JPH06199895A - ヒトＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキシドジスムターゼ誘導体及びその製造法 - Google Patents
ヒトＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキシドジスムターゼ誘導体及びその製造法Info
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- JPH06199895A JPH06199895A JP202593A JP202593A JPH06199895A JP H06199895 A JPH06199895 A JP H06199895A JP 202593 A JP202593 A JP 202593A JP 202593 A JP202593 A JP 202593A JP H06199895 A JPH06199895 A JP H06199895A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】電荷的及び分子量的に均一でかつ活性が安定で
ある医薬として有用なヒトＳＯＤ誘導体及びその製造法
を提供することである。 【構成】ヒトＳＯＤ構成アミノ酸の１１１番目のシステ
インのメルカプト基にアルキルチオ基を導入したオキシ
エチルチオ化ヒトＳＯＤなどのようなヒトＳＯＤ誘導体
は、ヒトＳＯＤとビス（２−ヒドロキシエチル）ジスル
フィドなどのようなアルキルジスルフィドとを反応させ
ることによって得ることができる。
ある医薬として有用なヒトＳＯＤ誘導体及びその製造法
を提供することである。 【構成】ヒトＳＯＤ構成アミノ酸の１１１番目のシステ
インのメルカプト基にアルキルチオ基を導入したオキシ
エチルチオ化ヒトＳＯＤなどのようなヒトＳＯＤ誘導体
は、ヒトＳＯＤとビス（２−ヒドロキシエチル）ジスル
フィドなどのようなアルキルジスルフィドとを反応させ
ることによって得ることができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、スーパーオキシドが関
与する疾患に対して有用であるヒトＣｕ，Ｚｎ型スーパ
ーオキシドジスムターゼ誘導体及びその製造法に関する
ものである（以下、「スーパーオキシドジスムターゼ」
を「ＳＯＤ」と称し、「ヒトＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキ
シドジスムターゼ」を「ヒトＳＯＤ」と称する。）。本
発明は、さらに詳しくは、生体に有害なスーパーオキシ
ドを分解する酵素活性を保持し、ヒトＳＯＤ構成アミノ
酸の１１１番目のシステインのメルカプト基にジスルフ
ィド交換反応でアルキルチオ基が導入されて電荷的及び
分子量的に均一でかつＳＯＤ活性が安定であるヒトＳＯ
Ｄ誘導体及びその製造法に関するものである。
与する疾患に対して有用であるヒトＣｕ，Ｚｎ型スーパ
ーオキシドジスムターゼ誘導体及びその製造法に関する
ものである（以下、「スーパーオキシドジスムターゼ」
を「ＳＯＤ」と称し、「ヒトＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキ
シドジスムターゼ」を「ヒトＳＯＤ」と称する。）。本
発明は、さらに詳しくは、生体に有害なスーパーオキシ
ドを分解する酵素活性を保持し、ヒトＳＯＤ構成アミノ
酸の１１１番目のシステインのメルカプト基にジスルフ
ィド交換反応でアルキルチオ基が導入されて電荷的及び
分子量的に均一でかつＳＯＤ活性が安定であるヒトＳＯ
Ｄ誘導体及びその製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ＳＯＤは、動物，植物，微生物などの生
体内に広く存在し、生体に有害なスーパーオキシドを分
解する作用を有しているので、スーパーオキシドによっ
て引き起こされる種々の疾患に対する予防薬，治療薬
（例えば、炎症，変形性関節炎，慢性関節リュウマチ，
放射線照射による障害，紫外線による障害，未熟児酸素
網膜症，白内障，アドリアマイシンなどの制癌剤の副作
用，虚血部分への血流再開に伴う障害など）などとして
期待されている。
体内に広く存在し、生体に有害なスーパーオキシドを分
解する作用を有しているので、スーパーオキシドによっ
て引き起こされる種々の疾患に対する予防薬，治療薬
（例えば、炎症，変形性関節炎，慢性関節リュウマチ，
放射線照射による障害，紫外線による障害，未熟児酸素
網膜症，白内障，アドリアマイシンなどの制癌剤の副作
用，虚血部分への血流再開に伴う障害など）などとして
期待されている。
【０００３】ＳＯＤを医薬品としてヒトに使用する場
合、抗原性の問題からヒトＳＯＤを使用することが好ま
しい。ヒトＳＯＤとしては、ヒト組織から製造された天
然ヒトＳＯＤ，遺伝子工学的手法で微生物を用いて製造
されたヒトＳＯＤと実質上同一のアミノ酸配列を有する
組換えヒトＳＯＤなどがある。ヒトＳＯＤをヒト組織又
は遺伝子工学的手法で作製した微生物細胞から単離する
場合、従来の方法では、電荷的及び分子量的に均一な形
でヒトＳＯＤを得ることができない。このことは、ヒト
ＳＯＤを品質的に均一性が要求される医薬品として開発
する上で大きな問題である。
合、抗原性の問題からヒトＳＯＤを使用することが好ま
しい。ヒトＳＯＤとしては、ヒト組織から製造された天
然ヒトＳＯＤ，遺伝子工学的手法で微生物を用いて製造
されたヒトＳＯＤと実質上同一のアミノ酸配列を有する
組換えヒトＳＯＤなどがある。ヒトＳＯＤをヒト組織又
は遺伝子工学的手法で作製した微生物細胞から単離する
場合、従来の方法では、電荷的及び分子量的に均一な形
でヒトＳＯＤを得ることができない。このことは、ヒト
ＳＯＤを品質的に均一性が要求される医薬品として開発
する上で大きな問題である。
【０００４】Ｊ．Ｗ．Ｈａｒｔｚ及びＨ．Ｆ．Ｄｅｕｔ
ｓｃｈ〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２２４，４５６５
（１９６５）〕は、ヒトＳＯＤの１１１番目のアミノ酸
であるシステインの反応性に注目した。そして、ヒトＳ
ＯＤが電荷的及び分子量的に不均一になる原因は、この
システインがその高い反応性によって種々の変換を受け
ているからではないかと考えたが、その推論を検証して
はいない。また、Ｊ．Ｒ．Ｊａｂｕｓｃｈ，Ｄ．Ｌ．Ｆ
ａｒｂ，Ｄ．Ａ．Ｋｅｒｓｃｈｅｎｓｔｅｉｎｅｒ及び
Ｈ．Ｆ．Ｄｅｕｔｓｃｈ〔Biochemistry, １９，２３１
０（１９８０）〕は、ヒトＳＯＤの１１１番目のシステ
インのメルカプト基をアルキル化することによって、ヒ
トＳＯＤの活性の安定性が向上することを報告してい
る。
ｓｃｈ〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２２４，４５６５
（１９６５）〕は、ヒトＳＯＤの１１１番目のアミノ酸
であるシステインの反応性に注目した。そして、ヒトＳ
ＯＤが電荷的及び分子量的に不均一になる原因は、この
システインがその高い反応性によって種々の変換を受け
ているからではないかと考えたが、その推論を検証して
はいない。また、Ｊ．Ｒ．Ｊａｂｕｓｃｈ，Ｄ．Ｌ．Ｆ
ａｒｂ，Ｄ．Ａ．Ｋｅｒｓｃｈｅｎｓｔｅｉｎｅｒ及び
Ｈ．Ｆ．Ｄｅｕｔｓｃｈ〔Biochemistry, １９，２３１
０（１９８０）〕は、ヒトＳＯＤの１１１番目のシステ
インのメルカプト基をアルキル化することによって、ヒ
トＳＯＤの活性の安定性が向上することを報告してい
る。
【０００５】しかし、本発明のように、ヒトＳＯＤの１
１１番目のアミノ酸であるシステインのメルカプト基に
アルキルチオ基を導入することによって、ヒトＳＯＤの
活性の安定性が向上するのみならず，電荷的及び分子量
的にも均一であるヒトＳＯＤ誘導体を得ることができる
ことは、従来、知られていなかった。
１１番目のアミノ酸であるシステインのメルカプト基に
アルキルチオ基を導入することによって、ヒトＳＯＤの
活性の安定性が向上するのみならず，電荷的及び分子量
的にも均一であるヒトＳＯＤ誘導体を得ることができる
ことは、従来、知られていなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、電荷
的及び分子量的に均一でかつ活性が安定である医薬品と
して有用なヒトＳＯＤ誘導体及びその製造法を提供する
ことである。
的及び分子量的に均一でかつ活性が安定である医薬品と
して有用なヒトＳＯＤ誘導体及びその製造法を提供する
ことである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記の問
題点を解決するために研究した結果、ヒトＳＯＤ構成ア
ミノ酸の１１１番目のシステインのメルカプト基にジス
ルフィド交換反応でアルキルチオ基を導入することによ
って、電荷的及び分子量的に均一でかつＳＯＤ活性が安
定であるヒトＳＯＤ誘導体を製造することができること
を見出して、本発明を完成させるに至った。即ち、本発
明は次の通りである。第１の発明は、次式（Ｉ）：
題点を解決するために研究した結果、ヒトＳＯＤ構成ア
ミノ酸の１１１番目のシステインのメルカプト基にジス
ルフィド交換反応でアルキルチオ基を導入することによ
って、電荷的及び分子量的に均一でかつＳＯＤ活性が安
定であるヒトＳＯＤ誘導体を製造することができること
を見出して、本発明を完成させるに至った。即ち、本発
明は次の通りである。第１の発明は、次式（Ｉ）：
【０００８】
【化３】
【０００９】〔式中、（ヒトＳＯＤ’）は、ヒトＳＯＤ
の１１１番目のシステイン残基のメルカプト基から水素
原子を除いたものを表し；Ｘは、アミノ基，炭素原子数
１〜１０個のアルキル基もしくは炭素原子数２〜１０個
のアシル基で置換されたアミノ基，又はヒドロキシル基
を表し；Ｒ1 及びＲ2 は、水素原子，又は炭素原子数１
〜１０個のアルキル基を表す。〕で示されるヒトＳＯＤ
誘導体に関するものである。
の１１１番目のシステイン残基のメルカプト基から水素
原子を除いたものを表し；Ｘは、アミノ基，炭素原子数
１〜１０個のアルキル基もしくは炭素原子数２〜１０個
のアシル基で置換されたアミノ基，又はヒドロキシル基
を表し；Ｒ1 及びＲ2 は、水素原子，又は炭素原子数１
〜１０個のアルキル基を表す。〕で示されるヒトＳＯＤ
誘導体に関するものである。
【００１０】第２の発明は、ヒトＳＯＤと次式（II）；
【００１１】
【化４】
【００１２】（式中、Ｘ，Ｒ1 及びＲ2 は前記の記載と
同義である。）で示されるアルキルジスルフィドとを反
応させることを特徴とする前記記載の式（Ｉ）で示され
るヒトＳＯＤ誘導体の製造法に関するものである。以
下、本発明を詳細に説明する。
同義である。）で示されるアルキルジスルフィドとを反
応させることを特徴とする前記記載の式（Ｉ）で示され
るヒトＳＯＤ誘導体の製造法に関するものである。以
下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】前記の目的物であるヒトＳＯＤ誘導体、そ
の製造原料であるアルキルジスルフィド〔化合物 (I
I）〕などにおいて表されるＸ，Ｒ1 ，Ｒ2 は次の通り
である。
の製造原料であるアルキルジスルフィド〔化合物 (I
I）〕などにおいて表されるＸ，Ｒ1 ，Ｒ2 は次の通り
である。
【００１４】Ｘとしては、アミノ基，炭素原子数１〜１
０個のアルキル基もしくは炭素原子数２〜１０個のアシ
ル基で置換されたアミノ基，ヒドロキシル基などを挙げ
ることができる。Ｘのアルキル基で置換されたアミノ基
としては、好ましくは炭素原子数１〜６個、さらに好ま
しくは１〜４個の直鎖状又は分岐状のアルキル基で置換
されたものがよい。Ｘのアシル基で置換されたアミノ基
としては、好ましくは炭素原子数１〜６個、さらに好ま
しくは１〜４個の直鎖状又は分岐状のアシル基で置換さ
れたものがよい。
０個のアルキル基もしくは炭素原子数２〜１０個のアシ
ル基で置換されたアミノ基，ヒドロキシル基などを挙げ
ることができる。Ｘのアルキル基で置換されたアミノ基
としては、好ましくは炭素原子数１〜６個、さらに好ま
しくは１〜４個の直鎖状又は分岐状のアルキル基で置換
されたものがよい。Ｘのアシル基で置換されたアミノ基
としては、好ましくは炭素原子数１〜６個、さらに好ま
しくは１〜４個の直鎖状又は分岐状のアシル基で置換さ
れたものがよい。
【００１５】Ｒ1 及びＲ2 としては、例えば、水素原
子，炭素原子数１〜１０個のアルキル基などを挙げるこ
とができる。Ｒ1 及びＲ2 におけるアルキル基として
は、好ましくは炭素原子数１〜６個、さらに好ましくは
１〜４個の直鎖状又は分岐状のものがよい。
子，炭素原子数１〜１０個のアルキル基などを挙げるこ
とができる。Ｒ1 及びＲ2 におけるアルキル基として
は、好ましくは炭素原子数１〜６個、さらに好ましくは
１〜４個の直鎖状又は分岐状のものがよい。
【００１６】ＳＯＤ誘導体は、緩衝液中、室温以下の温
