ここには、根
の誘導に関係する幾つかの遺伝子及び誘発した毛状根で
オパインと呼ばれる非タンパク態アミノ酸誘導体を生産
させる遺伝子がコードされている［Ｗｈｉｔｅ，ｅｔ
ａｌ．，”Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ
Ａｇｅｎｔｓ （Ｈｏｈｎ ａｎｄ Ｓｃｈｅｌｌ，ｅ
ｄｓ．）”，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１４９−１７７，１９８７］。
子葉植物に毛状根を誘発する植物病原土壌細菌で、菌体
内に毛状根を誘発する巨大プラスミド（Ｒｉプラスミ
ド）を保有していることが知られている。Ｒｉプラスミ
ド上には、植物細胞に移行して染色体ＤＮＡに安定して
挿入される断片（Ｔ−ＤＮＡ）が存在し、ここには、根
の誘導に関係する幾つかの遺伝子及び誘発した毛状根で
オパインと呼ばれる非タンパク態アミノ酸誘導体を生産
させる遺伝子がコードされている［Ｗｈｉｔｅ，ｅｔ
ａｌ．，”Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ
Ａｇｅｎｔｓ （Ｈｏｈｎ ａｎｄ Ｓｃｈｅｌｌ，ｅ
ｄｓ．）”，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１４９−１７７，１９８７］。
【０００３】アグロバクテリウム・リゾゲネスによって
誘発された毛状根は、植物ホルモンを含まない植物組織
培養培地で旺盛に増殖するため、有用物質生産植物にア
グロバクテリウム・リゾゲネスを接種し、得られた毛状
根を培養して有用物質を生産する試験例が報告されてい
る（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ ａｎｄ Ｔａｎａｋａ．”Ａ
ｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．”，５５：１０１９−
１０２５，１９９１）。
誘発された毛状根は、植物ホルモンを含まない植物組織
培養培地で旺盛に増殖するため、有用物質生産植物にア
グロバクテリウム・リゾゲネスを接種し、得られた毛状
根を培養して有用物質を生産する試験例が報告されてい
る（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ ａｎｄ Ｔａｎａｋａ．”Ａ
ｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．”，５５：１０１９−
１０２５，１９９１）。
【０００４】また、毛状根から再生した植物体は、器官
の小型化や形態変異、節間の短縮による矯化、頂芽優勢
の消失、根の生育の向上による根部比率の上昇、開花期
の変動といった、いわゆる「毛状根症候群」を示すこと
が知られ（Ｔｅｐｆｅｒ，”Ｃｅｌｌ”，３７：９５９
−９６７，１９８４）、これらの形質を利用して植物の
改良を行う試みもなされている。（特開平４−１９７１
１７、特開平４−１９７１１８）。
の小型化や形態変異、節間の短縮による矯化、頂芽優勢
の消失、根の生育の向上による根部比率の上昇、開花期
の変動といった、いわゆる「毛状根症候群」を示すこと
が知られ（Ｔｅｐｆｅｒ，”Ｃｅｌｌ”，３７：９５９
−９６７，１９８４）、これらの形質を利用して植物の
改良を行う試みもなされている。（特開平４−１９７１
１７、特開平４−１９７１１８）。
【０００５】一方、毛状根から比較的容易に植物体が再
生するため、最近では、アグロバクテリウム・ツメファ
シエンスよりもアグロバクテリウム・リゾゲネスを植物
形質転換用ベクターの宿主として用いる事例が増加して
いる（Ｓｈａｈｉｎ，ｅｔａｌ．，”Ｔｈｅｏｒ．Ａｐ
ｐｌ．Ｇｅｎｅｔ”，７２：７７０−７７７，１９８
６）。
生するため、最近では、アグロバクテリウム・ツメファ
シエンスよりもアグロバクテリウム・リゾゲネスを植物
形質転換用ベクターの宿主として用いる事例が増加して
いる（Ｓｈａｈｉｎ，ｅｔａｌ．，”Ｔｈｅｏｒ．Ａｐ
