JPH0611711B2 - 不妊症療法剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ソマトトロピン（成長ホルモン）放出因子を
単独で用いるか、または卵胞刺激ホルモンと組み合して
用いる男性および女性の不妊症療法並びにそれらの医薬
製剤に関する。

〔発明の背景〕

卵巣顆粒膜細胞のプロゲステロン合成の誘導における卵
胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の効能は周知である。かかる
細胞によるプロゲステロン合成能の獲得は、順次、正し
い卵胞の成長および黄体の正常な機能を果すための卵母
細胞の成熟の完成を決定する。

ＦＳＨおよびコリオゴナドトロピン（絨毛性性腺刺激ホ
ルモン）を用いる療法は、ゴナドトロピンの内因性分泌
が十分でないことに由来する無排卵不妊症の主要な治療
法となってきた。ＦＳＨは、同一単位(I.U.)の生物学的
活性のホルモンＦＳＨおよびＬＨ（黄体形成ホルモン）
を含有する製剤、メノトロピンもしくはＨＭＧ（ヒト閉
経期のゴナドトロピン）としてか、またはＦＳＨおよび
ほんの少量のＬＨを含有する製剤、ウロフォリトロピン
(Urofollitrophin)として投与することができる。

本出願人は、これらの製剤をそれぞれペルゴナール(Per
gonal ）およびメトロジン（Metrodin ）の名の下に
上市している。

セルトリー細胞（これは、卵巣顆粒膜細胞と等価な男性
細胞である）に対してゴナドトロピンの示す効能のため
に、同じ製剤が男性の不妊症療法にも使用されている。

前述したように、ゴナドトロピンによる療法が女性およ
び男性の不妊症における療法のいずれにも撰択されるよ
うになってきたとはいえ、この種の療法が有効でないい
くつかの臨床症状も存在する。

月経周期中にある正常な被検者で実施した研究は、ＧＲ
Ｆの静脈内投与が血清中のＨＧＨおよびＳ_m−Ｃレベル
を上昇せしめるが、プロラクチン、ＬＨまたはＦＳＨで
はそうでないことを示した（Evans W.S.等−月経周期中
の正常な女性における血清成長ホルモン、プロラクチ
ン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモンおよびソマト
メジン−Ｃの濃厚物に対するヒト膵臓成長ホルモン放出
因子−４０の効果−J.Clin.Endoc.Metab.59：1006,198
4）。

また、ナノモル濃度のＳ_m−Ｃが、培養ラット顆粒膜細
胞でプロゲステロンの合成を誘導するＦＳＨ量を上昇せ
しめる（Adashi E.Y.他−培養ラット顆粒膜細胞でのプ
ロゲスチン生合成能獲得におけるソマトメジン−Ｃと卵
胞刺激ホルモンの相乗作用−Endocrinology116：2135,1
985）。

すべての成長因子が同じような作用を果すわけでない。

例えば、ＥＧＦ（上皮成長因子）は、ＦＳＨ誘導性サイ
クリックＡＭＰ産生に対して阻害作用を有し、従って卵
巣顆粒膜細胞の分化に対して阻害作用を有することが知
られている。他の成長因子、TGF−β（形質転換成長因
子−β）は、同じ細胞の分化過程の期間を通じてＦＳＨ
およびＥＧＦの作用を調節する（Pei Feng，他−顆粒膜
細胞分化期間中の形質転換成長因子−βによる上皮成長
因子の阻害活性の調節−J.Boil.Chem.261(30),14167,19
86）。

結論として、成長因子は、前述の細胞分化過程の調節作
用を有し、そしてこのゴナドトロピンの細胞標的レベル
においてＦＳＨと相互に影響しあうことが明らかであ
る。それにもかかわらずいまだそれらの機能および相対
的な相乗作用の機構は、説明されない。

今や、ＧＲＦは、卵巣の卵胞形成および精子形成の調節
機構並びに精子の成熟に影響を与え得ることが発見され
た。

また、ＧＲＦは、性腺におけるゴナドトロピンの生体内
(in-vivo)効果を上昇することが発見された。

〔発明の構成〕

従って、本発明の主たる目的は、女性および男性の不妊
症の症例の療法におけるＧＲＦの療法上の使用である。
さらに、本発明の目的は、性腺におけるゴナドトロピン
の作用を高めることが望まれるかまたは必要である場合
に適するＧＲＦおよびゴナドトロピンの併用療法からな
る。