度でヒトＳＯＤとアルキルジスルフィドとを反応させる
ことによって製造することができる。ヒトＳＯＤとして
は、例えば、天然ヒトＳＯＤ，組換えヒトＳＯＤなどを
挙げることができる。そして、（ヒトＳＯＤ’）とは、
ヒトＳＯＤの１１１番目のシステイン残基のメルカプト
基から水素原子を除いたものを表す。天然ヒトＳＯＤ
は、例えば、赤血球，胎盤などのヒト組織から、常法に
よって得ることができるし、或いは市販品として入手す
ることもできる。組換えヒトＳＯＤは、天然ヒトＳＯＤ
と実質上同一のアミノ酸配列を有するものであり、例え
ば、特開昭６１−１１１６９０号公報などに記載の方法
によって得ることができるし、或いは市販品として入手
することもできる。
度でヒトＳＯＤとアルキルジスルフィドとを反応させる
ことによって製造することができる。ヒトＳＯＤとして
は、例えば、天然ヒトＳＯＤ，組換えヒトＳＯＤなどを
挙げることができる。そして、（ヒトＳＯＤ’）とは、
ヒトＳＯＤの１１１番目のシステイン残基のメルカプト
基から水素原子を除いたものを表す。天然ヒトＳＯＤ
は、例えば、赤血球，胎盤などのヒト組織から、常法に
よって得ることができるし、或いは市販品として入手す
ることもできる。組換えヒトＳＯＤは、天然ヒトＳＯＤ
と実質上同一のアミノ酸配列を有するものであり、例え
ば、特開昭６１−１１１６９０号公報などに記載の方法
によって得ることができるし、或いは市販品として入手
することもできる。
【００１７】ヒトＳＯＤが、その構成要素である銅イオ
ン，亜鉛イオンの全部又は一部を欠落しているもの（ア
ポヒトＳＯＤ）である場合には、欠落している金属の必
要量を取り込ませる処理が必要である。そして、その処
理の時期は、目的とするヒトＳＯＤ誘導体を得られる限
り特に限定されないが、好ましくはヒトＳＯＤとアルキ
ルジスルフィドとを反応させた後に処理するのがよい。
アポヒトＳＯＤの金属イオンによる処理は、緩衝液中、
室温以下の温度でアポヒトＳＯＤと金属イオンとを反応
させることによって行うことができる。アポヒトＳＯＤ
としては、例えば、アルキルジスルフィドとの反応；遠
心分離，硫安塩析，ゲル濾過クロマトグラフ，陰イオン
交換クロマトグラフ，陽イオン交換クロマトグラフ，メ
タルキレーティングアフィニティクロマトグラフ，疎水
性相互作用クロマトグラフなどの各処理；前記の各処理
方法を適宜に組み合わせた処理などで得たものを挙げる
ことができる。
ン，亜鉛イオンの全部又は一部を欠落しているもの（ア
ポヒトＳＯＤ）である場合には、欠落している金属の必
要量を取り込ませる処理が必要である。そして、その処
理の時期は、目的とするヒトＳＯＤ誘導体を得られる限
り特に限定されないが、好ましくはヒトＳＯＤとアルキ
ルジスルフィドとを反応させた後に処理するのがよい。
アポヒトＳＯＤの金属イオンによる処理は、緩衝液中、
室温以下の温度でアポヒトＳＯＤと金属イオンとを反応
させることによって行うことができる。アポヒトＳＯＤ
としては、例えば、アルキルジスルフィドとの反応；遠
心分離，硫安塩析，ゲル濾過クロマトグラフ，陰イオン
交換クロマトグラフ，陽イオン交換クロマトグラフ，メ
タルキレーティングアフィニティクロマトグラフ，疎水
性相互作用クロマトグラフなどの各処理；前記の各処理
方法を適宜に組み合わせた処理などで得たものを挙げる
ことができる。
【００１８】金属イオンとしては、銅イオン，亜鉛イオ
ンを挙げることができる。アポヒトＳＯＤとの反応にお
いては、金属イオンは塩の形で反応系に供給される。銅
イオンとしては、例えば、２価の銅塩（例えば、塩化第
二銅，硝酸第二銅，硫酸第二銅，酢酸第二銅など）を挙
げることができる。亜鉛イオンとしては、例えば、亜鉛
塩（例えば、塩化亜鉛，硝酸亜鉛，硫酸亜鉛，酢酸亜鉛
など）を挙げることができる。
ンを挙げることができる。アポヒトＳＯＤとの反応にお
いては、金属イオンは塩の形で反応系に供給される。銅
イオンとしては、例えば、２価の銅塩（例えば、塩化第
二銅，硝酸第二銅，硫酸第二銅，酢酸第二銅など）を挙
げることができる。亜鉛イオンとしては、例えば、亜鉛
塩（例えば、塩化亜鉛，硝酸亜鉛，硫酸亜鉛，酢酸亜鉛
など）を挙げることができる。
【００１９】銅塩および亜鉛塩の濃度は、０．５〜２０
ｍＭ、好ましくは１〜１０ｍＭがよい。金属イオン処理
における緩衝液成分としては、例えば、酢酸ナトリウ
ム，炭酸水素ナトリウム，リン酸ナトリウムなどを挙げ
ることができる。そして、その緩衝液の濃度は、５〜５
００ｍＭ、好ましくは１０〜１００ｍＭがよく；ｐＨ
は、４．５〜９、好ましくは４．５〜 ８．０がよい。
アポヒトＳＯＤの濃度は、１〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ま
しくは５〜５０ｍｇ／ｍｌがよい。金属イオン処理にお
ける反応温度は、室温以下の温度が好ましく、さらに好
ましくは０〜１０℃の温度がよい。金属イオン処理にお
ける反応時間は、１０分〜１日間である。
ｍＭ、好ましくは１〜１０ｍＭがよい。金属イオン処理
における緩衝液成分としては、例えば、酢酸ナトリウ
ム，炭酸水素ナトリウム，リン酸ナトリウムなどを挙げ
ることができる。そして、その緩衝液の濃度は、５〜５
００ｍＭ、好ましくは１０〜１００ｍＭがよく；ｐＨ
は、４．５〜９、好ましくは４．５〜 ８．０がよい。
アポヒトＳＯＤの濃度は、１〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ま
しくは５〜５０ｍｇ／ｍｌがよい。金属イオン処理にお
ける反応温度は、室温以下の温度が好ましく、さらに好
ましくは０〜１０℃の温度がよい。金属イオン処理にお
ける反応時間は、１０分〜１日間である。
【００２０】ＳＯＤ誘導体を製造する際に用いる最も好
ましい化合物 (II）〔アルキルジスルフィド〕として
は、例えば、ビス（２−アミノエチル）ジスルフィド，
ビス（２−アセチルアミノエチル）ジスルフィド，ビス
（２−ヒドロキシエチル）ジスルフィド，ビス（２−ヒ
ドロキシプロピル）ジスルフィドなどを挙げることがで
きる。
ましい化合物 (II）〔アルキルジスルフィド〕として
は、例えば、ビス（２−アミノエチル）ジスルフィド，
ビス（２−アセチルアミノエチル）ジスルフィド，ビス
（２−ヒドロキシエチル）ジスルフィド，ビス（２−ヒ
ドロキシプロピル）ジスルフィドなどを挙げることがで
きる。
【００２１】その際に使用する緩衝液の成分としては、
例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸
塩，炭酸ナトリウム，炭酸水素ナトリウム，リン酸ナト
リウム，トリエタノールアミン塩酸塩などを挙げること
ができる。そして、その緩衝液の濃度は、５〜１００ｍ
Ｍ、好ましくは１０〜５０ｍＭがよく；ｐＨは、ｐＨが
６より低いと反応が遅くなり，ｐＨが９より高いとメル
カプト基の変化が起こって種々の副生物を生成するの
で、好ましくはｐＨ６〜９、さらに好ましくはｐＨ７〜
８がよい。
例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸
塩，炭酸ナトリウム，炭酸水素ナトリウム，リン酸ナト
リウム，トリエタノールアミン塩酸塩などを挙げること
ができる。そして、その緩衝液の濃度は、５〜１００ｍ
Ｍ、好ましくは１０〜５０ｍＭがよく；ｐＨは、ｐＨが
６より低いと反応が遅くなり，ｐＨが９より高いとメル
カプト基の変化が起こって種々の副生物を生成するの
で、好ましくはｐＨ６〜９、さらに好ましくはｐＨ７〜
８がよい。
【００２２】反応温度は、好ましくは室温以下、さらに
は好ましくは０〜１０℃がよい。ヒトＳＯＤの濃度は、
特に限定されないが、好ましくは１〜１００ｍｇ／ｍｌ
がよい。アルキルジスルフィドの濃度は、ヒトＳＯＤの
濃度の５〜３００倍モル、好ましくは１０〜２００倍モ
ルがよい。
は好ましくは０〜１０℃がよい。ヒトＳＯＤの濃度は、
特に限定されないが、好ましくは１〜１００ｍｇ／ｍｌ
がよい。アルキルジスルフィドの濃度は、ヒトＳＯＤの
濃度の５〜３００倍モル、好ましくは１０〜２００倍モ
ルがよい。
【００２３】このようにして製造したヒトＳＯＤ誘導体
は、反応混合物を遠心分離，硫安塩析，ゲル濾過クロマ
トグラフ，陰イオン交換クロマトグラフ，陽イオン交換
クロマトグラフ，メタルキレーティングアフィニティク
ロマトグラフ，疎水性相互作用クロマトグラフなどの精
製法を適宜に組み合わせて精製することによって得るこ
とができる。そして、このようにして得られたＳＯＤ誘
導体は、電荷的及び分子量的に均一でかつＳＯＤ活性が
安定である。
は、反応混合物を遠心分離，硫安塩析，ゲル濾過クロマ
トグラフ，陰イオン交換クロマトグラフ，陽イオン交換
クロマトグラフ，メタルキレーティングアフィニティク
ロマトグラフ，疎水性相互作用クロマトグラフなどの精
製法を適宜に組み合わせて精製することによって得るこ
とができる。そして、このようにして得られたＳＯＤ誘
導体は、電荷的及び分子量的に均一でかつＳＯＤ活性が
安定である。
【００２４】
【実施例】以下、本発明を参考例，実施例及び分析例に
よって示す。なお、これらの実施例は、本発明の範囲を
限定するものではない。 参考例 （１）組換え大腸菌の培養及びヒトＳＯＤの誘発合成 滅菌培地〔大豆蛋白加水分解物（４５ｇ），グルコース
（６０ｇ），テトラサイクリン（０．１８８ｇ），Ｎａ
2 ＨＰＯ4 （９０ｇ），ＫＨ2 ＰＯ4 （４５ｇ），Ｎａ
Ｃｌ（７．５ｇ），ＮＨ4 Ｃｌ（１５ｇ），ＭｇＳＯ4
（３．６ｇ），ＣａＣｌ2 （０．１６７ｇ），ＣｕＣｌ
2 ・２Ｈ2 Ｏ（８０ｍｇ）及びＺｎＳＯ 4 ・７Ｈ2 Ｏ
（１３２ｍｇ）を含有〕（１２，０００ｍｌ）に、大腸
菌５４５πＨＲ（ｐＨＴ３５１）（微工研菌寄第９４３
５号）を接種し、撹拌とエアレーションとを行いなが
ら、３７℃で一晩培養した。
よって示す。なお、これらの実施例は、本発明の範囲を
限定するものではない。 参考例 （１）組換え大腸菌の培養及びヒトＳＯＤの誘発合成 滅菌培地〔大豆蛋白加水分解物（４５ｇ），グルコース
（６０ｇ），テトラサイクリン（０．１８８ｇ），Ｎａ
2 ＨＰＯ4 （９０ｇ），ＫＨ2 ＰＯ4 （４５ｇ），Ｎａ
Ｃｌ（７．５ｇ），ＮＨ4 Ｃｌ（１５ｇ），ＭｇＳＯ4
（３．６ｇ），ＣａＣｌ2 （０．１６７ｇ），ＣｕＣｌ
2 ・２Ｈ2 Ｏ（８０ｍｇ）及びＺｎＳＯ 4 ・７Ｈ2 Ｏ
（１３２ｍｇ）を含有〕（１２，０００ｍｌ）に、大腸
菌５４５πＨＲ（ｐＨＴ３５１）（微工研菌寄第９４３
５号）を接種し、撹拌とエアレーションとを行いなが
ら、３７℃で一晩培養した。
【００２５】この培養液（５，０００ｍｌ）を滅菌培地
〔大豆蛋白加水分解物（２８３０ｇ），グルコース（２
０２５ｇ），テトラサイクリン（１．７ｇ），Ｎａ2 Ｈ
ＰＯ 4 （８１０ｇ），ＫＨ2 ＰＯ4 （４０５ｇ），Ｎａ
Ｃｌ（６７．５ｇ），ＮＨ4Ｃｌ（１３５ｇ），ＭｇＳ
Ｏ4 （３２．４ｇ），ＣａＣｌ2 （１．５ｇ），ＣｕＣ
ｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ（７２５ｍｇ），ＺｎＳＯ2 ・７Ｈ2 Ｏ
（１．１８８ｇ），ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ（５．４
ｇ），ＭｎＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ（１．３５ｇ），ＡｌＣｌ
3 ・６Ｈ2 Ｏ（１．３５ｇ）及びＨ3 ＢＯ3 （６８ｍ
ｇ）を含有〕（１１０，０００ｍｌ）に加え、溶存酸素
量を飽和酸素濃度の２０％以上に保持するために攪拌と
エアレーションとを行いながら、クレット２００，４０
０，６００でＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏを各々２．３８ｇ，
３．５７ｇ，４．７６ｇ含む水溶液（５００ｍｌ）を加
え、３７℃下、ｐＨ７．１〜７．４で培養した。クレッ
ト１２００まで培養した後、グルコース（２０２５ｇ）
を含む水溶液（３，０００ｍｌ），次いでマイトマイシ
ンＣ（２００ｍｇ）を含む水溶液（５００ｍｌ）を順次
加え、誘発合成を３７℃で通気攪拌しながら４時間行わ
せた。誘発合成後、培養混合物を遠心分離（１０，８０
０Ｇ、６０分間）し、４．５Ｋｇの湿菌体を得た。
〔大豆蛋白加水分解物（２８３０ｇ），グルコース（２
０２５ｇ），テトラサイクリン（１．７ｇ），Ｎａ2 Ｈ
ＰＯ 4 （８１０ｇ），ＫＨ2 ＰＯ4 （４０５ｇ），Ｎａ
Ｃｌ（６７．５ｇ），ＮＨ4Ｃｌ（１３５ｇ），ＭｇＳ
Ｏ4 （３２．４ｇ），ＣａＣｌ2 （１．５ｇ），ＣｕＣ
ｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ（７２５ｍｇ），ＺｎＳＯ2 ・７Ｈ2 Ｏ
（１．１８８ｇ），ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ（５．４
