JPH06160385A - 核酸及び蛋白質検定のブロッキング剤 - Google Patents

核酸及び蛋白質検定のブロッキング剤

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JPH06160385A
JPH06160385A JP31734592A JP31734592A JPH06160385A JP H06160385 A JPH06160385 A JP H06160385A JP 31734592 A JP31734592 A JP 31734592A JP 31734592 A JP31734592 A JP 31734592A JP H06160385 A JPH06160385 A JP H06160385A
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JP
Japan
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casein
dna
blocking agent
nucleic acid
protein
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JP31734592A
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English (en)
Inventor
Satoshi Fujita
田 聡 藤
Masayoshi Momiyama
山 政 慶 籾
Naoto Kagiyama
山 直 人 鍵
Yasumitsu Kondo
藤 恭 光 近
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Aisin Corp
Original Assignee
Aisin Seiki Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【目的】本発明の目的は、より高感度に核酸、蛋白質を
検出可能にするブロッキング剤を提供することである。 【構成】支持担体であるフィルター上に例えばDNAを
固定し、DNAに特異的に化学物質を吸着させた後、化
学物質に蛍光基質・発色基質等を反応させてDNAを検
出するとき、化学物質のフィルターに対する非特異的吸
着を防ぐ目的で使用されるブロッキング剤であり、α−
カゼインあるいはβ−カゼインよりなることを特徴とす
るブロッキング剤である。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、核酸、蛋白質等の検体
を支持担体上で検出する系において、支持担体に固定さ
れた検体に特異的に結合する被検体(核酸、蛋白質)を
前記検体に結合させるとき、及び、その後被検体に検体
の存在を最終的に開示し得る化学物質を結合させる時、
被検体あるいは化学物質の支持担体への被特異的吸着を
防ぐ目的で行うブロッキング処理のブロッキング剤に関
するものである。
【0002】
【従来の技術】核酸あるいは蛋白質の検定方法として、
支持担体上に検体である核酸あるいは蛋白質を固定して
行う方法が知られている。この方法を、検体としてDN
Aを検定する場合を例にとって説明すると、まず、支持
担体であるフィルター上に検体であるDNAを固定し、
このDNAにディゴキシゲニンの抗原で標識したDNA
プローブをハイブリダイズさせる。続いて、該抗原に酵
素等の化学物質を結合させた抗体を結合させた後、化学
物質に蛍光基質・発色基質等を反応させてDNAを検出
するというものである。
【0003】フィルター上のDNAとDNAプローブと
の結合、及び、抗原と化学物質を結合させた抗体との結
合は、どちらも特異的な反応であるが、DNAプローブ
及び化学物質はDNAの吸着していないフィルター面に
も数多く非特異的に吸着する。非特異的に吸着した化学
物質は、DNAの存在する場所に吸着した化学物質と同
様にシグナルを発して、DNA検出の感度を低下させる
ため、従来では化学物質とDNAとの吸着反応を行う前
に、DNAの吸着していないフィルター上にブロッキン
グ剤を吸着させ、化学物質がDNA以外とは吸着反応を
起こさないようにしている。
【0004】このブロッキング剤としては、デンハート
溶液(2%ポリビニルピロリドン,2%フィコール、2
%BSA)が現在広く用いられている。このデンハート
溶液に含まれるBSAは負に帯電しているため、BSA
がフィルターに吸着すると同じ負に帯電している化学物
質はフィルターに付着できず、ノイズを除去することが
可能になる。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、BSA
は負に帯電しているもののフィルターへの吸着が弱いた
め、化学物質などのフィルターへの吸着を充分に排除す
ることができない。
【0006】また、近年、牛乳カゼインを用いたブロッ
キング剤も市場に出ている(DNAラベリング&ディテ
クションキット:ベーリンガーマンハイム山之内株式会
社製)。この牛乳カゼインよりなるブロッキング剤も、
デンハート溶液と同様に負に帯電して化学物質のフィル
ターへの吸着を排除するようになっており、デンハート
試薬よりもフィルターへの吸着が強いため、検体検出の