本発明の他の目的および利点は、以下の詳細な記載から
理解できるであろう。

なお、ＧＲＦについての豊富な文献が存在する（例え
ば、Guillemin等、Science,218,585,1982；Esch等、J.B
iol.Chem.258,1806,1983を参照）。

ＧＲＦの種々の調製物を精製し、そしてそれらのアミノ
酸配列を決定した。GRF-44は、GRF-40の完全なアミノ酸
配列を含み、さらに４個のアミノ酸によってカルボン酸
末端が伸びている。

次に、GRF-40は、GRF-37の完全なアミノ酸配列を含み、
さらに３個のアミノ酸によってカルボン酸末端が伸びて
いる。

また、ペプチドGRF-29は、生物学的な活性を有すること
が示されている（J.Rivier等、Nature,300,276-8,198
2）。

また、GRF-NH₂-44は成熟ホルモンであり、そしてGRF 4
0,37および２９は、すべて生物学的な活性断片であるこ
とが示されている。

さらにまた、種々のＧＲＦは脳下垂体による成長ホルモ
ンの合成レベルと放出レベルのいずれにおいても反応す
ることが示されている（Brazeau等、Proc.Nat.Acad.Sc
i.79,7909、1982；Brazeau等、Nature306,84,1983）。

ＧＲＦは、静脈内か、筋肉内かまたは皮下経路により投
与することができる。ＧＲＦの必要な血中レベルを与え
ることができる他の投与経路も本発明に包含される。

以下に記載する臨床試験では、GRF-29は、GRF100または
150マイクログラム(mcg)および賦形剤としてのマンニト
ール１０ミリグラム(mg)を含有する凍結乾燥アンプルと
して使用された。生理食塩水２mlに溶解した凍結乾燥品
を静脈内経路で投与した。

ＧＲＦの製薬学上の調製は、常法により実施し、それで
何等の困難もなかった。

試験管内(in-vitro)試験 試験は、ヒトの精液および卵胞液状物並びにラットのラ
イジッヒ(Leydig)細胞の上澄中のＧＲＦに対する免疫反
応性を測定し、さらに単離したラットのセルトリ(Serto
li)細胞においてＧＲＦに対する結合部位を同定した。

１．材料および方法 １．卵胞液状物(F.F.) 卵胞液状物は、GIFTまたはFIVETのプログラムの下に操
作される腹腔鏡検査の期間を通じて卵胞を吸引すること
により得た。この卵胞液状物は、2000rpmで１５分間、
直ちに遠心して細胞および細胞断片を除去し、この抽出
物をＧＲＦについて用いるまで上澄を−２０℃で凍結し
た。

精液(S.F.) 精液は、２４才〜３６才の健康な志願者から、２〜５日
の性交禁欲後の自慰により集めた。集めた後、精液を、
凝塊が液状化するまでの約２０分間、室温に維持し、次
いで1500rpmで１５分間遠心して精子および他の細胞種
を除去した。この上澄を0.5Ｍの酢酸溶液で１：１に希
釈し、１５分間煮沸し、そして1000rpmで１０分間遠心
した。上澄を−２０℃に凍結した。

ラット・ラィジッヒ細胞の上澄 ５０日令のスプラーク・ダウレイ(Spraque Dawley)成ラ
ットを犠牲にし、それらの睾丸を取り出し、被膜剥離を
行い、そして0.025％のコラゲナーゼを含有する培地(Ea
rle)中に入れた。攪拌しながら３４℃で15〜20分インキ
ュベーションした後、散乱する細胞を遠心により細管か
ら分離し、そして0.025％のコラゲナーゼを含有する培
地に移した。３時間のインキュベーション後、上澄を分
離しそして−２０℃に凍結した。