ｇ），ＭｎＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ（１．３５ｇ），ＡｌＣｌ
3 ・６Ｈ2 Ｏ（１．３５ｇ）及びＨ3 ＢＯ3 （６８ｍ
ｇ）を含有〕（１１０，０００ｍｌ）に加え、溶存酸素
量を飽和酸素濃度の２０％以上に保持するために攪拌と
エアレーションとを行いながら、クレット２００，４０
０，６００でＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏを各々２．３８ｇ，
３．５７ｇ，４．７６ｇ含む水溶液（５００ｍｌ）を加
え、３７℃下、ｐＨ７．１〜７．４で培養した。クレッ
ト１２００まで培養した後、グルコース（２０２５ｇ）
を含む水溶液（３，０００ｍｌ），次いでマイトマイシ
ンＣ（２００ｍｇ）を含む水溶液（５００ｍｌ）を順次
加え、誘発合成を３７℃で通気攪拌しながら４時間行わ
せた。誘発合成後、培養混合物を遠心分離（１０，８０
０Ｇ、６０分間）し、４．５Ｋｇの湿菌体を得た。
【００２６】（２）ヒトＳＯＤ産生菌体の破砕及びその
粗抽出液の調製 前記記載の(1) と同様にして得た湿菌体（５０ｇ）を１
０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０、２５
０ｍｌ）に懸濁し、フレンチプレスで破砕した。破砕液
を遠心分離（２８，４００Ｇ、１５分間）して上清液
（２２５ｍｌ）を得た。
粗抽出液の調製 前記記載の(1) と同様にして得た湿菌体（５０ｇ）を１
０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０、２５
０ｍｌ）に懸濁し、フレンチプレスで破砕した。破砕液
を遠心分離（２８，４００Ｇ、１５分間）して上清液
（２２５ｍｌ）を得た。
【００２７】（３）粗ヒトアポＳＯＤの精製 前記記載の(1) と同様にして得た湿菌体（２００ｇ）を
１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０、５
００ｍｌ）に懸濁し、フレンチプレスで破砕し、この破
砕液を遠心分離（１０，８００Ｇ、６０分間）して上清
液を得た。この液に１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝
液（ｐＨ７．０）を加えて全量を２，０００ｍｌとし、
これに硫酸アンモニウム（７２２ｇ）を加え、混合物を
約４℃で一晩撹拌した。生じた沈澱を遠心分離（１３，
４００Ｇ、１５分間）で除き、得られた上清に硫酸アン
モニウム（５１６ｇ）を加え、混合物を約４℃で３時間
撹拌した後、生じた沈澱を遠心分離（１３，４００Ｇ、
１５分間）で集めた。得られた沈澱物を１０ｍＭトリエ
タノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、溶液を
１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０、
２，５００ｍｌ）に対して３回透析した。
１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０、５
００ｍｌ）に懸濁し、フレンチプレスで破砕し、この破
砕液を遠心分離（１０，８００Ｇ、６０分間）して上清
液を得た。この液に１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝
液（ｐＨ７．０）を加えて全量を２，０００ｍｌとし、
これに硫酸アンモニウム（７２２ｇ）を加え、混合物を
約４℃で一晩撹拌した。生じた沈澱を遠心分離（１３，
４００Ｇ、１５分間）で除き、得られた上清に硫酸アン
モニウム（５１６ｇ）を加え、混合物を約４℃で３時間
撹拌した後、生じた沈澱を遠心分離（１３，４００Ｇ、
１５分間）で集めた。得られた沈澱物を１０ｍＭトリエ
タノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、溶液を
１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０、
２，５００ｍｌ）に対して３回透析した。
【００２８】この透析溶液を、１０ｍＭトリエタノール
アミン緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＱ−セファロ
ースＦＦ（ファルマシア社製、２００ｍｌ）カラムに通
し、このカラムを１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液
（ｐＨ７．０、１，０００ｍｌ）で洗った後、３０ｍＭ
ＮａＣｌ−１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）で展開してヒトＳＯＤ画分を集めた。このＳ
ＯＤ画分（４６０ｍｌ）に硫酸アンモニウム（３２０
ｇ）を加え、混合物を約４℃で６時間撹拌した後、生じ
た沈澱を遠心分離（１０，８００Ｇ、３０分間）で集め
た。得られた沈澱物を水に溶解し、水（２，５００ｍ
ｌ）に対して３回透析した。この透析液を０．２μｍの
フィルターで濾過した後、凍結乾燥して無色の固体（組
換えヒトアポＳＯＤ）を１．７６ｇ得た。
アミン緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＱ−セファロ
ースＦＦ（ファルマシア社製、２００ｍｌ）カラムに通
し、このカラムを１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液
（ｐＨ７．０、１，０００ｍｌ）で洗った後、３０ｍＭ
ＮａＣｌ−１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）で展開してヒトＳＯＤ画分を集めた。このＳ
ＯＤ画分（４６０ｍｌ）に硫酸アンモニウム（３２０
ｇ）を加え、混合物を約４℃で６時間撹拌した後、生じ
た沈澱を遠心分離（１０，８００Ｇ、３０分間）で集め
た。得られた沈澱物を水に溶解し、水（２，５００ｍ
ｌ）に対して３回透析した。この透析液を０．２μｍの
フィルターで濾過した後、凍結乾燥して無色の固体（組
換えヒトアポＳＯＤ）を１．７６ｇ得た。
【００２９】（４）ＣｕＣｌ2 処理ヒトＳＯＤの調製 前記(3) で得た組換えヒトアポＳＯＤ（１ｇ）に２Ｍ酢
酸緩衝液（ｐＨ５．０、１ｍｌ）と水（１４ｍｌ）とを
加えて撹拌した後、０．１ＭＣｕＣｌ2 水溶液（１．２
５ｍｌ）を加え、約４℃で一日撹拌した。この液を、
０．５ＭＮａＣｌ−０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）
で平衡化したＧ２５（ファルマシア社製、１００ｍｌ）
カラムに通し、０．５ＭＮａＣｌ−０．１Ｍ酢酸緩衝液
（ｐＨ５．０）で展開してヒトＳＯＤ画分を集めた。
酸緩衝液（ｐＨ５．０、１ｍｌ）と水（１４ｍｌ）とを
加えて撹拌した後、０．１ＭＣｕＣｌ2 水溶液（１．２
５ｍｌ）を加え、約４℃で一日撹拌した。この液を、
０．５ＭＮａＣｌ−０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）
で平衡化したＧ２５（ファルマシア社製、１００ｍｌ）
カラムに通し、０．５ＭＮａＣｌ−０．１Ｍ酢酸緩衝液
（ｐＨ５．０）で展開してヒトＳＯＤ画分を集めた。
【００３０】これを限外濾過膜を用いて濃縮し、１０ｍ
Ｍトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化
したＧ２５（ファルマシア社製、１００ｍｌ）カラムに
通し、１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．
０、５００ｍｌ）で洗い、２５ｍＭＮａＣｌ−１０ｍＭ
トリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０）で展開して
ヒトＳＯＤ画分を集めた。これを限外濾過膜を用いて濃
縮し、０．５ＭＮａＣｌ水溶液を加えて再度濃縮し、水
で平衡化したＧ２５（ファルマシア社製、１００ｍｌ）
カラムに通し、水で展開してＳＯＤ画分を集めた。これ
を限外濾過膜を用いて濃縮して組換えヒトＳＯＤを４９
０ｍｇ（紫外分光光度計で測定した吸光度から計算）得
た。
Ｍトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化
したＧ２５（ファルマシア社製、１００ｍｌ）カラムに
通し、１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．
０、５００ｍｌ）で洗い、２５ｍＭＮａＣｌ−１０ｍＭ
トリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０）で展開して
ヒトＳＯＤ画分を集めた。これを限外濾過膜を用いて濃
縮し、０．５ＭＮａＣｌ水溶液を加えて再度濃縮し、水
で平衡化したＧ２５（ファルマシア社製、１００ｍｌ）
カラムに通し、水で展開してＳＯＤ画分を集めた。これ
を限外濾過膜を用いて濃縮して組換えヒトＳＯＤを４９
０ｍｇ（紫外分光光度計で測定した吸光度から計算）得
た。
【００３１】（５）ヒトＳＯＤと２，２’−ジチオビス
（ベンゾチアゾール）との反応 前記記載の(3) と同様にして得たアポヒトＳＯＤ（０．
５ｇ）を１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ
７．０、１００ｍｌ）に溶かし、ｐＨを７．０に調整し
た。これに２，２’−ジチオビス（ベンゾチアゾール）
（３３３ｍｇ）を加え、ｐＨを７．０に調整した後、約
４℃で撹拌した。７７時間後、ＮａＣｌ（２．９２
ｇ），２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、５ｍｌ）及び０．
１ＭＣｕＣｌ2 水溶液（１．５ｍｌ）を加え、約４℃で
１７時間撹拌した。攪拌後にｐＨを７．０に調整し、硫
酸アンモニウム（７７ｇ）を加えて約４℃で３時間撹拌
した後、生じた沈澱を遠心分離（２８，４００Ｇ、１５
分間）で集めた。
（ベンゾチアゾール）との反応 前記記載の(3) と同様にして得たアポヒトＳＯＤ（０．
５ｇ）を１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ
７．０、１００ｍｌ）に溶かし、ｐＨを７．０に調整し
た。これに２，２’−ジチオビス（ベンゾチアゾール）
（３３３ｍｇ）を加え、ｐＨを７．０に調整した後、約
４℃で撹拌した。７７時間後、ＮａＣｌ（２．９２
ｇ），２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、５ｍｌ）及び０．
１ＭＣｕＣｌ2 水溶液（１．５ｍｌ）を加え、約４℃で
１７時間撹拌した。攪拌後にｐＨを７．０に調整し、硫
酸アンモニウム（７７ｇ）を加えて約４℃で３時間撹拌
した後、生じた沈澱を遠心分離（２８，４００Ｇ、１５
分間）で集めた。
【００３２】この沈澱を１０ｍＭトリエタノールアミン
緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、１０ｍＭトリエタノー
ルアミン緩衝液（ｐＨ７．０、１，０００ｍｌ）に対し
て３回透析した。この透析液を、１０ｍＭトリエタノー
ルアミン緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＱ−セファ
ロースＦＦ（ファルマシア社製、１０ｍｌ）カラムに通
し、１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．
０、５０ｍｌ）で洗った後、順次、５ｍＭ，１０ｍＭ，
２０ｍＭ，５０ｍＭ ＮａＣｌをそれぞれ含む１０ｍＭ
トリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０）で展開して
ヒトＳＯＤ画分を集めた。このＳＯＤ画分を硫酸アンモ
ニウム飽和にし、約４℃で６時間撹拌し、生じた沈澱を
遠心分離（２８，４００Ｇ、１５分間）で集めた後、水
（１，０００ｍｌ）に対して３回透析した。得られた透
析液を０．２μｍのフィルターで濾過し、凍結乾燥して
ヒトＳＯＤ誘導体２５０ｍｇ得た。
緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、１０ｍＭトリエタノー
ルアミン緩衝液（ｐＨ７．０、１，０００ｍｌ）に対し
て３回透析した。この透析液を、１０ｍＭトリエタノー
ルアミン緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＱ−セファ
ロースＦＦ（ファルマシア社製、１０ｍｌ）カラムに通
し、１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．
０、５０ｍｌ）で洗った後、順次、５ｍＭ，１０ｍＭ，
２０ｍＭ，５０ｍＭ ＮａＣｌをそれぞれ含む１０ｍＭ
トリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０）で展開して
ヒトＳＯＤ画分を集めた。このＳＯＤ画分を硫酸アンモ
ニウム飽和にし、約４℃で６時間撹拌し、生じた沈澱を
遠心分離（２８，４００Ｇ、１５分間）で集めた後、水
（１，０００ｍｌ）に対して３回透析した。得られた透
析液を０．２μｍのフィルターで濾過し、凍結乾燥して
ヒトＳＯＤ誘導体２５０ｍｇ得た。
【００３３】（６）ヒトＳＯＤと５，５’−ジチオビス
（ニトロ安息香酸）との反応 前記記載の(3) と同様にして得たアポヒトＳＯＤ（７
８．５ｍｇ）を１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液
（ｐＨ７．０、５ｍｌ）に溶かし、ｐＨを７．０に調整
した。これに５，５’−ジチオビス（ニトロ安息香酸）
（９．９ｍｇ）を加え、ｐＨを ７．０に再調整し、約
４℃で１４時間撹拌した。これにＮａＣｌ（０．１６
ｇ）及び２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、０．２６ｍｌ）
を加え、ｐＨを５．０に調整し、０．１ＭＣｕＣｌ2 水
溶液（０．１ｍｌ）を加え、約４℃で１２時間撹拌し
た。
（ニトロ安息香酸）との反応 前記記載の(3) と同様にして得たアポヒトＳＯＤ（７
８．５ｍｇ）を１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液
（ｐＨ７．０、５ｍｌ）に溶かし、ｐＨを７．０に調整
した。これに５，５’−ジチオビス（ニトロ安息香酸）
（９．９ｍｇ）を加え、ｐＨを ７．０に再調整し、約
４℃で１４時間撹拌した。これにＮａＣｌ（０．１６
ｇ）及び２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、０．２６ｍｌ）
を加え、ｐＨを５．０に調整し、０．１ＭＣｕＣｌ2 水
溶液（０．１ｍｌ）を加え、約４℃で１２時間撹拌し
た。
【００３４】ｐＨを７．０に調整した後、１０ｍＭトリ
エタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０、１，０００ｍ
ｌ）に対して３回透析し、１０ｍＭトリエタノールアミ
ン緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＱ−セファロース
ＦＦ（ファルマシア社製、１０ｍｌ）カラムに通した。
１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０、５
０ｍｌ）で洗った後、順次、５ｍＭ，１０ｍＭ，２０ｍ
Ｍ，５０ｍＭ ＮａＣｌをそれぞれ含む１０ｍＭトリエ
タノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０）で展開してヒトＳ
ＯＤ画分を集めた。このヒトＳＯＤ画分を硫酸アンモニ
ウム飽和とし、約４℃で６時間撹拌した後、生じた沈澱
を遠心分離（２８，４００Ｇ、１５分間）で集めた。こ
れを水に溶解し、水（１，０００ｍｌ）に対して３回透
析し、０．２μｍのフィルターで濾過し、凍結乾燥して
ヒトＳＯＤ誘導体６０ｍｇ得た。
エタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０、１，０００ｍ
ｌ）に対して３回透析し、１０ｍＭトリエタノールアミ
ン緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＱ−セファロース
ＦＦ（ファルマシア社製、１０ｍｌ）カラムに通した。
１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０、５
０ｍｌ）で洗った後、順次、５ｍＭ，１０ｍＭ，２０ｍ
Ｍ，５０ｍＭ ＮａＣｌをそれぞれ含む１０ｍＭトリエ
タノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０）で展開してヒトＳ
ＯＤ画分を集めた。このヒトＳＯＤ画分を硫酸アンモニ
ウム飽和とし、約４℃で６時間撹拌した後、生じた沈澱
を遠心分離（２８，４００Ｇ、１５分間）で集めた。こ
れを水に溶解し、水（１，０００ｍｌ）に対して３回透
析し、０．２μｍのフィルターで濾過し、凍結乾燥して
ヒトＳＯＤ誘導体６０ｍｇ得た。
【００３５】（７）ヒトＳＯＤと６，６’−ジチオビス
（ニコチン酸）との反応 前記記載の(3) と同様にして得たアポヒトＳＯＤ（０．
５ｇ）を１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ
７．０、１００ｍｌ）に溶かし、ｐＨを７．０に調整し
た。これに６，６’−ジチオビス（ニコチン酸）（３０
８ｍｇ）を加え、ｐＨを７．０に再調整し、約４℃で７
７時間撹拌した。これに、ＮａＣｌ（２．９２ｇ）及び
２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、５ｍｌ）を加え、ｐＨを
５．０に調整し、０．１ＭＣｕＣｌ2 水溶液（０．１ｍ
ｌ）を加え、約４℃で１７時間撹拌した。ｐＨを７．０
に調整し、硫酸アンモニウム（７７ｇ）を加え、約４℃
で３時間撹拌した後、生じた沈澱を遠心分離（２８，４
００Ｇ、１５分間）で集めた。この沈澱を１０ｍＭトリ
エタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、１０
ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０、１，０
００ｍｌ）に対して３回透析した。
（ニコチン酸）との反応 前記記載の(3) と同様にして得たアポヒトＳＯＤ（０．
５ｇ）を１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ
７．０、１００ｍｌ）に溶かし、ｐＨを７．０に調整し
た。これに６，６’−ジチオビス（ニコチン酸）（３０
８ｍｇ）を加え、ｐＨを７．０に再調整し、約４℃で７
７時間撹拌した。これに、ＮａＣｌ（２．９２ｇ）及び
２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、５ｍｌ）を加え、ｐＨを
５．０に調整し、０．１ＭＣｕＣｌ2 水溶液（０．１ｍ
ｌ）を加え、約４℃で１７時間撹拌した。ｐＨを７．０
に調整し、硫酸アンモニウム（７７ｇ）を加え、約４℃
で３時間撹拌した後、生じた沈澱を遠心分離（２８，４
００Ｇ、１５分間）で集めた。この沈澱を１０ｍＭトリ
エタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、１０
ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０、１，０
００ｍｌ）に対して３回透析した。
【００３６】透析液を１０ｍＭトリエタノールアミン緩
衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＱ−セファロースＦＦ
（ファルマシア社製、１０ｍｌ）カラムに通し、１０ｍ
Ｍトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０）５０ｍｌ
で洗った後、順次、５ｍＭ，１０ｍＭ，２０ｍＭ，５０
ｍＭ ＮａＣｌをそれぞれ含む１０ｍＭトリエタノール
アミン緩衝液（ｐＨ７．０）で展開してヒトＳＯＤ画分
を集めた。このＳＯＤ画分を硫酸アンモニウム飽和と
し、約４℃で６時間撹拌した後、生じた沈澱を遠心分離
（２８，４００Ｇ、１５分間）で集めた。得られた沈澱
を水に溶解し、水（１，０００ｍｌ）に対して３回透析
し、０．２μｍのフィルターで濾過した後、凍結乾燥し
てヒトＳＯＤ誘導体３６５ｍｇを得た。
衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＱ−セファロースＦＦ
（ファルマシア社製、１０ｍｌ）カラムに通し、１０ｍ
Ｍトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０）５０ｍｌ
で洗った後、順次、５ｍＭ，１０ｍＭ，２０ｍＭ，５０
ｍＭ ＮａＣｌをそれぞれ含む１０ｍＭトリエタノール
アミン緩衝液（ｐＨ７．０）で展開してヒトＳＯＤ画分
を集めた。このＳＯＤ画分を硫酸アンモニウム飽和と
し、約４℃で６時間撹拌した後、生じた沈澱を遠心分離
（２８，４００Ｇ、１５分間）で集めた。得られた沈澱
を水に溶解し、水（１，０００ｍｌ）に対して３回透析
し、０．２μｍのフィルターで濾過した後、凍結乾燥し
てヒトＳＯＤ誘導体３６５ｍｇを得た。
【００３７】（８）ヒトＳＯＤとジチオビス（グリコー
ル酸）との反応 前記記載の(3) と同様にして得たアポヒトＳＯＤ（０．
５ｇ）を１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ
７．０、１００ｍｌ）に溶かし、ｐＨを７．０に調整し
た。これにジチオビス（グリコール酸）（１８２ｍｇ）
を加え、ｐＨを７．０に調整した後、４℃で７７時間攪
拌した。攪拌後、ＮａＣｌ（２．９２ｇ），２Ｍ酢酸緩
衝液（ｐＨ５．０、５ｍｌ）及び０．１ＭＣｕＣｌ2 水
溶液（１．５ｍｌ）を加え、４℃で１７時間攪拌した。
ｐＨを７．０に調整し、硫酸アンモニウム飽和とし、約
４℃で６時間撹拌した後、生じた沈澱を遠心分離（２
８，４００Ｇ、１５分間）で集めた。
ル酸）との反応 前記記載の(3) と同様にして得たアポヒトＳＯＤ（０．
５ｇ）を１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ
７．０、１００ｍｌ）に溶かし、ｐＨを７．０に調整し
た。これにジチオビス（グリコール酸）（１８２ｍｇ）
を加え、ｐＨを７．０に調整した後、４℃で７７時間攪
拌した。攪拌後、ＮａＣｌ（２．９２ｇ），２Ｍ酢酸緩
衝液（ｐＨ５．０、５ｍｌ）及び０．１ＭＣｕＣｌ2 水
溶液（１．５ｍｌ）を加え、４℃で１７時間攪拌した。
ｐＨを７．０に調整し、硫酸アンモニウム飽和とし、約
４℃で６時間撹拌した後、生じた沈澱を遠心分離（２
８，４００Ｇ、１５分間）で集めた。
【００３８】これを１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝
液（ｐＨ７．０）に溶解し、１０ｍＭトリエタノールア
ミン緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析して脱塩した。
この透析液を１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）で平衡化したＱ−セファロースＦＦ（ファル
マシア社製、試料１０ｍｇに対して樹脂１ｍｌ使用）カ
ラムに通した。このカラムを１０ｍＭトリエタノールア
ミン緩衝液（ｐＨ７．０）で洗った後、順次、５ｍＭ，
１０ｍＭ，２０ｍＭ，５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍ
Ｍトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０）で展開し
てヒトＳＯＤ画分を集めた。このＳＯＤ画分を硫酸アン
モニウム飽和とし、生成した沈澱を遠心分離（２８，４
００Ｇ、１５分間）した。この沈澱を水溶液とし、０．
５ＭＮａＣｌ水溶液に対して透析し、次いで水に対して
透析し、凍結乾燥してヒトＳＯＤ誘導体を３５０ｍｇ得
た。
液（ｐＨ７．０）に溶解し、１０ｍＭトリエタノールア
ミン緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析して脱塩した。
この透析液を１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）で平衡化したＱ−セファロースＦＦ（ファル
マシア社製、試料１０ｍｇに対して樹脂１ｍｌ使用）カ
ラムに通した。このカラムを１０ｍＭトリエタノールア
ミン緩衝液（ｐＨ７．０）で洗った後、順次、５ｍＭ，
１０ｍＭ，２０ｍＭ，５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍ
Ｍトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０）で展開し
てヒトＳＯＤ画分を集めた。このＳＯＤ画分を硫酸アン
モニウム飽和とし、生成した沈澱を遠心分離（２８，４
００Ｇ、１５分間）した。この沈澱を水溶液とし、０．
５ＭＮａＣｌ水溶液に対して透析し、次いで水に対して
透析し、凍結乾燥してヒトＳＯＤ誘導体を３５０ｍｇ得
た。
【００３９】（９）ヒトＳＯＤとジチオビス（プロピオ
ン酸）との反応 前記記載の(3) と同様にして得たアポヒトＳＯＤ（０．
５ｇ）を１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ
７．０、１００ｍｌ）に溶解し、ｐＨを７．０に調整し
