JP3396786B2 - 脱窒細菌の培養方法、固定化脱窒細菌およびこれを用いる脱窒方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は脱窒細菌の培養方法、固
定化脱窒細菌およびこれを用いる脱窒方法に関し、より
詳しくは人工的な魚飼育などにおける水質浄化システム
への浄化微生物として適用できる脱窒細菌に関するもの
である。

【０００２】

【従来の技術】電気を有効に利用し、高度な飼育環境調
節を行う循環濾過養魚システムの開発が現在ヒラメなど
を対象として進められている。飼育適水温調節等のため
に飼育水を循環再利用するこのシステムでは、魚の排泄
物が飼育水中に蓄積し、水質悪化を引き起こすため、そ
の浄化は非常に重要となる。魚の主な排泄物であるアン
モニアが生物酸化されることによって生成される硝酸
は、高濃度では魚の生育を阻害し、また飼育水を酸性化
させる等の悪影響を及ぼすことから、飼育水を長期に利
用するためには、この硝酸を還元し、ガス状窒素として
除去する脱窒を行う必要がある。

【０００３】脱窒のためには脱窒細菌と呼ばれる浄化微
生物を用いる方法が物理化学的方法に比べ実際的である
ことが知られている。脱窒細菌は土壌や海洋など自然界
に広く生息し、硝酸や亜硝酸を還元してガス状窒素にし
て放出する細菌であり、その見かけ上の代謝経路に応じ
て以下の３つの型： Ａ型 ＮＯ₂ ^- → Ｎ₂ Ｂ型 ＮＯ₃ ^- → ＮＯ₂ ^- →Ｎ₂ Ｃ型 ＮＯ₃ ^- → Ｎ₂ に類別されることが知られている。本発明者はＣ型が魚
毒性のある亜硝酸を放出せず、魚の飼育における脱窒に
最も有用であると考え、そのような代謝経路をもち、か
つ高い脱窒活性を示す海洋性脱窒細菌を分離し、そして
濾材の表面に該細菌を付着させて浄化を行う生物膜法に
よる飼育水中からの硝酸の除去に関して検討を行い、有
効な濾材を選択し、ある程度の脱窒効果を確認した。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記生
物膜法による脱窒では、効率のよい脱窒作用を得るため
に、培養した細菌を、事前に脱窒槽内の濾材に高密度で
接種する必要のあることが明らかとなった。このため、
実験室レベルでの脱窒への前記脱窒細菌の適用の場合に
問題となることはないが、この生物膜法を工業レベルで
適用しようとする際に、上記の人工的に接種する脱窒細
菌を確保し、安定に供給する必要があるが、この脱窒細
菌を大量かつ高密度に培養する方法は今まで見出されて
いない。また、生物膜法による脱窒効果は高いものがあ
るが、しかしその能力には限界があり、しかもより長期
にわたる使用の場合、脱窒作用が不安定になるおそれが
ある等の問題がある。本発明は上記問題点を解決するた
めになされたものであり、海洋性脱窒細菌を大量かつ高
密度に培養し得る方法ならびに該脱窒細菌の固定化およ
びその固定化細菌を流動床方式で利用する脱窒方法を提
供することを課題とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者は、見かけ上の
代謝経路がＮＯ₃ ^- → Ｎ₂ である有用海洋性脱窒細菌
について最適生育条件等の種々の研究を行い、このよう
な海洋性脱窒細菌についてこれまで報告されたことのな
かった高密度および大量培養方法を見出し、さらに前記
脱窒細菌を固定化して脱窒を行うことにより、生物膜法
に比べ、より効率よく脱窒が行われ得ることを見出し、
さらに鋭意検討を重ね、本発明を完成させた。

【０００６】すなわち、本発明は、ｐＨ６〜８、温度３
５℃、培養培地塩分濃度０．８５〜３．４％の最適生育
条件を有し、硝酸から直接ガス状窒素へ還元する見かけ
上の代謝経路をもつアルカリゲネス属(Alcaligenes) の
海洋性脱窒細菌を塩分濃度０．８５〜３．４％の培養培
地中、該培地のｐＨを６〜８、温度を３２〜３８℃に維
持して培養液の６１０ｎｍでの吸光度が２以上となるま
で培養することからなる脱窒細菌の培養方法に関する。

【０００７】本発明のアルカリゲネス属の海洋性脱窒細
菌は、硝酸の還元で生成する亜硝酸を菌体外へ放出せず
に速やかにガス状窒素へ還元する次式：ＮＯ₃ ^- → Ｎ
₂ の見かけ上の代謝経路をもつものである。このような
脱窒細菌は各地海浜の海砂や底泥、魚類飼育装置の濾過
槽の濾過砂等を試料とし、硝酸集積培養分離法により分
離・純化され、脱窒活性が確認され、さらに脱窒型の判
別および属レベルでの分類がなされたものである。な
お、脱窒細菌は通性嫌気性であり、好気的にも生育し得
るので、上記分離培養は好気的条件下で行い、脱窒活性
はガス発生および培地ｐＨの上昇により確認した。ま
た、脱窒型の判別は培養後の培地中の無機窒素三態（Ｎ
Ｏ₃ ^- ，ＮＯ₂ ^- ，ＮＨ₄ ⁺ ）の量的変化により、属レ
ベルでの分類はグラム染色、鞭毛観察、糖発酵性試験等
により行った。

【０００８】本発明において、脱窒能力の高さや脱窒活
性の制御のしやすさ、さらに形質が安定である等の点か
ら好ましい海洋性脱窒細菌は、宮城県蒲生干潟の砂泥か
ら分離・純化されたアルカリゲネス属Ｇ−Ａ−２−１株
と命名される１株と、千葉県我孫子市に所在する財団法
人電力中央研究所・我孫子研究所の魚飼育水濾過槽の濾
過砂から分離・純化されたアルカリゲネス属Ａｂ−Ａ−
１株およびアルカリゲネス属Ａｂ−Ａ−２株と命名され
る２株である。これら３株の中で、脱窒活性の高さや培
養条件の広さ等の点からアルカリゲネス属Ａｂ−Ａ−１
株が特に好ましい。また、これらの脱窒細菌は平成５年
９月１３日に工業技術院生物工学工業技術研究所に寄託
され、それぞれ以下の受託番号を有する。 アルカリゲネス属菌株 受託番号 Ｇ−Ａ−２−１ ＦＥＲＭ Ｐ−１３８６１ Ａｂ−Ａ−１ ＦＥＲＭ Ｐ−１３８６２ Ａｂ−Ａ−２ ＦＥＲＭ Ｐ−１３８６０ これら菌株の分離等については渡部ら：電力中央研究所
・研究報告Ｕ８９０３５（１９８９）にさらに詳細に記
載されている。

