JPH06130031A - Ｂｏｄの測定装置及び測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 微生物を固定化した微生物膜（８）と酸素電
極（６）を利用してＢＯＤを測定するに際し、微生物電
極を装着したフローセル（７）の入口部に接続されてい
る液導入路に排水部（５）を設け、使用前の微生物膜に
栄養源を供給し、長時間微生物膜を使用しない時に洗浄
液又は基質溶液を該微生物膜に断続的に供液し、測定に
使用する溶液にホウ酸もしくはソルビン酸又はこれらの
塩を含有させる。 【効果】 短時間で精度の高い測定が可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、生物化学的酸素要求量
（ＢＯＤ) を微生物膜と酸素電極を組み合わせて迅速に
測定するＢＯＤの測定装置及び測定方法、並びにこれら
に使用する微生物膜の活性化方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】現在、ＢＯＤの測定は日本工業規格に定
められた方法（工業排水試験法 JIS K-0102-1972) に従
って行われているが、この方法は測定に５日間を要する
などの問題があり、このため従来よりＢＯＤを測定する
装置として微生物膜と酸素電極を組み合わせたセンサー
が開発されている。固定化する微生物としてはトリコス
ポロン・クタネウムや活性汚泥等がよく用いられている
（特公昭61-7258 号公報；鈴木周一編著、バイオセンサ
ー p.135〜136 、p.140 〜142(1989) 講談社発行所) 。

【０００３】また、微生物の膜への固定化方法も検討が
行われている（特開昭53-117496 号公報）。更に、測定
する装置に関しては微生物膜と酸素電極を組み合わせた
センサーをフローセルに装着して使用する装置が知られ
ている（特開昭53-47895号公報、特開平3-123851号公
報）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これま
で開発されてきたＢＯＤの測定装置は、(1) その構造上
標準液（グルコース 150mg、グルタミン酸 150mgを水に
とかし１ＬとしたものをＢＯＤ220ppm相当としたもの）
及び検水の入口からフローセルまでの液導入路内に前回
の標準液や検水が残っているため、次の測定時に混入し
て短時間で測定しようとすると測定値に誤差を生じてき
た。

【０００５】(2) また、保存してある状態の膜はすぐに
測定に使用できないため、活性化する必要があるが、従
来の方法では活性化に48時間以上が必要であり、実際に
は排水処理場等の現場ではすぐに測定したいという要望
を満足させ得ない。 (3) 更に、測定を行わない時は微生物膜の活性が低下す
るのを防ぐため、連続的に洗浄液と標準液を微生物膜に
与えなくてはならない。従って、洗浄液、緩衝液、標準
溶液が頻繁にかつ多量に必要とされ、装置を維持するの
に使用する溶液の調製の時間が多く要している。

【０００６】(4) 加えて、洗浄液、緩衝液、標準液は微
生物に汚染され腐りやすいため溶液交換の頻度が高く、
また装置経路内にスライムや菌塊、菌膜が詰まり装置の
維持管理も容易ではなくなる。そこで、本発明者らは、
これらの問題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、本発
明を完成するに至った。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、ＢＯＤを微生
物膜と酸素電極を組み合わせて迅速に測定するＢＯＤの
測定装置及び測定方法に関するものであり、かつ使用す
る微生物膜の活性化に要する時間を短縮し、使用溶液の
調製頻度を削減した従来にない改良されたＢＯＤの測定
装置及び測定方法を提供するものである。

【０００８】即ち、本願第１の発明は、微生物を固定化
した微生物膜と酸素電極を組み合わせたＢＯＤの測定装
置において、微生物電極を装着したフローセルの入口部
に接続されている液導入路に排水部を具備したＢＯＤの
測定装置であり、本願第２の発明は、微生物を固定化し
た微生物膜と酸素電極を組み合わせたＢＯＤの測定方法
に使用する微生物膜の活性化方法において、測定に使用
する前の微生物膜に栄養源を供給した後、該微生物膜を
洗浄し測定状態にすることを特徴とする微生物膜の活性
化方法であり、本願第３の発明は、微生物を固定化した
微生物膜と酸素電極を組み合わせたＢＯＤの測定方法に
おいて、長時間該微生物膜を使用しない時に、洗浄液又
は基質溶液を該微生物膜に断続的に給液することを特徴
とするＢＯＤの測定方法であり、本願第４の発明は、微
生物を固定化した微生物膜と酸素電極を組み合わせたＢ
ＯＤの測定方法において、ＢＯＤの測定に使用する溶液
にホウ酸もしくはソルビン酸又はこれらの塩を含有させ
ることを特徴とするＢＯＤの測定方法である。