た。これにジチオビス（プロピオン酸）（２１０ｍｇ）
を加え、ｐＨを７．０に調整した後、４℃で７７時間攪
拌した。攪拌後、ＮａＣｌ（２．９２ｇ），２Ｍ酢酸緩
衝液（ｐＨ５．０、５ｍｌ）、及び０．１ＭＣｕＣｌ2
水溶液（１．５ｍｌ）を加え、４℃で１７時間攪拌し
た。ｐＨを７．０に調整した後、硫酸アンモニウム飽和
とし、約４℃で６時間撹拌した後、生じた沈澱を遠心分
離（２８，４００Ｇ、１５分間）で集めた。これを１０
ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解
し、１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．
０）に対して透析して脱塩した。
ン酸）との反応 前記記載の(3) と同様にして得たアポヒトＳＯＤ（０．
５ｇ）を１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ
７．０、１００ｍｌ）に溶解し、ｐＨを７．０に調整し
た。これにジチオビス（プロピオン酸）（２１０ｍｇ）
を加え、ｐＨを７．０に調整した後、４℃で７７時間攪
拌した。攪拌後、ＮａＣｌ（２．９２ｇ），２Ｍ酢酸緩
衝液（ｐＨ５．０、５ｍｌ）、及び０．１ＭＣｕＣｌ2
水溶液（１．５ｍｌ）を加え、４℃で１７時間攪拌し
た。ｐＨを７．０に調整した後、硫酸アンモニウム飽和
とし、約４℃で６時間撹拌した後、生じた沈澱を遠心分
離（２８，４００Ｇ、１５分間）で集めた。これを１０
ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解
し、１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．
０）に対して透析して脱塩した。
【００４０】この透析液を１０ｍＭトリエタノールアミ
ン緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＱ−セファロース
ＦＦ（ファルマシア社製、試料１０ｍｇに対して樹脂１
ｍｌ使用）カラムに通した。このカラムを１０ｍＭトリ
エタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０）で洗った後、順
次、５ｍＭ，１０ｍＭ，２０ｍＭ，５０ｍＭ ＮａＣｌ
を含む１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．
０）で展開してヒトＳＯＤ画分を集めた。このＳＯＤ画
分を硫酸アンモニウム飽和とし、約４℃で６時間撹拌し
た後、生じた沈澱を遠心分離（２８，４００Ｇ、１５分
間）で集めた。この沈澱を水溶液とし、０．５ＭＮａＣ
ｌ水溶液に対して透析し、次いで水に対して透析した
後、凍結乾燥してヒトＳＯＤ誘導体１２５ｍｇを得た。
ン緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＱ−セファロース
ＦＦ（ファルマシア社製、試料１０ｍｇに対して樹脂１
ｍｌ使用）カラムに通した。このカラムを１０ｍＭトリ
エタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０）で洗った後、順
次、５ｍＭ，１０ｍＭ，２０ｍＭ，５０ｍＭ ＮａＣｌ
を含む１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．
０）で展開してヒトＳＯＤ画分を集めた。このＳＯＤ画
分を硫酸アンモニウム飽和とし、約４℃で６時間撹拌し
た後、生じた沈澱を遠心分離（２８，４００Ｇ、１５分
間）で集めた。この沈澱を水溶液とし、０．５ＭＮａＣ
ｌ水溶液に対して透析し、次いで水に対して透析した
後、凍結乾燥してヒトＳＯＤ誘導体１２５ｍｇを得た。
【００４１】（10）ＣｕＣｌ2 処理ヒトＳＯＤのＱ−セ
ファロースＦＦによる分画 前記記載の(2) で得た上清（５４ｍｌ）に１０ｍＭトリ
エタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０、２０ｍｌ）を加
えて７４ｍｌにした。これにＮａＣｌ（２．３４ｇ）及
び２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、４ｍｌ）を加え、ｐＨ
を５．１に調整し、０．１ＭＣｕＣｌ2 水溶液（１．６
ｍｌ）を加えた後、約４℃で１時間撹拌した。これにビ
ス（２−ヒドロキシエチル）ジスルフィド（０．１２３
ｇ）を加え、ｐＨを７．５に調整し、約４℃で２０時間
撹拌し、ｐＨを７．０に調整し、水を加えて１００ｍｌ
にし、硫酸アンモニウム（１８．０５ｇ）を加え、約４
℃で一晩撹拌した。生じた沈澱を遠心分離（２８，４０
０Ｇ、１５分間）で除き、得られた上清（１１０ｍｌ）
に硫酸アンモニウム（２６．２８ｇ）を加え、約４℃で
３時間撹拌した後、生じた沈澱を遠心分離（２８，４０
０Ｇ、１５分間）で集めた。
ファロースＦＦによる分画 前記記載の(2) で得た上清（５４ｍｌ）に１０ｍＭトリ
エタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０、２０ｍｌ）を加
えて７４ｍｌにした。これにＮａＣｌ（２．３４ｇ）及
び２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、４ｍｌ）を加え、ｐＨ
を５．１に調整し、０．１ＭＣｕＣｌ2 水溶液（１．６
ｍｌ）を加えた後、約４℃で１時間撹拌した。これにビ
ス（２−ヒドロキシエチル）ジスルフィド（０．１２３
ｇ）を加え、ｐＨを７．５に調整し、約４℃で２０時間
撹拌し、ｐＨを７．０に調整し、水を加えて１００ｍｌ
にし、硫酸アンモニウム（１８．０５ｇ）を加え、約４
℃で一晩撹拌した。生じた沈澱を遠心分離（２８，４０
０Ｇ、１５分間）で除き、得られた上清（１１０ｍｌ）
に硫酸アンモニウム（２６．２８ｇ）を加え、約４℃で
３時間撹拌した後、生じた沈澱を遠心分離（２８，４０
０Ｇ、１５分間）で集めた。
【００４２】この沈澱を１０ｍＭトリエタノールアミン
緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、１０ｍＭトリエタノー
ルアミン緩衝液（ｐＨ７．０、２，０００ｍｌ）に対し
て３回透析した。透析液を１０ｍＭトリエタノールアミ
ン緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＱ−セファロース
ＦＦ（ファルマシア社製、２０ｍｌ）カラムに通した。
このカラムを１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐ
Ｈ７．０、１００ｍｌ）で洗った後、２０ｍＭＮａＣｌ
−１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０）
で展開してヒトＳＯＤ画分を集めた。得られたＳＯＤ画
分（１２０ｍｌ）に硫酸アンモニウム（８４．０ｇ）を
加え、約４℃で一晩撹拌し、生じた沈澱を遠心分離（２
８，４００Ｇ、１５分間）で集めた。この沈澱を水に溶
解し、２，０００ｍｌの水に対して３回透析した後、凍
結乾燥してヒトＳＯＤ誘導体１４３ｍｇを得た。
緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、１０ｍＭトリエタノー
ルアミン緩衝液（ｐＨ７．０、２，０００ｍｌ）に対し
て３回透析した。透析液を１０ｍＭトリエタノールアミ
ン緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＱ−セファロース
ＦＦ（ファルマシア社製、２０ｍｌ）カラムに通した。
このカラムを１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐ
Ｈ７．０、１００ｍｌ）で洗った後、２０ｍＭＮａＣｌ
−１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０）
で展開してヒトＳＯＤ画分を集めた。得られたＳＯＤ画
分（１２０ｍｌ）に硫酸アンモニウム（８４．０ｇ）を
加え、約４℃で一晩撹拌し、生じた沈澱を遠心分離（２
８，４００Ｇ、１５分間）で集めた。この沈澱を水に溶
解し、２，０００ｍｌの水に対して３回透析した後、凍
結乾燥してヒトＳＯＤ誘導体１４３ｍｇを得た。
【００４３】〔実施例〕 （１）ヒトＳＯＤとシスタミンとの反応 参考例の(3) と同様にして得たアポヒトＳＯＤ（１０６
ｍｇ）に１Ｍトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．
０、０．１ｍｌ），水（５ｍｌ）及びシスタミン・二塩
酸（１１．３ｍｇ）を加え、ｐＨを７．０に調整し、水
を加えて１０ｍｌにした後、４℃で２４時間攪拌した。
攪拌後、１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、２ｍｌ），０．
１ＭＣｕＣｌ2 水溶液（０．２ｍｌ）及びＮａＣｌ
（０．５８ｇ）を加え、次いで水を加えて全量を２０ｍ
とし、ｐＨを５．０に調整した後、４℃で２４時間攪拌
した。このｐＨを７．０に調整し、１０ｍＭトリエタノ
ールアミン緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析して脱塩
した。
ｍｇ）に１Ｍトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．
０、０．１ｍｌ），水（５ｍｌ）及びシスタミン・二塩
酸（１１．３ｍｇ）を加え、ｐＨを７．０に調整し、水
を加えて１０ｍｌにした後、４℃で２４時間攪拌した。
攪拌後、１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、２ｍｌ），０．
１ＭＣｕＣｌ2 水溶液（０．２ｍｌ）及びＮａＣｌ
（０．５８ｇ）を加え、次いで水を加えて全量を２０ｍ
とし、ｐＨを５．０に調整した後、４℃で２４時間攪拌
した。このｐＨを７．０に調整し、１０ｍＭトリエタノ
ールアミン緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析して脱塩
した。
【００４４】（２）ヒトＳＯＤとビス（２−アセチルア
ミノエチル）ジスルフィドとの反応 参考例の(3) と同様にして得たアポヒトＳＯＤ（１０６
ｍｇ）に１Ｍトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．
０、０．１ｍｌ），水（５ｍｌ）及びビス（アセチルア
ミノエチル）ジスルフィド（１１．８ｍｇ）を加え、ｐ
Ｈを７．０に調整後、水（１０ｍｌ）を加え、４℃で２
４時間攪拌した。攪拌後、１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．
０、２ｍｌ），０．１ＭＣｕＣｌ2 水溶液（０．２ｍ
ｌ）及びＮａＣｌ（０．５８ｇ）を加え、次いで水を加
えて全量を２０ｍｌとし、ｐＨを５．０に調整した後、
４℃で２４時間攪拌した。このｐＨを７．０に調整し、
１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０）に
対して透析して脱塩した。
ミノエチル）ジスルフィドとの反応 参考例の(3) と同様にして得たアポヒトＳＯＤ（１０６
ｍｇ）に１Ｍトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．
０、０．１ｍｌ），水（５ｍｌ）及びビス（アセチルア
ミノエチル）ジスルフィド（１１．８ｍｇ）を加え、ｐ
Ｈを７．０に調整後、水（１０ｍｌ）を加え、４℃で２
４時間攪拌した。攪拌後、１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．
０、２ｍｌ），０．１ＭＣｕＣｌ2 水溶液（０．２ｍ
ｌ）及びＮａＣｌ（０．５８ｇ）を加え、次いで水を加
えて全量を２０ｍｌとし、ｐＨを５．０に調整した後、
４℃で２４時間攪拌した。このｐＨを７．０に調整し、
１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０）に
対して透析して脱塩した。
【００４５】（３）ヒトＳＯＤとビス（２−ヒドロキシ
プロピル）ジスルフィドとの反応 参考例の(3) と同様にして得たアポヒトＳＯＤ（０．１
５ｇ）を１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ
７．０、３０ｍｌ）に溶解し、ｐＨを７．０に調整し、
ビス（２−ヒドロキシプロピル）ジスルフィド（５４．
７ｍｇ）を加え、ｐＨを７．０に再調整した後、４℃で
２４時間攪拌した。これにＮａＣｌ（０．９２ｇ），２
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ ５．０、１．５ｍｌ）及び０．１
ＭＣｕＣｌ2 水溶液（０．４７ｍｌ）を加え、４℃で２