ｐｌ．Ｇｅｎｅｔ”，７２：７７０−７７７，１９８
６）。
【０００６】アグロバクテリウム・リゾゲネス ＭＡＦ
Ｆ０３−０１７２４株は、千葉県のメロン温室内で発生
したメロン毛根病の病原菌で、数少い国内産アグロバク
テリウム・リゾゲネスである（農林水産省生物資源研究
所遺伝資源センター寄託細菌；塩見等、「日植病報」、
５３：４５４−４５９，１９８８）。本菌株についての
解析や変異株の取得等が行われてきており、本菌が保有
するＲｉプラスミドの解析（特開平３−６７５９３）、
毛状根誘発遺伝子の塩基配列決定（特願平４−１３０５
８）、カナマイシン感受性菌株の取得（特願平４−６８
１９９）等が行われている。これらの解析によって、本
菌株の改良のための遺伝子や植物形質転換ベクター等の
ＤＮＡの導入が可能となった。
Ｆ０３−０１７２４株は、千葉県のメロン温室内で発生
したメロン毛根病の病原菌で、数少い国内産アグロバク
テリウム・リゾゲネスである（農林水産省生物資源研究
所遺伝資源センター寄託細菌；塩見等、「日植病報」、
５３：４５４−４５９，１９８８）。本菌株についての
解析や変異株の取得等が行われてきており、本菌が保有
するＲｉプラスミドの解析（特開平３−６７５９３）、
毛状根誘発遺伝子の塩基配列決定（特願平４−１３０５
８）、カナマイシン感受性菌株の取得（特願平４−６８
１９９）等が行われている。これらの解析によって、本
菌株の改良のための遺伝子や植物形質転換ベクター等の
ＤＮＡの導入が可能となった。
【０００７】アグロバクテリウム属細菌にＤＮＡを導入
し、形質転換する方法としては、移行可能なプラスミド
に遺伝子を連結して、菌から菌へメイティングを利用し
て導入する方法がよく用いられている。特に最近では、
トリペアレンタル・メイティング法によって、バイナリ
ー・ベクターを大腸菌からアグロバクテリウム属細菌へ
送り込む方法が、簡単で確実な方法として定着している
（Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｄｒａｐｅｒ，
ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｏｌｕｍｅ ＩＩ（ｅｄ．
ｂｙ Ｇｌｏｖｅｒ），ＩＲＬ ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏ
ｒｄ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ，ｐｐ．６７−１１
９，１９８５）。しかしながら、本法を用いる場合、導
入したい遺伝子を一旦移行可能なプラスミドに連結して
おく必要があり、又、供与菌と受容菌及び移行ヘルパー
プラスミドを保有する菌を同時に培養する必要があると
ともに、これら３種の菌から目的のベクターを受容した
菌のみが生育する選択培地上で選択する必要があり、手
順と日数を要する。
し、形質転換する方法としては、移行可能なプラスミド
に遺伝子を連結して、菌から菌へメイティングを利用し
て導入する方法がよく用いられている。特に最近では、
トリペアレンタル・メイティング法によって、バイナリ
ー・ベクターを大腸菌からアグロバクテリウム属細菌へ
送り込む方法が、簡単で確実な方法として定着している
（Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｄｒａｐｅｒ，
ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｏｌｕｍｅ ＩＩ（ｅｄ．
ｂｙ Ｇｌｏｖｅｒ），ＩＲＬ ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏ
ｒｄ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ，ｐｐ．６７−１１
９，１９８５）。しかしながら、本法を用いる場合、導
入したい遺伝子を一旦移行可能なプラスミドに連結して
おく必要があり、又、供与菌と受容菌及び移行ヘルパー