【０００９】本発明に使用する微生物としては、ＢＯＤ
の測定に利用できるものであれば特に制限はなく、例え
ばクレブシエラ(Klebsiella)属に属する微生物が挙げら
れる。クレブシエラ属に属する微生物としては、例え
ば、クレブシエラ・オキシトカＪＣＭ１６６５ (Klebsi
ella oxytoca JCM1665) 、クレブシエラ・プランティコ
ラ ＪＣＭ７２５１ (Klebsiella planticola JCM725
1)、クレブシエラ・オザエナエ ＪＣＭ１６６３ (Kleb
siella ozaenae JCM1663) 、クレブシエラ・テリゲナ
ＪＣＭ１６８７ (Klebsiella terrigena JCM1687) 等が
挙げられる。更に、本発明者らはＢＯＤ測定に適した微
生物を広く自然界より検索した結果、鹿児島県の土壌よ
り分離した１菌株が広い資化性を有し、短時間の活性化
処理でＢＯＤの測定ができる等の実用的に優れた性質を
持っていることを見出した。

【００１０】本菌株の菌学的性質を以下に記載する。 Ａ. 形態学的性質 (１) 細胞の形及び大きさ： 桿菌で大きさは0.８〜1.
２μm ×３〜６μm (２) 細胞の多形成： なし (３) 運動性： なし (４) 胞子の有無： なし (５) グラム染色性： 陰性 (６) 抗酸性： なし Ｂ. 培養的性質 (１) 肉汁寒天平板培養： 良く生育し、平滑な淡青
灰色のコロニーを形成する。

【００１１】 (２) 肉汁寒天斜面培養： 良く生育する (３) 肉汁液体培養： 良く生育する (４) ゼラチン穿刺培養： 液化せず (５) リトマス・ミルク： 酸性化し凝固する Ｃ. 生理学的性質 (１) 硝酸塩の還元： ＋ (２) 脱窒反応： ＋ (３) ＭＲテスト： − (４) ＶＰテスト： ＋ (５) インドールの生成： ＋ (６) 硫化水素の生成： − (７) デンプンの加水分解： − (８) クエン酸の利用： − (９) 無機窒素源の利用： ＋ (10) 色素の生成 − (11) ウレアーゼ： ＋ (12) オキシダーゼ： − (13) カタラーゼ： ＋ (14) 生育の範囲： 温度５〜40℃ pH４〜9.5 (15) 酸素に対する態度： 通性嫌気性 (16) Ｏ−Ｆテスト： Ｆ (発酵型) Ｄ. その他の性質 (１) β−ガラクトシダーゼ： ＋ (２) ＤＮase − (３) トリプトファンデアミナーゼ： − (４) エスクリンの分解： ＋ (５) アルギニンの分解： − (６) リジンの脱炭酸反応： ＋ (７) オルニチンの脱炭酸反応： − (８) 砒素耐性： 砒素10000pp
m存在下で生育可。

【００１２】以上の菌学的性質をもとに本菌株の分類学
上の地位をバージェイズ・マニュアル・オブ・システマ
ティック・バクテリオロジー第１巻 415〜416 頁、461
〜465 頁 (1984) (Bergey's Manual of Systematic Bac
teriology Volume 1, 415-416,461-465 (1984)) の記載
と比較したところ、クレブシエラ・オキシトカに属する
新菌株であると同定し、クレブシエラ・オキシトカ 120
92(Klebsiella oxytoca 12092)と命名した。なお、本菌
株は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研条寄第３
６１６号 (FERM BP-3616) として1991年10月22日に受託
され国際寄託されている。

【００１３】以下に本菌株の培養方法を記載する。本菌
株の培養は通常の細菌の培養方法であればいずれでも使
用できる。炭素源としては、ぶどう糖、麦芽糖、蔗糖、
糖蜜等通常用いられるものを単独、又は組み合わせて用
いることができる。窒素源としては、有機窒素含有物と
して各種アミノ酸、コーンスティープリカー、マルツエ
キス、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、尿素等をま
た、無機窒素含有物としては塩化アンモニウム、硫酸ア
ンモニウム、硝酸アンモニウム等を単独又は組み合わせ
て用いることができる。