抽出方法 前記のように調製される試料を解凍し、９０％のメタノ
ールおよび0.1％のＢＳＡで活性化したオクタドデカシ
リルシリク(octadodecasililsilic)カラム(Sep-Pak C1
8,Waters)を通して流がし、目的物を１％HCOOHの９０％
のメタノールで溶出し、次いで室温における窒素流下で
乾燥した。この方法により抽出される標識化したＧＲＦ
の回収率は７０％である。この乾燥残渣をＰＢＳ＋0.3
％のＢＳＡ、１０mMのEDTA溶液に再溶解し、ＲＩＡ法に
供した。

ＧＲＦのＲＩＡ量 使用した標識：（３−〔Ｉ〕^１２５−iodotyrosil ¹⁰）
ヒトGRF-44(Amershamより入手）、比活性は約2000Ｃｉ
／mmo^lである。

抗血清：ヒトGRF-44に対してラビットで得られた抗−Ｇ
ＲＦ(Amersham)。GRF-29との交差反応性は100％である。

コールド（標識していない）：ヒトGRF-44(Sigma)。

インキュベーション条件：４℃で２４時間。

リガンドからの脱離：カーボンデキストラン。

本法の感度：7.8pg／チューブ 内部(Intra-)および中間(Inter)の使用量： それぞれ５％および１０％。

セルトリー細胞の調製およびＧＲＦバインディング条件 セルトリー細胞は、既知の方法（A.Fabbri,等−オピエ
ート(Opiate)レセプターは、ラット睾丸中に存在する：
セルトリー細胞の同定および位置付け−Endocrinology1
17：2544-2546,1985）により、１４日令のラットの睾丸
から単離した。手短に言えば、この方法は、コラゲナー
ゼによる酵素的分散、そして続けてトリプシンおよびコ
ラゲナーゼによる微小管(tubules)の処理によりラィジ
ッヒ細胞に由来する微小管(tubular)構成物の分離から
成る。分離細胞は、ウエル当たり約100,000細胞の濃度
で４８ウェルコースタープレートに供した。９５％のＯ
₂／５％のCO₂の雰囲気下、３４℃のメタボリック・イン
キュベーター中に２４時間放置し、細胞をウエルの底に
付着させた。細胞を洗浄した後、10^-11Ｍの濃度のヨウ
素標識GRF-44の存在下、10^-6Ｍのコールド（標識化して
いない）ヒトGRF-44の存在下又は非存在下で、TC199の
１０mMのTRIS培地中で、４℃で６０分間インキュベーシ
ョンした。その後、細胞を、ＰＢＳ＋0.5％のＢＳＡを
用い、４℃にて３度洗浄し、次いで放射線活性を有する
細胞を0.1ＮのNaOHに可溶化し、そしてガイガーカウン
ターで読み取った。

２．結果 ＧＲＦに対する免疫反応性 試験した生物学的液体中のＧＲＦに対する免疫反応性は
以下のとおりであった。

卵胞液状物＝６０pg/ml 精液＝140pg/ml ラットのラィジッヒ上澄＝100pg/ml。

セルトリー細胞上の結合部位 得られた結果は、2.5fmo^lのペプチド／７０mcgのタンパ
ク（約４０fmo^l/mgのタンパク）に等価な、セルトリー
細胞に対するＧＲＦの特異的結合の存在を示した。

３．まとめ、 これらの結果は次のことを示唆する： （１）ＧＲＦに対する免疫反応性は、ヒトの卵胞液状物
および精液のいずれにも存在する。

（２）ＧＲＦに対する免疫反応性は、ラットのラィジッ
ヒ細胞の上澄にも存在し、そしてその結合部位は、同種
の動物のセルトリー細胞上に位置している。

従って、他の成長因子により媒介される効果の可能性を
も常に考慮しながら、卵胞形成および精子形成に対する
プラスの臨床効果は、卵巣および睾丸レベルにおけるペ
プチドの直接的な作用によると推測することができる。

臨床試験 女性不妊症の処置 本発明に従い実施される臨床試験は、正常な卵胞形成能
を有する女性（対照）と卵胞形成能を欠失した女性の両
者を処置した。

試験は、卵胞形成期間中の成熟増殖中の卵胞の体積並び
に17β−エストラジオールおよび17α−OHプロゲステロ
ンの血漿レベルを記録する卵胞形成能のエコーグラフィ
ック(echographic)およびホルモンのモニタリングから
なる。