【０００９】本発明のアルカリゲネス属に属する海洋性
脱窒細菌の最適生育条件は、培地ｐＨ、温度および塩分
濃度の各条件下における比増殖速度を比較することによ
り、ｐＨ６〜８、温度３５℃、塩分濃度０．８５〜３．
４％であることが見出された。また、上記最適生育条件
に維持して脱窒細菌を培養することにより、培養液の吸
光度（波長＝６１０ｎｍ，濁度）が２〜６程度まで該細
菌を高密度に培養することができ、しかも前記培養方法
は大量培養にも適用し得るものだった。なお、温度は３
２〜３８℃の範囲で高い増殖速度が得られることも確認
した。そこで、上記の海洋性脱窒細菌を塩分濃度０．８
５〜３．４％の培養培地中、該培地のｐＨを６〜８、温
度を３２〜３８℃に維持して培養することにより、本発
明の脱窒細菌を高密度で大量に培養することが可能とな
った。本発明の脱窒細菌の高密度および大量培養によ
り、生物膜法、すなわち濾材の表面に細菌を高密度で付
着させて水質浄化を行う方法に対して工業レベルで本発
明の脱窒細菌を適用することができる。ここで、濾材に
は例えば砂濾材（直径３〜６ｍｍ前後のもの等）、繊維
状濾材（極細の化学繊維を輪状に編んで紐としたもの
等）または板状濾材（ハニカム状プラスチックチューブ
等）等が用いられるが、菌体付着後の脱窒活性の高さの
点で砂濾材および繊維状濾材が好ましく、扱いやすさで
は繊維状濾材が特に好ましい。

【００１０】また、本発明は、ｐＨ６〜８、温度３５
℃、培養培地塩分濃度０．８５〜３．４％の最適生育条
件を有し、硝酸から直接ガス状窒素へ還元する見かけ上
の代謝経路をもつアルカリゲネス属の海洋性脱窒細菌を
固定化してなる固定化脱窒細菌に関する。本発明におい
て菌体の固定化は、慣用の方法に従って、天然もしくは
合成高分子ゲルの微細な粒子中に菌体を包み込むか、ま
たは半透膜性の膜により菌体を被覆することによる、い
わゆる包括固定化により行われのが好ましい。高分子ゲ
ルとしては、例えばポリビニルアルコール（ＰＶＡ）ゲ
ル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ゲル、ポリアク
リルアミドゲル、２−ヒドロキシメチルアクリルアミド
ゲル、シリカゲル、アルギン酸、ウレタン樹脂等を挙げ
ることができ、半透膜性の膜としてはセルロースまたは
その誘導体等を挙げることができる。また、本発明にお
ける菌体の固定化は、酵素の固定化の際に行われる担体
結合法や架橋法により行われてもよい。なお、海洋性魚
類の水質浄化への適用の場合、海水の塩濃度に対する耐
性等の点からＰＶＡゲルまたはＰＥＧゲルでの固定化が
好ましい。

【００１１】さらに、本発明は、上記固定化脱窒細菌を
嫌気的流動床にて流入水と接触させることからなる脱窒
方法を提供する。この脱窒方法において、前記流入水の
糖濃度を炭素換算濃度１２０〜３６０ｍｇ−Ｃ／ｌ、滞
留時間を１２〜３６時間として処理を行うことが好まし
い。本発明の脱窒方法の特に好ましい態様において、前
記流入水の糖濃度は炭素換算濃度で２４０ｍｇ−Ｃ／ｌ
であり、滞留時間は２４時間である。なお、本明細書に
おいて「滞留時間」とは水理学的滞留時間を意味し、あ
る系に含まれる流入水が１回置き換わる時間である。ま
た、本発明の脱窒方法は、前記流入水が循環濾過養魚シ
ステムにおける飼育水である、循環濾過養魚システムに
適用するのが効果的である。

【００１２】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明はこれのみに限定されるものではな
い。 Ｉ．有用海洋性脱窒細菌の選抜 Ａ．海洋底泥中の一般細菌数と脱窒細菌数の測定 試料として愛知県渥美湾、神奈川県横須賀小和田湾、宮
城県仙台湾南蒲生および仙台湾蒲生の海砂や底泥および
千葉県我孫子市に所在する財団法人電力中央研究所・我
孫子研究所の魚飼育水濾過槽の濾過砂の５検体を用い
た。一般海洋性細菌数については１／１０濃度ＺｏＢｅ
ｌｌ ２２１６Ｅ寒天培地および１／１０濃度ＯＲＩ寒
天培地を用いた希釈平板法で、また脱窒細菌数について
は海水を添加した硝酸添加肉エキス寒天培地（以下、肉
エキス培地と略す）および３％ＮａＣｌを添加したＧｉ
ｌｔａｙ培地（以下、Ｇｉｌｔａｙ培地と略す）を用い
た最確値法（Most Probable Number法，以下ＭＰＮ法と
略す）で算出した。いずれも培養は２５℃で１４日間と
した。用いた培地の種類と組成は表１に示した。

【表１】

【００１３】脱窒菌数の測定では、Ｇｉｌｔａｙ培地に
おける脱窒菌数の測定については、ガス発生（培地中に
入れたダラム管へのガス蓄積）かつ培地ｐＨの上昇（培
地の青色化）をもって脱窒陽性とし、肉エキス培地にお
いてはガス発生をもって脱窒陽性とした。なお、最確値
数をもって菌数に換算した。供試試料中の海洋性一般細
菌数を表２に、そして脱窒菌数を表３にまとめて示し
た。

【表２】

【表３】 このように、試料中の海洋性一般細菌の密度は、通常の
海浜における密度とほぼ同様な１０⁴ 〜１０⁷ ／ｇ生試
料のレベルであった（表２）。一方、脱窒細菌の密度は
１０¹ 〜１０² ／ｇ生試料のレベルであり、一般細菌数
に比較するとごく低い割合のため（表３）、分離には集
積培養が必要と判断された。

【００１４】Ｂ．海洋性脱窒細菌の分離とその脱窒型 海洋性脱窒細菌の分離は以下の２つの方法を用いて行っ
た。まず、ＭＰＮ法に用いた培養後の液体培地の一定量
を、Ｇｉｌｔａｙ寒天培地および肉エキス寒天培地に塗
布し脱窒細菌を分離した〔Watahiki等, Agric. Biol. B
iochem. 47, 1991-1996 (1983)参照〕。なお、脱窒細菌
は通性嫌気性であり、好気的にも生育し得るので、上記
分離培養は好気的条件下で行った。生育してきたコロニ
ーは任意に分離・純化した後、各分離株はＧｉｌｔａｙ
培地で嫌気培養し、脱窒活性はガス発生および培地ｐＨ
の上昇により確認した。この一連の分離操作を分離方法
Ｉとした。この分離方法は酸素に代わる酸化剤（最終電
子受容体）として硝酸を添加して脱窒細菌を集積する硝
酸集積培養分離法である。一方、最終電子受容体として
亜硝酸を添加して集積培養を行い、その集積培養液から
脱窒細菌を分離する、以下に示す一連の分離操作を分離
方法ＩＩとした。分離方法Ｉで用いた分離試料を採取し
た地点から、同様に採取した生試料１ｇをネジ口試験管
中の２０ｍｌ容の亜硝酸添加１／１０濃度ＺｏＢｅｌｌ
２２１６Ｅ液体培地に加え、嫌気グローブボックス
〔内部気相Ｎ₂ ：Ｈ₂ ：ＣＯ₂ ＝１７：２：１，酸素濃
度０．１％（ｖ／ｖ）以下〕中で嫌気培養した。なお、
亜硝酸の濃度は１００ｐｐｍ−Ｎとし、ＫＮＯ₂ の形で
添加した。２週間毎に同組成の培地に植え継ぎ、８週間
後に嫌気的好条件下で一定量の培養液を寒天平板培地に
塗布し細菌を分離した。分離菌株は１００ｐｐｍ−Ｎ相
当量の硝酸もしくは亜硝酸を添加した１／１０濃度Ｚｏ
Ｂｅｌｌ ２２１６Ｅ液体培地（各２０ｍｌ／試験管）
を用いて２２±２℃で１週間嫌気培養し、培養後の培地
中の無機窒素三態（ＮＯ₃ ^- ，ＮＯ₂ ^- ，ＮＨ₄ ⁺ ）の
量的変化から、脱窒活性の有無の確認と、硝酸および亜
硝酸からの脱窒の様式（以下、脱窒型とする）を判断し
た。分離方法Ｉで分離した脱窒菌も同様に脱窒型の判断
を行った。なお、培地中無機窒素三態の測定は菊地ら：
電力中央研究所・研究報告Ｕ８７０２５（１９８７）に
記載の方法に従った。