プラスミドを保有する菌を同時に培養する必要があると
ともに、これら３種の菌から目的のベクターを受容した
菌のみが生育する選択培地上で選択する必要があり、手
順と日数を要する。
【０００８】一方、ＤＮＡをアグロバクテリウム・リゾ
ゲネス属細菌に直接導入し、形質転換する方法がある。
この場合、大腸菌のようなコンピテント細胞を作製する
方法は確立されておらず専ら、凍結・融解の繰り返しに
よって膜を暖め、ＤＮＡを導入する方法が用いられてき
た（Ｌｉｃｈｔｅｈｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｄｒａｐｅ
ｒ，ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｏｌｕｍｅ ＩＩ
（ｅｄ．ｂｙ Ｇｌｏｖｅｒ），ＩＲＬ ｐｒｅｓｓ，
Ｏｘｆｏｒｄ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ，ｐｐ．６
７−１１９，１９８５）。本法は、簡便な方法である
が、導入効率が低いため、効率良くＤＮＡを導入し形質
転換する方法が求められている。
ゲネス属細菌に直接導入し、形質転換する方法がある。
この場合、大腸菌のようなコンピテント細胞を作製する
方法は確立されておらず専ら、凍結・融解の繰り返しに
よって膜を暖め、ＤＮＡを導入する方法が用いられてき
た（Ｌｉｃｈｔｅｈｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｄｒａｐｅ
ｒ，ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｏｌｕｍｅ ＩＩ
（ｅｄ．ｂｙ Ｇｌｏｖｅｒ），ＩＲＬ ｐｒｅｓｓ，
Ｏｘｆｏｒｄ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ，ｐｐ．６
７−１１９，１９８５）。本法は、簡便な方法である
が、導入効率が低いため、効率良くＤＮＡを導入し形質
転換する方法が求められている。
【０００９】しかし、最近、次々とエレクトロポレーシ
ョン法によって効率良くアグロバクテリウム属細菌にＤ
ＮＡを導入し、形質転換できることが報告されている
（Ｍａｔｔａｎｏｖｉｃｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１７：６７４７．１９８９；Ｗ
ｅｎ−ｊｕｎ ａｎｄ Ｆｏｒｄｅ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．１７：８３８５．１９８９；Ｍｅｒｓｅ
ｒｅａｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，９０：１４９−１
５１，１９９０）。本分では、アグロバクテリウム属細
菌の高濃度懸濁液にＤＮＡを添加し、高電圧を瞬時に与
え膜に穴をあけることによって、液中に存在するＤＮＡ
を菌体内に直接導入するものである。
ョン法によって効率良くアグロバクテリウム属細菌にＤ
ＮＡを導入し、形質転換できることが報告されている
（Ｍａｔｔａｎｏｖｉｃｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１７：６７４７．１９８９；Ｗ
ｅｎ−ｊｕｎ ａｎｄ Ｆｏｒｄｅ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．１７：８３８５．１９８９；Ｍｅｒｓｅ
ｒｅａｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，９０：１４９−１
５１，１９９０）。本分では、アグロバクテリウム属細
菌の高濃度懸濁液にＤＮＡを添加し、高電圧を瞬時に与
え膜に穴をあけることによって、液中に存在するＤＮＡ
を菌体内に直接導入するものである。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】前述のようなアグロバ