正常な卵胞形成能を有する対照では、卵胞形成能の２種
のモニタリングが、前記の方法により実施された。その
第１のものにより基礎的な状況が確められ、そして第２
のものにおいては周期の１〜７日目の間に100または150
mcg／日の量のGRF-29が静脈内投与された。

卵胞形成能の欠失した患者における卵胞形成能のモニタ
リングは、まったく医薬を投与しないもの（対照）、周
期の１〜７日目の間に100または150mcg／日の量のGRF-2
9を静脈内投与(i.v.)するもの、７日間に７５または150
I.U.／日の量のＦＳＨ〔メトロジン（METRODIN ）〕を
筋肉内投与(i.m.)するもの、前記の量でＦＳＨ＋ＧＲＦ
を組み合せて投与するものについて実施した。

ケース１(C.R.) ２１才−正常卵胞形成能−対照。

観察の第一周期（基礎）は、１７日目と１８日目との間
に排卵を伴い、周期の１４日目と１５日目との間に卵胞
の活性化の存在および優性な卵胞の形跡を示す。

GRF-29(100mcg／日、i.v.）による療法を施した観察の
第二周期は、１５日目と１６日目との間に排卵を伴い、
周期の１３日目と１４日目との間に卵胞の活性化の存在
および優性な卵胞の形跡を示す。

ケース２(S.A.) ２４才−正常卵胞形成能−対照 基礎的な観察 周期の１日目〜７日目の間におけるGRF-29の150mcg／
日、i.v.の条件下での観察： ケース３(C.A.) ３４才−患者。

卵胞形成能および排卵不全に帰因する４年の原発性不妊
症。従前のエコーグラフィックおよび生化学的試験、並
びにクエン酸クロミフェン＋エチニルエストラジオール
および／またはゴナドトロピンによる誘導療法は、優性
なものへの進展の可能性を伴わないが黄体形成の傾向を
伴う多数の卵胞活性化の存在を示す。

観察の第一周期は、卵胞の活性化および優性な卵胞のエ
コーグラフィックな徴候の不存在、並びに排卵活性化の
生化学的な徴候の存在を示した。

基礎的な観察： GRF-29(150mcg／日、i.v.）の投与条件下で実施した試
験の第二周期は、卵胞の活性化、優性な卵胞および卵胞
の裂開の存在を示す。卵胞に対して影響を与える大きさ
を考慮すると周期の１６日目以降のエコーグラフィック
観察の消失が退縮に帰因し得るとすることを排除できな
いであろう。生化学的データは、この周期の観察におい
て排卵の存在を明らかにする。

第三周期の試験は、周期の１日目〜７日目の間にＦＳＨ
〔メトロジン（Metrodin ）〕150I.U.量を投与する条
件下で実施した。このケースでは、優性な卵胞を伴わな
い卵巣の活性化の徴候が記録された。

第四周期の試験は、周期の１日目〜７日目の間にGRF-29
(150mcg／日、i.v.）＋メトロジン（Metrodin ）（150
I.U.／日、i.m.）の投与下で実施した。この周期の期間
中に、卵巣の活性化、優先な卵胞および周期の１８日目
に裂開を観察することができた。

ケース４(F.L.) ２８才−患者。

卵胞形成能不全に帰因する原発性のカップル(couple)不
妊症を病む患者。従前の試験は、卵胞の成熟の存在を示
している。過去には、クエン酸クロミフェンまたはゴナ
ドトロピンを用いる刺激療法を実施することにより、卵
胞の活性化および優性な卵胞の存在を示したが、しかし
ながら排卵を伴わなかった。

何んの療法も行わなかった第一周期の観察は、試験の２
５日目まで卵胞の活性化および優性な卵胞の不存在を示
す。

GRF-29(100mcg／日、i.v.）の投与下で実施した第二周
期の試験は、排卵の不存在を示したが、卵胞形成能は活
性化された。

第三周期の試験は、周期の１日目〜７日目の間に、７５
I.U.／日、i.m.のアンプル中のＦＳＨ〔メトロジン（Me
trodin ）〕の投与下で実施した。

なお、このケースでは、卵巣の活性化は示したが、正常
な卵胞の形成能および排卵は示さなかった。

第四周期の試験は、周期の１日目〜７日目の間にそれぞ
れi.v.およびi.m.の経路でGRF-29の100mcg／日＋メトロ
ジン（Metrodin ）の７５I.U.／日を投与する条件下で
実施した。観察期間を通じて、周期の１８日目および１
９日目の間に排卵を伴う、卵胞の成熟化への進展を観察
することができた。