感度を向上させることができる。
【0007】本発明は、上記した従来のブロッキング剤
の改良に関するものであり、より高感度にDNA等の核
酸及び蛋白質を検出可能にするブロッキング剤を提供す
ることを技術的課題とするものである。
【0008】
【発明の構成】
【0009】
【課題を解決するための手段】請求項1記載の発明は、
α−カゼインを成分とする核酸及び蛋白質検定のブロッ
キング剤である。また請求項2記載の発明は、β−カゼ
インを成分とする核酸及び蛋白質検定のブロッキング剤
である。
【0010】ブロッキング剤を用いたブロッキング処理
は、支持担体に固定された検体(核酸、蛋白質)に特異
的に結合する被検体(核酸、蛋白質)を検体に結合させ
る前、及び、被検体に検体の存在を最終的に開示し得る
化学物質を結合させる前などに行うことができ、α−カ
ゼインあるいはβ−カゼインを含む緩衝溶液に、検体あ
るいは被検体が吸着された支持担体を30分〜1時間浸
して行われる。
【0011】また、検体あるいは被検体を標識するもの
としては、放射性同位元素、アルカリホスファターゼ、
酸性ホスファターゼ、パーオキシターゼ、β−ガラクト
シターゼ、グルコース−6−リン酸デヒトロゲナーゼあ
るいはルシフェラーゼ等の酵素、蛍光剤、化学発光分
子、放射線不透過性物質、リポソーム及び特異的結合ペ
アの一方より選ぶことができる。
【0012】ブロッキング処理に使用される支持担体と
しては、ニトロセルロース、6,6ナイロン、6ナイロ
ン、アガロース、ポリアクリルアミド、及びこれらで化
学修飾されたもの、例えばメンブレンフィルターを使用
することができる。
【0013】尚、本発明のブロッキング剤は、核酸、蛋
白質、あるいは免疫学的に検出しうる物質の検出あるい
は検定に用いることができる。
【0014】
【実施例】
(1)カゼインの分取(参考文献:Touhouikaisi,35
(6),509-516,(1989) ) 牛から採取した牛乳200mlを4℃で遠心(3000
rpm,30分)し浮き上がった、脂肪分を薬さじで取
り除き脱脂粉乳180mlを得る。次いで、脱脂粉乳1
80mlを蒸留水で2倍に希釈し、0.5N塩酸を滴下
してpHを4.6に調製してカゼインを沈澱させ、濾別
する。これを希釈脱脂粉乳と同量の蒸留水に分散させ、
0.5N水酸化ナトリウムでpHを7.0に調製して溶
解させたもののpHを再び4.6にして再沈澱させた。
以下同じ操作を5回繰り返し、凍結乾燥し、カゼインを
80gr得た。
【0015】(2)κ−カゼインの分取(参考文献:J.
Dairy Res.,39.49,(1972) ) 40grのカゼインを6.6M尿素に溶かす。次いで
3.5M硫酸をゆっくり加えてpH1.5にする。次い
で蒸留水を加えて2.2M尿素まで希釈する。次いで、
1時間撹拌し、1時間放置する。その後5%硫酸アンモ
ニウム溶液になるように、硫酸アンモニウムを加える。
数分撹拌するとκ−カゼインが沈澱してくる。この懸濁
液を遠心(3000rpm,20分)し、上清液を別の
容器に移す。残った結晶に再び蒸留水を加え懸濁させ遠
心し、上清液を捨てる。この操作を5回繰り返し硫酸ア
ンモニウムを除き、精製する。次いで凍結乾燥し、約5
gのκ−カゼインを得た。
【0016】(3)α−カゼインの分取(参考文献:J.
Dairy Res.,39.49,(1972) ) (2)のκ−カゼインの分取過程において、別の容器に
移した5%硫酸アンモニウム溶液の上清液に、更に硫酸
アンモニウムを加え20%硫酸アンモニウム水溶液に
し、数分撹拌する。しばらくすると結晶が析出してくる
ので、吸引ろ過で結晶を得る。次いでこの結晶を60m
lの6.6M尿素と10mlの3.5M硫酸と115m
lの蒸留水の混合液で結晶を洗う。次いで、この沈澱物
を6.6M尿素に溶かし、次いで1N水酸化ナトリウム
でpH=4.5にするとα−カゼインが沈澱してくる。
次いで溶液を蒸留水で希釈し、3.3M尿素にする。2
時間撹拌後、1時間放置し遠心(3000rpm,20
分)をかけ、上清液を別の容器に移す。残った結晶に再
び蒸留水を加え懸濁し、上清液を捨てる。この操作を5
回繰り返し硫酸アンモニウムを除き精製する。次いで結
晶を凍結乾燥し約20gのα−カゼインを得た。
【0017】(4)β−カゼインの分取(参考文献:J.
Dairy Res.,39.49,(1972) ) (3)のα−カゼインの分取過程において、遠心をかけ
た後別の容器に移した上清液を、水で希釈し1.7M尿
素にする次いで、1N水酸化ナトリウムでpH=4.9
にするとβ−カゼインが沈澱してくる。2時間撹拌後,
1時間放置し遠心(3000rpm,20分)をかけ上
清液を捨てる。残った結晶に蒸留水を加え懸濁し、上清
液を捨てる。この操作を5回繰り返し硫酸アンモニウム
を除き精製する。次いで結晶を凍結乾燥し約15gのβ
−カゼインを得た。
【0018】(実施例1)牛乳カゼインの分画成分のブ
ロッキング剤としての有用性を確かめるために、ベ−リ
ンガ−・マンハイム(Boehringer Mannheim )社のDNA
Labeling and Detection kit、及び酵素基質として本発
明者らが開発した蛍光基質3-Hydroxy-N-2'-biphenyl-2-