クテリウム・リゾゲネスの殆どが外国産の菌株で、この
ような菌株を輸入する際は、管理や使用場所、管理責任
者及び実験内容等を明記した「輸入禁止品輸入許可申請
書」を農林水産大臣に提出し、その許可が必要である。
また、使用期間中は、毎年「輸入禁止品管理利用状況報
告書」を農林水産大臣に提出し、植物防疫官による立ち
入り検査が義務づけられている。更に、管理・使用場所
や管理責任者の変更の際には、「輸入禁止品輸入許可条
件の一部変更願」等の書類提出と許可が必要で、使用終
了時には「輸入禁止品管理終了報告書」を提出するとと
もに、植物防疫官立ち会いの下で輸入菌の死滅作業を行
う必要がある。
クテリウム・リゾゲネスの殆どが外国産の菌株で、この
ような菌株を輸入する際は、管理や使用場所、管理責任
者及び実験内容等を明記した「輸入禁止品輸入許可申請
書」を農林水産大臣に提出し、その許可が必要である。
また、使用期間中は、毎年「輸入禁止品管理利用状況報
告書」を農林水産大臣に提出し、植物防疫官による立ち
入り検査が義務づけられている。更に、管理・使用場所
や管理責任者の変更の際には、「輸入禁止品輸入許可条
件の一部変更願」等の書類提出と許可が必要で、使用終
了時には「輸入禁止品管理終了報告書」を提出するとと
もに、植物防疫官立ち会いの下で輸入菌の死滅作業を行
う必要がある。
【００１１】一方、アグロバクテリウム・リゾゲネス
ＭＡＦＦ０３−０１７２４株を始めとする国内産菌株
は、上述のような外国産菌株における節約を一切受けな
いばかりでなく、土壌への散布による自然条件下におけ
る毛根誘発実験も周辺に対する汚染の心配がなければ、
制約を受けない等の利点を併せ持っている。
ＭＡＦＦ０３−０１７２４株を始めとする国内産菌株
は、上述のような外国産菌株における節約を一切受けな
いばかりでなく、土壌への散布による自然条件下におけ
る毛根誘発実験も周辺に対する汚染の心配がなければ、
制約を受けない等の利点を併せ持っている。
【００１２】以上のような点から、アグロバクテリウム
・リゾゲネス ＭＡＦＦ０３−０１７２４株を始めとす
る国内産菌株は非常に有用であり、その利用も年々増加
しつつある。しかしながら、これらの菌株は毛根病の発
病部位もしくは発病地域の土壌から分離された野生株で
あるため、より使い易い菌として利用するには、有用遺
伝子や植物形質転換ベクタ−等の外来ＤＮＡの導入が必
要となってくる。
・リゾゲネス ＭＡＦＦ０３−０１７２４株を始めとす
る国内産菌株は非常に有用であり、その利用も年々増加
しつつある。しかしながら、これらの菌株は毛根病の発
病部位もしくは発病地域の土壌から分離された野生株で
あるため、より使い易い菌として利用するには、有用遺
伝子や植物形質転換ベクタ−等の外来ＤＮＡの導入が必
要となってくる。
【００１３】アグロバクテリウム・リゾゲネス ＭＡＦ
Ｆ０３−０１７２４株に外来ＤＮＡを導入する方法とし
ては、前述のようなトリペアレンタル・メイティング
法、凍結・融解法、エレクトロポレーション法等があ
る。前述の通り、トリペアレンタル・メイティング法は
手順と日数を要するため、簡便な凍結・融解法もしくは
エレクトロポレーション法が適している。ところで、該
菌株は、培養時に該菌株が生産する高粘性ポリサッカラ
イドが菌体外に分泌され、直径１〜２ｍｍからそれ以上
の大きさの凝集塊を作りながら増殖する。発明者らがこ
のような培養物を形質転換用菌として用いた時、凍結・
融解法でが外来ＤＮＡを導入し、形質転換することが全
くできなかった。また、エレクトロポレーション法で
も、その形質転換頻度は他の菌株に比較して著しく低
く、２．１×１０３コロニー／μｇＤＮＡ程度であっ
た。従って、該菌株にエレクトロポレーションによって
効率良くＤＮＡを導入し形質転換するためには、該菌株
の形質転換用菌の調製法の改善が必要である。
Ｆ０３−０１７２４株に外来ＤＮＡを導入する方法とし
ては、前述のようなトリペアレンタル・メイティング
法、凍結・融解法、エレクトロポレーション法等があ
る。前述の通り、トリペアレンタル・メイティング法は