【００１５】分離方法Ｉで分離できた菌株は２３５菌株
であり、そのうち脱窒活性を示したのは８１菌株で、分
離菌株数に占める脱窒菌株数の割合は３４％であった。
一方、分離方法ＩＩでは１４５菌株を分離し、その脱窒
活性を調べた結果、１２１菌株が脱窒活性を示し、分離
菌株数に占める脱窒菌株数の割合は８３％であり、分離
方法Ｉより高い割合であった。

【００１６】次に脱窒型の判断結果について説明する。
嫌気培養後の培地中の無機窒素三態の量的変化の測定に
より得られた結果のうち典型的なものを図１に示した。
なお、以下に示す菌株の名称は表５の脚注にも示したと
おり、Ａｔの表示のあるものは渥美湾の試料由来のもの
であり、以下同様に、Ｙは横須賀小和田湾の試料由来、
Ｇは仙台湾の試料由来、そしてＡｂは我孫子の電力中央
研究所の試料由来であることを意味する。菌株Ａｔ−８
−Ｒ−２は硝酸添加培地中で亜硝酸を生成しているが、
無機窒素の総量は変わらず、また、亜硝酸添加培地中の
亜硝酸の量も変化していない。このことから、この菌株
は、硝酸は還元するが脱窒はしない硝酸呼吸型（ＮＯ₃
^- → ＮＯ₂ ^- ）であると判断された。菌株Ａｔ−８−
Ｒ−１は硝酸添加および亜硝酸添加培地で無機窒素量が
減少しているので脱窒細菌であるが、硝酸添加培地では
亜硝酸が検出されており、見かけ上、硝酸は亜硝酸を経
てガス状窒素へ還元されている。菌株Ａｔ−Ｂ−４は硝
酸添加および亜硝酸添加培地で無機窒素量が減少してい
るので脱窒細菌であるが、硝酸添加培地ではＡｔ−８−
Ｒ−１菌株と異なり亜硝酸が検出されない。このことは
硝酸の還元で生成した亜硝酸は速やかにガス状窒素へ還
元されていることを示す。Ｇ−２−Ｒ−１菌株は亜硝酸
添加培地でのみ無機窒素量が減少しており、亜硝酸のみ
から脱窒できる菌株であると判断される。従って、脱窒
細菌は上記したようにその見かけ上の代謝経路に応じ、 Ａ型 ＮＯ₂ ^- → Ｎ₂ Ｂ型 ＮＯ₃ ^- → ＮＯ₂ ^- →Ｎ₂ Ｃ型 ＮＯ₃ ^- → Ｎ₂ の脱窒型に分類できる。亜硝酸は魚類に有害であり、ま
た飼育水に蓄積してくるのは硝酸が多いことから、循環
濾過方式の水質浄化システムへの適用を考慮するとＣ型
の脱窒細菌が有用であると考えられる。上の実験で脱窒
陽性と判断された菌株の脱窒型の判別結果を表４にまと
めて示す。

【表４】 Ｃ型脱窒細菌は、分離方法Ｉでは分離脱窒菌株の２０％
（８菌株）であり、分離方法ＩＩでは分離菌株の２３％
（２８菌株）であった。このことは、Ｃ型脱窒細菌は自
然界の脱窒菌の中では、少ないことを示唆するものであ
る。

【００１７】Ｃ．分離脱窒菌の分類 脱窒型から有用と考えられる分離菌株について、継代培
養しても活性が安定か否かを追試して菌株の安定性を確
認し、安定であった分離菌株について清水の方法〔「海
洋微生物実験法」門田・多賀編，学会出版センター，２
２８−２３３頁（１９８５年）〕に従い、グラム染色、
鞭毛観察、糖発酵性試験（ＯＦテスト）等を行い、属レ
ベルでの分類を行った。

【００１８】結果を表５にまとめて示す。

【表５】 分離方法Ｉで分離されたＣ型脱窒細菌（菌株名にＡの表
示あり）は８菌株中７菌株がアルカリゲネス属であり、
分離方法ＩＩで分離されたＣ型脱窒細菌（菌株名にＢの
表示あり）は８菌株ともにシュードモナス属(Pseudomon
as) であった。

【００１９】Ｄ．アセチレン阻害法を用いた脱窒活性の
測定 上記有用脱窒細菌の脱窒細菌をO'hara等, J. Gen. Micr
obiol., 129, 2405-2412 (1983) に記載の方法に準じ
て、アセチレン阻害法を用いて測定した。アセチレン阻
害法はアセチレンが脱窒過程（ＮＯ₃ ^- → ＮＯ
₂ ^- （ＮＯ）→Ｎ₂ Ｏ→Ｎ₂ ）の中で、Ｎ₂ ＯのＮ₂ へ
の還元を阻害するという性質を利用したもので、本来Ｎ
₂ およびＮ₂ Ｏとして発生すべき量をＮ₂ Ｏとして測定
し、脱窒活性を算出する方法である。

【００２０】脱窒活性の測定は以下のように行った。供
試菌株を、硝酸添加ＺｏＢｅｌｌ２２１６Ｅ寒天培地の
入った広口フラスコを用いて２４±１℃の嫌気グローブ
ボックス中で５日間嫌気培養した。培地に添加した硝酸
量は１００ｐｐｍ−Ｎ相当量であり、ＫＮＯ₃ の形で添
加した。寒天培地表面に生育した菌体をフラスコ中に注
いだ滅菌濾過海水に懸濁した後、遠心分離し上澄み液を
捨て、ペレット状の菌体をもう一度滅菌濾過海水に懸濁
し遠心分離をすることで菌体を洗浄した。菌体は最終的
に濾過海水に懸濁し、測定の試料とした。菌体懸濁液１
ｍｌを１２．８ｍｌ容の試験管に入れ、１８０ｍＭ濃度
のグルコース溶液１ｍｌおよび１８ｍＭ濃度のＫＮＯ₃
溶液１ｍｌを加えてゴム栓をし、直ちにガスタイトシリ
ンジを用いて内部気相（９．８ｍｌ）の１０％量のアセ
チレンを添加した。以上の操作は全て嫌気的条件下で行
った。アセチレン添加時を、脱窒活性測定開始時とし、
２５℃で一定時間培養後、生成したＮ₂ ＯをＰＩＤ型ガ
スクロマトグラフ装置（日立製作所製ＧＣ３０００ＰＩ
Ｄ）を用いて測定した。なお、反応液中のグルコース濃
度は６０ｍＭ、ＫＮＯ₃ 濃度は６ｍＭ（８４ｐｐｍ−
Ｎ）である。菌体懸濁液は、超音波処理で菌体を破砕し
た後、タンパク質含量の測定に供した。タンパク質含量
は、バイオラッド社のプロテインアッセイキットを用
い、アルブミンを標準として測定した。そして脱窒活性
はタンパク質単位重量の生成Ｎ₂ Ｏで表示した。