【００１４】その他、ビタミン、ミネラル等の成分を適
宜添加使用することができる。培養温度は好ましくは20
℃〜40℃、更に好ましくは28℃〜37℃である。培養pHは
好ましくは4.５〜9.０、更に好ましくは5.５〜8.０であ
る。培養方法は液体培養及び固体培養のいずれでも可能
であるが、生育力の強い対数増殖期の菌体が望ましく、
培養時間は、好気的に液体培養を行う場合には好ましく
は10時間〜72時間、更に好ましくは12時間〜48時間であ
る。固体培養を行う場合には好ましくは12時間〜96時
間、更に好ましくは24時間〜72時間である。

【００１５】培養終了後、公知の一般的方法にて菌体を
得ることができるが、例えば遠心分離法により菌体を集
めることができる。得られた菌体は蒸留水等で洗浄した
後、固定化を行うが、固定化法には通常用いられる方法
が使用でき、例えばメンブランフィルター (ポアサイズ
0.45ミクロン以下) 等の膜の間に固定化して用いると菌
体の漏洩がなく安定した固定化微生物膜が得られる。

【００１６】微生物の固定化に使用する膜は、菌体は通
過しないが試料溶液中の酸素、有機物等の溶解成分が通
過できる親水性の材質のものであればよく、１例を挙げ
ればポアサイズが0.45ミクロン以下のアセチルセルロー
ス膜、ニトロセルロース膜等が適している。また、微生
物を２枚の膜の間に固定化する際には、できるだけ膜間
の間隙を少なくし、密着した膜と膜の間に微生物が封入
される状態を保つことで安定した応答が得られ、かつ酸
素電極への密着性も高まるため酸素濃度変化に対する応
答性も向上し望ましい。

【００１７】本発明に用いる微生物電極は上記固定化微
生物膜と酸素電極とからなり、微生物膜は着脱可能なキ
ャップ等により酸素電極に密着固定されており、膜の交
換が容易にできる。また、この微生物電極は通常使用さ
れるフローセルであればいずれにも装着して利用できる
が、クレブシエラ・オキシトカ 12092は試料溶液中の成
分に対する応答が早く、かつ、検出感度が高いため少量
の試料でのＢＯＤ測定が可能であり、従って測定時間の
短縮化のためにフローセルの容量を１ml以下、更に好適
には、0.３ml〜0.６mlと微小にすることができ、また、
試料中の酸素濃度については、必ずしも完全に酸素飽和
とする必要はなく、酸素濃度が一定した状態であればよ
い。

【００１８】更に、フローセルを縦位置に配し、フロー
セル中を攪拌子で攪拌しながら下方より試料溶液を通
じ、上方より排出する方法をとることにより、気泡等の
微生物膜への付着や残留がなく安定した測定ができる。
例えば、試料溶液を４ml／分で通過させた場合、30℃で
は、約15分から20分で１試料の測定ができる。以下、本
願第１の発明について説明する。

【００１９】この発明の特徴はＢＯＤの測定装置におい
て、フローセルに溶液が流入する前に排水部を設けたこ
とである。従来の装置では、洗浄液、緩衝液、標準液、
検水はそれぞれの入口からフローセルまでの導入路は直
結の状態なので、例えば始めに測定する検水のＢＯＤが
高い場合、液導入路に検水が残り、次に測定する検水の
ＢＯＤが低い場合、前検水の影響がなくなるまで次検水
を流す方法が採用されているが、迅速に測定ができると
いう本装置の長所を損なう結果をもたらしている。本発
明者らは、フローセルの入口に接続された液導入路に排
水部を設けることによりこの問題を解決した。