手順と日数を要するため、簡便な凍結・融解法もしくは
エレクトロポレーション法が適している。ところで、該
菌株は、培養時に該菌株が生産する高粘性ポリサッカラ
イドが菌体外に分泌され、直径１〜２ｍｍからそれ以上
の大きさの凝集塊を作りながら増殖する。発明者らがこ
のような培養物を形質転換用菌として用いた時、凍結・
融解法でが外来ＤＮＡを導入し、形質転換することが全
くできなかった。また、エレクトロポレーション法で
も、その形質転換頻度は他の菌株に比較して著しく低
く、２．１×１０３コロニー／μｇＤＮＡ程度であっ
た。従って、該菌株にエレクトロポレーションによって
効率良くＤＮＡを導入し形質転換するためには、該菌株
の形質転換用菌の調製法の改善が必要である。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明は、上述した課題
に鑑みて発明されたものであり、その要旨とするところ
は、アグロバクテリウム・リゾゲネス ＭＡＦＦ０３−
０１７２４株（以下、１７２４株と称する）にエレクト
ロポレーションによって、効率良く外来ＤＮＡを導入
し、形質転換するための形質転換用菌の調製法である。
に鑑みて発明されたものであり、その要旨とするところ
は、アグロバクテリウム・リゾゲネス ＭＡＦＦ０３−
０１７２４株（以下、１７２４株と称する）にエレクト
ロポレーションによって、効率良く外来ＤＮＡを導入
し、形質転換するための形質転換用菌の調製法である。
【００１５】１７２４株の菌の培養物の凝集塊をできる
だけ細かく分散し、効率良くＤＮＡを導入して、形質転
換頻度を上昇するには、 ポリサッカライドを分解する酵素で菌の培養物を処理
し、ポリサッカライドを消化する生物的方法 界面活性剤や塩化ナトリウム溶液で菌の培養物を洗浄
し、ポリサッカライドを除去する化学的手法 バッフル付きのフラスコによる培養や入念なピペッテ
ィングによって菌の培養物の凝集塊を細かくする物理的
手法 等が考えられる。しかしながら、はアグロバクテリウ
ム属細菌の菌体外ポリサッカライドを分解する酵素を見
付け出すこと、酵素の反応条件を設定することを等、解
決すべき項目が多く実用的ではない。については、こ
れらの試薬によって菌が損傷を受け、かえって形質頻度
が下がる可能性がある。従って、最も簡便なの手法が
実用的である。
だけ細かく分散し、効率良くＤＮＡを導入して、形質転
換頻度を上昇するには、 ポリサッカライドを分解する酵素で菌の培養物を処理
し、ポリサッカライドを消化する生物的方法 界面活性剤や塩化ナトリウム溶液で菌の培養物を洗浄
し、ポリサッカライドを除去する化学的手法 バッフル付きのフラスコによる培養や入念なピペッテ
ィングによって菌の培養物の凝集塊を細かくする物理的
手法 等が考えられる。しかしながら、はアグロバクテリウ
ム属細菌の菌体外ポリサッカライドを分解する酵素を見
付け出すこと、酵素の反応条件を設定することを等、解
決すべき項目が多く実用的ではない。については、こ
れらの試薬によって菌が損傷を受け、かえって形質頻度
が下がる可能性がある。従って、最も簡便なの手法が
実用的である。
【００１６】具体的には、初めに１７２４株をバッフル
付きのフラスコで培養する。フラスコの容量は、液体培
地量を考慮して選ぶ必要があるが、５０ｍｌ〜１０ｌ程
度まで使用できる。バッフルの数は２〜１０個程度であ
ればよいが、３〜５個が好ましい。液体培地量、フラス
コの容量の１／５０〜１／２程度が好ましい。培地とし
ては、アグロバクテリウム・リゾゲネスが増殖するもの
ならばどのようなものでも構わないが、菌体外ポリサッ
カライドの生成が多い培地、例えばポテト・デキストロ
ース培地等は避ける方がよい。１７２４株を培養する培
地としては、ＬＢ培地、ＹＥＢ培地、ニュートリエント
・ブロス培地、ＡＢ培地、ＳＭ培地、ＭＧ培地、ＬＢＭ
Ｇ培地等が使用できる。次に、菌の培養物を遠心分離と
１０％グリセロール液で洗浄する際、入念なピペッティ
ングを行う。ピペッティングには、できるだけ口の細か