４時間攪拌した。攪拌後、ｐＨを７．０に調整し、硫酸
アンモニウム飽和とし、約４℃で６時間撹拌した後、生
じた沈澱を遠心分離（２８，４００Ｇ、１５分間）で集
めた。この沈澱を１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液
（ｐＨ７．０）に溶かし、１０ｍＭトリエタノールアミ
ン緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析して脱塩した。
プロピル）ジスルフィドとの反応 参考例の(3) と同様にして得たアポヒトＳＯＤ（０．１
５ｇ）を１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ
７．０、３０ｍｌ）に溶解し、ｐＨを７．０に調整し、
ビス（２−ヒドロキシプロピル）ジスルフィド（５４．
７ｍｇ）を加え、ｐＨを７．０に再調整した後、４℃で
２４時間攪拌した。これにＮａＣｌ（０．９２ｇ），２
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ ５．０、１．５ｍｌ）及び０．１
ＭＣｕＣｌ2 水溶液（０．４７ｍｌ）を加え、４℃で２
４時間攪拌した。攪拌後、ｐＨを７．０に調整し、硫酸
アンモニウム飽和とし、約４℃で６時間撹拌した後、生
じた沈澱を遠心分離（２８，４００Ｇ、１５分間）で集
めた。この沈澱を１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液
（ｐＨ７．０）に溶かし、１０ｍＭトリエタノールアミ
ン緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析して脱塩した。
【００４６】（４）ヒトＳＯＤとビス（２−ヒドロキシ
エチル）ジスルフィドとの反応 参考例の(3) と同様にして得たアポヒトＳＯＤ（０．１
５ｇ）を１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ
７．０、３０ｍｌ）に溶解し、ｐＨを７．０に調整し、
ビス（２−ヒドロキシエチル）ジスルフィド（２３ｍ
ｇ）を加え、ｐＨを７．０に再調整した後、４℃で２４
時間攪拌した。これにＮａＣｌ（０．９２ｇ），２Ｍ酢
酸緩衝液（ｐＨ５．０、１．５ｍｌ）及び０．１ＭＣｕ
Ｃｌ2 水溶液（０．４７ｍｌ）を加え、４℃で１３時間
攪拌した。攪拌後、ｐＨを７．０に調整し、硫酸アンモ
ニウム飽和とし、約４℃で６時間撹拌した後、生じた沈
澱を遠心分離（２８，４００Ｇ、１５分間）で集めた。
この沈澱を１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ
７．０）に溶解し、１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝
液（ｐＨ７．０）に対して透析して脱塩した。
エチル）ジスルフィドとの反応 参考例の(3) と同様にして得たアポヒトＳＯＤ（０．１
５ｇ）を１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ
７．０、３０ｍｌ）に溶解し、ｐＨを７．０に調整し、
ビス（２−ヒドロキシエチル）ジスルフィド（２３ｍ
ｇ）を加え、ｐＨを７．０に再調整した後、４℃で２４
時間攪拌した。これにＮａＣｌ（０．９２ｇ），２Ｍ酢
酸緩衝液（ｐＨ５．０、１．５ｍｌ）及び０．１ＭＣｕ
Ｃｌ2 水溶液（０．４７ｍｌ）を加え、４℃で１３時間
攪拌した。攪拌後、ｐＨを７．０に調整し、硫酸アンモ
ニウム飽和とし、約４℃で６時間撹拌した後、生じた沈
澱を遠心分離（２８，４００Ｇ、１５分間）で集めた。
この沈澱を１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ
７．０）に溶解し、１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝
液（ｐＨ７．０）に対して透析して脱塩した。
【００４７】（５）前記記載の(1) 〜(4) で得たヒトＳ
ＯＤ画分の精製 前記記載の(1) 〜(4) で得たＳＯＤ画分を、１０ｍＭト
リエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した
Ｑ−セファロースＦＦ（ファルマシア社製、試料１０ｍ
ｇに対して樹脂１ｍｌ使用）カラムに通した。このカラ
ムを１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．
０）で洗った後、順次、５ｍＭ，１０ｍＭ，２０ｍＭ，
５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭトリエタノールアミ
ン緩衝液（ｐＨ７．０）で展開してＳＯＤ画分を集め
た。このＳＯＤ画分に、硫酸アンモニウム飽和とし、約
４℃で６時間撹拌した後、生じた沈澱を遠心分離（２
８，４００Ｇ、１５分間）で集めた。この沈澱を水溶液
とし、０．５ＭＮａＣｌ水溶液に対して透析し、次いで
水に対して透析し、凍結乾燥してヒトＳＯＤ誘導体
〔(1) は７４ｍｇ，(2) は７４ｍｇ，(3) は１０５ｍ
ｇ，(4) は１２５ｍｇ〕を得た。
ＯＤ画分の精製 前記記載の(1) 〜(4) で得たＳＯＤ画分を、１０ｍＭト
リエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した
Ｑ−セファロースＦＦ（ファルマシア社製、試料１０ｍ
ｇに対して樹脂１ｍｌ使用）カラムに通した。このカラ
ムを１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．
０）で洗った後、順次、５ｍＭ，１０ｍＭ，２０ｍＭ，
５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭトリエタノールアミ
ン緩衝液（ｐＨ７．０）で展開してＳＯＤ画分を集め
た。このＳＯＤ画分に、硫酸アンモニウム飽和とし、約
４℃で６時間撹拌した後、生じた沈澱を遠心分離（２
８，４００Ｇ、１５分間）で集めた。この沈澱を水溶液
とし、０．５ＭＮａＣｌ水溶液に対して透析し、次いで
水に対して透析し、凍結乾燥してヒトＳＯＤ誘導体
〔(1) は７４ｍｇ，(2) は７４ｍｇ，(3) は１０５ｍ
ｇ，(4) は１２５ｍｇ〕を得た。
【００４８】（６）粗ヒトＳＯＤとビス（２−ヒドロキ
シエチル）ジスルフィドとの反応 参考例の(2) で得た上清（５４ｍｌ）に１０ｍＭトリエ
タノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０、２０ｍｌ）を加え
て７４ｍｌにし、ＮａＣｌ（２．３４ｇ），ビス（２−
ヒドロキシエチル）ジスルフィド（０．１２３ｇ）を加
え、ｐＨを７．５に調整した後、約４℃で２０時間撹拌
した。これに２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、４ｍｌ）を
加え、ｐＨを５．１に調整し、０．１ＭＣｕＣｌ2 水溶
液（１．６ｍｌ）を加え、約４℃で１時間撹拌した。ｐ
Ｈを７．０に調整し、水を加えて全量を１００ｍｌに
し、硫酸アンモニウム（１８．０５ｇ）を加え、約４℃
で一晩撹拌した。生成した沈澱を遠心分離（２８，４０
０Ｇ、１５分間）で除き、得られた上清（１１０ｍｌ）
に硫酸アンモニウム（２６．２８ｇ）を加え、約４℃で
３時間撹拌した後、生成した沈澱を遠心分離（２８，４
００Ｇ、１５分間）で集めた。
シエチル）ジスルフィドとの反応 参考例の(2) で得た上清（５４ｍｌ）に１０ｍＭトリエ
タノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０、２０ｍｌ）を加え
て７４ｍｌにし、ＮａＣｌ（２．３４ｇ），ビス（２−
ヒドロキシエチル）ジスルフィド（０．１２３ｇ）を加
え、ｐＨを７．５に調整した後、約４℃で２０時間撹拌
した。これに２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、４ｍｌ）を
加え、ｐＨを５．１に調整し、０．１ＭＣｕＣｌ2 水溶
液（１．６ｍｌ）を加え、約４℃で１時間撹拌した。ｐ
Ｈを７．０に調整し、水を加えて全量を１００ｍｌに
し、硫酸アンモニウム（１８．０５ｇ）を加え、約４℃
で一晩撹拌した。生成した沈澱を遠心分離（２８，４０
０Ｇ、１５分間）で除き、得られた上清（１１０ｍｌ）
に硫酸アンモニウム（２６．２８ｇ）を加え、約４℃で
３時間撹拌した後、生成した沈澱を遠心分離（２８，４
００Ｇ、１５分間）で集めた。
【００４９】この沈澱を１０ｍＭトリエタノールアミン
緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、溶液を１０ｍＭトリエ
タノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０、２，０００ｍｌ）
に対して３回透析した。透析液を１０ｍＭトリエタノー
ルアミン緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＱ−セファ
ロースＦＦ（ファルマシア社製、２０ｍｌ）カラムに通
した。このカラムを１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝
液（ｐＨ７．０、１００ｍｌ）で洗った後、２０ｍＭＮ
ａＣｌ−１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ
７．０）で展開してＳＯＤ画分を集めた。このＳＯＤ画
分（１２０ｍｌ）に硫酸アンモニウム（８４．０ｇ）を
加え、約４℃で一晩撹拌し、生じた沈澱を遠心分離（２
８，４００Ｇ、１５分間）で集めた。この沈澱を水に溶
解し、２，０００ｍｌの水に対して３回透析した後、凍
結乾燥してヒトＳＯＤ誘導体１６０ｍｇを得た。
緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、溶液を１０ｍＭトリエ
タノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０、２，０００ｍｌ）
に対して３回透析した。透析液を１０ｍＭトリエタノー
ルアミン緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＱ−セファ
ロースＦＦ（ファルマシア社製、２０ｍｌ）カラムに通
した。このカラムを１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝
液（ｐＨ７．０、１００ｍｌ）で洗った後、２０ｍＭＮ
ａＣｌ−１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ
７．０）で展開してＳＯＤ画分を集めた。このＳＯＤ画
分（１２０ｍｌ）に硫酸アンモニウム（８４．０ｇ）を
加え、約４℃で一晩撹拌し、生じた沈澱を遠心分離（２
８，４００Ｇ、１５分間）で集めた。この沈澱を水に溶
解し、２，０００ｍｌの水に対して３回透析した後、凍
結乾燥してヒトＳＯＤ誘導体１６０ｍｇを得た。
【００５０】〔分析例〕 （１）陰イオン交換クロマトグラフ法による分析 参考例の(5) 〜(9) ，実施例の(1) 〜(5) で得られたヒ
トＳＯＤ誘導体の陰イオン交換クロマトグラフ法による
分析は、次に示すようなＡ又はＢ法で行った。 （Ａ 法）２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）１
ｍｌ当たり試料約１ｍｇを含む溶液１００μｌにつき、
次のような条件の液体クロマトグラフ法によって分析し
た。
トＳＯＤ誘導体の陰イオン交換クロマトグラフ法による
分析は、次に示すようなＡ又はＢ法で行った。 （Ａ 法）２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）１
ｍｌ当たり試料約１ｍｇを含む溶液１００μｌにつき、
次のような条件の液体クロマトグラフ法によって分析し
た。
【００５１】 検 出 器 ：紫外吸光光度計（測定波長２８０ｎｍ） カ ラ ム ：ＤＥＡＥ ５ＰＷ（東ソー製） カラム温度 ：室温 流 速 ：０．８ｍｌ／ｍｉｎ 移 動 相 ： （Ｉ）液〔２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）〕 （II）液〔フッ化カリウムを０．５Ｍの濃度で含む
（Ｉ）液〕 次の表１に示すグラジェントプログラムに従い、（Ｉ）
液及び（II）液を送液する。
（Ｉ）液〕 次の表１に示すグラジェントプログラムに従い、（Ｉ）
液及び（II）液を送液する。
【００５２】
【表１】
【００５３】（Ｂ 法） （Ｉ）液と（II）液の送液方法を、次の表２に示すグラ
ジェントプログラムで行った以外の条件は、Ａ法と同様
である。
ジェントプログラムで行った以外の条件は、Ａ法と同様
である。
【００５４】
【表２】
【００５５】これらの結果を、図１〜図５の（Ａ−ａ）