ケース５(A.V.) ３０才−患者。

この患者は、卵胞の成熟不全、無排卵および卵胞の黄体
化に帰因する原発性カップル不妊症のために本試験に含
めた。クエン酸クロミフェンおよびゴナドトロピンを用
いる刺激療法の周期をしたが、臨床状況の解決は伴わな
かった。

何んの療法も施こすことなく実施した第一周期の観察
は、遅延した卵巣の活性化の存在、無排卵および卵胞の
黄体化の存在を示す。

周期の２２日目の観察は、優性な卵胞の壁の不規則性の
存在を示し、内部の黄体化のエコーを示す。従って、モ
ニターリングの中止を決定した。３５日目に月経が再度
始った。月経期間中に行ったエコーグラフィック試験
は、卵胞形成の消失を示した。

第二周期の試験は、周期の１日目〜７日目の間にＦＳＨ
〔メトロジン（Metrodin ）〕の７５I.U.／日、i.m.投
与下で実施した。より早熟な卵巣の活性化を除いて、対
照の周期の期間を通じて観察された状況と実質的に同様
であることが示された。

周期の２１日目の観察は、優性卵胞の明瞭な内部黄体化
様のエコーを示した。従って、この試験の中止を決定し
た。周期の２６日目に月経が自然に始った。月経期間中
に行ったエコーグラフィック検査は、この周期中に卵胞
形成の消失を示した。

第三周期の試験は、周期の１日目〜７日目の間にGRF-29
の100mcg／日、i.v.＋ＦＳＨ〔メトロジン（Metrodi
n ）〕の７５I.U.／日．i.m.投与下で実施した。この
期間の間に、周期の１６日目と１７日目との間に排卵を
伴う、卵胞のより優れた成熟の進展を観察することがで
きた。

ケース６(C.P.) ３２才−患者。

原発性不妊症８年。微小多嚢胞性卵巣の診断。また、ゴ
ナドトロピン誘導下で卵胞形成能の活性化を示さない。
左側の卵巣剔除術を施された観察下の患者。何等の療法
も施されていない第一周期の観察の期間を通じて、エコ
ーグラフィックな観察は可能であったが、生化学的な観
察はできず、そして卵巣の活性化の徴候および優性な卵
胞の不存在を観察することができた。

第二周期の観察は、周期の１日目〜７日目の間のGRF-29
の150mcg／日、i.v.投与の下に実施した。

良好な卵巣の活性化が観察され、次いで周期の１７日目
あたりに進展を示す、２種の卵胞（前述のような微小多
嚢胞性卵巣内）の増殖が観察された。

第三周期の観察は、周期の１日目〜７日目の間にメトロ
ジン（Metrodin ）の150I.U.／日、i.m.を投与するこ
とにより実施した。優性な卵胞を伴わない卵巣の活性化
が、エコーグラフィックおよび生化学的に示された。

第四の観察は、周期の１日目〜７日目の間にGRF-29の15
0mcg／日、i.v.＋ＦＳＨ〔メトロジン（Metrodin ）〕
の150I.U.／日、i.m.を投与することにより実施した。
周期の１４日目あたりで裂開を伴う、卵巣の活性化およ
び優性な卵胞が観察された。

ケース７(E.L.) ３７才−患者。

原発性不妊症。やはり、ゴナドトロピンの大量投与下で
も卵巣の活性化が見られない。この患者は、二次的無月
経であり、プロゲステロンの投与後だけ月経を生じる。
試験の開始に先立ち、ゲストン（Gestone ）100mg、i.
m.により月経を誘発した。第一周期の観察は、何等の療
法も施さないで実施し、卵巣の活性化に対するエコーグ
ラフィックおよび生化学的な徴候が存在しないことが確
認された。