い１０ｍｌ程度のピペットを用い、菌の懸濁液を吸引・
排出する動作を液を泡立てないようにゆっくりと行う。
ピペッティングの回数は１０〜１００回程度行うが、５
０回程度が好ましい。以下、実施例に基づいて本発明を
より詳細に説明する。
付きのフラスコで培養する。フラスコの容量は、液体培
地量を考慮して選ぶ必要があるが、５０ｍｌ〜１０ｌ程
度まで使用できる。バッフルの数は２〜１０個程度であ
ればよいが、３〜５個が好ましい。液体培地量、フラス
コの容量の１／５０〜１／２程度が好ましい。培地とし
ては、アグロバクテリウム・リゾゲネスが増殖するもの
ならばどのようなものでも構わないが、菌体外ポリサッ
カライドの生成が多い培地、例えばポテト・デキストロ
ース培地等は避ける方がよい。１７２４株を培養する培
地としては、ＬＢ培地、ＹＥＢ培地、ニュートリエント
・ブロス培地、ＡＢ培地、ＳＭ培地、ＭＧ培地、ＬＢＭ
Ｇ培地等が使用できる。次に、菌の培養物を遠心分離と
１０％グリセロール液で洗浄する際、入念なピペッティ
ングを行う。ピペッティングには、できるだけ口の細か
い１０ｍｌ程度のピペットを用い、菌の懸濁液を吸引・
排出する動作を液を泡立てないようにゆっくりと行う。
ピペッティングの回数は１０〜１００回程度行うが、５
０回程度が好ましい。以下、実施例に基づいて本発明を
より詳細に説明する。
【００１７】
【実施例１】 エレクトロポレーション用のアグロバクテリウム・リゾ
ゲネス １７２４株の調製 −７０℃で冷凍保存したアグロバクテリウム・リゾゲネ
ス １７２４株、アグロバクテリウム・ツメファシエン
スＣ５８Ｃ１もしくはＬＢＡ４４０４株を１．５％寒天
で固定したＬＢ固形培地に接種し、３０℃で二晩培養し
た。この菌を１０ｍｌのＬＢ培地に接種し３０℃で１６
時間振盪培養後、その１ｍｌを２ｌのフラスコもしくは
３つのバッフルがついた２ｌのフラスコに入れた３００
ｍｌのＬＢ培地に接種し、３０℃で１６時間振盪培養す
ることによって、ＯＤ６００＝０．５−０．７まで増殖
させた。この培養液を１０分間氷冷後、４℃、６，００
０ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行い集菌した。０．２
％ラウロイルサルコシンナトリウム（サルコシル）もし
くは１．０Ｍ ＮａＣｌでの前処理については、この段
階で各々５０ｍｌの溶液に菌を懸濁し、５分間室温で振
盪（１５０ｒｐｍ）することによって行い、４℃、６，
０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行った。菌体は、
３００ｍｌ、１５０ｍｌ、６ｍｌの冷１０％（ｖ／ｖ）
グリセロールへの懸濁と上記の遠心分離を繰り返すこと
によって洗浄した。ピペッティングは、１０％グリセロ
ールへの懸濁の際に行い、１０ｍｌの駒込ピペットを用
いて菌液を吸入・排出する操作を行った。最後の遠心分
離後、沈殿を３ｍｌの冷１０％グリセロールに懸濁しエ
レクトロポレーション用の菌として使用した。これらの
操作は全て氷上で行った。尚、調製菌の保存は、ドライ
アイス−エタノールバス中で急速冷凍後、−７０℃で行
った。
ゲネス １７２４株の調製 −７０℃で冷凍保存したアグロバクテリウム・リゾゲネ
ス １７２４株、アグロバクテリウム・ツメファシエン
スＣ５８Ｃ１もしくはＬＢＡ４４０４株を１．５％寒天
で固定したＬＢ固形培地に接種し、３０℃で二晩培養し
た。この菌を１０ｍｌのＬＢ培地に接種し３０℃で１６
時間振盪培養後、その１ｍｌを２ｌのフラスコもしくは
３つのバッフルがついた２ｌのフラスコに入れた３００
ｍｌのＬＢ培地に接種し、３０℃で１６時間振盪培養す
ることによって、ＯＤ６００＝０．５−０．７まで増殖
させた。この培養液を１０分間氷冷後、４℃、６，００
０ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行い集菌した。０．２
％ラウロイルサルコシンナトリウム（サルコシル）もし
くは１．０Ｍ ＮａＣｌでの前処理については、この段