【００２１】まずアルカリゲネスＡｂ−Ａ−１株につい
てＮ₂ Ｏの生成を測定したところ、図２に示したように
測定開始後３時間まで直線的に増加した。この結果を踏
まえ、他の供試菌株は測定開始後１時間で生成したＮ₂
Ｏを測定し脱窒活性とした。結果を表６に示した。

【表６】 このように、各菌株の脱窒活性は１３１〜４３３０ｎｍ
ｏｌＮ₂ Ｏ／時間／ｍｇタンパク質であり、菌株により
異なった。しかし、平均的な脱窒活性はSmith等, Soil
Sci. Soc. Am. J. 50，349-353 (1986)に報告されてい
る土壌から分離した代表的な脱窒細菌シュードモナス・
フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescence)の脱窒活
性（１３５０ｎｍｏｌＮ₂ Ｏ／時間／ｍｇタンパク質）
に比肩し得るものだった。

【００２２】Ｅ．脱窒活性と有機物の種類との関係 上記有用海洋性脱窒細菌１６菌株について、さらに脱窒
活性と有機物の種類との関係を調べた。有機物としてグ
ルコース、サッカロース、ペプトン、グルタミン酸およ
びメタノールを用いた。ペプトンはＤｉｆｃｏ製のもの
を用い、その他は和光純薬株式会社製のものを用いた。
脱窒に必要な有機物量の理論値はグルコースを用いた場
合は１ｍｇ−Ｎ ＮＯ₃ を脱窒するのに１．０７ｍｇ−
Ｃが必要であることから、ここでは有機物濃度を１２０
ｍｇ−Ｃ、硝酸イオン濃度を１００ｍｇ−Ｎ／ｌとし
た。なお、脱窒活性は前項と同様にアセチレン阻害法に
よって測定した。

【００２３】結果を図３に示したが、有機物と脱窒活性
の関係は菌株により異なることがわかる。なお、供試し
た１６菌株の脱窒活性の平均値をとると、グルコースの
場合６８０±４２９ｎｍｏｌＮ₂ Ｏ／時間／ｍｇタンパ
ク質であった。また、グルコースにおける脱窒速度を１
００とした場合、サッカロース１０７、ペプトン１４
５、グルタミン酸１１４、メタノール８７．８であっ
た。このように、添加有機物としてはペプトンやグルタ
ミン酸が高い活性を示す傾向にあったが、これら有機物
は２０％強の有機窒素を含んでいるので、該有機窒素が
無機化してアンモニアとして放出されることを考える
と、純脱窒活性は総脱窒活性の８割相当量になる。これ
を考慮すると、グルコースおよびサッカロースにおける
脱窒活性はペプトンに匹敵するレベルになる。また、グ
ルコースおよびサッカロースはペプトンやグルタミン酸
より安価であり、高濃度の水溶液での室温保存が可能で
ある等取扱いが容易である。以上のことから、脱窒のエ
ネルギー源として添加する有機物の種類としてはグルコ
ースおよびサッカロースが適当であると判断される。さ
らに、供試菌株を有機物に対する利用性の範囲の広さと
活性の高さの点から比較すると、アルカリゲネス属に属
するＧ−Ａ−２−１株、Ｇ−Ａ−２−２株、Ａｂ−Ａ−
１株およびＡｂ−Ａ−２株が特に有効な菌株であると判
断される。ただし、Ｇ−Ａ−２−２株は培養が他の３株
と比べ困難であるので、実際の適用は難しいと予想され
る。

【００２４】Ｆ．脱窒活性と溶存酸素濃度（ＤＯ）関係 前項で特に有効と判断されたアルカリゲネス属に属する
３株Ｇ−Ａ−２−１株、Ａｂ−Ａ−１株およびＡｂ−Ａ
−２株について脱窒活性とＤＯとの関係を調べた。この
場合、アセチレン阻害法による脱窒活性の測定ができな
いので、培養実験によって行った。実験には、２５℃に
保温した恒温培養槽５つを用い、ＤＯは０，７，１５，
３０ならびに６０％酸素飽和度とした。培養溶液ＤＯの
調節はエアレーションと窒素ガスによって行い、培養期
間のＤＯの変動範囲は設定値の±１０％程度であった。
例えば設定値が３０％酸素飽和度の場合、実際のＤＯの
変動範囲は２７〜３３％酸素飽和度であった。培養液の
攪拌はスクリュー型攪拌羽を用い７０ｒｐｍで行った。
脱窒活性は各培養槽中の培養液（硝酸イオン濃度１００
ｐｐｍ−Ｎならびにグルコース３００ｐｐｍを添加した
滅菌濾過海水２ｌ）に嫌気的に生育させた菌体を接種し
た後、２４時間培養後の培養液中の無機態窒素の減少量
を測定することから算出した。また、同時に、培養液中
の有機態炭素濃度（ＴＯＣ）を全有機炭素分析計（島津
製作所製ＴＯＣ−５００型）により測定し、有機物分解
速度を算出した。なお、本実験による接種菌体量はＧ−
Ａ−２−１株で１１．１μｇ菌体タンパク質／ｍｌ培養
液、Ａｂ−Ａ−１株で５．２μｇ菌体タンパク質／ｍｌ
培養液、そしてＡｂ−Ａ−２株で１９．６μｇ菌体タン
パク質／ｍｌ培養液であった。

【００２５】結果を図４を示すが、ここでの脱窒活性は
０％酸素飽和度における脱窒速度に対する比活性を意味
し、有機物分解速度についても併記した。いずれの菌株
ともに脱窒活性はＤＯの増加とともに減少したが、菌株
によってその度合いは異なっていた。また、有機物分解
の比活性（ＴＯＣ減少量）はどのＤＯでも１００％以上
であり、有機物分解は迅速に行われていることがわかっ
た。本実験で得られた２４時間後の窒素減少量から算出
した比活性から０％ＤＯにおける脱窒活性の５０％脱窒
活性を示すＤＯ値を推定すると、Ｇ−Ａ−２−１株で７
％ＤＯ、Ａｂ−Ａ−１株で３０〜６０％ＤＯ、そしてＡ
ｂ−Ａ−２株で１５％ＤＯであった。この結果から、ア
ルカリゲネス属Ａｂ−Ａ−１株を用いた場合、ＤＯが比
較的高い条件でも脱窒可能であるといえる。このよう
に、高い脱窒活性を得るためにはＤＯを低める方が良
い。しかし、ＤＯが比較的高い条件でも脱窒できれば、
魚類等の飼育水の循環利用の観点から利点は多い。従っ
て、上記アルカリゲネス属Ａｂ−Ａ−１株は特に好まし
い菌種であるといえる。