【００２０】図１にその仕組みを示す。 (1)〜(5) は切
り換えバルブを表しており、電磁弁を使用する。Ｐは液
送ポンプを表しており、洗浄液、標準液又は検水とリン
酸緩衝液とを同時に送り込む能力を有する物である。洗
浄液は通常の水道水、蒸留水又は脱イオン水を用いるこ
とができる。緩衝液は通常リン酸二水素カリウム（ＫＨ
₂ＰＯ₄）とリン酸水素二カリウム（Ｋ₂ＨＰＯ₄）からな
るリン酸緩衝液を用い、濃度は通常50〜300mM、好まし
くは130〜260mMである。pHは使用する微生物の性質によ
り、通常pH5.0〜8.0、好ましくはpH6.0〜7.0に調節す
る。他にリン酸二水素カリウムとリン酸水素二ナトリウ
ム（Ｎａ ₂ＨＰＯ₄）からなる緩衝液も使用できる。

【００２１】標準液はグルコース150mg／Ｌ、グルタミ
ン酸150mg／Ｌを含む混合液をＢＯＤ値220ppmとし、必
要に応じて設定ＢＯＤ値になるように希釈する。液送ポ
ンプを通り過ぎた後は、洗浄液、標準液、検水側とリン
酸緩衝液が合流する。ＡＰはエアーポンプを表してお
り、(5) のバルブを通過後、空気を通気することにより
標準液や検水の溶存酸素の差をなくすとともに、過飽和
の酸素の影響を取り除くために使用する。(6) は酸素電
極であり、その先端(8) は微生物膜である。(7) は液入
口と液出口を有するフローセルである。

【００２２】ここで本願第１の発明の効果を説明する。
例えば、検水が検水入口よりバルブ(4) に至る時間をＸ
とし、バルブ(4) からバルブ(5) までに至る時間をＹと
すると、前検水測定後、次検水に検水入口を取つけた
後、Ｘの間あるいはそれ以上バルブ(5) が開き、同時に
バルブ(4) も開く。次にＹの間バルブ(4) が閉じられ、
Ｙの間だけあるいはそれ以上バルブ(1) が開き洗浄液が
流れる。この方法により前検水はフローセルへ流入する
ことなく、バルブ(5) より排水されると同時に次検水は
検水入口よりバルブ(4) まで満たされ、次検水の測定準
備もでき上がる。

【００２３】この際バルブ(5) が開くとフローセルには
エアーポンプ（ＡＰ) からの空気のみが供給されること
になりベースラインが不安定となるが、上記Ｙの時間経
過後バルブ(5) が閉じ洗浄液がフローセルへ流れること
によりベースラインは安定する。以下、本願第２の発明
について説明する。

【００２４】この発明は、微生物膜の活性化に要する時
間の短縮を目的とする。ＢＯＤの測定に使用する微生物
膜は保存状態では活性を長期に保たせるために乾燥状態
にあり、これを測定に供するには乾燥状態から湿潤状態
にするとともに、乾燥菌を活性化する必要がある。従来
の方法では、微生物膜を緩衝液に浸漬させた後、酸素電
極に取り付け、出力が安定するまで標準液を与え続ける
ため測定に使用するまでに約２日間を要していた。

【００２５】そこで、本発明者らはより短時間でできる
活性化の方法を発見した。この方法では、乾燥膜を先ず
測定に使用する時と同様な緩衝液あるいは水に浸し、酸
素電極に装着後、標準液１、２もしくは３又は検水のい
ずれかひとつの入口に活性化に必要な栄養源を含む溶液
（以下「栄養液」という。）を取りつける。その後、一
定時間後、洗浄液、栄養液を交互に流す。

【００２６】ここで洗浄液の流入時間と栄養液の流入時
間はともに、通常30秒から30分の間、好ましくは10分前
後である。また栄養液の組成は一般に使用されている微
生物の培養に使用する培地や使用する微生物に適した組
成でよく、炭素源としてグルコースやフルクトース等の
単糖類やシュークロースやマルトース等の２糖類、窒素
源として塩化アンモニウムや硫酸アンモニウム等のアン
モニウム塩、各種アミノ酸、ポリペプトン類、ビタミン
源として酵母エキス、金属類として硫酸マグネシウムや
硫酸鉄等の金属塩を与えるとよい。

【００２７】また、使用する標準液にビタミン源の酵母
エキスを添加したものを栄養液としてもよく、必要に応
じて金属塩を添加してもよい。上述した標準液にビタミ
ン源の酵母エキスを添加した栄養液は、グルコース、グ
ルタミン酸及び酵母エキスを含む栄養液であるが、この
栄養液では、グルコース濃度及びグルタミン酸濃度は、
好ましくは５〜1000ppm 、更に好ましくは 300〜600ppm
であり、酵母エキス濃度は、好ましくは10〜10,000ppm
、更に好ましくは200 〜400ppmである。