〜（Ａ−ｉ）に示す。 （２）ペプチドマッピング分析 ６Ｍ塩酸グアニジン溶液（０．５Ｍトリスヒドロキシア
ミノメタン−塩酸緩衝液、１０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ６．
８）（０．４ｍｌ）を試験管にとり、窒素で置換した。
これに試料〔参考例の(5) 〜(9) ，実施例の(1) 〜(5)
に記載したもの〕（４ｍｇ）を加え、窒素雰囲気下に４
−ビニルピリジン（２μｌ）を加え、２５℃で１時間放
置し、水に対して透析した後、凍結乾燥した。この凍結
乾燥物（１ｍｇ）を５０ｍＭトリスヒドロキシアミノメ
タン−塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）（０．１９ｍｌ）とリ
ジルエンドペプチダーゼ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）（１０μ
ｌ）との混合液に溶解し、４０℃で９時間加熱し、次い
で、５０ｍＭトリスヒドロキシアミノメタン−塩酸緩衝
液（ｐＨ６．８）（０．８９ｍｌ）を加え、４０℃でさ
らに１５時間加熱した。この混合物（８０μｌ）につ
き、次の条件で液体クロマトグラフ法によって分析し
た。
〜（Ａ−ｉ）に示す。 （２）ペプチドマッピング分析 ６Ｍ塩酸グアニジン溶液（０．５Ｍトリスヒドロキシア
ミノメタン−塩酸緩衝液、１０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ６．
８）（０．４ｍｌ）を試験管にとり、窒素で置換した。
これに試料〔参考例の(5) 〜(9) ，実施例の(1) 〜(5)
に記載したもの〕（４ｍｇ）を加え、窒素雰囲気下に４
−ビニルピリジン（２μｌ）を加え、２５℃で１時間放
置し、水に対して透析した後、凍結乾燥した。この凍結
乾燥物（１ｍｇ）を５０ｍＭトリスヒドロキシアミノメ
タン−塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）（０．１９ｍｌ）とリ
ジルエンドペプチダーゼ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）（１０μ
ｌ）との混合液に溶解し、４０℃で９時間加熱し、次い
で、５０ｍＭトリスヒドロキシアミノメタン−塩酸緩衝
液（ｐＨ６．８）（０．８９ｍｌ）を加え、４０℃でさ
らに１５時間加熱した。この混合物（８０μｌ）につ
き、次の条件で液体クロマトグラフ法によって分析し
た。
【００５６】検 出 器 ：紫外吸光光度計（測定波長
２２０ｎｍ） カ ラ ム ：ＴＳＫ−ｇｅｌ（ＯＤＳ−８０ＴＭ、東
ソー製） カラム温度 ：約３５℃ 流 速 ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ 移 動 相 ： （III)液〔０．１Ｗ／Ｖ％トリフルオロ酢酸溶液〕 （IV）液〔０．１Ｗ／Ｖ％トリフルオロ酢酸のアセトニ
トリル・水混液（４：１）〕 次の表３に示すグラジェントプログラムに従い、(III）
液及び（IV）液を送液する。
２２０ｎｍ） カ ラ ム ：ＴＳＫ−ｇｅｌ（ＯＤＳ−８０ＴＭ、東
ソー製） カラム温度 ：約３５℃ 流 速 ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ 移 動 相 ： （III)液〔０．１Ｗ／Ｖ％トリフルオロ酢酸溶液〕 （IV）液〔０．１Ｗ／Ｖ％トリフルオロ酢酸のアセトニ
トリル・水混液（４：１）〕 次の表３に示すグラジェントプログラムに従い、(III）
液及び（IV）液を送液する。
【００５７】
【表３】
【００５８】これらの結果を図６〜図１１の（Ｂ−ａ）
〜（Ｂ−ｊ）に示す。 （３）金属分析 試料〔参考例の(5) 〜(9) ，実施例の(1) 〜(5) に記載
したもの〕（約２０ｍｇ）を硫酸と硝酸を用いて灰化
し、０．０５Ｎ硝酸に溶解して５０ｍｌとしたものを銅
測定試料溶液とした。この液２５ｍｌに０．０５Ｎ硝酸
を加えて５０ｍｌとし、これを亜鉛測定試料溶液とし
た。これらの試料溶液を用いて、銅及び亜鉛の量を原子
吸光光度法によって分析した。それらの結果を表４に示
す。
〜（Ｂ−ｊ）に示す。 （３）金属分析 試料〔参考例の(5) 〜(9) ，実施例の(1) 〜(5) に記載
したもの〕（約２０ｍｇ）を硫酸と硝酸を用いて灰化
し、０．０５Ｎ硝酸に溶解して５０ｍｌとしたものを銅
測定試料溶液とした。この液２５ｍｌに０．０５Ｎ硝酸
を加えて５０ｍｌとし、これを亜鉛測定試料溶液とし
た。これらの試料溶液を用いて、銅及び亜鉛の量を原子
吸光光度法によって分析した。それらの結果を表４に示
す。
【００５９】
【表４】
【００６０】（４）活性測定 試料〔参考例の(5) 〜(9) ，実施例の(1) 〜(5) に記載
したもの〕を用いて、ＭｃＣｏｒｄとＦｒｉｄｖｉｃｈ
の方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４４，６０４９
（１９６９）］でヒトＳＯＤ活性を測定した。それらの
結果を表５に示す。
したもの〕を用いて、ＭｃＣｏｒｄとＦｒｉｄｖｉｃｈ
の方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４４，６０４９
（１９６９）］でヒトＳＯＤ活性を測定した。それらの
結果を表５に示す。
【００６１】
【表５】
【００６２】（５）ＳＨ基の定量 実施例の(4) と同様にして合成した２−ヒドロキシエチ
ルチオ基で修飾されたヒトＳＯＤ誘導体（約５ｍｇ）を
水（１ｍｌ）に含む溶液（２５０μｌ）に、ジチオスレ
イトール溶液（２ｍｇ／ｍｌ、２５ｍＭＥＤＴＡ、７．
４ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．１）（２５０
μｌ）を加え、５０℃で１時間加熱した。放冷後、１０
％トリクロロ酢酸水溶液（１ｍＭＥＤＴＡ）（５００μ
ｌ）を加え、生じた沈澱を遠心分離で除いた。上清（３
０μｌ）に、１ｍＭＥＤＴＡ水溶液（１２０μｌ），
２．５Ｍホウ酸緩衝液（５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ９．５）
（６００μｌ）及び７−フルオロベンゾ−２−オキサ−
１，３−ジアゾール−４−スルホン酸アンモニウム溶液
（２ｍｇ／ｍｌ、２．５Ｍホウ酸緩衝液）を加え、６０
℃で１時間加熱し、放冷後、得られた溶液を試料溶液と
した。
ルチオ基で修飾されたヒトＳＯＤ誘導体（約５ｍｇ）を
水（１ｍｌ）に含む溶液（２５０μｌ）に、ジチオスレ
イトール溶液（２ｍｇ／ｍｌ、２５ｍＭＥＤＴＡ、７．
４ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．１）（２５０
μｌ）を加え、５０℃で１時間加熱した。放冷後、１０
％トリクロロ酢酸水溶液（１ｍＭＥＤＴＡ）（５００μ
ｌ）を加え、生じた沈澱を遠心分離で除いた。上清（３
０μｌ）に、１ｍＭＥＤＴＡ水溶液（１２０μｌ），
２．５Ｍホウ酸緩衝液（５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ９．５）
（６００μｌ）及び７−フルオロベンゾ−２−オキサ−
１，３−ジアゾール−４−スルホン酸アンモニウム溶液
（２ｍｇ／ｍｌ、２．５Ｍホウ酸緩衝液）を加え、６０
℃で１時間加熱し、放冷後、得られた溶液を試料溶液と
した。
【００６３】ヒトＳＯＤ誘導体の代わりに２−メルカプ
トエタノール水溶液（１ｍｇ／１０ｍｌ）（２５０μ
ｌ）を用いて同様に操作して、標準溶液を得た。ヒトＳ
ＯＤ誘導体中の２−メルカプトエタノールの量は、試料
溶液又は標準溶液（２０μｌ）を、次の条件の液体クロ
マトグラフ法によって分析し、標準溶液のピーク面積に
対する試料溶液のピーク面積の割合から求めた。その結
果、ヒトＳＯＤ誘導体に対する２−メルカプトエタノー
ルの量は、０．４７％であった（ヒトＳＯＤ誘導体１分
子中に２分子の２−メルカプトエタノールが結合してい
る場合の理論値は０．４８％である。）。
トエタノール水溶液（１ｍｇ／１０ｍｌ）（２５０μ
ｌ）を用いて同様に操作して、標準溶液を得た。ヒトＳ
ＯＤ誘導体中の２−メルカプトエタノールの量は、試料
溶液又は標準溶液（２０μｌ）を、次の条件の液体クロ
マトグラフ法によって分析し、標準溶液のピーク面積に
対する試料溶液のピーク面積の割合から求めた。その結
果、ヒトＳＯＤ誘導体に対する２−メルカプトエタノー
ルの量は、０．４７％であった（ヒトＳＯＤ誘導体１分
子中に２分子の２−メルカプトエタノールが結合してい
る場合の理論値は０．４８％である。）。
【００６４】検 出 器 ：蛍光検出器（励起波長３８
５ｎｍ、検出波長５１５ｎｍ） カ ラ ム ：ＴＳＫ−ｇｅｌ（ＯＤＳ−１２０Ｔ、２
５ｃｍ、東ソー製） カラム温度 ：室温 流 速 ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ 移 動 相 （Ｖ）液〔０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．
０）／メタノール混液（９５：５）〕 （VI）液〔０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．
０）／メタノール混液（６０：４０）〕 次の表６に示すグラジェントプログラムに従い、（Ｖ）
液及び（VI）液を送液する。
５ｎｍ、検出波長５１５ｎｍ） カ ラ ム ：ＴＳＫ−ｇｅｌ（ＯＤＳ−１２０Ｔ、２
５ｃｍ、東ソー製） カラム温度 ：室温 流 速 ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ 移 動 相 （Ｖ）液〔０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．
０）／メタノール混液（９５：５）〕 （VI）液〔０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．
０）／メタノール混液（６０：４０）〕 次の表６に示すグラジェントプログラムに従い、（Ｖ）
液及び（VI）液を送液する。
【００６５】
【表６】
【００６６】（６）安定性試験 ヒトＳＯＤ〔参考例の(4) で得たもの〕とヒトＳＯＤ誘
導体〔実施例の(4) 及び(5) で得たオキシエチルチオ化
ヒトＳＯＤ〕の安定性を、水溶液中、３０℃で、３箇月
間保存して調べた。保存による品質の変化は、次に示す
ような陰イオン交換クロマトグラフ法による分析（Ｃ
法）で評価した。
導体〔実施例の(4) 及び(5) で得たオキシエチルチオ化
ヒトＳＯＤ〕の安定性を、水溶液中、３０℃で、３箇月
間保存して調べた。保存による品質の変化は、次に示す
ような陰イオン交換クロマトグラフ法による分析（Ｃ
法）で評価した。
【００６７】（Ｃ 法）１０ｍＭトリエタノールアミン
塩酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍｌ当たり試料
約１ｍｇを含む溶液１００μｌにつき、次のような条件
の液体クロマトグラフ法によって分析した。 検 出 器 ：紫外吸光光度計（測定波長２８０ｎｍ） カ ラ ム ：ＭｏｎｏＱ ＨＲ５／５（ファルマシア
製） カラム温度 ：室温 流 速 ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ 移 動 相 ： (VII）液〔１０ｍＭトリエタノールアミン塩酸−ＮａＯ
Ｈ緩衝液（ｐＨ７．０）〕 (VIII)液〔塩化ナトリウムが０．５Ｍの(VII）液〕 次の表７に示すグラジェントプログラムに従い、(VII）
液及び(VIII)液を送液する。
塩酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍｌ当たり試料
約１ｍｇを含む溶液１００μｌにつき、次のような条件
の液体クロマトグラフ法によって分析した。 検 出 器 ：紫外吸光光度計（測定波長２８０ｎｍ） カ ラ ム ：ＭｏｎｏＱ ＨＲ５／５（ファルマシア
製） カラム温度 ：室温 流 速 ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ 移 動 相 ： (VII）液〔１０ｍＭトリエタノールアミン塩酸−ＮａＯ
Ｈ緩衝液（ｐＨ７．０）〕 (VIII)液〔塩化ナトリウムが０．５Ｍの(VII）液〕 次の表７に示すグラジェントプログラムに従い、(VII）
液及び(VIII)液を送液する。
【００６８】
【表７】
【００６９】その結果、ヒトＳＯＤの品質には顕著な変
化が観察されたにもかかわらず、ヒトＳＯＤ誘導体の品
質は殆ど変化しないことがわかった。それらの結果を図
１２〜図１４の（Ｃ−ａ）〜（Ｃ−ｄ）に示す。
化が観察されたにもかかわらず、ヒトＳＯＤ誘導体の品
質は殆ど変化しないことがわかった。それらの結果を図
１２〜図１４の（Ｃ−ａ）〜（Ｃ−ｄ）に示す。
【００７０】