【００２６】ＩＩ．海洋性脱窒細菌の大量・高密度培養 次に上で脱窒活性の高さ等の点で特に好ましいとされた
アルカリゲネス属に属する３株Ｇ−Ａ−２−１株、Ａｂ
−Ａ−１株およびＡｂ−Ａ−２株を用いてそれらの大量
培養を可能にする条件の探索のために、それらの生育最
適条件、有機物条件およびそれらの結果をふまえて大量
培養方法を検討した。 Ａ．最適生育条件の検討 まず、上記のアルカリゲネス属の３株について、基本培
地としてＺｏＢｅｌｌ２２１６Ｅ液体培地を用い、培地
のｐＨ、海水濃度、温度条件のいずれか１つのみを変化
させ、その際の各条件下における比増殖速度（μ）を測
定することにより、それぞれの最適条件を明らかにし
た。最適培地ｐＨの探索の場合、培地ｐＨは５、６、
７、８、９および１０の６段階に変化させ、その他の条
件は海水濃度を１００％、そして温度を３０℃に一定と
した。また最適海水濃度は、海水濃度は１００、７５、
５０、２５および０％の５段階に変化させ、それ以外の
条件は一定とした（ｐＨ：７．８，温度３０℃）。そし
て最適温度の探索の場合、２０、２５、３０、３５およ
び４０℃の５段階に温度を変化させ、ｐＨは７．８、海
水濃度は１００％に一定とした。比増殖速度は以下のよ
うに算出した。試験管（１８ｍｍφ×１８ｃｍ）に１０
ｍｌの培地を入れ、各条件に設定した後、オートクレー
ブ滅菌した。ｐＨの調整は１規定の塩酸もしくは水酸化
ナトリウム溶液を培地に添加することで、また、海水濃
度の調整は蒸留水を添加することでオートクレーブ滅菌
前に調整した。調整した培養液の入った試験管に、予め
各菌株を接種したのち３日間３０℃で震盪培養したＺｏ
Ｂｅｌｌ ２２１６Ｅ培養液０．３ｍｌを接種し、往復
震盪培養機によって各設定条件下において震盪培養し
た。培養のための試験管は多数準備し、測定試料は経時
的に採取した。脱窒細菌の生育は培養液の濁度（Ｏ．
Ｄ．６１０ｎｍ）を測定することによって求め、濁度の
経時的な変化から増殖曲線を描き、その増殖曲線から、
細菌が１時間当り何倍になるかを示す比増殖速度を算出
した。

【００２７】海洋性脱窒細菌３株の増殖におよぼすｐ
Ｈ、海水濃度および温度の影響を、それぞれ図５、６お
よび７に示した。 （１）ｐＨ（図５参照） 供試したアルカリゲネス属の３株について、その至適ｐ
Ｈは３株ともに７であった。ｐＨが６から８では、いず
れの株もその比増殖速度はｐＨ７の場合と比較して大き
くは変わらなかった。ｐＨ５、９および１０では、比増
殖速度は低下する傾向がみられたがその程度は菌株によ
って異なっていた。すなわち、Ｇ−Ａ−２−１株とＡｂ
−Ａ−２株では、最も低い比増殖速度を示したｐＨ１０
の場合では、ｐＨ７に比較して比増殖速度は２０％前後
低下したが、Ａｂ−Ａ−１株では、ｐＨ１０の場合、約
４０％低下と顕著であった。ｐＨ５では、Ｇ−Ａ−２−
１株が他の２株に比較して低下の割合が高かったが、ｐ
Ｈ７の場合と比較して１０％の低下であった。

【００２８】（２）海水濃度（図６参照） 脱窒細菌の増殖に与える海水濃度の影響については、以
下の結果が得られた。いずれの株においても、０％濃度
（実際の海水濃度は接種源からの塩が入るので約３％海
水濃度）では、他の濃度に比較して著しく比増殖速度が
低下した。その他の濃度、すなわち２５％から１００％
の間では、株によって若干の違いはあるものの、ほぼ同
レベルの比増殖速度を示した。海水濃度が２５％から１
００％間の比増殖速度の違いは以下のようであった。Ｇ
−Ａ−２−１株では、２５％から１００％の間でほぼ等
しい比増殖速度を示した。Ａｂ−Ａ−２株では、２５な
らびに５０％が比増殖速度が最も高く、それ以上の濃度
では比増殖速度がわずかに低下した。Ａｂ−Ａ−１株の
場合は、５０％で最も比増殖速度が高く、２５％ならび
に７５％および１００％ではわずかに低下した。これ
ら、２５から１００％の海水濃度範囲では、比増殖速度
の違いは、最も大きいＡｂ−Ａ−１株でも最大１６％
（濃度が５０％と１００％の場合）であった。一般に海
洋性細菌は、その至適塩濃度が０．３〜０．５Ｍ（海水
の塩濃度は約０．５Ｍ）にある低度好塩性細菌であると
されるが、以上の結果から、本供試３菌株も、その特徴
を有していることが明かとなった。

【００２９】（３）温度（図７参照） 脱窒細菌の増殖に与える温度の影響については、以下の
結果が得られた。Ａｂ−Ａ−１株とＡｂ−Ａ−２株で
は、培養温度が２０℃から３５℃までは、温度の上昇に
伴って比増殖速度も直線的に高まり、４０℃では若干低
下した。一方、Ｇ−Ａ−２−１株では、３５℃で最も比
増殖速度が高かったが、それは３０℃における値とほぼ
同等であり、２０℃および４０℃では著しく低かった。
これら３株は、至適温度が３５℃にあり、中温性細菌で
あることが示された。以上の検討結果から、供試した３
株の生育に最適な条件は、ｐＨ；６から８、海水濃度；
２５％〜１００％（すなわち、塩分濃度０．８５〜３．
４％）、温度；３５℃であることが明かとなった。

【００３０】Ｂ．有機物の種類および濃度が海洋性脱窒
細菌の増殖に与える影響 前項における検討結果から、各菌株について明らかとな
った生育最適条件下において、基本培地への有機物添加
の効果について検討した。基本培地として、ＺｏＢｅｌ
ｌ ２２１６Ｅ培地およびＡｎｄｅｒｓｏｎ培地（培地
１リットルあたりペプトン２．５ｇ、酵母エキス２．５
ｇ、ＦｅＰＯ₄ ０．１ｇ）のｐＨを７、海水濃度を５０
％としたものを用い（これを、それぞれＺｏＢｅｌｌ改
変培地およびＡｎｄｅｒｓｏｎ改変培地と呼ぶ）、それ
にグルコース、マンニトール、サッカロース、水溶性デ
ンプンまたはアスパラギン酸を２段階の濃度（１．０％
および０．５％）で添加した場合の比増殖速度を比較し
た。また、無機窒素源の添加の影響を調べるためＫＮＯ
₃ を加えた区を、培地有機物濃度が低い場合の影響を調
べるためにＺｏＢｅｌｌ改変培地を１／２濃度にした区
を設定した。また、培養温度は全て３５℃とした。