【００２８】なお、微生物の生育に重要なリン酸塩はリ
ン酸緩衝液から供給される。以下、本願第３の発明につ
いて説明する。この発明は、より少量の供給液で微生物
膜の活性を長期に保たせることを目的とする。微生物膜
は測定中の場合、その原理から検水中の有機物を資化す
るため栄養源が与えられていると考えられる。しかし、
測定を行わない時には洗浄液のみが流れることとなり、
栄養源の供給がなく活性が低下する。従って、微生物膜
の活性を維持するためには測定を行わない時にも活性を
保つために必要な栄養源を与え続けなくてはならない。
そこで、実際の方法として通常栄養源を与える手段とし
て、標準液を測定する方法を利用して、洗浄液と標準液
を連続的に与える方法が考えられる。この場合、測定に
使用する全ての標準液を用いる方法と、一つの濃度の標
準液のみを用いる方法がある。しかし前述のいずれの場
合も、連続使用するため、標準液、洗浄液、緩衝液のそ
れぞれの量がかなり多く消費される。例えば、５ml／分
の流速にて16時間運転した際には、洗浄液、標準液、緩
衝液が合わせて５Ｌ近く消費されることになる。このた
め、これらの溶液の調製の頻度も高くなり、時間も必要
となる。

【００２９】そこで、本発明者らが研究した結果、栄養
源を前述のように連続的に与えるのではなく、微生物膜
の活性が落ちない程度に断続的に与えても微生物膜の活
性を保つには充分であることが判った。その方法は液送
ポンプを一定時間稼働させ、次に一定時間停止させる方
法である。更に稼働させている間には、洗浄液と基質溶
液を一定の間隔で交互に与えるものである。ここでいう
ポンプ稼働の一定時間は使用する膜中の微生物の性質に
もよるが、通常10秒から４分の間、好ましくは30秒から
２分の間である。また停止する時間は、通常30秒から３
分の間、好ましくは１分から２分の間である。

【００３０】また、微生物膜に供給される基質溶液とし
ては、標準液の他、前述した栄養源を含む栄養液を使用
してもよい。更に、洗浄液と基質溶液の間隔としては、
稼働・停止時間と同様、使用する微生物の性質による
が、洗浄液と基質溶液を１回毎に交互に与えたり、洗浄
液を10回与えた後、１回基質溶液を与える等種々の組み
合わせを用いることができる。

【００３１】以下、本願第４の発明について説明する。
測定に使用する溶液に他の試薬を混入して防腐する方法
としては、一般的には塩酸や酢酸によって防腐の対象物
のpHを下げる方法が知られており、他に次亜塩素酸ナト
リウムやpHを低くしてクロラムフェニコールを添加する
方法が知られている。しかし、微生物膜を使用する上で
当然使用する防腐剤は微生物膜に使用している微生物に
極力影響を与えないものが好ましい。

【００３２】そこで、本発明者らは、種々の防腐剤を検
討した結果、ホウ酸（H₃BO₃)もしくはソルビン酸又はこ
れらの塩が優れた効果を与えることを見出した。ホウ酸
又はソルビン酸の塩としては、ホウ酸ナトリウム、ソル
ビン酸カリウムが挙げられる。特に、ホウ酸、ソルビン
酸カリウムを使用することが好ましい。使用濃度は、使
用する防腐剤の種類により異なるが、ホウ酸では、通常
0.1〜1.0 ％、好ましくは 0.3〜0.5 ％であり、ソルビ
ン酸カリウムでは、通常 0.1〜1.0 ％、好ましくは0.25
〜0.5 ％である。

【００３３】更に、緩衝液の濃度を問題としないなら
ば、ホウ酸と低pHとの併用も有効な防腐手段である。pH
は、塩酸等の無機酸又は本発明に使用している微生物に
より資化されない有機酸を用いて２〜３に調整すると更
に防腐効果が上昇する。