naphthalenecarboxamide phosphate ester(特開平04-9
1799号に開示。以下、HNPPと称する)、及びブロッ
キング剤として牛乳カゼインのα−カゼインを用い、ナ
イロンメンブレンフィルタ−上でDNAの検出を行っ
た。
【0019】始めに、ディコギシゲニン(Dig)によ
りλDNAを標識し、このλDNAが0fg,2.5fg,5fg,10
fg,20fg,40fg,80fg,400fg,2000fgとなるように希釈を行
い、ナイロンメンブレンフィルタ−にスポットし、減圧
下80℃,30分加熱することにより固定した。なおこ
の際全てのスポットが非特異的DNAとして100ng
(100×10-9g)のニシン精子DNAを含むように
した。
【0020】次にこのナイロンメンブレンフィルタ−に
ブロッキング処理を行った。1%のα- カゼインを含む
バッファー溶液(Tris-HCl 100mmol, NaCl 150mmol/l,
pH 7.5(20 ℃))を調整してブロッキング処理溶液とし、
10ccをシャーレに移した。ここに、ナイロンメンブイレ
ンフィルターを浸し、室温(約20℃)で1時間放置し
た。
【0021】こうして、ブロッキング処理を終えた後、
アルカリホスファタ−ゼ標識抗DiG抗体と反応させ、
未反応の抗体を除いた後、100mMトリス(pH9.
5)、100mMNaCl、50mMMgCl2 溶液中
で終濃度100μg/mlのHNPPを反応させた。蛍
光シグナルの検出は紫外線励起光源下でポラロイドフィ
ルム(商標名)による写真撮影することにより行った。
【0022】この結果を図1に示す。同図において、1
は核酸試料担体フィルタ−、11は蛍光感光部分であ
る。尚、表1における「+」は検出可能を、「±」は検
出不明瞭を、「−」は検出不可能を示す。上記より知ら
れるごとく、5fgという極微小量でも十分検出でき
た。
【0023】(実施例2)実施例1で用いたα−カゼイ
ンの代わりにβ−カゼインを用いてブロッキング処理溶
液を調整し、実施例1と同様にDNAの検定を行った。
【0024】結果を表1に示す。このように、10fg
のDNAを明瞭に検出することができた。
【0025】(比較例1)実施例1で用いたα−カゼイ
ンの代わりに、ベーリンガー・マンハイム山之内株式会
社製のブロッキング試薬(分画していないカゼインを使
用)を用い、該会社のプロトコールに従ってブロッキン
グ処理溶液を調整し、実施例1と同様にDNAの検定を
行った。
【0026】表1に示すように、10fgのDNAを検
出することができたが、実施例2のようにブロッキング
処理溶液としてβ−カゼインを用いた場合よりもバック
グラウンドが高くなってしまい、感度は実施例2よりも
低いものとなった。
【0027】(比較例2)実施例1で用いたα−カゼイ
ンの代わりにκ−カゼインを用いてブロッキング処理溶
液を調整し、実施例1と同様にDNAの検定を行った。
【0028】表1に示すように、10fgのDNAを検
出することができたが、比較例1と同様にバックグラウ
ンドが高く、感度は実施例2よりも低いものとなった。
【0029】
【表1】
【0030】
【発明の効果】本発明のα−カゼインあるいはβ−カゼ
インによるブロッキング剤を使用すれば、より高感度に
フィルター上の核酸及び蛋白質を検出することが可能と
なる。
【0031】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 近 藤 恭 光 愛知県刈谷市朝日町2丁目1番地 アイシ ン精機株式会社内

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 α−カゼインを成分とする核酸及び蛋白
    質検定のブロッキング剤。
  2. 【請求項2】 β−カゼインを成分とする核酸及び蛋白
    質検定のブロッキング剤。
JP31734592A 1992-11-26 1992-11-26 核酸及び蛋白質検定のブロッキング剤 Pending JPH06160385A (ja)

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JP31734592A JPH06160385A (ja) 1992-11-26 1992-11-26 核酸及び蛋白質検定のブロッキング剤

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JP31734592A JPH06160385A (ja) 1992-11-26 1992-11-26 核酸及び蛋白質検定のブロッキング剤

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JP (1) JPH06160385A (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013019888A (ja) * 2011-06-16 2013-01-31 Fujifilm Corp 高感度なイムノクロマトグラフ方法及びイムノクロマトグラフ用キット

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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