【００３１】結果を図８に示した。ＺｏＢｅｌｌ改変培
地を基本培地として用いた場合、以下の結果が得られ
た。Ｇ−Ａ−２−１株の場合、ＺｏＢｅｌｌ改変培地区
に比較して、１／２ＺｏＢｅｌｌ改変培地で明かに比増
殖速度が低下し、１．０％マンニトールを添加した場合
で１７％高くなったが、他の実験区では大きな差はなか
った。Ａｂ−Ａ−１株の場合、ＺｏＢｅｌｌ改変培地区
に比較して、他の実験区では大きな差はなかったが、マ
ンニトールならびにサッカロース添加区以外では、比増
殖速度が低くなる傾向が見られた。Ａｂ−Ａ−２の場合
も、ＺｏＢｅｌｌ改変培地区に比較して、他の実験区で
は大きな差はなかったが、１．０％デンプン添加区、
１．０％サッカロース添加区、１．０％グルコース添加
区で低下する傾向を示した。いずれの株の場合も、最大
の比増殖速度を示したのは、ＺｏＢｅｌｌ改変培地に、
１．０％のマンニト−ルを添加した場合であり、マンニ
トールの添加による脱窒細菌の増殖促進効果があること
が示唆された。また、Ａｎｄｅｒｓｏｎ改変培地を基本
培地として行った同様の検討では、ＺｏＢｅｌｌ改変培
地と同等か、それより劣る比増殖速度が得られた。従っ
て、供試株を大量に培養することを想定した場合、Ｚｏ
Ｂｅｌｌ ２２１６Ｅ培地を用い、かつマンニト−ルを
添加することが有効であると考えられた。各菌株におい
て最も高い比増殖速度が得られた、ＺｏＢｅｌｌ改変培
地にマンニトール１．０％を加えた培地をＺｏＢｅｌｌ
改変培地（ＩＩ）として、次の大量培養に用いた。

【００３２】Ｃ．海洋性脱窒細菌の大量培養 海洋性脱窒細菌の培養には、２リットル容三角フラスコ
および２０リットル容のジャーファーメンター（三菱油
化エンジニアリング株式会社製）を用いた。まず、三角
フラスコを用いて、脱窒細菌３株の培養を行った。２リ
ットル容三角フラスコに１リットルのＺｏＢｅｌｌ改変
培地（ＩＩ）を入れオートクレーブにより滅菌した。培
地は脱窒細菌を接種後、３０℃、１００ｒｐｍで震盪培
養した。培養液を経時的に採取し、培養液の濁度（Ｏ．
Ｄ．６１０ｎｍ）を測定した。この際、培養液の菌密度
が高い場合には、濁度が０．４以下になるように培養液
を希釈して測定し換算した。次に、ジャーファーメンタ
ーを用いて培養を行った。該ジャーファーメンターの内
容量は２０リットルであり、内部の攪拌はタービン型羽
根で行い、無菌空気の供給は培養槽の下部から行った。
なお、ジャーファーメンターの滅菌は、熱水ならびに７
０％アルコール溶液によって行った。培養槽容器の中に
滅菌した１８リットルのＺｏＢｅｌｌ改変培地（ＩＩ）
を入れ、予め前培養した培養液３００ｍｌを接種した
後、３５℃、攪拌速度１００ｒｐｍ、空気流速０．５リ
ットル空気／リットル培養液／分の条件下で培養を行っ
た。本実験条件においては、培養期間中のＤＯは飽和度
の７０％以上を維持した。培養の経過に伴う培地ｐＨの
変化は、適宜、１規定の塩酸もしくは水酸化ナトリウム
溶液により調節した。培養中に培養液の一部を採取し、
培養液の濁度（Ｏ．Ｄ．６１０ｎｍ）を測定することに
より増殖速度を評価した。

【００３３】２リットル容三角フラスコを用いて行った
脱窒細菌３株の培養の結果を図９に示した。各菌株とも
に、接種後直ちに対数増殖に入ったが、培養時間約１２
時間でＯ．Ｄ．が０．６程度の対数増殖終期に入り、７
２時間まで培養を継続しても、最終密度はＯ．Ｄ．（６
１０ｎｍ）＝１程度までしか上がらなかった。図１０
に、２０リットルのジャーファーメンターによる大量培
養の結果を示した。本実験においては、フラスコ条件と
同様に、培養開始後直ちに対数増殖に入り、フラスコ条
件における最終到達濃度である濁度１（Ｏ．Ｄ．，６１
０ｎｍ）に１２時間以内に達した。その後、Ａｂ−Ａ−
２株は増殖がゆっくりとなり定常期に入り４８時間後に
最大濁度２を示したのちに死滅期に入った。Ｇ−Ａ−２
−１株とＡｂ−Ａ−１株は１２時間以降も増殖を続け、
Ｇ−Ａ−２−１株では、３６時間目に最大濁度が５に、
Ａｂ−Ａ−１株では４８時間目に最大濁度が６に達し
た。各グラフの下側には培地ｐＨの推移を示したが、そ
のグラフ上の矢印はその時点でｐＨを調整したことを表
す。これらの最大濁度における細菌数を希釈平板法で計
数したところ、Ｇ−Ａ−２−１株で５．４×１０¹⁵細胞
／ｍｌ、Ａｂ−Ａ−１株で３．４×１０¹⁵細胞／ｍｌ、
Ａｂ−Ａ−２株で７．１×１０¹⁵細胞／ｍｌに達した。
また、最大濁度条件の培養液を遠心分離して得られた菌
体の乾物重を測定したところ、Ｇ−Ａ−２−１株で１．
８８ｇ乾物／リットル培養液、Ａｂ−Ａ−１株で２．６
ｇ乾物／リットル培養液、Ａｂ−Ａ−２株で１．３６ｇ
乾物／リットル培養液であった。最大濁度に達するまで
の期間の菌体生産効率は、Ｇ−Ａ−２−１株で５２ｍｇ
乾物／リットル培養液／時間、Ａｂ−Ａ−１株で５４ｍ
ｇ乾物／リットル培養液／時間、Ａｂ−Ａ−２株で２８
ｍｇ乾物／リットル培養液であった。以上の検討結果か
ら、３株の内ではＡｂ−Ａ−１株が、最も増殖が早く高
密度培養が可能であることが示された。また、培養の経
過とともに、培養液のｐＨが変動した。３株ともに培養
初期には培地が酸性側に傾いたが、培養の後期は培地が
アルカリ側に傾く現象が見られた。３株の中では、Ａｂ
−Ａ−１株がｐＨ変動の割合が少なかった。今まで、海
洋性脱窒細菌を大量かつ高密度に培養して利用する試み
はほとんどなされておらず、参考にすべき報告値は見あ
たらない。従って、本発明は脱窒細菌の高密度の大量培
養条件を初めて明かにしたものといえる。なお、本項で
の培養は全て好気的な条件で行ったが、脱窒細菌は好気
条件で培養しても嫌気条件に誘導すれば脱窒活性を誘導
するので、好気培養よりも難しい嫌気条件での大量培養
法は必要性が少ないと判断したためである。

【００３４】ＩＩＩ. 固定化脱窒細菌を適用した脱窒シ
ステムの効率化に関する検討 次に、脱窒細菌を包括固定化し、固定化脱窒細菌を適用
した流動床型脱窒槽を適用した脱窒法に関する検討を行
った。 Ａ．固定化脱窒細菌の脱窒活性に与える基質濃度ならび
に溶存酸素の影響に関する検討 脱窒細菌の固定化担体の作成は、植本ら：電力中央研究
所・研究報告Ｕ９００５６（１９９１）に記載の方法に
従った。供試菌株にはアルカリゲネス属Ａｂ−Ａ−１株
を用い、ＺｏＢｅｌｌ ２２１６Ｅ液体培地で培養した
後、培養液から遠心分離により菌体を回収した。包括固
定用の高分子ゲルとしてポリビニルアルコール（ＰＶ
Ａ，クラレ製クラレポバールＰＶＡ−ＨＣ）を１０％
（ｗ／ｖ）の濃度で用い、固定化した菌数濃度は８×１
０¹⁸細胞／リットルＰＶＡであった。作成した固定化脱
窒細菌は、ＺｏＢｅｌｌ ２２１６Ｅ液体培地に５００
ｍｇ−Ｎ／ｌのＫＮＯ₃ を添加した培養液で馴養した。
この馴養を十分に行い、脱窒活性の発現が認められた固
定化脱窒細菌を用い以下の検討を行った。