【００３４】

【実施例】以下、調製例、実験例及び実施例により本発
明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに
限定されるものではない。 （調製例１） 微生物膜の調製 クレブシエラ・オキシトカ 12092(Klebsiella oxytoca
12092)(FERM BP-3616)をポリペプトン１％、酵母エキス
0.1％、塩化ナトリウム 0.5％を含む液体培地(pH6.5)
100ml の入った 500ml容坂口フラスコに接種し、30℃に
て17時間好気的条件下で振盪培養を行った。培養終了
後、培養液を6000rpm で20分間遠心分離して菌体を集め
た。得られた菌体に少量の滅菌蒸留水を加えて懸濁し、
再度遠心分離して洗浄を行った。この洗浄を３回繰り返
し最終的に20倍希釈してＯＤ₆₆₀ の値が0.58になるよう
な菌体濃縮液を調製した。

【００３５】この菌体濃縮液32μｌを滅菌した1.7％κ
−カラギーナン、0.8％ローカストビーンガム混合液２
ｇに懸濁し、平均細孔径 0.8μm のアセチルセルロース
膜（ミリポア社製メンブランフィルタータイプＨＡ）上
に滴下し、この微生物懸濁液が該膜中に全て保持される
まで膜の下部より吸引し、浸潤させて該膜中に固定し
た。該膜を通過した余剰のκ−カラギーナン水溶液はそ
のまま膜の下部より滴下させて除けばよい。次に、この
微生物を保持した該膜を氷冷した後、40mMリン酸緩衝液
100ml中に室温で５分間浸漬してκ−カラギーナン、ロ
ーカストビーンガムを固化させ微生物膜を得た。

【００３６】（実験例１） 排水部を付けた場合と付け
ない場合の比較 調製例１で得られた微生物膜を用いてＢＯＤの測定を行
った。測定にはグルコース 150mg／L、グルタミン酸 15
0mg／Lの混合液をＢＯＤ値 220ppm としたものを希釈し
てＢＯＤ値 100ppm 、５ppm を調製したものを用いた。

【００３７】使用した装置は図１に示した経路の中で
(5)の排水部を付けた場合と付けない場合のものをそれ
ぞれ使用した。エアーポンプは1000ml／分の流速で通気
し、洗浄液、標準液を４ml／分で、緩衝液を１ml／分の
流量で液送ポンプにて流した。測定条件としては、排水
部を付けた場合と付けない場合について測定を行い、ま
ず標準液を引き込む前に洗浄を行いベースラインを安定
化させるために、洗浄液（水) を10分間流した。次に、
標準液として100ppmに調製した標準液を流し続けた。そ
して、検水の出力ラインが一定になった始めの点を出力
値として得た。次に、洗浄液を10分間流し、５ppm 標準
液を検水入口にセットし出力ラインが一定になるまで流
した。

【００３８】その結果として酸素電極の出力の変化を図
２に示した。図２から、排水部を取り付けた場合、15分
で出力が安定しピーク値が得られるが、排水部を取り付
けない場合は100ppmの標準液の影響を受け出力が安定す
るまでに30分を要したことがわかる。 （実験例２） 栄養液による乾燥微生物膜の活性化 栄養液としてはグルコース 426ppm 、グルタミン酸 426
ppm 、酵母エキス 300ppm を含むものを使用した。

【００３９】微生物膜は実験例１で使用した膜と同じ方
法で調製したものを用いた。使用した装置は実験例１で
使用した排水部(5) を有するものを使用し、他の条件は
実験例１と同じにした。栄養液と緩衝液はそれぞれ10分
間供給した。この時の出力状態を図３に示した。図中の
出力値は、溶存酸素が高い場合は高い値を、溶存酸素が
低い場合は低い値を示す。

【００４０】図３においては、微生物膜に栄養液が供給
されると、微生物膜中の微生物により栄養液中の基質が
消費されるため、溶存酸素も減少する。従って、栄養液
が供給されると、出力値が低くなってくる。次に、洗浄
液が供給されると、洗浄液中には基質が存在していない
ため、溶存酸素の消費はなく出力値は高くなる。次にま
た栄養液を供給すると、１回目の栄養液供給により微生
物膜中の微生物が活性化されたり、増殖するため、酸素
消費量は１回目の栄養液供給の場合よりも多くなり、出
力値が更に低くなる。この栄養液と洗浄液の供給を繰り
返していくと、活性が高まるにつれ栄養液に対する出力
値は徐々に低くなっていき、この出力値に対する洗浄に
よる出力値の戻りが遅くなり、ベースラインが低くなっ
てくる。ここでこのベースライン値の低下は微生物膜の
活性が高くなってきていることを示していると考えられ
るため、ベースライン値が一定の出力値になれば測定に
必要な活性に達したと判断できると考えられる。