階で各々５０ｍｌの溶液に菌を懸濁し、５分間室温で振
盪（１５０ｒｐｍ）することによって行い、４℃、６，
０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行った。菌体は、
３００ｍｌ、１５０ｍｌ、６ｍｌの冷１０％（ｖ／ｖ）
グリセロールへの懸濁と上記の遠心分離を繰り返すこと
によって洗浄した。ピペッティングは、１０％グリセロ
ールへの懸濁の際に行い、１０ｍｌの駒込ピペットを用
いて菌液を吸入・排出する操作を行った。最後の遠心分
離後、沈殿を３ｍｌの冷１０％グリセロールに懸濁しエ
レクトロポレーション用の菌として使用した。これらの
操作は全て氷上で行った。尚、調製菌の保存は、ドライ
アイス−エタノールバス中で急速冷凍後、−７０℃で行
った。
【００１８】
【実施例２】 エレクトロポレーションによるＤＮＡの導入 導入ＤＮＡとしてバイナリーベクターｐＢＩＮＩ１９
（Ｂｅｖａｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１
２：８７１１−８７２１，１９８４）を使用した。エレ
クトロポレーションは、バイオ・ラッド社のジーン・パ
ルサーＴＭを使用した。４０μｌの調製菌液に少量（５
μｌ以下）の滅菌水に溶解した４０ｎｇのｐＢＩＮ１９
を添加し、よく混合して氷上に置いた。これを、氷冷し
たサンプルキュベット（電極間距離０．２ｃｍ）に移
し、１２．５ｋｖ／ｃｍ、２５μＦ、６００Ω（１０ｍ
ｓｅｃ）でエレクトロポレーションを行った。これに、
０．８ｍｌのＳＯＣ培地を加え、３０℃で１時間振盪培
養し、５０μｇ／ｍｌとなるようカナマイシンを添加し
たＬＢ固形培地に塗布接種して、３０℃で３６時間培養
し、形質転換コロニーを出現させた。
（Ｂｅｖａｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１
２：８７１１−８７２１，１９８４）を使用した。エレ
クトロポレーションは、バイオ・ラッド社のジーン・パ
ルサーＴＭを使用した。４０μｌの調製菌液に少量（５
μｌ以下）の滅菌水に溶解した４０ｎｇのｐＢＩＮ１９
を添加し、よく混合して氷上に置いた。これを、氷冷し
たサンプルキュベット（電極間距離０．２ｃｍ）に移
し、１２．５ｋｖ／ｃｍ、２５μＦ、６００Ω（１０ｍ
ｓｅｃ）でエレクトロポレーションを行った。これに、
０．８ｍｌのＳＯＣ培地を加え、３０℃で１時間振盪培
養し、５０μｇ／ｍｌとなるようカナマイシンを添加し
たＬＢ固形培地に塗布接種して、３０℃で３６時間培養
し、形質転換コロニーを出現させた。
【００１９】
【表１】 表１に示されるようにアグロバクテリウム・リゾゲネス
１７２４株のエレクトロポレーション用菌の調製の
際、何ら処理を施さなかった時は、形質転換頻度が２．
１×１０３／μｇＤＮＡで、アグロバクテリウム・ツメ
ファシエンスＬＢＡ４４０４株の場合の３．０×１０６
／μｇＤＮＡ株の場合の８．０×１０５／μｇＤＮＡに
比較してかなり低かった。バッフル付きフラスコでの培
養及びピペッティングを行った時、形質転換頻度が８．
６×１０３／μｇＤＮＡに上昇した（〜線表示）。これ
は、無操作に比較して４倍以上の頻度上昇である。一
方、ラウロイルサルコシンナトリウムによる前処理では
４．７×１０１／μｇＤＮＡ、ＮａＣｌでの処理では
６．７×１０２／μｇＤＮＡで、形質転換頻度が下降
し、利用できないことが示された。
１７２４株のエレクトロポレーション用菌の調製の
際、何ら処理を施さなかった時は、形質転換頻度が２．
１×１０３／μｇＤＮＡで、アグロバクテリウム・ツメ
ファシエンスＬＢＡ４４０４株の場合の３．０×１０６
／μｇＤＮＡ株の場合の８．０×１０５／μｇＤＮＡに
比較してかなり低かった。バッフル付きフラスコでの培
養及びピペッティングを行った時、形質転換頻度が８．
６×１０３／μｇＤＮＡに上昇した（〜線表示）。これ
は、無操作に比較して４倍以上の頻度上昇である。一
方、ラウロイルサルコシンナトリウムによる前処理では