第二周期の観察は、周期の１日目〜７日目の間にGRF-29
の150mcg／日、i.v.の投与で実施した。卵巣の活性化の
エコーグラフィックな徴候の存在が確認されたが、優性
な卵胞は存在しないことが確認された。

第三周期の観察は、周期の１日目〜７日目の間にＦＳＨ
〔メトロジン（Metrodin ）〕の150I.U.／日、i.m.の
投与の下に実施した。卵巣の活性化のエコーグラフィッ
クな観察は可能であったが、卵巣の活性化の生化学的な
徴候は観察できず、さらに優性な卵胞も存在しないこと
が観察された。

第四周期の観察は、周期の１日目〜７日目の間にGRF-29
の150mcg／日、i.v.＋メトロジン（Metrodin ）の150
I.U.／日、i.m.の投与の下に実施した。卵胞の活性化、
優性な卵胞および卵胞の裂開のエコーグラフィックおよ
び生化学的な徴候の存在を示すことができた。

これらの結果は、周期の第一相の間のGRF-29の投与は、
卵胞の成長を促進し、そして排卵（裂開）を期待できる
か、または排卵の誘発さえも示す。さらに、ＧＲＦは、
ほぼ卵胞のレベルで無排卵が実証されている患者におけ
るＦＳＨ作用を相互に補助しあう(coadjuvating)ことが
できる。これらの後者では、ＦＳＨとの組み合せたＧＲ
Ｆによる処置は、常に卵胞を排卵まで成長せしめる効能
をもたらす。

男性不妊症の処置 乏精液症または無精子症を伴う種々の疾病の精子形成不
全症を病む患者を、選択されるプロトコールの判定基準
に従い、１週３度の５mcg/kg、s.c.量のGRF-29で３ヶ月
間処置した。

プロトコールに含まれる判定基準によれば、すべての患
者は、正常または平均以上のゴナドトロピンレベルを有
する25〜40才の範囲内にあり、そして精液パラメーター
を妨害し得る炎症反応または他の疾病を有していない。
睾丸の生検は、管周の線維形成の不存在による精子細胞
レベルでの精子形成の停止を示した。

まず最初の調整は、療法開始から４５日後に行い、そし
て第二の調整は３ヶ月後に行った。試験は、精液パラメ
ーターの改善を示し、具体的には精子の数の増加および
それらの能動性の上昇を示し、このことから本療法の有
効性を推測することができる。

前記の療法は、プロトコールに含まれる判定基準に従
い、正常または平均以上のゴナドトロピンのレベルを考
慮して、ＧＲＦ単独使用により実施した。睾丸の病理に
由来するか、またはゴナドトロピンの分泌不全（ゴナド
トロピン不全性の性機能不全）に由来するかを問わず、
精子形成不全の全ての場合のゴナドトロピンの作用を増
強するためにＧＲＦを使用することは、本発明の範囲内
に入る。

たとえ前述の臨床試験が、ゴナドトロピンとしてＦＳＨ
を用いて実施されているとしても、メノトロピン（ＨＭ
Ｇ）またはその他ＦＳＨを含有する調剤により同様な結
果が得られることは明らかである。

同様に、前述の臨床試験で使用されているGRF-29に代
え、GRF-44または他の類似の活性を有する分子を用いる
ことは、均等と解することができる。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ソマトトロピン放出因子の薬学上の有効量
   および１以上の賦形剤を含有する不妊症療法のための医
   薬製剤。
2. 【請求項２】ソマトトロピン放出因子が、GRF-29である
   請求項１記載の医薬製剤。
3. 【請求項３】医薬として許容され得る１以上の賦形剤の
   存在下で、ソマトトロピン放出因子および卵胞刺激ホル
   モンを含有し、不妊症療法においてその活性成分を同時
   にか、別々にかまたは連続的に使用するための医薬製
   剤。
4. 【請求項４】医薬として許容され得る１以上の賦形剤の
   存在下で、GRF-29および卵胞刺激ホルモンを含有する請
   求項３記載の医薬製剤。
5. 【請求項５】ソマトトロピン放出因子およびメノトロピ
   ン(Menotrophin)を含有する請求項３記載の医薬製剤。
6. 【請求項６】ソマトトロピン放出因子がGRF-29である請
   求項５記載の医薬製剤。