【００３５】固定化脱窒細菌の脱窒速度の測定には、図
１１に示す装置を用いた。容量２リットルの培養槽１は
所定量の固定化脱窒細菌２が予め充填され、そして反応
液３をその中に導入する（矢印ａ）反応液導入管４、処
理後の反応液３を排出する（矢印ｂ）反応液排出管５を
備えている。なお、培養槽１内部の攪拌は矢印ｃの芳香
に回転する回転羽根（スクリュー型羽根７とタービン型
羽根８）を備えた攪拌機９を用いて行われる（回転速度
は７０ｒｐｍ）。反応液３のｐＨはｐＨメーター１３に
より検知され、必要に応じ適当な酸または塩基が反応槽
１内に供給される。同様に、反応液３の温度は温度計１
４により検知され、設定温度（２５℃）より高温となっ
た場合、培養槽１周囲を覆うウォータージャケット１０
の給水管１１から冷却水を注入し、該ジャケット内に満
たされた後、排水管１２から排水することにより設定温
度まで冷却し、逆に設定温度より低温となった場合、温
水または水蒸気を前記ジャケット１０に通し加温する。
さらに、反応液３中のＤＯの制御は、培養槽１に備えた
ＤＯセンサー１５により検知され、必要に応じ、該セン
サー１５に連結したＤＯコントローラー１６がガス流量
計１７を作動させ、ライン１８を介して攪拌機９下部に
取りつけた散気管６から反応液３中に所定量の窒素と空
気を供給することにより行われる。なお、ＤＯは酸素飽
和度１％以下に保った。

【００３６】固定化脱窒細菌の反応特性の検討では、海
水（汲み置きしたもの）で洗浄した３６０ｍｌ容の固定
化脱窒細菌を培養槽に入れ１４４０ｍｌの海水を添加
し、総容量１．８リットル、充填率２０％とした。これ
に２００ｍｇ−Ｎ／ｌＫＮＯ₃と１０００ｍｇ／ｌグル
コースを添加し、次に窒素ガスを供給しながら嫌気条件
を保ち、脱窒活性を誘導した。その後、内部の反応液を
入れ換えて、各条件下での脱窒活性を測定した。反応条
件は以下のように設定した。基質硝酸量と脱窒活性の関
係を検討するために、炭素源としてのグルコース濃度は
１０００ｍｇ／ｌ反応液に設定し、硝酸濃度を１００、
２００、５００、１０００ｍｇ／ｌと変化させて脱窒活
性を測定した。脱窒活性の測定は、反応液中の無機窒素
三態量を上記方法に従って測定し、無機窒素の減少量か
ら脱窒量を算出して行った。基質グルコース量と脱窒活
性の関係を検討するためには、硝酸濃度は２００ｍｇ−
Ｎ／ｌ反応液に設定し、グルコース濃度を３００、６０
０、１０００、１００００ｍｇ／ｌと変化させて脱窒活
性を測定した。

【００３７】固定化脱窒細菌の脱窒について、基質硝酸
量との関係について検討した結果を図１２に示した。初
期硝酸濃度を１００ｍｇ−Ｎ／ｌから１０００ｍｇ−Ｎ
／ｌの範囲で変化させたが、２４時間目までの脱窒量に
大きな差はなく、実験区間の脱窒活性には大きな違いが
なかったことが示された。２４時間以降では、初期硝酸
濃度が１００ｍｇ−Ｎ／ｌの場合においては硝酸がなく
なったため脱窒量は増えなかったが、それ以外の区では
実験区間に大きな差はなかった。このことは、固定化脱
窒細菌による脱窒速度は本実験で設定した初期基質硝酸
濃度の範囲では大きな影響を受けないことを示す。

【００３８】基質グルコースと脱窒活性の関係について
検討した結果を図１３に示した。初期グルコース濃度を
３００ｍｇ／ｌから１００００ｍｇ／ｌの範囲で変化さ
せたが、実験区間の脱窒活性に違いが見られた。すなわ
ち、グルコース濃度が３００〜１０００ｍｇ／ｌの範囲
では脱窒量において各実験区で大きな差はなかったが、
１００００ｍｇ／ｌの場合は顕著に活性が低下した。ま
た、この最後の実験区では、反応液の中に糸状菌と思わ
れる水垢状のものが繁茂した。グルコース基質が十分に
存在したことがこのような現象を招いたと考えられる
が、この糸状菌と思われるものによって固定化微生物が
なんらかの影響を受けて脱窒活性が低下したことが予想
される。本発明者はＡｂ−Ａ−１株は菌体懸濁液の条件
ではグルコース濃度が増加してもその脱窒活性は大きく
は向上しないことをこれまでの研究で確認しているが
（渡部ら：電力中央研究所・研究報告Ｕ９１００２（１
９９１）、以上の結果から、グルコース濃度が３００〜
１０００ｍｇ／ｌの範囲では、固定化してもその性質は
変わらないと考えられる。

【００３９】Ｂ．固定化脱窒細菌を適用した嫌気的流動
床による脱窒法の検討 ここでは、連続 (Chemostat)条件における固定化脱窒細
菌の脱窒活性の検討を行った。図１１に示した装置を用
い、ペリスタポンプを用いて反応液を流入させ、連続反
応実験を行った。実験条件は表７に示した。反応槽の容
量は１．８リットルであり、温度は２５℃、攪拌速度は
７０ｒｐｍとした。実験期間中、ＤＯの制御は行わなか
った。装置への流入水と流出水に含まれる無機窒素三態
と全有機炭素（ＴＯＣ）を上記方法に従って測定した。

【表７】

【００４０】連続反応条件下における固定化脱窒細菌の
脱窒活性ならびにＴＯＣ消費量の経時的推移を図１４に
示した。実験は２連でおこなったが、同様の推移を示し
たので、１連のみの結果を示した。反応槽流入水と流入
水の窒素三態ならびにＴＯＣについても示した。なお、
ＤＯは実験期間中を通じて酸素飽和度の５％以下に保た
れた。水理学的滞留時間（ＨＲＴ）が４８時間の最初の
７日間は、脱窒量はほぼ一定であり、約６０ｍｇ−Ｎ／
ｌが除去され、また添加されたＴＯＣの大部分が消費さ
れていた。また、４日目までは亜硝酸の生成が見られた
が、それ以降は検出されなかった。Ａｂ−Ａ−１株を適
用した生物膜法による脱窒では、脱窒槽の運用開始直後
の数日間に亜硝酸の蓄積が見られたが、その後は亜硝酸
の蓄積はなかった。このように、固定化脱窒細菌を適用
した場合でも生物膜法と同様の現象が見られた。ＨＲＴ
が２４時間の次の７日間では、脱窒量は増加したが、Ｔ
ＯＣ量についても増加した。脱窒量が増えた理由とし
て、滞留時間が短くなったことで、ＨＲＴが４８時間の
場合に比較して基質の供給が活発になり、脱窒活性も上
昇したことが考えられる。また、炭素基質の供給が２倍
に増えたことが、未消費のＴＯＣを増やした理由であろ
う。ＨＲＴが１２時間の７日間は、脱窒量はＨＲＴ２４
時間に比較して減少し、流出水のＴＯＣ量についてはさ
らに増加した。流入水の基質濃度を半分にしてＨＲＴを
２４時間にした７日間は、ＨＲＴ１２時間と比べて、脱
窒量はほぼ同じで、流出水のＴＯＣ量が減少した。