４．７×１０１／μｇＤＮＡ、ＮａＣｌでの処理では
６．７×１０２／μｇＤＮＡで、形質転換頻度が下降
し、利用できないことが示された。
【００２０】
【発明のこ効果】本発明によって、植物の形質転換や毛
状根の誘発に有用なアグロバクテリウム・リゾゲネス
ＭＡＦＦ０３−０１７２４株に効率良く外来のＤＮＡを
導入できる。また、本発明の方法を用いて、他の同様な
性質を持つアグロバクテリウム属細菌に効率良く外来Ｄ
ＮＡも導入できる。
状根の誘発に有用なアグロバクテリウム・リゾゲネス
ＭＡＦＦ０３−０１７２４株に効率良く外来のＤＮＡを
導入できる。また、本発明の方法を用いて、他の同様な
性質を持つアグロバクテリウム属細菌に効率良く外来Ｄ
ＮＡも導入できる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:01）
Claims (2)
- 【請求項１】 アグロバクテリウム・リゾゲネス ＭＡ
ＦＦ０３−０１７２４株をバッフル付きフラスコで培養
し、培養物洗浄時に入念なピペッティングを繰り返して
行い、培養物中の凝集塊を細かく分散することによって
外来ＤＮＡ導入効率を高める形質転換用菌の調製法。 - 【請求項２】 前記形質転換法が、エレクトロポレーシ
ョン法である請求項１に記載の形質転換用菌の調製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5013389A JPH06217763A (ja) | 1993-01-29 | 1993-01-29 | アグロバクテリウム・リゾゲネス ｍａｆｆ０３−０１７２４株の形質転換用菌の調整法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5013389A JPH06217763A (ja) | 1993-01-29 | 1993-01-29 | アグロバクテリウム・リゾゲネス ｍａｆｆ０３−０１７２４株の形質転換用菌の調整法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06217763A true JPH06217763A (ja) | 1994-08-09 |
Family
ID=11831754
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5013389A Pending JPH06217763A (ja) | 1993-01-29 | 1993-01-29 | アグロバクテリウム・リゾゲネス ｍａｆｆ０３−０１７２４株の形質転換用菌の調整法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06217763A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0391632A2 (en) * | 1989-04-03 | 1990-10-10 | Sharp Kabushiki Kaisha | Sheet feeding device for facsimile apparatus |
-
1993
- 1993-01-29 JP JP5013389A patent/JPH06217763A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0391632A2 (en) * | 1989-04-03 | 1990-10-10 | Sharp Kabushiki Kaisha | Sheet feeding device for facsimile apparatus |
| US5072306A (en) * | 1989-04-03 | 1991-12-10 | Sharp Kabushiki Kaisha | Sheet feeding device for facsmile apparatus |
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