【発明の効果】本発明のヒトＳＯＤ誘導体は、電荷的及
び分子量的に均一でかつＳＯＤ活性が安定であるので、
スーパーオキシドによって引き起こされる種々の疾患に
対する優れた医薬として期待できるものである。
び分子量的に均一でかつＳＯＤ活性が安定であるので、
スーパーオキシドによって引き起こされる種々の疾患に
対する優れた医薬として期待できるものである。
【図１】（Ａ−ａ）は、参考例の(5) に記載したヒトＳ
ＯＤと２，２’−ジチオビス（ベンゾチアゾール）との
反応で得られたヒトＳＯＤ誘導体の陰イオン交換クロマ
トグラフ法分析（Ａ法）の結果である。（Ａ−ｂ）は、
参考例の(7) に記載したヒトＳＯＤと６，６’−ジチオ
ビス（ニコチン酸）との反応で得られたヒトＳＯＤ誘導
体の陰イオン交換クロマトグラフ法分析（Ｂ法）の結果
である。
ＯＤと２，２’−ジチオビス（ベンゾチアゾール）との
反応で得られたヒトＳＯＤ誘導体の陰イオン交換クロマ
トグラフ法分析（Ａ法）の結果である。（Ａ−ｂ）は、
参考例の(7) に記載したヒトＳＯＤと６，６’−ジチオ
ビス（ニコチン酸）との反応で得られたヒトＳＯＤ誘導
体の陰イオン交換クロマトグラフ法分析（Ｂ法）の結果
である。
【図２】（Ａ−ｃ）は、参考例の(6) に記載したヒトＳ
ＯＤと５，５’−ジチオビス（ニトロ安息香酸）との反
応で得られたヒトＳＯＤ誘導体の陰イオン交換クロマト
グラフ法分析（Ｂ法）の結果である。（Ａ−ｄ）は、参
考例の(8) に記載したヒトＳＯＤとジチオビス（グリコ
ール酸）との反応で得られたＳＯＤ誘導体の陰イオン交
換クロマトグラフ法分析（Ｂ法）の結果である。
ＯＤと５，５’−ジチオビス（ニトロ安息香酸）との反
応で得られたヒトＳＯＤ誘導体の陰イオン交換クロマト
グラフ法分析（Ｂ法）の結果である。（Ａ−ｄ）は、参
考例の(8) に記載したヒトＳＯＤとジチオビス（グリコ
ール酸）との反応で得られたＳＯＤ誘導体の陰イオン交
換クロマトグラフ法分析（Ｂ法）の結果である。
【図３】（Ａ−ｅ) は、参考例の(9) に記載したヒトＳ
ＯＤとジチオビス（プロピオン酸）との反応で得られた
ＳＯＤ誘導体の陰イオン交換クロマトグラフ法分析（Ｂ
法）の結果である。（Ａ−ｆ）は、実施例の(1) 及び
(5) に記載したヒトＳＯＤとシスタミンとの反応で得ら
れたＳＯＤ誘導体の陰イオン交換クロマトグラフ法分析
（Ａ法）の結果である。
ＯＤとジチオビス（プロピオン酸）との反応で得られた
ＳＯＤ誘導体の陰イオン交換クロマトグラフ法分析（Ｂ
法）の結果である。（Ａ−ｆ）は、実施例の(1) 及び
(5) に記載したヒトＳＯＤとシスタミンとの反応で得ら
れたＳＯＤ誘導体の陰イオン交換クロマトグラフ法分析
（Ａ法）の結果である。
【図４】（Ａ−ｇ) は、実施例の(2) 及び(5) に記載し
たヒトＳＯＤとビス（２−アセチルアミノエチル）ジス
ルフィドとの反応で得られたＳＯＤ誘導体の陰イオン交
換クロマトグラフ法分析（Ａ法）の結果である。（Ａ−
ｈ) は、実施例の(3) 及び(5) に記載したヒトＳＯＤと
ビス（２−ヒドロキシプロピル）ジスルフィドとの反応
で得られたＳＯＤ誘導体の陰イオン交換クロマトグラフ
法分析（Ａ法）の結果である。
たヒトＳＯＤとビス（２−アセチルアミノエチル）ジス
ルフィドとの反応で得られたＳＯＤ誘導体の陰イオン交
換クロマトグラフ法分析（Ａ法）の結果である。（Ａ−
ｈ) は、実施例の(3) 及び(5) に記載したヒトＳＯＤと
ビス（２−ヒドロキシプロピル）ジスルフィドとの反応
で得られたＳＯＤ誘導体の陰イオン交換クロマトグラフ
法分析（Ａ法）の結果である。
【図５】（Ａ−ｉ）は、実施例の(4) 及び(5) に記載し
たヒトＳＯＤとビス（２−ヒドロキシエチル）ジスルフ
ィドとの反応で得られたＳＯＤ誘導体の陰イオン交換ク
ロマトグラフ法分析（Ａ法）の結果である。
たヒトＳＯＤとビス（２−ヒドロキシエチル）ジスルフ
ィドとの反応で得られたＳＯＤ誘導体の陰イオン交換ク
ロマトグラフ法分析（Ａ法）の結果である。
【図６】（Ｂ−ａ) は、参考例の(4) に記載したヒトＳ
ＯＤのマッピング分析である。
ＯＤのマッピング分析である。
【図７】（Ｂ−ｂ) は、参考例の(5) に記載したヒトＳ
ＯＤと２，２’−ジチオビス（ベンゾチアゾール）との
反応で得られたヒトＳＯＤ誘導体のマッピング分析の結
果である。（Ｂ−ｃ) は、参考例の(7) に記載したヒト
ＳＯＤと６，６’−ジチオビス（ニコチン酸）との反応
で得られたヒトＳＯＤ誘導体のマッピング分析の結果で
ある。
ＯＤと２，２’−ジチオビス（ベンゾチアゾール）との
反応で得られたヒトＳＯＤ誘導体のマッピング分析の結
果である。（Ｂ−ｃ) は、参考例の(7) に記載したヒト
ＳＯＤと６，６’−ジチオビス（ニコチン酸）との反応
で得られたヒトＳＯＤ誘導体のマッピング分析の結果で
ある。
【図８】（Ｂ−ｄ) は、参考例の(6) に記載したヒトＳ
ＯＤと５，５’−ジチオビス（ニトロ安息香酸）との反
応で得られたヒトＳＯＤ誘導体のマッピング分析の結果
である。（Ｂ−ｅ) は、参考例の(8) に記載したヒトＳ
ＯＤとジチオビス（グリコール酸）との反応で得られた
ヒトＳＯＤ誘導体のマッピング分析の結果である。
ＯＤと５，５’−ジチオビス（ニトロ安息香酸）との反
応で得られたヒトＳＯＤ誘導体のマッピング分析の結果
である。（Ｂ−ｅ) は、参考例の(8) に記載したヒトＳ
ＯＤとジチオビス（グリコール酸）との反応で得られた
ヒトＳＯＤ誘導体のマッピング分析の結果である。
【図９】（Ｂ−ｆ) は、参考例の(9) に記載したヒトＳ
ＯＤとジチオビス（プロピオン酸）との反応で得られた
ヒトＳＯＤ誘導体のマッピング分析の結果である。（Ｂ
−ｇ）は、実施例の(1) 及び(5) で得られたヒトＳＯＤ
とシスタミンとの反応で得られたヒトＳＯＤ誘導体のマ
ッピング分析の結果である。
ＯＤとジチオビス（プロピオン酸）との反応で得られた
ヒトＳＯＤ誘導体のマッピング分析の結果である。（Ｂ
−ｇ）は、実施例の(1) 及び(5) で得られたヒトＳＯＤ
とシスタミンとの反応で得られたヒトＳＯＤ誘導体のマ
ッピング分析の結果である。
【図１０】（Ｂ−ｈ) は、実施例の(2) 及び(5) で得ら
れたヒトＳＯＤとビス（２−アセチルアミノエチル）ジ
スルフィドとの反応で得られたヒトＳＯＤ誘導体のマッ
ピング分析の結果である。（Ｂ−ｉ) は、実施例の(3)
及び(5) で得られたヒトＳＯＤとビス（２−ヒドロキシ
プロピル）ジスルフィドとの反応で得られたヒトＳＯＤ
誘導体のマッピング分析の結果である。
れたヒトＳＯＤとビス（２−アセチルアミノエチル）ジ
スルフィドとの反応で得られたヒトＳＯＤ誘導体のマッ
ピング分析の結果である。（Ｂ−ｉ) は、実施例の(3)
及び(5) で得られたヒトＳＯＤとビス（２−ヒドロキシ
プロピル）ジスルフィドとの反応で得られたヒトＳＯＤ
誘導体のマッピング分析の結果である。
【図１１】（Ｂ−ｊ) は、実施例の(4) 及び(5) で得た
ヒトＳＯＤとビス（２−ヒドロキシエチル）ジスルフィ
ドとの反応で得られたヒトＳＯＤ誘導体のマッピング分
析の結果である。
ヒトＳＯＤとビス（２−ヒドロキシエチル）ジスルフィ
ドとの反応で得られたヒトＳＯＤ誘導体のマッピング分
析の結果である。
【図１２】（Ｃ−ａ) は、参考例(4) で得たヒトＳＯＤ
を、陰イオン交換カラムクロマトグラフ法（Ｃ法）によ
って分析した結果である。
を、陰イオン交換カラムクロマトグラフ法（Ｃ法）によ
って分析した結果である。
【図１３】（Ｃ−ｂ）は、参考例(4) で得たヒトＳＯＤ
を、３０℃で３カ月間保存した後に、陰イオン交換カラ
ムクロマトグラフ法（Ｃ法）によって分析した結果であ
る。（Ｃ−ｃ) は、実施例の(4) のオキシエチルチオ化
ヒトＳＯＤを、陰イオン交換カラムクロマトグラフ法
（Ｃ法）によって分析した結果である。
を、３０℃で３カ月間保存した後に、陰イオン交換カラ
ムクロマトグラフ法（Ｃ法）によって分析した結果であ
る。（Ｃ−ｃ) は、実施例の(4) のオキシエチルチオ化
ヒトＳＯＤを、陰イオン交換カラムクロマトグラフ法
（Ｃ法）によって分析した結果である。
【図１４】（Ｃ−ｄ) は、実施例の(4) のオキシエチル
チオ化ヒトＳＯＤを、３０℃で３カ月間保存した後に、
陰イオン交換カラムクロマトグラフ法（Ｃ法）によって
分析した結果である。
チオ化ヒトＳＯＤを、３０℃で３カ月間保存した後に、
陰イオン交換カラムクロマトグラフ法（Ｃ法）によって
分析した結果である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 岩本 儀唯 山口県宇部市大字小串1978番地の５ 宇部 興産株式会社宇部研究所内
Claims (2)
- 【請求項１】 次式（Ｉ）； 【化１】 〔式中、（ヒトＳＯＤ’）は、ヒトＣｕ，Ｚｎ型スーパ
ーオキシドジスムターゼの１１１番目のシステイン残基
のメルカプト基から水素原子を除いたものを表し；Ｘ
は、アミノ基，炭素原子数１〜１０個のアルキル基もし
くは炭素原子数２〜１０個のアシル基で置換されたアミ
ノ基，又はヒドロキシル基を表し；Ｒ1 及びＲ2 は、水
素原子，又は炭素原子数１〜１０個のアルキル基を表
す。〕で示されるヒトＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキシドジ
スムターゼ誘導体。 - 【請求項２】 ヒトＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキシドジス
ムターゼと次式（II）； 【化２】 （式中、Ｘ，Ｒ1 及びＲ2 は請求項１の記載と同義であ
る。）で示されるアルキルジスルフィドとを反応させる
ことを特徴とする請求項１記載の式（Ｉ）で示されるヒ
トＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキシドジスムターゼ誘導体の
製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP00202593A JP3232542B2 (ja) | 1993-01-08 | 1993-01-08 | ヒトＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキシドジスムターゼ誘導体及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP00202593A JP3232542B2 (ja) | 1993-01-08 | 1993-01-08 | ヒトＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキシドジスムターゼ誘導体及びその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06199895A true JPH06199895A (ja) | 1994-07-19 |
| JP3232542B2 JP3232542B2 (ja) | 2001-11-26 |
Family
ID=11517797
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP00202593A Expired - Lifetime JP3232542B2 (ja) | 1993-01-08 | 1993-01-08 | ヒトＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキシドジスムターゼ誘導体及びその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3232542B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022244757A1 (ja) | 2021-05-18 | 2022-11-24 | 株式会社Ｌｔｔバイオファーマ | 抗癌剤の投与に伴う障害を治療又は予防するための医薬組成物 |
-
1993
- 1993-01-08 JP JP00202593A patent/JP3232542B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022244757A1 (ja) | 2021-05-18 | 2022-11-24 | 株式会社Ｌｔｔバイオファーマ | 抗癌剤の投与に伴う障害を治療又は予防するための医薬組成物 |
| KR20240008844A (ko) | 2021-05-18 | 2024-01-19 | 가부시키가이샤 엘티티 바이오파마 | 항암제의 투여에 수반되는 장애를 치료 또는 예방하기 위한 의약 조성물 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3232542B2 (ja) | 2001-11-26 |
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