【００４１】更に、図３に示すように栄養液により微生
物膜の活性が上昇していくが、このままではベースライ
ンが高く、測定に供することはできないため、再び洗浄
を行いベースラインを安定化させる必要がある。そこ
で、ベースラインの出力値が上述の活性化された一定値
に達した時点で栄養液の供給を停止し、洗浄液を流し洗
浄を始めベースラインを安定化させた。

【００４２】活性化に到達したと判断する出力値につい
ては微生物膜に対し栄養液を供給した際のベースライン
が1000、900 、800 、700mV に達した時点で洗浄液を供
給し、一定の出力になった後、測定を行った。その結
果、出力値が800mV 以下に達した後、洗浄を行うことに
より乾燥前の微生物膜の活性と同様な出力を得た（表
１）。

【００４３】

【表１】

【００４４】また、700mV と 800mVでは同じ活性に到達
したが、その所要時間が700mV で約17時間であり、800m
V では約11時間であったため、図３では活性化を短時間
で行うため 800mVに達した時点で洗浄液を供給すること
とした。その結果、約21時間で洗浄が開始され、洗浄時
間はベースラインが安定するまでとし、洗浄開始から５
時間以上が好ましいことがわかった。よって、微生物膜
の洗浄終了まで26時間で活性化が全て終了した。本試験
で活性化した微生物膜の活性を表２に示す。

【００４５】

【表２】

【００４６】以上のことから明らかなように、栄養液に
よる乾燥微生物膜の活性化方法により活性はほぼ以前と
同じ程度にもどり測定に充分な出力を得る程度まで活性
化できた。また、活性化時間も16時間となった。従来の
方法では活性化時間は乾燥微生物膜を緩衝液に１日浸漬
し、その後、装置に装着後、標準液と洗浄液を交互に与
えるが、微生物膜に供給する栄養液が従来の方法では標
準液で、組成がグルコースとグルタミン酸のみであるた
め、ビタミンや金属塩の欠乏により微生物膜中の微生物
の活性化に時間がかかり、実際には測定可能な活性を得
るには１日間必要であり、微生物膜が使用できるまで合
計２日間かかった。これに対し本発明の方法では32時間
の時間短縮ができた。

【００４７】（実験例３） 連続的供液と断続的供液と
の比較 条件：微生物膜は実験例１で使用した膜と同様に調製
したものを用いた。 ポンプ稼働時間 30秒 ポンプ停止時間 90秒 開始後、ポンプ稼働５回目まで洗浄液を流し、６回目で
標準液を流した。その後は同様の操作を繰り返した。 タイムコースを図４に示す。 条件：ポンプ連続稼働 洗浄液 11分 標準液（50ppm) 4分 流入を繰り返した。

【００４８】流速：５ml／分、運転時間16時間 装置は、実験例２で使用したものと同じものを使用し
た。 結果を表３に示す。消費した洗浄液、標準液、緩衝液の
合計は約1.2Lとなり、連続稼働の 1／4の消費量となっ
た。また活性は連続稼働と同等の活性を保持できた。

【００４９】

【表３】

【００５０】（実験例４） 防腐剤の影響 (1) 種々の防腐剤を洗浄液、緩衝液、標準液に添加した
ときの活性（出力) を無添加の場合と比較した。測定条
件としては、ＢＯＤ 50ppmの標準液を10回測定し、その
時の出力の変化を１回目の出力値と比較した。

【００５１】結果を表４に示す。

【００５２】

【表４】

【００５３】表４から、ホウ酸及びソルビン酸カリウム
が優れていることがわかる。 (2) 洗浄液、緩衝液、標準液にホウ酸を添加して、食品
工場放流水を毎日測定し、測定しないときは実験例３の
条件にて活性を保持させた場合の微生物膜表面の雑菌
フロックの有無を目視により調べた。結果を表５に示
す。