【００４１】以上の結果を基に、連続反応条件下におけ
る固定化脱窒細菌の脱窒活性ならびにＴＯＣ消費速度に
関する評価を行い、結果を表８に示した。脱窒活性なら
びにＴＯＣ消費速度に関する評価は、各実験条件の最終
日の測定値を、この時期が各条件における定常状態であ
ると仮定して用いた。測定値は、２連の平均値である。

【表８】 表８にまとめた結果から以下のことが明かとなった。Ｈ
ＲＴが４８時間の場合は、１．８リットルの反応槽で１
日当り８８．２ｍｇ−Ｎが除去されており、これは反応
槽１リットル当りに換算すると４９ｍｇ−Ｎである。本
発明者が確立した生物膜法による脱窒能力は、約４０ｍ
ｇ−Ｎ／ｌ脱窒槽／日であるので（ＨＲＴが４８時間，
グルコース濃度３００ｍｇ／ｌの条件下）、本発明によ
る値はその１．２倍であり、生物膜法と比較してわずか
であるが向上している。ＨＲＴ２４時間の場合は、１．
８リットル反応槽で１日当り２０２ｍｇ−Ｎが除去され
ており（反応槽１リットル当りでは１１２ｍｇ−Ｎ）、
生物膜法に比較して２．８倍の能力があり、生物膜法と
比較して、非常に活性が高かった。ＨＲＴが１２時間の
場合は、１．８リットルの反応槽で１日当り２２０ｍｇ
−Ｎが除去されており、生物膜法に比較して３倍の能力
がある。しかし、脱窒槽に添加されたＴＯＣのうち７７
％が流出するという問題がある。従って、ＴＯＣが魚に
影響を与えることが考えられる場合は、固定化脱窒細菌
を用いた流動床型脱窒槽と、流れ出すＴＯＣの処理槽を
組み合わせることが必要になるかも知れない。また、Ｈ
ＲＴ２４時間の条件で基質濃度を半分にした場合は、脱
窒量もＴＯＣ消費速度も約半分に低下するものの、生物
膜法に比べ脱窒効率の若干の向上がみられた。以上の検
討結果から、固定化脱窒細菌を適用した嫌気的流動床に
よる脱窒法は、生物膜法に比較して全般的に脱窒効率が
向上し、特に、基質の糖濃度を炭素換算濃度で２４０ｍ
ｇ−Ｃと２倍以上に高め、かつＨＲＴを２４時間と２倍
に早めた場合に、その脱窒能力が２．８倍程度に効率化
することが明らかとなった。

【００４２】

【発明の効果】本発明は上記の構成を採ることにより以
下の効果を奏するものである。まず、有用海洋性脱窒細
菌の高密度での大量培養を可能にしたことにより、濾材
への人工接種を可能とし、該海洋性脱窒細菌は実験室レ
ベルのみならず、工業的レベルでの生物膜法での脱窒に
適用できるものとなった。さらに、本発明は、上記脱窒
細菌を包括固定化し、その固定化脱窒細菌を適用した嫌
気的流動床型の脱窒槽を用いることで、より高い効率で
脱窒を行うことを可能にした。また、本発明の海洋性脱
窒細菌はその見かけ上の代謝が硝酸からガス状窒素へ直
接還元するタイプであるので、亜硝酸発生が望ましくな
い循環濾過養魚システム等における水質浄化の浄化微生
物として、生物膜またはより効率的には固定化細菌の形
態で好適に用いることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】各種脱窒細菌株の嫌気培養後の培地中における
無機窒素三態の量的変化を示すグラフである。

【図２】アセチレン添加嫌気条件下での脱窒細菌アルカ
リゲネス属Ａｂ−Ａ−１株によるＮ₂ Ｏ生成量の経時的
変化を示すグラフである。

【図３】脱窒細菌の脱窒活性と添加有機物の種類との関
係を示すグラフである。

【図４】脱窒細菌の脱窒活性および有機物分解速度に与
える溶存酸素濃度の影響を示すグラフである。

【図５】有用海洋性脱窒細菌３株の増殖に及ぼすｐＨの
影響を示すグラフである。

【図６】有用海洋性脱窒細菌３株の増殖に及ぼす培地中
海水濃度の影響を示すグラフである。

【図７】有用海洋性脱窒細菌３株の増殖に及ぼす温度の
影響を示すグラフである。

【図８】有用海洋性脱窒細菌３株の増殖に与える有機物
添加の効果を示すグラフである。

【図９】有用海洋性脱窒細菌３株の震盪培養条件下にお
ける増殖の経時的推移を示すグラフである。

【図１０】有用海洋性脱窒細菌３株の大量培養条件下に
おける増殖の経時的推移および培地ｐＨ調整を示すグラ
フである。

【図１１】バッチ方式および連続方式での固定化脱窒細
菌の反応特性の測定に用いた装置を示す断面図である。

【図１２】固定化脱窒細菌による脱窒量と基質硝酸濃度
との関係を示すグラフである。

【図１３】固定化脱窒細菌による脱窒量と基質グルコー
ス濃度との関係を示すグラフである。

【図１４】連続反応条件下における固定化脱窒細菌の脱
窒活性ならびに全有機炭素（ＴＯＣ）消費量の経時的推
移を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:02） Ｃ１２Ｒ 1:02 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C02F 3/00 - 3/34 A01K 63/04 C12N 1/20 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ｐＨ６〜８、温度３５℃、培養培地塩分
   濃度０．８５〜３．４％の最適生育条件を有し、硝酸か
   ら直接ガス状窒素へ還元する見かけ上の代謝経路をもつ
   アルカリゲネス属の海洋性脱窒細菌を塩分濃度０．８５
   〜３．４％の培養培地中、該培地のｐＨを６〜８、温度
   を３２〜３８℃に維持して培養液の６１０ｎｍでの吸光
   度が２以上となるまで培養することからなる脱窒細菌の
   培養方法。
2. 【請求項２】 ｐＨ６〜８、温度３５℃、培養培地塩分
   濃度０．８５〜３．４％の最適生育条件を有し、硝酸か
   ら直接ガス状窒素へ還元する見かけ上の代謝経路をもつ
   アルカリゲネス属の海洋性脱窒細菌を固定化してなる固
   定化脱窒細菌。
3. 【請求項３】 海洋性脱窒細菌がアルカリゲネス属Ｇ−
   Ａ−２−１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１３８６１号）、アルカ
   リゲネス属Ａｂ−Ａ−１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１３８６２
   号）またはアルカリゲネス属Ａｂ−Ａ−２株（ＦＥＲＭ
   Ｐ−１３８６０号）である請求項２記載の固定化脱窒
   細菌。
4. 【請求項４】 請求項２または３記載の固定化脱窒細菌
   を嫌気的流動床にて流入水と接触させることからなる脱
   窒方法。
5. 【請求項５】 前記流入水の糖濃度を炭素換算濃度１２
   ０〜３６０ｍｇ−Ｃ／ｌ、滞留時間を１２〜３６時間と
   して処理を行う請求項４記載の脱窒方法。
6. 【請求項６】 前記流入水が循環濾過養魚システムにお
   ける飼育水である請求項４または５記載の脱窒方法。