【００５４】

【表５】

【００５５】* 1.0％ホウ酸添加の場合、測定は可能だ
が、微生物膜が影響を受け、実験例２のような微生物膜
の活性化に24時間以上の時間を要した。 表４から、ホウ酸濃度は 0.3〜0.5 ％とするのが好まし
いことがわかる。 (3) ＢＯＤ 50ppm標準液を表５に示す条件で10日間、30
℃で放置した場合の生菌数を測定した。pHは塩酸にて2.
0 に調整した。

【００５６】結果を表６に示す。

【００５７】

【表６】

【００５８】（実施例１）ＢＯＤ₅ （公定法) と本方法
（微生物膜法) との相関性 条件：微生物膜は実験例１の方法で調製した。 保存膜の活性化は実験例２の方法を用いた。 洗浄液、緩衝液、標準液はホウ酸 0.3％添加になるよ
う調製し塩酸にてpH2.0 とした。 活性保持は実験例３の条件の方法を用いた。 方法：検水は食品工場放流水を１日１回サンプリング
し、５日間の公定法と微生物膜を用いたセンサー法で測
定し、両者の相関を求めた。 その結果、公定法とセンサー法との相関は 0.9以上の高
い値を示し、本発明方法は公定法と高い相関性があるこ
とがわかった（図５）。

【００５９】（実施例２）本発明方法による連続測定 実施例１と同様の条件で連続測定を行い、公定法との相
関性を調べるとともに、微生物膜の活性の保持時間を調
べた。その結果、連続使用においても公定法との相関は
高く、また微生物膜も、３カ月は使用可能であった（図
６）。

【００６０】以上のことから、本発明によれば、ＢＯＤ
を測定するために公定法のように５日間を必要とせず迅
速にかつ容易に日々の排水中のＢＯＤの管理ができるこ
とがわかる。

【００６１】

【発明の効果】本願第１の発明によれば、短時間で精度
の高い測定が可能となる。本願第２の発明によれば、微
生物膜の活性化に要する時間を短縮できる。本願第３の
発明によれば、より少量の供給液で微生物膜の活性を長
期に保たせることが可能となる。本願第４の発明によれ
ば、微生物膜に使用している微生物に極力影響を与える
ことなく、測定に使用する溶液の防腐が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のＢＯＤの測定装置の経路を示す図であ
る。

【図２】排水部を付けた場合と付けない場合の酸素電極
の出力の変化を示す図である。

【図３】栄養液による乾燥微生物膜の活性化を示す図で
ある。

【図４】断続的供液のタイムコースを示す図である。

【図５】公定法と微生物膜を用いたセンサー法との相関
を示す図である。

【図６】公定法と微生物膜を用いたセンサー法による連
続測定の結果を示す図である。

【符号の説明】

１，２，３，４，５ 切り換えバルブ ６ 酸素電極 ７ フローセル ８ 微生物膜 ＡＰ エアーポンプ Ｐ 液送ポンプ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/18 １０５ 9015−2Ｊ (72)発明者 奥村 一 愛知県半田市岩滑東町５−66−14 (72)発明者 川村 吉也 愛知県江南市古知野町古渡132

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 微生物を固定化した微生物膜と酸素電極
   を組み合わせたＢＯＤの測定装置において、微生物電極
   を装着したフローセルの入口部に接続されている液導入
   路に排水部を具備したＢＯＤの測定装置。
2. 【請求項２】 微生物を固定化した微生物膜と酸素電極
   を組み合わせたＢＯＤの測定方法に使用する微生物膜の
   活性化方法において、使用する前の微生物膜に栄養源を
   供給した後、該微生物膜を洗浄し測定状態にすることを
   特徴とする微生物膜の活性化方法。
3. 【請求項３】 微生物を固定化した微生物膜と酸素電極
   を組み合わせたＢＯＤの測定方法において、長時間該微
   生物膜を使用しない時に、洗浄液又は基質溶液を該微生
   物膜に断続的に給液することを特徴とするＢＯＤの測定
   方法。
4. 【請求項４】 微生物を固定化した微生物膜と酸素電極
   を組み合わせたＢＯＤの測定方法において、ＢＯＤの測
   定に使用する溶液にホウ酸もしくはソルビン酸又はこれ
   らの塩を含有させることを特徴とするＢＯＤの測定方
   法。